CN107260747B - 一种协同抗前列腺癌的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种协同抗前列腺癌的药物组合物。该药物包含活性成分和药物学上可接受的辅料，其特征在于，所述的活性成分包含多西他赛和三萜化合物，所述的三萜化合物为3α，11α‑二羟基‑羽扇豆‑20(29)‑烯‑28‑酸或3α‑羟基‑羽扇豆‑20(29)‑烯‑23，28‑二酸。由于三萜类化合物能增强前列腺癌细胞对多西他赛的敏感性和减少耐药性。两者联合用药产生了协同作用，不仅提供更多用药安全性，而且降低了多西他赛的临床使用剂量，减少大剂量使用多西他赛所产生的毒副作用，提高临床治疗安全指数，为多西他赛临床应用提供了更多的可能性。

Description

一种协同抗前列腺癌的药物组合物

技术领域

本发明属于联合药物技术领域，更具体地，涉及一种协同抗前列腺癌的药物组合物。

背景技术

前列腺癌是一个全球性的健康问题，已位居世界男性最常见的癌症的第二位，占男性癌症的。前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见肿瘤之一近年来，随着人口老龄化、生活水平及诊断技术的提高我国的发病率呈显著增长的趋势。目前治疗前列腺癌的方法主要包括根治性手术切除、放射治疗、内分泌治疗和化学治疗，但是，采用单药治疗时，虽然增加剂量可以提高疗效，但随之而来的是毒副作用的增加。并且治疗时具有组织浸润性强、易于早期转移的特点临床诊断时大多数患者已经处于进展期出现局部侵袭和远处转移手术效果不理想或者失去了手术根治的机会。

多西他赛是紫杉醇类抗肿瘤药，通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络而起抗肿瘤作用，主要用于先期化疗失败的晚期或转移性乳腺癌、使用以顺铂为主的化疗失败的晚期或转移性非小细胞肺癌等的治疗，它可通过加强微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，使细胞形成稳定的非功能性微管束，因而破坏肿瘤细胞的有丝分裂，并阻滞细胞于G2/M期，最终导致肿瘤细胞凋亡。但是经研究发现，多西他赛在进行a和P微管蛋白的过度表达、微管蛋白的突变和微管蛋白翻译后的修饰可以拮抗紫杉醇的微管稳定作用，减少肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性，并能对抗紫杉醇诱导的聚合，降低微管聚合率，从而导致耐药。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提供一种协同抗前列腺癌的药物组合物。该药物组合物通过将簕菜中两个三萜化合物分别和多西他赛进行联合用药，以前列腺中的VCap细胞作为研究对象，该药物组合物对前列腺癌细胞的细胞生存率，细胞凋亡形态，细胞迁移程度等具有显著的抑制作用，并且对可能引起抑制NF-κB通路转录活性进行检测等具有显著的抑制作用。

本发明另一目的在于提供上述协同抗前列腺癌的药物组合物的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，该药物包含活性成分和药物学上可接受的辅料，其特征在于，所述的活性成分包含多西他赛和三萜化合物，所述三萜化合物为3α，11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸或3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23，28-二酸。

优选地，所述的三萜化合物和多西他赛的摩尔比为(5000～45000)∶(0.8～3)。

进一步优选，所述的三萜化合物和多西他赛的摩尔比为(6500～30000)∶(0.9～2.5)。

更为优选地，所述的三萜化合物和多西他赛的摩尔比为10000∶1。

优选地，所述的抗前列腺癌的药物组合物为口服制剂。

更为优选地，所述的口服制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂或液剂。

上所述药物组合物在制备抗癌细胞药物中的应用。

优选地，所述癌细胞为前列腺癌细胞。

本发明的药物组合物依靠所述的三萜化合物和多西他赛作为活性成分发挥抗前列腺癌的协同作用，发明人通过大量试验对这三种组分的用量比进行了筛选，结果发现所述三萜化合物和多西他赛的摩尔比为(5000～45000)∶(0.8～3)的范围内时，其抗前列腺癌的增值效果较好，为降低多西他赛的毒副作用以及耐药性，本发明减少了该药物的用量，因此在本发明最优选的体外实施例中，三萜化合物与多西他赛的摩尔比为10000∶1。

