KR101867606B1 - 미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101867606B1
KR101867606B1 KR1020107012426A KR20107012426A KR101867606B1 KR 101867606 B1 KR101867606 B1 KR 101867606B1 KR 1020107012426 A KR1020107012426 A KR 1020107012426A KR 20107012426 A KR20107012426 A KR 20107012426A KR 101867606 B1 KR101867606 B1 KR 101867606B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
polypeptide
antibodies
cells
mice
Prior art date
Application number
KR1020107012426A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100096137A (ko
Inventor
알렉산더 알. 아바스
디미트리 엠. 다닐렌코
프레데릭 제이. 드 사우바게
니코 피. 길라르디
조라 모드루산
웬준 오우양
패트리샤 에이. 발데즈
얀 젱
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20100096137A publication Critical patent/KR20100096137A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101867606B1 publication Critical patent/KR101867606B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/204—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 발명은 숙주 면역반응의 조정에 의한 미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 항-미생물 면역반응을 매개하는 조성물, 및 상기 조성물을 사용하는 미생물 감염의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF MICROBIAL DISORDERS}
본 발명은 일반적으로 숙주 면역반응의 조정에 의한 미생물 질환의 치료에 관한 것이다.
미생물 병원체에 의한 감염은 세계적으로 주요 사망 원인이고, 세계 보건에 심각한 위협을 제기한다 (WHO, The World Health Report (2004)). 예를 들어, 부착 및 소멸형 (attaching and effacing: A/E) 세균 병원체, 예를 들어 장출혈성 에스체리키아 콜라이 (Escherichia coli) (EHEC) 및 장병원성 이. 콜라이 (EPEC)가 특히 개발도상국에서 유아 및 아동 사이에서 설사, 이환율 및 사망률을 일으키는 세균 중의 하나이다 (2). EHEC 균주 중 하나인 이. 콜라이 O157:H7 때문에, 많은 사람들이 병원에 입원하고, 미국에서 작년에 3명이 사망하였다 (MMWR Morb Mortal Wkly Rep 55, 1045 (Sep 29, 2006)). 또한, 산업화된 국가에서 모든 사례의 설사후 용혈성 요독증후군 (HUS)의 90% 이상이 이. 콜라이 O157:H7 감염에 의해 유발되는 것으로 생각된다 (R.L. Siegler, Pediair Clin North Am 42, 1505 (Dec, 1995)). 다른 EPEC 균주, 예를 들어 이. 콜라이 O55:H7도 세계적으로 유아들 사이에서 장 질환을 유발한다 (T.S. Whitlam et al., Infect Imrmm 61, 1619 (May, 1993)). 숙주가 A/E 병원체의 감염을 제어하는 방법에 대한 많은 지식은 마우스에서 천연 병원체인 시트로박터 로덴티움 (Citrobacter rodentium)에 의한 감염의 연구로부터 얻은 것이다 (L. Eckmann, Ann NY Acad Sci 1072, 28 (August 1, 2006)). 인간에서의 EHEC 또는 EHPC의 발병기전과 유사하게, 쥐 결장 상피 세포에 대한 씨. 로덴티움의 밀접한 부착은 부착 및 소멸형 (A/E) 병변으로 불리는 솔 연변 (brush border) 미세융모의 소멸, 및 결장 과다형성을 일으킨다 (D.B. Schauer, S. Falkow, Infect Immun 61, 2486 (Jun, 1993)).
장 상피 및 면역 세포는 모두 A/E 병원체에 대한 숙주 방어에서 중요한 역할을 한다. 장 상피 세포의 치밀한 이음부 (tight junction)가 미생물이 장 내강에 남아있는 것을 방지하는 제1 장벽을 제공한다 (T.T. MacDonald, G. Monteleone, Science 307, 1920 (March 25, 2005)). 추가로, 상피 세포는 위장(GI)관 내의 병원체를 제어하기 위해 항-미생물 펩티드를 분비한다 (A. Takahashi et al., FEBS Lett 508, 484 (Nov 23, 2001)). 씨. 로덴티움 감염 동안 면역 결핍 마우스 균주를 사용하는 연구에서 CD4+ T 세포, B 세포, 및 항-씨. 로덴티움 특이적 항체 반응이 모두 감염을 방지하고 근절시키기 위한 적응 면역의 필수적인 성분임을 확립하였다 (L. Bry, M.B. Brenner, J Immunol 172, 433 (January 1, 2004)). 감염 동안 림프구에 의해 생산된 많은 시토킨은 상피 세포의 선천 면역반응을 향상시킬 수 있다. 그러나, A/E 병원체 감염 동안 이들 시토킨의 특수한 기능은 불명확하다.
IL-10 패밀리 시토킨인 IL-22는 림프구, 특히 Th17 세포에 의해 생산된다 (Y. Zheng et al., Nature 445, 648 (Feb 8, 2007)). Th17 세포는 IL-17을 또한 생산하는 최근에 밝혀진 CD4+ T 헬퍼 (helper) 하위세트에 속한다. IL-17은 세포외 세균 감염의 제어에서 중요한 기능을 갖는다 (K.I. Happel et al., J. Exp. Med. 202, 761 (September 19, 2005)). 그러나, 숙주 방어에서 IL-22의 역할은 여전히 많이 알려지지 않은 상태이다. 종양 괴사 인자 (TNF)-관련 단백질은 숙주 방어로부터 면역 조절과 세포자멸에 이르기까지 다양한 활성을 갖는 큰 패밀리의 단백질로서 당업계에서 인정된다. TNF는 시험관 내에서 몇몇 형질전환된 세포주에 대해 세포독성이고, 생체 내에서 특정 종양의 괴사를 일으키는 혈청-유래 인자로서 처음에 확인되었다. 수퍼패밀리 내의 유사한 인자가 확인되었고 림프독소 ("LT")으로 칭해진다. 1980년대 초기에 TNF와 LT 사이의 관찰된 유사성 때문에, TNF 및 LT를 각각 TNF-α 및 TNF-β로 칭할 것이 제안되었다. 따라서, 학술 문헌에서는 두 명칭을 모두 사용한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "TNF"는 TNF-α를 나타낸다. 후속 연구에서 LTα 및 LTβ로 언급되는 2가지 형태의 림프독소가 밝혀졌다. US 2005-0129614에서는 구조적 및 생물학적 유사성에 기반한 TNF 리간드 수퍼패밀리의 또다른 폴리펩티드 멤버 (TL-5로 지정됨)를 설명하고 있다. TNF 패밀리의 단백질의 멤버는 세포-세포 접촉을 통해 국소적으로 작용하는 막-결합형으로, 또는 분비형 단백질로서 존재한다. TNF-관련 수용체의 패밀리는 이들 단백질과 반응하고, 세포 사멸 또는 세포자멸, 세포 증식, 조직 분화 및 염증유발 (proinflammatory) 반응을 비롯한 다양한 신호전달 경로를 촉발한다. TNF-α 자체는 염증성 질병, 자가면역 질병, 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 악성 종양, 및/또는 신경변성 질병에 관련되고, RA 및 크론 (Crohn) 병과 같은 질병에서 특정 생물학적 요법의 유용한 표적이다.
<발명의 개요>
본 발명은 숙주 면역반응의 조정에 의한 미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 숙주에서 항-미생물 면역반응은 항-미생물 면역반응을 매개하는 하나 이상의 항-미생물 폴리펩티드 (AMP)의 활성을 증가시키거나 감소시킴으로써 향상되거나 억제될 수 있다.
