CN114137226A - 脑梗塞早期诊断标志物、筛选方法及应用和脑梗塞早期诊断模型的构建方法及应用 - Google Patents

脑梗塞早期诊断标志物、筛选方法及应用和脑梗塞早期诊断模型的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开脑梗塞早期诊断标志物、筛选方法及应用和脑梗塞早期诊断模型的构建方法及应用，诊断标志物由4‑二甲基烯丙基色氨酸、牛磺鹅脱氧胆酸‑3‑硫酸酯、三己糖神经酰胺(d18:1/18:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:0)、精氨酸‑丙氨酸、天门冬氨酸‑色氨酸、甲硫氨酸‑精氨酸、鞘磷脂d37:5、磷脂酰甘油(12:0/21:0)和葡糖神经酰胺(d18:0/18:0)组成；诊断标志物是利用UPLC‑MS技术对血清同时进行代谢组学和脂质组学分析而筛选出的；本发明提供的利用上述诊断标志物构建诊断模型的方法其灵敏度，特异性，准确度和AUC均大于0.9，可准确区分脑梗塞患者和健康人群，可用于脑梗塞的早期诊断。

Description

脑梗塞早期诊断标志物、筛选方法及应用和脑梗塞早期诊断 模型的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及脑梗塞诊断标志物技术领域。具体地说是脑梗塞早期诊断标 志物、筛选方法及应用，脑梗塞早期诊断模型的构建方法及应用。
背景技术
脑梗塞(Cerebral Infarction，CI)又称缺血性脑卒中,是一种神经系统疾 病，是指因脑缺血、缺氧及血供紊乱而引起的局部脑组织缺血性坏死。脑梗 塞病人的临床症状表现在意识、认知、运动、语言和感觉等方面，病情较轻 的病人短时间内会出现四肢麻木无力甚至眩晕等现象；而病情严重者，容易 发生偏瘫、脑疝甚至死亡。脑梗塞发病率高、死亡率高并具有低预防率的特 点，是严重危害人类健康的主要疾病之一,也是致残的首位病因,其病死率仅 低于心肌梗死和癌症,位居第三位。在我国，脑梗塞患病率和发病率呈上升 趋势，影响患者的生活,同时也给医疗卫生造成了巨大压力。
目前脑梗塞的诊断是基于临床病史、体格检查、神经影像学和实验室检 查。影像学的诊断方法有很多种，其中CT检查(电子计算机体层扫描)、 MRI(磁共振成像)、DSA(数字减影血管造影术)是最常用的影像检查方 法。但各种检查方法均存在一定的局限性，如CT检查对缺血性卒中敏感度 低，妊娠或装有心脏起搏器者不宜进行MRI检查，同时对造影剂过敏或麻 醉剂过敏的病人无法进行DSA检查等；因此迫切需要早期准确诊断脑梗塞 的新方法。
近年来，代谢组学迅速发展成为系统生物学的一个重要组成部分。代谢 组学通过对机体的整个代谢谱进行分析，探寻代谢物与生理病理变化之间的 对应关系，找寻与疾病相关的生物标志物，从而为疾病诊断提供依据。(Han, S.,Van Treuren,W.,Fischer,C.R.et al.A metabolomics pipeline for the mechanistic interrogation of thegut microbiome.Nature 595,415–420(2021). Quinn,R.A.,Melnik,A.V.,Vrbanac,A.etal.Global chemical effects of the microbiome include new bile-acidconjugations.Nature 579,123–129(2020).) 代谢组学技术已广泛应用于药物研发、药物毒性评价、临床诊断等领域。作 为代谢组学的一种补充方法，脂质组学主要用于生物体内各种脂类分子的研 究，脂类代谢物是动植物代谢中的第一大类(如血浆中约70％的代谢物是脂 类)，参与能量运输、信息传递与调控生长发育等重要过程。通过脂质组学 深入了解脂质代谢的变化，有助于揭示疾病或药物的作用机制，从而使复杂 的生化研究更具有针对性。(Oswald Quehenberger,Aaron M.Armando,Alex H. Brown,Stephen B.Milne,DavidS.Myers,Alfred H.Merrill,Sibali Bandyopadhyay,Kristin N.Jones,Lipidomicsreveals a remarkable diversity of lipids in human plasma,Journal of LipidResearch,2010,51(11),3299-3305.)
