CN102920994B - 一种含动物骨多肽的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种骨多肽制品，具体讲，涉及一种含动物骨多肽的药物组合物。所述的药物组合物的组成为：由猪骨、牛骨和鹿骨中提取的多肽注射剂原液100重量份，三氯叔丁醇0.1～5重量份，磷酸二氢钠0.5～5重量份。本发明的含动物骨多肽的药物组合物的稳定性好，高分子物质含量极低，安全性高，非常适合于临床应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种骨多肽制品，具体讲，涉及一种含动物骨多肽的药物组合物。
背景技术
从动物骨中提取的提取物，其主要成分为小分子多肽类物质，是由胶原蛋白分解而来的小分子肽类混合物，具有调节骨代谢、刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成，以及调节钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防止骨质疏松的作用，临床上主要用于促进骨折愈合。其中，多肽提取物可通过补充和增加各种成骨因子，直接作用于成骨软骨及破骨细胞，促进骨与软骨基质的合成，加速损伤愈合与修复；同时，动物骨中的多肽提取物还可以促进体内生长激素、促甲状腺激素、甲状腺激素的分泌，同时全面促进人体代谢、间接调节骨与软骨的生长代谢，最终促进骨质形成，提高骨愈合质量。
现有技术中公开针对骨多肽注射剂的报道和研究。
专利ZL03111084.3骨多肽氯化钠注射液及其制备工艺，公开了一种骨多肽氯化钠注射剂，该产品由骨多肽溶液、氯化钠和注射用水构成，其制备工艺包括以下过程：取胎牛四肢骨，加纯水于100～120℃热压提取两次，每次0.5～2小时，提取液过滤，用HCI调pH值3.0~5.5静置15～24小时，离心，取上清液用NaOH调pH值8.0～10.0，在-10℃～-25℃冷冻24小时以上，取出融化，离心，取上清液，用HCI调pH值至6.5～7.5，加热至70～100℃，离心，取上清液，用分子量5000～10000膜超滤，收集超滤液，制得骨多肽溶液；在浓度为3％的氯化钠溶液中加入0.05～2％g/m1的活性炭，煮沸5～30分钟，过滤脱炭，冷却至室温，0.45um微孔滤膜过滤，加入处方量的所述的超滤液，调pH值6.5～7.5，用0.22um微孔滤膜除菌，于100～115C℃灭菌30分钟。该专利采用了高压的提取方法会对提取物的生物活性造成影响。
专利ZL200510076912.8公开了一种新骨多肽注射液制备方法及产品，制备方法为：1)将哺乳动物骨用盐水热压煮提一次或多次，离心过滤，合并煮提液，在低温下放置1～40小时，将提取液温热后离心过滤，收集滤液备用；2)将滤液真空浓缩后加入乙醇，静置沉淀，吸出上层醇液，定容回收乙醇，得水提液；3)将水提液加等体积蒸馏水，依次通过弱酸性阳离子树脂柱、弱碱性阴离子树脂柱、珠状壳聚糖柱和壳聚糖改性活性炭柱，去杂纯化，得纯净稀药液；4)将纯净稀药液浓缩后，加压过微孔滤膜，将滤液灌装、熔封、热压灭菌，或将所得药液通过冷冻干燥，得到冻干粉针剂。该方法制备工艺复杂，需要采用多种提取柱子，成本高，不适用于大规模的工业化生产。
专利ZL201110110502中公开了一种骨多肽组合物制剂及制备方法，该专利中的骨多肽组合物包括：骨多肽化合物A 8～10重量份、骨多肽化合物B 5～8重量份、骨多肽化合物C5～8重量份、骨多肽化合物D 4.5～7.5重量份、骨多肽化合物E 3～6重量份、游离氨基酸16～22重量份、核糖0.3～5.4重量份、微量元素0.04～0.12重量份、游离脂肪酸0～0.01重量份；1)取健康新鲜冷冻的哺乳动物的四肢骨，洗净，压碎；2).压碎的四肢骨用骨泥机磨成骨泥，放入提取罐中，加3～6倍量水，80～100℃保温搅拌1～2小时，取上清液储存；将得到的骨渣加入2～4倍量水，80～100℃保温搅拌1～2小时，取上清液；合并二次得到的上清液50~60℃减压浓缩至原料重；3).将步骤2中得到的溶液于-5～0℃条件下，放置12～24小时,除去上层脂肪；4).溶液用盐酸调pH值4.5～5.5，加热煮沸15～30min，过滤，冷却后，于-5～0℃条件下放置12～24h，去除上层脂肪后低温离心；5).酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值7.5～9.5，加热煮沸15～30min，过滤，冷却后，于-5～0℃条件下放置12～24h，去除上层脂肪后低温离心；6).溶液用盐酸调至中性，用10000分子量的超滤器超滤，超滤液50～60℃减压浓缩至规定体积；7).溶液用盐酸调pH值4.5～5.0，按溶液量的0.1%加入药用活性炭，加热至100℃搅拌吸附30min，冷却降温至30～35℃，用0.22μm微孔滤膜过滤得精滤液；8).精滤液用氢氧化钠溶液调pH6.5～7.5，用6000道尔顿的超滤器超滤，得超滤液；9).超滤液50～60℃减压干燥，得骨多肽组合物。该制备工艺需要进行多次离心、浓缩等操作，步骤繁琐，不利于工业化生产，并且对收率会造成一定的影响。
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种动物骨多肽注射剂，该骨多肽注射剂中不仅大分子物质含量低，游离脂肪酸含量低，并且生物活性高，其制备方法操作简单，适用于工业化生产，并且产率高，可使企业获得较高的经济收益。
发明内容
本发明的发明目的在于提出一种动物骨多肽的药物组合物。
本发明涉及一种含动物骨多肽的药物组合物，所述的药物组合物的组成为：由猪骨、牛骨和鹿骨中提取的骨多肽注射剂原液100重量份，三氯叔丁醇0.1～5重量份，磷酸二氢钠0.5～5重量份；优选为：由猪骨、牛骨和鹿骨中提取的多肽注射剂原液100重量份，三氯叔丁醇0.5～2.5重量份，磷酸二氢钠1～4重量份。
本发明的第一优选技术方案为：所述的药物组合物的原料猪骨、牛骨和鹿骨的重量比为1～4：1～2：1～3；优选1～2：1：1～2。
本发明的第二优选技术方案为：所述骨多肽注射原液的制备方法包括以下步骤：
1.按比例称取健康新鲜冷冻的猪骨、牛骨和鹿骨的四肢骨，洗净，压碎；
2.压碎的四肢骨研磨成直径为2～10mm的骨渣颗粒，放入提取罐中，加1～2倍量水，采用频率为20～25kHz的超声波处理0.5～2小时，超声处理完毕后90～100℃保温搅拌1～3小时，取上清液；再将骨渣颗粒加入1～2倍量的水，采用频率为25～35kHz的超声波处理0.5～1小时，超声处理完毕后90～100℃保温搅拌1～3小时，取上清液；
3.合并步骤2中两次得到的上清液，减压浓缩至原体积的1/4～1/2，然后在-15～-25℃条件下冻存，去除上层脂肪；
4.将冻存3～7天的骨渣提取物解冻，取上清液；
5.溶液用盐酸调pH值5.0～5.5，90～100℃保温搅拌1～3小时，过滤，降温至0～1℃，再次过滤；
6.酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值8.0～8.5，90～100℃保温搅拌1～3小时，过滤，降温至0～1℃，再次过滤；
7.溶液用盐酸调pH值6.5～7.5，用5000～8000分子量的超滤器超滤，收集超滤液，得到骨多肽溶液；
8.将制备得到的骨多肽溶液按溶液质量的0.02～0.05%加入药用活性炭，加热至70~75℃搅拌吸附30min，用0.45μm微孔滤膜过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤除菌得到骨多肽注射剂原液，按照比例加入三氯叔丁醇和磷酸二氢钠搅拌均匀后，再用0.22μm微孔滤膜过滤一遍，得到含动物骨多肽的药物组合物。
本发明的第三优选技术方案为：在步骤2中，超声功率为600～800W，超声发出时间1～2秒，间歇2～3秒。
本发明的第四优选技术方案为：在步骤2中，第一次超声波处理的时间为45～90分钟，优选45～60分钟。
本发明的第五优选技术方案为：在步骤2中，第二次超声波处理的时间为30～60分钟，优选30～45分钟。
本发明的第六优选技术方案为：在步骤4中，将冻存的骨渣提取物置于15～65℃的条件下解冻，优选40～60℃。
本发明的第七优选技术方案为：在步骤4中，冻存的骨渣提取物的升温速度为0.1～0.5℃/min，优选0.2～0.4℃/min。
本发明的第八优选技术方案为：所述含动物骨多肽的药物组合物的剂型为注射液或冻干粉。
本发明的第九优选技术方案为：所述含动物骨多肽的注射液为将所述的含动物骨多肽的药物组合物用注射用水稀释至含有骨多肽5mg/ml。
下面对本发明的技术方案作进一步的解释和说明：
