WO2021225159A1 - Ｇｉｔｒ結合性分子 - Google Patents

Ｇｉｔｒ結合性分子 Download PDF

Info

Publication number
WO2021225159A1
WO2021225159A1 PCT/JP2021/017479 JP2021017479W WO2021225159A1 WO 2021225159 A1 WO2021225159 A1 WO 2021225159A1 JP 2021017479 W JP2021017479 W JP 2021017479W WO 2021225159 A1 WO2021225159 A1 WO 2021225159A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
heavy chain
gitr
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/017479
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
洋 珠玖
泰 赤堀
Original Assignee
国立大学法人三重大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人三重大学 filed Critical 国立大学法人三重大学
Priority to JP2022519631A priority Critical patent/JPWO2021225159A1/ja
Publication of WO2021225159A1 publication Critical patent/WO2021225159A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to GITR-binding molecules and the like.
  • GITR glucocorticoid-induced TNFR-related protein
  • TNFRSF18 a membrane protein expressed in peripheral blood T cells and bone marrow cells
  • GITRL GITR ligand
  • stimulation from GITRL transmits co-stimulation to T cells, which in turn transmits activation signals via NFkB signals, and T cells are resistant to suppression of activation by Tregs.
  • a stimulation system that targets GITR and a drug distribution system that targets GITR.
  • An object of the present invention is to provide a GITR-binding molecule.
  • the present inventor has a heavy chain variable region containing heavy chain CDRs 1 to 3 containing a specific amino acid sequence, and / or a light chain containing light chain CDRs 1 to 3 containing a specific amino acid sequence. It was found that excellent binding to GITR can be exhibited by including a chain variable region.
  • the present inventor has completed the present invention as a result of further research based on this finding. That is, the present invention includes the following aspects.
  • Variable heavy chain including heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9, and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10.
  • Chain variable region (C) Heavy chain variable including heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41, and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42.
  • Item 2 The GITR-binding molecule according to Item 1, which has the feature (A), the feature (B), or the feature (C).
  • Item 3 The GITR-binding molecule according to Item 1 or 2, which has the above-mentioned characteristic (A).
  • Item 4. The GITR-binding molecule according to any one of Items 1 to 3, which contains an antibody structure.
  • Item 5 At least selected from the group consisting of immunoglobulin structure, Fab structure, F (ab') 2 structure, minibody structure, scFv-Fc structure, Fv structure, scFv structure, deerbody structure, triabody structure, and tetrabody structure.
  • Item 4. The GITR-binding molecule according to any one of Items 1 to 4, which comprises one type of structure.
  • Item 6 A polynucleotide encoding the GITR-binding molecule according to any one of Items 1 to 5.
  • Item 7 A cell containing the polynucleotide according to item 6.
  • Item 8 A medicament containing at least one selected from the group consisting of the GITR-binding molecule according to any one of Items 1 to 5 and the polynucleotide according to Item 6.
  • Item 9 An adjuvant containing at least one selected from the group consisting of the GITR-binding molecule according to any one of Items 1 to 5 and the polynucleotide according to Item 6.
  • Item 10 A reagent containing at least one selected from the group consisting of the GITR-binding molecule according to any one of Items 1 to 5 and the polynucleotide according to Item 6.
  • GITR-binding molecule can be provided.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the antibody screen method (GITR forced expression cell screen) of Test Example 1-4
  • (B) is a schematic diagram of the antibody screen method (screen for immobilized GITR protein) of Test Example 1-5.
  • the figure is shown.
  • the antibody phage library is reacted with GITR forced expression 293T cells, and the polyclonal antibody phage bound to the cells is sorted by centrifugation using an organic solvent.
  • biotin-bound GITR-Fc binds to neutravidin while maintaining its three-dimensional structure, and phage antibodies that bind to this can be selected. By diluting the antigen concentration, clones with strong binding are selected.
  • the FACS result of Isotype control in the examination of cell surface expression GITR recognition ability (Test Example 2-2) is shown.
  • the vertical axis shows the number of cell counts, and the horizontal axis shows the fluorescence intensity.
  • the FACS result of antibody clone A in the examination of cell surface expression GITR recognition ability (Test Example 2-2) is shown.
  • the vertical axis shows the number of cell counts, and the horizontal axis shows the fluorescence intensity.
  • the FACS result of antibody clone B in the examination of cell surface expression GITR recognition ability (Test Example 2-2) is shown.
  • the vertical axis shows the number of cell counts, and the horizontal axis shows the fluorescence intensity.
  • the FACS result of antibody clone C in the examination of cell surface expression GITR recognition ability (Test Example 2-2) is shown.
  • the vertical axis shows the number of cell counts, and the horizontal axis shows the fluorescence intensity.
  • the FACS result of antibody clone D in the examination of cell surface expression GITR recognition ability (Test Example 2-2) is shown.
  • the vertical axis shows the number of cell counts, and the horizontal axis shows the fluorescence intensity.
  • the FACS result of Isotype control (mouse IgG2a) in the examination of GITR recognition on naturally activated human T cells (Test Example 3-1) is shown.
  • the FACS result of Isotype control (HERCEPTIN) in the examination of GITR recognition on naturally activated human T cells (Test Example 3-1) is shown.
  • the FACS results of a commercially available antibody in the examination of GITR recognition on naturally activated human T cells (Test Example 3-1) are shown.
  • the FACS result of antibody clone B in the examination of GITR recognition on naturally activated human T cells (Test Example 3-1) is shown.
  • the FACS results in the examination of GITR recognition on natural CAR T cells (Test Example 3-2) are shown.
  • Identity of amino acid sequences refers to the degree of coincidence of amino acid sequences with each other among two or more comparable amino acid sequences. Therefore, the higher the match between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity is determined, for example, using FASTA, a sequence analysis tool, using default parameters.
  • FASTA a sequence analysis tool
  • the algorithm BLAST by Karlin and Altschul Karlin and Altschul (KarlinS, Altschul SF. “Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes” Proc Natl Acad Sci USA.
  • a program called BLASTX based on such a BLAST algorithm has been developed. Specific methods for these analysis methods are known, and the National Center for Biotechnology Information (NCBI) website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) can be referred to.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the "identity" of the base sequence is also defined according to the above.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • substitution between amino acid residues having a basic side chain such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution.
  • amino acid residues with acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues with non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine and tryptophan
  • amino acid residues with beta-branched side chains such as threonine, valine and isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan and histidine Substitution between amino acid residues is also a conservative substitution.
  • CDR is an abbreviation of C omplementarity D etermining R egion, also called complementarity determining regions.
  • the CDR is a region existing in the variable region of immunoglobulin, and is a region deeply involved in the specific binding of the antibody to the antigen.
  • the "light chain CDR” means a CDR existing in the light chain variable region of immunoglobulin
  • the “heavy chain CDR” means a CDR existing in the heavy chain variable region of immunoglobulin.
  • the "variable region” means an region including CDR1 to CDR3 (hereinafter, simply referred to as "CDRs1-3").
  • CDRs1-3 CDR1 to CDR3
  • the arrangement order of these CDRs1-3 is not particularly limited, but preferably, the frames are continuous or described later in the order of CDR1, CDR2, and CDR3 in the direction from the N-terminal side to the C-terminal side, or vice versa. It means a region arranged via another amino acid sequence called a work region (FR).
  • the "heavy chain variable region” is a region in which the above-mentioned heavy chain CDRs1-3 is arranged, and the “light chain variable region” is a region in which the above-mentioned light chain CDRs1-3 is arranged.
  • FR framework areas
  • the region between the N-terminal of the variable region and CDR1 is FR1
  • the region between CDR1 and CDR2 is FR2
  • the region between CDR2 and CDR3 is FR3
  • the region between CDR3 and the C-terminal of the variable region is Defined as FR4 respectively.
  • GITR-binding molecule having any of the following characteristics (A) to (D) (in the present specification, it may be referred to as "GITR-binding molecule of the present invention”. There is.) This will be described below.
  • the GITR-binding molecule of the present invention is particularly limited as long as it has any of the following characteristics (A) to (D) and has binding property (preferably specifically binding) to GITR. Not limited.
  • Feature (A) includes heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • Feature (B) includes heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25, and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26.
  • Feature (C) includes heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41, and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 42.
  • Feature (D) includes heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 56, heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 57, and heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 58.
  • the GITR binding molecule of the present invention preferably has a feature (A), a feature (B), or a feature (C), and more preferably has a feature (A) or a feature (B). It has, and more preferably has the feature (A).
  • the GITR-binding molecule of the present invention preferably contains both the heavy chain variable region and the light chain variable region in each of the characteristics (A) to (D).
  • the heavy chain variable region is preferably 90% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 ( It is a heavy chain variable region containing an amino acid sequence having an identity of preferably 95% or more, preferably 98% or more, preferably 99% or more).
  • the light chain variable region is preferably 90% or more (preferably 95% or more, preferably 98% or more, preferably 99%) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. It is a light chain variable region containing an amino acid sequence having the same identity as above). If there is an amino acid mutation from SEQ ID NO: 3 or 4, the mutation is preferably an amino acid substitution, more preferably a conservative substitution of an amino acid.
  • the heavy chain variable region is preferably 90% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 ( It is a heavy chain variable region containing an amino acid sequence having an identity of preferably 95% or more, preferably 98% or more, preferably 99% or more).
  • the light chain variable region is preferably 90% or more (preferably 95% or more, preferably 98% or more, preferably 99%) of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 20 or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 20. It is a light chain variable region containing an amino acid sequence having the same identity as above). If there is an amino acid mutation from SEQ ID NO: 19 or 20, the mutation is preferably an amino acid substitution, more preferably a conservative substitution of an amino acid.
  • the heavy chain variable region is preferably 90% or more of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 35 or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 35 ( It is a heavy chain variable region containing an amino acid sequence having an identity of preferably 95% or more, preferably 98% or more, preferably 99% or more).
  • the light chain variable region is preferably 90% or more (preferably 95% or more, preferably 98% or more, preferably 99%) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36. It is a light chain variable region containing an amino acid sequence having the same identity as above). If there is an amino acid mutation from SEQ ID NO: 35 or 36, the mutation is preferably an amino acid substitution, more preferably a conservative substitution of an amino acid.
  • the heavy chain variable region is preferably 90% or more of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 51 or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 51 ( It is a heavy chain variable region containing an amino acid sequence having an identity of preferably 95% or more, preferably 98% or more, preferably 99% or more).
