JP2017531427A - グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）抗体およびその使用法 - Google Patents

Abstract

本発明は、GITR（グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体としても公知）に結合するヒトモノクローナル抗体を含む。本発明の抗体のGITRに対する結合は、そのリガンドであるGITR-Lの結合を阻害し、癌を処置するために使用することができる。

Description

関連出願
本願は、その内容全体が参照により組み入れられる2014年10月3日に出願された米国仮出願第62/059,458号からの優先権およびその恩典を主張する。

発明の分野
本発明は、概して、抗グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（GITR）抗体およびその使用法に関する。

政府の利益
本発明は、［ ］から授与された［ ］の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有している。

配列表の参照による組み入れ
2015年10月5日に作成された50キロバイトのサイズの「DFCI-093_001WO_ST25.txt」という名のテキストファイルの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。

発明の背景
免疫系は、自己免疫疾患を防ぐ寛容性を維持しつつ（例えば癌において）病原体を排除する効果的な応答間のバランスを達成しなければならない。T細胞は、免疫機能の抑制と能動的な免疫拒絶の間のバランスを維持する上で重要な役割を果たしている。T制御性細胞（Treg）は、CD25+、CD4+、FOXp3+およびグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子関連受容体（GITR）の発現によって特徴付けられる。Tregは、病的な免疫応答を抑制し、究極的には免疫学的自己寛容性を制御することによって免疫恒常性を維持する。Tregの存在は、様々な病原体の排除を担う活性化されたエフェクターT細胞の活性を抑制する。

ヒト上皮性悪性腫瘍は、循環および腫瘍自身の両方における増加した量のTregの存在と関連付けられている。癌患者における抑制性Tregの存在の増加は、エフェクター細胞を含む通常のT細胞を抑制し、これによりIFN-γ産生を下方制御する。インビボ癌動物モデルにおけるTregの存在または活性の減少は、エフェクターT細胞の量および活性を増加させ、これは多くの場合その後に腫瘍のサイズの減少および他の癌の症状の軽減をもたらす。

T細胞の活性化は、TregおよびエフェクターT細胞の両方においてGITRレベルを上方制御する。Tregの免疫抑制機能を低下させエフェクターT細胞の活性を増加させるようGITRの活性を調整する方法は、現在集中的な研究が行われている領域である。GITRリガンドであるGITR-Lは、樹状細胞、マクロファージおよびB細胞を含む様々な細胞において発現される。以前の研究は、癌モデルにおいて、外来GITR-Lの投与後のまたはGITRをアンタゴナイズする他の手段による抗腫瘍免疫活性の増加の間の関連性を示している。

その存在の増加およびTregが癌において有する役割から、GITRを通じたTregの活性および存在の調整に対するさらなる注目が、さらなる理解および究極的には癌の処置のために重要である。したがって、エフェクターT細胞活性および結果としての抗腫瘍活性を促進する手段としての、GITRに特異的に結合し、GITRとそのリガンドであるGITR-Lの結合を調整することができる薬剤に対する喫緊の要望がある。

様々な局面において、本発明は、ヒト抗グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（GITR）に結合する単離されたヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。この抗体は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域およびSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域；SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域；SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域；SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域およびSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域；SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域およびSEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域；SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域およびSEQ ID NO:24のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域；SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域およびSEQ ID NO:28のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域；SEQ ID NO:30のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域およびSEQ ID NO:32のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域；SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域およびSEQ ID NO:36のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域；SEQ ID NO:38のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域およびSEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域；またはSEQ ID NO:42のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域およびSEQ ID NO:44のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域を有する。

さらなる局面において、本発明は、SEQ ID NO:45、46もしくは47のアミノ酸配列を有する、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:48、49もしくは50のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；SEQ ID NO:51、52もしくは53のアミノ酸配列を有する、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:54、55もしくは56のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；SEQ ID NO:57、58もしくは59のアミノ酸配列を有する、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:60、61もしくは62のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；SEQ ID NO:63、64もしくは65のアミノ酸配列を有する、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:66、67もしくは68のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；SEQ ID NO:69、70もしくは71のアミノ酸配列を有する、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:72、73もしくは74のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；SEQ ID NO:75、76もしくは77のアミノ酸配列を有する、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:78、79もしくは80のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；SEQ ID NO:81、82もしくは83のアミノ酸配列を有する、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:84、85もしくは86のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；SEQ ID NO:87、88もしくは89のアミノ酸配列を有する、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:90、91もしくは92のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；SEQ ID NO:93、94もしくは95のアミノ酸配列を有する、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:96、97もしくは98のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；SEQ ID NO:99、100もしくは101のアミノ酸配列を有する、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:102、103もしくは104のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；またはSEQ ID NO:105、106もしくは107のアミノ酸配列を有する、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:108、109もしくは110のアミノ酸配列を有する可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）を有する単離されたヒト化モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

抗体は、1価または2価である。例えば、抗体は、単鎖抗体である。抗体は、10^-5 M〜10^-12 Mの範囲内の結合親和性を有する。いくつかの局面において、抗体は、IgG4重鎖定常領域を有する。他の局面において、抗体は、アミノ酸234位および235位に変異を含むFc領域を有する。変異は、例えば、L234AおよびL235Aである。

他の局面において、本発明は、本発明のヒトGITR抗体および腫瘍関連抗原、サイトカインまたは細胞表面受容体にも結合する抗体を含む二重特異性抗体を含む。

任意で、本発明の抗体は、治療剤、例えば毒素、放射性標識、siRNA、低分子またはサイトカインに連結される。

本発明にしたがう抗体を産生する細胞もまた、本発明によって提供される。

様々な局面において、本発明は、その必要がある対象に本発明にしたがう抗体を含む組成物を投与することによって、対象において制御性T細胞を除去する方法を提供する。

本発明の他の方法は、その必要がある対象に本発明にしたがう抗体を含む組成物を投与することによって、抗原に対する免疫応答を増大させることを含む。抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原または腫瘍関連抗原である。

様々な局面において、本発明にしたがう抗体の投与は、抗原特異的なT細胞の活性を増加させ、および／またはNK細胞の細胞傷害性を増加させる。

いくつかの局面において、本発明の方法はさらに、対象へのIL-15の投与を含む。

さらに別の局面において、本発明は、その必要がある対象に本発明にしたがう抗体を含む組成物を投与することによる、癌の症状を処置または軽減する方法を含む。癌は、GITRまたはそのリガンドであるGITR-Lを過剰発現する癌である。任意で、対象にさらに、サイトカイン、例えばIL-15または化学療法剤が投与される。

本発明はさらに、SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43の核酸配列を有する核酸を提供する。

さらなる局面において、本発明は、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44のポリペプチドをコードする核酸またはSEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。本発明にしたがう核酸を含むベクターもまた提供される。本発明にしたがうベクターを含む細胞もまた、本発明に含まれる。

それ以外の定義がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本発明を実施する際には、本明細書に記載されているのと同様または同等の方法および材料を使用することができるが、以下には適当な方法および材料が記載されている。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、明示的に、それらの全体が参照により組み入れられる。相反する場合、定義を含めて本明細書が優先される。加えて、本明細書に記載される材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、かつそれらに包含される。

抗GITR抗体の結合親和性を示すグラフである。GITRを発現する293T細胞に対する抗GITR抗体の結合親和性。GITR発現293T細胞を、4℃で1時間、異なる濃度の抗GITR抗体と共にインキュベートし、その後に4℃でさらに1時間、FITC標識抗ヒトFc抗体を用いて染色した。さらに細胞をフローサイトメトリーによって検出し、抗GITR抗体の、最大の効果を生じる濃度の半分の濃度（EC₅₀)をPrismソフトウェアによって測定した。これらのデータは、抗GITR抗体がGITRに対して異なる結合活性を示すことを示唆した。 抗GITR抗体の競合活性を示すグラフ集である。GITR発現293T細胞を、4℃で1時間、GITRLの存在下および非存在下で抗GITR抗体またはMEM188（市販の抗GITR mAb）と共にインキュベートし、その後に4℃でさらに1時間、FITC標識抗ヒトFc抗体を用いて染色した。さらに細胞をフローサイトメトリーによって検出し、FlowJoソフトウェアによって分析した。これらの結果は、すべての抗GITR抗体、特に＃7、10、13および15がGITRLとGITRの相互作用を阻止できることを示した。 抗体・抗原相互作用の速度論的特徴付けを示している。GITR-C9タグ融合タンパク質を、マウス抗C9タグ抗体によって結合させ、そしてマウスFcバイオセンサ上に固定した。緩衝液での簡単な洗浄の後、バイオセンサを、備考欄に記載される一連のアイソタイプ特異的抗体に暴露した。各抗GITR抗体のK_on、K_offおよびK_Dを分析した。K_on（M^-1秒^-1）；K_off（秒^-1）；K_D（M） TeffおよびTreg共培養物に対する抗GITR抗体の生物活性を示すグラフ集である。CFSE標識Teff（5x10⁴）および非標識Treg（5x10³）を、20μg/mlの抗GITR抗体の存在下および非存在下で5日間、96ウェルプレートにおいて20μg/mlのPHAと共インキュベートした。CFSE標識Teffを収集し、CFSE強度をフローサイトメトリーによって分析した。Teffは、PHAとの5日間のインキュベート後に増殖したが、Teff/Treg共培養物中では増殖しなかった。これらのデータは、＃1、＃3、＃10、＃11、＃15および＃17が、Treg抑制機能を阻害することによってTeff増殖を支援できることを示した。 TeffおよびTreg共培養物中で抗GITR抗体によって刺激されたサイトカインのプロフィールを示すチャート集である。Teff/Treg比が10の下での5日後の同培養物中でのサイトカイン産生を、MSD V-PLEXキットによって測定した。データは、＃1、＃3、＃10、＃14、＃15および＃17がIFN-γ分泌を誘導することができ、＃1、＃3、＃11、＃15および＃17がIL-10分泌を誘導することができることを示した。まとめると、＃1、＃3、＃15および＃17は、GITRに対するアゴニストとして優れた活性を有し得る。

