KR100877978B1

KR100877978B1 - Ｃｄ８６ 분자가 넉 다운된 형질전환 돼지 혈관 내피세포주 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100877978B1
Application number: KR1020070003707A
Authority: KR
Inventors: 안규리; 김재영; 김동희; 남동현; 고현숙; 최인호; 조범래; 김성대
Original assignee: 가천의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2007-01-12
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2009-01-12
Also published as: KR20080066368A

Abstract

본 발명은 CD86 분자가 넉 다운 (knock down)된 형질전환 돼지 혈관 내피 세포주 (cell line) 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 RNA 간섭에 의해 CD86 분자를 넉 다운시킨 형질전환 돼지 혈관 내피 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라 돼지 CD86 분자를 넉 다운한 돼지 혈관 내피 세포주는 이종장기이식에서 인간 T 세포의 활성화를 저해하므로 이를 이용하여 장기이식용 형질전환 돼지를 생산할 경우 인간 T 세포 및 자연 살해 세포에 의한 면역거부반응을 효과적으로 제어할 수 있다.

형질전환, 돼지 공통자극인자, CD86, 돼지 혈관내피세포

Description

ＣＤ８６ 분자가 넉 다운된 형질전환 돼지 혈관 내피 세포주 및 이의 제조방법{CD86 Knockdown Transgenic Pig Vascular Endothelial Cell Line and Preparatiaon Method Thereof}

도 1은 본 발명에 따른 siRNA 발현벡터 pSNU6-1.2 및 돼지 CD86 분자에 대한 siRNA 서열의 모식도이다.

도 2는 돼지 CD86 분자에 대한 siRNA 발현 벡터 (siCD86-1/pSNU6-1.2, siCD86-2/pSNU6-1.2)의 모식도이다.

도 3는 돼지 CD86 분자에 대한 siRNA 서열의 표적부위를 돼지 CD86 mRNA의 예측구조에 표시한 것이다.

도 4의 A는 돼지 CD86 분자를 넉 다운 (knock down)한 돼지 혈관 내피 세포주들 중에서 각 콜로니의 CD86 분자의 발현이 감소된 정도를 보여주는 그래프이고, B는 발현이 가장 많이 감소한 콜로니의 유세포 분석결과이며, C는 RT-PCR을 통해 mRNA의 발현 수준을 보여주는 사진이다.

도 5는 형질전환된 세포주의 SLA 클라스 I과 SLA 클라스 II의 발현 변화를 보여주는 유세포 분석결과이다.

도 6의 A는 형질 전환된 세포주인 M1C5와 M2C31에 대한 인간 T 세포주인 E6.1의 부착을 보여주는 사진이다. B는 부착된 세포와 M1C5, M2C31을 플레이트에서 떼어내어 유세포 분석을 한 결과로써 E6.1에는 부착 전에 CFSE를 염색하여 구분하였다. C는 부착된 E6.1의 백분율을 나타내는 그래프이다.

도 7은 MPN3, M1C5 및 M2C31을 각각 인간 T 세포와 혼합 림프구 배양을 한 결과를 나타낸 그래프이다.

말기 장기부전 환자에게는 새로운 장기의 이식이 필수적이다. 그러나 이식대기자 수에 비해 공여자의 수는 턱없이 부족한 것이 현실이다. 이에 대한 하나의 대안으로써 이종장기 이식이 대두 되었으며, 특히 사람의 장기와 비교하여 크기와 생리적 특징 면에서 유사한 돼지의 장기를 공여원으로 이용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만, 돼지 장기를 인체에 이식하게 되면 다단계의 심한 거부반응이 일어나며, 이 거부반응을 극복하는 것이 현재 이종장기의 당면한 해결 과제이다.

돼지의 장기가 사람에게 이식되면 즉시 사람의 XNA (xenoreactive natural antibody)가 돼지의 내피세포에 있는 Gal-α(1,3)-Gal에 결합하여 혈청보체를 활성화하고 혈소판을 유인해 수 분 내에 혈전을 형성하여 장기기능을 정지시키는 초급성 거부반응 (Hyperacute Rejection)이 일어난다. 이러한 초급성 거부반응을 조절하기 위한 방법으로 XNA 반응을 감소시키는 방법과 혈청 보체의 활성을 차단하는 방법이 연구되고 있다. 현재 사람의 혈청보체 조절인자인 DAF, CD59 등을 돼지에 과발현시킨 유전자 조작 돼지가 개발되어 시판되고 있으며 (Rosengard, A.bM. et al., Transplantation 59, 1325-1333, 1995), 최근에 Gal-α(1,3)-Gal 녹아웃 돼지의 생산이 성공한 바 있다 (Lai, L. et al., Science 295, 1089-1092, 2002; Kuwaki, K. et al., Nat . Med . 11, 29-31, 2005).