目前已有关于脑梗塞的代谢组学研究，其中也涉及高准确度，高灵敏度 和特异性的诊断标志物集，可应用于脑梗塞的早期诊断。(Xiaoping Z,Tao G, Huafang W,etal.Potential biomarkers of acute cerebral infarction detected by SELDI-TOF-MS.American Journal of Clinical Pathology:299-304.J,Y,Jung,et al.1H-NMR-BasedMetabolomics Study of Cerebral Infarction.Stroke,2011, 42(5):1282-8.Jiang Z,Sun J,Liang Q,et al.A metabonomic approach applied to predict patients withcerebral infarction.Talanta,2011,84(2):298-304.)脑梗 塞是一种神经系统疾病，病理机制也涉及大部分脂质分子的代谢，但是目前 关于脑梗塞的脂质组学研究较少，更缺乏对代谢组学和脂质组学研究结果的 整合，缺乏对代谢和脂质诊断标志物的整合。因此寻找灵敏度高、特异性好 且安全经济的脑梗塞血清代谢和脂质诊断标志物，并建立一种可靠有效的脑 梗塞早期分子诊断模型仍具有重要的临床应用价值。
机器学习是人工智能的一个重要分支，近年来在疾病的诊断方面展现了 良好的表现，也被视作未来医学发展的重要方向及辅助手段。因此将代谢组 学和脂质组学技术与机器学习方法相结合，有可能更加快速、精准地找到更 为有效可靠的诊断标志物。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种脑梗塞诊断标志物及其 应用，以解决当前脑梗塞早期诊断标志物中缺乏代谢组学和脂质组学的有效 整合，而导致的灵敏度差、特异性低的问题，且还可以解决有些诊断手段， 比如影像诊断法，会限制一部分人群无法检查等问题；本发明还提供一种基 于UPLC-MS技术的血清代谢组学和脂质组学的脑梗塞诊断标志物的筛选方 法及其应用，该方法对脑梗塞早期诊断的准确性好且灵敏性高。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
脑梗塞诊断标志物，由如下10种物质组成：4-二甲基烯丙基色氨酸 (4-dimethylalyltryptophan)、牛磺鹅脱氧胆酸-3-硫酸酯 (Taurochenodeoxycholate-3-sulfate)、三己糖神经酰胺(d18:1/18:0) 【Trihexosylceramide(d18:1/18:0)】、溶血磷脂酰胆碱(18:0)【LysoPC(18:0)】、 精氨酸-丙氨酸(Arginyl-Alanine)、天门冬氨酸-色氨酸(Asparaginyl-Tryptophan)、甲硫氨酸-精氨酸(Methionyl-Arginine)、鞘磷 脂d37:5(SMd37:5)、磷脂酰甘油(12:0/21:0)【PG(12:0/21:0)】和葡糖神经 酰胺(d18:0/18:0)【GlcCer(d18:0/18:0)】。
上述脑梗塞诊断标志物，所述脑梗塞诊断标志物为血清标志物。其中 4-二甲基烯丙基色氨酸、牛磺鹅脱氧胆酸-3-硫酸酯、溶血磷脂酰胆碱(18:0)、 精氨酸-丙氨酸、天门冬氨酸-色氨酸和甲硫氨酸-精氨酸来自代谢组学研究结 果，(d18:1/18:0)三己糖神经酰胺(d18:1/18:0)、鞘磷脂d37:5、磷脂酰甘油 (12:0/21:0)和葡糖神经酰胺(d18:0/18:0)来自脂质组学研究结果。
脑梗塞诊断标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：收集脑梗塞患者和健康人群的血清样本，分别进行基于代谢 组学和脂质组学的血清预处理；
步骤(2)：用UPLC/Q-TOF-MS平台采集血清代谢组和脂质组轮廓图谱， 对图谱进行预处理，通过多变量统计分析筛选潜在的差异代谢物和脂质分子；
步骤(3)：整合步骤(2)中筛选出的代谢物和脂质分子的离子信息、 加合峰信息和同位素分布信息，并结合一级和二级质谱信息，计算代谢物和 脂质分子的分子量和分子式，并与代谢物数据库进行比对，确认差异代谢物 和脂质分子的结构，从而得到基于代谢组学和脂质组学的脑梗塞诊断标志物；
脑梗塞诊断标志物由如下10种物质组成：4-二甲基烯丙基色氨酸、牛 磺鹅脱氧胆酸-3-硫酸酯、三己糖神经酰胺(d18:1/18:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:0)、 精氨酸-丙氨酸、天门冬氨酸-色氨酸、甲硫氨酸-精氨酸、鞘磷脂d37:5、磷 脂酰甘油(12:0/21:0)和葡糖神经酰胺(d18:0/18:0)。