詳細な説明
本発明は、GITRとしても公知のグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体に対して特異的なヒト化モノクローナル抗体を提供する。この抗体は、270億個のヒト単鎖抗体（scFv）ファージディスプレイライブラリの使用を通じて、ライブラリ選別標的としてGITRを使用することによって同定された。これらの抗体は、GITRに対する新しいクラスのヒトモノクローナル抗体である。

これらの抗GITRヒトモノクローナル抗体は、本明細書で「huGITR抗体」と称される。

上皮癌の症例における制御性T細胞（Treg）の量の増加の証拠が確認されている。Tregにより維持される主要な免疫学的自己寛容性においてGITRが重要な役割を果たしている証拠も存在する。このTregにおけるGITR発現と癌におけるTregの増加との間の結びつきは、強いエフェクターT細胞機能を促進する手段としてGITR活性を標的化する機会を提供する。詳細には、これが、GITRの標的化を、癌の処置に対する潜在的な免疫療法アプローチにしている。

Tregは、CD28、CD4、FOXP3およびGITRを発現する。エフェクターT細胞活性の抑制は、大部分が、活性化されたT細胞核因子NF-ATとのFOXP3の二量体化によって媒介され、これはその後、IFN-γ、IL-2およびIL-4を抑制する。そのリガンドとの結合によるGITRの連結の増加は、Tregが活性化されたT細胞に対して有している抑制効果を減少させることが示されている。さらに、GITRを直接標的化する抗体もまた、Tregの抑制機能を減少させることが示されている。

GITRはTregおよびエフェクターT細胞の両方で発現されるが、GITRの発現量は前者においてずっと多い。そのため、GITRは、癌を含む様々な疾患におけるTregの抑制機能の調整の良い候補標的であるとみなされている。マウスモデルは、GITRの刺激がTregの抑制活性を減少させることを示した。他の研究もまた、GITR活性のアンタゴナイズが悪性細胞へのTregの動員を減少させることを示した。まとめると、これらのデータは、癌の病態生理学における重要な受容体としてのGITRを示している。

本発明は、GITRタンパク質に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体のGITRへの結合は、GITRに結合するGITRリガンドの能力を妨害する。様々な機構によって、huGITR抗体は、Tregがエフェクター細胞に対して有している抑制機能を減少させる。huGITR抗体の投与は、Tregの除去、エフェクターT細胞（Teff）の増殖の増加、抗原特異的T細胞活性の増加およびエフェクターサイトカインの産生の増加をもたらし得る。いくつかの例において、huGITR抗体は、抗原特異的免疫応答を促進または増強する。

したがって、本発明のhuGITR抗体は、T細胞活性の調整に有用である。特に、huGITR抗体は、Treg活性を抑制し、かつTeff活性を刺激することができる。加えて、本発明のhuGITR抗体は、NK細胞の細胞傷害性を増加させ、かつIFNγ分泌を増加させる。

huGITR抗体は、1価または2価であり、1つまたは2つの鎖を含む。機能的に、huGITR抗体の結合親和性は、10^-5M〜10^-12Mの範囲内である。例えば、huGITR抗体の結合親和性は、10^-6M〜10^-12M、10^-7M〜10^-12M、10^-8M〜10^-12M、10^-9M〜10^-12M、10^-5M〜10^-11M、10^-6M〜10^-11M、10^-7M〜10^-11M、10^-8M〜10^-11M、10^-9M〜10^-11M、10^-10M〜10^-11M、10^-5M〜10^-10M、10^-6M〜10^-10M、10^-7M〜10^-10M、10^-8M〜10^-10M、10^-9M〜10^-10M、10^-5M〜10^-9M、10^-6M〜10^-9M、10^-7M〜10^-9M、10^-8M〜10^-9M、10^-5M〜10^-8M、10^-6M〜10^-8M、10^-7M〜10^-8M、10^-5M〜10^-7M、10^-6M〜10^-7Mまたは10^-5M〜10^-6Mである。

さらに、本発明の抗体は、毒素、放射性標識、siRNAまたはサイトカインを含むがこれらに限定されない治療剤を含む。

11個の特有のモノクローナルhuGITR抗体を同定した。これらは、mAb #1-81、3-167、#5-139、#7-192、#10-116、#11-126、#12-46、#13-169、#14-182、#15-68および#17-60を含む。それらの可変領域核酸配列およびアミノ酸配列が、表1A〜11Bに示されている。これらの抗体の可変領域に関連するCDRのアミノ酸配列が、表12に示されている。

モノクローナルヒトGITR抗体の核酸およびアミノ酸配列を以下に提供する。

（表１Ａ）Ab #1-81の可変領域の核酸配列

（表１Ｂ）Ab #1-81の可変領域のアミノ酸配列

（表２Ａ）Ab #3-167の可変領域の核酸配列

（表２Ｂ）Ab #3-167の可変領域のアミノ酸配列

（表３Ａ）Ab #5-139の可変領域の核酸配列

（表３Ｂ）Ab #5-139の可変領域のアミノ酸配列

（表４Ａ）Ab #7-192の可変領域の核酸配列

（表４Ｂ）Ab #7-192の可変領域のアミノ酸配列

（表５Ａ）Ab #10-116の可変領域の核酸配列

（表５Ｂ）Ab #10-116の可変領域のアミノ酸配列

（表６Ａ）#11-126の可変領域の核酸配列

（表６Ｂ）#11-126の可変領域のアミノ酸配列

（表７Ａ）#12-46の可変領域の核酸配列

（表７Ｂ）#12-46の可変領域のアミノ酸配列

（表８Ａ）#13-169の可変領域の核酸配列

（表８Ｂ）#13-169の可変領域のアミノ酸配列

（表９Ａ）#14-182の可変領域の核酸配列

（表９Ｂ）#14-182の可変領域のアミノ酸配列

（表１０Ａ）#15-68の可変領域の核酸配列

（表１０Ｂ）#15-68の可変領域のアミノ酸配列

（表１１Ａ）#17-190の可変領域の核酸配列

（表１１Ｂ）#17-190の可変領域のアミノ酸配列

本明細書に記載されるhuGITR抗体は、GITRに結合する。1つの局面において、huGITR抗体は、GITRに対して高い親和性および高い特異性を有する。別の局面において、huGITR抗体は、GITR受容体に結合することができ、リガンドであるGITR-Lがその受容体であるGITRに結合するのを防ぐことができ、阻害することができ、または阻止することができる。

（表１２）重鎖および軽鎖のアミノ酸配列

本発明はまた、本明細書に記載されるhuGITR抗体のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して特定比率の同一性または類似性を有する抗体を特徴とする。例えば、抗体は、本明細書に記載されるhuGITR抗体の任意の1つの特定領域または全長と比較して、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い同一性を有し得る。本発明の核酸およびタンパク質に対する配列同一性または類似性は、当技術分野で公知の方法による配列比較および／またはアラインメントによって決定され得る。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、BLASTまたはBLAST 2.0）、手作業によるアラインメントまたは目視検査が、本発明の核酸およびタンパク質とのパーセント配列同一性または類似性を決定するために利用され得る。

アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列内の単一のアミノ酸または小比率のアミノ酸を変更、付加、欠失または置換する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、本明細書で集合的に「保存的修飾変種」と称されることを直ちに理解するであろう。いくつかの態様において、その変更は、あるアミノ酸を化学的に類似するアミノ酸で置換する。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。本明細書に開示されるhuGITR抗体のそのような保存的修飾変種は、未修飾のhuGITR抗体と比較して、GITRに対して増加した交差反応性を示し得る。

抗体
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ig）分子の免疫学的に活性な一部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を表す。「〜に特異的に結合する」または「〜と免疫反応する」は、その抗体が所望の抗原の1つまたは複数の抗原性決定基と反応し他のポリペプチドと反応しないことを意味する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、dAb（ドメイン抗体）、単鎖、F_ab、F_ab'およびF_(ab')2フラグメント、scFvおよびF_ab発現ライブラリを含むがこれらに限定されない。