보다 특히, 본 발명은 AMP, 그의 조정인자, 및 미생물 질환의 치료를 위한 상기 조성물의 사용 방법을 제공한다. 상기 미생물 질환은 감염성 질병, 예를 들어, EHEC- 및 EPEC-유발 설사, 염증성 장 질환 (IBD) 및, 보다 특히, 궤양성 대장염 (UC) 및 크론병 (CD)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 AMP는 항-미생물 면역반응을 매개하는 폴리펩티드이고, Reg 수퍼패밀리의 유전자에 의해 코딩되는 LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23 (예를 들어, IL-23 p19 또는 IL-23 p40 포함), 및 Reg 또는 Reg-관련 단백질을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. Reg 수퍼패밀리는 인간, 래트, 및 마우스로부터의 Reg 및 Reg-관련 유전자를 포함하고, 4개의 하위클래스, 즉 타입 I, II, III, 및 IV로 분류된다. 예를 들어, 타입 I은 인간 REG Iα, 인간 REG Iβ, 래트 RegI, 및 마우스 RegI을 포함하고; 타입 II는 마우스 RegII를 포함하고; 타입 III은 인간 REG III, 인간 HIP/PAP (간세포 암종-장-췌장에서 발현되는 유전자/췌장염-연관 단백질을 코딩하는 유전자), 래트 PAP/펩티드23, 래트 RegIII/PAPII, 래트 PAP III, 마우스 RegIIIα, RegIIIβ, RegIIIγ, 마우스 RegIIIδ, 및 햄스터 INGAP (소도 신생-연관 단백질)를 포함한다. 타입 IV는 인간 REG IV를 함유한다. 한 측면에서, REG 단백질은 REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III, REG IV, 및 Reg-관련 서열 (RS)을 포함하고 이로 제한되지 않는 인간 REG 유전자 패밀리의 멤버에 의해 코딩된다.
일부 측면에서, 본 발명의 AMP의 아미노산 서열은 다음 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42, 서열 44, 서열 46, 서열 48, 서열 50, 서열 52, 서열 54, 및 서열 56.
다른 측면에서, 본 발명의 AMP를 코딩하는 핵산 서열은 다음 군 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함한다: 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 47, 서열 49, 서열 51, 서열 53, 및 서열 55.
본 발명의 AMP의 활성은 또다른 AMP 또는 동일한 AMP의 활성에 비해 증가 또는 감소 및/또는 차별적으로 조절될 수 있다. 본 발명의 AMP의 활성의 예는 AMP 발현, 결합 파트너에 대한 결합, 신호 전달, 항-미생물 활성, 또는 그의 다른 생물학적 또는 면역학적 활성을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
한 측면에서, 하나 이상의 본 발명의 AMP의 활성의 증가는 대상에서 항-미생물 면역반응을 향상시킨다.
한 측면에서, 본 발명의 AMP는 IL-22와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 폴리펩티드, 예를 들어 미생물 병원체 (예를 들어, 세균 또는 바이러스)에 의한 감염에 대한 숙주 저항성을 매개하는 IL-22 신호 전달 경로의 상류 또는 하류에 위치하는 폴리펩티드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 AMP의 예는 LT, IL-6, IL-18, 및 IL-23 (예를 들어, IL-23 p19 또는 IL-23 p40 포함)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 조정인자는 AMP의 활성을 직접 또는 간접적으로 조정하는 폴리펩티드 및 핵산 분자 (예를 들어, DNA 분자 또는 RNA 분자)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 조정의 예는 본 발명의 AMP의 활성의 증가, 감소, 유도 또는 활성화, 억제, 또는 조절 (예를 들어, 상향 또는 하향 조절)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
한 측면에서, 조정인자는 IL-22 결합 단백질 (BP) 활성을 감소시키거나 억제하여 IL-22 활성을 증가시킴으로써 IL-22 활성을 간접적으로 조정한다. 특정 측면에서, 조정인자는 IL-22 BP의 IL-22에 대한 결합을 감소시키거나 억제하여 IL-22 활성을 증가시킨다.
일부 측면에서, 조정인자는 폴리펩티드, 예를 들어 AMP에 결합하거나 다른 방식으로 상호작용하여 AMP의 활성을 증가, 유도 또는 조절하는 폴리펩티드이다. 한 측면에서, 조정인자는 AMP의 활성을 조정하는 융합 폴리펩티드이다.
한 측면에서, 조정인자는 AMP에 결합하는 항체이다. 특정 측면에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 다른 측면에서, 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편으로부터 선택되는 항체 단편이다. 다른 측면에서, 항체는 융합 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 융합 폴리펩티드)이다. 다른 측면에서, 항체는 키메라 (chimera) 항체이다. 특정 측면에서, 항체는 인간화 항체이다. 다른 측면에서, 항체는 인간 항체이다. 다른 측면에서, 항체는 인간, 비-인간 영장류, 또는 다른 포유동물 (예를 들어, 돼지, 양, 토끼, 마멋 (marmot), 래트, 또는 마우스)로부터 선택되는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 측면에서, 항체는 AMP 효능제이다.
다른 특정 측면에서, 조정인자는 재조합 AMP 또는 AMP를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)이다.
본 발명은 항-미생물 면역반응을 조정함으로써 미생물 질환을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 AMP 또는 AMP의 조정인자를 포함하는 유효량의 제약 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 미생물 질환의 치료 방법을 제공하고, 상기 AMP는 LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23, REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III, REG IV 및 Reg-관련 서열 (RS)로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 한 측면에서, 질환은 감염성 질병, 예를 들어, EHEC- 또는 EPEC-유발 설사, 염증성 장 질환 (IBD) 또는, 보다 특히, 궤양성 대장염 (UC) 또는 크론병 (CD)이다.
특정 측면에서, 본 발명은 AMP-매개된 신호 전달 경로 및/또는 ThIL -17 세포 기능을 자극하거나 억제함으로써 항-미생물 면역반응을 조정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 미생물 질환의 치료에 유용하다. 예를 들어, 한 측면에서, 본 발명은 예를 들어 AMP-매개된 신호 전달 경로, 및 IL-22 및/또는 IL-23 매개된 신호 전달 경로를 자극함으로써 항-미생물 면역반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 시토킨-매개된 신호 전달 경로를 자극하거나 억제함으로써 항-미생물 면역반응을 조정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 한 측면에서, 본 발명은 시토킨-매개된 신호 전달 경로, 예를 들어, IL-22 및/또는 IL-23 신호 전달 경로를 자극함으로써 항-미생물 면역반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 ThIL -17 세포 기능을 자극하거나 억제함으로써 항-미생물 면역반응을 조정하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 AMP 효능제를 생물학적 시스템에 제공하는 것을 포함하는, 생물학적 시스템에서 AMP-매개된 신호 전달 경로를 자극하는 방법을 제공한다. 상기 생물학적 시스템의 예는 시험관내 세포 배양 시스템 또는 생체 내의 유기체 내의 포유동물 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 다른 측면에서, 본 발명은 AMP 길항제를 생물학적 시스템에 제공하는 것을 포함하는, 생물학적 시스템에서 AMP-매개된 신호 전달 경로를 억제하는 방법을 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 IL-22 또는 IL-22 효능제를 생물학적 시스템에 제공하는 것을 포함하는, 생물학적 시스템에서 IL-23 및/또는 IL-22 매개된 신호 전달 경로를 자극함으로써 생물학적 시스템에서 항-미생물 면역반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, IL-22 효능제는 IL-22이다. 다른 측면에서, IL-22 효능제는 IL-22에 결합하는 항체이다.
다른 측면에서, IL-22 길항제를 생물학적 시스템에 제공하는 것을 포함하는, 생물학적 시스템에서 IL-23-매개된 신호 전달 경로를 억제하는 방법이 제공된다. 한 측면에서, IL-22의 길항제는 항체, 예를 들어 중화 항-IL-22 항체 및/또는 중화 항-IL-22R 항체이다.
다른 측면에서, 본 발명은 ThIL -17 세포를 IL-23 매개된 신호 전달 경로를 매개하는 AMP의 효능제 (예를 들어, IL-23, IL-6, 또는 IL-22)에 노출시키는 것을 포함하는, ThIL -17 세포 기능의 자극 방법을 제공한다. 상기 방법은 미생물 질환 치료에 유용하다. 한 측면에서, IL-22 효능제는 IL-22이다. 다른 측면에서, IL-22 효능제는 IL-22에 결합하는 항체이다.
다른 측면에서, ThIL -17 세포를 IL-23 매개된 신호 전달 경로를 매개하는 AMP의 길항제 (예를 들어, IL-23, IL-6, 또는 IL-22)에 노출시키는 것을 포함하는, ThIL -17 세포 기능을 억제하는 방법이 제공된다. 한 측면에서, 길항제는 항-IL-22 항체, 예를 들어, 중화 항-IL-22 항체이다.