上述脑梗塞诊断标志物的筛选方法，步骤(1)中，血清预处理时，代 谢组学样本采用-20℃预冷的乙腈去除血清中的蛋白：将代谢组学血清样本 置于离心管中，向离心管中加入-20℃预冷的乙腈，涡旋震荡并于-20℃静置 60min，之后在4℃条件下离心，离心后取上清液备用；代谢组学血清样本 与乙腈的体积之比为1:4；
脂质组学样本用预冷的甲醇和甲基叔丁基醚提取血清中的脂质：将脂质 组学血清样本置于离心管中，加入-20℃预冷甲醇涡旋后，再加入甲基叔丁 基醚，于摇床混匀后，加入超纯水加速分层，并于室温下静置，之后在4℃ 条件下离心，离心后取上清液氮气吹干，将吹干后的提取物用由异丙醇、乙 腈和水混合而成的复溶混合液进行复溶，备用；脂质组学血清样本、甲醇、 甲基叔丁基醚和超纯水的体积之比为1:4：10：2，异丙醇、乙腈和水的体积 之比为2:1:1，复溶混合液与脂质组学血清样本的体积之比为2.5:1；
步骤(2)中，UPLC/Q-TOF-MS平台为Waters ACQUITY UPLC XevoTM G2-XSTOF，代谢组学色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3，(2.1×100mm， 1.7μm)，脂质组学色谱柱为ACQUITYUPLC CSH C18(2.1×100mm，1.7μm)， 在采集过程中用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量以确保实测质量的准确性和重 复性；
在代谢组学的UPLC-MS分析中：流动相A为水+0.1％甲酸，即向1000 mL纯水中加入1mL LC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟； 流动相B为乙腈+0.1％甲酸，即向1000mL乙腈中加入1mL LC-MS级甲酸， 配制好后放入超声仪超声脱气30分钟；流动相梯度为：0～4min，流动相B 的体积分数由5％增加到60％；4～12min，流动相B的体积分数由60％增 加到90％；12～13min，流动相B的体积分数由90％增加到100％；13～15 min，保持流动相B的体积分数为100％不变；15～16min，流动相B的体 积分数由100％下降到5％；16～17min，流动相B的体积分数保持为5％不 变；
在脂质组学的UPLC-MS分析中：流动相A为乙腈：水＝6:4+10mM甲 酸铵+0.1％甲酸，即向600mL乙腈和400mL纯水中加入10mmol甲酸铵 和1mL LC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟；流动相B 为异丙醇：乙腈＝9:1+10mM甲酸铵+0.1％甲酸，即向100mL乙腈和900mL 异丙醇中加入10mmol甲酸铵和1mL LC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟；流动相梯度为：0～4min，流动相B的体积分数由30％ 增加到43％；4～4.1min，流动相B的体积分数由43％增加到50％；4.1～8 min，流动相B的体积分数由50％增加到58％；8～12min，保持流动相B 的体积分数为58％不变；12～16min，流动相B的体积分数由58％增加到 60％；16～21min，流动相B的体积分数由60％增加到86％；21～22min， 流动相B的体积分数由86％增加到99％；22～24min，流动相B的体积分 数保持在99％不变；24～24.1min，流动相B的体积分数由99％下降到30％； 24.1～26min，流动相B的体积分数保持在30％不变；
步骤(2)中，在多变量统计分析中，主成分分析用Center方法进行归 一化，正交偏最小二乘分析用Unit Variance方法进行归一化；
步骤(3)中，差异代谢物的结构鉴定使用HMDB、Lipid maps和 ChemSpider三种数据库进行比对。
脑梗塞早期诊断模型的构建方法，包括如下步骤：
步骤A：收集脑梗塞患者和健康人群的血清样本，分别进行基于代谢组 学和脂质组学的血清预处理；采用UPLC/Q-TOF-MS平台采集血清代谢组和 脂质组轮廓图谱，对图谱进行预处理，通过多变量统计分析筛选潜在的差异 代谢物和脂质分子；