  • the light chain variable region is preferably 90% or more (preferably 95% or more, preferably 98% or more, preferably 99%) of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 52 or the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 52. It is a light chain variable region containing an amino acid sequence having the same identity as above). If there is an amino acid mutation from SEQ ID NO: 51 or 52, the mutation is preferably an amino acid substitution, more preferably a conservative substitution of an amino acid.
  • the structure of the GITR-binding molecule of the present invention is not particularly limited.
  • the GITR-binding molecule of the present invention preferably contains an antibody structure.
  • the structure (tag, signal sequence, etc. described later) may be added.
  • the antibody structure may include a constant region of immunoglobulin or may not include a constant region of immunoglobulin.
  • the constant region When the constant region is included, the heavy chain constant region (CH1, CH2, and CH3) and the light chain constant region (CL) may be all included, and any one or more of these may be included. May include a combination of.
  • antibody structures include immunoglobulin structure, Fab structure, F (ab') 2 structure, minibody structure, scFv-Fc structure, Fv structure, scFv structure, diabody structure, and triabody structure.
  • (Triabody) structure, tetrabody structure and the like can be mentioned.
  • Immunoglobulin has a structure in which two structures consisting of one heavy chain having a heavy chain variable region and a heavy chain constant region and one light chain having a light chain variable region and a light chain constant region are combined.
  • Fab includes a heavy chain fragment containing CH1 in a heavy chain variable region and a heavy chain constant region, and a light chain containing a light chain variable region and a light chain constant region (CL), and includes a heavy chain variable region and a light chain. It has a structure in which the chain variable region is associated by the non-covalent intermolecular interaction described above or is bound by a disulfide bond.
  • CH1 and CL may be disulfide-bonded with each other by the thiol groups of the cysteine residues present in each.
  • F (ab') 2 has two pairs of the above Fabs, and CH1 is a structure formed by disulfide bonds between thiol groups of cysteine residues contained therein.
  • the minibody is a structure in which two fragments in which CH3 is bound to the heavy chain variable region constituting the following scFv are associated with each other by non-covalent intermolecular interaction.
  • scFv-Fc With scFv-Fc, the following two antibody fragments containing scFv, CH2, and CH3 are associated with each other by non-covalent intermolecular interaction between CH3s as in the case of the above minibody, and the cysteine residue contained in each CH3. It is a structure in which thiol groups of groups are disulfide-bonded to each other.
  • Fv is also called the smallest structural unit of an antibody, and is a structure in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are associated by a non-covalent intermolecular interaction.
  • the thiol groups of cysteine residues existing in the heavy chain variable region and the light chain variable region may be disulfide-bonded to each other.
  • scFv is a structure in which the C-terminal of the heavy chain variable region and the N-terminal of the light chain variable region are linked by a linker, or the N-terminal of the heavy chain variable region and the C-terminal of the light chain variable region are linked by a linker. It is a structure and is also called a single chain antibody.
  • the above scFv forms a dimer, a trimer, and a tetramer, respectively, and like Fv, non-covalent intermolecular interactions between variable regions, etc.
  • the structure is structurally stable.
  • the GITR-binding molecule of the present invention is immunoglobulin
  • its class is not particularly limited. Examples of the class include IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, and the like, and further include subclasses thereof.
  • the origin of the antibody structure is not particularly limited.
  • the antibody structure can be, for example, a human-derived antibody, a mouse-derived antibody, a rat-derived antibody, a rabbit-derived antibody, a monkey-derived antibody, a chimpanzee-derived antibody, or the like.
  • the antibody structure includes chimeric antibodies (for example, antibodies in which the amino acid sequence of the constant region of an antibody derived from a non-human organism (such as mouse) is replaced with the amino acid sequence of the constant region of a human-derived antibody), a humanized antibody, and a completely human antibody. It may be a chemical antibody or the like.
  • the GITR-binding molecule of the present invention is preferably a monoclonal molecule (that is, a molecular population having a single amino acid sequence and structure).
  • the molecular weight of the GITR-binding molecule of the present invention is not particularly limited, but the lower limit is, for example, 20,000, 50,000, 100,000, or 120,000, and the upper limit is, for example, 1,000,000, 500,000, or 200,000.
  • the GITR-binding molecule of the present invention may be a molecule composed of one kind of polypeptide or a molecule composed of a complex of two or more kinds of polypeptides. Further, the GITR-binding molecule of the present invention may be a molecule composed of a polypeptide or a complex thereof, or another substance (for example, a fluorescent substance, a radioactive substance, an inorganic particle, etc.) may be added to the polypeptide or the complex thereof. May be connected.
  • the GITR-binding molecule of the present invention may be chemically modified.
  • R in the ester is, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; for example, phenyl.
  • C 6-12 aryl groups such as ⁇ -naphthyl; for example, phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl, phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl.
  • Aralkyl group; Pivaloyloxymethyl group etc. are used.
  • the polypeptide constituting the GITR-binding molecule of the present invention may have a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal amidated or esterified. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the polypeptide constituting the GITR binding molecules of the present invention the amino group of the amino acid residues of the N-terminal protecting group (e.g., formyl group, such as C 1-6 alkanoyl such as acetyl group C 1-6 Those protected with an acyl group (such as an acyl group), those in which the N-terminal glutamine residue that can be cleaved and produced in vivo is pyroglutamine-oxidized, and substituents on the side chain of amino acids in the molecule (for example, -OH,- SH, amino group, imidazole group, indol group, guanidino group, etc.) are protected by suitable protective groups (eg, C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl group such as formyl group, acetyl group, etc.) What is included is also included.
  • suitable protective groups eg, C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl group such as formyl
  • the GITR-binding molecule of the present invention may be one to which a protein or peptide such as a known protein tag or signal sequence is added.
  • a protein or peptide such as a known protein tag or signal sequence
  • the protein tag include biotin, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, PA tag, fluorescent protein tag and the like.
  • the GITR-binding molecule of the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt with an acid or base.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and either an acidic salt or a basic salt can be adopted.
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, and apple.
  • Organic acid salts such as acid salts, citrates, methane sulfonates and paratoluene sulfonates; amino acid salts such as asparaginates and glutamates can be mentioned.
  • basic salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt.
  • the GITR-binding molecule of the present invention may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
  • the GITR-binding molecule of the present invention comprises, for example, culturing a host transformed with a polynucleotide encoding the GITR-binding molecule of the present invention and recovering a fraction containing the GITR-binding molecule of the present invention. It can be manufactured by the method.
  • the polynucleotide encoding the GITR-binding molecule of the present invention is not particularly limited as long as it contains the GITR-binding molecule of the present invention in an expressible state, and other than the coding sequence of the GITR-binding molecule of the present invention, other It may contain an array.
  • Other sequences include a secretory signal peptide coding sequence, a promoter sequence, an enhancer sequence, a repressor sequence, an insulator sequence, a replication base point, and a drug resistance gene coding sequence, which are arranged adjacent to the GITR-binding molecular coding sequence of the present invention. And so on.
  • the polynucleotide encoding the GITR-binding molecule of the present invention may be a linear polynucleotide or a cyclic polynucleotide (vector or the like).
  • polynucleotide examples include (I) a base sequence encoding at least one selected from the group consisting of heavy chains, heavy chain variable regions, and heavy chain CDRs1-3 of the GITR-binding molecule of the present invention.
  • Polynucleotide, (II) A polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding at least one selected from the group consisting of the light chain, the light chain variable region, and the light chain CDRs1-3 of the GITR-binding molecule of the present invention, (III).
  • a polynucleotide containing a base sequence encoding at least one selected from the group consisting of the heavy chain, the heavy chain variable region, and the heavy chain CDRs1-3 of the GITR-binding molecule of the present invention, and the GITR-binding property of the present invention examples thereof include a polynucleotide containing a base sequence encoding at least one selected from the group consisting of the light chain, the light chain variable region, and the light chain CDRs 1-3 of the molecule.
  • the host is not particularly limited, and examples thereof include insect cells, eukaryotic cells, and mammalian cells. Among them, from the viewpoint of more efficiently expressing the antibody, mammalian cells such as HEK cells, CHO cells, NS0 cells, SP2 / O cells, and P3U1 cells are preferable.
  • mammalian cells such as HEK cells, CHO cells, NS0 cells, SP2 / O cells, and P3U1 cells are preferable.
  • the method of transformation, culturing, and recovery is not particularly limited, and a known method in antibody production can be adopted. After recovery, the GITR-binding molecule of the present invention may be purified, if necessary. Purification can be performed by known methods in antibody production, such as chromatography, dialysis and the like.
  • polynucleotides of the invention that encode the GITR-binding molecules of the invention. This will be described below.
  • the polynucleotide of the present invention may contain other sequences in addition to the coding sequence of the GITR-binding molecule of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention preferably contains the GITR-binding molecule of the present invention in an expressible state. Examples of other sequences include a promoter sequence, an enhancer sequence, a repressor sequence, an insulator sequence, a replication base point, a reporter protein (for example, a fluorescent protein, etc.) coding sequence, a drug resistance gene coding sequence, and the like.
  • the polynucleotide of the present invention may be a linear polynucleotide or a cyclic polynucleotide (vector or the like).
  • the vector can be a plasmid vector, or a viral vector (eg, adenovirus, or retrovirus).
  • the vector can be, for example, a cloning vector or an expression vector.
  • the expression vector include a vector for prokaryotic cells such as Escherichia coli and actinomycetes, and a vector for eukaryotic cells such as yeast cells, insect cells, and mammalian cells.
  • the polynucleotide of the present invention includes not only DNA and RNA, but also those to which known chemical modifications are applied, as illustrated below.
  • PS phosphorothioate
  • methylphosphonate methylphosphonate
  • phosphorodithionate to prevent degradation by hydrolytic enzymes such as nucleases.
  • the hydroxyl group at the 2-position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is changed to -OR (R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2'-O-MOE), CH.
  • the base moiety (pyrimidine, purine) may be chemically modified, for example, introduction of a methyl group or a cationic functional group at the 5-position of the pyrimidine base, or substitution of the carbonyl group at the 2-position with thiocarbonyl.
  • examples thereof include those in which the phosphoric acid moiety and the hydroxyl moiety are modified with biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • polynucleotide includes not only natural nucleic acids but also any of BNA (Bridged Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PNA (Peptide Nucleic Acid) and the like.
