CN102920759A

CN102920759A - 一种簕菜提取物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102920759A
Application number: CN2012102747886A
Authority: CN
Inventors: 张焜; 胡瑞连; 王华倩; 艾伦·康尼; 杜志云; 郑希; 李晨悦; 郑俊霞; 卢宇靖; 吴盼盼; 黄华容; 方岩雄; 赵肃清; 汪舰; 曾华强
Original assignee: Guangdong University of Technology; Wuyi University; Perfect China Co Ltd
Current assignee: Guangdong University of Technology; Wuyi University; Perfect China Co Ltd
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2032-08-03
Also published as: CN102920759B

Abstract

本发明提供了一种簕菜提取物及其制备方法和应用，首先称取簕菜全草，用乙醇浸泡，经旋转蒸发浓缩后得到水溶液，然后分别用油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取水溶液；萃取液经减压蒸馏后得到膏体，即得到石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物，水溶物；通过抗自由基氧化实验，巨噬细胞生长实验、NF-kB核转录因子的抑制实验和Erk1/2的激活作用实验，证实簕菜提取物具有抗氧化和抗炎能力，添加了簕菜及其提取物的治疗炎症的药物或抗氧化的化妆品或食品组合物具有抗炎和抗氧化作用，而可用于防治炎症或衰老的化妆品、药物、植物性饮料及保健食品。

Description

一种簕菜提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种簕菜提取物及其制备方法和应用。

背景技术

簕菜（Acanthopanan trifoliatus (L.) Merr）又称白簕、苦刺、鹅掌霸、三叶五加、三加皮，为五加科攀援状灌木，主要分布于我国云南、四川、广东等地区，印度东北部至印度支那、日本和菲律宾也有分布。簕菜自古就是药食同源的地方特产，其使用具有悠久的历史。李时珍曰：“五加治风湿痪库，壮筋骨，其功良深”。明代《食物本草》中记有“五加，叶作蔬食，去皮肤风湿”。据《广东药用植物简编》（吴修仁编）记载，簕菜根、茎、叶均可入药，其辛、微苦、涩、凉，气微香。根，祛风除湿、散痕、止痛。叶，疏风，消肿，止痒，有舒筋活血、消肿解毒之功效。据《中国高等植物图鉴》，簕菜味苦、辛、凉，具有清热解毒、祛风利湿、舒筋活血、止咳平喘之功效。在广东恩平等地，簕菜因其色泽翠绿、口感脆嫩、品味清香、苦中带甘，可泡茶、熬汤、清炒，且具有清热除湿降火等作用而深受当地人们的喜爱。

国内外有研究者对簕菜进行了初步研究与开发。研究发现簕菜叶中含有大量的萜烯、萜醇类化合物以及少量的长链脂肪族和芳香族化合物，推测其应具有明显的镇咳、祛痰、抗真菌、抗炎和祛痛等作用，但至今未见有系统深入研究和开发应用。

发明内容

本发明的目的在于提供来源于植物，用于炎症治疗或抗氧化的化妆品、药物和保健食品。

本发明以五加科植物簕菜（Acanthopanan trifoliatus (L.) Merr）为原料。

本发明制备簕菜提取物能有效清除各种自由基（如超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢）。

本发明制备簕菜提取物能抑制炎症细胞巨噬细胞的生长，抑制核转录因子NF-κB活性，降低小鼠巨噬细胞RAW264.7中Erk1/2的活化程度，从而有效地减轻或抑制炎症。

本发明提供了一种簕菜提取物的制备方法，其具体步骤如下：

1）称取自然干燥的簕菜1000g粉碎，过60目筛，取100g置于5L 圆底烧瓶中，加70wt%乙醇溶液2000mL加热至沸腾后保持2h，再用纱布过滤，取滤液，重复3 次；

2）将上述提取液减压蒸干，称重，加适量蒸馏水，超声提取，冷冻干燥，得醇提物；

3）在醇提物中加入质量比1:10的蒸馏水溶解，加入等体积的石油醚，摇匀，在分液漏斗中静置1h，得石油醚层和水层，分别萃取三次，收集石油醚层萃取物；继续按照1:1的体积比依次加入乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取，分液后取上层溶液，重复3 次；收集水层物、乙酸乙酯层萃取物和正丁醇层萃取物。