步骤B：整合筛选出的差异代谢物和脂质分子的二维数据矩阵信息，建 立随机森林机器学习模型：将80％的脑梗塞患者和80％的健康人群的血清 样本作为训练集，将剩下20％的脑梗塞患者和20％的健康人群的血清样本 作为测试集；采用随机森林机器学习模型，不仅方法简单易操作，且生成的 脑梗塞早期诊断模型具有较高的灵敏度和特异性；
步骤C：对训练集采用交叉验证，生成在交叉验证集上的第一最优诊断 模型；
步骤D：随后将生成的第一最优诊断模型在测试集上进行测试验证，当 第一最优诊断模型的预测值小于50％时，即可诊断为脑梗塞；
步骤E：根据对第一最优诊断模型的贡献程度对差异代谢物和脂质分子 进行排序，并筛选出对第一最优诊断模型贡献程度最大的前10个差异代谢 物和脂质分子作为脑梗塞诊断标志物，并根据脑梗塞诊断标志物的二维数据 矩阵重复步骤B和步骤C再次构建随机森林模型，生成第二最优诊断模型；
步骤F：将步骤E生成的第二最优诊断模型在测试集上进行测试验证， 当第二最优诊断模型的预测值小于50％时，即可诊断为脑梗塞；
当第二最优诊断模型的预测值小于50％时，用于生成第二最优诊断模型 的10个差异代谢物和脂质分子即为目标脑梗塞诊断标志物，目标脑梗塞诊 断标志物由如下10种物质组成：4-二甲基烯丙基色氨酸、牛磺鹅脱氧胆酸 -3-硫酸酯、三己糖神经酰胺(d18:1/18:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:0)、精氨酸- 丙氨酸、天门冬氨酸-色氨酸、甲硫氨酸-精氨酸、鞘磷脂d37:5、磷脂酰甘 油(12:0/21:0)和葡糖神经酰胺(d18:0/18:0)。该模型对脑梗塞的早期诊断具有 较高的灵敏度、特异性和准确度，对脑梗塞的早期诊断和治疗提供技术支持。
上述脑梗塞早期诊断模型的构建方法，步骤C中，对训练集采用五折 交叉验证，并循环迭代100次，生成在交叉验证集上的第一最优诊断模型； 随机森林模型的随机树数目设置为1000，预测因子的个数设置为7。
脑梗塞早期诊断模型的构建方法的应用，将采用上述脑梗塞早期诊断模 型的构建方法构建的第二最优诊断模型用于脑梗塞早期诊断中。
脑梗塞诊断标志物的应用，将上述脑梗塞诊断标志物用于脑梗塞早期诊 断的血清生物标志物中，或者用于制备脑梗塞早期诊断的产品中，或者用于 制备和筛选治疗脑梗塞的药物中。
上述脑梗塞诊断标志物的应用，将上述脑梗塞诊断标志物用于脑梗塞早 期诊断试剂盒的制备中。这种脑梗塞早期诊断试剂盒含有检测十种血清诊断 标志物的检测试剂，还含有十种血清诊断标志物的标准品；采用本试剂盒仅 通过取血就能进行早期诊断，方便快捷无内创，对于脑梗塞的早期诊断具有 较高的灵敏度和特异性。
上述脑梗塞诊断标志物的应用，将上述脑梗塞早期诊断试剂盒用于脑梗 塞早期诊断中。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
本发明针对脑梗塞发病率高、早期诊断困难，目前研究缺乏脂质诊断标 志物和对代谢组与脂质组结果整合的这一现状，建立了一种基于UPLC-MS 技术的血清代谢组学和脂质组学，筛选出了与脑梗塞发病相关的差异代谢物 和脂质。本发明提供了一组适合于脑梗塞早期诊断的诊断标志物，该组诊断 标志物整合了代谢组学和脂质组学研究结果，对于脑梗塞的灵敏度，特异性 和准确度均大于0.9，对脑梗塞的早期诊断，改善预后和提高生存率具有重 要意义。
本发明对45例脑梗塞患者和60例健康人群的血清样本进行分析，使用 超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC-MS)分别采集正负离子模式下的代谢和 脂质指纹图谱，经多变量统计分析，筛选与脑梗塞发病相关的潜在差异代谢 物和脂质分子。通过随机森林机器学习方法继续筛选出适合早期诊断脑梗塞 的诊断标志物，并构建出早期诊断模型，该模型对脑梗塞预测具有较高的灵 敏度，特异性和准确度。
附图说明
图1a本发明实施例中代谢组学正离子模式的轮廓图；
图1b本发明实施例中代谢组学负离子模式的轮廓图；
图1c本发明实施例中脂质组学正离子模式的轮廓图；
图1d本发明实施例中脂质组学负离子模式的轮廓图；
图2a本发明实施例中代谢组学正离子模式PCA得分图；
图2b本发明实施例中代谢组学正离子模式OPLS-DA得分图；
图2c本发明实施例中代谢组学正离子模式置换检验结果示意图；
图2d本发明实施例中代谢组学负离子模式PCA得分图；
图2e本发明实施例中代谢组学负离子模式OPLS-DA得分图；
图2f本发明实施例中代谢组学负离子模式置换检验结果示意图；
图3a本发明实施例中脂质组学正离子模式PCA得分图；
图3b本发明实施例中脂质组学正离子模式OPLS-DA得分图；
图3c本发明实施例中脂质组学正离子模式置换检验结果示意图；
