CN111732658B - 一组gitr单克隆抗体及其医药用途 - Google Patents

一组gitr单克隆抗体及其医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域；具体涉及一组抗GITR的单克隆抗体及其医药用途。本发明通过杂交瘤技术获得了一组在激活免疫作用方面有优异效果的抗GITR单克隆抗体，并成功地对其进行了人源化改造。所述抗体在制备用于激活免疫反应，从而显著增强机体免疫力的相关药物，尤其是治疗癌症相关药物方面具有广阔的应用前景。

Description

一组GITR单克隆抗体及其医药用途
技术领域
本发明属于肿瘤及免疫学药物领域，具体地，本发明涉及一组抗GITR的单克隆抗体及其医药用途。
技术背景
GITR是糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白，也称为TNFRSF18或CD357；它是一种I型跨膜蛋白，在Treg细胞上有高水平表达，而在初始和记忆T细胞上有低水平的表达[Shimizu等，(2002)，Nat.Immunol.3：135-42；Nocentini等，(2009)，Adv.Exp.Med.Biol.647：156-73；McHughet等，(2002)，Immunity 16：311-23；Nocentini等，(2005)，Eur J Immunol 35：1016–1022]。激活后，初始T细胞和TregT细胞迅速上调GITR的表达(Shimizu等，(2002),Nat.Immunol.3：135-42；Krausz等，(2007,Scientific World Journal 7：533-66)。在活化的先天性免疫细胞(例如天然杀伤细胞，巨噬细胞和树突细胞(DC)上也有从低到中等水平的GITR表达[Clouthier等，(2014),Growth Factor Rev.25：91-106]。GITR的配体(GITRL)是属于TNF超家族的II型跨膜蛋白，它在包括B细胞，巨噬细胞和树突状细胞(DC)在内的内皮细胞以及活化的抗原呈递细胞(APC)的细胞表面上观察到一定量的表达[Yu等，(2003),Biochem.Biophys.Res.Commun.310：433-438；Toneet等，(2003),Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：15059-15064]。
通过GITRL或GITR激动剂抗体与GITR的相互作用，GITR可被刺激从而增强TCR诱导的T细胞增殖和细胞因子产生的作用[Ronchetti等，(2004)，Eur.J.Immunol.34：613-622；Tone等,(2003)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：15059-15064；Stephens等，(2004)，J.Immunol.173：5008-5020]，以及降低效应T细胞对Treg细胞介导的免疫抑制作用的敏感性[Ronchetti等，(2007)，Eur.J.Immunol.37：1165-1169；Stephens等，(2004),J.Immunol.173：5008-5020]。GITR的激活可募集TNFR相关联的因子2(TRAF 2)和5(TRAF5)，并诱导激活转录因子NF-κB和MAP激酶诱导的信号传导通路[Snellet等，(2011)，Immunol.Rev.244：197-217；Snell等，(2010),J.Immunol.185：7223-34]，以及诱导抗凋亡的Bcl-XL蛋白的转录，从而减少由细胞激活作用所导致的T细胞的死亡[Ronchetti等人，(2004)，Eur.J.Immunol.34：613-622；Esparza等，(2006)，J.Biol.Chem.281：8555-64]。GITR的激活还可进一步导致依赖于NFkB的TRAF6活化以及IL-9的产生，从而增强DC细胞的功能以及激活T淋巴细胞的细胞毒性反应[Kim等，(2015)，Nat.Med.21：1010-7]。GITR信号传导也可促进FoxP3的降解[Cohenet等，(2010),PLoS ONE 5：10436；Schaer等，(2013),Cancer Immunology Research 1：320-331]。以及c-Jun N末端激酶(JNK)的磷酸化[Joetham等，(2012)，J Biol.Chem.287：17100-17108]；从而，进一步抑制Treg细胞对免疫的抑制功能。另外，也有报道显示抗GITR抗体可逆转Treg细胞对B细胞介导的抗体产生作用的抑制效应[Cava等，(2004)，J.Immunol.173：3542-3548]。
临床前研究表明，GITR信号传导通路的激活可以显著增强肿瘤的消除作用。其效果取决于免疫效应细胞的激活[Ramirez等，(2006),J Immunol 176：6434-6442；Boczkowski等，(2009),Cancer Gene Ther.16：900-911；Mitsui等，(2010)，Clin.CancerRes.16：2781-91],也取决于对Treg细胞免疫抑制活性的去除或压制[Cohen等，(2010)，PLoS ONE 5:e10436；Coe等，(2010),Cancer Immunol.Immunother.59：1367-77；Xiao等，(2015),Nat.Commun.6：8266]。GITR激活型抗体被单独使用时，可减少Treg细胞进入肿瘤组织,并使肿瘤内Treg细胞失去foxp3的表达；从而局部性地消除肿瘤内Treg细胞的免疫抑制作用。最终，在肿瘤微环境中，Teff/Treg细胞比率得到提高，并增强了Teff细胞的活性和功能(Cohen等，(2010)，PLoS ONE 5：e10436)。在卵巢癌模型中，抗GITR和抗PD-1抗体的联合疗法可整体提高病人的存活率；在治疗90天后，无肿瘤的小鼠达到20％。分析小鼠肿瘤内进入的白细胞(TILs)的结果，发现CD4+和CD8+效应记忆T细胞的数目得到显着的增加，同时，Treg免疫调控细胞的数目显著的减少[Lu等，(2014)，J.Transl.Med.12：36-47]。虽然单药治疗的效果对于该GITR抗体来说不是很显著，它和抗CTLA4抗体的联合用药在MethA和CT26的肿瘤模型中出现了显著增强的协同抗肿瘤作用[Ko等，(2005),J.Exp.Med.202：885-91；Mitsui等，(2010),Clin.Cancer Res.16：2781-91]。
发明内容
在此基础上，本发明通过杂交瘤技术获得了一组具有激活GITR和免疫细胞活性的，而且可以阻断GITR－L与GITR相互作用的效果优异的抗GITR单克隆抗体；并成功的对相关抗体进行了人源化改造。所述抗体在制备用于刺激和增强免疫反应的药物以及治疗癌症相关药物方面有显著的应用前景。
本发明提供了一组抗GITR单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链的CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2,10,18,26,34,42,50,58,66,74,82,90,98和106中的一种；所述重链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3,11,19,27,35,43,51,59,67,75,83,91,99和107中的一种；所述重链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4,12,20,28,36,44,52,60,68,76,84,92,100和108中的一种；所述轻链的CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：6,14,22,30,38,46,54,62,70,78,86,94,102和110中的一种；所述轻链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：7,15,23,31,39,47,55,63,71,79,87,95,103和111中的一种；所述轻链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：8,16,24,32,40,48,56,64,72,80,88,96,104和112中的一种；其中所述抗原结合片段的重链和轻链包含分别跨越所述抗体的重链和轻链的CDR1到CDR3的氨基酸序列。
进一步的，本发明公开了上述的一组GITR单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1,9,17,25,33,41,49,57,65,73,81,89,97和105中的一种；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：5,13,21,29,37,45,53,61,69,77,85,93,101和109中的一种。
进一步的，本发明公开了对上述抗GITR单克隆抗体或其抗原结合片段的重链和轻链进行人源化改造，所述经过人源化改造的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：113,115,117和119中的一种；所述经过人源化改造的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：114,116,118和120中的一种。
进一步的，本发明公开了上述经过人源化改造的一组抗GITR单克隆抗体或其抗原结合片段，所述人源化改造的重链的全长氨基酸选自SEQ ID NO：121,123，125，127，128，129和130中的一种；所述人源化改造的轻链的全长氨基酸选自SEQ ID NO：122,124，126和131中的一种。
进一步的，本发明相应公开了编码上述GITR单克隆抗体或其抗原结合片段的的核苷酸序列。
进一步的，本发明公开了上述抗GITR片段在制备如下药物中的用途：激活T淋巴细胞的药物、阻断GITR-L与GITR结合的药物、或者提高T淋巴细胞中IL-2和IFN-γ表达的药物。
进一步的，本发明公开了一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其中，所述单克隆抗体为权利要求1-4任一项所述的GITR单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、细胞因子受体片段、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种。
进一步的，本发明公开了上述单克隆抗体偶联物在制备如下药物中的用途：激活T淋巴细胞的药物、阻断GITR-L与GITR结合的药物、或者提高T淋巴细胞中IL-2和IFN-γ表达的药物。
进一步的，本发明公开了上述单克隆抗体偶联物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明的进步性表现为：本发明采用哺乳动物细胞表达系统制备重组GITR作为抗原免疫小鼠，将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。通过对大量杂交瘤细胞的多次克隆及筛选后，得到一些单克隆杂交瘤细胞株。这些杂交瘤细胞株能够产生和GITR特异性高亲和力结合的单克隆抗体，能促进混合淋巴细胞反应中IL-2，INF-γ的分泌，以及能够有效阻断GITR－L与GITR的结合，并且通过RT-PCR克隆编码抗体轻链和重链可变区的基因，采用互补决定簇嫁接方法构建人源化抗体。体外功能试验表明，这些人源化的GITR抗体能特异性高亲和力结合GITR蛋白，能显著促进T细胞分泌细胞因子IL-2和INF-γ，并且能阻断GITR－L与GITR的结合。以上实验结果表明本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包含本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段的单克隆抗体偶联物在制备激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞表达IL-2和INF-γ的药物、阻断GITR－L与GITR结合的药物、以及在预防和治疗或者辅助治疗肿瘤的药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为用ELISA方法检测人源化抗GITR抗体与GITR-mFc蛋白结合的EC50；
图2显示了人源化GITR抗体与细胞膜上GITR相结合的FACS测试结果；
图3显示了人源化GITR抗体对GITR-L与Jurkat-GITR细胞的结合的阻断作用；
图4显示了基于293T-GITR-NFkb-luc细胞报告基因测定法的人源化抗GITR抗体的GITR激活活性；
图5是显示了人源化GITR抗体在没有交联的情况下活化Jurkat-GITR细胞使其释放细胞因子IL2的结果；
图6表明了人源化GITR抗体在有交联的情况下活化Jurkat-GITR细胞使其释放细胞因子IL2的结果；
图7显示了人源化GITR抗体对CD4 T细胞产生细胞因子IL2的影响；