  • the present invention relates, in one aspect, to cells containing the polynucleotides of the invention (sometimes referred to herein as "cells of the invention”). This will be described below.
  • the cell from which the cell of the present invention is derived is not particularly limited.
  • the derived cells include cells that can be used for protein expression (for example, insect cells, eukaryotic cells, mammalian cells, etc.). Can be mentioned.
  • Examples of cells include Escherichia coli K12 and other Escherichia coli, Bacillus subtilis MI114 and other Bacillus bacteria, Saccharomyces cerevisiae AH22 and other yeast, Spodoptera frugiperda-derived Sf cell lineage, and Trichoplusia ni-derived High Five cell lineage, and olfactory nerve cells.
  • Examples include animal cells such as insect cells and COS7 cells.
  • the animal cells are preferably cultured cells derived from mammals, specifically, COS7 cells, CHO cells, HEK293 cells, HEK293FT cells, Hela cells, PC12 cells, N1E-115 cells, SH-SY5Y cells and the like. Be done.
  • the present invention in one aspect thereof, comprises a composition containing at least one selected from the group consisting of the GITR-binding molecule of the present invention and the polynucleotide of the present invention (in the present specification, "the present invention”. It may be referred to as "composition").
  • the GITR-binding molecule of the present invention can bind to GITR expressed in cells. Therefore, at least one selected from the group consisting of the GITR-binding molecule of the present invention and the polynucleotide of the present invention can be used as an active ingredient of, for example, a drug, an adjuvant, a reagent or the like.
  • use as an adjuvant molecule that stimulates the T cell response that is, use as an agonist molecule that stimulates activated T cells
  • use as an agonist molecule that stimulates activated T cells in addition to the method of administration as a protein molecule, CAR-introduced T cells, Use as a molecule that stimulates them by co-expressing them in TCR-introduced T cells; Use as a DNA vaccine; Use as an reagent that delivers molecules to activated T cells; Since it is obtained, its use in the treatment of autoimmune diseases can be mentioned.
  • the antibody molecule having agonist activity can be selected by a reporter assay.
  • a reporter assay For example, it can be selected by the following method.
  • Jurkat E6J cells are modified into reporter cells that express CFP in an NF-kB-dependent manner, and GITR is forcibly expressed in these reporter cells. Confirm that the reporter works by the agonist molecule by GITRL administration experiment.
  • the antibody is modified into a membrane-bound type and introduced into reporter cells with a retrovirus.
  • the cells into which the agonist antibody has been introduced stimulate GITR in autocline and express CFP, so they can be selected with a cell sorter. From this, scFv is recovered and transformed into a minibody antibody to examine the agonist activity.
  • the content of the active ingredient in the composition of the present invention depends on the type of use, for example, if the use is pharmaceutical, the type of target disease, the target therapeutic effect, the administration method, the treatment period, and the patient. It can be appropriately set in consideration of the age of the patient, the weight of the patient, and the like.
  • the content of the active ingredient in the composition of the present invention can be about 0.0001 parts by weight to 100 parts by weight, assuming that the entire composition of the present invention is 100 parts by weight.
  • composition of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect can be obtained.
  • oral administration and parenteral administration for example, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration
  • Percutaneous administration, local administration can be administered to mammals including humans.
  • the preferred dosage form is parenteral administration, more preferably intravenous injection.
  • Dosage forms for oral administration and parenteral administration and methods for producing the same are well known to those skilled in the art, and the active ingredient can be produced according to a conventional method by mixing it with a pharmaceutically acceptable carrier or the like. can.
  • Formulations for parenteral administration include injectable preparations (eg, drip injections, intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections), external preparations (eg ointments, paps, lotions). Agents), suppository inhalants, eye agents, eye ointments, nasal drops, ear drops, liposomes and the like.
  • an injectable preparation is prepared by dissolving an antibody or a cell in distilled water for injection, and if necessary, a lysis aid, a buffer, a pH adjuster, an isotonic agent, a soothing agent, a preservative, and a preservative. Stabilizers and the like can be added.
  • the pharmaceutical can also be a lyophilized preparation for preparation of errands.
  • the carrier used for the formulation of the composition of the present invention includes a substrate, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, a colorant, a flavoring and odorant commonly used in the art, and if necessary, a stabilizer.
  • Agents, emulsifiers, absorption enhancers, surfactants, pH regulators, preservatives, antioxidants, bulking agents, wetting agents, surface activators, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, pain relief Agents and the like can be used.
  • the amount of the composition of the present invention to be used depends on the type of use, for example, if the use is pharmaceutical, the route of administration, the type of disease, the degree of symptoms, the age, sex, weight of the patient, and the seriousness of the disease. Based on various factors such as degree, pharmacokinetic and toxicological characteristics, availability of drug delivery system, and whether it is administered as part of a combination of other drugs, by a clinician Can be decided.
  • the dose of the drug can be, for example, about 1 ⁇ g / kg (body weight) to 10 g / kg (body weight) per day.
  • the administration schedule of the drug can also be determined in consideration of the same factors as the dose. For example, the above daily dose can be administered once a day to January.
  • Test example 1 As an antibody for the purpose of obtaining an anti-GITR antibody, it is necessary to recognize the natural form of GITR expressed on the cell surface and strongly bind to it. In addition, a means for obtaining at least a plurality of antibodies was required. This time, we have developed a screen method using an organic solvent and developed a method to obtain the desired antibody by combining it with a solid-phase antigen screen. Specifically, it was carried out as follows.
  • Test Example 1-1 Preparation of human antibody library AIMS6 With the consent of the patient, mRNA was prepared from human surgical materials (tonsil, bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood), and based on this, VH and VL were prepared using specific primers. Amplified. It was recombined with pTZ19R as a fusion gene (scFv-cp3) of M13 phage with cp3 to prepare a plasmid library. Escherichia coli into which this gene was introduced was amplified and infected with helper phage KO7 to prepare an antibody library AIMS6 expressing scFv-cp3 on M13 phage.
  • Test Example 1-2 Preparation of GITR-Fc A gene fragment with an Avi-tag attached to the C-terminal is prepared by fusing the extracellular domain of the human GITR gene with the Fc portion of human IgG1, and this is co-expressed with secretory biotin ligase. Incorporate into the designed pCAGGS vector, introduce into 293T cells, cultivate in GIT medium containing biotin 2 microgram / ml, collect the culture supernatant, and purify with a protein-G column to obtain biotinylated GITR-Fc protein. Obtained.
  • Test Example 1-3 Preparation of GITR forced expression 293T cells
  • the human GITR gene was introduced into pCDNA3.1neo, introduced into 293T cells, and cultured in the presence of G418 to obtain GITR forced expression 293T cells.
  • the cells were introduced into mouse cells CMS5a and cultured to obtain GITR forced expression CMS5a cells.
  • Test Example 1-4 Antibody screen against GITR forced expression cells using the human antibody library AIMS A schematic diagram of the antibody screen method of this test example is shown in FIG. 1 (A).
  • Glucose was 2% and ampicillin was 200 microgram / ml. After culturing in the containing 2xYT medium, the glucose concentration was lowered to 0.05%, and then the helper phage KO7 was infected and cultured to obtain a phage solution. The second and third organic solvent screens were layered on the organic solvent and centrifuged four times, and the antibody population with strong binding was selected. At this point, polyclone antibodies that bind to a large number of cell surface antigens, including GITR, have been obtained. In order to narrow down the target GITR recognition antibody, the following screen using biotinylated GITR-Fc was performed.
  • Test Example 1-5 Antibody screen with immobilized human GITR protein A schematic diagram of the antibody screen method of this test example is shown in FIG. 1 (B).
  • Test example 2 Antibody evaluation 1 Test Example 2-1. ELISA evaluation of antibody clones Antibody clone Escherichia coli was cultured in 0.5 mM IPTG, 200 microgram / ml ampicillin 2xYT medium to obtain a culture supernatant containing scFv-cp3. Next, this culture supernatant was reacted with a maxisorp plate on which 0.5 microgram of GITR-Fc was immobilized, and then a rabbit anti-cp3 antibody and an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody were reacted to develop color with TMB. From the ELISA results, four antibody clones (antibody clones A, B, C, and D) having excellent binding to human GITR were selected.
  • the amino acid sequence of each region of each antibody clone and the base sequence encoding the same are shown below.
  • the CDR sequence was estimated by IMGT.
  • Heavy chain variable region nucleotide sequence CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAACACAAACTACGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACGCGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTACCCCTTAGTGGCTACCTGTACTACTTTGACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGA (SEQ ID NO: 49) Light chain variable region nucleotide sequence: GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGCCCAG
  • Test Example 2-2 Examination of cell surface expression GITR recognition ability of antibody clone hGITR forced expression CMS5a cells were reacted with the supernatant of the antibody clone, then the rabbit anti-cp3 antibody was reacted and washed, and then the anti-rabbit IgG-Alexa488 was reacted and washed. Then, it was measured by FACScalibur. The results are shown in FIGS. 2 to 6. Antibody clones A, B, C, or D were found to recognize hGITR forced expression CMS5a cells.
  • Test Example 2-3 Preparation of minibody type antibody
  • a fusion protein of scFv with human IgG1 Fc was prepared, recombined with pCAGGS, introduced into 293T cells, cultured, and the supernatant was collected. This was purified with protein G sepharose to obtain a minibody type antibody.
  • Test Example 2-4 Affinity evaluation of minibody type antibody (Fig. 3) BIAcore 3000 was used to evaluate the binding activity of the minibody of antibody clones A, B, C, and D.
  • the method is as follows.
  • the human GITR protein was bound to the sensor chip CM5 by the amine coupling method, and the minibody protein diluted with HBS-EP buffer was allowed to flow at a constant rate for 60 seconds to measure the binding reaction. Next, only the HBS-EP buffer was flowed and the dissociation reaction was measured. These values were calculated to calculate the dissociation constant KD.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • Test example 3 Antibody evaluation 2 Test example 3-1. GITR recognition on natural activated human T cells Human PBMC was stimulated with OKT3 and retronectin, and the expression of GITR on activated T cells as of day 6 was stained for CD8 cells and CD4 cells, and analyzed by FACSCANT. Was done. For commercially available monoclonal antibodies, Biolegend's APC-labeled clone 621 was used. The antibody of antibody clone B was reacted with the antibody and then stained with APC-labeled anti-human IgG antibody, and at the same time, stained with anti-CD8 and anti-CD4.
  • Test Example 3-2 Naturally Activated GITR Recognition on CAR T Cells Fresh PBMCs are not activated and expression of activation markers CD25 and GITR is absent. On the other hand, when activated by OKT3 and retronectin and then the CAR gene is introduced using a retrovirus, the activated T cells can observe the expression of CD25 and GITR. Fresh PBMC isolated by the Ficoll method and T cells at the time of day 13 when the CAR gene was introduced by activating it were stained with anti-CD25 antibody, commercially available monoclone GITR antibody, and antibody clone B antibody, and then stained with FACSCANT. Measurements were made.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