単鎖Fv（「scFv」）ポリペプチド分子は、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたV_HおよびV_Lをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現され得る、共有結合により連結されたV_H:V_Lヘテロ2量体である（Huston et al. (1988) Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883を参照のこと）。自然界では一体となっているが化学的には別々の、抗体V領域由来の軽および重ポリペプチド鎖をscFv分子に変換し、これを抗原結合部位の構造に実質的に類似する3次元構造に折りたたむための化学構造を識別する多くの方法が記載されている。例えば、米国特許第5,091,513号；同第5,132,405号；および同第4,946,778号を参照のこと。

多くの標的分子に対する再構成された抗体遺伝子の大きな供給源を提供するために、非常に大きなナイーブヒトscFvライブラリが作製されておりかつ作製され得る。よりも小さなライブラリは、疾患特異的な抗体を単離するために、感染疾患を有する個体から構築され得る（Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-43(1992); Zebedee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3175-79 (1992)を参照のこと）。

一般に、ヒトから得られる抗体分子は、IgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDのクラスのいずれかに関連し、これらは分子中に存在する重鎖の性質によって互いと異なっている。特定のクラスはサブクラス、例えばIgG₁、IgG₂、IgG₃、およびIgG₄等も有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を表す。抗原結合部位は、重（「H」）および軽（「L」）鎖のN末端可変（「V」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される、重および軽鎖のV領域内の3つの高多様性ストレッチが、「フレームワーク領域」または「FR」として公知のより保存されている隣接ストレッチの間に介在している。したがって、「FR」という用語は、自然界において、免疫グロブリンの超可変領域の間にまたは超可変領域に隣接して見られるアミノ酸配列を表す。抗体分子においては、軽鎖の3つの超可変領域および重鎖の3つの超可変領域が抗原結合表面を形成するよう3次元空間で相互に配置される。この抗原結合表面は、結合する抗原の3次元表面と相補的であり、重および軽鎖の各々の3つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」と称される。CDRを含むscFv抗体のVHおよびVL領域は、表1A〜表11Bに示されている。

本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、scFvまたはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、化学的に活性な表面分子群、例えばアミノ酸または糖側鎖からなり、そして通常、特定の3次元構造的特徴および特定の電荷的特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのN末端またはC末端ペプチドに対して惹起され得る。

本明細書で使用される場合、「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンが特異的な抗原との間で起こるタイプの非共有結合的相互作用を表す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、その相互作用の解離定数（K_d）の観点で表され得、より小さなK_dはより大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量され得る。1つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度（rate）の測定を必要とするものであり、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性および両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。このようにして、「オンレート定数」（K_on）および「オフレート定数」（K_off）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定され得る（Nature 361:186-87 (1993)を参照のこと）。K_off/K_onの比は、親和性に関連しないすべてのパラメータの消去を可能にし、そしてそれは解離定数K_dに等しい（概要について、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照のこと）。本発明の抗体は、アッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に公知の同様のアッセイによって測定される平衡結合定数（K_d）が≦10μM、好ましくは≦10 nM、より好ましくは≦10 nM、最も好ましくは≦100 pM〜約1 pMの場合にGITRエピトープに特異的に結合すると言われる。

本発明のGITRタンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の作製において免疫原として使用され得る。プロテオリポソームと結合したGITRタンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の作製において免疫原として使用され得る。

当業者は、過度の実験を要することなく、ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを、前者が後者のGITR結合を妨げるかどうかを評価することによって決定することができることを理解しているであろう。試験されるヒトモノクローナル抗体が、本発明のヒトモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する場合、その2つのモノクローナル抗体は同じまたは関係の近いエピトープに結合することが考えられる。

ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定する別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を通常それと反応するGITRタンパク質と共にプレインキュベートし、次いで試験されるヒトモノクローナル抗体を添加して、試験されるヒトモノクローナル抗体がGITR結合能力に関して阻害されるかどうかを決定することである。試験されるヒトモノクローナル抗体が阻害される場合、それはほぼ確実に本発明のモノクローナル抗体と同じまたは機能的に等価なエピトープ特異性を有する。本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリーニングはまた、GITRを使用し、試験モノクローナル抗体がGITRを中和することができるかどうかを決定することによって実施され得る。

当技術分野で公知の様々な手順が、本発明のタンパク質に対するまたはその誘導体、フラグメント、アナログホモログもしくはオルソログに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の製造に使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）。

抗体は、周知技術、例えば、主として免疫血清のIgGフラクションを提供するプロテインAまたはプロテインGを用いる親和性クロマトグラフィーによって精製され得る。その後にまたはその代わりに、探索対象の免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはそのエピトープが、免疫親和性クロマトグラフィーによって免疫特異的な抗体を精製するためにカラムに固定され得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、D.Wilkinson（The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No.8 (April 17, 2000), pp.25-28）によって議論されている。

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」または「MAb」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特有の軽鎖遺伝子産物および特有の重鎖遺伝子産物からなる単一分子種である抗体分子を含む抗体分子の集団を表す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）は、その集団の分子のすべてで同一である。MAbは、それに対する特有の結合親和性によって特徴づけられる抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えばKohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記載される方法を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法においては、典型的に、マウス、ハムスターまたはその他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫し、その免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球が生成される。あるいは、リンパ球が、インビトロで免疫され得る。

免疫剤は、典型的には、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質を含む。通常、ヒト起源の細胞が望まれる場合に末梢血リンパ球が使用されるか、または非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合に脾細胞もしくはリンパ節が使用されるかのいずれかである。リンパ球は、次いで、適当な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp.59-103）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは未融合の不死化細胞の成長または生存を阻害する1つまたは複数の物質を含む適当な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（「HAT培地」）。

好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支援し、そして培地、例えばHAT培地に対する感受性を有するものである。より好ましい不死化細胞株は、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CaliforniaおよびAmerican Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手できるマウス骨髄腫株である。ヒトモノクローナル抗体の産生に関しては、ヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987) pp.51-63を参照のこと）。

ハイブリドーマ細胞を培養する培養培地は、その後、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降によってまたはインビトロ結合アッセイ、例えば放射免疫アッセイ（RIA）もしくは酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）によって決定される。そのような技術およびアッセイは、当技術分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)のScatchard分析によって決定され得る。さらに、モノクローナル抗体の治療適用においては、標的抗原に対する高い程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。

所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンが限外希釈手順によってサブクローニングされ、そして標準的な方法によって生育され得る（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp.59-103を参照のこと）。この目的に適した培養培地は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびRPMI-1640培地を含む。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腹水としてインビボで生育され得る。

サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来的な免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーによって培養培地または腹水液から単離または精製され得る。

モノクローナル抗体はまた、組み換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載される方法によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来的な手順を用いて（例えば、マウス抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離および配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源となる。単離後、DNAは発現ベクターに入れられ、次いでこれがそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞または骨髄腫細胞にトランスフェクトされ、その組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体が合成される。DNAはまた、例えば、ヒト重および軽鎖定常ドメインのコード配列をそれと相同なマウス配列と置換することによって（米国特許第4,816,567号；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)を参照のこと）または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を共有結合により接続することによって、修飾され得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換され得、またはキメラ2価抗体を作製するために本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインと置換され得る。

完全ヒト抗体は、CDRを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子から得られたものである抗体分子である。そのような抗体は、本明細書で、「ヒト化抗体」、「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と称される。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照のこと）；およびヒトモノクローナル抗体を製造するEBVハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96を参照のこと）を使用して調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを用いることによって（Cole, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照のこと）またはインビトロでヒトB細胞をエプスタインバーウイルスで形質転換することによって（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96を参照のこと）使用され得、製造され得る。

加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含むさらなる技術を用いて製造され得る（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)を参照のこと）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって作製され得る。チャレンジの後、遺伝子の再構成、構築および抗体レパートリーを含むすべての点でヒトにおいて見られるものと非常に類似するヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号およびMarks et al., Bio/Technology, 10, 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；およびLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。

ヒト抗体は、加えて、抗原によるチャレンジに応じてその動物の内因性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するよう修飾されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて製造され得る（PCT公開WO94/02602を参照のこと）。非ヒト宿主の重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子は無力化され、ヒト重および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座が宿主のゲノムに挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトDNAセグメントを含む酵母人工染色体を用いて組み込まれる。その後、望まれる修飾のすべてを提供する動物が、修飾の補完性が完全でない中間トランスジェニック動物を交雑することにより子孫として取得される。そのような非ヒト動物の好ましい態様はマウスであり、PCT公開WO 96/33735およびWO 96/34096に開示されるようにXenomouse（商標）と呼ばれる。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するB細胞を産生する。抗体は、関心対象の免疫原を用いた免疫後に動物から直接的に、例えばポリクローナル抗体調製物として、あるいはその動物由来の不死化B細胞、例えばモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、入手され得る。加えて、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子が、抗体を直接入手するために回収および発現され得、または抗体のアナログ、例えば単鎖Fv（scFv）分子を入手するためにさらに修飾され得る。

内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠失している、マウスとして例示される、非ヒト宿主を作製する方法の例は、米国特許第5,939,598号に開示されている。それは、胚性幹細胞の少なくとも1つの内因性重鎖遺伝子座からJセグメント遺伝子を除去してその遺伝子座の再構成を防止するおよび再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止する方法、選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的指向ベクターにより欠失を行う方法；ならびにその体細胞および生殖細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から作製する方法、を含む方法によって入手され得る。