本发明提供的一种簕菜提取物，采用上述的制备方法制备而得。

本发明提供的一种用于制备治疗炎症的药物或抗氧化的化妆品组合物，其含所述的簕菜提取物。

本发明提供的一种用于制备防治炎症药物或抗氧化的食品组合物，其含有所述的簕菜提取物。

本发明提供的一种用于治疗炎症的药物或药物组合物，其含有所述的簕菜提取物，以及一种或多种在药学上可接受的辅助剂。

所述的治疗炎症的药物或药物组合物，包括片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。

上述簕菜的石油醚萃取物在制备抗炎抗氧化剂中的用途。

上述簕菜的乙酸乙酯萃取物在制备抗炎抗氧化剂中的用途。

一种用于抗炎抗氧化的饮料、化妆品、药物或保健食品，其中含有簕菜及其提取物，以及药学上可接受的辅助剂。

上述用于抗炎抗氧化的饮料、化妆品、药物或保健食品，其中含有簕菜石油醚萃取物，以及药学上可接受的辅助剂。

上述用于抗炎抗氧化的饮料、化妆品、药物或保健食品，其中含有簕菜乙酸乙酯萃取物，以及药学上可接受的辅助剂。

所述的抗炎抗氧化的饮料、化妆品、药物或保健食品是制成片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。

本发明的有益效果是：

通过抗自由基氧化以及炎性因子实验验证簕菜及其提取物具有抗炎抗氧化能力。其中簕菜的石油醚及乙酸乙酯萃取物有很强的抗炎抗氧化能力。

附图说明

图1.簕菜提取物对RAW264.7细胞NK-κB转录活性的影响。

图2.簕菜提取物对Erk1 / 2活化的抑制作用。

上述图中：

C：对照组；WE：水提物；EE：醇提物；PEL：石油醚部分；EAL：乙酸乙酯部分：NBL:正丁醇部分；WL：水溶物；CUR：姜黄素。

磷酸化丝裂原活蛋白激酶1即Phospho-Erk1；

磷酸化丝裂原活蛋白激酶2即Phospho-Erk2；

β肌动蛋白即β-actin。

具体实施方式

本发明是通过以下方案实现：

实施例1：簕菜提取物的制备

提取：首先称取自然干燥的簕菜1000g粉碎，过60目筛，取100g置于5L 圆底烧瓶中，加70%乙醇溶液2000mL加热至沸腾后保持2h，再用纱布过滤，取滤液，重复3 次；将上述提取液减压蒸干，称重，加适量蒸馏水，超声提取，冷冻干燥，得醇提物；在醇提物中加入质量比1:10的蒸馏水溶解，加入等体积的石油醚，摇匀，在分液漏斗中静置1h，得石油醚层和水层，分别萃取三次，收集石油醚层萃取物；继续按照1:1的体积比依次加入乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取，分液后取上层溶液，重复3 次；收集水层物、乙酸乙酯层萃取物和正丁醇层萃取物。得到石油醚萃取物1.1g，乙酸乙酯萃取物7.66g，正丁醇萃取物7.43g，水溶物18.05g。

实施例2：DPPH法测定簕菜提取物抗氧化活性

使用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）测定簕菜提取物的抗氧化活性。DPPH是一种比较稳定的脂性自由基，其N上有一个游离电子，其乙醇溶液呈紫色，在517nm处有最大的吸收峰。加入簕菜提取物以后，DPPH捕捉一个电子与游离电子配对，紫色褪去，变为无色物质，在517nm处的吸收消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系。依此原理用分光光度计检测DPPH自由基与簕菜提取物反应后吸光值的变化，可检定试样提供氢原子、清除自由基抗氧化的能力。方法：称取0.02g的DPPH晶体，用无水乙醇溶解，定容至500ml，配制成0.04mg/L溶液，避光保存。分别称取各种簕菜提取物样品，配制成0.5mg/ml的样品溶液。使用1.5ml的离心管作为反应容器，参比管中加900μl的DPPH·溶液和100μl的无水乙醇，以1ml的无水乙醇做为空白对比。样品管中分别按5μl、10μl、20μl、40μl、80μl的梯度体积加入样品溶液和900μl的DPPH·溶液，再加无水乙醇使总体积为1ml。4℃恒温反应30min。用紫外可见分光光度计测得参比管的吸光度为AC，样品管的吸光度为AS，通过公式计算其清除率，并计算其IC₅₀值（IC₅₀值指清除率达到50%时对应的样品浓度）。簕菜提取物的清除效果如表1所示。