图3d本发明实施例中脂质组学负离子模式PCA得分图；
图3e本发明实施例中脂质组学负离子模式OPLS-DA得分图；
图3f本发明实施例中脂质组学负离子模式置换检验结果示意图；
图4a本发明实施例中基于63个差异代谢物的ROC曲线图；
图4b本发明实施例中基于63个差异代谢物的测试集模型预测结果；
图5本发明实施例中优化的10个诊断标志物排序示意图；
图6本发明实施例中基于优化的10个诊断标志物的ROC曲线图；
图7本发明实施例中基于优化的10个诊断标志物的测试集模型预测 结果。
具体实施方式
下面结合具体实施实例来进一步阐释本发明，本发明的实施例仅用于解 释本发明，并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、 方法和设备，所用试剂和材料均为市购。
一、血清样本的收集和预处理
1.1样本的收集
从某医院共收集血清样本105个，脑梗塞组(CON)样本共45个，健 康人群样本(CI)共60个作为对照组。
1.2样本预处理
代谢组学样本预处理：将血清样本于室温下解冻，取100微升血清于 1.5mL离心管中，向离心管中加入400微升乙腈(-20℃预冷)，涡旋振荡2 min后，将样品于-20℃静置60min,随后于4℃，14000rps下离心20min。 离心后，取200微升上清液转移至液相小瓶。取每个血清样本50微升上清 液混合，制取血清QC样本,将制备好的血清QC样本转移至液相小瓶中。
脂质组学样本预处理：将血清样品于室温下解冻，取100微升血清于 2.0mL离心管中，加入400微升甲醇，涡旋2min,随后加入1mL MTBE(甲 基叔丁基醚),摇床混合1h。混合结束后加入200微升的超纯水加速分层， 于室温下静置10min后，在4℃、14000rps下离心10min。离心后，取出 1000微升上层清液于氮气气流下吹干。吹干后的提取物用250微升的(异 丙醇：乙腈：水＝2:1:1)混合液复溶。最后，将复溶后的溶液转移至液相小 瓶中。
二、血清代谢组学和脂质组学UPLC-MS分析；
本实施例使用的仪器为：Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相 色谱仪，XevoTMG2-XSTOF质谱仪。
2.1液相色谱条件
液相色谱参数如下：用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm，1.7μm) 色谱柱进行代谢组学研究，其中流动相A为水+0.1％甲酸【即向1000mL纯 水中加入1mL LC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟】，流 动相B为乙腈+0.1％甲酸【即向1000mL乙腈中加入1mL LC-MS级甲酸， 配制好后放入超声仪超声脱气30分钟】，流动相梯度如表1所示；样品室温 度为4℃，进样量为2μL，流速为0.4mL/min；
表1代谢组学梯度洗脱程度
Figure BDA0003389268450000101
用ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×100mm，1.7μm)色谱柱进行脂质 组学研究，流动相A为乙腈：水＝6:4+10mM甲酸铵+0.1％甲酸【即向600 mL乙腈和400mL纯水中加入10mmol甲酸铵和1mL LC-MS级甲酸，配 制好后放入超声仪超声脱气30分钟】，流动相B为异丙醇：乙腈＝9:1+ 10mM甲酸铵+0.1％甲酸【即向100mL乙腈和900mL异丙醇中加入10 mmol甲酸铵和1mL LC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟】， 流动相梯度如表2所示，样品室温度为4℃，进样量为2μL，流速为0.35 mL/min。
表2脂质组学梯度洗脱程序
Figure BDA0003389268450000102
2.2质谱条件
质谱参数如下：正离子模式下：毛细管电压3.0kV；锥孔电压40kV； 离子源温度110℃；锥孔气体流速50L/h；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气 流速800L/h；
负离子模式下：毛细管电压2.0kV；锥孔电压35kV；离子源温度110℃； 锥孔气体流速50L/h；脱溶剂气温度500℃；脱溶剂气流速800L/h；
两种扫描模式下扫描时间均为0.2s，数据采集范围：50-1000m/z，在 采集过程中用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量以确保实测质量的准确性和重复 性。