예시적인 ThIL -17 세포 기능은 세포-매개된 면역의 자극 (지연형 과민반응); 선천 면역 세포, 예를 들어 골수양 (myeloid) 세포 (예를 들어, 단핵구 및 호중구)의 염증 부위로의 동원; 및 조직 내로의 염증 세포 침윤의 자극을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 한 측면에서, ThIL -17 세포 기능은 IL-23 및/또는 IL-22에 의해 매개된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 AMP 또는 AMP의 조정인자를 포함하는 유효량의 제약 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 미생물 병원체 (예를 들어, 세균 또는 바이러스)에 의한 감염의 치료 방법을 제공하고, 여기서 AMP는 LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23, REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III, REG IV 및 Reg-관련 서열 (RS)로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상의 세포를 AMP 또는 AMP의 조정인자를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시키는 것을 포함하는, 대상에서 미생물 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 AMP는 LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23, REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III, REG IV 및 Reg-관련 서열 (RS)로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 한 측면에서, 질환은 감염성 질병, 예를 들어, EHEC- 또는 EPEC-유발 설사, 염증성 장 질환 (IBD) 또는, 보다 특히, 궤양성 대장염 (UC) 또는 크론병 (CD)이다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포를 AMP 또는 AMP의 조정인자를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시키는 것을 포함하는, 미생물 병원체 (예를 들어, 세균 또는 바이러스)로 감염된 대상의 세포에서 AMP의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 여기서 AMP는 LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23, REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III (예를 들어, REG IIIβ 또는 REGIIIγ), REG IV 및 Reg-관련 서열 (RS)로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
미생물 병원체의 예는 세균 또는 바이러스를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 한 측면에서, 미생물 병원체는 세균, 예를 들어, 그람 음성 또는 그람 양성 세균이다. 특정 측면에서, 세균은 그람 음성 세균이다. 다른 측면에서, 세균은 부착 또는 소멸형 (A/E) 세균, 및 보다 특히, 장출혈성 에스체리키아 콜라이 (EHEC) 또는 장병원성 이. 콜라이 (EPEC)이다. 한 측면에서, 세균은 장병원성이고, 이. 콜라이 (EHEC)는 이. 콜라이 O157:H7 또는 이. 콜라이 O55:H7이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 AMP, 또는 그의 조정인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 측면에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 다른 측면에서, 숙주 세포는 CHO 세포, 효모 세포, 또는 세균 세포 (예를 들어, 이. 콜라이)이다.
한 측면에서, 본 발명은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고, 항체를 단리하는 것을 포함하는, 본 발명의 AMP에 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본 발명은 본 발명의 AMP의 효능제인 항체의 제조 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 항체의 AMP에 대한 결합을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 AMP에 대한 항체와 접촉시키고, 항체와 AMP 사이에 복합체가 형성되는지를 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 AMP의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 AMP 및/또는 그의 조정인자를 포함하는 키트를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 AMP 또는 그의 조정인자를 각각 포함하는 하나 이상의 제약 조성물을 제공한다.
도 1은 씨. 로덴티움 감염에 대한 숙주 방어를 보여주는 데이타를 도시한 것이다. 도 1(A)는 비감염된 야생형 마우스 GI관에서 IL-22에 대한 수용체 서브유닛에 대한 실시간 RT-PCR 분석 결과를 보여주고; 도 1(B-F)는 씨. 로덴티움 감염시에 야생형 마우스 결장에서 다양한 시토킨 발현에 대한 실시간 RT-PCR 분석을 보여주고; 도 1(G)는 씨. 로덴티움 감염 후에 C57B1/6 (n=5), IL-23p40-/- (n=5), 및 IL-6-/- (n=5) 마우스의 생존을 보여주고; 도 1(H)는 씨. 로덴티움 감염 후에 C57B1/6, IL-23p40-/-, 및 IL-6-/- 마우스 결장에서 IL-22 및 IL-17 발현에 대한 시간 경과 실시간 RT-PCR 분석을 보여준다. 씨. 로덴티움 감염을 위해, 마우스에게 2x109 CFU의 세균을 경구 접종하였다. 상기 모든 데이타는 2회의 독립적인 실험을 나타낸 것이다.
도 2는 IL-22 결핍이 마우스를 씨. 로덴티움 감염에 취약하게 만든다는 것을 보여주는 데이타를 도시한 것이다. 6-7주령의 IL-22-/- (도 2(A-C)), IL-17RC-/- (D), IL-20Rβ-/- 마우스 (도 2(F)) 또는 야생형 마우스 (도 2(A-C, E))에게 2x109 CFU의 세균을 경구 접종하고, 나타낸 시점에서 칭량하였다. 헤마톡실린-및-에오신 (H&E) 염색 8일 후에 IL-22-/- 및 야생형 마우스로부터의 결장에 대한 조직학적 분석 (도 2(B 및 C)). 화살표는 점막하 염증 (도 2(B)), 및 점액선 내로의 세균 침습 (도 2(C))을 나타낸다. 대표적인 데이타를 제시한다 (도 2(B)에서 막대 = 100 ㎛ 및 도 2(C)에서 막대 = 25 ㎛). 야생형 C57B1/6 마우스에게 접종 후 0일 또는 8일에 시작하여 격일로 150 ㎍의 항-IL-22 mAb 또는 이소형 대조군 IgG1 mAb를 복강 내로 투여하였다 (도 2(E)). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. 모든 데이타는 2회의 독립적인 실험을 나타낸 것이다.
도 3은 씨. 로덴티움 감염 동안 마우스에서 IL-22 결핍의 효과를 보여주는 데이타를 도시한 것이다. C57B1/6 마우스 (도 3(A, B, 및 F)), IL-22-/- 및 야생형 마우스 (도 3(C-E, 및 G))에게 2x109 CFU의 씨. 로덴티움을 경구 접종하였다. 또한, 마우스에게 씨. 로덴티움 접종과 동일한 날에 시작하여 격일로 150 ㎍의 항-IL-22 mAb 또는 이소형 대조군 IgG1 mAb를 복강 내로 투여하였다 (도 3(A 및 B)). 제10일에, 결장의 사진을 찍고, 개개의 결장 길이를 측정하였다 (도 3(A)). 결장에 대한 조직학적 분석을 헤마톡실린-및-에오신 (FI&E) 염색을 사용하여 수행하였다 (도 3(B)). 감염된 IL-22-/- 및 야생형 마우스로부터의 결장 및 간의 조직학적 분석 (제8일)을 H&E 염색을 사용하여 수행하였다 (도 3(C 및 E)). 도 3(C)에서 화살표는 결장 전층 (transmural) 염증 및 궤양 형성을 나타낸다. 도 3(E)는 IL-22-/- 마우스에서 간 패혈성 미세농양을 도시한 것이다. 대표적인 데이타는 도 3(C)에 제시되고, 여기서 상부 패널에서 막대 = 500 ㎛, 하부 패널에서 막대 = 100 ㎛이다. 도 3(E)에서, 막대 = 25 ㎛이다. 도 3(D)는 결장, 간, 비장, 및 장간막 림프절에서 log10 CFU의 씨. 로덴티움을 도시한 것이다. 도 3(F-G)는 ELISA에 의한 혈청 항-씨. 로덴티움 IgG 수준을 도시한 것이다. * p < 0.05. 상기 모든 데이타는 2회의 독립적인 실험을 나타낸 것이다.
도 4는 IL-22가 씨. 로덴티움 감염시에 항-미생물 RegIII 패밀리 단백질 발현을 유도함을 보여주는 데이타를 도시한 것이다. C57B1/6 마우스 결장의 시험관내 배양물을 10 ㎍의 IL-22로 24시간 동안 처리하고, RNA를 단리하여 마이크로어레이 분석 (도 4(A)) 및 실시간 RT-PCR 분석 (도 4(B))에 사용하였다. 도 4(C)에서, IL-22-/- 마우스 및 야생형 한배 새끼 (littermate)에게 2x109 CFU의 씨. 로덴티움을 경구 접종하고, 나타낸 시점에서 수집한 개개의 마우스 결장으로부터 단리된 RNA에 대해 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 모든 데이타는 2회의 독립적인 실험을 나타낸 것이다.
