CN109929825A

CN109929825A - 一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法

Info

Publication number: CN109929825A
Application number: CN201711357830.XA
Authority: CN
Inventors: 刘乃山; 夏衬来; 张晓�
Original assignee: Qingdao Guanlong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Qingdao Guanlong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-12-17
Filing date: 2017-12-17
Publication date: 2019-06-25

Abstract

本发明公开一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法，该方法通过以下工艺步骤：（1）离子交换层析;（2）盐析；（3）超滤；（4）热原处理；（5）透析；（6）疏水色谱；（7）冻干，制备激肽释放酶。本发明对激肽释放酶的生产工艺进行不断改进，特别是对各工艺参数进行反复的实验研究，不断优化，最终确立了一套更为科学的规模化生产工艺，经疏水色谱纯化所得的激肽释放酶的效价高达1500～1800iu/mg,并且各项指标均符合中国药典规定。

Description

一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种应用疏水色谱纯化激肽释放酶的方法。

背景技术

激肽释放酶属于丝氨酸蛋白酶，它包括血浆型激肽释放酶和组织型激肽释放酶两种类型，分子量分别为25200道尔顿和33800道尔顿，均能使激肽原释放出一种多肽——激肽，而激肽释放酶－激肽系统（kallikrein kinin system，KKS）是体内主要的降压系统之一，作为一个复杂的内源性多酶系统，参与调控心血管、肾脏、神经系统等的生理功能，与心脏病、肾病、炎症反应、癌症等疾病的发生有着密切关系。

近年来在心血管系统方面的研究进展很快，许多临床研究和基础实验已证实糖尿病、高血压、心力衰竭、心肌梗死及左心室肥厚等疾病的发生与KKS的活性降低有关。因而深入研究KKS的作用为研究心血管相关疾病的发病机制和治疗手段提供了又一新的途径。

本发明人自2008年开始对胰酶的生产工艺进行试验研究，特别是在糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的生产过程中，不断探索，力求优化完善工艺参数，并且在原有工艺的基础上另辟蹊径，成功完成提取激肽释放酶原的工艺研究，其收率为0.2%～0.4%，生产工艺稳定，质量可控。

发明内容

本发明提供了一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法，通过疏水色谱等生物分离工程技术纯化激肽释放酶，较好的保持蛋白活性。

一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法，其特征在于：采用疏水色谱等现代生物分离技术，将激肽释放酶效价提高到1500～1800iu/mg，更好的保持了蛋白的活性。在发明技术方案中，其特征还在于所述提取工艺包括如下步骤：

1）离子交换层析

1.1）将激肽释放酶原用0.001-0.01mol/L，PH3-6的醋酸缓冲液溶解离心，上清液加入离子交换树脂，搅拌、吸附，收集树脂，漂洗直至无泡沫；

1.2）再用0.01-0.3mol/L，PH3-8的0.1-5mol/L，PH5-10的NaCL溶液搅拌洗脱树脂，分离树脂得洗脱液；

2）盐析

调节洗脱液pH值至3.0～5.0，加入固体硫酸铵，静置过夜，次日过滤，收集滤饼；

3）超滤

加入滤饼重量15倍量的（w/v）磷酸盐缓冲液，搅拌，调节pH值至7.0～9.0，待液体超滤，体积控制在3/10；

4）热原处理

4.1）取超滤液，按50：5：3的比例，先后加入磷酸钠溶液和醋酸钙溶液；

4.2）调节pH值至8.0～10.0，搅拌，离心，弃去沉淀物，取滤液，准备透析扎包；

5）透析工序

取滤液，透析液扎包，放入纯化水中，进行透析交换，透析4～6天；

6）疏水色谱

6.1）用适量的含0.5-3mol/L (NH₄)₂SO₄的0.01-0.3mol/L，PH3-8的NaAc-HAc缓冲液来平衡疏水色谱快胶柱；

6.2）将透析液流经此柱，流速控制在1~5mL/min左右；

6.3）平衡后，用0.5-3mol/L 的(NH₄)₂SO₄溶液洗脱至蛋白检测仪显示至基线；

6.4）再用不含(NH₄)₂SO₄平衡缓冲液洗脱，收集含激肽释放酶活性峰的洗脱液，-20℃保存；

7）冻干

调节pH值至5.5～6.5，装盘、冻干，得激肽释放酶。

经检测，所得激肽释放酶效价约为1500～1800iu/mg。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

选用疏水色谱等现代生物分离技术纯化激肽释放酶,可以使其理化性质和生物活性在后续生产过程中保持稳定，最终使激肽释放酶的各项指标均符合中国药典标准。更重要的是，通过工艺的不断改进和完善，使得激肽释放酶效价提高到1500～1800iu/mg，节约成本，提高了经济效益。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，而不以任何方式限制。

实施例1

1）离子交换层析

1.1）将激肽释放酶原20kg用0.005mol/L，PH4的醋酸缓冲液100L溶解离心，上清液加入离子交换树脂，搅拌吸附2h，收集树脂，漂洗直至无泡沫；

1.2）再用0.03mol/L，PH5的NaCL溶液150L搅拌洗脱树脂1h，分离树脂得洗脱液138L；

2）盐析

调节洗脱液pH值至3.0～5.0，加入固体硫酸铵，静置过夜，次日过滤，收集滤饼13.5kg；

4）超滤

将所得滤饼投入反应罐中，加入磷酸盐缓冲液163L，搅拌10分钟，用5mol/L NaOH调节pH值至8.5，待液体超滤，体积控制在3/10，得超滤液165L;