图8展现的是人源化GITR抗体对CD4 T细胞产生细胞因子IFN-γ的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；本发明所涉及的抗体的氨基酸见表1-3。
表1 GITR抗体轻链CDR序列
Figure BDA0002557541680000051
Figure BDA0002557541680000061
表2 GITR抗体重链CDR序列：
Figure BDA0002557541680000062
Figure BDA0002557541680000071
Figure BDA0002557541680000081
表3 抗体的轻链和重链可变区序列以及完整抗体序列
Figure BDA0002557541680000082
Figure BDA0002557541680000091
Figure BDA0002557541680000101
Figure BDA0002557541680000111
Figure BDA0002557541680000121
Figure BDA0002557541680000131
实施例1
抗GITR杂交瘤抗体的产生。
用东大生物表达纯化的人源GITR(ECD)-mFc(Kim et al.,2007,Oncol Rep.18:1189).融合蛋白作为抗原，与等体积完全弗氏佐剂(Sigma,Cat No:F5581)充分乳化后，经皮下免疫6-8周龄Balb/c小鼠(购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司)，抗原免疫量为50μg/只；随后每隔2周，用相同剂量的抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma,Cat No:F5506)充分乳化后，经皮下免疫小鼠三次。免疫三次后测定小鼠血清效价，融合前3天经腹腔进行加强免疫。以PEG Hybri-Max(Sigma,Cat No:7181)作为融合剂，将小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞按照4:1的比例混合。将融合后的细胞加入到96孔板中(1×105细胞/孔)，每孔含有0.1mL 1X HAT培养基(Invitrogen,Cat No:21060-017)。在第3天加入0.1mL HT(Invitrogen,Cat No:11067-030)培养基，在第7天吸掉96孔板中的培养基，补加0.2mL新鲜的HT培养基。在第9天，收取上清液，用于下一步的ELISA和FACS检测。
实施例2
基于ELISA、FACS和报告基因测试的多克隆杂交瘤筛选分析。
这些测试的目的是筛选出能与GITR结合并能阻断GITR－L与GITR的相互作用以及能显著激活GITR分子活性的多克隆杂交瘤，选择其中具高结合力和高刺激活性的多克隆杂交瘤进行亚克隆，从而得到所需的单克隆杂交瘤抗体。
在将具高ELISA滴度的免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合以及培养7天后，对杂交瘤细胞首先进行ELISA和FACS测定以发现和筛选能与GITR结合的阳性杂交瘤，然后初步使用293T荧光素酶报告基因测试筛选具有功能性应答反应的多克隆杂交瘤。此项工作总共鉴定出了四十几个与GITR结合较强的多克隆杂交瘤抗体，经报告基因测试后，选择其中结合力和刺激活性显著的多克隆杂交瘤进行下一步的亚克隆筛选。与GITR结合较强的杂交瘤细胞被冷冻保存在液氮中。
关于ELISA检测：用GITR-ECD-hFc包被96孔ELISA板(Corning，Cat No:9018)，置4度过夜，用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次后，加入封闭缓冲液(PBS+1％BSA(Sigma,Cat No:V90093)孵育1小时；洗涤96孔板3次；加入杂交瘤上清孵育1小时，洗涤3次；每孔加入100μL 1:10000倍稀释的羊抗鼠IgG二抗(Thermo,Cat No:31432)，室温孵育1小时后洗涤3次；每孔加入100μL TMB(北京百奥赛博，Cat No:ES-002)显色3分钟，再加入100μL/孔的终止液(2N H2SO4)终止反应，用Tecan Spark酶标仪测定各样品的OD450×信号。
关于抗体结合力的FACS分析：取50μL在上述ELISA检测中呈阳性的杂交瘤上清与50μL 293T-GITR细胞混合(1×105细胞/孔)加入到U形底96孔板中孵育1小时，用FACS缓冲液(PBS+3％FCS)离心洗涤2次后加入1:400倍稀释的PE标记羊抗鼠二抗(Biolegend，CatNo:405307)，孵育30分钟，经FACS缓冲液洗涤后，用BD C6流式细胞仪检测293T-GITR细胞的PE信号。
关于抗体阻断作用的FACS分析：使用BD C6进行FACS分析以确定杂交瘤抗体对经过生物素标记的人源GITR配体结合到Jurkat-hGITR细胞上的阻断作用。将Jurkat-hGITR细胞悬浮在FACS缓冲液(含3％FBS的PBS)中。将稀释的杂交瘤抗体添加到细胞悬液中，并在4℃下于96孔板中孵育1小时。将生物素标记的人GITR配体蛋白添加到96孔板的孔中，并在4℃下孵育1小时。将孵育后的96孔板洗涤3次，并加入小鼠抗生物素PE抗体(Biolgend，目录号409004)，并在4℃下孵育0.5小时。将96孔板中的细胞洗涤3次，最后用BD C6进行分析。
关于基于Jurkat-GITR-NF-κB细胞的报告基因测试加以确认杂交瘤抗GITR抗体在免疫激活方面的作用的分析：通过对抗GITR杂交瘤上清液，用Jurkat-GITR-NF-κB细胞系进行报告基因的FACS分析。每个反应使用25000 Jurkat-GITR-NF-κB细胞，将这些细胞加入到96孔培养板的每个孔中，然后在每个孔中再加入50μL杂交瘤上清液，并在37℃下孵育4小时。用50μLBright Glo试剂(Promega，目录号：E2620)裂解细胞，并使用Tecan Spark在发光条件下读取信号。
实施例3
多克隆杂交瘤细胞的亚克隆，GITR单克隆杂交瘤细胞的扩增培养与抗体纯化以及单克隆杂交瘤抗体的DNA序列分析。
亚克隆的目的是为了建立单克隆杂交瘤细胞以获得单克隆抗体克隆。我们的亚克隆方法是基于有限稀释的程序，在96孔板中获得产生单个孔中张单个克隆的杂交瘤细胞。进行多轮(3轮)的亚克隆后，确保所得到的单克隆没有其它的细胞成分。对于每一轮亚克隆，均通过ELISA、FACS以及报告基因激活活性的检测。三轮亚克隆后，对于保持较高GITR结合力宇刺激活性的单克隆细胞，部分用于冻存，另一部分用于细胞扩增培养以获取足够量的单克隆抗体进行纯化以及进一步的测试。
对总共14种抗GITR单克隆杂交瘤细胞进行了培养及抗体纯化，包括4E1、8H4、4E4、3F5、4C1、7D7、7E11、10E11、3G12、4B11、5F1、5F6，13G12和9B3。杂交瘤细胞是在含有10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，2％L-谷氨酰胺和1％调节NaHCO3溶液的Dulbecco's ModifiedEagle's培养基(GIBCO；Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中培养。然后将所选择的杂交瘤细胞适应于无血清培养基中，并使用Protein-G柱(GE Healthcare)从上清液中纯化抗体。用PBS洗涤后，用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱结合的抗体，然后用2.0M Tris中和pH。Ultra-15离心浓缩器(Amicon)用于缓冲液交换和抗体浓缩。
实施例4
对纯化的4E1、8H4、4E4、3F5、4C1、7D7、7E11、10E11、3G12、4B11、5F1、5F6、13G12和9B3的杂交瘤抗hGITR单克隆抗体进行了进一步的GITR结合力、GITR配体阻断作用，基于报告基因的GITR激活活性，以及与猴源GITR的交叉结合特性的测试分析，实验涉及ELISA、FACS以及基于使用Jurkat-GITR-NF-κB细胞的报告基因激活分析。
基于ELISA和FACS方法的测试分析；所用方法与上述实施例2中所述的方法相似，不同的是这里的测试使用了测定浓度的纯化抗体，运用系列稀释的抗体浓度与相应的结果，可以计算出EC 50和IC50值。表4-7显示了14种抗体的测试结果。另外，对与猴源GITR交叉结合特性的分析表明，所选的14种抗体与猴源GITR有交叉结合反应。
表4.杂交瘤抗GITR抗体基于ELISA结合力的EC50
ng/ml 4E1 8H4 4E4 3F5 4C1 7D7 7E11 10E11 3G12 4B11 5F1 5F6 13G12 9B3
EC50 0.067 1.338 1.705 2.314 1.932 1.037 1.144 4.733 1.628 0.883 2.039 1.259 0.277 0.523
表5.杂交瘤抗GITR抗体基于FACS结合力的EC50
ng/ml 4E1 8H4 4E4 3F5 4C1 7D7 7E11 10E11 3G12 4B11 5F1 5F6 13G12 9B3
EC50 0.416 20.41 19.92 6.026 8.3 6.387 7.844 9.173 33.06 15.67 51.74 29.35 77.31 1.923
表6.杂交瘤抗GITR抗体基于FACS分析对GITR-L与GITR结合的阻断作用IC50
ng/ml 4E1 8H4 4E4 3F5 4C1 7D7 7E11 10E11 3G12 4B11 5F1 5F6 13G12 9B3
EC50 12.91 457.6 112.7 906.2 97.29 102.3 70.82 89.77 322.0 318.5 1.513 118.2 4002 41.35
表7.杂交瘤抗GITR抗体在Jurkat-GITR-NF-κB细胞报告基因测试分析中的刺激活性
Activity 4E1 8H4 4E4 3F5 4C1 7D7 7E11 10E11 3G12 4B11 5F1 5F6 13G12 9B3
Luc_signal ++++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++
表中不同的+数代表活性的强弱(更多的+表示更强的活性)
实施例5
杂交瘤GITR抗体在激活Jurkat细胞IL-2细胞因子释放方面的活性测试。
为了确定杂交瘤抗GITR抗体的免疫激活活性，Jurkat-GITR细胞的IL2细胞因子释放被用作GITR信号传导通路活化的的评价指标之一。在补充有10％FBS的RPMI 1640中进行Jurkat-GITR细胞培养。在培养前一天，将96孔板在室温下用山羊抗人IgG(Jackson，目录号：109-005-008)和山羊抗小鼠IgG(Jackson，目录号：115-006-071)在常温下包被过夜。洗涤板孔后，添加200μL封闭缓冲液，在37℃下封闭孵育1小时。将板用PBS洗涤3次后，在37℃下将40ng/mL OKT3(ebioscience，目录号：16-0037-85)加入孔中孵育1小时。再用PBS洗涤板后，在有或没有稀释GITR抗体的情况下，将100μl Jurkat-GITR细胞添加到96孔板上的每个孔中(每孔1x105个细胞)。在37℃下孵育48或72小时后，将96孔板离心并收集上清液以测量IL-2(R&D Systems，目录号DY202)。结果示于表8。
表8.基于Jurkat-GITR细胞IL-2释放测定的杂交瘤抗GITR抗体对免疫细胞的激活活性
Activity 4E1 8H4 4E4 3F5 4C1 7D7 7E11 10E11 3G12 4B11 5F1 5F6 13G12 9B3
IL2 ++ +++ ++++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ ++ + +++
表中不同的+数代表活性的强弱(更多的+表示更强的活性)
实施例6
测试杂交瘤抗GITR抗体对CD4 T细胞激活及产生细胞因子的影响。
为了进一步评估杂交瘤GITR抗体在激活GITR信号通路中的活性，本研究用原代淋巴效应细胞测试了抗体对免疫细胞释放IL2以及IFNγ细胞因子的促进作用。使用CD4 T细胞的阴性选择提纯试剂盒以及补充有10％FBS的RPMI 1640培养液，在人源PBMC的基础上，进一步纯化得到人的CD4 T细胞。在提纯T细胞的前一天，将96孔板在室温下用山羊抗人IgG(Jackson，目录号：109-005-008)和山羊抗小鼠IgG(Jackson，目录号：115-006-071)在常温下包被过夜。洗涤板孔后，添加200μL封闭缓冲液，在37℃下封闭孵育1小时。将板用PBS洗涤3次后，在37℃下将40ng/mL OKT3(Ebioscience，目录号：16-0037-85)加入孔中孵育1小时。用PBS洗涤板后，在存在或不存在稀释的GITR抗体的情况下，将100μl CD4 T细胞添加到96孔板上的每个孔中(每孔1x105个细胞)。在37℃下孵育48或72小时后，将96孔板离心，并收集上清液，然后使用ELISA试剂盒(R&D Systems，Cat。Cat)测量IL-2(R&D Systems，目录号：DY202)和IFN-γ的产生编号：DY285)。结果显示于表9。
表9：基于检测原代CD4 T细胞IL-2和IFNg释放的杂交瘤抗GITR抗体对免疫细胞的激活活性。