도 5는 쥐 IL-17RC 유전자의 표적화된 붕괴를 보여주는 데이타를 도시한 것이다. 도 5(A)는 IL-17RC 낙아웃 (knockout) 마우스의 생성 전략을 도시한 것이다. IL-17RC 코딩 서열을 포함하는 엑손 1-5 (흰 네모)는 네오마이신 내성 카세트로 대체되었다. 도 5(B)는 나타낸 프라이머 세트 (P1, P2 및 P3)을 사용하여 야생형 (WT) 및 낙아웃 (KO) 마우스로부터의 자손체의 유전자형 결정을 도시한 것이다. WT 및 KO 마우스로부터의 꼬리 끝 섬유모세포를 생성시키고, 다양한 농도의 IL-17A 및 IL-17F로 시험관 내에서 24시간 동안 자극하고, 배양 상등액을 IL-6 ELISA를 위해 수집하였다 (도 5(C)).
도 6은 씨. 로덴티움 감염시에 야생형 마우스 결장에서의 IL-19, IL-20 및 IL-24 발현에 대한 시간 경과 실시간 RT-PCR 분석 데이타를 도시한 것이다. C57B1/6 마우스에게 2x109 CFU의 씨. 로덴티움을 경구 접종하였다. 결장을 나타낸 시점에서 수집하고, 단리된 RNA를 실시간 RT-PCR 분석을 위해 사용하였다.
도 7은 GI관에서 IL-20Rα 및 IL-20Rβ 발현을 입증하는 데이타를 도시한 것이다. 비감염된 야생형 마우스 GI관에서 IL-19, IL-20 및 IL-24에 대한 수용체 서브유닛에 대한 실시간 RT-PCR 분석.
도 8은 쥐 IL-20Rβ 유전자의 표적화된 붕괴를 보여주는 데이타를 도시한 것이다. 도 8(A)는 IL-20Rβ 낙아웃 마우스의 생성 전략을 도시한 것이다. 엑손 1 (흰 네모)은 네오마이신 내성 카세트로 교체되었다. 도 8(B)는 나타낸 프라이머 세트 (p1, p2 및 p3)를 사용하여 야생형 (WT), 이종접합성 (HET) 및 낙아웃 (KO) 마우스로부터의 자손의 표현형 결정을 도시한 것이다. 도 8(C): WT 및 KO 마우스 귀에 20 ㎕ PBS 중의 500 ng 재조합 IL-20를 또는 20 ㎕ PBS를 단독으로 피내 주사하였다. 24시간 후에, 마우스 귀를 RNA 단리를 위해 수집하였다. 단리된 RNA는 IL-20 신호 전달시에 상향 조절되는 것으로 알려진 유전자에 대한 실시간 RT-PCR 분석을 위해 사용하였다.
도 9는 씨. 로덴티움을 접종한 항-IL-22 mAb 처리된 야생형 마우스로부터의 마우스 결장에 대한 조직학적 분석 데이타를 도시한 것이다. C57B1/6 마우스에게 2x109 CFU의 씨. 로덴티움을 경구 접종하였다. 또한, 마우스에게 씨. 로덴티움 접종과 동일한 날에 시작하여 격일로 150 ㎍의 항-IL-22 mAb 또는 이소형 대조군 IgG1 mAb를 복강 내로 투여하였다. 제10일에, 결장에 대한 통상적인 조직학적 분석을 헤마톡실린-및-에오신 (H&E) 염색을 사용하여 수행하였다. 화살표는 전층 염증이 존재하는 점막 궤양 형성을 나타낸다. 대표적인 영상이 제시되고, 상부 패널에서 막대 = 500 ㎛s이고, 하부 패널에서 막대 = 250 ㎛이다.
도 10은 씨. 로덴티움 감염 동안 IL-22-/- 마우스 및 야생형 한배 새끼에서 혈청 Ig 수준을 보여주는 데이타를 도시한 것이다. IL-22-/- 및 야생형 한배 새끼 마우스에게 2x109 CFU의 씨. 로덴티움을 경구 접종하였다. 나타낸 시점에, 마우스 혈액을 수집하였다. 총 혈청 IgM 및 IgG (도 10(A)) 및 혈청 항-씨. 로덴티움 IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3 (도 10(B))의 수준을 ELISA로 결정하였다. 모든 데이타는 2회의 독립적인 실험을 나타낸 것이다.
도 11은 씨. 로덴티움 감염 후에 C57B1/6, IL-23p19-/-, 및 IL-6-/- 마우스 결장에서 IL-22 (도 11(A)) 및 IL-17 (도 11(B)) 발현의 생체 외에서의 결장 배양액 ELISA를 보여주는 데이타를 도시한 것이다. 씨. 로덴티움 감염을 위해, 마우스에게 2x109 CFU의 세균을 경구 접종하였다. 모든 데이타는 적어도 2회의 독립적인 실험을 나타낸 것이다.
도 12는 단리된 마우스 IEL, LPMC 및 결장 상피 세포에 대한 IL-22R 발현의 FACS 분석 (도 12(A)), 및 1차 인간 결장 상피 세포에 대한 IL-22R 발현의 FACS 분석 (도 12(B))을 도시한 것이다. 모든 데이타는 적어도 2회의 독립적인 실험을 나타낸 것이다.
도 13은 수지상 세포 (DC)에 의해 생산된 IL-22가 씨. 로덴티움 감염에 대한 선천 면역반응에 중요함을 보여주는 데이타를 도시한 것이다. 도 13(A)에서, Rag2-/- 및 야생형 Balb/c 마우스에게 2x109 CFU의 씨. 로덴티움을 경구 접종하였다. 도 13(B 및 C)에서, 마우스에게 또한 세균 접종과 동일한 날에 시작하여 격일로 150 ㎍의 이소형 대조군 IgG1 mAb 또는 항-IL-22 mAb를 복강 내로 투여하고, 나타낸 시점에 칭량하였다. 도 13(B)는 시간 경과 실시간 RT-PCR 분석을 도시한 것이고, 도 13(C)는 씨. 로덴티움 감염 후에 야생형 Balb/c 및 Rag2-/- 마우스의 결장에서 IL-22 및 IL-17 발현에 대한 생체 외에서의 결장 배양액 ELISA를 도시한 것이다. 도 13(D)는 씨. 로덴티움 감염된 Rag2-/- 마우스로부터의 제4일 결장에서 IL-22, CD11c, 및 DAPI에 대한 면역조직화학적 염색을 도시한 것이다 (배율: 400x). 도 13(E)는 IL-23이 ELISA에 의해 측정시에 시험관 내에서 단리된 쥐 CD11c+ DC로부터 IL-22의 생산을 직접 유도함을 보여주는 데이타를 도시한 것이다. 모든 데이타는 2회의 독립적인 실험을 나타낸 것이다.
도 14는 IL-22가 인간 결장 세포주에서 STAT3 활성화를 유도할 수 있음을 보여주는 데이타를 도시한 것이다. 도 14(A)에서, IL-22-/- 마우스 및 야생형 한배 새끼에게 2x109 CFU의 씨. 로덴티움을 경구 접종하였다. 또한, IL-22-/- 마우스의 한 군에게는 mRegIIIγ-Ig 융합 단백질을 투여하였다. 동물을 칭량하고, 나타낸 시점에서 모니터링하였다. *p < 0.05, **p < 0.01. 도 14(B)에서, IL-23은 ELISA에 의해 측정시에 단리된 인간 DC로부터 IL-22 생산을 직접 유도한다. 도 14(C)는 인간 결장 세포주에서 FACS에 의한 IL-22R의 발현을 도시한 것이다. 도 14(D)는 IL-22가 인간 결장 세포주에서 STAT3 활성화를 유도할 수 있음을 보여주는 웨스턴 블로팅을 도시한 것이다. 도 14(E)는 IL-22로 처리된 인간 결장 상피 세포주에서 RegIIIβ 및 RegIIIγ 발현에 대한 실시간 RT-PCR 분석을 도시한 것이다. 모든 데이타는 2회의 독립적인 실험을 나타낸 것이다.
