SU943278A1 - Способ очистки микробных липаз методом аффинной хроматографии - Google Patents
Способ очистки микробных липаз методом аффинной хроматографии Download PDFInfo
- Publication number
- SU943278A1 SU943278A1 SU792818836A SU2818836A SU943278A1 SU 943278 A1 SU943278 A1 SU 943278A1 SU 792818836 A SU792818836 A SU 792818836A SU 2818836 A SU2818836 A SU 2818836A SU 943278 A1 SU943278 A1 SU 943278A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- solution
- sorbent
- enzyme
- purification
- desorption
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
мента в 2-5 раз, удельна активность
возрастает до 160 ед. Выход 50-78%
от активности исходного- материала fl
однако способ характеризуетс невысокой степенью очистки и недоста .точной устойчивостью органической матрищл сорбента к вли нию среды и действию микроорганизмов, что приводит к загр знению выдел емого фермента продуктами разрушени матричного материала.
Цель изобретени - повышение степени очистки ферментов.
Поставленна цель достигаетс тем что согласно способу очистки микробных липаз путем аффинной хроматографии , включающим сорбцию фермента из раствора на аффинном сорбенте при рН 7-8 и десорбцию фермента органическим растворителем и детергентами, используют сорбент, представл ющий собой- силохром с нанесеннЕдм полимерным покрытием из сополимера 2,2-ди- (4-эпоксипропилоксифенил)-пропана и поливинилового спирта и присоединенных с помощью гексаметилендиизоцианата C5-Cio-алкильных групп.
Используют 0,05-0,2 мг.экв/г сорбента с содержанием С -С д-алкильных групп.
Десорбцию фермента обычно провод т 50%-ным раствором этиленгликол , 0,5%-ным раствором дезоксихолата натри , 0,1-0,6%-ным раствором тритона х-100.
Предлагаемый способ обеспечивает повышение степени очистки ферментов до 13-23 раз.
Повышение степени очистки обусловлено высокой избирательностью адсорбции ферментов на сорбенте, который содержит лиганды - гидрофобные алкильньае группы, а также гидрофобные группировки молекул эпоксидной смолы , поливинилового спирта и гексаметилендиизоцианата , по отношению . к которым липаза про вл ет свою аффинность . Высока степень гидрофобности сорбента, усиливающа гидрофобное взаимодействие фермента с сорбентом , увеличивает адсорбцию липазы.
Кроме того, сорбент на основе неорганической Матрицы обладает структурной стабильностью (такие носители мало чувствительны к изменени м рН и других условий среды и не измен ют своих .размеров и конфигураций , т.е. вл ютс механически прочными), устойчивостью к действию микроорганизмов, легкостью модификаций, доступностью и сравнительно-низкой себестоимостью.
-Используемый в предлагаемом способе аффинный сорбент представл ет ,собой фактически модифицированный силохром, который получают пропиткой силохрома 1-30%-ной эпоксидной
смолой в растворе ацетона и последующим выпариванием растворител , отверждением смолы 3-5%-ным водным раствором поливинилового спирта в присутствии 1-2% триэтиламина при весовом соотношении силохрома и раствора 1:5-10 и 90-95 0 и последующей активацией .материала 5-20%ным раствором гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле при весовом соотношении твердой фазы 1:4-6 и 105-110 с в течение 1 ч и присоединением лиганда обработкой полученного материала алифатическим спиртом с числом углеродных атомов при весовом соотношении матрцы и спирта 1:3-6 и 100-105°С.
Пример. Получение сорбент
В коЛбу загружают 20 г силохрсма и раствор 1 г зпоксидной смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2. мин дл удалени воздуха из пор носител . После выпаривани растворител добавл ют 200 мг 5%-ного водного раствора поливинилового спирта, 2 мл триэтил амина и нагревают на вод ной бане при 90-95 с в течение 1 ч. Фильтруют , проишвают гор чей водой, ацетоном и сушат.