Activity 4E1 8H4 4E4 3F5 4C1 7D7 7E11 10E11 3G12 4B11 5F1 5F6 13G12 9B3
IL2 +++ NA +++ NA ++ ++++ ++ +++ ++ ++++ ++ ++ NA ++++
IFN-g +++ NA ++++ NA +++/- +++++ +++ +++ +++ ++++ +++ ++++/- NA +++
表中不同的+数代表活性的强弱(更多的+表示更强的活性)
实施例7
GITR杂交瘤单克隆抗体cDNA克隆及序列分析。
对14种抗GITR单克隆杂交瘤抗体，4E1、8H4、4E4、3F5、4C1、7D7、7E11、10E11、3G12、4B11、5F1、5F6，13G12和9B3，进行了DNA序列检测。其相应的氨基酸序列分析结果被列于表1、表2和表3中。
GITR抗体可变区基因的克隆分析包括以下步骤：用TRIzon(Cwbiotech,Cat No:CW0580)裂解GITR单克隆杂交瘤细胞株，提取杂交瘤细胞的总RNA。用HiFi Script cDNA合成试剂盒(Cwbiotech,Cat No:CW2569)将杂交瘤细胞的RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，用简并引物通过PCR方法(Kettleborough et al.(1993)Eur.J Immunology 23:206-211；Strebe et al.(2010)Antibody Engineering 1:3-14)扩增抗体的重链和轻链的可变区基因。反应在S1000TM热循环仪(Bio-Rad，CAT#：184-2000)中以30个循环进行：94℃，1.5分钟变性；50℃，退火1分钟；在72℃和1分钟下进行合成。在第30个循环结束时，将反应混合物在72℃下再温育7分钟加以延伸。
将PCR混合物在含有0.5μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖/Tris-硼酸盐凝胶中进行电泳。从凝胶上切出具有预期大小的DNA片段(重链和轻链约400bp)并纯化。将3μl纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体(Takara，CAT#：D101A)中，转化DH5α感受态细胞，涂板并置37℃过夜培养。从培养板上挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，测定抗体的基因序列。根据抗体的基因序列，分析其互补决定簇(CDR)和骨架区。
抗体的重链和轻链的CDR区氨基酸序列见表1和表2；抗体的重链和轻链的可变区全长氨基酸序列见表3。从相应的杂交瘤克隆中扩增的是14种抗体的可变区序列(见表)：4E1、8H4、4E4、3F5、4C1、7D7、7E11、10E11、3G12、4B11、5F1、5F6、13G12和9B3，具有相应的轻链可变序列SEQ ID NO：5,13,21,29,37,45,53,61,69,77,85,93,101和109；以及相应的重链可变序列-SEQ ID NO：SEQ ID NO：1,9,17,25,33,41,49,57,65,73,81,89,97和105。这些抗体表现出某些所需的功能，例如刺激GITR和增加T细胞活化和细胞因子释放。
实施例8
GITR单克隆杂交瘤抗体的人源化。
对14种抗GITR单克隆杂交瘤抗体，4E1、8H4、4E4、3F5、4C1、7D7、7E11、10E11、3G12、4B11、5F1、5F6，13G12和9B3进行综合(包括GITR结合力、GITR配体的阻断作用、对GITR和免疫细胞的激活活性、抗体的DNA序列等)的分析和比较后，我们选择了其中的4个，包括10E11、4E4、4B11和3F5，作了进一步的GITR抗体人源化改造。
GITR抗体的人源化设计采用了互补决定区嫁接法。首先，在IMGT数据库中分别搜寻与鼠源10E11、4E4、4B11和3F5抗体的轻、重链可变区同源性最高的人胚系抗体(germlineantibody)序列。10E11抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV3-15*01，重链可变区人源化选取IGHV5-10-1*01。4E4抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV2-28*01，重链可变区人源化选取IGHV1-2*06。4B11抗体轻链人源化选取IGKV3-11*01，重链人源化选取IGHV1-3*01。3F5抗体轻链人源化选取IGKV2-24*01，重链人源化选取IGHV1-2*02。保留鼠源抗体的CDR区，将鼠源抗体的框架区(framework)序列用人胚系抗体的框架区序列置换。其次，建立鼠源抗体的结构模型，逐个对比人源抗体与相应鼠源抗体结构模型中的每个不同氨基酸位点，如果在框架区的某个位点采用人的氨基酸序列没有导致CDR区域空间结构的破坏或改变，则该位点使用人的氨基酸序列，否则在该位点使用对应的鼠源序列(即回复突变为鼠源序列)。根据结构模拟，将10E11、4E4、4B11和3F5人源化抗体框架区的部分氨基酸回复突变为鼠源序列。
这样，上述模板中人抗体的CDR氨基酸序列被小鼠4E4、10E11、4B11和3F5抗体的CDR的氨基酸序列取代。另外，将上述模板人抗体VH和VL的框架移植有小鼠4E4、10E11、4B11和3F5抗体的VH和VL的必需氨基酸序列，以得到功能性人源化抗体。另外，关于于4E4、10E11、4B11和3F5的VH和VL，上述模板人抗体的框架氨基酸的几个位点被反突变为小鼠4E4、10E11、4B11和3F5抗体中的相应氨基酸序列。
10E11抗体人源化重链的第24位Gly回复突变为Ala，第28位Ser回复突变为Pro，第29位Phe回复突变为Val，第30位Thr回复突变为Ser，第48位Met回复突变为Ile，第69位Ile回复突变为Phe，第73位Lys回复突变为Ile，第93位Ala回复突变为Ser。10E11抗体人源化轻链的第49位Tyr回复突变为Ser。4E4抗体人源化重链的第48位Met回复突变为Ile，第67位Val回复突变为Ala，第69位Met回复突变为Leu，第71位Arg回复突变为Val，第73位Thr回复突变为Lys。4E4抗体人源化轻链的第2位Ile回复突变为Val。4B11抗体人源化重链的第27位Tyr回复突变为Phe，第48位Met回复突变为Ile，第67位Val回复突变为Ala，第69位Ile回复突变为Leu，第71位Arg回复突变为Ser，第73位Thr回复突变为Lys。4B11抗体人源化轻链的第49位Tyr回复突变为Lys。3F5抗体人源化重链的第48位Met回复突变为Ile，第67位Val回复突变为Ala，第69位Met回复突变为Leu，第71位Arg回复突变为Val，第73位Thr回复突变为Lys。3F5抗体人源化轻链的第46位Leu回复突变为Arg。
10E11人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：119和SEQID NO：129。4E4人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：113和SEQID NO：114。4B11人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116。3F5人源化抗体重链和轻链的可变区氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118。将10E11、4E4、4B11和3F5人源化抗体构建为IgG1亚型；产生了人源化的4E4、10E11和4B11的人源IgG1(hIgG1)版本，人源化10E11的hIgG1(3A)版本以及人源化10E11和3F5抗体的hIgG4版本：h10E11-hIgG1，h4E4-hIgG1，h4B11-hIgG1，h10E11-hIgG1(3A)，h10E11-hIgG4以及h3F5-hIgG4。氨基酸序列包括h4E4-IgG1[SEQ ID NOs：121(全长重链)和122(全长轻链)]，h10E11-IgG1[(SEQ ID NOs：127及128(全长重链)和131(全长轻链))、h10E11-IgG1(3A)[(SEQ ID NOs：129(全长重链)和131(全长轻链))，h10E11-IgG4[(SEQ ID NOs：130(全长重链)和131(全长轻链))，h4B11-IgG1[(SEQ ID NOs：123(全长重链)和124(全长轻链))和h3F5-IgG1[(SEQ ID NOs：125(全长重链)和126(全长轻链))，如上列表3所示。
人源化4E4、10E11、4B11和3F5抗体的构建和表达：合成编码人源化抗体轻链和重链的DNA，并将其克隆到表达载体pcDNA3.1(Invitrogen，CAT：#V-790)。用100μg每种人源化重链和轻链表达质粒转染Freestyle 293细胞(200mL，106/mL)，并培养6天。然后用Protein-G柱(GE Healthcare)纯化上清液中的人源化抗体。
实施例9
使用ELISA和FACS确定人源化抗体与GITR的结合，使用FACS测定GITR配体被阻断的活性，以及基于Jurkat-GITR-NF-κB细胞报告基因测试分析人源化抗体的免疫活化反应。
人源化抗体的产生和纯化后，通过基于ELISA和FACS的结合分析和Jurkat-GITR细胞的GITR-L阻断分析，确定抗体的结合和特异性。所使用的方法与以上实例2和4中所述的方法相似。
在基于ELISA的结合测定中，人源化抗体显示出与GITR的显着结合，如附图1所示，用ELISA方法检测人源化抗GITR抗体与GITR-mFc蛋白结合的EC50；人源化的抗GITR抗体包括h10E11(AV)-hIgG1(3A)，h10E11(AV)-hIgG4，h4E4-hIgG1，h4B11-hIgG1和h3F5-hIgG1。图的上部分显示了在一系列人源化抗体或对照hIgG1浓度范围内的光吸度值。如X轴所示，每种抗体的测试浓度分别为20000ng/mL，2000ng/mL，200ng/mL，20ng/mL，2ng/mL，0.2ng/mL，0.02ng/mL，0.002ng/mL、0.0002ng/mL和0.00002ng/mL。在图底部的表显示了每种测试抗体所计算的EC50。如图所示，所有人源化抗体显示出与平板包被的GITR-mFc有显著的结合作用，h4B11-hIgG1和h10E11(AV)-hIgG1(3A)具更强的结合力。
图2显示了Jurkat-GITR细胞上基于FACS的与GITR的结合。底部面板提供了每种人源化抗体的EC50。4B11-hIgG1和10E11(AV)-hIgG1是基于FACS分析的主要结合物。人源化GITR抗体包括h10E11(AV)-hIgG1，h10E11(AV)-hIgG1(3A)，h10E11(AV)-hIgG4，h4E4-hIgG1，h4B11-hIgG1，h3F5-hIgG1和阴性对照(人源IgG1)。图的上部分显示了在一系列人源化抗体或对照hIgG1浓度范围内的平均荧光指数值。底部显示了每种测试抗体的计算EC50。结果表明，所有人源化抗体均显示与Jurkat-GITR细胞的显着结合。同时，人源化的h4E4和h10E11(AV)抗体是最主要的粘合剂。如X轴所示，每种抗体的测试浓度分别为20000ng/mL，2000ng/mL，200ng/mL，20ng/mL，2ng/mL，0.2ng/mL，0.02ng/mL和0.002ng/mL。
图3显示了人源化抗体在Jurkat-GITR细胞上GITR-L与GITR的结合阻断。使用的GITR-L浓度为0.25ug/ml)；测试的GITR抗体包括h10E11(AV)-hIgG1，h10E11(AV)-hIgG1(3A)，h10E11(AV)-hIgG4，h4E4-hIgG1，h4B11-hIgG1，h3F5-hIgG1和阴性对照(人源IgG1)。如X轴所示，每种抗体的测试浓度分别为20000ng/mL，4000ng/mL，800ng/mL，160ng/mL，32ng/mL，6.4ng/mL，1.28ng/mL和0.256ng/mL。结果表明，所有人源化GITR抗体对GITR-L与Jurkat-GITR细胞的结合均显示出一定的阻断活性。人源化h10E11(AV)和h3F5抗体具更好的阻断作用。
图4显示了基于293T-GITR-NFkb-luc细胞报告基因测定法的人源化抗GITR抗体的GITR激活活性。测试的抗GITR抗体包括h10E11(AV)-hIgG1(3A)，h10E11(AV)-hIgG1，h4E4-hIgG1，h4B11-hIgG1，h3F5-hIgG1和阴性对照(人源IgG1)。每种抗体的测试浓度分别为20000ng/mL，4000ng/mL，800ng/mL，160ng/mL，32ng/mL，6.4ng/mL，1.28ng/mL和0.256ng/mL。结果表明，所有人源化抗体对293T-GITR-NFkb-luc细胞的荧光素酶报道基因表达均具有较强的激活活性。在测试的人源化抗体之间的活性是相似的。
实施例10
用Jurkat-GITR IL-2释放分析对人源化抗GITR抗体的激活测试
