CN101948774A - 功能性益生性乳杆菌高密度培养及其冻干产品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
功能性益生性乳杆菌高密度培养及其冻干产品的制备方法，它涉及乳杆菌培养及其冻干产品的制备方法。它解决了现有乳杆菌生产存在产品中活菌含量小、用量大、发酵效果差，而且其冻干制剂的制造和使用成本均较高的问题。培养：一、耐氧驯化的功能性益生性乳杆菌接种到增菌培养基中，得发酵液；二、洗脱和絮凝；三、膜浓缩处理后即完成。制备：一、膜浓缩产物与冷冻保护剂混合预冷，得混合物；二、将混合物预冻后，经主干燥和解析干燥，再进行粉碎、包装并贮藏即完成。本发明中乳杆菌的活菌数为5.4×1010CFU/g，用量减少，且发酵效果好，冻干产品的生产成本低、工艺简单且活性高，可达到直接使用目的。
Description
技术领域
本发明涉及乳杆菌培养及其冻干产品的制备方法。
背景技术
乳杆菌属于乳酸菌，革兰氏染色阳性、无芽孢杆菌。分解糖的主要终产物是乳酸，不发酵乳酸盐，很少致病，广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中，也见于温血动物的口腔、阴道和肠道内；分解糖的能力强，分解蛋白质类的能力极低。
目前，乳杆菌生产，多是采用离心浓缩的方式，存在处理量较小、离心机取料程序繁杂、菌体死亡率较高及收获率较低的缺点，致使产品中活菌含量小、用量大、发酵效果差；且其产品主要为冻干制剂，制造和使用成本均较高。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有乳杆菌生产存在产品中活菌含量小、用量大、发酵效果差，而且其冻干制剂的制造和使用成本均较高的问题，而提供功能性益生性乳杆菌高密度培养及其冻干产品的制备方法。
功能性益生性乳杆菌高密度培养按以下步骤进行：一、将经过耐氧驯化的功能性益生性乳杆菌接种到发酵罐的增菌培养基中，在温度为35～37℃、pH值为6.5～6.8的条件下培养15～17h，得发酵液；二、发酵液在0～20℃时，加入与发酵液等重量的质量浓度为10％的柠檬酸钠溶液或质量浓度为10％的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白的洗脱，再加入质量浓度为0.2～2％的壳聚糖进行菌体的絮凝；三、絮凝后的发酵液使用孔径为100～200nm、面积为0.5m2的陶瓷膜，在跨膜压力为110KPa进行膜浓缩处理至絮凝后的发酵液的浓缩倍数达到6，得到含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物，即完成功能性益生性乳杆菌高密度培养；其中步骤一中接种量为2％；步骤一中增菌培养基由80～120g的脱脂乳粉，40～60g的胰蛋白酶水解乳清粉，30～60g的番茄汁、30～60g的麦芽汁、10～30g乳糖、0.50～0.70g的酵母膏或酵母粉、6.8～7.2mg的腺嘌呤和50～54mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至1000mL组成；步骤三中膜浓缩处理的方式为两个陶瓷膜管串联。
功能性益生性乳杆菌冻干产品的制备方法按以下步骤进行：一、按重量比1∶1～2将含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度0～10℃的条件下进行10～12h的冷冻前预冷处理，得混合物；二、将混合物置于-70℃冷冻机的冷冻盘中进行预冻，直至混合物的温度达到-45℃，保持30min，然后以5℃/30min的速率升温至-28℃，并维持此温度至真空度达到0.05MPa完成主干燥阶段，再升温至10℃并维持此温度至真空度达到0.03MPa完成解析干燥阶段，取出后用颗粒机粉碎，再用无菌铝箔纸盒包装并置于-20℃的环境中贮藏，即完成功能性益生性乳杆菌冻干产品的制备；其中步骤一中冷冻保护剂10～20g的脱脂乳粉、1～3g的甘油、1～2g的维生素C、0.5～1g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和3～15g的海藻糖加入蒸馏水并定容至1000mL组成；步骤二中混合物置于-70℃冷冻机的冷冻盘中的大小为长40cm×宽50cm×高20mm。
本发明中功能性益生性乳杆菌高密度培养，所得含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物中乳杆菌的活菌数为5.4×1010CFU/g，比现有的活菌数提高10倍以上，乳杆菌用量减少，仅取0.005％～0.010％与酸奶发酵剂配合使用即可满足益生菌发酵乳生产的要求，可以作为优质的益生菌直投式发酵剂，且发酵效果好，同时增菌培养基中所用的腺嘌呤，为后续冻干产品的制备过程中增加了功能性益生性乳杆菌的存活率。本发明可以适合于益生功能的嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或副干酪乳杆菌。