도 15는 면역조직화학을 위한 항-IL-22 mAb의 특성화를 도시한 것이다. 도 15(A)는 Alexa555 컨쥬게이팅된 항-IL-22 mAb (8E11) 또는 이소형 대조군으로 염색된, 씨. 로덴티움 감염된 IL-22-/- 및 야생형 마우스 또는 비감염된 야생형 마우스의 제4일로부터의 결장 절편을 도시한 것이다. 도 15(B)는 Alexa555 컨쥬게이팅된 항-IL-22 mAb (8E11) 또는 이소형 대조군으로 염색된 IL-22-발현 293 세포의 세포 펠렛을 도시한 것이다. 배율은 200x이다.
도 16은 씨. 로덴티움 감염 후에 C57B1/6 및 IL-23p19-/- 마우스 결장에서 RegIIIγ 및 RegIIIβ 발현에 대한 시간 경과 분석을 도시한 것이다. C57B1/6 및 IL-23p19-/- 마우스에게 2x109 CFU의 씨. 로덴티움을 경구로 접종하였다. 나타낸 시점에, 마우스 결장을 RNA 추출을 위해 수집한 후, 마우스 RegIIIγ 및 RegIIIβ 발현에 대한 실시간 RT-PCR 분석을 수행하였다.
도 17은 씨. 로덴티움 감염 후에 IL-22-/- 및 야생형 마우스 결장에서 다른 Reg 패밀리 멤버의 발현에 대한 시간 경과 분석을 도시한 것이다. IL-22-/- 및 야생형 한배 새끼 마우스에게 2x109 CFU의 씨. 로덴티움을 경구로 접종하였다. 나타낸 시점에, 마우스 결장을 RNA 추출을 위해 수집한 후, 실시간 RT-PCR 분석을 수행하였다.
도 18은 씨. 로덴티움 감염 후에 재조합 인간 REGIIIγ 융합 단백질이 IL-22-/-를 부분적으로 보호할 수 있음을 보여주는 데이타를 도시한 것이다. IL-22-/- 마우스 및 야생형 한배 새끼에게 2x109 CFU의 씨. 로덴티움을 경구로 접종하였다. 또한, 1군의 IL-22-/- 마우스에게는 인간 RegIIIγ-cFlag 융합 단백질을 투여하였다. 동물을 칭량하고, 나타낸 시점에 모니터링하였다. *p < 0.05.
도 19 A-C는 IL-22 처리에 의해 결장에서 차별적으로 발현된 161개의 유전자를 도시한 것이다.
도 20은 IL-22 처리에 의해 결장에서 차별적으로 발현된 161개 유전자의 2D 계층적 클러스터링 (hierarchical clustering)을 도시한 것이고, 여기서 선택된 유전자는 피어슨 (Pearson) 상관 계수에 의해 가장 크게 연관된 벡터의 반복 응집에 의해 클러스터링되고, 응집된 벡터에 대한 데이타는 평균 연관법에 의해 요약되었다.
도 21은 LTbRFc와 항-IL-22 mAb 모두가 씨. 로덴티움 감염 후에 사망을 야기함을 보여주는 데이타를 도시한 것이다.
도 22는 IL-22 생산에 관련되는 다수의 상류 위치의 LT 경로 조절을 보여주는 데이타를 도시한 것이다.
도 23은 IL-22가 LTbR 처리된 마우스에서 관찰되는 결함을 부분적으로 구제함을 보여주는 데이타를 도시한 것이다.
도 24는 항-IL-22 mAb 처리가 결장 소포 (follicle)의 감소, B/T 조직 (organization)의 손상, 및 결장에서 DC, T 세포 및 B 세포의 수 감소를 야기함을 보여주는 데이타를 도시한 것이다.
본 발명은 숙주 면역반응의 조정에 의해 미생물 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명자들은 포유동물의 감염성 미생물 병원체에 대한 면역반응 및 저항성을 매개하는 신규한 시토킨 경로를 밝혀내었다. 특히, 본 발명자들은 IL-22이 부착 또는 소멸형 (A/E) 세균 병원체의 초기 감염 동안 적응 면역반응 및 선천 상피 방어를 연결시키는 핵심 시토킨 중의 하나임을 밝혀내었다.
본원에 제시한 바와 같이, 초기 감염기 동안 면역 세포에 의해 생산되는 시토킨, 예를 들어 IL-22가, 병원성 미생물의 숙주 내로의 전신 침습을 방지하기 위해 장 상피 세포가 전체-항-미생물 반응 및 상처 치유 반응을 유도하는데 필요하다. 본 발명에서의 연구는 IL-22가 장 상피 장벽의 통합성을 보호하고 전신 전파되는 세균 침습을 방지함을 보여준다. 또한, 본원에서의 연구는 IL-22가 초기 항-세균 IgG 반응의 유도에 관련되고, 세균 감염 동안 결장 상피 세포로부터 항-미생물 렉틴, 예를 들어 RegIIIβ 및 RegIIIγ의 유도에 필수적임을 나타낸다. 상기 메카니즘 중의 어느 하나 또는 둘 모두의 결여는 씨. 로덴티움 감염 동안 IL-22-/- 마우스에서 전신 전파 및 사망률을 증가시키면서 숙주 방어 반응을 손상시키는데 기여할 수 있다.
본원에서 제시되는 바와 같이, RegIIIβ 및 RegIIIγ의 유도는 또한 IL-22가 다양한 세균 감염을 제어하는데 더 넓은 기능을 할 수 있음을 나타낸다. 본원에서의 연구는 감염성 질병 및 자가면역 질병에서 ThIL -17 세포 및 그들의 효과기 시토킨의 역할을 추가로 지지한다. 또한, 본원에서의 연구는 IL-22 및 그의 하류 생성물, 예를 들어 RegIIIβ 및 RegIIIγ가 감염성 질병의 치료에 유익할 수 있음을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 숙주 면역반응의 조정에 의해 상기 미생물 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 대상에서 항-미생물 면역반응은 항-미생물 면역반응을 매개하는 하나 이상의 항-미생물 폴리펩티드 (AMP)의 활성을 증가시키거나 감소시킴으로써 향상되거나 억제될 수 있다.
보다 특히, 본 발명은 AMP, 그의 조정인자, 및 미생물 질환의 치료를 위해 상기 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 상기 미생물 질환은 감염성 질병, 예를 들어, EHEC- 및 EPEC-유발 설사, 염증성 장 질환 (IBD), 및 보다 특히, 궤양성 대장염 (UC) 및 크론병 (CD)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
특허, 출원 및 학술 문헌을 포함하여 본원에서 인용되는 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일반적인 기술
본원에서 기재되고 언급되는 기술 및 절차는 일반적으로 당업자가 잘 이해하고 있고, 통상적인 방법, 예를 들어 다음 문헌에 기재된 바와 같은 널리 이용되는 방법에 의해 사용된다: [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.]; [Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003))]; [the series Methods in Enzvmology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987))]; [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)]; [Methods in Molecular Biology, Humana Press]; [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press]; [Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987)]; [Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press]; [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons]; [Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)]; [Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; [Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)]; [Antibodies (P. Finch, 1997)]; [Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; [Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; [Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; [The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)] 및 [Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)].
I. 정의
본원 명세서의 해석을 위해, 하기 정의가 적용되고, 적절한 경우, 단수로 사용되는 용어는 복수를 포함할 것이고, 그 반대도 가능하다. 아래에서 제시되는 임의의 정의가 본원에 참조로 포함된 임의의 문헌과 충돌할 경우에는, 아래에서 제시되는 정의가 적용된다.