3.3血清样本测试
为了保证仪器状态稳定，在连续测样之前先测10个血清QC样品平衡 整个系统。在测样过程中，每五个样品之间插入一个QC样品，用来监测仪 器的稳定性；每三个样品之间插入一个空白样品，用来确保柱子中无残留。
本实施测得的正负离子模式下代谢组学和脂质组学的典型轮廓图谱分 别如图1a至图1d所示：图1a和图1b分别为代谢组学正负离子模式的轮廓 图，图1c和图1d分别为脂质组学正负离子模式的轮廓图。
三、多变量统计分析和代谢物的鉴定
3.1数据预处理
将Waters Masslynx(v4.1，Waters，USA)软件采集的原始数据导入到 ProgenesisQI软件(v2.2，Waters，USA)。以血清QC样品为参考进行峰提取， 峰对齐对和归一化分析。
3.2主成分分析(PCA)
主成分分析作为无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况。将 数据导入EZinfo软件(v3.0，Waters，USA)进行多元统计分析，进行主成分 分析，PCA得分图如图2a至图2f以及图3a至图3f所示：大部分样本点都 在95％置信区间内，脑梗塞组和健康对照组虽然有部分重叠，但分离趋势比 较明显。
3.3正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)
进一步采用有监督式方法进行建模分析，比较两组间的差异。模型的 R2Y表示模型的解释率，Q2表示模型的预测能力，大于0.4就表明模型可 靠，越靠近1表明越可靠。在EZinfo软件(v3.0，Waters，USA)中继续进行 OPLS-DA分析，代谢组学和脂质组学的正负离子模式下Q2均大于0.7，说 明建立的预测模型比较可靠。为了防止模型过拟合，将数据继续导入 SIMCA-P(v14.1,USA)进行200次的置换检验，结果如图2c、图2f、图3c 和图3f，拟合直线在纵轴上的截距明显低于直线右侧高点，表明本实施例建 立的模型没有“过拟合”。
3.4差异代谢物的筛选和鉴别
根据上述的OPLS-DA模型，本实施例筛选得到组间投影重要性(VIP) ＞1的变量。为进一步检验差异变量的显著性，在Progenesis QI软件(v2.2， Waters，USA)中进行独立样本t检验，检验结果P<0.05的变量具有显著性 差异。最后将于满足VIP>1，P<0.05的变量对应的代谢物和脂质作为潜在的 生物标志物。潜在生物标志物根据碎片和分子量信息以及 HMDB(http://www.hmdb.ca/)、Lipid maps、ChemSpider (http://www.chemspider.com/)等数据库对潜在生物标志物进行鉴定。最终共 鉴定出63个差异代谢物和脂质，其中包括23个差异代谢物和40个差异脂 质。差异代谢物和差异脂质的信息如表3。
表3 63种差异代谢物和差异脂质分子的信息
Figure BDA0003389268450000121
Figure BDA0003389268450000131
四、构建并优化随机森林机器学习诊断模型
4.1构建随机森林模型
使用随机森林(Random Forest，RF)机器学习算法学习3.4步骤中筛选 到的差异代谢物的二维数据矩阵，将84例(80％)脑梗塞患者【36例】和 作为对照组的健康人群血清样本【48例】作为训练集，21例(20％)脑梗 塞患者【9例】和作为对照组的健康人群血清样本【12例】作为测试集。对 训练集采用随机五折交叉验证，并循环迭代100次，生成在交叉验证集上的 最优诊断模型。随后将该模型在21例测试集上进行测试验证，结果如图图 4b所示，在9例脑梗塞样本中，9例预测正确；在12例健康对照样本中， 11例预测正确，预测的灵敏度为100％，特异性为91.7％，准确度为95.2％。 用ROC曲线评估模型的分类能力，如图4a所示，得到曲线下面积(AUC) 为0.981，95％置信区间为0.934-1，说明该生物标志物组预测结果良好。
4.2优化模型参数
上述诊断标志物组由于数量较多，实际应用性不强。因此本实施例接着 对诊断标志物进行优化。在4.1构建的机器学习模型中，本实施例根据对模 型的贡献程度对诊断标志物进行排序，结果如图5所示，本实施例筛选出对 模型贡献程度最大的前十个标志物，并根据这10个标志物的数据矩阵重复 4.1步骤的操作，最终成功构建了诊断模型，结果如图7所示，在9例脑梗 塞样本中，9例预测正确；在12例健康对照样本中，11例预测正确，预测 的灵敏度为100％，特异性为91.7％，准确度为95.2％。