상술한 초급성 거부반응을 극복한 다음에도 급성 혈관성 거부반응 (Acute Vascular Rejection)이 일어난다. 급성 혈관성 거부반응은 병리조직학적으로 단핵구와 자연 살해 세포 (Natural killer cell)가 침윤되고 국소적인 허혈성 변화, 간질의 출혈과 함께 혈액응고 기능의 항진에 의한 미세 혈관 내 혈액응고가 관찰된다. 이 거부반응의 발병기전은 이식 장기의 혈관내피세포가 XNA에 의해 활성화되어 피브린 침착이 일어나는 것으로 알려져 있다. 이러한 급성 혈관성 거부반응을 조절하기 위해 IκB, RelA를 이용한 NF-κB의 억제, A-20, bcl-2, bcl-XL 등 항-아 폽토시스 기능이 있는 유전자들을 이용한 형질전환 돼지가 생산된 바 있다.

그러나 자연 항체와 보체 반응에 의한 초급성 및 급성 면역거부반응을 극복할지라도 T 세포에 의한 세포매개성 면역거부반응에 의해 이식된 장기는 기능을 할 수 없는 상태가 된다. 그러므로 이러한 T 세포 면역거부반응을 억제하는 것은 이종장기 이식의 성공 여부를 결정짓는 중요한 요소가 될 수 있다.

돼지의 혈관내피세포는 공통자극인자인 CD86을 발현하는데 이는 인간 T 세포를 활성화시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Bravery, C. A. et al., Transplantation 60, 1024-1033, 1995; Maher, S. E. et al., J. Immunol . 157, 3838-3844, 1996). 돼지 CD86 분자에 의한 인간 T 세포의 활성화의 억제가 중요한 이유는 일반적으로 널리 사용되는 인간 T 세포의 활성화를 억제하기 위해 사용하는 면역억제제인 사이클로스포린 A (cyclosporine A)에 저항성을 갖기 때문이다 (Davis, T. A. et al., Int . Immunol . 8, 1099-1111, 1996). 또한, 돼지 CD86 분자는 인간의 자연 살해 (Natural Killer) 세포를 활성화시키는 데에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Costa, C. et al., J. Immunol. 168, 3808-3816, 2002).

따라서 이종이식에 의한 거부반응을 극복하기 위해서는, 상기 CD86 분자를 녹아웃 시키는 기술의 확보가 시급하다.

특정 유전자를 넉 다운시키는 방법 중 하나로 RNA 간섭 (RNA interference, 이하 「RNAi」라 칭한다)이 있다. 상기 RNAi는 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA (이하, 「dsRNA」라 칭한다)를 세포 등에 도입하는 것에 의하여 표적유전자 mRNA의 분해를 유도하고 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상이다. 이와 같이 RNAi는 표적유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 종래의 지루하고 비효율적인 상동재조합에 의한 유전자 파괴방법을 대신하는 간단한 유전자 넉 다운 방법으로서 상당한 관심을 모으고 있다.

최근, 긴 이중사슬 RNA 대신 21-25 뉴클레오티드의 짧은 dsRNA (이하, siRNA이라 함)를 포유동물 세포에 도입함으로써 포유동물 세포에서도 RNAi를 유도할 수 있음이 보고되었다 (Elbashir, S. M. et al., Nature 411, 494-498, 2001; Caplen, N. J. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98, 9742-9747, 2001).

이에 본 발명의 발명자들은 돼지의 CD86 분자에 대한 siRNA를 규명하고 이를 돼지의 혈관 내피 세포에 도입하여 CD86 분자가 넉 다운된 형질전환 혈관 내피 세포주를 확립함으로써 이종 장기의 공여원으로서의 가능성을 확인하고 발명에 이르게 되었다.

본 발명은 형질전환 세포주 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다. 더 구체 적으로 본 발명은 CD86 분자가 넉 다운된 형질전환 돼지 혈관 내피 세포주 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 형질전환 돼지 혈관 내피 세포주 및 이의 제조방법, 이를 활용한 방법은 향후 이종 장기 공여 원으로서의 형질전환 돼지 또는 복제 돼지 연구에 필요한 도구를 제공할 수 있다. 즉, 본 발명에 의한 돼지 CD86 분자를 넉 다운한 돼지 혈관 내피 세포주는 이종장기 이식에서 인간 T 세포의 활성화를 저해하므로 이를 이용하여 장기 이식용 형질전환돼지를 생산할 경우 인간 T 세포 및 자연 살해 세포에 의한 면역거부반응을 효과적으로 제어할 수 있다.

본 발명은 형질전환 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 더 구체적으로 본 발명은 돼지의 공통자극인자인 CD86 분자를 넉 다운 (knock down)시킨 돼지 혈관 내피 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어진 돼지 CD86 분자에 대한 siRNA 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 핵산 서열로 이루어진 돼지 CD86 분자에 대한 siRNA 서열에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 siRNA 서열, siRNA 서열의 발현을 개시할 수 있는 프로모터 및 항생제 내성 유전자를 포함하는 siRNA 발현 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터를 돼지 혈관 내피 세포주에 도입시키는 것 을 특징으로 하는 형질전환 돼지 혈관 내피 세포주의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 CD86이 넉 다운된 형질전환 돼지 혈관 내피 세포주에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 세포주는 M1C5 또는 M2C31를 포함한다. 또한, 본 발명의 형질전환 돼지 혈관 내피 세포주는 기탁번호 KCLRF-BP-00130의 세포주를 포함한다.