为了测试杂交瘤抗GITR抗体的激活活性，首先通过其对Jurkat-GITR细胞中GITR信号通路的刺激作用来评估抗体。将Jurkat-GITR，293T-OKT3、293T-CD32A和293T细胞分别在补充有10％FBS的RPMI 1640中培养。将50μl Jurkat-GITR(每孔1x105细胞)和50μl293T-OKT3(每孔2x104细胞)和50μl 293T-CD32A或293T(每孔2x104细胞)细胞添加到96孔板的单个孔中。是否存在稀释的GITR抗体。在37℃下孵育48或72小时后，将96孔板离心并收集上清液以测量IL-2(R&D Systems，目录号DY202)。
图5显示由于人源化抗-GITR抗体活化Jurkat-GITR细胞而没有交联的情况下IL2释放的结果。Jurkat-GITR细胞受293T－OKT3细胞中OKT3一定程度的刺激。测试的抗GITR抗体包括h10E11(AV)-hIgG1(3A)，h10E11(AV)-hIgG1，h4E4-hIgG1，h4B11-hIgG1，h3F5-hIgG1和阴性对照(人源IgG1)。每种抗体的测试浓度分别为20000ng/mL，4000ng/mL，800ng/mL，160ng/mL，32ng/mL，6.4ng/mL，1.28ng/mL和0.256ng/mL。如我们所见，所有的人源化抗体在无需交联的情况下，可以在一定程度上刺激Jurkat-GITR细胞IL2的释放。
图6显示由于人源化抗GITR抗体在存在交联的情况下激活Jurkat-GITR细胞而导致的IL2释放的结果。交联因子为在293T－CD32a细胞中表达的CD32a。Jurkat-GITR细胞受293T－OKT3细胞中OKT3一定程度的刺激。测试的抗GITR抗体包括h10E11(AV)-hIgG1(3A)，h10E11(AV)-hIgG1，h4E4-hIgG1，h4B11-hIgG1，h3F5-hIgG1和阴性对照(人源IgG1)。每种抗体的测试浓度分别为20000ng/mL，4000ng/mL，800ng/mL，160ng/mL，32ng/mL，6.4ng/mL，1.28ng/mL和0.256ng/mL。如我们所见，通过交联，所有人源化抗体对Jurkat-GITR细胞(尤其是h4E4-hIgG1)的IL2释放均表现出更强的刺激活性。
实施例11
人源化抗GITR抗体对CD4+T细胞产生细胞因子的影响
GITR杂交瘤抗体的活性通过其刺激淋巴细胞效应细胞中的GITR信号传导途径的作用来评估。使用补充了10％FBS的RPMI 1640中的CD4+阴性选择试剂盒，从PBMC中纯化人CD4+T细胞。在前一天，将96孔板在室温下用山羊抗人IgG(Jackson，目录号：109-005-008)和山羊抗小鼠IgG(Jackson，目录号：115-006-071)包被过夜。温度。洗涤孔并通过添加200μL封闭缓冲液封闭并在37℃温育1小时。将板用PBS洗涤3次后，在37℃下将40ng/mL OKT3(Ebioscience，目录号：16-0037-85)加入孔中孵育1小时。用PBS洗涤板后，在存在或不存在稀释的GITR抗体的情况下，将100μl CD4+T细胞添加到96孔板上的每个孔中(每孔1x105个细胞)。在37℃下温育48或72小时后，将96孔板离心并收集上清液，以使用ELISA试剂盒(R&DSystems，Cat。Cat)测量IL-2(R&D Systems，目录号：DY202)和IFN-γ的产生编号：DY285)。
图7显示了人源化抗GITR抗体对CD4+T细胞产生IL2的影响。测试的抗GITR抗体包括h10E11(AV)-hIgG1(3A)，h10E11(AV)-hIgG1，h4E4-hIgG1，h4B11-hIgG1，h3F5-hIgG1和阴性对照(人IgG1)。每种抗体的测试浓度分别为20ng/mL，2ng/mL，0.2ng/mL和0.02ng/mL。如图所示，人源化的10E11、4B11和4E4抗体(特别是h4B11-hIgG1)对原代CD4 T细胞产生细胞因子IL2具有显著的刺激作用；而人源化3F5抗体在此分析中显示的活性相对较低。
图8显示了人源化抗GITR抗体对CD4+T细胞产生的IFN-γ的影响。测试的抗GITR抗体包括h10E11(AV)-hIgG1(3A)，h10E11(AV)-hIgG1，h4E4-hIgG1，h4B11-hIgG1，h3F5-hIgG1和阴性对照(人IgG1)。每种抗体的测试浓度分别为20ng/mL，2ng/mL，0.2ng/mL和0.02ng/mL。如图所示，人源化10E11、4B11和4E4抗体(特别是h4B11-hIgG1)对原代CD4 T细胞产生细胞因子IFN-γ具有显著的刺激作用；而人源化3F5抗体在此分析中显示了较低的活性。结果指定了与图7中IL2产生相似的模式。也就是说，人源化的10E11、4B11和4E4抗体对IL2产生对原代CD4 T细胞的刺激具有显著作用。而人源化3F5抗体则显示相对较低的激活活性。
实施例12：人源化4E4、10E11、4B11和3F5抗GITR抗体的Biacore动力学分析
为了表征人源化抗体的结合特性，通过Biacore3000测量了GITR和抗GITR抗体之间的结合动力学，并以1Hz的数据采集速率进行记录。将多克隆兔抗小鼠IgG(GE，BR-1008-38)用10mM pH 5.0乙酸钠稀释并使用胺偶联试剂盒(GE，BR10050)固定在CM5生物传感器芯片的参比和实验流通池上至约15000RU)。在每个循环的开始，将稀释的测试抗体(1.5μg/mL)注入实验流动池中1分钟以捕获。GITR分析物系列的制备方法是：用流动缓冲液将原液稀释至100nM，然后在同一缓冲液中进行2倍系列稀释至0.78nM。将分析物以30μL/分钟的流速连续注入参考和实验流通池3分钟。然后，使运行缓冲液(含0.05％P20的PBS)以30μL/分钟的流速流过10分钟。在每个循环结束时，通过以10μL/min的流速注入10mM pH1.7甘氨酸-HCl缓冲液3分钟，使生物传感器表面再生。对于每次分析物样品注射(即每个循环)，通过从参考表面减去同时记录的响应，然后从单个参考运行缓冲液样品中减去响应，来对从实验生物传感器表面获得的结合响应进行双重参考。通过使用Biaevaluation 4.0软件将整个滴定系列的双参考传感图拟合到Langmuir模型(1∶1)，可以同时确定缔合和解离速率常数(ka和kd)。解离常数KD由确定的速率常数通过关系式KD＝kd/ka计算得出。如表10所示，人源化抗GITR抗体以高亲和力结合人GITR。特别是人性化的4B11和10E11。
表10.GITR-his multi-cycle kinetics test by SPR
Antibody Ka(1/MS) Kd(1/S) KD(M)
Humanized 10E11 4.24E+05 2.93E-04 6.91E-10
Humanized 4E4 3.25E+05 1.23E-03 3.78E-09
Humanized 4B11 1.73E+06 2.57E-04 1.49E-10
Biacore T200 test；Model：kmetlcs.1∶1 binding；KD＝kd/ka
以上实施例的结果表明本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包含本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段的单克隆抗体偶联物在制备激活GITR信号传导的药物、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞表达IL-2和INF-γ的药物、阻断GITR-L与GITR结合的药物、以及在预防和治疗或者辅助治疗肿瘤的药物方面具有良好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 东大生物技术（苏州）有限公司
<120> 一组GITR单克隆抗体及其医药用途
<130> 2020
<160> 131
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 4E1
<400> 1
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Arg Asn Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Gly His His Asp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4E1
<400> 2
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<223> 4E1
<400> 3
Tyr Ile Arg Asn Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4E1
<400> 4
Ser Gly His His Asp Leu Phe Asp Tyr
1 5
<210> 5
<211> 114
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 4E1
<400> 5
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Phe Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4E1
<400> 6
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4E1
<400> 7
Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4E1
<400> 8
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 8H4
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Asn His Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H4
<400> 10
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H4
<400> 11
Asn Ile Asn Pro Asn His Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H4
<400> 12
Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
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<211> 108
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 8H4
<400> 13
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Phe Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Phe
35 40 45
Asp Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser His Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Phe Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Leu Lys Arg Ala
100 105
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H4
<400> 14
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
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<400> 15
Asp Thr Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 8H4
<400> 16
Gln Gln Trp Ser Ser Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 17
<211> 115
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 4E4
<400> 17
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asp Pro Lys Asn Gly Gly Thr Leu Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4E4
<400> 18
Asp His Tyr Met Asn
1 5
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<212> PRT
<213> 人工
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Asp Ile Asp Pro Lys Asn Gly Gly Thr Leu Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4E4
<400> 20
Arg Glu Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 21
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<212> PRT