5）热原处理

5.1）取上述超滤液，按50：5：3的比例，先加入0.4mol/L磷酸钠溶液16.5L，在不断搅拌下缓缓加入1mol/L醋酸钙溶液9.90L;

5.2）用2mol/L NaOH调节pH值至9.0，稳定后继续搅拌1.5小时，结束后，离心20分钟，弃去沉淀物,得滤液162L;

6）透析工序

取上述滤液，透析液扎包（100mL/包），将透析袋放入4℃纯化水中，进行透析交换5天，每24小时换一次纯化水；

7）疏水色谱

7.1）用44L的含1.5mol/L (NH₄)₂SO₄的0.2mol/L，PH3-8的NaAc-HAc缓冲液来平衡疏水色谱快胶柱；

7.2）将透析液流经此柱，流速控制在3mL/min左右；

7.3）平衡后，用1.5mol/L 的(NH₄)₂SO₄溶液洗脱至蛋白检测仪显示至基线；

7.4）再用不含(NH₄)₂SO₄平衡缓冲液洗脱，收集含激肽释放酶活性峰的洗脱液，-20℃保存；

8）冻干

用2mol/L NaOH溶液调节pH值至6.0，装盘、冻干，得激肽释放酶6.5kg。

经检测，所得激肽释放酶效价约为1725iu/mg。

实施例2

1）离子交换层析

1.1）将激肽释放酶原1.8kg用0.005mol/L，PH4的醋酸缓冲液90L溶解离心，上清液加入离子交换树脂，搅拌吸附2h，收集树脂，漂洗直至无泡沫；

1.2）再用0.03mol/L，PH5的NaCL溶液140L搅拌洗脱树脂1h，分离树脂得洗脱液126L；

2）盐析

调节洗脱液pH值至3.0～5.0，加入固体硫酸铵，静置过夜，次日过滤，收集滤饼12.9kg；

4）超滤

将所得滤饼投入反应罐中，加入磷酸盐缓冲液156L，搅拌10分钟，用5mol/L NaOH调节pH值至8.5，待液体超滤，体积控制在3/10，得超滤液158L;

5）热原处理

5.1）取上述超滤液，按50：5：3的比例，先加入0.4mol/L磷酸钠溶液15.8L，在不断搅拌下缓缓加入1mol/L醋酸钙溶液9.48 L;

5.2）用2mol/L NaOH调节pH值至9.0，稳定后继续搅拌1.5小时，结束后，离心20分钟，弃去沉淀物,得滤液155L;

6）透析工序

7）疏水色谱

7.1）用42L的含2mol/L (NH₄)₂SO₄的0.15mol/L，PH3-8的NaAc-HAc缓冲液平衡疏水色谱快胶柱；

7.2）将透析液流经此柱，流速控制在2mL/min左右；

7.3）平衡后，用1mol/L 的(NH₄)₂SO₄溶液洗脱至蛋白检测仪显示至基线；

8）冻干

用2mol/L NaOH溶液调节pH值至6.5，装盘、冻干，得激肽释放酶6.2kg。

经检测，所得激肽释放酶效价约为1688iu/mg。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法，其特征在于,该方法通过疏水色谱等现代生物分离技术，提高了纯化激肽释放酶的效率，保持激肽释放酶的效价稳定。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：以激肽释放酶原为原料，依次经过离子交换层析、盐析、超滤、热原处理、透析、疏水色谱、冻干等工序纯化得到激肽释放酶。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述纯化工艺包括如下步骤：

1）将激肽释放酶原用醋酸缓冲液溶解，离心，上清液加入离子交换树脂，搅拌、吸附、漂洗、洗脱；

2）调节pH值后加入固体硫酸铵进行盐析，静置过夜，过滤，收集滤饼；

3）加入磷酸盐缓冲液搅拌调节pH值，超滤；

4）超滤液加入磷酸钠溶液和醋酸钙溶液后，调节pH搅拌，离心，弃沉淀物；

5）取上述滤液置于透析袋中，透析4～6天；

6）疏水色谱，用2种洗脱液进行洗脱，最终收集含激肽释放酶活性峰的洗脱液，-20℃保存；

7）调节pH值，装盘、冻干，得激肽释放酶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于离子交换树脂选AmheriteCG-50,并且m(树脂)：m（粗制品）=50：1。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于离子交换层析选用洗脱液为0.01-0.3mol/L，PH3-8的NaCl溶液。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于盐析工序中每升提取液中加入500g硫酸铵。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述疏水色谱快胶柱包括：Butyl-Sepharose2B FF,Butyl-Sepharose 4B FF,Butyl-Sepharose 6B FF，Butyl-Sepharose CL-2B FF,Butyl-Sepharose CL-4B FF,Butyl-Sepharose CL-6B FF。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述疏水色谱条件为：平衡液选用含0.5-3mol/L (NH₄)₂SO₄的0.01-0.3mol/L，PH3-8的NaAc-HAc缓冲液,流速控制在1~5mL/min左右，洗脱液选用0.5-3mol/L 的(NH₄)₂SO₄溶液和不含(NH₄)₂SO₄平衡缓冲液。

9.如权利要求1～7所述的方法，其特征在于：疏水色谱纯化所得激肽释放酶效价高达1500～1800iu/mg。