본 발명에 있어서, CD86 분자를 넉 다운시키는 방법은 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되고 활용할 수 있는 유전공학적인 방법을 포함한다. 본 발명의 한 실시예는 돼지의 공통자극 인자인 CD86에 대한 짧은 간섭용 이중사슬 RNA (small interference; 이하, 'siRNA'이라 함)를 발현할 수 있는 벡터를 돼지 혈관 내피 세포주에 형질감염 (transfection)시키는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 돼지 CD86 분자를 넉 다운시키는 방법은 돼지 CD86 분자에 대한 siRNA 서열과 U6 프로모터, 하이그로마이신 B-내성 유전자를 포함한 siRNA 발현벡터인 pSNU6-1.2 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 siRNA　발현벡터로 형질 감염시킨 후 하이그로마이신B가 포함된 배지에서 선별 배양하여 넉 다운 효율이 가장 높은 세포주를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 용어, "siRNA"는 표적 유전자의 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 의 미하고, 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉 다운 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치 (대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지 (일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 (blunt) 말단 혹은 점착 (cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA (예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 본 발명의 CD86에 대한 siRNA는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 핵산 서열과 서열번호 3 및 서열번호 4로 이 루어진 핵산 서열을 포함한다.

본 발명의 siRNA는 이의 활성을 저하시키지 않는 변화를 갖는, 즉 기능적 등가물인, 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함한다. 이러한 변형체는 상기한 siRNA의 서열(서열번호 1 내지 4)과 70% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘 (Altschul, S. F. J. Mol . Biol . 219, 555-565, 1991; Henikoff, S. and Henikoff, J. G. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89, 10915-10919, 1992)을 이용하여 폴리뉴클레오타이드의 서열을 표적 폴리뉴클레오타이드의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래 siRNA 발현 카세트를 세포 안으로 형질전환 또는 감염 (infection) 시키는 방법이 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 siRNA 발현벡터를 제조하고, 이를 돼지의 혈관 내피 세포에 형질전환시켰다.

본 발명에서 "벡터"란 목적 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포로 도입되기 위한 수단으로, 상기 벡터를 이용하여 세포 내에서 siRNA를 발현시킬 수 있다. 벡터의 종류는 특별히 제한되지 않고, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 본 발명의 벡터는 CD86 mRNA의 어느 한 영역에 대하여 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥 및 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

상기 안티센스 RNA 가닥과 센스 RNA 가닥은 동일한 벡터에서 발현될 수도 있고, 다른 벡터에서 각각 발현되는 형태일 수도 있다. 동일한 벡터로부터 안티센스 RNA 가닥 및 센스 RNA 가닥을 발현시킬 경우, 프로모터에서 센스 RNA가 발현되는 발현 카세트와 프로모터에서 안티센스 RNA가 발현되는 별개의 발현 카세트를 각 구축하고 이들 카세트를 같은 방향 혹은 역방향으로 벡터에 삽입할 수 있다. 또한, 스템루프형 siRNA를 발현할 수 있는 시스템으로 안티센스 RNA 가닥과 센스 RNA 가닥을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 동일 DNA 사슬 상에 역방향으로 배치하고, 이들 DNA 사이에 링커를 삽입하여 연결시킨 단위를 하나의 프로모터의 하위 (downstream)에 위치하도록 할 수 있다. 이 때, 발현되는 순서는 제한되지 않는다. 즉, 안티센스 RNA 가닥을 코딩하는 DNA-링커-센스 RNA를 코딩하는 DNA 형태와 센스 RNA 가닥을 코딩하는 DNA-링커-안티센스 RNA를 코딩하는 DNA 형태일 수 있다. 그 결과, 생성되는 siRNA는 링커 부분을 루프로 하고, 그 양쪽의 센스 RNA 가닥과 안티센스 RNA 가닥이 짝을 이루게 되는 스템 루프형 구조를 가진다. 링커는 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드 링커로 다양한 길이를 가질 수 있다. 바람직하게는 6 내지 12개의 뉴클레오타이드 길이를 가진다. 또한, CD86에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 RNA 만을 발현시키는 벡터를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 siRNA 발현벡터는 CD86 분자에 대한 siRNA 서열, 상기 siRNA 서열의 발현을 개시할 수 있는 프로모터 및 항생제 내성 유전자를 포함한다. 상기 프로모터로는 이에 한정되지는 않으나, U6 프로모터, H1 프로모터, 그 외 RNA 폴리머라아제 III 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 항생제 내성 유전자는 하이그로마이신 B-내성 유전자, 암피실린-내성 유전자, 제오신-내성 유전자, 퓨로마이신-내성 유전자를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 CD86에 대한 각기 다른 두 개의 siRNA 서열을 갖는 siCD86-1/pSNU6-1.2과 siCD86-2/pSNU6-1.2가 개시되어 있다. 상기 발현벡터는 각각 U6 프로모터, 하이그로마이신B-내성 유전자 및 암피실린-내성 유전자를 포함한다 (실시예 <1-2> 참조).