在本发明的实施例中，所述抗抗前列腺癌的药物组合物中含有的三萜化合物和多西他赛均可以通过肠道以较快的速度吸收并发挥生物活性，因此本发明的药物组合物优选为口服制剂。药物单位制剂可以是常规的制剂工艺制成的药物学上可接受的任意常规口服制剂，如胶囊剂、片剂、颗粒剂或液剂，为使上述制剂型能够实现，需在制备的过程中加入药学上可接受的辅料，所述药物学上可接受的辅料为填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂或甜味剂。在本发明的实施例中用到填充剂为淀粉、乳糖、微晶纤维素或蔗糖中的一种，也可以使用上述填充剂的任意混合物；使用的崩解剂为淀粉、羧甲基淀粉钠或预胶化淀粉中的一种，也可使用其他已知的崩解剂如低取代羟丙纤维素或交联羧甲基纤维素钠，还可以使用上述崩解剂的任意混合物，使用的润滑剂为硬脂酸镁或二氧化硅，也可使用其他已知的中的润滑剂如十二烷基硫酸钠，还可以使用上述润滑剂的任意混合物；所述助悬剂为聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖或羟丙基甲基纤维素中的一种以上；所述粘合剂为羟丙基甲基纤维素、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮中的一种以上；所述甜味剂为糖精钠、甘草次酸、蔗糖、阿斯帕坦或甜蜜素中的一种以上。

本发明三萜化合物是簕菜的分离提取物。簕菜，学名为白簕(Acanthopanaxtrifoliatus(Linn.)Merr.)，又称鹅掌簕、三叶五加、三加皮、苦刺、刺三加，为五加科(Araliaceae)五加属(Acanthopanax)的一种攀援状灌木。簕菜是药食同源植物，我国资料对其早有记载，李时珍曰：“五加治风湿痪库，壮筋骨，其功良深”；明代《食物本草》中记载“五加，叶作蔬食，去皮肤风湿”。本发明人经过长期的基础研究从簕菜中分离到两个三萜类化合物3α，11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸和3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23，28-二酸，如图1所示，并且对其进行了基础活性的测试，结果表明，此类化合物具有抗肿瘤，抗炎，抑制ɑ-葡萄糖苷酶(专利CN104922173A)等作用。

本发明以前列腺中的VCap细胞作为研究对象，通过将这两个三萜化合物分别和多西他赛进行联合用药，对VCap细胞进行体外抗癌活性测试。结果表明，簕菜中两个三萜类化合物和多西他赛的联合使用对前列腺癌细胞的细胞生存率有非常明显的效果，很大程度上降低其生存率，使VCap细胞的细胞凋亡形态发生强烈的变化，并且使细胞迁移程度的速率显著降低，显示出联合用药对于前列腺癌VCap细胞具有显著的细胞的生长，增值等抑制作用。本发明还对可能引起抑制NF-κB通路转录活性进行测定，有望成为较为安全可靠的新型治疗前列腺癌的候选药物。其与传统的单药治疗相比具有多种优点，如可以同时靶向多种重要信号通路、克服肿瘤耐药、降低毒副作用等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明以前列腺中的VCap细胞作为研究对象，通过将这两个三萜化合物分别和多西他赛进行联合用药，对VCap细胞进行体外抗癌活性测试。结果表明，三萜类化合物和多西他赛的联合使用对前列腺癌细胞的细胞生存率有非常明显的效果，很大程度上降低其生存率，使VCap细胞的细胞凋亡形态发生强烈的变化，并且使细胞迁移程度的速率显著降低，显示出联合用药对于前列腺癌VCap细胞具有显著的细胞的生长和增值抑制作用。本发明还对可能引起抑制NF-κB通路转录活性进行测定，有望成为较为安全可靠的新型治疗前列腺癌的候选药物。