関心対象の抗体、例えばヒト抗体を作製する1つの方法は、米国特許第5,916,771号に開示されている。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを培養下の1つの哺乳動物宿主細胞に導入し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞に導入し、そして2つの細胞を融合させてハイブリッド細胞を形成することを含む。このハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。

この手順のさらなる改善として、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法および該関連エピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する関連法が、PCT公開WO 99/53049に開示されている。

抗体は、上記の単鎖抗体をコードするDNAセグメントを含むベクターによって発現され得る。

これらは、ベクター、リポソーム、ネイキッドDNA、アジュバントアシストDNA、遺伝子銃、カテーテル等を含み得る。ベクターは、化学コンジュゲート体、例えば標的指向部分（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）および核酸結合部分（例えば、ポリリジン）を有するWO 93/64701に記載されるもの、ウイルスベクター（例えば、DNAまたはRNAウイルスベクター）、融合タンパク質、例えば標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）および核酸結合部分（例えば、プロタミン）を含む融合タンパク質であるPCT/US 95/02140（WO 95/22618）に記載されるもの、プラスミド、ファージ等を含む。ベクターは、染色体、非染色体または合成であり得る。

好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学コンジュゲート体を含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスを含む。DNAウイルスベクターが好ましい。これらのベクターは、ポックスベクター、例えばオルソポックスまたは鳥ポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター、例えば単純ヘルペスIウイルス（HSV）ベクター（Geller, A.I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed (Oxford Univ. Press, Oxford England)(1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A.I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990)を参照のこと）、アデノウイルスベクター（LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)を参照のこと）およびアデノ随伴ウイルスベクター（Kaplitt, M.G.. et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)を参照のこと）を含む。

ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。鳥ポックスウイルスベクターは、核酸の短期間の発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターは、神経細胞への核酸の導入に好ましい。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約4ヶ月）よりも短期間の発現（約2ヶ月）をもたらし、これはHSVベクターよりも短い。選択される個々のベクターは、標的細胞および処置される状態に依存すると考えられる。導入は、標準的技術、例えば感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換によるものであり得る。遺伝子移入の様式の例は、例えば、ネイキッドDNA、CaPO₄沈降、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクションおよびウイルスベクターを含む。

ベクターは、本質的に任意の所望の標的細胞を標的とするために使用され得る。例えば、定位注射が、ベクター（例えば、アデノウイルス、HSV）を所望の場所に送るために使用され得る。加えて、粒子は、ミニポンプ注入システム、例えばSynchroMed Infusion Systemを用いる脳室内（icv）注入によって送達され得る。対流と呼ばれるバルクフローに基づく方法も、大型の分子を脳の広い領域に送達するのに効果的であることが証明されており、ベクターを標的細胞に送達するのに有用であり得る（Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)を参照のこと）。使用することができる他の方法は、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内および皮下注射、ならびに経口またはその他の公知の投与経路を含む。

これらのベクターは、様々な目的で、例えばサンプルにおけるGITRの存在を検出するために使用され得る抗体を多量に発現させるために使用され得る。抗体はまた、GITRに結合しGITR活性を妨害する試みを行うために使用され得る。

技術は、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の製造のために適合させることができる（例えば、米国特許第4,946,778号を参照のこと）。加えて、方法は、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルF_abフラグメントの高速かつ効率的な同定を可能にするF_ab発現ライブラリの構築のために適合させることができる（例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281を参照のこと）。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、（i）抗体分子のペプシン消化によって作製されるF_(ab')2フラグメント；（ii）F_(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成されるF_abフラグメント；（iii）パパインおよび還元剤による抗体分子の処置によって生成されるF_abフラグメント；ならびに（iv）F_vフラグメントを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の技術によって作製され得る。

ヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲に包含される。ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合により接続された抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的指向させるため（米国特許第4,676,980号を参照のこと）およびHIV感染の処置のため（WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089を参照のこと）に提案されている。抗体が、架橋剤を利用するものを含む合成タンパク質化学において公知の方法を用いてインビトロで調製され得ることも想定されている。例えば、免疫毒素が、ジスルフィド交換反応を用いてまたはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的に適した試薬の例は、イミノチオレートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミデートならびに例えば米国特許第4,676,980号に開示されるものを含む。

本発明の抗体を、例えば癌の処置における該抗体の効果を増強するために、エフェクター機能に関して修飾することが望ましいことがある。例えば、システイン残基がFc領域に導入され、それによってこの領域に鎖間ジスルフィド結合が形成され得る。そのようにして作製されるホモ2量体抗体は、改善されたインターナライゼーション能力ならびに／または増大した補体媒介細胞殺傷性および抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を有し得る（Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)およびShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照のこと）。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するよう、そしてそれによって増強された補体溶解およびADCC能力を有し得るよう改造され得る（Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)を参照のこと）。

特定の態様において、本発明の抗体は、抗体の抗原非依存的エフェクター機能、特に抗体の循環半減期を変化させるアミノ酸置換を含むFc変種を含み得る。そのような抗体は、これらの置換を有さない抗体との比較でFcRnに対する増加した結合または減少した結合のいずれかを示し、したがって、それぞれ、血清中での増加または減少した半減期を有する。FcRnに対する改善された親和性を有するFc変種は、より長い血清半減期を有することが期待され、そのような分子は、例えば慢性疾患または障害を処置するために投与された抗体の長い半減期が望まれる哺乳動物を処置する方法において有用性を有する。対照的に、減少したFcRn結合親和性を有するFc変種は、より短い半減期を有すると考えられ、そのような分子もまた、例えば、例えばインビボ診断画像化のためにまたは出発抗体が長期間循環中に存在する場合に有毒な副作用を有する状況において短縮された循環時間が有利であり得る哺乳動物への投与において有用である。減少したFcRn結合親和性を有するFc変種はまた、胎盤と行き来する可能性が低く、したがって妊婦における疾患または障害の処置においても有用である。加えて、減少したFcRn結合親和性が望ましい場合がある他の用途は、脳、腎臓および／または肝臓への局在化が望まれる用途を含む。1つの例示的な態様において、本発明の改変された抗体は、血管からの腎臓糸球体の上皮を越える輸送の減少を示す。別の態様において、本発明の改変された抗体は、脳から血管空間への血液脳関門（BBB）を越える輸送の減少を示す。1つの態様において、変更されたFcRn結合を示す抗体は、Fcドメインの「FcRn結合ループ」内に1つまたは複数のアミノ酸置換を有するFcドメインを含む。FcRn結合ループは、（EU番号にしたがう）アミノ酸残基280〜299からなる。FcRn結合活性を変化させる例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み入れられる国際PCT公報第WO05/047327号に開示されている。特定の例示的な態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、以下の置換の1つまたは複数を有するFcドメインを含む：V284E、H285E、N286D、K290EおよびS304D（EU番号）。

いくつかの態様において、変異は、mAbの抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ADCC）活性が変化するようmAbの定常領域に導入される。例えば、変異は、CH2ドメイン内のLALA変異である。1つの局面において、bsAbは、ヘテロ二量体mAbの一方のscFvユニットに、ADCC活性を減少させる変異を含む。別の局面において、mAbは、ヘテロ二量体mAbの両方の鎖に、ADCC活性を完全に除去する変異を含む。例えば、mAbの一方または両方のscFvユニットに導入される変異は、CH2ドメイン内のLALA変異である。様々なADCC活性を有するこれらのmAbは、そのmAbによって認識される1つの抗原を発現する細胞に対して最大の選択的殺傷性を示すが、そのmAbによって認識される第2の抗原に対しては最小限の殺傷性を示すように最適化され得る。

他の態様において、本明細書に記載される診断および処置方法において使用される抗体は、グリコシル化を減少または排除するよう変更された定常領域、例えばIgG₁またはIgG₄重鎖定常領域を有する。例えば、本発明の抗体はまた、抗体のグリコシル化を変化させるアミノ酸置換を含むFc変種を含み得る。例えば、そのFc変種は、減少したグリコシル化（例えば、NまたはO結合型グリコシル化）を示し得る。例示的な態様において、Fc変種は、通常アミノ酸297位（EU番号）で見出されるN結合型グリカンのグリコシル化の減少を示す。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列NXTまたはNXSを含むグリコシル化モチーフ、例えばN結合型グリコシル化モチーフ付近または該モチーフ内にアミノ酸置換を有する。具体的な態様において、抗体は、アミノ酸228位または299位（EU番号）にアミノ酸置換を有するFc変種を含む。より具体的な態様において、抗体は、S228PまたはT299A変異（EU番号）を含むIgG1またはIgG4定常領域を含む。