GITR結合性分子を提供すること。 特定のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3を含む重鎖可変領域、及び／又は特定のアミノ酸配列を含軽鎖CDR1～3を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、GITR結合性分子。

Description

ＧＩＴＲ結合性分子
　本発明は、GITR結合性分子等に関する。
　GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein)はTNFRSF18という名前でも知られており、末梢血T細胞や骨髄細胞に発現する膜タンパクで、ヒトでは３種類のsplice variantが存在することが知られている。特にT細胞では活性化に伴って発現が亢進する。そのリガンドはGITRリガンド（GITRL）であり、これはB細胞、マクロファージ、内皮細胞、樹状細胞上に発現している。GITRLからの刺激によってT細胞には共刺激が伝達され、それはNFkBシグナルを介して活性化のシグナルが伝達され、T細胞はT regによる活性化抑制に抵抗性となることが知られている。特にがん治療においては、がんを攻撃するエフェクターT細胞の活性維持と増殖促進が重要なので、GITRを標的とする刺激のシステムや、GITRを標的とした薬剤分配システムの構築が重要である。
　本発明は、GITR結合性分子を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、特定のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1～3を含む重鎖可変領域、及び／又は特定のアミノ酸配列を含軽鎖CDR1～3を含む軽鎖可変領域を含むことにより、GITRに対する優れた結合性を発揮できることを見出した。本発明者はこの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　（A）配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号10で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号14で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号15で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号16で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むこと、
（B）配列番号24で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号25で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号32で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むこと、
（C）配列番号40で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号41で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号42で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号47で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号48で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むこと、或いは
（D）配列番号56で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号57で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号58で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号62で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号63で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号64で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むこと、
を特徴とする、GITR結合性分子。
　項２．　前記特徴（A）、前記特徴（B）、或いは前記特徴（C）を有する、項１に記載のGITR結合性分子。
　項３．　前記特徴（A）を有する、項１又は２に記載のGITR結合性分子。
　項４．　抗体構造を含む、項１～３のいずれかに記載のGITR結合性分子。
　項５．　イムノグロブリン構造、Fab構造、F(ab’)2構造、ミニボディ構造、scFv‐Fc構造、Fv構造、scFv構造、ディアボディ構造、トリアボディ構造、及びテトラボディ構造からなる群より選択される少なくとも1種の構造を含む、項１～４のいずれかに記載のGITR結合性分子。
　項６．　項１～５のいずれかに記載のGITR結合性分子をコードする、ポリヌクレオチド。
　項７．　項６に記載のポリヌクレオチドを含有する、細胞。
　項８．　項１～５のいずれかに記載のGITR結合性分子、及び項６に記載のポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬。
　項９．　項１～５のいずれかに記載のGITR結合性分子、及び項６に記載のポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、アジュバント。
　項１０．　項１～５のいずれかに記載のGITR結合性分子、及び項６に記載のポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、試薬。
　本発明によれば、GITR結合性分子を提供することができる。
（A）は試験例1-4の抗体スクリーン法（GITR強制発現細胞スクリーン）の模式図を示し、（B）は試験例1-5の抗体スクリーン法（固相化GITRタンパクに対するスクリーン）の模式図を示す。抗体ファージライブラリをGITR強制発現293T細胞に反応させ、細胞に結合したポリクローンの抗体ファージが、有機溶媒を使用した遠心によって選別される。また、ビオチン結合GITR-Fcは立体構造を保ったままneutravidinに結合し、これに結合するファージ抗体が選別できる。抗原濃度を希釈することにより、結合の強いクローンが選択される。 細胞表面発現GITR認識能の検討（試験例2-2）におけるIsotype controlのFACS結果を示す。縦軸は細胞カウント数、横軸は蛍光強度を示す。 細胞表面発現GITR認識能の検討（試験例2-2）における抗体クローンAのFACS結果を示す。縦軸は細胞カウント数、横軸は蛍光強度を示す。 細胞表面発現GITR認識能の検討（試験例2-2）における抗体クローンBのFACS結果を示す。縦軸は細胞カウント数、横軸は蛍光強度を示す。 細胞表面発現GITR認識能の検討（試験例2-2）における抗体クローンCのFACS結果を示す。縦軸は細胞カウント数、横軸は蛍光強度を示す。 細胞表面発現GITR認識能の検討（試験例2-2）における抗体クローンDのFACS結果を示す。縦軸は細胞カウント数、横軸は蛍光強度を示す。 ナチュラルな活性化ヒトT細胞上のGITR認識の検討（試験例3-1）におけるIsotype control（マウスIgG2a）のFACS結果を示す。 ナチュラルな活性化ヒトT細胞上のGITR認識の検討（試験例3-1）におけるIsotype control（HERCEPTIN）のFACS結果を示す。 ナチュラルな活性化ヒトT細胞上のGITR認識の検討（試験例3-1）における市販抗体のFACS結果を示す。 ナチュラルな活性化ヒトT細胞上のGITR認識の検討（試験例3-1）におけ抗体クローンBのFACS結果を示す。 ナチュラルなCAR T細胞上のGITR認識の検討（試験例3-2）におけるFACS結果を示す。
　1．定義
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes ”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
　本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったbeta－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　本明細書中において、「CDR」とは、Complementarity Determining Regionの略であり、相補性決定領域とも称される。CDRとは、イムノグロブリンの可変領域に存在する領域であり、抗体が有する抗原への特異的な結合に深く関与する領域である。そして、「軽鎖CDR」とはイムノグロブリンの軽鎖可変領域に存在するCDRであり、「重鎖CDR」とはイムノグロブリンの重鎖可変領域に存在するCDRのことを意味する。
　本明細書中において、「可変領域」とは、CDR1～CDR3（以下、単に「CDRs1-3」という）を含む領域のことを意味する。これらのCDRs1-3の配置順序は特に限定はされないが、好ましくは、N末端側からC末端側の方向に、CDR1、CDR2、及びCDR3の順か、若しくはこの逆の順に、連続又は後述するフレームワーク領域（FR）と称される他のアミノ酸配列を介して、配置された領域を意味する。そして「重鎖可変領域」とは、上述の重鎖CDRs1-3が配置された領域であり、「軽鎖可変領域」とは、上述の軽鎖CDRs1-3が配置された領域である。
　各可変領域の上記CDR1-3以外の領域は、上述するようにフレームワーク領域（FR）と称される。特に可変領域のN末端と上記CDR1との間の領域をFR1、CDR1とCDR2との間の領域をFR2、CDR2とCDR3との間の領域をFR3、CDR3と可変領域のC末端との間をFR4とそれぞれ定義される。
　2．GITR結合性分子
　本発明は、その一態様において、下記特徴（A）～（D）のいずれかを有する、GITR結合分子（本明細書において、「本発明のGITR結合性分子」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　本発明のGITR結合性分子は、下記特徴（A）～（D）のいずれかを有し、且つGITRに対して結合性を有する（好ましくは、特異的に結合する）分子である限り、特に制限されない。
　特徴（A）は、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号10で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号14で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号15で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号16で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、という特徴である。
　特徴（B）は、配列番号24で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号25で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号32で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、という特徴である。
　特徴（C）は、配列番号40で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号41で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号42で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号47で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号48で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、という特徴である。
　特徴（D）は、配列番号56で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号57で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号58で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号62で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号63で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号64で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、という特徴である。