2.本发明通过将簕菜中的两个活性较强的三萜类化合物分别与抗前列腺癌一线临床药物多西他赛进行联合用药。由于其两个三萜类化合物能增强前列腺癌细胞对多西他赛的敏感性和减少其耐药性。两者联合用药产生了协同作用，不仅提供更多用药安全性，而且降低了多西他赛的临床使用剂量，减少大剂量使用多西他赛所产生的毒副作用，提高临床治疗安全指数，为多西他赛临床应用提供了更多的可能性。

3.本发明药物联用可以显著地抑制VCap-N细胞中的NF-kB的转录活性，且药物联用的作用比单药增强了20％左右，且药物连用的药效要强于单药给药产生了协同作用。

附图说明

图1是3α，11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(E12-1)(a)，3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23(b)，28-二酸(E13-1)和多西他赛(c)的化学结构式。

图2是三萜化合物E12-1、E13-1和多西他赛对VCap细胞生长的影响。

图3是三萜化合物E12-1、E13-1和多西他赛被PI染色代表性的显微照片。

图4是三萜化合物E12-1、E13-1和多西他赛对VCap细胞处理后凋亡细胞形态学比率。

图5是三萜化合物E12-1和多西他赛对VCap细胞处理后0h，5h和24h细胞划痕愈合细胞形态显微照片。

图6是三萜化合物E13-1和多西他赛对VCap细胞处理后0h，5h和24h细胞划痕愈合细胞形态显微照片。

图7是三萜化合物E12-1、E13-1和多西他赛对VCap细胞处理后三萜化合物和多西他赛对VCap细胞处理后迁移结果。

图8是三萜化合物E12-1、E13-1和多西他赛对VCap-N细胞处理后NF-κB转录活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

在下面实施例中所采用的实验仪器有Thermo Scientific Series 8000 CO₂培养箱(美国Thermo公司)；Class IIA/B³水平流净化工作台(美国Thermo公司)；MDF-382E超低温冰箱(日本Sanyo公司)；CPKR高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；Allegra X-22R冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；Locator4型液氮罐(美国Thermo公司)；Hotpack型高温消毒柜(美国Thermo公司)；移液枪(德国Eppendorf公司)；Nikon Optiphot光学显微镜(日本Nikon公司)；Nikon Eclipse TE200荧光显微镜(日本Nikon公司)；Nikon EFD-3显微镜(日本Nikon公司)；Infinite M200 PRO多功能酶标仪(奥地利TECAN公司)；Sirius单管式化学发光检测仪(德国Berthold Detection Systems公司)；ChemiDoc^TMXRS Imager成像系统(美国Bio-Rad公司)。

所采用的实验试剂有RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)：将RPMI-1640干粉(1L用)溶于约800mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，加入青霉素和链霉素混合液(终浓度：青霉素100units/mL，链霉素100μg/mL)，加入2g碳酸钠，定容至1000mL。然后加入10％胎牛血清，过滤除菌后分装到无菌血清瓶中，4℃保存备用。胎牛血清(FBS)(美国Serum SourceInternational公司)；胰蛋白酶-EDTA溶液(1×)(美国Sigma-Aldrich公司)；0.4％台盼蓝溶液(美国Cambrex Bio Science公司)；蛋白测定试剂盒(美国Bio-Rad公司)；荧光素酶检测试剂盒(美国Promega公司)；SuperSignal West Femto最高灵敏度化学发光底物(美国Thermo公司)；MTT、PI、DMSO(美国Sigma-Aldrich公司)；其他试剂均为美国Sigma公司分析纯以上等级。

实施例1

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-18000份，多西他赛1份，微晶纤维素3600份，充分混匀后，灌装胶囊1000粒。