本发明中功能性益生性乳杆菌冻干产品的制备方法，将功能性益生性乳杆菌高密度培养所得的膜浓缩产物进行加工，这样减小冷冻处理的负荷，同时，优化后的冷冻保护剂，也可以提高功能性益生性乳杆菌的存活率，与冻干制品相比具有生产成本低而活性高的优点，达到直接使用目的，而且工艺简单；此外，本发明中功能性益生性乳杆冻干产品还可以作为辅料添加到奶粉中，在12个月的保质期内益生菌奶粉的益生乳杆菌的活菌数均大于1.0×106CFU/g。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式功能性益生性乳杆菌高密度培养按以下步骤进行：一、将经过耐氧驯化的功能性益生性乳杆菌接种到发酵罐的增菌培养基中，在温度为35～37℃、pH值为6.5～6.8的条件下培养15～17h，得发酵液；二、发酵液在0～20℃时，加入与发酵液等重量的质量浓度为10％的柠檬酸钠溶液或质量浓度为10％的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白的洗脱，再加入质量浓度为0.2～2％的壳聚糖进行菌体的絮凝；三、絮凝后的发酵液使用孔径为100～200nm、面积为0.5m2的陶瓷膜，在跨膜压力为110KPa进行膜浓缩处理至絮凝后的发酵液的浓缩倍数达到6，得到含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物，即完成功能性益生性乳杆菌高密度培养；其中步骤一中接种量为2％；步骤一中增菌培养基由80～120g的脱脂乳粉，40～60g的胰蛋白酶水解乳清粉，30～60g的番茄汁、30～60g的麦芽汁、10～30g乳糖、0.50～0.70g的酵母膏或酵母粉、6.8～7.2mg的腺嘌呤和50～54mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至1000mL组成；步骤三中膜浓缩处理的方式为两个陶瓷膜管串联。
本实施方式步骤一中耐氧驯化的功能性益生性乳杆菌，是从自然发酵食品或人类肠道中分离出功能性益生性乳杆菌，为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或副干酪乳杆菌，然后通过连续在微氧条件下驯化筛选所得，具体操作参照张旭，魏仲珊，李华丽.双歧杆菌的分离鉴定与耐氧驯化.现代食品科技，2009，Vol.25，No.1：31-37；驯化：挑选革兰氏染色阳性、接触酶试验阴性、明胶液化试验阴性、葡萄糖产气试验阴性、果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)试验阳性的菌落，接种于已灭菌的PTY液体培养基中，将接种后的三角瓶放置于厌氧培养箱中，用氮气洗2次，采用透气膜封口，然后在37℃厌氧培养箱中培养72h。将扩增后菌液在有氧环境继续培养6～8h，有氧条件培养时逐步增加培养箱中的氧气含量，以指示剂的颜色变化来判断含氧量的多少，经多次传代驯化后，选择在脱脂乳培养基中凝乳时间较短、活菌数较高且贮藏中仍能保持较高活菌数的菌株。
本实施方式步骤三中所用陶瓷膜可以再生，再生工艺为：50℃的热水清洗5min，质量浓度为0.5％的氢氧化钠溶液清洗10min，50℃的热水清洗5min，质量浓度为0.5％的硝酸清洗10min，50℃的热水清洗5min，即完成陶瓷膜再生。
本实施方式采用流加法补充增菌培养基。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中采用中和剂调节增菌培养基的pH值，中和剂为质量浓度为10～15％的氢氧化钠、质量浓度为10～15％的氨水或质量浓度为20％的Na2CO3；步骤一中培养15～17h的过程中需补加乳糖，乳糖补加量为所消耗的中和剂中碱性物质摩尔量的3～5倍，同时采用D301型树脂吸附培养过程中产生的钠盐。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中在温度为35℃、pH值为6.5的条件下培养17h，得发酵液。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中在温度为37℃、pH值为6.8的条件下培养15h，得发酵液。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中在温度为36℃、pH值为6.6的条件下培养16h，得发酵液。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中增菌培养基由80g的脱脂乳粉，40g的胰蛋白酶水解乳清粉，30g的番茄汁、30g的麦芽汁、10g乳糖、0.50g的酵母膏或酵母粉、6.8mg的腺嘌呤和50mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至1000mL组成。