本发明涉及一种含动物骨多肽的药物组合物，该药物组合物的制备方法为：按比例称取健康新鲜冷冻的猪骨、牛骨和鹿骨的四肢骨，洗净，压碎；将压碎的四肢骨研磨成直径为2～10mm的骨渣颗粒，放入提取罐中，加1～2倍量水，采用频率为20～25kHz的超声波处理0.5～2小时，优选45～90分钟，更优选45～60分钟；超声处理完毕后90～100℃保温搅拌1～3小时，取上清液；再将骨渣颗粒加入1～2倍量的水，采用频率为25～35kHz的超声波处理0.5～1小时，优选30～45分钟；超声处理完毕后90～100℃保温搅拌1～3小时，取上清液；超声功率为600～800W，超声发出时间1～2秒，间歇2～3秒；本发明通过将骨渣两次超声提取，最大限度的将骨中的有效成分提取出来，从而保证了本发明骨多肽注射剂的收率；同时，本发明对两次超声提取的频率及时间进行了反复实验，从而得到在该功率和时间条件下，提取效率最高，并且保证了骨多肽的生物活性。
制备过程中，合并上一步骤中两次得到的上清液，减压浓缩至原体积的1/4～1/2，然后在-15～-25℃条件下冻存，去除上层脂肪；在该温度条件下，将骨渣提取物冻存3～7天，优选4～7天，然后解冻，取上清液；解冻的条件为：在15～65℃的条件下解冻，优选40～60℃；骨渣提取物的升温速度为0.1～0.5℃/min，优选0.2～0.4℃/min；本发明通过对骨渣提取物的冻存和解冻，从而促进骨渣提取物中多肽物质的游离，减少高分子物质的含量。
进一步的，将解冻后的溶液用盐酸调pH值5.0～5.5，90～100℃保温搅拌1～3小时，过滤，降温至0～1℃，再次过滤；过滤过程中可将下层沉淀和上层脂肪全部除去，从而减少溶液中的杂质和脂肪等物质；将过滤得到的酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值8.0～8.5，90～100℃保温搅拌1～3小时，过滤，降温至0～1℃，再次过滤；过滤过程中可将在碱提过程中产生的杂质和脂肪等物质全部除去；本发明pH值做了更精细的调控，从而在保证产品收率的同时，保证了骨多肽的生物活性。
最后，溶液用盐酸调pH值6.5～7.5，用5000～8000分子量的超滤器超滤，收集超滤液，得到骨多肽溶液；将制备得到的骨多肽溶液按溶液质量的0.02～0.05%加入药用活性炭，加热至70~75℃搅拌吸附30min，用0.45μm微孔滤膜过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤除菌得到骨多肽注射剂原液，进一步添加辅料制备组合物。通过对骨多肽溶液的进一步精制和过滤，从而得到的骨多肽注射液的安全性大大提高。
通过对现有骨多肽注射剂工艺的改进，本发明制备得到的骨多肽注射剂中高分子物质的含量很低，通过长期试验检测得知，本发明制备的注射剂在不添加稳定剂等添加剂的基础上，经过24个月的长期试验，高分子物质无明显增加。并且通过进一步添加辅料三氯叔丁醇和磷酸二氢钠，可进一步提高注射剂的稳定性。
本发明的制备工艺避免了反复冻融，从而避免了降压物质的产生，从而使药物的安全性得到进一步的提高。
本发明由于选用了超声提取的工艺，使骨多肽的产率大大增加，可达到原料重的1.41～1.50%，远远高于现有技术。同时，通过动物试验证实，本发明的制备工艺得到的骨多肽注射剂的生物活性很高，超声提取并未对多肽的生物活性产生不良的影响。并且由于本发明提取过程中对条件等的严格控制，通过临床实验证实，其生物活性要高于现有技术。
本发明的具体实施方式仅是对本发明技术方案的进一步解释和说明，并不限制本发明的内容。
具体实施方式
实施例1：
1.按比例称取健康新鲜冷冻的猪骨、牛骨和鹿骨的四肢骨，洗净，压碎；猪骨、牛骨和鹿骨的重量比为1：2：3；
2.压碎的四肢骨研磨成直径为2～10mm的骨渣颗粒，放入提取罐中，加1倍量水，采用频率为20kHz的超声波处理0.5小时，超声处理完毕后100℃保温搅拌1小时，取上清液；再将骨渣颗粒加入1倍量的水，采用频率为25kHz的超声波处理0.5小时，超声处理完毕后100℃保温搅拌1小时，取上清液；其中，超声功率为600～800W，超声发出时间2秒，间歇3秒；
3.合并步骤2中两次得到的上清液，减压浓缩至原体积的1/2，然后在-25℃条件下冻存，去除上层脂肪；