<213> 鼠
<223> 4E4
<400> 21
Asp Val Leu Met Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4E4
<400> 22
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工
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Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4E4
<400> 24
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr
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<212> PRT
<213> 鼠
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<400> 25
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ile Asn Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gly Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Phe Ser Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3F5
<400> 26
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3F5
<400> 27
Tyr Ile Arg Asn Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
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<400> 28
Ser Gly His His Asp Leu Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 鼠
<223> 3F5
<400> 29
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Phe Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Leu Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
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<400> 30
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
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<210> 31
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<212> PRT
<213> 人工
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<400> 31
Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
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Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser
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<212> PRT
<213> 鼠
<223> 4C1
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Glu Gly Arg Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4C1
<400> 34
Asp His Tyr Met His
1 5
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4C1
<400> 35
Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ile Asn Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4C1
<400> 36
Gly Phe Ser Gly Leu Ala Tyr
1 5
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<211> 106
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 4C1
<400> 37
Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Val
1 5 10 15
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp
20 25 30
Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ala Ala
35 40 45
Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe
65 70 75 80
Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Pro Pro Trp Thr Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4C1
<400> 38
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4C1
<400> 39
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 4C1
<400> 40
Gln His Phe Trp Gly Pro Pro Trp Thr
1 5
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 7D7
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Asp Tyr Ile Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Tyr Asn Asn Ser Asn Asp Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Gly Thr Phe Tyr Thr Met Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 7D7
<400> 42
Asn Tyr Leu Ile Glu
1 5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 7D7
<400> 43
Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<223> 7D7
<400> 44
Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Arg Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 110
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 7D7
<400> 45
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Arg Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His His Ser Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105 110
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<223> 7D7
<400> 46
Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Phe His
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 7D7
<400> 47
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 7D7
<400> 48
His Gln Tyr His His Ser Pro Arg Thr
1 5
<210> 49
<211> 117
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 7E11
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Glu Gly Arg Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 50
<211> 5
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Asn Tyr Ala Met Val
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<210> 51
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<212> PRT
<213> 人工
<223> 7E11
<400> 51
Tyr Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ser Lys Tyr Asn Gln Ser Phe Arg
1 5 10 15
Asp
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 7E11
<400> 52
Ser Pro Leu Leu Gly Asn Leu Asp Tyr
1 5
<210> 53
<211> 109
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 7E11
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Pro Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 7E11
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Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工
<223> 7E11
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Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 7E11
<400> 56
Gln His Phe Trp Gly Pro Pro Trp Thr
1 5
<210> 57
<211> 118
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E11
<400> 57
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Asn Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Tyr Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Lys Gly Ala Tyr Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10E11
<400> 58
Ser Tyr Trp Met Gln
1 5
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10E11
<400> 59
Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10E11
<400> 60
Phe Glu Gly Arg Gln Phe Ala Tyr
1 5
<210> 61
<211> 109
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E11
<400> 61
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile His Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Arg Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala
100 105
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10E11
<400> 62
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Tyr Leu His
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10E11
<400> 63
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 10E11
<400> 64
Gln Gln Ser Asn Arg Trp Pro Leu Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 鼠
<223> 3G12
<400> 65
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Thr Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Gly Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
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<400> 66
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3G12
<400> 67
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Tyr Asn Asn Ser Asn Asp Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 3G12
<400> 68
Lys Gly Thr Phe Tyr Thr Met Asp His
1 5
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<211> 109
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 3G12
<400> 69
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Pro Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
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<212> PRT
<213> 人工
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<213> 人工
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<400> 71
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<211> 9
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<213> 人工
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<400> 72
Gln His Phe Trp Gly Pro Pro Trp Thr
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<212> PRT
<213> 鼠
<223> 4B11
<400> 73
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
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Val Leu His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Tyr Ile His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Phe His Asp Ser Phe
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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
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<400> 74
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<213> 人工
<223> 4B11
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Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys
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Gly
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<211> 8
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<213> 人工
<223> 4B11
<400> 76
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<211> 113
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 4B11
<400> 77
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20 25 30
Thr Tyr Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
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Ala
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Thr Tyr Ser Tyr Val His
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<213> 人工
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<400> 79
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<213> 人工
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<212> PRT
<213> 鼠
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Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser His
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Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Asn Leu Glu Trp
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Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
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Ala Arg Asp Trp Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
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115
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<213> 人工
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<400> 82
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<213> 人工
<223> 5F1
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Gly
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<213> 人工
<223> 5F1
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1 5
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<212> PRT
<213> 鼠
<223> 5F1
<400> 85
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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<211> 10
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<213> 人工
<223> 5F1
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1 5 10
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<213> 人工
<223> 5F1
<400> 87
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1 5
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<213> 人工
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<212> PRT
<213> 鼠
<223> 5F6
<400> 89
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Arg Tyr
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
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<211> 5
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<213> 人工
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<223> 5F6
<400> 91
Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工
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<400> 92
Phe Tyr Gly Gly Ala Met Asp Ser
1 5
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<211> 113
<212> PRT
<213> 鼠
<223>
<400> 93
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Trp
85 90 95
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100 105 110
Ala
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<223> 5F6
<400> 94
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 5F6
<400> 95
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 5F6
<400> 96
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<212> PRT
<213> 鼠
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<400> 97
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
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Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