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中增菌培养基由120g的脱脂乳粉，60g的胰蛋白酶水解乳清粉，60g的番茄汁、60g的麦芽汁、30g乳糖、0.70g的酵母膏或酵母粉、7.2mg的腺嘌呤和54mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至1000mL组成。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中增菌培养基由90～110g的脱脂乳粉，45～55g的胰蛋白酶水解乳清粉，40～50g的番茄汁、40～50g的麦芽汁、15～25g乳糖、0.55～0.65g的酵母膏或酵母粉、6.9～7.1mg的腺嘌呤和51～53mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至1000mL组成。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中增菌培养基由100g的脱脂乳粉，50g的胰蛋白酶水解乳清粉，45g的番茄汁、45g的麦芽汁、20g乳糖、0.60g的酵母膏或酵母粉、7mg的腺嘌呤和52mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至1000mL组成。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤二中加入质量浓度为0.2％的壳聚糖进行菌体的絮凝。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤二中加入质量浓度为1％的壳聚糖进行菌体的絮凝。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤二中加入质量浓度为0.5～1.5％的壳聚糖进行菌体的絮凝。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤二中加入质量浓度为2％的壳聚糖进行菌体的絮凝。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十四：本实施方式功能性益生性乳杆菌冻干产品的制备方法按以下步骤进行：一、按重量比1∶1～2将含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度0～10℃的条件下进行10～12h的冷冻前预冷处理，得混合物；二、将混合物置于-70℃冷冻机的冷冻盘中进行预冻，直至混合物的温度达到-45℃，保持30min，然后以5℃/30min的速率升温至-28℃，并维持此温度至真空度达到0.05MPa完成主干燥阶段，再升温至10℃并维持此温度至真空度达到0.03MPa完成解析干燥阶段，取出后用颗粒机粉碎，再用无菌铝箔纸盒包装并置于-20℃的环境中贮藏，即完成功能性益生性乳杆菌冻干产品的制备；其中步骤一中冷冻保护剂10～20g的脱脂乳粉、1～3g的甘油、1～2g的维生素C、0.5～1g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和3～15g的海藻糖加入蒸馏水并定容至1000mL组成；步骤二中混合物置于-70℃冷冻机的冷冻盘中的大小为长40cm×宽50cm×高20mm。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式十四不同的是步骤一中按重量比1∶1将含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度0℃的条件下进行12h的冷冻前预冷处理，得混合物。其它步骤及参数与具体实施方式十四相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式十四不同的是步骤一中按重量比1∶2将含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度10℃的条件下进行10h的冷冻前预冷处理，得混合物。其它步骤及参数与具体实施方式十四相同。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十四不同的是步骤一中按重量比1∶1.5将含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度5℃的条件下进行11h的冷冻前预冷处理，得混合物。其它步骤及参数与具体实施方式十四相同。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十四至十七之一不同的是步骤一中冷冻保护剂10g的脱脂乳粉、1g的甘油、1g的维生素C、0.5g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和3g的海藻糖加入蒸馏水并定容至1000mL组成。其它步骤及参数与具体实施方式十四至十七之一相同。