表1各组分抗氧化活性测试结果（DPPH法）

	醇提物	水提物	石油醚部分	乙酸乙酯部分	正丁醇部分	水溶物
							IC₅₀（μg/mL）	28.8	34.5	15.8	17.3	19.1	35.4

实施例3：ABTS法测定簕菜提取物抗氧化活性

ABTS法测定总抗氧化能力的原理是，ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS·+，在抗氧化物存在时ABTS·+的产生会被抑制，在734nm或405nm测定ABTS·+的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。方法：称取0.0192g的ABTS溶解在5ml的无水乙醇中，配制成浓度为7mmol/L的溶液。称取0.0378g的过硫酸钾粉末，溶解在1ml的蒸馏水中，配制成浓度为140mmol/L的溶液。分别取5ml的7mmol/L的ABTS+溶液和88μl的140mmol/L的过硫酸钾溶液混合，静置12h，配制成ABTS+ 自由基储备液。将该溶液避光条件下保存，使用前，用无水乙醇稀释成工作液，使其在734nm波长下的吸光度为0.70±0.02（稀释比例大概为1︰100）。使用1.5ml的离心管作为反应容器，参比管中加900μl的ABST·溶液和100μl的无水乙醇，以1ml的无水乙醇做对比。样品管中分别按5μl、10μl、20μl、40μl、80μl的体积梯度加入样品溶液和900μl的ABST·溶液，再加无水乙醇使总体积为1ml。4℃恒温反应30min。用紫外可见分光光度计测得参比管的吸光度为AC，样品管的吸光度为AS，通过公式计算其清除率，并计算其IC₅₀值。簕菜提取物的抗氧化活性测定结果如表2所示。

表2 各组分抗氧化活性测试结果（ABTS法）

	醇提物	水提物	石油醚部分	乙酸乙酯部分	正丁醇部分	水溶物
							IC₅₀（μg/mL）	15.7	16.1	7.7	8.6	9.7	18.1

实施例4：簕菜提取物对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的生长影响作用

方法：小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞以0.1×10⁵个/ ml的浓度接种于35mm培养皿中，生长24小时后使用不同的簕菜提取物（40 μg/ml）作用96小时，台盼蓝染色法测定存活和死亡细胞数。结果如表3所示，簕菜提取物能抑制RAW264.7细胞的生长，其中石油醚层和乙酸乙酯层有较强的抑制作用。

表3 不同簕菜提取物对巨噬细胞RAW264.7细胞生长的影响作用

	对照组	石油醚部分	乙酸乙酯部分	正丁醇部分	水溶物
						活细胞数^*	100	21.1	41.8	86.7	77.4
死细胞数^*	0.9	26.0	11.1	4.0	2.5

^*与对照组比较的百分数

实施例5：簕菜提取物对小鼠巨噬细胞RAW264.7 中NF-κB转录活性的影响作用

方法：使用荧光素酶报告基因表达分析法检测簕菜提取物对小鼠巨噬细胞RAW264.7 中NF-κB转录活性的影响作用。RAW264.7细胞以0.2×10⁵个/ml的浓度接种在35mm培养皿中，生长24小时后用不同的簕菜提取物（80 g/ml）与细胞共孵育24小时，使用荧光素酶活性测定方法测定NF-κB的转录活性。结果如图1所示，图中所列为三次实验平均值±SE。结果表明，簕菜提取物会降低小鼠巨噬细胞RAW264.7中NF-κB的转录活性。其中石油醚层，乙酸乙酯层和正丁醇层比其他成分抑制活性更强（C：对照组；WE：水提物；EE：醇提物；PEL：石油醚部分；EAL：乙酸乙酯部分：NBL:正丁醇部分；WL：水溶物）。

实施例6：簕菜提取物对小鼠巨噬细胞RAW264.7中Erk1/2的激活作用

Erk1/2的活化在炎症发生中起着重要作用。使用Western blot分析方法对RAW264.7细胞中Erk1/2的影响作用进行了分析。RAW264.7细胞以1×10⁵个/ ml的浓度接种，生长24小时后使用不同簕菜提取物（80 g/ml）与细胞共孵育。使用抗磷酸化Erk1/2抗体进行Western Blot测定Erk1/2。以β-肌动蛋白作为对照组。结果如图2所示，簕菜提取物能降低RAW264.7细胞中的磷酸化Erk1/2的表达水平（C：对照组；CUR：姜黄素；WE：水提物；EE：醇提物；PEL：石油醚部分；EAL：乙酸乙酯部分：NBL:正丁醇部分；WL：水溶物）。

Claims

1.一种簕菜提取物的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

1）称取自然干燥的簕菜1000g粉碎，过60目筛，取100g置于5L 圆底烧瓶中，加70%乙醇溶液2000mL加热至沸腾后保持2h，再用纱布过滤，取滤液，重复3 次；

2.一种簕菜提取物，其特征在于：采用权利要求1所述的制备方法制备而得。

3.权利要求2所述的簕菜提取物在制备治疗炎症的药物或抗氧化的化妆品组合物中的应用。

4.权利要求2所述的簕菜提取物在制备防治炎症药物或抗氧化的食品组合物中的应用。

5.一种治疗炎症的药物或防治炎症药物，其含有权利要求2所述的簕菜提取物，以及一种或多种在药学上可接受的辅助剂。

6.权利要求5所述的治疗炎症的药物或药物组合物，其特征在于所述的药物或药物组合物包括片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。