グリコシル化を減少または変化させる例示的なアミノ酸置換は、参照により本明細書に組み入れられる国際PCT公報第WO05/018572号に開示されている。好ましい態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、グリコシル化を除去するよう修飾される。そのような抗体またはそのフラグメントは、「無糖鎖（agly）」抗体またはそのフラグメント（例えば、「無糖鎖」抗体）と称される。学説により拘束されるものではないが、「無糖鎖」抗体またはそのフラグメントは、インビボで改善された安全性および安定性プロフィールを示し得ると考えられる。例示的な無糖鎖抗体またはそのフラグメントは、Fcエフェクター機能を欠くためGITRを発現する正常な生存器官に対するFc媒介毒性の可能性が排除されているIgG4抗体の非グリコシル化Fc領域を含む。さらに他の態様において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、変更されたグリカンを含む。例えば、この抗体は、Fc領域のAsn297のN-グリカン上に減少した数のこれらの残基を有し得る、すなわち非フコシル化される。別の態様において、この抗体は、Fc領域のAsn297のN-グリカン上に変更された数のシアル酸残基を有し得る。iii）共有結合付加。

本発明はまた、細胞傷害剤、例えば毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性を有する毒素またはそのフラグメント）または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート体）にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲート体に関する。

使用することができる酵素活性を有する毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害物質、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲート抗体の作製に利用可能である。例は、²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Yおよび¹⁸⁶Reを含む。

抗体および細胞傷害剤のコンジュゲート体は、様々な2官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの2官能性誘導体（例えば、ジメチルアジプイミデートHCL）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン2,6-ジイソシアネート（tolyene 2,6-diisocyanate））、および二活性フッ素化合物（例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載されるようにして調製され得る。炭素14標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションにおける例示的なキレート剤である（WO94/11026を参照のこと）。

当業者は、本発明の得られる抗体または他の分子に非常に多様な候補部分をカップリングさせることができることを理解しているであろう（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる"Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照のこと）。

カップリングは、抗体および他の部分がそれら各々の活性を保持する限リ、2つの分子を結合させる任意の化学反応によって達成され得る。この連結は、多くの化学メカニズム、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合および錯体化を含み得る。しかし、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接的縮合によってまたは外部架橋分子の組み込みによってのいずれかによって達成され得る。多くの2価または多価連結剤が、タンパク質分子、例えば本発明の抗体、の他の分子へのカップリングに有用である。例えば、代表的なカップリング剤は、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンを含み得る。このリストは、当技術分野で公知の様々なクラスのカップリング剤を網羅することを意図したものではなく、より一般的なカップリング剤の例示にすぎない（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); およびVitetta et al., Science 238:1098 (1987)を参照のこと）。好ましいリンカーは、文献に記載されている（例えば、MBS（M-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用について記載するRamakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)を参照のこと）。オリゴペプチドリンカーによって抗体にカップリングされたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用について記載する米国特許第5,030,719号も参照のこと。特に好ましいリンカーは：（i）EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミドヒドロクロリド）；（ii）SMPT（4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジル（pridyl）-ジチオ)-トルエン）（Pierce Chem. Co., Cat.(21558G)）；（iii）SPDP（スクシンイミジル-6[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート）（Pierce Chem. Co., Cat #21651G）；（iv）スルホ-LC-SPDP（スルホスクシンイミジル 6 [3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート）（Pierce Chem. Co., Cat. #2165-G）；および（v）EDCにコンジュゲートされたスルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホ-スクシンイミド：Pierce Chem. Co., Cat. #24510）を含む。

上記のリンカーは、異なる特質を有する要素を含み、それによって生理化学的特性が異なるコンジュゲートが生成される。例えば、アルキルカルボン酸のスルホ-NHSエステルは、芳香族カルボン酸のスルホ-NHSエステルよりも安定である。NHS-エステル含有リンカーは、スルホ-NHSエステルよりも溶解性が低い。さらに、リンカーSMPTは、立体的に妨げられたジスルフィド結合を含み、高い安定性のコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド連結は、一般に、インビトロで切断されるため他の連結よりも安定性が低く、コンジュゲートの利用性を低下させるものである。スルホ-NHSは、特に、カルボジイミドカップリングの安定性を増強し得る。カルボジイミドカップリング（例えば、EDC）は、スルホ-NHSと組み合わせて使用される場合、カルボジイミドカップリング反応単独よりも加水分解に対する抵抗性が高いエステルを形成する。

本明細書に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。該抗体を含むリポソームは、当技術分野で公知の方法、例えばEsptein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；ならびに米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号に記載される方法、によって調製される。循環時間が増強されたリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。

特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生成するよう定義された孔サイズのフィルターを通じて押出される。本発明の抗体のFab'フラグメントは、Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるようにジスルフィド交換反応を通じてリポソームにコンジュゲートされ得る。

GITRに対する抗体の使用
本発明のGITRタンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、GITR関連疾患または障害の処置のために投与され得る。「GITR関連疾患または障害」は、GITRレベルの増加および／またはGITRが関与する細胞シグナル伝達経路の活性化が見られる疾患状態および／または疾患状態に関連する症状を含む。例示的なGITR関連疾患または障害は、癌および炎症疾患を含むがこれらに限定されない。

多くの癌はGITRを過剰発現し、GITRの上方制御は高リスク予測因子に関連する。腫瘍細胞におけるGITRまたはそのリガンドであるGITR-Lの過剰発現もまた、その腫瘍細胞が抗腫瘍免疫を回避する機構を示し得る。そのような癌は、固形腫瘍および血液腫瘍を含む。本発明の抗体の使用は、Tregを抑制または除去し、かつTeffを刺激する。加えて、本発明の抗体は、NK細胞の毒性を増加させ、かつIFNγ産生を増加させる。

二重特異性、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全ヒト抗体を含む本発明の抗体は、治療剤として使用され得る。そのような薬剤は、通常、対象において癌を処置もしくは予防するために、ワクチン効力を増大させるためにまたは自然免疫応答を増進するために使用される。抗体調製物、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するもの、が対象に投与され、そして通常、その標的に対する結合によって効果を生ずる。抗体の投与は、GITRタンパク質の活性を無効化または阻害または妨害し得る。

本発明のGITRタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体は、薬学的組成物の形態で癌の処置のために投与され得る。該抗体を含む治療組成物の調製に関する原理および考察ならびに成分の選択の手引は、例えば、Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; およびPeptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol.4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供されている。

本発明の抗体の治療有効量は、通常、治療目的を達成するために必要とされる量に関連する。上記のように、これは、抗体とその標的抗原との間の、特定の例では標的の機能を妨害する結合相互作用であり得る。投与に必要とされる量はさらに、その特異的抗原に対する抗体の結合親和性に依存するであろうし、また投与された抗体がそれを投与された対象の自由空間（free volume）から消失する速度にも依存するであろう。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療有効投与量の一般的範囲は、非限定的な例であるが、約0.1 mg/kg体重〜約50 mg/kg体重であり得る。一般的投与頻度は、例えば、1日に2回〜1週間に1回の範囲であり得る。

抗体フラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づき、標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子が設計され得る。そのようなペプチドは、化学的に合成および／または組み換えDNA技術により作製され得る（例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照のこと）。製剤はまた、処置される特定の兆候に必要となる場合、1つより多い活性化合物、好ましくは互いに対して悪影響を及ぼさない補完的活性を有するもの、を含み得る。あるいはまたは加えて、組成物は、その機能を増強する剤、例えば、細胞傷害剤、サイトカイン（例えば、IL-15）、化学療法剤または成長阻害剤を含み得る。そのような分子は、意図されている目的に有効な量で適当に組み合わされる。

活性成分はまた、例えば液滴技術によってまたは界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおける、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルの中に捕捉され得る。

インビボ投与に使用される製剤は、無菌性でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通じたろ過によって容易に達成され得る。

持続放出調製物が、調製され得る。持続放出調製物の適当な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、このマトリクスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形式である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸およびγエチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸-グルコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（商標）（乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドから構成される注射可能なマイクロスフィア）ならびにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む。ポリマー、例えばエチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸は100日を超える分子の放出を実現するのに対して、特定のヒドロゲルは、それより短い期間でタンパク質を放出する。

本発明にしたがう抗体は、サンプル中のGITR（またはタンパク質もしくはそのタンパク質フラグメント）の存在を検出するための剤として使用され得る。好ましくは、抗体は、検出可能な標識を含む。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、F_ab、scFvまたはF_(ab)2）が使用され得る。プローブまたは抗体に関する「標識」という用語は、プローブまたは抗体への検出可能物質のカップリング（すなわち、物理的連結）によるプローブまたは抗体の直接的標識および直接的に標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含することが意図されている。間接的標識の例は、蛍光標識された2次抗体を用いる1次抗体の検出および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るビオチンによるDNAプローブの末端標識を含む。「生物学的サンプル」という用語は、対象から単離された組織、細胞および生物学的流体ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図されている。したがって、血液ならびに血清、血漿またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分が、「生物学的サンプル」という用語の用法に含まれる。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロおよびインビボで生物学的サンプル中の分析物であるmRNA、タンパク質またはゲノムDNAを検出するために使用され得る。例えば、分析物mRNAの検出のためのインビトロ技術は、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチューハイブリダイゼーションを含む。分析物タンパク質の検出のためのインビトロ技術は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を含む。分析物ゲノムDNAの検出のためのインビトロ技術は、サザンハイブリダイゼーションを含む。免疫アッセイを実施する手順は、例えば、"ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J.R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T.Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; および"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、分析物タンパク質の検出のためのインビボ技術は、標識された抗分析物タンパク質抗体の対象への投入を含む。例えば、抗体は、標準的な画像化技術によって対象内でのその存在および場所が検出できる放射性マーカーで標識され得る。