　GITR結合性の観点から、本発明のGITR結合性分子は、好ましくは特徴（A）、特徴（B）、或いは特徴（C）を有し、より好ましくは特徴（A）或いは特徴（B）を有し、さらに好ましくは特徴（A）を有する。
　本発明のGITR結合性分子は、特徴（A）～（D）それぞれにおいて、好ましくは上記重鎖可変領域及び上記軽鎖可変領域を両方含む。
　本発明のGITR結合性分子が特徴（A）を有する場合、重鎖可変領域は、好ましくは、配列番号3で示されるアミノ酸配列、又は配列番号3で示されるアミノ酸配列に対して90％以上（好ましくは95％以上、好ましくは98％以上、好ましくは99％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域である。軽鎖可変領域は、好ましくは、配列番号4で示されるアミノ酸配列、又は配列番号4で示されるアミノ酸配列に対して90％以上（好ましくは95％以上、好ましくは98％以上、好ましくは99％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域である。配列番号3又は4からアミノ酸変異がある場合、その変異は、アミノ酸置換であることが好ましく、アミノ酸の保存的置換であることがより好ましい。
　本発明のGITR結合性分子が特徴（B）を有する場合、重鎖可変領域は、好ましくは、配列番号19で示されるアミノ酸配列、又は配列番号19で示されるアミノ酸配列に対して90％以上（好ましくは95％以上、好ましくは98％以上、好ましくは99％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域である。軽鎖可変領域は、好ましくは、配列番号20で示されるアミノ酸配列、又は配列番号20で示されるアミノ酸配列に対して90％以上（好ましくは95％以上、好ましくは98％以上、好ましくは99％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域である。配列番号19又は20からアミノ酸変異がある場合、その変異は、アミノ酸置換であることが好ましく、アミノ酸の保存的置換であることがより好ましい。
　本発明のGITR結合性分子が特徴（C）を有する場合、重鎖可変領域は、好ましくは、配列番号35で示されるアミノ酸配列、又は配列番号35で示されるアミノ酸配列に対して90％以上（好ましくは95％以上、好ましくは98％以上、好ましくは99％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域である。軽鎖可変領域は、好ましくは、配列番号36で示されるアミノ酸配列、又は配列番号36で示されるアミノ酸配列に対して90％以上（好ましくは95％以上、好ましくは98％以上、好ましくは99％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域である。配列番号35又は36からアミノ酸変異がある場合、その変異は、アミノ酸置換であることが好ましく、アミノ酸の保存的置換であることがより好ましい。
　本発明のGITR結合性分子が特徴（D）を有する場合、重鎖可変領域は、好ましくは、配列番号51で示されるアミノ酸配列、又は配列番号51で示されるアミノ酸配列に対して90％以上（好ましくは95％以上、好ましくは98％以上、好ましくは99％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域である。軽鎖可変領域は、好ましくは、配列番号52で示されるアミノ酸配列、又は配列番号52で示されるアミノ酸配列に対して90％以上（好ましくは95％以上、好ましくは98％以上、好ましくは99％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域である。配列番号51又は52からアミノ酸変異がある場合、その変異は、アミノ酸置換であることが好ましく、アミノ酸の保存的置換であることがより好ましい。
　本発明のGITR結合性分子の構造は、特に制限されない。本発明のGITR結合性分子は、抗体構造を含むことが好ましい。なお、「抗体構造を含む」とは、部分構造として抗体分子構造を含む限り特に制限されず、抗体分子構造のみからなるもの（＝抗体分子）であってもよいし、抗体分子構造に他の構造（後述のタグ、シグナル配列等）が付加されてなるものであってもよい。
　抗体構造は、イムノグロブリンの定常領域を含むものであってもよいし、イムノグロブリンの定常領域を含まないものであってもよい。定常領域を含む場合、重鎖の定常領域（CH1、CH2、及びCH3）並びに軽鎖の定常領域（CL）の全てを含んでいてもよいし、これらの内の任意の1種又は2種以上の組み合わせを含んでいてもよい。
　抗体構造の具体例としては、イムノグロブリン構造、Fab構造、F(ab’)2構造、ミニボディ（minibody）構造、scFv‐Fc構造、Fv構造、scFv構造、ディアボディ（diabody）構造、トリアボディ（triabody）構造、テトラボディ（tetrabody）構造などが挙げられる。
　イムノグロブリンは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する1本の重鎖と軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する1本の軽鎖から成る構造が2つ組み合わされた構造を有する。
　Fabとは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域中のCH1を含む重鎖の断片と、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域（CL）を含む軽鎖とを含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが上述する非共有結合性の分子間相互作用によって会合するか、またはジスルフィド結合によって結合してなる構造を有する。Fabにおいて、CH1とCLとは、それぞれに存在するシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合していてもよい。
　F(ab’)2とは、2対の上記Fabを有し、CH1同士がこれらに含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合してなる構造である。
　ミニボディとは、下記scFvを構成する重鎖可変領域にCH3が結合した断片2つが、CH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。
　scFv‐Fcとは、下記scFv、CH2、およびCH3を含む抗体断片2つが、上記ミニボディと同様にCH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合し、それぞれのCH3に含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合した構造である。
　Fvとは、抗体の最小構造単位ともいわれ、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。Fvにおいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域内に存在するシステイン残基のチオール基同士がジスルフィド結合していてもよい。
　scFvとは、重鎖可変領域のC末端と軽鎖可変領域のN末端がリンカーで繋がれた構造、又は重鎖可変領域のN末端と軽鎖可変領域のC末端とがリンカーで繋がれた構造であり、単鎖抗体とも呼ばれる。
　ディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディとは、それぞれ上記scFvが2量体、3量体および4量体を形成し、Fvなどと同様に可変領域同士の非共有結合性の分子間相互作用等により、構造的に安定な状態で会合した構造である。
　本発明のGITR結合性分子がイムノグロブリンである場合、そのクラスは特に制限されない。該クラスとしては、例えばIgA、IgD、IgE、IgG、IgMなど、さらにはこれらのサブクラスが挙げられる。
　抗体構造の由来は特に制限されない。抗体構造は、例えばヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ウサギ由来抗体、サル由来抗体、チンパンジー由来抗体などであり得る。また、抗体構造は、キメラ抗体（例えばヒト以外の生物（マウスなど）由来抗体の定常領域のアミノ酸配列をヒト由来抗体の定常領域のアミノ酸配列に置き換えられてなる抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体などであってもよい。
　本発明のGITR結合性分子は、モノクローナル分子である（すなわち、単一のアミノ酸配列及び構造である分子集団である）ことが好ましい。
　本発明のGITR結合性分子の分子量は、特に制限されないが、下限は、例えば20,000、50,000、100,000、又は120,000であり、上限は、例えば1,000,000、500,000、又は200,000である。
　本発明のGITR結合性分子は、1種のポリペプチドからなる分子であってもよいし、2種以上のポリペプチドの複合体からなる分子であってもよい。また、本発明のGITR結合性分子は、ポリペプチド又はその複合体からなる分子であってもよいし、ポリペプチド又はその複合体に、他の物質（例えば蛍光物質、放射性物質、無機粒子等）が連結してなるものであってもよい。
　本発明のGITR結合性分子は、化学修飾されたものであってもよい。本発明のGITR結合性分子を構成するポリペプチドは、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明のGITR結合性分子を構成するポリペプチドは、C末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のGITR結合性分子を構成するポリペプチドには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－OH、－SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイル基などのC1－6アシル基など）で保護されているものも包含される。
　本発明のGITR結合性分子は、公知のタンパク質タグ、シグナル配列等のタンパク質又はペプチドが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ、蛍光タンパク質タグ等が挙げられる。
　本発明のGITR結合性分子は、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；　アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；　カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　本発明のGITR結合性分子は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　本発明のGITR結合性分子は、例えば、本発明のGITR結合性分子をコードするポリヌクレオチドにより形質転換させた宿主を培養し、本発明のGITR結合性分子を含む画分を回収する工程を含む方法によって製造することができる。
　本発明のGITR結合性分子をコードするポリヌクレオチドは、本発明のGITR結合性分子を発現可能な状態で含む限りにおいて特に制限されず、本発明のGITR結合性分子のコード配列以外に、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、本発明のGITR結合性分子コード配列に隣接して配置される分泌シグナルペプチドコード配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、複製基点、薬剤耐性遺伝子コード配列などが挙げられる。また、本発明のGITR結合性分子をコードするポリヌクレオチドは、直鎖状のポリヌクレオチドであってもよいし、環状のポリヌクレオチド（ベクターなど）であってもよい。
　ポリヌクレオチドの具体例としては、（I）本発明のGITR結合性分子の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、（II）本発明のGITR結合性分子の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、（III）本発明のGITR結合性分子の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに本発明のGITR結合性分子の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
　宿主は、特に制限されず、例えば昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞等が挙げられる。中でも、抗体をより効率的に発現させる観点から、哺乳類細胞であるHEK細胞、CHO細胞、NS0細胞、SP2/O細胞、P3U1細胞などが好ましい。形質転換、培養、及び回収の方法は、特に制限されず、抗体製造における公知の方法を採用することができる。回収後は、必要に応じて本発明のGITR結合性分子を精製してもよい。精製は、抗体製造における公知の方法、例えばクロマトグラフィー、透析などにより行うことができる。