본 발명의 CD86이 넉 다운된 돼지 혈관 내피 세포주의 제조방법은 상기 발현 벡터를 돼지 혈관 내피 세포주에 도입하는 것을 특징으로 한다. 상기 발현 벡터의 도입은 당 업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 입자 총 충격 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리 (sonication), 일렉트로포레이션 (electroporation)법을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 발현 벡터를 돼지 혈관 내피 세포주인 MPN3에 일렉트로포레이션법에 의해 도입시켰다. 그 다음 상기 MPN3 세포를 항생제가 포함된 배지에서 배양하여 항생제에 저항성을 갖고 독립적인 콜로니를 형성하는 콜로니를 선택하였다 (실시예 <2-1> 참조).

상기 각 콜로니에서 발현되는 CD86을 유세포 분석으로 측정하고 돼지 CD86 분자를 가장 적게 발현하는 것을 선택하였다 (도 4의 A 참조). 발현 벡터 siCD86-1/pSNU6-1.2로 넉 다운한 것은 M1C5로, 발현벡터 siCD86-2/pSNU6-1.2로 넉 다운한 것은 M2C31로 명명하였으며, 이 중에서 M1C5 세포주를 2006년 2월 14일자로 부다페스트 협약하의 국제기탁기관인 한국 세포주 은행 (KCLB; 서울시 종로구 연건동 28번지 서울대학교 의과대학 암연구소 소재)에 기탁하고 기탁번호 KCLRF-BP-00130을 부여받았다.

나아가, 본 발명자들은 본 발명의 형질전환 세포주 M1C5 및 M2C31을 RT-PCR하여 CD86 mRNA의 발현을 조사하였다. 그 결과, CD86 mRNA의 발현이 M1C5와 M2C31 세포주에서 각각 84.7%와 80.2% 억제되는 효과를 보였다 (도 4의 C 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 형질전환 세포주에서 CD86의 발현 정도를 유세포 분석기로 측정하였다. 그 결과, CD86 단백질의 발현이 M1C5와 M2C31 세포주에서 각각 82%와 81% 억제되는 효과를 보였다 (도 4의 B 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 형질전환 세포주의 형질전환에 의한 변화를 확인하기 위해서 돼지주조직면역복합체의 발현 변화를 유세포 분석으로 확인한 결과, 형질감염에 의한 세포주의 변화는 없는 것으로 확인되었다 (도 5 참조).

또한, 상기 세포들 및 인간 CD4⁺ T 세포주인 E6.1과의 접착성을 평가한 결과, M1C5에 대해서는 70%감소, M2C31에 대해서는 58%까지 접착성이 감소하였다 (도 6 참조).

또한 세포들로 인간 CD4⁺ T 세포와 혼합 림프구 배양을 한 결과, M1C5는 대조군에 비해 68% 그리고 M2C31은 62%까지 인간 CD4⁺ T 세포의 활성화를 억제하였다 (도 7 참조).

따라서 본 발명의 방법에 따라 돼지 CD86 분자가 넉 다운된 혈관 내피 세포주는 인간 T 세포의 활성화를 억제하는 능력이 탁월하고 이를 이용한 넉 다운 돼지를 생산하여 이종장기이식에 이용하는데 중요한 자료를 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

돼지 CD86 분자를 넉 다운하기 위한 siRNA 벡터의 제작

본 발명자들은 siRNA 발현을 위한 벡터인 pSNU6-1.2를 제작하였다. 돼지 CD86 분자를 넉 다운하기 위해 먼저, 돼지 CD86 분자에 대한 siRNA 서열을 결정하 였다.

<1-1> 돼지 CD86 분자에 대한 siRNA 서열

돼지 CD86 분자에 대한 siRNA 서열은 siRNA 서열 결정 프로그램 (http://ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)을 이용하여 후보서열을 찾고 이 중에서 가장 적합하다고 생각되는 두 개의 서열부위 (서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4)를 선택하였다. 돼지 CD86 분자에 대한 siRNA 서열의 모식도는 도 1에 나타낸 바와 같으며, 돼지 CD86 분자에 대한 siRNA 서열의 표적부위는 도 2에 나타낸 바와 같다.

siCD86 -1 (325-355)

센스 (서열번호 1)

5' - AGGGCCGCATGGACTTGTTTAGATCTGAAACAAGTCCATGCGGCCCTTTTTTT - 3'

안티센스 (서열번호 2)

5' - AATTAAAAAAAGGGCCGCATGGACTTGTTTCAGATCTAAACAAGTCCATGCGGCCCTGGCC-3'

siCD86 -2 (753-773)

센스(서열번호 3)

5' -CAGTGGTCGTTGTGTGTGGTAGATCTGACCACACACAACGACCACTGTTTTTT - 3'

안티센스(서열번호 4)

5' -AATTAAAAAACAGTGGTCGTTGTGTGTGGTCAGATCTACCACACACAACGACCACTGGGCC - 3'

상기 서열들에 대한 올리고머를 공지된 방법으로 합성한 후 이중사슬로 제조하였다 (J. Biotechnol. Choi, I. et al., 120, 251-261, 2005). 이중 나선 형성을 위한 어닐링 과정은 다음과 같다. 동량의 올리고뉴클레오티드를 섞고 95℃에서 5 분간 가열한 후 어닐링 완충액(10 mM Tris HCl, 100 mM NaCl)에서 상온까지 서서히 감온하였다.