GITRタンパク質（またはそのフラグメント）に対する抗体は、GITRタンパク質の局在化および／または定量に関して当技術分野で公知の方法において使用され得る（例えば、適当な生理学的サンプル中のGITRタンパク質のレベルの測定において使用するために、診断法において使用するために、タンパク質の画像化において使用するために等）。所定の態様において、抗体由来抗原結合ドメインを含む、GITRタンパク質に特異的な抗体またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログは、薬学的に活性な化合物（本明細書の以降で「治療剤」と称される）として使用される。

本発明のGITRタンパク質に特異的な抗体は、標準的技術、例えば免疫親和性、クロマトグラフィーまたは免疫沈降によりGITRポリペプチドを単離するために使用され得る。GITRタンパク質（またはそのフラグメント）に対する抗体は、臨床試験手順の一部として、例えば所定の処置計画の効果を決定するため、組織内のタンパク質レベルをモニターするために診断的に使用され得る。検出は、該抗体を検出可能物質にカップリング（すなわち、物理的に連結）することによって行われ得る。検出可能物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を含む。適当な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含み、そして適当な放射性物質の例は、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵Sまたは³Hを含む。

薬学的組成物
本発明の抗体または剤（本明細書で「活性化合物」とも称される）およびそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。そのような組成物は、典型的に、該抗体または剤および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤等を含むことが意図されている。適当な担体は、参照により本明細書に組み入れられる、この分野の標準的参考文献であるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液および5％ヒト血清アルブミンを含むがこれらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば固定油も使用され得る。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来的な媒体または剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、該組成物におけるその使用が想定されている。補助的な活性化合物も組成物に組み込まれ得る。

本発明の薬学的組成物は、意図されている投与経路に適合するよう処方される。投与経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜および直腸投与を含む。非経口、皮内または皮下適用で使用される溶液または懸濁物は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化物質、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および浸透圧調節剤、塩化ナトリウムまたはデキストロース。pHは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアルに収納され得る。

注射用途に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物および滅菌注射溶液または分散物を即時準備するための滅菌粉末を含む。静脈内投与に適した担体は、生理学的食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, N.J.）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、注射容易性（easy syringeability）が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の混入行動に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）ならびにそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散物の場合は必要な粒子サイズの維持によっておよび表面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の行動の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合において、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射可能な組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。

注射可能な滅菌溶液は、上記の成分の1つまたは組み合わせを含む適当な溶媒に必要量の活性化合物を添加し、必要な場合、その後に濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、基本分散媒および上記のうちの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに活性化合物を添加することによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を事前に滅菌濾過されたその溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥である。

経口組成物は、通常、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに収容されるかまたは錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的で、活性化合物は賦形剤と共に添加され、そして錠剤、トローチまたはカプセルの形式で使用され得る。経口組成物はまた、口内洗浄液として使用するために流体担体を用いて調製され得、この場合、流体担体中の化合物が経口的に適用され、そしてうがいされ吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント物質が、組成物の一部分として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分のいずれかまたは類似の性質を有する化合物を含み得る：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Primogelもしくはトウモロコシデンプン；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸塩（Sterotes）；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン；またはフレーバー剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバー。

吸入による投与の場合、化合物は、適当な推進剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含む加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからのエアゾール噴霧の形式で送達される。

全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与の場合、透過したい障壁に適した浸透剤が製剤で使用される。そのような浸透剤は、一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐薬の使用を通じて達成され得る。経皮投与の場合、活性化合物は、一般に当技術分野で公知のように軟膏、サルヴェ（salve）、ゲルまたはクリームにより処方され得る。

化合物はまた、直腸送達のために（例えば、従来的な坐薬基剤、例えばココアバターおよびその他のグリセリドを含む）坐薬または停留浣腸剤の形式で調製され得る。

1つの態様において、活性化合物は、体内からの迅速な排除から該化合物を保護する担体、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル送達システムを含む制御放出製剤、を用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が使用され得る。そのような製剤を調製する方法は、当業者に明らかであろう。これらの物質は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞に標的指向化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に活性な担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の方法にしたがい、例えば米国特許第4,522,811号に記載されるようにして調製され得る。

投与の容易さおよび用量の均一さのために経口または非経口組成物を単位剤形で処方することが特に有益である。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象に対する単回の投薬に適した物理的に隔離されている単位であって；各単位が、必要とされる薬学的担体と共に所望の治療効果を生ずるよう計算された既定量の活性化合物を含むものを表す。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特徴および達成したい特定の治療効果ならびに個体の処置のためのそのような活性化合物の配合の分野に特有の制約により決定づけられ、かつそれらに直接的に依存する。

薬学的組成物は、投与のための指示書と共に、容器、袋またはディスペンサーに含まれ得る。

診断アッセイ
huGITR抗体は、例えば、例えば特定の処置および／または予防計画の効果を決定するために、臨床試験手順の一部として免疫細胞障害（例えば、CLL）の発生または進行をモニタリングするために、診断的に使用され得る。

いくつかの局面において、診断目的で、本発明のhuGITR抗体は、検出可能部分に連結され、癌または慢性感染に罹患した対象においてT細胞の枯渇を検出する手段を提供する。

検出可能部分は、抗体もしくはフラグメントに直接的にまたは例えば蛍光性の2次抗体を用いて間接的にコンジュゲートされ得る。直接的なコンジュゲーションは、例えば抗体もしくは抗体フラグメントに対するフルオロフォアの標準的化学カップリングによってまたは遺伝子操作を通じて達成され得る。蛍光または生物発光タンパク質にカップリングされた抗体または抗体フラグメントを含むキメラまたは融合タンパク質が構築され得る。例えば、Casadeiらは、エクオリンおよび抗体遺伝子の融合タンパク質を哺乳動物細胞内で発現させることができるベクターコンストラクトを作製する方法を記載している。

本明細書で使用される場合、プローブまたは抗体に関する「標識」という用語は、プローブまたは抗体への検出可能物質のカップリング（すなわち、物理的連結）によるプローブまたは抗体の直接的標識および直接的に標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含することが意図されている。間接的標識の例は、蛍光標識された2次抗体を用いる1次抗体の検出および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るビオチンによるDNAプローブの末端標識を含む。「生物学的サンプル」という用語は、対象（例えば、生検）から単離された組織、細胞および生物学的流体ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図されている。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロおよびインビボで生物学的サンプル中のGITRを発現する細胞を検出するために使用され得る。例えば、GITRの検出のためのインビトロ技術は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を含む。さらに、GITRの検出のためのインビボ技術は、対象への標識抗GITR抗体の投入を含む。例えば、抗体は、標準的な画像化技術によって対象内でのその存在および場所が検出できる放射性マーカーで標識され得る。「標的指向化」されたコンジュゲート、すなわち、そのコンジュゲートを対象または動物内の特定部位または部位群に局在化させるよう設計された分子または特徴である標的指向部分を含むコンジュゲートの場合、局在化は、対象内で、固定されている「局在化」した物体と固定されていない「遊離」の状態の物体との間の平衡が本質的に達成されている状態を表す。そのような平衡が達成される速度は、投与経路に依存する。例えば、血栓に局在化するよう静脈内注射により投与されたコンジュゲートは、注射から数分以内に、血栓への局在化または蓄積を達成し得る。他方、腸内の感染部位に局在化するよう経口投与されたコンジュゲートは、局在化を達成するのに数時間を要し得る。あるいは、局在化は、単に、その物体が投与された後の選択された期間における対象または動物内でのその物体の場所を表し得る。別の例として、局在化は、その部分が投与後に分散されたときに達成される。

上記のすべての場合において、局在化を達成する時間の合理的な見積もりが当業者により行われ得る。さらに、時間の関数としての局在化の状態は、本発明の方法にしたがう、例えば光検出デバイスを用いる検出可能部分（例えば、発光性コンジュゲート）の画像化によって追跡され得る。使用される「光検出デバイス」は、哺乳動物内からのかすかな光の画像化を合理的な時間内に実現するのにおよびそのようなデバイスからのシグナルを画像の構築に使用するのに十分高い感度を有する必要がある。

極めて明るい光発生部分を使用することおよび／または画像化される対象もしくは動物の表面付近に局在化された光発生融合タンパク質を検出することが可能な場合、「暗視」ゴーグルまたは標準的な高感度ビデオカメラ、例えばSilicon Intensified Tube (SIT)カメラ（例えば、Hammamatsu Photonic Systems, Bridgewater, N.J.製）が使用され得る。しかし、より典型的には、より好感度の光検出法が必要とされる。