　3．ポリヌクレオチド
　本発明は、その一態様において、本発明のGITR結合性分子をコードする、ポリヌクレオチド（本明細書において、「本発明のポリヌクレオチド」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　本発明のポリヌクレオチドは、本発明のGITR結合性分子のコード配列以外に、他の配列を含んでいてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のGITR結合性分子を発現可能な状態で含むことが好ましい。他の配列としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、複製基点、レポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質等）コード配列、薬剤耐性遺伝子コード配列などが挙げられる。また、本発明のポリヌクレオチドは、直鎖状のポリヌクレオチドであってもよいし、環状のポリヌクレオチド（ベクターなど）であってもよい。ベクターは、プラスミドベクター、又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、又はレトロウイルス）であり得る。また、ベクターは、例えば、クローニング用ベクター又は発現用ベクターであり得る。発現用ベクターとしては、大腸菌、又は放線菌等の原核細胞用のベクター、或いは、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞等の真核細胞用のベクターを挙げることができる。
　本発明のポリヌクレオチドは、DNA、RNAのみならず、これらに、次に例示するように、公知の化学修飾が施されたものも包含する。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、「ポリヌクレオチド」の語は、天然の核酸だけでなく、BNA（Bridged Nucleic Acid）、LNA（Locked Nucleic Acid）、PNA（Peptide Nucleic Acid）等の何れも包含する。
　4．細胞
　本発明は、その一態様において、本発明のポリヌクレオチドを含有する、細胞（本明細書において、「本発明の細胞」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　本発明の細胞の由来細胞は、特に制限されない。本発明の細胞を、本発明のGITR結合性分子の製造において使用する目的であれば、由来細胞としては、タンパク質発現に使用できる細胞（例えば、昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞等）等が挙げられる。
　細胞としては、例えば、Escherichia coli K12等の大腸菌、Bacillus subtilis MI114等のバチルス属細菌、Saccharomyces cerevisiae AH22等の酵母、Spodoptera frugiperda 由来の Sf細胞系もしくはTrichoplusia ni由来のHighFive細胞系、嗅神経細胞等の昆虫細胞、COS7細胞等の動物細胞等を挙げることができる。動物細胞としては、好ましくは、哺乳動物由来の培養細胞、具体的には、COS7細胞、CHO細胞、HEK293細胞、HEK293FT細胞、Hela細胞、PC12細胞、N1E-115細胞、SH-SY5Y細胞等が挙げられる。
　5．用途
　本発明は、その一態様において、本発明のGITR結合性分子、及び本発明のポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、組成物（本明細書において、「本発明の組成物」と示すこともある。）に関する。
　本発明のGITR結合性分子は、細胞に発現したGITRに結合することができる。このため、本発明のGITR結合性分子、及び本発明のポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも1種は、例えば医薬、アジュバント、試薬等の有効成分として利用することができる。より具体的には、例えば、T細胞応答を刺激するアジュバント分子としての使用、即ち、活性化T cellを刺激するアゴニスト分子としての使用；　タンパク分子として投与する方法の他に、CAR導入T cell, TCR導入T cellにおいて、共発現させることによりそれらを刺激する分子としての使用；　DNAワクチンとしての使用；　活性化T cellに分子をdeliveryするreagentとしての使用；　活性化刺激とともに不活化刺激も可能となり得るので、自己免疫疾患の治療における使用等が挙げられる。
　なお、アゴニスト活性を有する抗体分子はレポーターアッセイによって選択し得る。例えば次に示す方法で選択することができる。Jurkat E6J細胞にてNF-kB依存性にCFPを発現するレポーター細胞に改変し、これにGITRを強制発現させる。アゴニスト分子によってレポーターが働くことをGITRL投与実験によって確認する。次に抗体を膜結合型に改変してレトロウィルスにてレポーター細胞に導入する。アゴニスト抗体が導入された細胞はオートクラインにGITRを刺激し、CFPを発現させるので、セルソーターにて選択できる。これよりscFvを回収し、minibody抗体に経変してアゴニスト活性を検討する。
　本発明の組成物中の有効成分の含有量は、用途の種類に応じて、例えば用途が医薬の場合であれば対象とする疾患の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、及び患者の体重等を考慮して、適宜設定することができる。例えば、本発明の組成物中の有効成分の含量は、本発明の組成物全体を100重量部として0.0001重量部～100重量部程度をすることができる。
　本発明の組成物の使用形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、例えば医薬の場合であれば、経口投与、及び非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。好ましい投与形態は非経口投与であり、より好ましくは静脈注射である。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、有効成分を、薬学的に許容される坦体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。
　非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。例えば、注射用製剤は、抗体又は細胞を注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤等を添加することができる。医薬は、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
　本発明の組成物の製剤化に用いる担体には、当該技術分野において通常用いられる基材、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を用いることができる。
　本発明の組成物の使用量は、用途の種類に応じて、例え用途が医薬の場合であれば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴等の薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、臨床医師により決定することができる。医薬の投与量は、例えば、一日当たりで、1μg/kg（体重）～10g/kg（体重）程度とすることができる。医薬の投与スケジュールも、その投与量と同様の要因を勘案して決定することができる。例えば、上記の1日当たりの投与量で、1日～1月に1回投与することできる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．抗GITR抗体の取得
　目的の抗体として、細胞表面に発現されている、自然な形態のGITRを認識してこれに強く結合することが必要である。また、少なくとも複数の抗体を得る手段が必要であった。今回、有機溶媒を使用したスクリーン方法を開発し、固相化抗原スクリーンと組み合わせることで、目的の抗体を得る方法を開発した。具体的には以下のようにして行った。
　試験例1-1．ヒト抗体ライブラリAIMS6の作製
　患者同意のもと、ヒトの手術材料（扁桃腺、骨髄、末梢血、臍帯血）よりmRNAを調製し、これをもとに特定のプライマーを使用してVHとVLを増幅した。それをM13ファージのcp3との融合遺伝子（scFv-cp3)としてpTZ19Rにて組み換えて作製して、プラスミドライブラリを作製した。これを遺伝子導入した大腸菌を増幅し、ヘルパーファージKO7を感染させてM13ファージ上にscFv-cp3を発現する抗体ライブラリAIMS6を作製した。
　試験例1-2．GITR-Fcの作製
　ヒトGITR遺伝子の細胞外ドメインとヒトIgG1のFc部分を融合させ、C末にAvi-tagを付けた遺伝子断片を作製し、これを分泌型のbiotin ligaseを共発現するように設計したpCAGGSベクターに組込み、293T細胞に導入してビオチン2 micro gram/ml入りのGIT培地にて培養して培養上清を集め、protein-Gカラムにて精製してビオチン化GITR-Fcタンパクを得た。
　試験例1-3．GITR強制発現293T細胞の作製
　ヒトGITR遺伝子をpCDNA3.1neoに導入し、293T細胞に導入してG418存在下で培養してGITR強制発現293T細胞を得た。同様にしてマウス細胞CMS5aに導入して培養し、 GITR強制発現CMS5a細胞を得た。
　試験例1-4．ヒト抗体ライブラリAIMSを使用したGITR強制発現細胞に対する抗体スクリーン
　本試験例の抗体スクリーン法の模式図を図１の（A）に示す。
　ヒトGITRを強制発現させた293T細胞5x10^7に対して1x10^12のAIMS6ライブラリを入れた溶液1mlを反応させたのち、これを有機溶媒（ジブチルフタレイト：シクロヘキサン　9:1) 1mlの上に重層し、2000xgの遠心力を2分間作用させて細胞を沈降させたのちMEMにて懸濁して有機溶媒液に重層し、再度の遠心を行った。この操作を計3回繰り返して得た細胞ペレットをPBSにて懸濁したのち液体窒素にて凍結し、これを融解したのち大腸菌DH12Sに感染させ、グルコースが2%,アンピシリンが200 micro gram/ml入った2xYT培地にて培養したのち、グルコース濃度を0.05%に下げて培養したのちヘルパーファージKO7を感染させて培養し、ファージ液を得た。2回目、3回目の有機溶媒スクリーンは有機溶媒上に重層して遠心する回数を4回にし、結合の強い抗体集団を選択した。この時点ではGITRを含む多数の細胞表面抗原に結合するポリクローン抗体が得られている。目的のGITR認識抗体を絞り込むため、次のビオチン化GITR-Fcを使用したスクリーンを行った。
　試験例1-5．固相化ヒトGITRタンパクによる抗体スクリーン
　本試験例の抗体スクリーン法の模式図を図１の（B）に示す。
　Maxisorp plate（Thermo社製）上にneutravidin（Thermo社製） 0.5 micro gramをコートしたのち2%BSAにてブロッキングを行ったのちPBSにて洗浄し、これにビオチン化GITR-Fcタンパク0.05 micro gramを固相化し、これに試験例1-4で選別したポリクローン抗体ファージを反応させた。反応後PBSにて洗浄し、plateに残った抗体ファージを回収して大腸菌に感染させ、多数の抗体クローンを得た。次にmaxisorp上にGITR-Fcタンパク0.005 micro gramを固相化し、厳しい条件でのスクリーニングを行い、結合活性の高い抗体を絞りこんだ。
　試験例2．抗体の評価1
　試験例2-1．抗体クローンのELISA評価
　抗体クローン大腸菌を0.5mM IPTG, 200 micro gram/ml ampicillin 2xYT培地にて培養し、scFv-cp3を含む培養上清を得た。 次に0.5 micro gramのGITR-Fcを固相化させたmaxisorp plateにこの培養上清を反応させたのち、ウサギ抗cp3抗体、HRP標識抗ウサギIgG抗体を反応させ、TMBにて発色させた。ELISAの結果より、ヒトGITRへの結合性に優れた4つ抗体クローン（抗体クローンA、B、C、及びD）を選択した。
　各抗体クローンの各領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を以下に示す。なお、CDRの配列はIMGTで推定した。
　＜抗体クローンA＞