<1-2> siRNA 발현 벡터의 제작

상기 실시예 <1-1>에서 합성한 돼지 CD86 유전자에 대한 각기 다른 두 곳의 표적부위에 대한 센스와 안티센스를 상보적으로 연결한 다음 pSNU6-1.2 벡터에 삽입하여 클로닝하였다. 상기 벡터는 U6 프로모터와 하이그로마이신B-내성 유전자, 암피실린-내성 유전자를 포함한다. 각기 다른 두 곳의 표적부위에 대한 siRNA 발현벡터는 각각 siCD86-1/pSNU6-1.2 및 siCD86-2/pSNU6-1.2로 명명하였다.

벡터 제작 과정을 보다 자세하게 설명하면 다음과 같다. 먼저, 포유류 세포에서 작용할 수 있는 siRNA 발현 벡터 (pSNU6-1; Choi, I. et al., J. Biotechnol. 120, 251-261, 2005)는 쥐의 게놈 DNA에서 획득한 U6 RNA 프로모터를 도입하여 제조하였다. 이 벡터에 하이그로마이신에 대한 저항성 유전자를 도입하여 pSNU6-1.2 벡터를 제조하였다(도 1). 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 CD86 유전자의 siRNA 주형을 제한효소인 5'-Apa I과 3'-Hind III로 절단하고 pSNU6-1.2 벡터에 라이게이션 하여 siCD86-1/pSNU6-1.2와 siCD86-2/pSNU6-1.2를 제조하였다(도 2). 상기 벡터는 RNA 중합효소 III에 특이적인 전사물의 합성에 관여하는 U6 프로모터 부위의 3' 말단부에, 돼지 CD86 유전자에 대한 siRNA의 주형으로 작용할 염기 서열을 삽입하였고, RNA 중합효소 III의 전사 정지 신호로 작용하는 6개의 T를 3' 말단에 반복되게 추가하였다.

<실시예 2>

돼지 CD86 분자를 넉 다운한 돼지 혈관 내피 세포주의 제조

<2-1> 돼지 혈관 내피 세포의 형질감염

본 발명자들은 돼지 CD86 분자를 넉 다운한 형질전환 돼지 혈관 내피 세포주를 제조하기 위하여, 먼저 발명자들에 의해 이미 만들어진 돼지 혈관 내피 세포주인 MPN3(Kim, D. et al., Cell Biol . Int . 29, 638-646, 2005)를 10% (v/v) FBS (fetal bovine serum)와 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지 (Welgene Inc., Daegu, Korea)에 배양한 후 2×10⁶ cells/㎖로 AMAXA T 용액으로 부유시킨 0.1 ml의 MPN3에 1 ug의 실시예 <1-2>의 siRNA 발현벡터를 넣고 전기천공법에 의해 형질감염시켰다.

각각의 siRNA 발현벡터가 형질 감염된 MPN3 세포를 100 mm 플라스크에 세포를 10% (v/v) FBS (fetal bovine serum)와 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신 포함 하는 DMEM 배지에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 안정적으로 넉 다운된 세포를 선별하기 위하여 하이그로마이신B를 0.5 mg/ml 농도로 배양 배지에 첨가하여 7 내지 10일 동안 매일 선택배지를 교환하면서 배양시켰다.

이후 항생제에 저항성을 갖고 독립적인 콜로니를 형성하는 콜로니를 선택하여 새로운 플레이트로 옮겨 2 내지 3주간 추가 배양하였다.

<2-2> 유세포 분석을 이용한 CD86 분자의 발현 조사

상기 실시예 <2-1>에서 수득한 각 콜로니들을 대상으로 유세포 분석을 수행함으로써 돼지 CD86 분자를 가장 적게 발현하는 것을 선택하였다. 상기 콜로니를 PBS에 0.1% BSA, 0.05% NaN₃가 첨가된 완충액 100 ul에 유세포 분석용 튜브 당 5×10⁵개의 농도로 재부유하였다. 그 후 일차항체인 항-인간/돼지 CD86 (CTLA4-Ig; Ancell, USA)을 1 ug 첨가한 후 상온에서 30분간 정치배양 다음 2회 세척하고 FITC가 중합된 염소 항-마우스 이차항체 (FITC-conjugated anti-mouse IgG, Serotec Ltd., UK)를 첨가한 후 다시 얼음위에서 20분간 정치배양 후 2회 세척하였다. 이후 유세포 분석기를 통해서 이들 세포의 돼지 CD86 분자의 발현정도를 측정하였다.