極めて低い光レベルでは、単位面積あたりのフォトンフラックスが非常に低くなり、画像化される光景はもはや連続的なものではなくなる。代わりに、それは、時間的および空間的の両面で相互に異なる個々のフォトンによって表される。モニター上で見ると、そのような画像は、各々が単一の検出されたフォトンを表す光のシンチレーション点のように見える。これらの検出されたフォトンを経時的にデジタル画像プロセッサに蓄積することによって、画像が取得および構築され得る。各像点のシグナルが強度値を割り当てられる従来のカメラと異なり、フォトン計数式の画像化においては、シグナルの大きさは重要ではない。目的は単に、シグナル（フォトン）の存在を検出することおよびその位置に関するシグナルの発生を経時的に計数することである。

以下に記載される少なくとも2つのタイプの光検出デバイスが、個々のフォトンを検出し、画像プロセッサによって分析できるシグナルを生成することができる。ノイズ軽減型光検出デバイスは、フォトンシグナルを増幅するのとは反対に、フォトン検出器におけるバックグラウンドノイズを軽減することによって高感度を達成するものである。ノイズは、主として検出器アレイを冷却することによって軽減される。このデバイスは、「裏面薄膜化（backthinned）」冷却CCDカメラと称される電荷結合素子（CCD）カメラを含む。より高感度の機器において、冷却は、例えば、CCDアレイの温度をおよそ-120℃まで下げる液体窒素を用いて達成される。「裏面薄膜化」は、検出されるフォトンが通る光路長を短縮し、それによって量子効率を増大させる極薄バックプレートを表す。特に高感度の裏面薄膜化低温CCDカメラは、Photometrics, Ltd.（Tucson, Ariz.）から入手可能な「TECH 512」、シリーズ200カメラである。

「フォトン増幅デバイス」は、検出スクリーンに衝突する前にフォトンを増幅する。このクラスは、増倍器、例えばマイクロチャネル増倍器を有するCCDカメラを含む。マイクロチャネル増倍器は、典型的に、カメラの検出スクリーンに対して垂直でありかつカメラの検出スクリーンと同一の広がりをもつチャネルの金属アレイを含む。マイクロチャネルアレイは、画像化されるサンプル、対象または動物とカメラの間に設置される。このアレイのチャネルに進入したフォトンの大部分は、励起前にチャネルの側面と接触する。このアレイ全体に適用される電圧が、各フォトン衝突から多くの電子を放出させる。そのような衝突から得られた電子は、「ショットガン」パターンでそれらの元のチャネルから出て、そしてカメラによって検出される。

さらに高い感度は、第1段階で電子が生成され第2段階で電子のシグナルが増幅されるように増倍マイクロチャネルアレイを連続して設置することによって達成され得る。しかし、感度の向上は、空間分解能を犠牲にして達成され、空間分解能は各々の追加の増幅段階ごとに減少していく。例示的なマイクロチャネル増倍器ベースの単一フォトン検出デバイスは、Hamamatsuから入手可能なC2400シリーズである。

画像プロセッサは、フォトンを計数する光検出デバイスによって生成されたシグナルを処理し、例えばモニターに表示することができるまたはビデオプリンターでプリントすることができる画像を構築する。そのような画像プロセッサは、典型的に、上記の高感度フォトン計測カメラを含むシステムの一部として売られており、したがって同じ供給源から入手可能である。画像プロセッサは、通常、購入した画像化システムの一部として含まれる場合または含まれない場合があるパーソナルコンピュータ、例えばIBM互換PCまたはApple Macintosh（Apple Computer, Cupertino, Calif.）に接続される。画像が電子ファイル形式の場合、それらは様々な画像処理プログラム（例えば、「ADOBE PHOTOSHOP」, Adobe Systems, Adobe Systems, Mt. View, Calif.）によって操作され印刷され得る。

1つの態様において、生物学的サンプルは、試験対象由来のタンパク質分子を含む。1つの好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって対象から単離された末梢血白血球サンプルである。

本発明はまた、生物学的サンプルにおいてGITRまたはGITR発現細胞の存在を検出するためのキットを包含する。例えば、キットは：生物学的サンプル中の癌または腫瘍細胞を検出することができる標識された化合物または剤（例えば、抗GITR scFvまたはモノクローナル抗体）；サンプル中のGITRの量を決定するための手段；およびサンプル中のGITRの量を標準と比較するための手段、を含み得る。標準は、いくつかの態様において、非癌細胞またはその細胞抽出物である。化合物または剤は、適当な容器に収納され得る。キットはさらに、該キットを用いてサンプル中の癌を検出するための指示書を含み得る。

二重特異性抗体
二重特異性抗体（bsAb）は、得られる抗体が2つの異なる抗原を認識するよう2つの可変ドメインまたはscFvユニットを含む抗体である。本発明は、GITRおよび第2の抗原を認識する二重特異性抗体を提供する。例示的な第2の抗原は、腫瘍関連抗原、サイトカインおよび細胞表面受容体を含む。いくつかの態様において、第2の抗原は、CAIX（炭酸脱水酵素IX、またはG250）、IL-10またはCCR4であり得る。いくつかの態様において、第2の抗原は、PD-1、PDL1、CCR4、IL21R、BTLA、HVEM、またはTIM3である細胞表面受容体であり得る。本発明の二重特異性抗体は、本明細書に開示されるhuGITR抗体の重鎖および軽鎖の組み合わせまたはscFvを含む。

二重特異性抗体の構築
本発明の二重特異性抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて構築され得る。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、2つのscFvフラグメントが、抗体を形成するよう2つのscFvユニット間の分子内会合を実現するのに十分な長さの長いリンカーポリペプチドにより接続されている単一ポリペプチドである。他の態様において、二重特異性抗体は、共有または非共有結合により連結された1つより多いポリペプチドである。

別の態様において、二重特異性抗体は、「ノブ・イントゥー・ホール（knob into hole）」法を用いて構築される（Ridgway et al., Protein Eng 7:617-621 (1996)）。この方法では、2つの異なる可変ドメインのIg重鎖が、重-軽鎖対を維持しつつ重鎖対を選択的に開裂するよう還元される。2つの異なる抗原を認識する2つの重-軽鎖ヘテロ2量体は、CH3ドメインの人工「ノブ・イントゥー・ホール」を介したヘテロライゲーション対形成が行われるよう混合される。

別の態様において、二重特異性抗体は、2つまたはそれ以上の異なる抗体由来の重-軽鎖2量体の交換により、第1の重-軽鎖2量体がGITRを認識し第2の重-軽鎖2量体が第2の抗原を認識するハイブリッド抗体を生成することによって構築され得る。重-軽鎖2量体についてのメカニズムは、これも二重特異性分子として機能するヒトIgG4の形成に類似するものである。IgG重鎖の2量体化は、分子内力、例えば各重鎖のCH3ドメインの対形成およびジスルフィド架橋によってもたらされる。CH3ドメインにおける特定アミノ酸（R409）の存在は、2量体交換およびIgG4分子の構築を促進することが示されている。重鎖対はまた、抗体のヒンジ領域における重鎖間ジスルフィド架橋によってさらに安定化される。特に、IgG4では、ヒンジ領域が、アミノ酸226〜230に（配列Cys-Pro-Pro-Cysを含む安定なIgG1のヒンジ領域に対して）アミノ酸配列Cys-Pro-Ser-Cysを含んでいる。この229位のセリンの配列の違いは、IgG4がそのヒンジ領域において新たな鎖内ジスルフィドを形成する傾向と関連付けられている（Van der Neut Kolfschoten, M. et al., 2007, Science 317:1554-1557およびLabrijn, A.F. et al, 2011, Journal of immunol 187:3238-3246）。

したがって、本発明の二重特異性抗体は、GITRを認識する1つの重-軽鎖2量体および本明細書に開示される任意の抗原である第2の抗原を認識する第2の重-軽鎖2量体を有する抗体分子を生じるよう重-軽鎖2量体が交換されるよう、CH3ドメインにおけるR409残基の導入およびGITRまたは第2の抗原を認識する抗体のヒンジ領域におけるCys-Pro-Ser-Cys配列の導入を通じて作製され得る。既知のIgG4分子もまた、本明細書に開示されるように重および軽鎖がGITRまたは第2の抗原を認識するよう変更され得る。本発明の二重特異性抗体の構築におけるこの方法の使用は、そのFc領域が、免疫応答のエフェクター系、例えば補体および特定の白血球細胞によって発現されるFc受容体とほとんど相互作用しない点で他のIgGサブタイプと相違するというIgG4分子の固有の特徴のために有益であり得る。この特定の性質ゆえに、これらのIgG4ベースの二重特異性抗体は、抗体が標的に結合しその標的に関連するシグナル伝達経路を機能的に変更させることを要求されるがエフェクター活性を誘発することは要求されない治療適用において魅力的なのである。

いくつかの態様において、bsAbの抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）活性が変化するよう、bsAbの定常領域に変異が導入される。例えば、変異は、CH2ドメインにおけるLALA変異である。1つの局面において、bsAbは、ヘテロ2量体bsAbの一方のscFvユニット上に、ADCC活性を減少させる変異を含む。別の局面において、bsAbは、ヘテロ2量体bsAbの両方の鎖上に、ADCC活性を完全に取り除く変異を含む。例えば、bsAbの一方または両方のscFvユニットに導入される変異は、CH2ドメインにおけるLALA変異である。これらの様々なADCC活性を有するbsAbは、bsAbがそのbsAbにより認識される1つの抗原を発現する細胞に対して最大限の選択的殺傷性を示すが、そのbsAbにより認識される第2の抗原に対しては最小限の殺傷性を示すよう、最適化され得る。