重鎖可変部塩基配列：GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCCGGTCAAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGGAGCCTCTGGATTCTCCTTCAATTCCTATAGTATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCGTGGATTAGTAGTAGTGGAAATAAGATTCAGTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACGCCAGAAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAACACCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGTTAGAGAGGCGCATCCTCGCGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGA （配列番号1）
軽鎖可変部塩基配列：TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA （配列番号2）
重鎖可変部アミノ酸配列：EVQLVESGGGPVKPGGSLRLSCGASGFSFNSYSMSWVRQAPGKGLEWVSWISSSGNKIQYADSVKGRFTVSRDNARNSLYLQMNSLNTEDTAVYYCVREAHPRAFDIWGQGTTVTVSR （配列番号3）
軽鎖可変部アミノ酸配列：SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSP （配列番号4）
重鎖CDR1塩基配列：GGATTCTCCTTCAATTCCTATAGT （配列番号5）
重鎖CDR2塩基配列：ATTAGTAGTAGTGGAAATAAGATT （配列番号6）
重鎖CDR3塩基配列：GTTAGAGAGGCGCATCCTCGCGCTTTTGATATC （配列番号7）
重鎖CDR1アミノ酸配列：GFSFNSYS （配列番号8）
重鎖CDR2アミノ酸配列：ISSSGNKI （配列番号9）
重鎖CDR3アミノ酸配列：VREAHPRAFDI （配列番号10）
軽鎖CDR1塩基配列：AGCCTCAGAAGCTATTAT （配列番号11）
軽鎖CDR2塩基配列：GGTAAAAAC （配列番号12）
軽鎖CDR3塩基配列：AACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACGTGGTA （配列番号13）
軽鎖CDR1アミノ酸配列：SLRSYY （配列番号14）
軽鎖CDR2アミノ酸配列：GKN （配列番号15）
軽鎖CDR3アミノ酸配列：NSRDSSGNVV （配列番号16）。
　＜抗体クローンB＞
重鎖可変部塩基配列：CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGGCAGCTCGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGA （配列番号17）
軽鎖可変部塩基配列：CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGGCTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATAGCAGCCTGAGTGCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA （配列番号18）
重鎖可変部アミノ酸配列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWISPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGQLDAFDIWGQGTTVTVSR （配列番号19）
軽鎖可変部アミノ酸配列：QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRLSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVET （配列番号20）
重鎖CDR1塩基配列：GGATACACCTTCACCGGCTACTAT （配列番号21）
重鎖CDR2塩基配列：ATCAGCCCTAACAGTGGTGGCACA （配列番号22）
重鎖CDR3塩基配列：GCGAGAGATGGGCAGCTCGATGCTTTTGATATC （配列番号23）
重鎖CDR1アミノ酸配列：GYTFTGYY （配列番号24）
重鎖CDR2アミノ酸配列：ISPNSGGT （配列番号25）
重鎖CDR3アミノ酸配列：ARDGQLDAFDI （配列番号26）
軽鎖CDR1塩基配列：AGCTCCAACATTGGGAATAATTAT （配列番号27）
軽鎖CDR2塩基配列：GACAATAAT （配列番号28）
軽鎖CDR3塩基配列：GGAACATGGGATAGCAGCCTGAGTGCTGTGGTA （配列番号29）
軽鎖CDR1アミノ酸配列：SSNIGNNY （配列番号30）
軽鎖CDR2アミノ酸配列：DNN （配列番号31）
軽鎖CDR3アミノ酸配列：GTWDSSLSAVV （配列番号32）。
　＜抗体クローンC＞
重鎖可変部塩基配列：GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAATGCTGGCAAGGACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGA （配列番号33）
軽鎖可変部塩基配列：CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATAGCAGCCTGAGTGCTTATGGCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA （配列番号34）
重鎖可変部アミノ酸配列：EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCANAGKDFDYWGQGTLVTVSR （配列番号35）
軽鎖可変部アミノ酸配列：QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAYGFGTGTKVTVL （配列番号36）
重鎖CDR1塩基配列：GGATTCACCTTCAGTAACTATGGC （配列番号37）
重鎖CDR2塩基配列：ATATCATATGATGGAAGTAATAAA （配列番号38）
重鎖CDR3塩基配列：GCGAATGCTGGCAAGGACTTTGACTAC （配列番号39）
重鎖CDR1アミノ酸配列：GFTFSNYG （配列番号40）
重鎖CDR2アミノ酸配列：ISYDGSNK （配列番号41）
重鎖CDR3アミノ酸配列：ANAGKDFDY （配列番号42）
軽鎖CDR1塩基配列：AGCTCCAACATTGGGAATAATTAT （配列番号43）
軽鎖CDR2塩基配列：GACAATAAT （配列番号44）
軽鎖CDR3塩基配列：GGAACATGGGATAGCAGCCTGAGTGCTTATGGC （配列番号45）
軽鎖CDR1アミノ酸配列：SSNIGNNY （配列番号46）
軽鎖CDR2アミノ酸配列：DNN （配列番号47）
軽鎖CDR3アミノ酸配列：TWDSSLSAYG （配列番号48）。
　＜抗体クローンD＞
重鎖可変部塩基配列：CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTAACACAAACTACGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACGCGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTACCCCTTAGTGGCTACCTGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGA （配列番号49）
軽鎖可変部塩基配列：GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGCCCAGTCAGAGTGTTAGGAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGTAGACTGGAGCCTGAAGATTCTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCCTTATTCGCTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAC （配列番号50）
重鎖可変部アミノ酸配列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDAAVYYCARVPLSGYLYYFDYWGQGTLVTVSR （配列番号51）
軽鎖可変部アミノ酸配列：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRPSQSVRSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQYGSSPLFAFGPGTKVDIK （配列番号52）
重鎖CDR1塩基配列：GGTTACACCTTTACCAGCTATGGT （配列番号53）
重鎖CDR2塩基配列：ATCAGCGCTTACAATGGTAACACA （配列番号54）
重鎖CDR3塩基配列：GCGAGAGTACCCCTTAGTGGCTACCTGTACTACTTTGACTAC （配列番号55）
重鎖CDR1アミノ酸配列：GYTFTSYG （配列番号56）
重鎖CDR2アミノ酸配列：ISAYNGNT （配列番号57）
重鎖CDR3アミノ酸配列：ARVPLSGYLYYFDY （配列番号58）
軽鎖CDR1塩基配列：CAGAGTGTTAGGAGCAGCTAC （配列番号59）
軽鎖CDR2塩基配列：GGTGCATCC （配列番号60）
軽鎖CDR3塩基配列：CAGCAGTATGGTAGCTCACCCTTATTCGCT （配列番号61）
軽鎖CDR1アミノ酸配列：QSVRSSY （配列番号62）
軽鎖CDR2アミノ酸配列：GAS （配列番号63）
軽鎖CDR3アミノ酸配列：QQYGSSPLFA （配列番号64）。
　試験例2-2．抗体クローンの細胞表面発現GITR認識能の検討
　hGITR強制発現CMS5a細胞に抗体クローンの上清を反応させ、次にウサギ抗cp3抗体を反応させ、洗浄したのち、抗ウサギIgG-Alexa488を反応させ、洗浄したのち、FACScaliburにて測定した。結果を図２～６に示す。抗体クローンA、B、C、又はDはhGITR強制発現CMS5a細胞を認識することが分かった。
　試験例2-3．minibody型抗体の作製
　抗体クローンA、B、C、及びDについてscFvをヒトIgG1 Fcとの融合タンパクを作製してpCAGGSに組み替え、これを293T細胞に導入して培養し、上清を回収した。これをprotein G sepharoseにて精製し、minibody型抗体とした。
　試験例2-4．minibody型抗体のaffinity評価（図3）
　抗体クローンA、B、C、及びD の minibodyについて、BIAcore 3000にて結合活性を評価した。方法は以下のものである。センサーチップCM5に、ヒトGITRタンパクをアミンカップリング法にて結合させ、これにHBS-EP bufferで希釈したminibodyタンパクを一定速度で60秒間流して結合反応を測定した。次にHBS-EPバッファーのみを流して解離反応を測定した。これらの数値を計算して解離定数KDを算出した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　試験例3．抗体の評価2
　試験例3-1．ナチュラルな活性化ヒトT細胞上のGITR認識
　ヒトPBMCをOKT3とretronectinによって刺激し、day 6の時点での活性化T細胞上のGITRの発現をCD8細胞、CD4細胞について染色を行い、FACSCANTによる解析を行った。市販モノクローン抗体についてはBiolegendのAPC標識されたclone621を使用した。抗体クローンBの抗体については、抗体を反応させたのち、APC標識抗ヒトIgG 抗体による染色を行い、同時に抗CD8, 抗CD4での染色を行った。
　結果を図７～１０に示す。抗体クローンBでは、市販抗体に比較して強いGITR認識があることが確認された。市販モノクローン抗体のアイソタイプコントロールは抗GD2認識抗体の14g2aで、取得ヒト抗体のアイソタイプコントロールはHERCEPTINである。
　試験例3-2．ナチュラルな活性化CAR T細胞上のGITR認識
　フレッシュなPBMCは活性化しておらず、活性化マーカーのCD25とGITRの発現がみられない。一方、OKT3とretronectinによって活性化し、さらにレトロウィルスを使用してCAR遺伝子を導入すると、活性化したT細胞はCD25とGITRの発現が観察できるようになる。フィコール法で分離したフレッシュなPBMCと、それを活性化してCAR遺伝子を導入したday 13時点のT細胞について、抗CD25抗体と市販モノクローンGITR抗体、抗体クローンBの抗体による染色を行い、FACSCANTによる測定を行った。
　結果を図１１に示す。抗体クローンBの抗体はCAR導入により活性化したCAR T細胞を良く認識し、活性化の無いPBMC細胞は認識しないことが示された。染色強度も抗体クローンBの抗体は市販モノクローン抗体に勝ることが示された。