实施例2

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-15000份，多西他赛1.5份，微晶纤维素2850份，充分混匀后，灌装胶囊100粒。

实施例3

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-110000份，多西他赛1份，乳糖7600份，混合均匀后，加入5000份淀粉制成的10％的淀粉浆，进行喷雾制粒。再加入硬脂酸镁800份和PVP 3000份，混合均匀后，压片制成2000片。

实施例4

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-15850份，多西他赛1份，乳糖400份，混合均匀后，加入7300份淀粉制成的10％的淀粉浆，进行喷雾制粒。再加入硬脂酸镁100份和PVP5150份，混合均匀后，压片制成5000片。

实施例5

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-18000份，多西他赛1.5份，淀粉9100份，羧甲基纤维素6200份，真空干燥，混合均匀，过100目筛，制成颗粒剂。

实施例6

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-145000份，多西他赛0.8份，淀粉9800份，羧甲基纤维素3500份，真空干燥，混合均匀，过80目筛，制成颗粒剂。

实施例7

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-145000份，多西他赛3份，二氧化硅4000份，淀粉浆3000份，蔗糖2000份，混匀，直至均匀的液体，过滤灭菌，分装，制成口服液剂。

实施例8

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-15000份，多西他赛3份，二氧化硅8500份，淀粉浆800份，蔗糖7000份，混匀，直至均匀的液体，过滤灭菌，分装，制成口服液剂。

实施例9

一种具有协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-15000份，多西他赛0.8份，羧甲基淀粉钠6400份，预胶化淀粉5550份，混匀，过120目筛，制粒，干燥，整粒，加入8500份硬脂酸镁混合，压片制成5000粒。

实施例10

一种具有协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E12-16500份，多西他赛2.5份，羧甲基淀粉钠5200份，预胶化淀粉7300份，混匀，过60目筛，制粒，干燥，整粒，加入4600份硬脂酸镁混合，压片制成5000粒。

实施例11

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-16500份，多西他赛0.9份，预胶化淀粉500份，乳糖6800份，混合均匀，制粒，干燥，加入二氧化硅7500份作为润滑剂，再次混匀，过120目筛，填充，制成100粒胶囊。

实施例12

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-130000份，多西他赛0.9份，预胶化淀粉4200份，乳糖7500份，混合均匀，制粒，干燥，加入二氧化硅400份作为润滑剂，再次混匀，过60目筛，填充，制成5000粒胶囊。

实施例13

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-130000份，多西他赛2.5份，二氧化硅6000份，淀粉浆800份，蔗糖8000份，混匀，直至均匀的液体，过滤灭菌，分装，制成口服液。

实施例14

一种协同抗前列腺癌的药物组合物，按摩尔计量包含从簕菜醇提物中分离出的三萜化合物E13-16000份，多西他赛2.5份，二氧化硅8800份，淀粉浆3000份，蔗糖7000份，混匀，直至均匀的液体，过滤灭菌，分装，制成口服液。

上述实施例1-14中添加的药物学上可接受的辅料可有效防潮，同时也利于药物成型。

实施例15MTT比色法

MTT是一种能接收H+的黄色染料。在活细胞线粒体呼吸链中，琥珀酸脱氢酶和细胞色素C可使MTT的四氮唑环开裂，生成蓝紫色的甲瓒结晶，而死细胞中不含这种脱氢酶。甲瓒结晶的生成量与活细胞数成正比，可通过检测甲瓒结晶的量来评价药物对细胞增殖的影响。VCap细胞以接种浓度1×10⁵个/mL的浓度接种于96孔板(100μL/孔)，同时设置空白调零孔(培养基铺板孔)和对照孔(二甲基亚砜DMSO处理孔)，5％CO₂，37℃培养过夜，加入浓度梯度的化合物以及多西他赛进行处理，每个样品设4个复孔，5％CO₂，37℃孵育72h后小心吸出培养液，每孔加入100μL培养基配制的MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)；继续培养1h后，小心吸去孔内培养液。每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；用酶标仪测量570nm处各孔的吸光值，用式(1)计算实施例1-14中药物中含有的三萜化合物和多西他赛对VCap细胞生长的抑制率，结果如表1所示。