"항-미생물 폴리펩티드" 또는 "AMP"는 미생물 병원체에 대한 항-미생물 면역반응을 매개하거나 다른 방식으로 영향을 주는 폴리펩티드이고, AMP 활성, 예를 들어 항-미생물 활성, 또는 항-미생물 면역반응을 조정하기 위한 활성을 보유하는 그의 단편, 변이체, 유사체, 유도체 또는 모방체 (mimetic)를 포함한다. 상기 방법은 감염성 미생물 병원체, 예를 들어 바이러스 또는 세균으로 감염된 대상 또는 감염될 위험이 있는 대상의 치료를 위해 사용될 수 있다. AMP의 활성은 또다른 AMP 또는 동일한 AMP에 비해 조정되거나 또는 차별적으로 조절 (예를 들어, 상향 또는 하향 조절)될 수 있다.
본 발명의 AMP는 천연 AMP 및 그의 변이체 형태 (본원에서 추가로 규정됨)를 포함하고, 다양한 공급원, 예를 들어 인간 조직 또는 다른 공급원으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 천연 AMP는 임의의 종, 예를 들어, 쥐 또는 인간으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 AMP는 LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23 (예를 들어, IL-23 p19 또는 IL-23 p40 포함), 및 Reg 수퍼패밀리의 유전자에 의해 코딩되는 Reg 또는 Reg-관련 단백질을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. Reg 수퍼패밀리는 인간, 래트, 및 마우스로부터의 Reg 및 Reg-관련 유전자를 포함하고, 4개의 하위클래스, 즉 타입 I, II, III, 및 IV로 분류된다. 예를 들어, 타입 I은 인간 REG Iα, 인간 REG Iβ, 래트 RegI, 및 마우스 RegI을 포함하고; 타입 II는 마우스 RegII를 포함하고; 타입 III은 인간 REG III, 인간 HIP/PAP (간세포 암종-장-췌장에서 발현되는 유전자/췌장염-연관 단백질을 코딩하는 유전자), 래트 PAP/펩티드23, 래트 RegIII/PAPII, 래트 PAP III, 마우스 RegIIIα, RegIIIβ, RegIIIγ, 마우스 RegIIIδ, 및 햄스터 INGAP (소도 신생-연관 단백질)를 포함한다. 타입 IV는 인간 REG IV를 함유한다. 추가로, 인간 Reg-관련 서열 (RS)은 위유전자 (pseudogene)로 보고된 서열이다. 한 실시태양에서, REG 단백질은 REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III, REG IV, 및 Reg-관련 서열 (RS)을 포함하고 이로 제한되지 않는 인간 REG 유전자 패밀리의 멤버에 의해 코딩된다.
림프독소 (LT)는 종양 괴사 패밀리의 삼량체 시토킨이고; 활성화된 T, B, 및 NK 세포에 의해 발현되고; 염증 반응 신호 전달 및 2차 림프계 기관 구성에 관여한다. "림프독소-" 또는 "LT"는 미국 특허 5,824,509의 도 2A에 제시된 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 폴리펩티드로서 본원에서 규정된다. "LT"는 인간 TNFα 또는 그의 천연 동물 유사체를 구체적으로 제외하는 것으로 규정된다 ([Pennica et al., Nature 312:20/27: 724-729 (1984)] 및 [Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 260: 2345-2354 (1985)]). 본원에서 사용될 때, "LT"는 본원에서 설명되는 하나 이상의 LT 서브유닛을 의미한다.
"림프독소-α" 또는 "LTα"는 예를 들어 US 5,661,004에서 규정된 바와 같이 인간 LTβ를 구체적으로 제외하는 것으로 규정된다. "림프독소α-3 삼랑체" 또는 "LTα3"은 LTα 단량체의 동종삼량체를 의미한다. 상기 동종삼량체는 LTβ, 막횡단 및 세포질 도메인에 의해 세포 표면에 고정된다.
"림프독소-αβ" 또는 "LTαβ" 또는 "LTαβ 복합체"는 LTα와 LTβ의 이종삼량체를 의미한다. 이들 이종삼량체는 LTα의 2개의 서브유닛 및 LTβ의 1개의 서브유닛 (LTα2β1), 또는 LTα의 1개의 서브유닛 및 LTβ의 2개의 서브유닛 (LTα1β2)를 함유한다. 본원에서 사용되는 용어 "LTaβ" 또는 "LTab"는 LTα의 1개의 서브유닛 및 LTβ의 2개의 서브유닛 (LTα1β2)로 이루어진 이종삼량체를 의미한다.
"종양 괴사 인자 수용체-1" 또는 "TNFR1" 및 "종양 괴사 인자 수용체-II" 또는 "TNFRII"는 각각 p55 및 p75로도 알려진, LTα3 동종삼량체에 대한 세포-표면 TNF 수용체를 의미한다.
"림프독소-β 수용체" 또는 "LTβ-R"은 LTαβ 이종삼량체가 결합하는 수용체를 나타낸다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 AMP의 아미노산 서열은 다음 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하다: 서열 2 (인간 IL-6), 서열 4 (인간 IL-12B), 서열 6 (인간 IL-18), 서열 8 (인간 IL-22), 서열 10 (인간 IL-23 p19 또는 IL-23A), 서열 12 (인간 REG1A), 서열 14 (인간 REG1B), 서열 16 (인간 REG3A, 변이체 1), 서열 18 (인간 REG3A, 변이체 2), 서열 20 (인간 REG3A, 변이체 3), 서열 22 (인간 REG3G, 변이체 2), 서열 24 (인간 REG3G, 변이체 1), 서열 26 (인간 REG4), 서열 28 (쥐 IL-6), 서열 30 (쥐 IL-12B), 서열 32 (쥐 IL-18), 서열 34 (쥐 IL-22), 서열 36 (쥐 IL-23 p19 또는 IL-23A), 서열 38 (쥐 PAP), 서열 40 (쥐 REG1), 서열 42 (쥐 REG2), 서열 44 (쥐 REG3A), 서열 46 (쥐 REG3D), 서열 48 (쥐 REG4), 서열 50 (인간 LTα), 서열 52 (인간 LTβ), 서열 54 (쥐 LTα), 및 서열 56 (쥐 LTβ).
다른 실시태양에서, 본 발명의 AMP를 코딩하는 핵산 서열은 다음 군 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함한다: 서열 1 (인간 IL-6), 서열 3 (인간 IL-12B), 서열 5 (인간 IL-18), 서열 7 (인간 IL-22), 서열 9 (인간 IL-23 p19 또는 IL-23A), 서열 11 (인간 REG1A), 서열 13 (인간 REG1B), 서열 15 (인간 REG3A, 변이체 1), 서열 17 (인간 REG3A, 변이체 2), 서열 19 (인간 REG3A, 변이체 3), 서열 21 (인간 REG3G, 변이체 2), 서열 23 (인간 REG3G, 변이체 1), 서열 25 (인간 REG4), 서열 27 (쥐 IL-6), 서열 29 (쥐 IL-12B), 서열 31 (쥐 IL-18), 서열 33 (쥐 IL-22), 서열 35 (쥐 IL-23 p19 또는 IL-23A), 서열 37 (쥐 PAP), 서열 39 (쥐 REG1), 서열 41 (쥐 REG2), 서열 43 (쥐 REG3A), 서열 45 (쥐 REG3D), 서열 47 (쥐 REG4), 서열 49 (인간 LTα), 서열 51 (인간 LTβ), 서열 53 (쥐 LTα), 및 서열 55 (쥐 LTβ).
"천연 서열 AMP 폴리펩티드" 또는 "천연 서열 AMP 폴리펩티드"는 자연에서 유도되는 대응하는 AMP 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 천연 서열 AMP 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조될 수 있다. 상기 용어는 구체적으로 자연 발생하는 말단 절단된 (truncated) 또는 분비된 형태의 특이적 AMP 폴리펩티드 (예를 들어, 그의 연관된 신호 펩티드가 결여된 IL-22), 폴리펩티드의 자연 발생하는 변이체 형태 (예를 들어, 선택적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연 발생하는 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 다양한 실시태양에서, 본원에 개시된 천연 서열 AMP 폴리펩티드는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다.
