CN112782292B - 一种代谢物adma在制备早期骨关节炎诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种代谢物ADMA在制备骨关节炎诊断试剂盒中的应用。现有骨关节炎的诊断方法依赖影像学检查与临床表现。X线表现为关节间隙狭窄，关节面模糊，软骨下骨增生、关节腔骨赘形成与关节融合及脱位等。本发明将代谢物ADMA作为骨关节炎诊断的标记物，用以制备诊断关节炎，特别是早期关节炎的试剂盒。该关节炎试剂盒包括ADMA粉末、ADMA‑D7、甲酸、乙腈和超纯去离子水。本发明利用关节液中代谢物ADMA含量与关节炎患病情况的高度关联性，以代谢物ADMA为标记物，提供了能够检测关节炎，特别是早期关节炎的试剂盒。本发明提供的关节炎试剂盒具有检测速度快、重复性好、高灵敏度及高特异度的特点，且无放射性危害。

Description

一种代谢物ADMA在制备早期骨关节炎诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于分析化学及临床医学技术领域，具体涉及一种代谢物ADMA在制备骨关节炎试剂盒中的应用及代谢物ADMA的定量分析方法。

背景技术

骨关节炎(OA)又名退行性骨关节病，好发于负重大、活动多的关节，是一种以关节软骨退变、磨损、滑膜炎症以及骨赘增生等为特征的慢性退行性疾病。其高发于中老年人群，临床表现主要有关节疼痛肿胀与活动受限。根据最新的中国流行病学调查数据，65岁以上的老年人有较高的骨关节炎患病率，其中男性影像学患病率达27％，临床患病率达7％；女性影像学患病率高达46％，临床患病率达15％。骨关节炎患者的全球伤残调整生命年在非传染疾病中位居前十，疼痛与功能障碍给患者造成了极大的痛苦，也给社会经济造成了沉重的负担。

现有骨关节炎的诊断方法主要基于影像学检查与临床表现。X线表现为关节间隙狭窄，关节面模糊，软骨下骨增生、关节腔骨赘形成与关节融合及脱位等。MRI可显示关节腔内的积液与软组织情况，对于半月板、软骨的病变有也较好的提示作用。而影像学检测通常伴有一定的射线，或者有较为高昂的费用。而早期骨关节炎又无明显的临床症状与影像学表现，这不利于骨关节炎的早期发现与干预。当关节炎患者出现临床症状而就医时，其病程通常已达晚期，手术治疗是唯一的方法。因此，我们试图通过检测关节液中某些特定的生化指标，来辅助骨关节炎病人的早期诊断。同时，检测关节液中的生化代谢物具有可操作性强、分析速度快的优点。有研究表明，非骨关节炎患者关节液中非对称性二甲基精氨酸(ADMA)含量与血浆中相似，而关节炎患者关节液中ADMA含量显著高于血浆。我们前期研究表明，ADMA与骨关节炎有较为密切的关系，早期关节炎患者关节液中ADMA水平即有显著升高。因此，测定膝关节关节液中ADMA的含量，将有利于辅助骨关节炎的早期诊断，提高诊断方法的敏感性。这种方法相比传统方法具有简便快速、无射线的优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种代谢物ADMA在骨关节炎诊断的应用及试剂盒和定量分析方法。

本发明将代谢物ADMA作为骨关节炎诊断的标记物，用以制备诊断关节炎，特别是早期关节炎的试剂盒。该关节炎试剂盒包括ADMA粉末、ADMA-D7、甲酸、乙腈和超纯去离子水。

作为优选，判定关节炎的ADMA浓度阈值为366.08μg/mL。

作为优选，关节炎试剂盒配合液相色谱质谱联用仪来检测关节液中的ADMA含量。

作为优选，液相色谱质谱联用仪检测ADMA含量时使用的标准曲线的回归方程为 Y＝89.853X-5.7004。其中，X为ADMA浓度，Y为ADMA峰面积与内标峰面积之比。

该关节炎试剂盒的检测ADMA浓度的使用方法如下：

步骤1.采集被测者的关节液。

步骤2.样本分析

2-1.对关节液进行预处理

2-2.用关节炎试剂盒中ADMA粉末和ADMA-D7作为标准品配置梯度浓度的多个标准曲线溶液工作液，并分别进行液相色谱质谱联用检测获得浓度为横坐标X，以标准品峰面积与内标峰面积之比作为纵坐标Y的标准曲线。

2-3.取步骤2-1预处理后的关节液离心后取上清液加入含内标的纯水溶液，进行液相色谱质谱联用检测，测得关节液对应的ADMA峰面积和内标峰面积。进而在标准曲线上确定关节液中的ADMA浓度。