4.将冻存3天的骨渣提取物解冻，取上清液；将冻存的骨渣提取物置于65℃的条件下解冻；冻存的骨渣提取物的升温速度为0.3℃/min；
5.溶液用盐酸调pH值5.0，100℃保温搅拌1小时，过滤，降温至0℃，再次过滤；
6.酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值8.0，100℃保温搅拌1小时，过滤，降温至0℃，再次过滤；
7.溶液用盐酸调pH值6.5，用5000～8000分子量的超滤器超滤，收集超滤液，得到骨多肽溶液；
8.将制备得到的骨多肽溶液按溶液质量的0.02%加入药用活性炭，加热至75℃搅拌吸附30min，用0.45μm微孔滤膜过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤除菌得到骨多肽注射剂原液，按照骨多肽注射剂原液100重量份、三氯叔丁醇0.1重量份、磷酸二氢钠1重量份的比例加入辅料搅拌均匀后，再用0.22μm微孔滤膜过滤一遍，得到含动物骨多肽的药物组合物；
9.将所述的骨多肽药物组合物用注射用水稀释至含有骨多肽5mg/ml的骨多肽组合物注射液，按照常规方法制备骨多肽组合物注射液水针；或者将得到的骨多肽注射剂组合物采用常规方法冻干，得到骨多肽组合物的冻干粉针。
实施例2：
1.按比例称取健康新鲜冷冻的猪骨、牛骨和鹿骨的四肢骨，洗净，压碎；猪骨、牛骨和鹿骨的重量比为2：1：2；
2.压碎的四肢骨研磨成直径为2～10mm的骨渣颗粒，放入提取罐中，加2倍量水，采用频率为25kHz的超声波处理2小时，超声处理完毕后100℃保温搅拌3小时，取上清液；再将骨渣颗粒加入2倍量的水，采用频率为35kHz的超声波处理30分钟，超声处理完毕后100℃保温搅拌3小时，取上清液；其中，超声功率为800W，超声发出时间1秒，间歇3秒；
3.合并步骤2中两次得到的上清液，减压浓缩至原体积的1/4，然后在-25℃条件下冻存，去除上层脂肪；
4.将冻存5天的骨渣提取物解冻，取上清液；将冻存的骨渣提取物置于60℃的条件下解冻，冻存的骨渣提取物的升温速度为0.2℃/min
5.溶液用盐酸调pH值5.5，100℃保温搅拌2小时，过滤，降温至0℃，再次过滤；
6.酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值8.5，100℃保温搅拌2小时，过滤，降温至0℃，再次过滤；
7.溶液用盐酸调pH值7.5，用8000分子量的超滤器超滤，收集超滤液，得到骨多肽溶液；
8.将制备得到的骨多肽溶液按溶液质量的0.02%加入药用活性炭，加热至75℃搅拌吸附30min，用0.45μm微孔滤膜过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤除菌得到骨多肽注射剂原液，按照多肽注射剂原液100重量份，三氯叔丁醇2.5重量份，磷酸二氢钠1重量份的比例加入辅料搅拌均匀后，再用0.22μm微孔滤膜过滤一遍，得到含动物骨多肽的药物组合物；
9.将得到的骨多肽注射剂组合物用注射用水稀释至含有骨多肽5mg/ml的骨多肽组合物注射液，按照常规方法制备骨多肽组合物注射液水针；或者将得到的骨多肽注射剂组合物采用常规方法冻干，得到骨多肽组合物的冻干粉针。
实施例3：
1.按比例称取健康新鲜冷冻的猪骨、牛骨和鹿骨的四肢骨，洗净，压碎；猪骨、牛骨和鹿骨的重量比为4：2：3；
2.压碎的四肢骨研磨成直径为2～10mm的骨渣颗粒，放入提取罐中，加2倍量水，采用频率为25kHz的超声波处理1小时，超声处理完毕后100℃保温搅拌2小时，取上清液；再将骨渣颗粒加入1倍量的水，采用频率为30kHz的超声波处理45分钟，超声处理完毕后100℃保温搅拌1小时，取上清液；其中，超声功率为700W，超声发出时间1秒，间歇3秒；
3.合并步骤2中两次得到的上清液，减压浓缩至原体积的1/3，然后在-20℃条件下冻存，去除上层脂肪；
4.将冻存6天的骨渣提取物解冻，取上清液；将冻存的骨渣提取物置于40℃的条件下解冻；冻存的骨渣提取物的升温速度为0.1℃/min；
5.溶液用盐酸调pH值5.0，100℃保温搅拌2小时，过滤，降温至1℃，再次过滤；
6.酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值8.5，100℃保温搅拌2小时，过滤，降温至1℃，再次过滤；