"변이체" 폴리펩티드는 전장 천연 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 활성 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 변이체 폴리펩티드는 전장 또는 성숙 천연 폴리펩티드 서열에 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 81%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 82%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 83%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 84%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 85%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 86%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 87%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 88%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 89%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 90%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 91%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 92%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 93%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 94%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 95%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 96%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 97%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 98%의 아미노산 서열 동일성, 및 별법으로 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.
"아미노산 서열 동일성 비율 (％)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하도록 갭 (gap)을 도입시킨 후, 특이적 또는 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에서 정의되고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 당업자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 전장 서열에 걸친 최대 정렬의 달성에 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 아미노산 서열 비교를 위해, 제시된 아미노산 서열 A의 제시된 아미노산 서열 B에 대한 아미노산 서열 동일성 % (별법으로 제시된 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 제시된 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:
100 x X/Y
상기 식에서, X는 서열 정렬 프로그램에 의한 A 및 B의 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 것으로 평가된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않을 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. 상기 방법을 사용한 아미노산 서열 동일성 % 계산의 예로서, 하기 표 1 및 2는 "참조 단백질"로 지정된 아미노산 서열의 "IL-22"로 지정된 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성 %를 계산하는 방법을 제시하고, 여기서 "IL-22"는 목적하는 IL-22 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "참조 단백질"은 목적하는 "IL-22" 폴리펩티드가 그에 대해 비교되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 아미노산 잔기를 나타낸다.
표 1
IL-22 XXXXXXXXXXXXXXX (길이 = 15 아미노산)
참조 단백질 XXXXXYYYYYYY (길이 = 12 아미노산)
아미노산 서열 동일성 % =
(두 폴리펩티드 서열 사이의 동일하게 일치하는 아미노산 잔기의 수)/(IL-22 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총수) = 5/15 = 33.3%
표 2
IL-22 XXXXXXXXXX (길이 = 10 아미노산)
참조 단백질 XXXXXYYYYYYZZYZ (길이 = 15 아미노산)
아미노산 서열 동일성 % =
(두 폴리펩티드 서열 사이의 동일하게 일치하는 아미노산 잔기의 수)/(IL-22 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총수) = 5/10 = 50%
본원에 개시된 "단리된" 생물학적 분자, 예를 들어 다양한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 및 항체는 그의 천연 환경의 적어도 하나의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 생물학적 분자를 의미한다.
폴리펩티드에 대한 "활성의" 또는 "활성"은 천연 폴리펩티드의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 의미하고, "생물학적" 활성은 천연 폴리펩티드가 갖는 항원 에피토프에 대해 작용하는 항체의 생산을 유도하는 능력 이외의 다른, 천연 폴리펩티드의 생물학적 기능을 의미한다. "면역학적" 활성은 천연 폴리펩티드가 갖는 항원 에피토프에 대해 작용하는 항체의 생산을 유도하는 능력을 의미한다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 또한, "길항제"는 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 전사 또는 번역을 완전히 또는 부분적으로 억제하는 분자도 포함한다. 적합한 길항제 분자는 예를 들어 길항제 항체 또는 항체 단편; 천연 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체; 펩티드; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 유기 소분자; 및 폴리펩티드 길항제 또는 길항제 항체를 코딩하는 핵산을 포함한다. "길항제"라는 표현은 하나의 길항제 또는 2개 이상의 상이한 길항제의 조합물을 포함한다.
용어 "효능제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 폴리펩티드, 예를 들어 천연 AMP의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 또한, "효능제"는 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 전사 또는 번역을 자극하는 분자도 포함한다. 적합한 효능제 분자는 예를 들어 효능제 항체 또는 항체 단편; 천연 폴리펩티드; 천연 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체; 펩티드; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 유기 소분자; 및 폴리펩티드 효능제 또는 항체를 코딩하는 핵산을 포함한다. "효능제"라는 표현은 하나의 효능제 또는 2개 이상의 상이한 효능제의 조합물을 포함한다.
"항-미생물 면역반응"은 미생물 병원체에 의한 감염에 대한 저항 또는 방어를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 저항 또는 방어는 미생물 감염성, 복제, 증식 또는 미생물 병원체의 다른 활성의 억제 또는 감소를 야기할 수 있다. 특히, 항-미생물 면역반응을 야기하는 처리는 미생물 질환 또는 미생물 질환의 증상의 완화를 야기할 수 있다.
"완화", "완화하는" 또는 그의 동등한 표현은 치료적 처치 및 예방 또는 억제적 조치를 모두 나타내고, 그 목적은 표적 미생물 질환 또는 그의 증상의 개선, 억제, 지연 (약화), 감소 또는 억제이다. 치료가 필요한 대상은 이미 질환이 조재하는 대상 및 질환이 발생하기 쉬운 대상 또는 질환이 예방되어야 하는 대상을 모두 포함한다.
미생물 질환의 치료에 대해서, "치료", "치료하는", 또는 그의 동등한 표현은 질환이 존재하는 대상에서 미생물 질환 또는 미생물 질환의 증상의 완화를 의미한다.
"만성" 투여는 연장된 기간 동안 초기의 치료 효과를 유지하기 위해서, 급성 방식과 달리 연속적인 방식으로 물질(들)을 투여하는 것을 의미한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 수행되지 않고, 특성상 주기적으로 시행되는 투여이다.
치료를 위한 "포유동물"은 인간, 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트), 및 원숭이; 가축 및 사육 동물; 및 동물원, 스포츠, 실험실 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함하는, 포유동물로 분류된 임의의 동물을 의미한다. 일부 실시태양에서, 포유동물은 인간, 설치류, 또는 원숭이로부터 선택된다. 이와 유사하게, 치료를 위한 "대상"은 포유동물 대상을 의미하고, 인간 및 수의용 대상을 모두 포함한다.
하나 이상의 추가의 치료제와의 "조합" 투여는 동시 (병행) 및 임의의 순서의 연속적인 투여를 포함한다.
본원에서 사용되는 "담체"는 사용된 투여량 및 농도에 노출된 세포 또는 포유동물에게 비독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 종종 생리학상 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예는 버퍼, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈(TWEEN)™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 플루로닉스(PLURONICS)™를 포함한다.
"항체" (Ab)" 및 "면역글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 항체는 특이적 항원에 결합 특이성을 나타내지만, 면역글로불린은 항체, 및 일반적으로 항원 특이성이 결여된 다른 항체-유사 분자를 모두 포함한다. 후자의 종류의 폴리펩티드는 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로, 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 보다 상세히 기재된 바와 같이)을 포함할 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화 및/또는 친화도 항체일 수 있다.
특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원을 표적으로 할 때 항체가 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 바람직하게는, 비-표적 폴리펩티드에 대한 상기 항체의 결합 정도는 예를 들어 방사 면역 측정법 (RIA)으로 측정시에 표적 항원에 대한 항체의 결합의 약 10％ 미만이다. 특정 실시태양에서, 표적 항원에 결합하는 항체의 해리 상수 (Kd)는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 ≤0.1 nM이다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 나타낸다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 언급될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 언급될 수 있다. 상기 도메인은 일반적으로 항체의 최대 가변 부분이고, 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분의 서열이 항체들 사이에서 크게 상이함을 의미하고, 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역 (HVR)으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, 주로 베타-시트 형태를 취하는 4개의 FR 영역을 각각 포함한다. 각 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (예를 들어 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed. National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 상이한 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
임의의 척추동물종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 구분되는 종류 중 하나에 분류될 수 있다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린)는 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]에 일반적으로 기재되어 있다. 항체는 항체와 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 아래에 정의된 항체 단편이 아닌, 그의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 의미한다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 의미한다.
"항체 단편"은 무손상 항체 내에 존재할 때 그 부분과 정상적으로 관련이 있는 기능의 적어도 하나 및 대부분 또는 전부를 보유하는, 무손상 항체의 일부만을 포함한다. 한 실시태양에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 다른 실시태양에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 항체 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 관련이 있는 적어도 하나의 생물학적 기능, 예를 들어 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합을 보유한다. 한 실시태양에서, 항체 단편은 무손상 항체에 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암 (arm)을 포함할 수 있다.