CD86 분자의 발현 정도가 가장 낮은 것을 선별하고 siCD86-1/pSNU6-1.2 벡터로 넉 다운한 것은 M1C5로, siCD86-2/pSNU6-1.2 벡터로 넉 다운한 것은 M2C31로 명명하였다(도 4의 A 및 B). 이 중에서 상기 M1C5 세포주를 2006년 2월 14일자로 부 다페스트 협약하의 국제기탁기관인 한국 세포주 은행 (KCLB; 서울시 종로구 연건동 28번지 서울대학교 의과대학 암연구소 소재)에 기탁하고 기탁번호 KCLRF-BP-00130를 부여받았다.

<2-3> RT-PCR

MPN3, M1C5와 M2C31 세포주의 RNA 분리는 RNA 분리 미니 키트 (Qiagen, CA, USA)를 이용하였고, 최종 산물을 RNase-무함유 H₂O에 녹여 흡광도계 260 nm에서 정량하였다. RNA에서 cDNA로의 역전사 반응은, 2㎍의 RNA와 0.5㎍ 올리고 dT, 1mM dNTP의 혼합액을 13 ㎕로 맞추어 65℃에서 5 분간 전 배양 하였다. 이후 역전사 반응 용액 (50 mM Tris-HCl [pH 8.3], 50 mM K㎍㎍Cl, 10 mM MgCl₂, 10 mM 디티오트레이톨, 0.5 mM 스퍼미딘)에 20 unit RNasin, 10 unit AMV 역전사 효소를 포함하여 총 용량이 20 ㎕가 되도록 하고 42℃에서 1 시간 배양, 70℃에서 15 분간 배양하였다. 반정량-PCR은 1 ㎍의 cDNA로 반응시켰다. 반응 용액은 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 1mM dNTP, 2.5 unit Taq DNA 중합효소 (Promega, WI, USA), 4 pM 프라이머를 포함하여 총 용량이 50 ㎕가 되도록 dH₂O를 첨가하였다. 실험에 이용된 프라이머는 집돼지 (Sus scrofa Domesticus)의 CD86 유전자에 기초한 것으로, 다음과 같다(Maher, S. E. et al., J. Immunol. 157, 3838-3844, 1996).

센스 프라이머(서열번호 5)

5'-GCG GTA CCA TGG GAC TGA GTA ACA TT-3'

안티센스 프라이머(서열번호 6)

5'-GCC TCG AGT TAA AAA TCT GTA GTA CT-3'

증폭은 써멀 사이클러 PTC-200(Thermal cycler PTC-200, MJ Research Inc., MA, USA)을 이용하여 94℃에서 30초간 열 변성, 58℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 1 분간 합성하는 과정을 23회 반복 수행하였다. 산물은 2% 아가로스 겔로 확인하였고, 결과는 하우스키핑(housekeeping) 유전자인 글리세알데히드 3-포스페이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)의 mRNA 양으로 기준하였다.

그 결과, CD86 mRNA의 발현이 MPN3 세포주에서 발현되는 정도와 비교하여 M1C5와 M2C31 세포주에서 각각 84.7%와 80.2% 억제되는 효과를 보였다(도 4의 C).

<실시예 3>

형질전환에 의한 세포주의 변화 확인

돼지 주조직 면역복합체 (MHC)의 발현 변화를 유세포 분석으로 확인하였다. 0.05% 트립신-EDTA (Gibco BRL)에 세포를 부유시켜 단일 세포로 만들고, 1x HBSS (Sigma, MO, USA) 완충액을 사용하여 최종 농도가 5 ｘ 10⁵ ~ 1 ｘ 10⁶ cells/mL 이 되도록 재부유 하였다. 부유 상태에서 각 분자의 일차항체를 희석하여 처리하고 암상태, 상온에서 30 분간 반응시켰다. 돼지의 MHC 염색을 위해 마우스 항-SLA 클래스 I과 마우스항-SLA 클래스 II (VMRD Inc., Pullman, WA, USA)를 이용하였다. 이들 항체는 1:800 농도로 희석하여 처리하고 암상태, 상온에서 30 분간 반응시켰다. 이후 1x HBSS로 2 회 세척하고 일차항체의 각 아형(isotype) 별로 2차 항체로서 FITC-결합된 항-마우스 IgG (Serotec Ltd.)를 1:50 농도로 희석하여 처리한 후 암상태, 4 ℃에서 20 분간 반응시켰다. 그 후 다시 1xHBSS로 2회 세척 후 세포를 재부유하여 FACS 칼리버 시스템(Calibur system, Becton Dickinson, CA, USA)으로 형광체의 발현을 확인하였고, 분석은 CELLQUEST 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 이용하였다.

그 결과, 형질감염에 의해 각 세포주에서 주조직 적합성 분자의 발현에는 변화가 없는 것으로 확인되었다 (도 5).