细胞生长抑制率(％)＝(1-A_样品组/A_对照组)×100％ 式(1)

表1三萜化合物和多西他赛对VCap细胞的增值抑制作用(MTT法)

	E12-1	E13-1	多西他赛Docetaxel
				IC<sub>50</sub>	80.16±6.58μM	61.18±3.79μM	15.71±1.35nM

采用MTT法分别测定了萜类化合物3α，11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(E12-1)，3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23，28-二酸(E13-1)和多西他赛对VCap细胞增殖的抑制活性。结果表明，所有的化合物具有较强的抑制前列腺癌细胞生长的活性，其IC₅₀分别为：80.16，61.17μM和15.71nM。

实施例16台盼蓝拒染法

台盼蓝染色检测原理：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡，这与中性红作用相反。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。VCap细胞以接种浓度0.2×10⁵个/mL的浓度接种于直径35mm培养皿(2mL/培养皿)(6孔板，2mL/孔)，5％CO₂，37℃培养过夜。加入溶解于二甲基亚砜(DMSO)中的高、中、低浓度的化合物以及多西他赛，并且将其进行联合给药，对VCap细胞进行处理72h后，使用台盼蓝染色的方法测定化合物对细胞生长和死亡的影响。具体方法为：使用胰酶消化贴壁生长的细胞，将细胞悬液80μL与0.4％的台盼蓝溶液20μL均匀混合，静置2min后，使用显微镜观察和计数。视野下，光亮透明细胞计为活细胞，台盼蓝染为蓝色细胞计为死细胞。每次实验二甲基亚砜浓度不超过0.1％。结果如表2所示。

表2三萜化合物和多西他赛对VCap细胞存活率的影响

用台盼蓝拒染法测试了化合物E12-1，E13-1与多西他赛对VCap细胞的致死率，选择药物联用所需的浓度根据其IC₅₀，选择细胞致死率为20％时药物的浓度值，确定E12-1，E13-1所需浓度为20μM，多西他赛浓度为2nM。确定给药浓度后，对其进行药物联用，结果如图1所示，联合用药对细胞的致死率比单药给药的致死率效果好。单药时，E12-1，E13-1，绿原酸和乌苏酸和多西他赛细胞的生存率分别是80.3％，74.1％和70.9％。而实施例1-14中药物中含有的三萜化合物和多西他赛联用后，VCap细胞的生存率分别仅为46.8％和48.5％。细胞生存率通过药物联合后下降了35％-40％左右。由此证明，在同等浓度下联合用药可以更有效的抑制VCap细胞的生长，发生了协同增效的作用。

实施例17细胞凋亡检测

将台盼蓝拒染实验中联用化合物处理72h后的VCap细胞悬浮液，用细胞离心涂片器制成细胞涂片，经丙酮/甲醇(1:1)溶液固定10min后，用碘化丙啶(PI)PBS溶液(10μg/mL)染色，使用荧光显微镜对其进行观察和形态分析，DNA呈红色荧光。细胞凋亡是由经典的形态特征确定，包括核固缩，细胞收缩，和凋亡小体的形成。观察时细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。每个样品于显微镜下随机观察数个视野，总共不少于200个细胞，计数每个视野(×200)中包含的凋亡细胞的百分比。