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Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工
<223> 13G12
<400> 99
Tyr Ile His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Phe His Asp Ser Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<223> 13G12
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Asn Asp Glu Leu Arg Val Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
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<211> 108
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 13G12
<400> 101
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Gly Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
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Asp Thr Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<223> 13G12
<400> 102
Gly Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
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<213> 人工
<223> 13G12
<400> 103
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 13G12
<400> 104
Gln His Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 105
<211> 118
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 9B3
<400> 105
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Asn Leu Gly Ala
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35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Tyr Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Lys Gly Ala Tyr Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
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115
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<211> 6
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<213> 人工
<223> 9B3
<400> 106
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<211> 16
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<223> 9B3
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Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<223> 9B3
<400> 108
Asp Trp Pro Phe Ala Tyr
1 5
<210> 109
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 9B3
<400> 109
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
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Ser Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile His Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Arg Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<223> 9B3
<400> 110
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Tyr Leu His
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<223> 9B3
<400> 111
Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<223> 9B3
<400> 112
Gln Gln Ser Asn Arg Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 113
<211> 115
<212> PRT
<213> 人源化
<223> 4E4
<400> 113
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
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100 105 110
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115
<210> 114
<211> 112
<212> PRT
<213> 人源化
<223> 4E4
<400> 114
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 115
<211> 119
<212> PRT
<213> 人源化
<223> 4B11
<400> 115
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人源化
<223> 4B11
<400> 116
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Thr Tyr Ser Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Gly Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人源化
<223> 3F5
<400> 117
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ile Asn Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Ser Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人源化
<223> 3F5
<400> 118
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Ile Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人源化
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<400> 119
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Pro Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Tyr Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly His Ala Thr Phe Ser Ala Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Lys Gly Ala Tyr Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asp Pro Lys Asn Gly Gly Thr Leu Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
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Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Lys
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<213> 人源化
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<400> 124
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
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Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
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Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
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<213> 人源化
<223> 3F5
<400> 126
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<400> 127
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
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385 390 395 400
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<213> 人源化
<223> 10E11
<400> 129
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 130
<211> 444
<212> PRT
<213> 人源化
<223> 10E11
<400> 130
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Tyr Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly His Val Thr Phe Ser Ala Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Lys Gly Ala Tyr Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
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275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
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305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
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370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
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<212> PRT
<213> 人源化
<223> 10E11
<400> 131
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Tyr
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Ser Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (6)