К полученному продукту добавл ют 80 мл 10%-ного раствора гексаметиледиизоцианата в сухом толуоле и перемешивают при 100-110 С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают на фильтре толуолом и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Содержание изоцианатных
групп 0,06 МГ-ЭК8/Г.
Активированньй силохром загружают в колбу с 80 мл амилового спирта и перемешивают при 100-1Об С в течение 1 ч. Фильтруют, промывают этано .лом и сушат. Содержание амиловых групп приблизительно 0,05 мг-экв/г.
Так как алкильные группы не поддаютс пр мому определению, то их содержание определ етс из расчета, что степень превращени изоцианатных в алкильные около 80%.
П .р и м е р 2. Очистка липазы на сорбенте с октиловой группой с примнением при десорбции ступенчатого градиента концентрации тритона х-10
Приготовление ис.ходного ферментного препарата.
Исходным материалом дл очистки служит ферментный препарат, полученный осаждением сульфатом аммони белков из культуральной жидкости микроскопического гриба Jeotrichum asteroides, выращенного.на питательной среде в течение 48 ч при аэрации и 28°с. Препарат имеет активность 14-21 ед/мг белка. За единицу липолитической активности принимают количество фермента, освобождающее 1 мкмоль олеиновой кислоты за 1 мин при 37°С.
К 400 мг сорбента (октилсилохрома добавл ют 4 мл ферментного раствора 365 ед,) в 0,01 М фосфатном буфере (рН7,2). Смесь оставл ют при на 2 ч, периодически встр хива , после чего частицы сорбента с гщсорбированной липазой помещают на колонку (10 мм в диаметре) и сорбируют фильтру, Сорбент с адсорбированным ферментом промывают фосфатным буфером до изчезновёни белка в промы--. вных водах. В фильтрате определ ют липолитическую активность по методу Ота и Ямада, а также белок по методу Лбури в модификации Хартри. Количество адсорбированного белка и активности определ ют по разности со держани белка и активности в исходном материале и в фильтрате, полученном после отделени частиц но сйтел с адсорбированным ферментом. Адсорбированный фермент элюируют (фракции по 3 мл) по следующей схеме: 50%-ный раствор этилеигликол 15 мл; 0,5%-ный раствор дезоксихолата натри 15 мл; тритон х-100 :0,1%-ный раствор 9 мл; 0,2%-ный 12 мл; 0,4%-ный 12 мл; 0,6%-ный 12 мл; 0,8%-ньА 12 мл.
Результаты элюировани представлены в таблице.
Исходный ферментный р-р
Адсорбировано на
носителе
Десорбци f%
Этиленгликоль Дезоксихолат
Белок и активность при десорбции выргикены в процентах от белка и активности исходного материала. Удельна активность представлена по нгшболее активным фракци м.
Величины активности даны с учетом вли ни разных концентраций тритона х-100 на активность липазы.
Тритон х-100 в концентрации 0,10 ,2% десорбирует 84% липазы с очисткой в 11 раз, в наиболее активных фракци х в 13 раз.
Тритон х-100, оказывающий на липа ,зу ингибирук цее действие в концентрации 0,013% и выше, удал ют ультра100 ,0
356
21,0 76,4
272
7,5
2,5
фильтргщией через мембрану РИПОР-4 60 (Олайне) при добавлении к фермент . ному раствору глицерина.
Пример 3. Очистка липазы на сорбенте с октиловой группой с применением при десорбции непре{швного 5 градиента концентрации тритона х-100
Claims (3)
- Формула изобретения1. Способ очистки микробных липаз методом аффинной хроматографии, включающий сорбцию фермента из раствора на аффинном сорбенте при pH 7-8 и десорбцию фермента органическим растворителем и детергентами, отличающий с я тем, что, с целью повышения степени . очистки липаз, используют сорбент, представляющий собой силохром с нанесенным полимерным покрытием из сополимера 2,2-ди-(4-эпоксипропилоксифенил)-пропана и поливинилового спирта и присоединенных с помощью гексаметилендииэоцианата С5~С1О -алкильных групп.