<실시예 4>

형질 전환된 세포주에 대한 인간 T 세포주의 부착

상기 실시예 2의 형질 전환 세포주 M1C5와 M2C31에 대한 인간 T 세포주인 E6.1의 부착 정도를 조사하였다. MPN3, M1C5와 M2C31 세포주를 세포 배양 배지를 이용하여 8 x 10⁵cells/well 이 되도록 부유시켜 6 웰 배양접시에서 배양하였다. 인간 T 세포주인 E6.1 Jurkat 세포주는 1x HBSS를 이용하여 1 x 10⁷cells/mL로 부유시키고 녹색형광을 발현하게 하는 CFSE를 10uM로 처리하여 상온에서 8분간 배양하였다. 이 후 HBSS와 동량의 우혈청 (FBS)을 첨가하여 1 분간 반응시켜 반응을 정지시켰다. 1x PBS를 이용하여 2 회 세척한 후 부착된 내피세포에 혼합하여 2 시간 배양하였다. 1x PBS를 이용한 세척으로 부유된 세포를 모두 제거한 후 형광현미경에서 내피세포에 부착된 세포를 확인하였다. 또한 전체 세포를 수확하여 유세포 분석을 이용해 형광을 발현하는 세포 분획을 재확인하였다. 실험 결과, 인간 T 세포주는 M1C5에 대해서는 70% 감소, M2C31에 대해서는 58%까지 접착성이 감소하였다 (도 6).

<실시예 5>

형질 전환된 세포주와 인간 T 세포의 혼합 림프구 배양

인간 T 림프구를 분리하기 위해 서울대학교병원 윤리위원회 (Institutional Review Board, IRB)의 심의과정을 준수하여 건강하고 자발적인 20 - 30세의 기증자로부터 말초혈액을 획득하였다. 말초혈액 단핵구 (PBMC)의 분리는 Ficoll-Paque^TMPLUS (density, 1.077, Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA)를 이용하였다. 이 과정을 간단히 요약하면, 혈액을 2mM EDTA (Gibco BRL)가 첨가된 동량의 1x PBS로 희석한 후, 이를 Ficoll-Paque^TM PLUS가 들어있는 튜브에 조심스럽게 얹고 1750 RPM으로 20 분간 원심분리 하였다. Ficoll 층과 혈장 사이에 버피(buffy) 형태의 PBMC 층을 수확하여 2mM EDTA-PBS로 부유시켜 세척하였다. 그 후 적혈구 용혈 완충액 (erythrocyte lysis buffer, Qiagen, SA, USA)에서 15 분간 배양하여 섞여있는 적혈구를 제거하고 다시 2mM EDTA-PBS로 3 회 세척하였다. 확보된 PBMC는 10% 우혈청, 1% 항생제가 포함된 RPMI 1640 (Welgene Inc.) 배지로 부유시켜 MPN3에 대한 반응에 이용하였다.

인간 T 림프구 분리를 위한 PBMC는 T-75 플라스크(Falcon)에 넣어 37℃, 5% CO₂배양기에서 4 - 12 시간 배양하여 부착력이 우수한 대식세포를 제거하였다. 그 후 수확한 세포에서 두 번의 선택과정을 거쳐 CD4⁺ T 림프구를 분리하였다. 먼저 인간 CD4⁺ T 세포 분리 키트 II (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)로 음성 선택 (negative selection)을 수행하였다. 음성 선택은 PBMC 중 CD4⁺ T 림프구를 제외한 CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCR 과 Glycophorin A 세포들의 표지자에 대해 마이크로비드가 결합된 항체가 포함되어 있어 이를 제거하고 남은 세포를 모으는 것으로, 항체 반응시킨 세포를 LD 컬럼 (Miltenyi Biotec)을 통과시켜 CD4⁺T-리치 세포군을 획득하였다. 음성 선택으로 획득한 세포는 다시 마이크로비드가 결합된 CD4 T 항체 (Miltenyi Biotec)를 아이스에서 15 분간 반응 시 킨 후 LS 컬럼 (Miltenyi Biotec)을 통과시켜 컬럼에 남아있는 세포를 수확 (양성선택, positive selection)하였다. T 림프구의 순수도는 99% 이상이었고, RPMI 1640 배양 배지에서 배양하였다.