本明細書中に開示される二重特異性抗体は、疾患または病状、例えば癌の処置に有用であり得る。本発明の二重特異性抗体は、増加したTregに関連する疾患または病状において特に有用であり得る。

処置の方法
本発明は、癌または他の細胞増殖関連疾患もしくは障害の危険がある（またはそれらにかかりやすい）対象を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。そのような疾患または障害は、例えば、GITRの異常な発現に関連する疾患または障害を含むがこれらに限定されない。例えば、この方法は、癌の症状を処置、予防または軽減するために使用される。あるいは、この方法は、GITRがT細胞応答に関して負の調節的役割を果たしている癌の症状を処置、予防または軽減するために使用される。あるいは、この方法は、固形腫瘍、例えば乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、皮膚癌、肝癌、膵癌または胃癌の症状を処置、予防または軽減するために使用される。さらに、本発明の方法は、血液の癌、例えば白血病およびリンパ腫を処置するために使用される。あるいは、この方法は、転移した癌の症状を処置、予防または軽減するために使用される。

したがって、1つの局面において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体、scFv抗体、または本発明の二重特異性抗体を対象に投与することによって対象における癌または細胞増殖疾患もしくは障害の症状を予防、処置または軽減する方法を提供する。例えば、huGITR抗体が、治療有効量で投与され得る。

癌または細胞増殖関連疾患もしくは障害の危険がある対象は、癌の家族歴を有する患者または発癌性が知られているもしくは疑われる物質に曝露された対象を含む。予防的薬剤の投与は、疾患が予防されるようにあるいはその進行が遅れるように、癌の発現の前に行われ得る。

別の局面において、本発明のGITR抗体を細胞と接触させることによって、腫瘍細胞の成長が阻害される、Tregの活性化が減少する、Teffの活性化が増加する、あるいはNK細胞の細胞毒性が増加する。細胞は、GITRを発現する任意の細胞である。例えば、細胞はT細胞、またはNK細胞である。

抗原に対する免疫応答を増加または増強する方法も、本発明に含まれる。免疫応答は、本発明のモノクローナル抗体またはscFv抗体を対象に投与することによって増加または増強される。免疫応答は、例えば抗原特異的なTエフェクター機能を増進することによって増進される。抗原は、ウイルス（例えば、HIV）、細菌、寄生虫または腫瘍抗原である。免疫応答は自然免疫応答である。自然免疫応答によって、感染の結果である免疫応答が意味される。感染は慢性感染である。抗原に対する免疫応答の増加または増強は、当技術分野で公知の多くの方法によって測定され得る。例えば、免疫応答は、以下のいずれか1つを測定することによって測定され得る：T細胞の活性、T細胞の増殖、T細胞の活性化、エフェクターサイトカインの産生およびT細胞の転写プロフィール。

あるいは、免疫応答は、ワクチン摂取により誘導される応答である。したがって、別の局面において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはscFv抗体およびワクチンを対象に投与することによってワクチン効果を増大させる方法を提供する。抗体およびワクチンは、順次または同時に投与される。ワクチンは、腫瘍ワクチン、細菌ワクチンまたはウイルスワクチンである。

併用法
本発明は、GITRタンパク質の同一エピトープあるいはGITRタンパク質の2つの異なるエピトープに結合する2つの抗体を投与することによる患者の癌の処置を提供する。あるいは、癌は、GITRに結合する第1の抗体およびGITR以外のタンパク質に結合する第2の抗体を投与することにより処置される。例えば、GITR以外の他のタンパク質は、PD-1、PD-L1、CAIX、CCR4およびIL-10を含み得るがこれらに限定されない。例えば、GITR以外の他のタンパク質は、腫瘍関連抗原である。

いくつかの態様において、本発明は、単独でのまたはGITR以外の別のタンパク質を認識する追加抗体と組み合わせての、免疫応答をもたらすまたは増進することができる細胞と組み合わせての、huGITR抗体の投与を提供する。例えば、これらの細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）またはPBMCにおいて見出される任意の細胞型、例えば細胞傷害性T細胞、マクロファージおよびナチュラルキラー（NK）細胞であり得る。

加えて、本発明は、GITRタンパク質に結合する抗体および抗新生物剤、例えば低分子、成長因子、サイトカイン、または生分子、例えばペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、ポリヌクレオチド、脂質由来メディエーター、小さな生体アミン、ホルモン、神経ペプチドおよびプロテアーゼを含む他の治療剤の投与を提供する。低分子は、無機分子および小さな有機分子を含むがこれらに限定されない。適切な成長因子またはサイトカインは、IL-2、GM-CSF、IL-12およびTNF-αを含む。低分子ライブラリは、当技術分野で公知である（Lam, Anticancer Drug Des., 12:145, 1997を参照のこと）。

本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、これは特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではない。

他の態様
本発明はその詳細な説明に関連して説明されてきたが、上記の説明は例示を意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。他の局面、利点および改変も、添付の特許請求の範囲に包含される。

Claims (27)

1. ヒトグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（GITR）に結合する単離されたヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
   a. SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域；
   b. SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域；
   c. SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域；
   d. SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域；
   e. SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域；
   f. SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:24のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域；
   g. SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:28のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域；
   h. SEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域；
   i. SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域；
   j. SEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域；または
   k. SEQ ID NO:42のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域およびSEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域
   を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. （a）SEQ ID NO:45、46もしくは47のアミノ酸配列を含む、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:48、49もしくは50のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；
   （b）SEQ ID NO:51、52もしくは53のアミノ酸配列を含む、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:54、55もしくは56のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；
   （c）SEQ ID NO:57、58もしくは59のアミノ酸配列を含む、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:60、61もしくは62のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；
   （d）SEQ ID NO:63、64もしくは65のアミノ酸配列を含む、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:66、67もしくは68のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；
   （e）SEQ ID NO:69、70もしくは71のアミノ酸配列を含む、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:72、73もしくは74のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；
   （f）SEQ ID NO:75、76もしくは77のアミノ酸配列を含む、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:78、79もしくは80のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；
   （g）SEQ ID NO:81、82もしくは83のアミノ酸配列を含む、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:84、85もしくは86のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；
   （h）SEQ ID NO:87、88もしくは89のアミノ酸配列を含む、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:90、91もしくは92のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；
   （i）SEQ ID NO:93、94もしくは95のアミノ酸配列を含む、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:96、97もしくは98のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；
   （j）SEQ ID NO:99、100もしくは101のアミノ酸配列を含む、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:102、103もしくは104のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）；または
   （k）SEQ ID NO:105、106もしくは107のアミノ酸配列を含む、それぞれ、可変重鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VH-CDR）；およびSEQ ID NO:108、109もしくは110のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1、2もしくは3（VL-CDR）
   を含み、ヒトグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（GITR）に結合する、単離されたヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
3. 1価または2価である、請求項1記載の抗体。
4. 単鎖抗体である、請求項1記載の抗体。
5. 10^-5 M〜10^-12 Mの範囲内の結合親和性を有する、請求項1記載の抗体。
6. IgG4重鎖定常領域を有する、請求項1記載の抗体。
7. Fc領域がアミノ酸234位および235位に変異を含む、請求項1記載の抗体。
8. 変異がL234AおよびL235Aである、請求項7記載の抗体。
9. 腫瘍関連抗原、サイトカイン、または細胞表面受容体にも結合する二重特異性抗体である、請求項1記載の抗体。
10. 治療剤に連結されている、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
11. 治療剤が、毒素、放射性標識、siRNA、低分子、またはサイトカインである、請求項10記載の抗体。
12. 請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体を産生する、細胞。
13. 対象において制御性T細胞を除去する方法であって、その必要がある対象に請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体を含む組成物を投与する段階を含む、方法。
14. 抗原に対する免疫応答を増大させる方法であって、その必要がある対象に請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体を含む組成物を投与する段階を含む、方法。
15. 抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、または腫瘍関連抗原である、請求項14記載の方法。
16. 前記抗体の投与が、抗原特異的なT細胞の活性を増加させる、請求項14記載の方法。
17. 前記抗体の投与が、NK細胞の細胞傷害性を増加させる、請求項14記載の方法。
18. 対象にIL-15を投与する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
19. 癌の症状を処置または軽減する方法であって、その必要がある対象に請求項1〜11のいずれか一項記載の抗体を含む組成物を投与する段階を含む、方法。
20. 癌が、GITRまたはそのリガンドであるGITR-Lを過剰発現する癌である、請求項19記載の方法。
21. 対象にサイトカインまたは化学療法剤をさらに投与する段階を含む、請求項20記載の方法。
22. サイトカインがIL-15である、請求項21記載の方法。
23. SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43の核酸配列を含む、核酸。
24. SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44のポリペプチドをコードする、核酸。
25. SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
26. 請求項23または24記載の核酸を含む、ベクター。
27. 請求項26記載のベクターを含む、細胞。

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