- 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют 0,050,2 мг-экв/г сорбента с содержанием с5 _с10 -алкильных групп *
- 3. Способ поп.1, отличающийся тем, что десорбцию фермента проводят 50%-ным раствором этиленгликоля, 0,5%-ным раствором дезоксихолата натрия, 0,1-0,6%-ным: раствором тритона х-100.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU792818836A SU943278A1 (ru) | 1979-08-16 | 1979-08-16 | Способ очистки микробных липаз методом аффинной хроматографии |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU792818836A SU943278A1 (ru) | 1979-08-16 | 1979-08-16 | Способ очистки микробных липаз методом аффинной хроматографии |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU943278A1 true SU943278A1 (ru) | 1982-07-15 |
Family
ID=20850283
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU792818836A SU943278A1 (ru) | 1979-08-16 | 1979-08-16 | Способ очистки микробных липаз методом аффинной хроматографии |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU943278A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4923810A (en) * | 1988-08-24 | 1990-05-08 | Genzyme Corporation | Resolution of glycidyl esters to high enantiomeric excess |
-
1979
- 1979-08-16 SU SU792818836A patent/SU943278A1/ru active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4923810A (en) * | 1988-08-24 | 1990-05-08 | Genzyme Corporation | Resolution of glycidyl esters to high enantiomeric excess |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4245005A (en) | Pellicular coated support and method | |
Kaçar et al. | Biosorption of Hg (II) and Cd (II) from aqueous solutions: comparison of biosorptive capacity of alginate and immobilized live and heat inactivated Phanerochaete chrysosporium | |
US4264738A (en) | Process for purification of proteolytic enzymes | |
US4138287A (en) | Purifying and isolating method for hepatitis virus to use in preparing vaccine | |
Boeden et al. | Bead cellulose derivatives as supports for immobilization and chromatographic purification of proteins | |
US6074555A (en) | Modified chromatographic support materials | |
GB1589620A (en) | Carrier material for enzymes consisting of an inorganic porous material and a polymer and a method for its preparation | |
US5085779A (en) | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography | |
CA1082625A (en) | Pressure-driven affinity sorption membranes | |
JPH0290943A (ja) | 生物物質を固定することのできる材料と、そのアフィニティークロマトグラフィーの担体としての応用 | |
CN103055832A (zh) | 一种用于分离水溶性聚合物和蛋白用色谱填料及其制备方法 | |
JP2678341B2 (ja) | 固定化リパーゼ | |
CN104277111B (zh) | 用于制备固定化蛋白质、多肽或寡肽的复合载体、制法及用途 | |
JPH0427504B2 (ru) | ||
SU943278A1 (ru) | Способ очистки микробных липаз методом аффинной хроматографии | |
Gao et al. | Immobilized lipase on porous ceramic monoliths for the production of sugar-derived oil gelling agent | |
US9505850B2 (en) | Endotoxin adsorbent | |
Şenel et al. | Comparison of adsorption performances of metal–chelated polyamide hollow fibre membranes in lysozyme separation | |
US5736259A (en) | Packing material for high-performance liquid chromatography and process for producing the same | |
US4013512A (en) | Method for adsorption and elution of lipid hydrolyzing enzymes | |
EP0186347B1 (en) | Method for producing high-active biologically efficient compounds immobilized on a carrier | |
SU935121A1 (ru) | Способ получени сорбента дл аффинной хроматографии микробных липаз | |
CH626402A5 (en) | Process for immobilising proteins on a solid support | |
JP3018277B2 (ja) | エステルの転移反応方法 | |
KR20150028245A (ko) | 고리형 매크로라이드계 화합물의 분리 방법 |