7.溶液用盐酸调pH值7.5，用5000分子量的超滤器超滤，收集超滤液，得到骨多肽溶液；
8.将制备得到的骨多肽溶液按溶液质量的0.02%加入药用活性炭，加热至75℃搅拌吸附30min，用0.45μm微孔滤膜过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤除菌得到骨多肽注射剂原液，按照骨多肽注射剂原液100重量份、三氯叔丁醇1重量份、磷酸二氢钠5重量份的比例加入辅料搅拌均匀后，再用0.22μm微孔滤膜过滤一遍，得到含动物骨多肽的药物组合物；
9.将得到的骨多肽注射剂组合物用注射用水稀释至含有骨多肽5mg/ml的骨多肽组合物注射液，按照常规方法制备骨多肽组合物注射液水针；或者将得到的骨多肽注射剂组合物采用常规方法冻干，得到骨多肽组合物的冻干粉针。
实施例4：
1.按比例称取健康新鲜冷冻的猪骨、牛骨和鹿骨的四肢骨，洗净，压碎；猪骨、牛骨和鹿骨的重量比为1：1：2；
2.压碎的四肢骨研磨成直径为2～10mm的骨渣颗粒，放入提取罐中，加1倍量水，采用频率为25kHz的超声波处理1.5小时，超声处理完毕后100℃保温搅拌2小时，取上清液；再将骨渣颗粒加入2倍量的水，采用频率为35kHz的超声波处理0.5小时，超声处理完毕后100℃保温搅拌2小时，取上清液；其中，超声功率为700W，超声发出时间2秒，间歇3秒；
3.合并步骤2中两次得到的上清液，减压浓缩至原体积的1/5，然后在-25℃条件下冻存，去除上层脂肪；
4.将冻存7天的骨渣提取物解冻，取上清液；将冻存的骨渣提取物置于65℃的条件下解冻，冻存的骨渣提取物的升温速度为0.3℃/min；
5.溶液用盐酸调pH值5.0，98℃保温搅拌3小时，过滤，降温至0℃，再次过滤；
6.酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值8.5，98℃保温搅拌3小时，过滤，降温至0℃，再次过滤；
7.溶液用盐酸调pH值7.0，用7000分子量的超滤器超滤，收集超滤液，得到骨多肽溶液；
8.将制备得到的骨多肽溶液按溶液质量的0.02%加入药用活性炭，加热至75℃搅拌吸附30min，用0.45μm微孔滤膜过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤除菌得到骨多肽注射剂原液，按照骨多肽注射剂原液100重量份、三氯叔丁醇1.5重量份、磷酸二氢钠2.5重量份的比例加入辅料搅拌均匀后，再用0.22μm微孔滤膜过滤一遍，得到含动物骨多肽的药物组合物；
9.将得到的骨多肽注射剂组合物用注射用水稀释至含有骨多肽5mg/ml的骨多肽组合物注射液，按照常规方法制备骨多肽组合物注射液水针；或者将得到的骨多肽注射剂组合物采用常规方法冻干，得到骨多肽组合物的冻干粉针。
实验例1高分子物质检测
实施例1制备得到的骨多肽注射剂原液直接用注射用水稀释至含有骨多肽5mg/ml，按照常规方法制备水针，取其中的三个批次101、102、103，模拟上市包装，进行如下稳定性试验：于40℃±2℃，75%±5%RH的条件下放置6个月，在试验期间分别于1、2、3、6个月末取样一次，对各稳定性重点考察项目进行检验。实验结果如表1所示。
表1：
根据上述实验证明，本发明的骨多肽直接分装得到的水针的稳定性很高，产品质量稳定，适于大规模的推广使用。
采用本发明其他实施例制备的骨多肽直接分装进行稳定性试验，得到相同的实验结果，为节约申请文件篇幅，故仅给出实施例1的实验结果。
实验例2高分子物质检测
实施例1制备得到的骨多肽组合物的注射剂水针，取其中的三个批次104、105、106，模拟上市包装，进行如下稳定性试验：于40℃±2℃，75%±5%RH的条件下放置6个月，在试验期间分别于1、2、3、6个月末取样一次，对各稳定性重点考察项目进行检验。实验结果如表2所示。
表2：
根据上述实验证明，本发明的骨多肽组合物的注射剂水针的稳定性得到进一步的提高，产品质量稳定，适于大规模的推广使用。
采用本发明其他实施例制备的骨多肽组合物的注射剂进行稳定性试验，得到相同的实验结果，为节约申请文件篇幅，故仅给出实施例1的实验结果。
实验例3：稳定性比较试验
按照专利ZL03111084实施例3的方法制备骨多肽氯化钠注射液，作为对比例1；
按照专利ZL200510076912实施例1的方法制备骨多肽注射液，作为对比例2；