作为优选，步骤2-1的具体过程如下：将步骤1获得的关节液样品注入ep管中，离心去除关节液中的细胞、细胞碎片以及絮状沉淀；取关节液上清置于新的ep管并涡旋混匀。

本发明具有的有益效果是：

1、本发明利用关节液中代谢物ADMA含量与关节炎患病情况的高度关联性，以代谢物ADMA为标记物，提供了能够检测关节炎，特别是早期关节炎的试剂盒。

2、本发明提供的关节炎试剂盒具有检测速度快、重复性好、高灵敏度及高特异度的特点，同时无放射性危害。

3、本发明通过检测关节液中ADMA的水平，可作为应用于早期关节炎的辅助诊断，从而达到早期干预与防治的目的。

附图说明

图1为本发明中获得标准曲线图；

图2为测得的ADMA浓度与正常被测者、早期关节炎被测者、晚期关节炎被测者的关系图；

图3a、3b分别为非早期关节炎、早期关节炎对应的接受者操作特性曲线图；

图4为本发明测得的ADMA水平与Knee Social Score临床评分关系图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1

一种关节炎试剂盒，包括试剂盒包括ADMA(非对称性二甲基精氨酸)粉末、 ADMA-D7(非对称性二甲基精氨酸同位素标记内标)、甲酸、乙腈和超纯去离子水。

该关节炎试剂盒能够检测关节液中小分子代谢物ADMA的含量，从而辅助诊断早期关节炎，质谱靶向分析离子信息如下表1所示。

表1.ADMA靶向分析信息表

该关节炎试剂盒的具体使用过程如下：

步骤1.关节液样本收集。采集被测者就要检测的关节中的关节液。

步骤2.样本分析

2-1.样本的预处理

将步骤1获得的关节液样品注入1.5mL ep管中，4℃条件下5000g离心10分钟，去除关节液中的少量细胞、细胞碎片以及絮状沉淀后，取关节液上清置于新的1.5ml ep管并涡旋混匀，保存在-80℃冰箱中备用或直接测量。

2-2.设定超高效液相色谱质谱联用方法分析的条件如下：

(1)液相条件：色谱仪为SHIMADZU LC-20，色谱柱为XBridge@BEH HILIC Column(2.5μm，2.1×100mm)，流动相为10mM甲酸铵-0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)，洗脱梯度：0–4min 70％B，流速为0.4mL/min；进样量2μL；柱温30℃。

(2)质谱条件：SHIMADZU LCMS 8040Triple Quadruple MS/MS。雾化气流量：3L/min； DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气流量：15L/min。

2-3.标准品的配置与标准曲线的绘制

精确称取关节炎试剂盒中的ADMA、ADMA-D7标准品约1mg，置于1.5mL ep管中，加入纯水定容，配制成浓度约为1mg/mL的标准品原始储备液待用。取ADMA标准品原始储备液100μL，加入900μL水涡旋，配制成浓度为100μg/mL的ADMA标准品储备液。取 ADMA标准品储备液适量，加入纯水逐级稀释成2ng/mL，6ng/mL，20ng/mL，60ng/mL， 200ng/mL，600ng/mL，2000ng/mL的标准曲线溶液工作液作为线性溶液。取各浓度梯度的线性溶液100μL，分别加入等量含内标100ng/mL的纯水溶液，混匀，得到浓度为1ng/mL， 3ng/mL，10ng/mL，30ng/mL，100ng/mL，300ng/mL，1000ng/mL的标准曲线溶液工作液作为关节液标准曲线溶液。取上述浓度梯度的标准曲线工作溶液适量，按步骤2-2中设定的超高效液相色谱质谱联用方法分析条件进行测定，获得各浓度的标准曲线工作溶液的标准品峰面积和内标峰面积。以标准品浓度为横坐标X，以标准品峰面积与内标峰面积之比作为纵坐标Y绘制标准曲线离散点。

2.4待测样本的处理

取步骤2-1中获得的关节液上清50μL，加入150μL甲醇，涡旋1min，高速离心(13000rpm，4℃，15min)后，取上清液50μL，加入150μL含内标100ng/mL的纯水溶液，混匀后上机检测，测得ADMA峰面积和内标峰面积。

2.5质控(QC)溶液配置

取ADMA标准品储备液适量，加入纯水逐级稀释成2ng/mL(LQC)，20ng/mL(MQC)，200ng/mL(HQC)的梯度标准品溶液。取三个浓度梯度标准品溶液各100μL，分别加入等量含内标10ng/mL的纯水溶液，混匀后上机检测

2.6关节液测试结果及定量分析方法

对步骤2-3所得的标准曲线离散点通过SPSS进行回归分析，所建模型获得标准曲线与回归方程Y＝89.853X-5.7004(R²＝0.9992)如图1所示。将测得关节液ADMA峰面积与内标峰面积之比代入回归方程，计算样品ADMA浓度如图2所示。