Claims (10)

  1. （A）配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号10で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号14で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号15で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号16で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むこと、
    （B）配列番号24で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号25で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号32で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むこと、
    （C）配列番号40で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号41で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号42で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号47で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号48で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むこと、或いは
    （D）配列番号56で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号57で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号58で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は配列番号62で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号63で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号64で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むこと、
    を特徴とする、GITR結合性分子。
  2. 前記特徴（A）、前記特徴（B）、或いは前記特徴（C）を有する、請求項１に記載のGITR結合性分子。
  3. 前記特徴（A）を有する、請求項１又は２に記載のGITR結合性分子。
  4. 抗体構造を含む、請求項１～３のいずれかに記載のGITR結合性分子。
  5. イムノグロブリン構造、Fab構造、F(ab’)2構造、ミニボディ構造、scFv‐Fc構造、Fv構造、scFv構造、ディアボディ構造、トリアボディ構造、及びテトラボディ構造からなる群より選択される少なくとも1種の構造を含む、請求項１～４のいずれかに記載のGITR結合性分子。
  6. 請求項１～５のいずれかに記載のGITR結合性分子をコードする、ポリヌクレオチド。
  7. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有する、細胞。
  8. 請求項１～５のいずれかに記載のGITR結合性分子、及び請求項６に記載のポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬。
  9. 請求項１～５のいずれかに記載のGITR結合性分子、及び請求項６に記載のポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、アジュバント。
  10. 請求項１～５のいずれかに記載のGITR結合性分子、及び請求項６に記載のポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、試薬。
PCT/JP2021/017479 2020-05-08 2021-05-07 Ｇｉｔｒ結合性分子 WO2021225159A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022519631A JPWO2021225159A1 (ja) 2020-05-08 2021-05-07

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020082653 2020-05-08
JP2020-082653 2020-05-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021225159A1 true WO2021225159A1 (ja) 2021-11-11

Family

ID=78467973

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/017479 WO2021225159A1 (ja) 2020-05-08 2021-05-07 Ｇｉｔｒ結合性分子

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2021225159A1 (ja)
WO (1) WO2021225159A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007515942A (ja) * 2003-05-23 2007-06-21 ワイス Ｇｉｔｒリガンド及びｇｉｔｒリガンド関連分子及び抗体及びその使用
JP2017526615A (ja) * 2014-05-28 2017-09-14 アジェナス インコーポレイテッド 抗ｇｉｔｒ抗体及びその使用法
JP2017531427A (ja) * 2014-10-03 2017-10-26 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）抗体およびその使用法
WO2018213297A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of cancer with anti-gitr agonist antibodies
JP2018535665A (ja) * 2015-10-07 2018-12-06 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激ｔｎｆ受容体に対する四価の二重特異性抗体発明の分野

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007515942A (ja) * 2003-05-23 2007-06-21 ワイス Ｇｉｔｒリガンド及びｇｉｔｒリガンド関連分子及び抗体及びその使用
JP2017526615A (ja) * 2014-05-28 2017-09-14 アジェナス インコーポレイテッド 抗ｇｉｔｒ抗体及びその使用法
JP2017531427A (ja) * 2014-10-03 2017-10-26 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）抗体およびその使用法
JP2018535665A (ja) * 2015-10-07 2018-12-06 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激ｔｎｆ受容体に対する四価の二重特異性抗体発明の分野
WO2018213297A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of cancer with anti-gitr agonist antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2021225159A1 (ja) 2021-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7314356B2 (ja) 改変ｊ鎖を有する結合分子
EP3259597B1 (en) Pvrig polypeptides and methods of treatment
KR20200052373A (ko) 키메라 폴리펩티드 및 그의 용도
JP2018537410A (ja) 改変ｊ鎖を有する結合分子
JP7486636B2 (ja) 抗ｍｓ４ａ４ａ抗体及びその使用方法
JP2022513432A (ja) 免疫細胞活性化のための二重特異性抗体
US11773177B2 (en) Variant antibodies that bind OX40
JP2021508449A (ja) Ｃｈ３ドメイン中に挿入された特異的ｐｄ−ｌ１結合配列
CN115746138A (zh) Ilt3结合剂及其使用方法
US20230167185A1 (en) Cd40 binding protein
KR20230104617A (ko) 항-덱틴-1 항체 및 이의 사용 방법
JP2022514962A (ja) ヒト化抗ｐｄ－１抗体及びこの使用
TW201522373A (zh) 抗ｃｄ５２之抗體
JP2022145555A (ja) Ｐｄ－１とｌａｇ－３を標的とした四価二重特異性抗体、その製造方法および用途
US20230416394A1 (en) Novel conjugate molecules targeting cd39 and tgfbeta
WO2021020564A1 (ja) Ｇｄ２結合性分子
US20240084000A1 (en) Anti-MARCO Antibodies and Uses Thereof
CN114127112A (zh) 与t细胞结合的多功能分子及其治疗自身免疫性病症的用途
WO2021225159A1 (ja) Ｇｉｔｒ結合性分子
CN113226357A (zh) 双特异性缀合物
TW202336035A (zh) 治療自體免疫疾病及癌症之方法及組成物
KR20230170672A (ko) 항-cd122 항체 및 이의 용도
TW202128758A (zh) 多專一性融合蛋白及其用途
US20240024480A1 (en) Prame binding molecule
TW202330581A (zh) 含有il-21r突變蛋白之免疫細胞介素

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21799618

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022519631

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21799618

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1