按照专利ZL 201110110502实施例1的方法制备骨多肽提取物制备的水针，作为对比例3；
同时取本发明实施例2制备得到的骨多肽组合物的水针作为对比：
将上述对比例模拟上市包装，进行如下稳定性试验：于40℃±2℃，75%±5%RH的条件下放置6个月，在试验期间分别于1、2、3、6个月末取样一次，对各稳定性重点考察项目进行检验。实验结果如表3所示。
表3：
由上述对比试验可知，本发明的骨多肽注射剂水针的稳定性能良好，高分子物质的含量极低。好于现有技术。
采用本发明其他实施例制备的骨多肽注射剂进行稳定性试验，得到相同的实验结果，为节约申请文件篇幅，故仅给出实施例1的实验结果。
实验例4
骨折延迟愈合或骨不连是骨科临床常见疾病，骨多肽促进骨折愈合。2011年6月~2011年12月，在江西医学院第一附属医院分别用于治疗骨折延迟愈合或骨不连100例，疗效明显优于对比药物治疗者和中药治疗者。
1资料与方法
1.1临床资料
100例患者中男60例、女40例，年龄18~70岁。骨折部位不同，有股骨、胫腓骨、尺桡骨、肱骨、锁骨，均接受切开复位内固定术。术后8个月两断端未达到骨性连接者或复位4个月后未达到愈合标准。随机分为5组，每组20例。
供试药品：本发明实施例2制备的骨多肽注射液，对比药物同实验例2中的对比药物1～3；
2.实验分组：共5个给药组；
1.2治疗方法
对照组：给予三七骨伤片、谷康泰灵等中成药，连服20~30d；同时应用骨折治疗仪中频电刺激15~30min/次，1次/d，15d为1个疗程；连用2~3个疗程。
实验例组：给予实施例2制备骨多肽注射剂20ml（相当于骨多肽100mg），加入等渗盐水250ml静滴，1次/d，30d为1个疗程。
对比例1组：给予对比药物1的骨多肽注射液100ml（相当于骨多肽130mg），加入等渗盐水150ml静滴，1次/d，30d为1个疗程。
对比例2组：给予对比例药物2的骨多肽注射液20ml（相当于骨多肽120mg），加入等渗盐水250ml静滴，1次/d，30d为1个疗程。
对比例3组：给予对比药物3的骨多肽冻干粉500mg（相当于骨多肽100mg），加入等渗盐水250ml静滴，1次/d，30d为1个疗程。
1.3疗效评价方法
治疗后25周患者观察评价疗效：局部无压痛及纵向叩击痛，局部无反常活动，X线片骨折线模糊，有连续性骨痂通过骨折线，伤肢能完成一定强度练习，连续观察2周骨折处不变形为痊愈；患者以上症状、体征及功能有部分改善，但未达到痊愈标准为有效，治疗前后无明显变化为无效。以痊愈和有效病理计算总有效率。
1.4外周血内皮素(ET)、NO水平检测方法
治疗前及治疗后10、20周收集各组患者外周血，采用放射免疫法（RIA）检测内皮素（ET）水平，采用改良的Griess反应测定NO水平。操作按试剂盒说明书进行。
1.5统计学方法采用SPSS 11.0统计软件
计量资料比较用F检验和Q检验；率的比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。
2结果：如表4～6所示：
表4：有效率比较
| n | 痊愈 | 有效 | 无效 | 总有效率 | |
| 对照组 | 20 | 8 | 3 | 9 | 55% |
| 实验例组 | 20 | 16 | 3 | 1 | 95%*△# |
| 对比组1 | 20 | 10 | 4 | 6 | 70% |
| 对比组2 | 20 | 11 | 2 | 7 | 65% |
| 对比组3 | 20 | 12 | 3 | 4 | 75%* |
与对照组1比较，*p＜0.05；与对比组2比较：△P＜0.05；与对比组1比较#P＜0.05；
表5：治疗前及治疗后10、20周外周血ET水平比较(χ±s)
与对照组1比较，*p＜0.05；与对比组2比较：△P＜0.05；与对比组1比较#P＜0.05；
表6：治疗前及治疗后10、20周外周血NO水平比较(χ±s)
与对照组1比较，*p＜0.05；与对比组2比较：△P＜0.05；与对比组1比较#P＜0.05；
根据上述实验结果表明，本发明制备得到的骨多肽注射液具有促进骨折愈合的作用，并且与对比例相比也具有显著差异，证明本发明的骨多肽注射液的临床效果好于现有技术。
采用本发明其他实施例制备的制剂进行临床试验，取得了相同的效果。
实施例4