用ROC曲线评估模型的分类能力，结果如图6所示，得到曲线下面积 (AUC)为0.972，95％置信区间为0.909-1，说明该生物标志物组预测结果 良好。将优化得到的10个标志物作为最终的诊断标志物组，其信息如下表 4所示。
表4优化后的10种诊断标志物的信息
Figure BDA0003389268450000141
Figure BDA0003389268450000151

Claims (10)

1.脑梗塞诊断标志物，其特征在于，由如下10种物质组成：4-二甲基烯丙基色氨酸、牛磺鹅脱氧胆酸-3-硫酸酯、三己糖神经酰胺(d18:1/18:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:0)、精氨酸-丙氨酸、天门冬氨酸-色氨酸、甲硫氨酸-精氨酸、鞘磷脂d37:5、磷脂酰甘油(12:0/21:0)和葡糖神经酰胺(d18:0/18:0)。
2.根据权利要求1所述的脑梗塞诊断标志物，其特征在于，所述脑梗塞诊断标志物为血清标志物。
3.脑梗塞诊断标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：收集脑梗塞患者和健康人群的血清样本，分别进行基于代谢组学和脂质组学的血清预处理；
步骤(2)：用UPLC/Q-TOF-MS平台采集血清代谢组和脂质组轮廓图谱，对图谱进行预处理，通过多变量统计分析筛选潜在的差异代谢物和脂质分子；
步骤(3)：整合步骤(2)中筛选出的代谢物和脂质分子的离子信息、加合峰信息和同位素分布信息，并结合一级和二级质谱信息，计算代谢物和脂质分子的分子量和分子式，并与代谢物数据库进行比对，确认差异代谢物和脂质分子的结构，从而得到基于代谢组学和脂质组学的脑梗塞诊断标志物；
脑梗塞诊断标志物由如下10种物质组成：4-二甲基烯丙基色氨酸、牛磺鹅脱氧胆酸-3-硫酸酯、三己糖神经酰胺(d18:1/18:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:0)、精氨酸-丙氨酸、天门冬氨酸-色氨酸、甲硫氨酸-精氨酸、鞘磷脂d37:5、磷脂酰甘油(12:0/21:0)和葡糖神经酰胺(d18:0/18:0)。
4.根据权利要求3所述的脑梗塞诊断标志物的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，血清预处理时，代谢组学样本采用-20℃预冷的乙腈去除血清中的蛋白：将代谢组学血清样本置于离心管中，向离心管中加入-20℃预冷的乙腈，涡旋震荡并于-20℃静置60min，之后在4℃条件下离心，离心后取上清液备用；代谢组学血清样本与乙腈的体积之比为1:4；
脂质组学样本用预冷的甲醇和甲基叔丁基醚提取血清中的脂质：将脂质组学血清样本置于离心管中，加入-20℃预冷的甲醇涡旋后，再加入甲基叔丁基醚，于摇床混匀后，加入超纯水加速分层，并于室温下静置，之后在4℃条件下离心，离心后取上清液氮气吹干，将吹干后的提取物用由异丙醇、乙腈和水混合而成的复溶混合液进行复溶，备用；脂质组学血清样本、甲醇、甲基叔丁基醚和超纯水的体积之比为1:4：10：2，异丙醇、乙腈和水的体积之比为2:1:1，复溶混合液与脂质组学血清样本的体积之比为2.5:1；
步骤(2)中，UPLC/Q-TOF-MS平台为Waters ACQUITY UPLC XevoTMG2-XS TOF，代谢组学色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3，(2.1×100mm，1.7μm)，脂质组学色谱柱为ACQUITY UPLCCSH C18(2.1×100mm，1.7μm)，在采集过程中用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量以确保实测质量的准确性和重复性；
在代谢组学的UPLC-MS分析中：流动相A为水+0.1％甲酸，即向1000mL纯水中加入1mLLC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟；流动相B为乙腈+0.1％甲酸，即向1000mL乙腈中加入1mL LC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟；流动相梯度为：0～4min，流动相B的体积分数由5％增加到60％；4～12min，流动相B的体积分数由60％增加到90％；12～13min，流动相B的体积分数由90％增加到100％；13～15min，保持流动相B的体积分数为100％不变；15～16min，流动相B的体积分数由100％下降到5％；16～17min，流动相B的体积分数保持为5％不变；