1.抗GITR单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：18；所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列选自SEQID NO：19；所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：20；所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：22；所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列选自SEQ IDNO：23；所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：24。
2.根据权利要求1所述的抗GITR单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：17并且所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ IDNO：21；或者，所述人源化后的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：113并且所述人源化后的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：114。
3.根据权利要求2所述的抗GITR单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，人源化后的重链的全长氨基酸序列选自SEQ ID NO：121；人源化后的轻链的全长氨基酸序列选自SEQID NO：122。
4.编码如权利要求1-3任一项所述的抗GITR单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
5.一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其特征在于，所述单克隆抗体为权利要求1-3任一项所述的抗GITR单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、细胞因子受体片段、酶、荧光素和生物素中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的一种单克隆抗体偶联物在制备阻断GITR－L 与 GITR结合的药物中的用途。
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GR01 Patent grant
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CB03 Change of inventor or designer information

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Inventor after: Sun Jie

Inventor after: Zhou Man

Inventor after: Chen Junyong

Inventor after: Sun Jian

Inventor after: District RI Shan

Inventor before: Qiu Junzhuan

Inventor before: Sun Ziyong

Inventor before: Wang Zhensheng

Inventor before: Sun Jie

Inventor before: Zhou Man

Inventor before: Chen Junyong

Inventor before: Sun Jian

Inventor before: District RI Shan