实验通过单药和实施例1-14中药物中含有的三萜化合物和多西他赛联用进行对比，对VCap细胞进行72h处理后，经固定并通过PI染色后，使用荧光显微镜对其进行观察。图3是三萜化合物和多西他赛被PI染色代表性的显微照片。其中，(A)为以DMSO为阳性对照，作用于细胞后被PI染色后的显微照片，(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分别为E12-1、E13-1和多西他赛单药给药和联合用药后，细胞被PI染色后的显微照片。从图3可知，凋亡细胞细胞核呈红色(图3中灰色部分)致密浓染，或呈红色碎块状致密浓染，细胞核部分发生异变。联合药物的细胞凋亡情况较单药较为严重。图4是三萜化合物和多西他赛对VCap细胞处理后凋亡细胞形态学比率。从图4可知，单药时，E12-1、E13-1和多西他赛细胞的凋亡率分别是18.6％，21.1％和19.9％。药物联合时，细胞凋亡率大幅度提高，E12-1，E13-1分别与多西他赛联用，VCap细胞凋亡率分别提高到36.5％和35.6％。结果说明，E12-1和E13-1分别与多西他赛药物联用促进细胞凋亡的作用比单药给药的效果提高，使细胞凋亡增加了15％～18％。进一步说明，E12-1和E13-1分别与多西他赛药物联用的效果强于单药给药。

实施例18细胞迁移实验

VCap细胞以接种浓度4×10⁶个/mL的浓度接种于直径35mm培养皿(2mL/培养皿)(6孔板，2mL/孔)，5％CO₂，37℃培养36-48h。观察培养皿的细胞融合度达到90％-100％时，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，加入溶解于DMSO中的化合物以及多西他赛，并且将其进行联合给药，对VCap细胞进行处理后，观察0h，5h和24h时，细胞的愈合情况。具体方法为：用微量枪头在培养皿中细胞生长的中央区域划线，确保划线部位粗细均匀，用PBS洗两遍细胞，去除中央部分的细胞和部分漂浮细胞，换成无血清培养基对细胞进行继续培养，根据设定好的药物浓度加入培养基中。在药物加入后，分别于0h，5h和24h时，观察并拍照，记录下细胞形态和其迁移情况。

采用细胞划痕实验，可以测定E12-1和E13-1分别与多西他赛药物对VCap细胞的愈合能力以及细胞运动的形态，实验通过单药和药物联用进行对比，使VCap细胞生长融合到90％-100％后，对其进行划痕处理。图5和图6分别是三萜化合物E12-1和E13-1对VCap细胞处理后0h，5h和24h细胞划痕愈合细胞形态显微照片。从图5和6可知，通过不同时间段的跟踪观察，细胞的形态与其愈合程度，分析药物对细胞的愈合能力。结果表明，随着细胞生长时间的增加，被划伤的细胞逐渐恢复原来的形态，一些不能恢复的细胞不断死去，细胞的愈合程度不断增强，划痕面积逐渐变小。但是联合用药组的细胞，愈合能力明显比单药给药的愈合能力弱。图7是三萜化合物E12-1、E13-1和多西他赛对VCap细胞处理后三萜化合物和多西他赛对VCap细胞处理后迁移结果。从图7可知，E12-1和E13-1分别与多西他赛药物联合后对VCap细胞的愈合能力明显低于单药给药，其愈合能力较单药给药降低了15％-20％左右，即药物联用的效果更能使细胞无法正常生长。

实施例19荧光素酶报告基因法

荧光素酶报告基因法是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。将荧光素酶表达序列插入到靶启动子的特定片段后方，如果目标转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与其靶启动子片段有作用。本发明使用VCap-N细胞为实验对象。VCap-N细胞是荧光素酶质粒稳定转染VCap细胞后得到的单个稳定克隆，通过检测报告基因荧光素酶活性间接反应转录因子NF-κB的活性。以0.5×10⁵个/mL的浓度接种在12孔板中(1mL/孔)，5％CO₂，37℃培养过夜。然后加入E12-1、E13-1和多西他赛单药以及E12-1和E13-1分别与多西他赛药物连用，与细胞共同孵育24小时。然后吸弃所有溶液，使用冰浴的PBS清洗细胞2次后，加入1×细胞裂解缓冲液(0.1mL/次，两次)并收集细胞裂解液。-80℃冻存样品过夜，然后立即解冻，涡旋样品30秒，在4℃离心(12，000rpm)5min。采用Bio-rad蛋白定量试剂盒测定裂解液中蛋白浓度。