在脂质组学的UPLC-MS分析中：流动相A为乙腈：水＝6:4+10mM甲酸铵+0.1％甲酸，即向600mL乙腈和400mL纯水中加入10mmol甲酸铵和1mL LC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟；流动相B为异丙醇：乙腈＝9:1+10mM甲酸铵+0.1％甲酸，即向100mL乙腈和900mL异丙醇中加入10mmol甲酸铵和1mL LC-MS级甲酸，配制好后放入超声仪超声脱气30分钟；流动相梯度为：0～4min，流动相B的体积分数由30％增加到43％；4～4.1min，流动相B的体积分数由43％增加到50％；4.1～8min，流动相B的体积分数由50％增加到58％；8～12min，保持流动相B的体积分数为58％不变；12～16min，流动相B的体积分数由58％增加到60％；16～21min，流动相B的体积分数由60％增加到86％；21～22min，流动相B的体积分数由86％增加到99％；22～24min，流动相B的体积分数保持在99％不变；24～24.1min，流动相B的体积分数由99％下降到30％；24.1～26min，流动相B的体积分数保持在30％不变；
步骤(2)中，在多变量统计分析中，主成分分析用Center方法进行归一化，正交偏最小二乘分析用Unit Variance方法进行归一化；
步骤(3)中，差异代谢物的结构鉴定使用HMDB、Lipid maps和ChemSpider三种数据库进行比对。
5.脑梗塞早期诊断模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：收集脑梗塞患者和健康人群的血清样本，分别进行基于代谢组学和脂质组学的血清预处理；采用UPLC/Q-TOF-MS平台采集血清代谢组和脂质组轮廓图谱，对图谱进行预处理，通过多变量统计分析筛选潜在的差异代谢物和脂质分子；
步骤B：整合筛选出的差异代谢物和脂质分子的二维数据矩阵信息，建立随机森林机器学习模型：将80％的脑梗塞患者和80％的健康人群的血清样本作为训练集，将剩下20％的脑梗塞患者和20％的健康人群的血清样本作为测试集；
步骤C：对训练集采用交叉验证，生成在交叉验证集上的第一最优诊断模型；
步骤D：随后将生成的第一最优诊断模型在测试集上进行测试验证，当第一最优诊断模型的预测值小于50％时，即可诊断为脑梗塞；
步骤E：根据对第一最优诊断模型的贡献程度对差异代谢物和脂质分子进行排序，并筛选出对第一最优诊断模型贡献程度最大的前10个差异代谢物和脂质分子作为脑梗塞诊断标志物，并根据脑梗塞诊断标志物的二维数据矩阵重复步骤B和步骤C再次构建随机森林模型，生成第二最优诊断模型；
步骤F：将步骤E生成的第二最优诊断模型在测试集上进行测试验证，当第二最优诊断模型的预测值小于50％时，即可诊断为脑梗塞；
当第二最优诊断模型的预测值小于50％时，用于生成第二最优诊断模型的10个差异代谢物和脂质分子即为目标脑梗塞诊断标志物，目标脑梗塞诊断标志物由如下10种物质组成：4-二甲基烯丙基色氨酸、牛磺鹅脱氧胆酸-3-硫酸酯、三己糖神经酰胺(d18:1/18:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:0)、精氨酸-丙氨酸、天门冬氨酸-色氨酸、甲硫氨酸-精氨酸、鞘磷脂d37:5、磷脂酰甘油(12:0/21:0)和葡糖神经酰胺(d18:0/18:0)。
6.根据权利要求5所述的脑梗塞早期诊断模型的构建方法，其特征在于，步骤C中，对训练集采用五折交叉验证，并循环迭代100次，生成在交叉验证集上的第一最优诊断模型；随机森林模型的随机树数目设置为1000，预测因子的个数设置为7。
7.脑梗塞早期诊断模型的构建方法的应用，其特征在于，将采用权利要求5中所述的脑梗塞早期诊断模型的构建方法构建的第二最优诊断模型用于脑梗塞早期诊断中。
8.脑梗塞诊断标志物的应用，其特征在于，将权利要求1所述的脑梗塞诊断标志物用于脑梗塞早期诊断的血清生物标志物中，或者用于制备脑梗塞早期诊断的产品中，或者用于制备和筛选治疗脑梗塞的药物中。
9.根据权利要求8所述的脑梗塞诊断标志物的应用，其特征在于，将权利要求1所述的脑梗塞诊断标志物用于脑梗塞早期诊断试剂盒的制备中。
10.根据权利要求9所述的脑梗塞诊断标志物的应用，其特征在于，将权利要求9中所述的脑梗塞早期诊断试剂盒用于脑梗塞早期诊断中。
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