股骨头缺血性坏死是临床难治疾病，由于股骨头缺血性坏死具有一个复杂的病理过程，如早期不能得到及时有效的治疗，就会使股骨头塌陷，关节间隙变窄，最后导致坏死性骨关节炎，使病人髋关节功能障碍而致残。所以股骨头坏死的治疗，目前仍是国内外医学界的一大难题。本发明采用2011年1月到2012年1月在南宁市第二人民医院，应用本发明制备的骨多肽注射液和对比药物的骨多肽制剂治疗100例股骨头缺血性坏死，并观察治疗前后血液流变学的变化。
1资料与方法
1.1一般资料
共100例患者中，男55例，女45例，年龄18~68岁，单侧病变72例，双侧28例；病程2~36个月，平均10个月；随机分为5组，每组在年龄、性别、病程病史等方面无显著性差异，具有可比性。临床表现为髋关节疼痛、大腿痛或膝关节痛,伴有不同程度的髋关节活动受限及跛行，患肢直腿抬高试验(+)。所有患者均经X线摄片、CT或MRI确诊为股骨头缺血性坏死。
1.2治疗方法
对照组1：口服活血化瘀中药，一日一剂。
实验例组：给予实施例1制备骨多肽注射剂20ml（相当于骨多肽100mg），加入等渗盐水250ml静滴，1次/d，30d为1个疗程。
对比例1组：给予对比例1制备骨多肽注射液100ml（相当于骨多肽130mg），加入等渗盐水150ml静滴，1次/d，30d为1个疗程。
对比例2组：给予对比例2制备骨多肽注射液20ml（相当于骨多肽120mg），加入等渗盐水250ml静滴，1次/d，30d为1个疗程。
对比例3组：给予对比例3制备骨多肽冻干粉500mg（相当于骨多肽100mg），加入等渗盐水250ml静滴，1次/d，30d为1个疗程。
1.3血液流变学检测方法
患者治疗前后空腹静脉抽血做血液流变学各项指标检测，采用北京世帝R80-A血液流变分析仪和日立7170A生化分析仪测定。
1.4统计学方法
实验数据用均数标准差(χ±s)表示，采用SPSS10.0统计软件进行组间t检验。
2结果
治疗前后血液流变学指标变化见表7。
表7：血液流变学指标的变化
注:*表示与治疗前比较，*P<0.05；#表示与对比例1比较，#P<0.05；△表示与对比例2比较：△P＜0.05。
根据以上数据可以看出，本发明的骨多肽注射液可显著的降低全血浓度、血浆粘度、红细胞聚集指数，其效果较中药好，且好于对比例中的骨多肽制品。
采用本发明其他实施例制备的制剂进行临床试验，取得了相同的效果。
比较例1：对比超声处理的效果
D1组采用实施例1中的制备方法处理猪四猪骨100kg，D2组采用实施例1中的方法处理猪四猪骨100kg，唯一不同之处在于在步骤（2）不进行超声波处理，其余步骤和条件均相同，得到的骨多肽注射剂原液中，经减压浓缩干燥，其中D1组得到骨多肽972g，D2组得到骨多肽653g。
比较例2：超声条件的影响：
D1组采用实施例2中的制备方法处理猪四猪骨100kg，
D3~5组采用实施例2中的方法处理猪四猪骨100kg，区别在于步骤2中的超声波处理仅进行一次，其余步骤和条件均相同，得到的骨多肽注射剂原液中，经减压浓缩干燥，得到的骨多肽的质量为：
表8：
比较例3：冻存时间的效果
D1组采用实施例4中的制备方法处理猪四猪骨100kg，D7组采用实施例3中的方法处理猪四猪骨100kg，唯一不同之处在于在步骤（4）冻存12小时；其余步骤和条件均相同，得到的骨多肽注射剂原液中，经减压浓缩干燥，其中D1组得到骨多肽970g，D6组得到骨多肽920g。
比较例4：升温速度的效果
D1组采用实施例3中的制备方法处理猪四猪骨100kg，D6组采用实施例3中的方法处理猪四猪骨100kg，唯一不同之处在于在步骤（4）中升温的速度为2℃/min，其余步骤和条件均相同，得到的骨多肽注射剂原液中，经减压浓缩干燥，其中D1组得到骨多肽973g，D6组得到骨多肽915g。
Claims (14)
1.一种含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的组成为：由猪骨、牛骨和鹿骨中提取的多肽注射剂原液100重量份，三氯叔丁醇0.1～5重量份，磷酸二氢钠0.5～5重量份；所述的组合物的制备方法包括以下步骤：
（1）按比例称取健康新鲜冷冻的猪骨、牛骨和鹿骨的四肢骨，洗净，压碎；所述的药物组合物的原料猪骨、牛骨和鹿骨的重量比为1～4：1～2：1～3；