蛋白浓度测定：在1mL反应液A中加入20μL反应液S配制反应液A’；以PBS配制牛血清白蛋白BSA 16mg/mL，并依次用水稀释成0.1，0.2，0.4，0.8，1.6mg/mL系列BSA标准溶液；各取5μL蛋白样品(如果蛋白浓度过高，进行适当稀释)和BSA标准溶液于96孔板中，依次加入25μL反应液A’，200μL反应液B，混匀，室温振摇反应15min；于波长650nm处读取吸光度值，绘制标准曲线。根据标准曲线计算待测蛋白质样品浓度。

取上清液5μL与25μL的底物混合后立即用Sirius单管式化学发光检测仪测定发光强度。每个样品设定3个复孔，每孔测定5次，取平均值。荧光素酶活性用发光强度与蛋白浓度的比值表示，并且换算为空白对照组(DMSO处理)的百分比表示。

研究证明NF-kB信号通路在前列腺癌的生长、肿瘤形成、血管生成和转移的过程中都发挥着重要作用，在很多前列腺癌中都存在NF-kB的组成性活化。图8是三萜化合物和多西他赛对VCap细胞处理后三萜化合物和多西他赛对VCap-N细胞处理后核转录因子NF-kB活性表达结果。结果从表3和图8可知，单药时，E12-1、E13-1和多西他赛细胞抑制VCap-N细胞中的NF-kB的转录活性分别为57.8％，74.5％和83.6％，而药物联合时，药物对VCap-N细胞中核转录因子NF-kB的抑制作用大幅度提高，E12-1，E13-1分别与多西他赛联用，NF-kB的转录活性结果分别降低为39.6％和53.4％。结果显示，E12-1和E13-1分别与多西他赛药物联用可以显著地抑制VCap-N细胞中的NF-kB的转录活性，且药物联用的作用比单药增强了20％左右，因此，E12-1和E13-1分别与多西他赛药物联用的抗肿瘤作用可能与抑制NF-κB转录活性有关，并且药物连用的药效要强于单药给药产生了协同作用。

表3三萜化合物和多西他赛对VCap-N细胞荧光素酶活性影响

实施例20统计学分析

对实验结果进行方差分析，结果用means±SD的形式表示。样品处理组与对照组间数据差异性分析均采用Student's t检验进行。P<0.05(*)和P<0.001(**)分别代表差异显著和差异极显著。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种协同抗前列腺癌的药物组合物，该药物包含活性成分和药物学上可接受的辅料，其特征在于，所述的活性成分包含多西他赛和三萜化合物，所述的三萜化合物为3α，11α-二羟基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸或3α-羟基-羽扇豆-20(29)-烯-23，28-二酸；所述的三萜化合物和多西他赛的摩尔比为（5000~45000）：（0.8~3）。

2.根据权利要求1中所述协同抗前列腺癌的药物组合物，其特征在于，所述的三萜化合物和多西他赛的摩尔比为（6500~30000）：（0.9~2.5）。

3.根据权利要求2中所述协同抗前列腺癌的药物组合物，其特征在于，所述的三萜化合物和多西他赛的摩尔比为10000：1。

4.根据权利要求1中所述协同抗前列腺癌的药物组合物，其特征在于，所述的抗前列腺癌的药物组合物为口服制剂。

5.根据权利要求4中所述协同抗前列腺癌的药物组合物，其特征在于，所述的口服制剂为胶囊剂、片剂或颗粒剂。

6.权利要求1-5任一项所述药物组合物在制备抗前列腺癌细胞药物中的应用。

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