具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式十四至十七之一不同的是步骤一中冷冻保护剂20g的脱脂乳粉、3g的甘油、2g的维生素C、1g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和15g的海藻糖加入蒸馏水并定容至1000mL组成。其它步骤及参数与具体实施方式十四至十七之一相同。
具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式十四至十七之一不同的是步骤一中冷冻保护剂12～18g的脱脂乳粉、1.5～2.5g的甘油、1.2～1.8g的维生素C、0.6～0.9g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和5～10g的海藻糖加入蒸馏水并定容至1000mL组成。其它步骤及参数与具体实施方式十四至十七之一相同。
具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式十四至十七之一不同的是步骤一中冷冻保护剂15g的脱脂乳粉、2g的甘油、1.5g的维生素C、0.8g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和8g的海藻糖加入蒸馏水并定容至1000mL组成。其它步骤及参数与具体实施方式十四至十七之一相同。
具体实施方式二十二：本实施方式功能性益生性乳杆菌高密度培养按以下步骤进行：一、将经过耐氧驯化的功能性益生性乳杆菌接种到发酵罐的增菌培养基中，在温度为36℃、pH值为6.6的条件下培养16h，得发酵液；二、发酵液在10℃时，加入与发酵液等重量的质量浓度为10％的柠檬酸钠溶液或质量浓度为10％的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白的洗脱，再加入质量浓度为1％的壳聚糖进行菌体的絮凝；三、絮凝后的发酵液使用孔径为150nm、面积为0.5m2的陶瓷膜，在跨膜压力为110KPa进行膜浓缩处理至絮凝后的发酵液的浓缩倍数达到6，得到含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物，即完成功能性益生性乳杆菌高密度培养；其中步骤一中接种量为2％；步骤一中增菌培养基由100g的脱脂乳粉，50g的胰蛋白酶水解乳清粉，45g的番茄汁、45g的麦芽汁、20g乳糖、0.60g的酵母膏或酵母粉、6.8mg的腺嘌呤和52mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至1000mL组成；步骤三中膜浓缩处理的方式为两个陶瓷膜管串联。
功能性益生性乳杆菌冻干产品的制备方法按以下步骤进行：一、按重量比1∶1.5将含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度6℃的条件下进行12h的冷冻前预冷处理，得混合物；二、将混合物置于-70℃冷冻机的冷冻盘中进行预冻，直至混合物的温度达到-45℃，保持30min，然后以5℃/30min的速率升温至-28℃，并维持此温度至真空度达到0.05MPa完成主干燥阶段，再升温至10℃并维持此温度至真空度达到0.03MPa完成解析干燥阶段，取出后用颗粒机粉碎，再用无菌铝箔纸盒包装并置于-20℃的环境中贮藏，即完成功能性益生性乳杆菌冻干产品的制备；其中步骤一中冷冻保护剂15g的脱脂乳粉、2g的甘油、1.5g的维生素C、0.8g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和10g的海藻糖加入蒸馏水并定容至1000mL组成；步骤二中混合物置于-70℃冷冻机的冷冻盘中的大小为长40cm×宽50cm×高20mm。
本实施方式中所得冻干产品，经测试其中活菌数为5.4×1010CFU/g，与酸奶发酵剂配合使用以0.005％-0.010％的量接种到灭菌脱脂乳和鲜牛奶中，在41～43℃的条件下发酵3.5h，乳凝固并产酸70°T，组织状态、风味良好，在21天酸奶的保质期内益生菌的活菌数均大于1.0×106CFU/g，可以作为优质的益生菌直投式发酵剂；此外，还可以作为辅料添加到奶粉中，在12个月的保质期内益生菌奶粉的益生乳杆菌的活菌数均大于1.0×106CFU/g。
Claims (10)