MPN3에 대한 인간 T 림프구의 혼합 림프구 반응과정은 다음과 같다. MPN3에 0.05% 트립신-EDTA를 처리하여 수확한 후 96 웰 플레이트(well flat-bottom plate, Falcon)에 5 x 10⁴ cells/100uL/well이 되게 접종하였다. 4 시간 경과 후 세포의 부착이 확인되면, 방사선 (γ-irradiation, 30 Gy)을 조사하였다. MPN3의 배지를 제거한 후 인간 말초혈액 T, CD4⁺ T 림프구를 1 - 2 x 10⁵/200 uL씩 혼합하여 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 인간 T 림프구 증식반응은 2 - 8 일간 측정하였고, 수확 전 16 시간 동안 1 uCi/well의 ³H-티미딘 (Amersham Pharmacia Biotech)을 처리하였다. 혼합반응 후 인간 T 림프구는 세포 수확기(Inotech Cell Harvester, Inotech Biotechnologies Ltd., Germany)를 이용하여 유리섬유 필터(glass-fiber filter, Printed Filtermat A, Wallac, Turku, Finland)로 수확하였다. 필터를 샘플 백(sample back, 1450 MicroBetaTM용, PerkinElmer Life And Analytical Sciences Inc., MA, USA)에 넣고 버퍼(scintillation buffer, Betaplate Scint, PerkinElmer Life And Analytical Sciences Inc.)를 처리한 후, 액체 섬광계수기 (1450 LSC & Luminescence Counter, PerkinElmer Life And Analytical Sciences Inc.)로 측정하였다. CD86 발현이 억제된 혈관 내피 세포주에 대한 인간 CD4⁺T 림 프구의 반응을 조사하기 위하여 돼지 CD86의 발현이 넉 다운된 M1C5, M2C31 세포주에 대한 CD4⁺ T 림프구 반응을 분석하였다. 인간 CD4⁺T 림프구 분리와 MPN3, M1C5와 M2C31 세포 준비는 위에서 언급한 혼합배양 방법과 동일하게 수행하였고, 무처리 군의 내피세포에 인간 CD4⁺ T 림프구 2 x 10⁵/200uL 를 섞어 1:4 비율로 반응시켰다.

인간 CD4⁺ T 세포와 혼합림프구 배양을 한 결과, M1C5는 대조군에 비해 68% 그리고 M2C31은 62%까지 인간 CD4⁺ T 세포의 활성화를 억제하였다 (도 7).

본 발명에 의한 돼지 CD86 분자를 넉 다운한 돼지 혈관 내피 세포주는 이종장기이식에서 인간 T 세포의 활성화를 저해하는 효과가 있고, 이를 이용한 넉 다운 장기이식용 형질전환돼지를 생산할 경우 인간 T 세포 및 자연 살해 세포에 의한 면역거부반응을 효과적으로 제어할 수 있다.

<110> GACHON UNIVERSITY OF MEDICINE AND SCIENCE INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> CD86 Knockdown Transgenic Pig Vascular Endothelial Cell Line and Preparation Method Thereof <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCD86-1 sense <400> 1 agggccgcat ggacttgttt agatctgaaa caagtccatg cggccctttt ttt 53 <210> 2 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCD86-1 antisense <400> 2 aattaaaaaa agggccgcat ggacttgttt cagatctaaa caagtccatg cggccctggc 60 c 61 <210> 3 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCD86-2 sense <400> 3 cagtggtcgt tgtgtgtggt agatctgacc acacacaacg accactgttt ttt 53 <210> 4 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCD86-2 antisense <400> 4 aattaaaaaa cagtggtcgt tgtgtgtggt cagatctacc acacacaacg accactgggc 60 c 61 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 5 gcggtaccat gggactgagt aacatt 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 6 gcctcgagtt aaaaatctgt agtact 26

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 돼지 CD86 분자의 발현을 억제하는 siRNA.
서열번호 3 및 서열번호 4의 핵산서열로 이루어진 돼지 CD86 분자의 발현을 억제하는 siRNA.
제1항 또는 제2항의 siRNA 서열, 상기 siRNA 서열의 발현을 개시할 수 있는 프로모터 및 항생제 내성 유전자를 포함하는 돼지 CD86 분자의 발현을 억제하는 siRNA 발현벡터.
제3항에 있어서, 상기 프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터 및 RNA 폴리머라아제 III 프로모터로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 발현 벡터.
제3항에 있어서, 상기 항생제 내성 유전자는 하이그로마이신 B-내성 유전자, 암피실린-내성 유전자, 제오신-내성 유전자 및 퓨로마이신-내성 유전자로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 발현 벡터.
제3항에 있어서, 상기 발현 벡터는 도 2의 개열지도를 갖는 siCD86-1/pSNU6-1.2 또는 siCD86-2/ pSNU6-1.2인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제3항에 따른 발현 벡터를 돼지 혈관 내피 세포주에 도입하는 것을 특징으로 하는 CD86이 넉 다운된 형질전환 돼지 혈관 내피 세포주의 제조방법.
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제7항에 따른 방법에 따라 제조되고, 기탁번호가 KCLRF-BP-00130인 것을 특징으로 하는 CD86이 넉 다운된 형질전환 돼지 혈관 내피 세포주.
제7항에 있어서,

상기 발현벡터의 siRNA 서열의 발현을 개시할 수 있는 프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터 및 RNA 폴리머라아제 III 프로모터로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,

상기 발현벡터의 항생제 내성 유전자는 하이그로마이신 B-내성 유전자, 암피실린-내성 유전자, 제오신-내성 유전자 및 퓨로마이신-내성 유전자로 이루어진 군중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,

상기 발현벡터는 도 2의 개열지도를 갖는 siCD86-1/pSNU6-1.2 또는 siCD86-2/ pSNU6-1.2인 것을 특징으로 하는 방법.