步骤3.若步骤2-6测得的ADMA浓度超过浓度阈值，则判断被测这患有关节炎或处于关节炎早期。本实施例中的浓度阈值为366.08μg/mL。

以下针对筛选代谢物ADMA作为关节炎诊断标志物的过程和原因进行说明：

代谢物ADMA由一型蛋白精氨酸甲基转移酶(Type I PRMTs)催化甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)转移到精氨酸残基上形成，在胞内主要由DDAH1(二甲基精氨酸水解酶1) 降解，或经由转运蛋白CAT-1或CAT-2转运到胞外。我们前期实验通过代谢组学的方法，对取自膝关节炎病人的软骨细胞与取自膝关节骨折病人(无关节炎病史)的软骨细胞进行高通量代谢组学检测，筛选到了ADMA在关节炎软骨细胞的表达水平显著上调。关节炎发病时，我们发现退变的软骨细胞中DDAH1在转录水平和翻译水平表达显著下调，而转运蛋白CAT-2表达显著上调，尤其是关节炎相关的炎症因子能使得CAT-2在转录水平上调数十倍。这导致在关节炎病人的软骨细胞中ADMA降解减少，积累增多，通过CAT-2转运蛋白进入关节液中，进而使得ADMA在关节液中的含量显著上升(如图2所示)。

在此基础上，为进一步验证本发明提供的关节炎试剂盒对ADMA含量检测的准确性以及ADMA含量与关节炎的关联程度；本申请对包括350例来自杭州、嘉兴和台州地区的患者进行测试。所有患者都经过影像学膝关节X片检查，根据Kellgren-Lawrence分级评分系统(KL评分)将患者骨关节炎的情况分为0级、I级、II级、III级与IV级，其中0 级与I级定义为无关节炎、II级与III级定义为早期关节炎、IV级定义为晚期关节炎。根据病人关节液的量，采用1mL或5mL或10mL注射器采集的关节液样品。

对关节液样品按照前述的过程进行检测，并对小分子代谢物ADMA的诊断效果进行评价，发现其对于诊断关节炎的AUC＝0.832，对于诊断早期关节炎的AUC＝0.811，有较强的临床诊断意义(如图3a和3b所示)。对于诊断关节炎，其灵敏度为81.12％，特异度为74.26％；对于诊断早期关节炎，其灵敏度为79.86％，特异度为75.25％；如表2所示；基于我们的数据，ADMA浓度大于366.08μg/mL可考虑定义为判断早期骨关节液炎的标准。此外，采用Pearson分析ADMA水平与Knee Social Score临床评分(KSS score)的相关性，结果呈现较好的负相关(如图4所示)。基于此，申请人认为筛选出的代谢物ADMA可作为诊断关节炎，尤其是早期关节炎的标记物。此外，我们进一步实验表明，ADMA可结合去泛素化酶USP36，并抑制其功能，导致调控软骨细胞合成代谢的关键转录因子SOX9 泛素化降解，进而促进了关节炎的进展。

表2.ADMA在关节炎与早期关节炎诊断中的灵敏度与特异度

综上所述，本发明提供的针对小分子代谢物ADMA的检测试剂盒，通过检测关节液中ADMA的含量，有助于辅助诊断关节炎，尤其是早期关节炎。该检测试剂盒具有检测速度快、重复性好、高灵敏度及高特异度的特点。相对于传统影像学方法，该试剂盒检测无放射性，且成本相对较低，有望在骨关节炎的早期诊断中得到应用。

Claims (3)

1.一种代谢物ADMA在制备早期骨关节炎诊断试剂盒中的应用，其特征在于：与无关节炎被测者相比，ADMA在早期关节炎被测者的关节液中的含量显著上升；判定早期关节炎的ADMA 浓度阈值为366.08μg/mL；所述ADMA为非对称性二甲基精氨酸；样本分析：将关节液样品在4℃条件下离心；取关节液上清；加入甲醇，涡旋，在4℃下高速离心，取上清液，加入含内标的纯水溶液，混匀后进行液相色谱质谱联用检测。

2.根据权利要求1所述的一种代谢物ADMA在制备早期骨关节炎诊断试剂盒中的应用，其特征在于：液相色谱质谱联用仪检测ADMA 含量时使用的标准曲线的回归方程为Y=89.853X-5.7004；其中，X为ADMA浓度，Y为ADMA峰面积与内标峰面积之比；内标为ADMA-D7。

3.根据权利要求1所述的一种代谢物ADMA在制备早期骨关节炎诊断试剂盒中的应用，其特征在于：液相色谱质谱联用检测条件为：

液相条件：色谱仪为SHIMADZU LC-20，色谱柱为XBridge @BEH HILIC Column，2.5μm，2.1×100mm，流动相为10mM甲酸铵-0.1%甲酸水A-0.1%甲酸乙腈B，洗脱梯度：0 – 4 min70% B，流速为0.4mL/min；进样量 2μL；柱温 30℃；

质谱条件：SHIMADZU LCMS 8040 Triple Quadruple MS/MS；雾化气流量：3L/min；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气流量：15 L/min。

Images