（2）压碎的四肢骨研磨成直径为2～10mm的骨渣颗粒，放入提取罐中，加1～2倍量水，采用频率为20～25kHz的超声波处理0.5～2小时，超声处理完毕后90～100℃保温搅拌1～3小时，取上清液；再将骨渣颗粒加入1～2倍量的水，采用频率为25～35kHz的超声波处理0.5～1小时，超声处理完毕后90～100℃保温搅拌1～3小时，取上清液；
（3）合并步骤（2）中两次得到的上清液，减压浓缩至原体积的1/4～1/2，然后在-15～-25℃条件下冻存，去除上层脂肪；
（4）将冻存3～7天的骨渣提取物解冻，取上清液；
（5）溶液用盐酸调pH值5.0～5.5，90～100℃保温搅拌1～3小时，过滤，降温至0～1℃，再次过滤；
（6）酸性滤液用氢氧化钠溶液调pH值8.0～8.5，90～100℃保温搅拌1～3小时，过滤，降温至0～1℃，再次过滤；
（7）溶液用盐酸调pH值6.5～7.5，用5000～8000分子量的超滤器超滤，收集超滤液，得到骨多肽溶液；
（8）将制备得到的骨多肽溶液按溶液质量的0.02～0.05%加入药用活性炭，加热至70～75℃搅拌吸附30min，用0.45μm微孔滤膜过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤除菌得到骨多肽注射剂原液，按照比例加入三氯叔丁醇和磷酸二氢钠搅拌均匀后，再用0.22μm微孔滤膜过滤一遍，得到含动物骨多肽的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的组成为：由猪骨、牛骨和鹿骨中提取的多肽注射剂原液100重量份，三氯叔丁醇0.5～2.5重量份，磷酸二氢钠1～4重量份。
3.根据权利要求1所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的原料猪骨、牛骨和鹿骨的重量比为1～2：1：1～2。
4.根据权利要求1所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，在步骤（2）中，超声功率为600～800W，超声发出时间1～2秒，间歇2～3秒。
5.根据权利要求1所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，在步骤（2）中，第一次超声波处理的时间为45～90分钟。
6.根据权利要求5所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，在步骤（2）中，第一次超声波处理的时间为45～60分钟。
7.根据权利要求1所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，在步骤（2）中，第二次超声波处理的时间为30～60分钟。
8.根据权利要求7所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，在步骤（2）中，第二次超声波处理的时间为30～45分钟。
9.根据权利要求1所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，在步骤（4）中，将冻存的骨渣提取物置于15～65℃的条件下解冻。
10.根据权利要求9所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，在步骤（4）中，将冻存的骨渣提取物置于40～60℃的条件下解冻。
11.根据权利要求1所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，在步骤（4）中，冻存的骨渣提取物的升温速度为0.1～0.5℃/min。
12.根据权利要求11所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，在步骤（4）中，冻存的骨渣提取物的升温速度为0.2～0.4℃/min。
13.根据权利要求1所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型为注射液或冻干粉。
14.根据权利要求13所述的含动物骨多肽的药物组合物，其特征在于，所述含动物骨多肽的注射液为将所述的含动物骨多肽的药物组合物用注射用水稀释至含有骨多肽5mg/ml。
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