1.功能性益生性乳杆菌高密度培养，其特征在于功能性益生性乳杆菌高密度培养按以下步骤进行：一、将经过耐氧驯化的功能性益生性乳杆菌接种到发酵罐的增菌培养基中，在温度为35～37℃、pH值为6.5～6.8的条件下培养15～17h，得发酵液；二、发酵液在0～20℃时，加入与发酵液等重量的质量浓度为10％的柠檬酸钠溶液或质量浓度为10％的磷酸钠溶液对发酵液进行蛋白的洗脱，再加入质量浓度为0.2～2％的壳聚糖进行菌体的絮凝；三、絮凝后的发酵液使用孔径为100～200nm、面积为0.5m2的陶瓷膜，在跨膜压力为110KPa进行膜浓缩处理至絮凝后的发酵液的浓缩倍数达到6，得到含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物，即完成功能性益生性乳杆菌高密度培养；其中步骤一中接种量为2％；步骤一中增菌培养基由80～120g的脱脂乳粉，40～60g的胰蛋白酶水解乳清粉，30～60g的番茄汁、30～60g的麦芽汁、10～30g乳糖、0.50～0.70g的酵母膏或酵母粉、6.8～7.2mg的腺嘌呤和50～54mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至1000mL组成；步骤三中膜浓缩处理的方式为两个陶瓷膜管串联。
2.根据权利要求1所述的功能性益生性乳杆菌高密度培养，其特征在于步骤一中采用中和剂调节增菌培养基的pH值，中和剂为质量浓度为10～15％的氢氧化钠、质量浓度为10～15％的氨水或质量浓度为20％的Na2CO3；步骤一中培养15～17h的过程中需补加乳糖，乳糖补加量为所消耗的中和剂中碱性物质摩尔量的3～5倍，同时采用D301型树脂吸附培养过程中产生的钠盐。
3.根据权利要求1或2所述的功能性益生性乳杆菌高密度培养，其特征在于步骤一中在温度为36℃、pH值为6.6的条件下培养16h，得发酵液。
4.根据权利要求3所述的功能性益生性乳杆菌高密度培养，其特征在于步骤一中增菌培养基由90～110g的脱脂乳粉，45～55g的胰蛋白酶水解乳清粉，40～50g的番茄汁、40～50g的麦芽汁、15～25g乳糖、0.55～0.65g的酵母膏或酵母粉、6.9～7.1mg的腺嘌呤和51～53mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至1000mL组成。
5.根据权利要求3所述的功能性益生性乳杆菌高密度培养，其特征在于步骤一中增菌培养基由100g的脱脂乳粉，50g的胰蛋白酶水解乳清粉，45g的番茄汁、45g的麦芽汁、20g乳糖、0.60g的酵母膏或酵母粉、7mg的腺嘌呤和52mg的L-半胱氨酸盐酸盐加入蒸馏水并定容至1000mL组成。
6.根据权利要求4或5所述的功能性益生性乳杆菌高密度培养，其特征在于步骤二中加入质量浓度为0.5～1.5％的壳聚糖进行菌体的絮凝。
7.根据权利要求4或5所述的功能性益生性乳杆菌高密度培养，其特征在于步骤二中加入质量浓度为2％的壳聚糖进行菌体的絮凝。
8.制备如权利要求1所述的功能性益生性乳杆菌高密度培养的所得功能性益生性乳杆菌冻干产品的方法，其特征在于功能性益生性乳杆菌冻干产品的制备方法按以下步骤进行：一、按重量比1∶1～2将含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度0～10℃的条件下进行10～12h的冷冻前预冷处理，得混合物；二、将混合物置于-70℃冷冻机的冷冻盘中进行预冻，直至混合物的温度达到-45℃，保持30min，然后以5℃/30min的速率升温至-28℃，并维持此温度至真空度达到0.05MPa完成主干燥阶段，再升温至10℃并维持此温度至真空度达到0.03MPa完成解析干燥阶段，取出后用颗粒机粉碎，再用无菌铝箔纸盒包装并置于-20℃的环境中贮藏，即完成功能性益生性乳杆菌冻干产品的制备；其中步骤一中冷冻保护剂10～20g的脱脂乳粉、1～3g的甘油、1～2g的维生素C、0.5～1g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和3～15g的海藻糖加入蒸馏水并定容至1000mL组成；步骤二中混合物置于-70℃冷冻机的冷冻盘中的大小为长40cm×宽50cm×高20mm。
9.根据权利要求8所述的功能性益生性乳杆菌冻干产品的制备方法，其特征在于步骤一中按重量比1∶1.5将含有功能性益生性乳杆菌的膜浓缩产物与冷冻保护剂混合，在温度5℃的条件下进行11h的冷冻前预冷处理，得混合物。
10.根据权利要求8或9所述的功能性益生性乳杆菌冻干产品的制备方法，其特征在于步骤一中冷冻保护剂15g的脱脂乳粉、2g的甘油、1.5g的维生素C、0.8g的谷氨酸或甘氨酸、5g的蔗糖和8g的海藻糖加入蒸馏水并定容至1000mL组成。
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- 2010-08-30 CN CN2010102663152A patent/CN101948774A/zh active Pending
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