항체를 파파인 소화시키면 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (상기 명칭은 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영한다)을 생성시킨다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
"Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 한 실시태양에서, 이중쇄 Fv종은 강하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 이중쇄 Fv종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커 (linker)에 의해 공유 연결될 수 있다. 상기 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가된다는 점에서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 결합이 또한 공지되어 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대해서는, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디 (diabody)"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내고, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 페어링하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 ([Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134;] 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)])에 상세히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디도 문헌 [Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134]에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미한다. 즉, 이 집단을 구성하는 개개의 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 가능한 돌연변이, 예를 들어 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다. 특정 실시태양에서, 모노클로날 항체는 일반적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 방법에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선별 방법은 복수의 클론, 예를 들어 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 특유한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양액에서 그의 생산을 개선시키고, 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성시키기 위해서 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해하여야 한다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제에 비해, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그들의 특이성에 추가로, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않았다는 점에서 유리하다.
수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 다양한 기술, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, [Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)] 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 로커스 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]); 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; 문헌 ([Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)] 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)에 의해 제조할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 요구되는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 및 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 [Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)]).
비인간 (예, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 한 실시태양에서, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 보다 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 FR에 상응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)])을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 ([Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma ＆ Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)] 및 여기에 인용된 참조문헌을 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체의 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 그의 1개 이상의 HVR에 1개 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시태양에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 제조될 수 있다. 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화도 성숙을 기재하고 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발은 문헌 ([Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)] 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)])에 기재되어 있다.
"차단" 항체, "중화" 항체, 또는 "길항제" 항체는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 상기 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제할 수 있다.
본원에서 사용되는 "효능제 항체"는 목적하는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 모방하는 항체이다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 의미하고, 항체 이소형에 따라 상이하다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 나타낸다. 달리 나타내지 않으면, 본원에서 사용될 때 "결합 친화도"는 결합쌍의 멤버 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함한 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 쉽게 해리하는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 빠르게 결합하고 보다 오래 결합된 상태로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시태양을 아래에 기재한다.
한 실시태양에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하기 분석에서 기재되는 바와 같이 목적하는 항체의 Fab 버젼 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성 표지된 항원 결합 분석 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab를 평형화시킨 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol. 293 : 865-881). 분석 조건을 확립하기 위해, 미세적정 플레이트 (다이넥스 (Dynex))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 ㎍/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스 (Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (약 23℃)에서 차단하였다. 비흡착 플레이트 (넝크 (Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 목적하는 Fab의 연속 희석액과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 목적하는 Fab를 밤새 인큐베이션하지만, 평형이 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 혼합물은 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션을 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1％ 트윈-20으로 8회 세척한다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 ㎕/웰의 섬광제 (scintillant) (MicroScint-20; 팩카드 (Packard))를 첨가하고, 플레이트를 Topcount 감마 계수기 (팩카드) 상에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁적 결합 분석에서 사용하기 위해 선택한다.
다른 실시태양에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 10 이하의 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어™-2000 또는 비아코어™-3000 (비아코아, 인크. (BIAcore, Inc., 미국 뉴저지주 피스카타웨이))를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용함으로써 측정한다. 간단히 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코아, 인크.)을 제조사의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/ml (~0.2 μM)으로 희석한 후, 커플링된 단백질의 약 10 반응 단위 (RU)를 달성하도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후에, 미반응기를 차단하기 위해 1M 에탄올아민을 주입한다. 역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05％ 트윈 20을 갖는 PBS (PBST) 내에서 주입한다. 회합율 (kon) 및 해리율 (koff)은 회합 및 해리 센소그램을 동시 피팅함으로써 단순 일대일 랭그뮈어 (Langmuir) 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어 버젼 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon으로서 계산한다 (예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol 293: 865-881] 참조). 온-레이트 (on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 106 M- ls-1을 초과하면, 온-레이트는 분광계, 예를 들어 정지 유동 설치 분광분석기 (아비브 인스트루먼츠 (Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (써모스펙트로닉 (ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "회합율" 또는 "회합 속도" 또는 "kon"은 또한 비아코어™-2000 또는 비아코어™-3000 (BIAcore, Inc.)를 사용하여 상기한 바와 같이 결정할 수 있다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 향체는 항체의 자연 환경의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "표지"는 "표지된" 분자를 생성시키기 위해 분자 (예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 또는 항체)에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이팅된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체로 검출가능하거나 (예를 들어 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에, 검출가능한 생성물을 생성시키는, 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
"고상"은 분자 (예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 또는 항체)가 부착될 수 있는 비-수성 매트릭스이다. 본원에 포함되는 고상의 예는 부분적으로 또는 전적으로 유리 (예를 들어, 제어된 공극 유리), 다당류 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 문맥에 따라, 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있고; 다른 부분에서는 정제 컬럼 (예를 들어, 친화도 크로마토그래피 컬럼)일 수 있다. 또한, 이 용어는 미국 특허 4,275,149에 기재된 것과 같은, 별개 입자의 비연속적 고체상을 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 항체, 효능제 또는 길항제)을 포유동물에게 전달하기 위해 유용한 다양한 종류의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 베지클이다. 리포좀의 성분은 통상적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 2층 구조로 배열된다.
"소분자" 또는 "유기 소분자"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 미만인 유기 분자로 규정된다.
표적 폴리펩티드에 결합하는 "올리고펩티드"는, 올리고펩티드가 폴리펩티드의 표적화시에 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 표적 폴리펩티드에 충분한 친화도로 결합할 수 있는 올리고펩티드이다. 특정 실시태양에서, 비관련된 비-표적 폴리펩티드에 대한 올리고펩티드의 결합 정도는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 측정시에 표적 폴리펩티드에 대한 올리고펩티드의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시태양에서, 올리고펩티드는 ≤1 ㎛, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 ≤0.1 nM의 해리 상수 (Kd)로 표적 폴리펩티드에 결합한다.
표적 폴리펩티드에 결합하는 "유기 분자"는, 유기 분자가 폴리펩티드의 표적화시에 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 표적 폴리펩티드에 충분한 친화도로 결합할 수 있는, 본원에서 규정되는 올리고펩티드 또는 항체 이외의 다른 유기 분자이다. 특정 실시태양에서, 비관련된 비-표적 폴리펩티드에 대한 유기 분자의 결합 정도는 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 측정시에 표적 폴리펩티드에 대한 유기 분자의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시태양에서, 유기 분자는 ≤1 ㎛, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 ≤0.1 nM의 해리 상수 (Kd)로 표적 폴리펩티드에 결합한다.
"생물학적 시스템"은 공통적인 신호 전달 경로를 공유하는 포유동물 세포를 포함하는 시험관내, 생체외 또는 생체내 시스템이다.
"미생물 질환"은 미생물 병원체가 질병 또는 병태의 이환을 야기하거나, 매개하거나 또는 다른 방식으로 기여하는 질병 또는 병태를 의미한다. 또한, 항-미생물 반응의 자극 또는 개입이 질병의 진행에 대한 개선 효과를 갖는 질병도 포함된다. 상기 용어에는, 미생물 병원체의 1차 감염에 의한 감염성 질병 또는 병태, 및 기회감염 질병이 포함된다. 상기 감염성 질병의 예는 EHEC- 및 EPEC-유발 설사, 염증성 장 질환 (IBD) 및, 보다 특히, 궤양성 대장염 (UC) 및 크론병 (CD)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
용어 "T 세포 매개된 질병"은 T 세포가 포유동물에서 이환을 직접 또는 간접적으로 매개하거나 또는 다른 방식으로 기여하는 질병을 의미한다. T 세포 매개된 질병은 세포 매개된 효과, 림포킨 매개된 효과 등, 및 심지어 B 세포가 예를 들어 T 세포에 의해 분비된 림포킨에 의해 자극될 경우 B 세포와 연관된 효과와 연관될 수 있다.
"자가면역 질환" 또는 "자가면역"은 체액성 또는 세포-매개된 면역반응이 신체 자신의 조직에 대해 시작되는 임의의 상태를 의미한다. "IL-23 매개된 자가면역 질환"은 IL-23 활성에 의해 야기되거나, 유지되거나 또는 악화되는 임의의 자가면역 질환이다.
"염증"은 일반적으로 통증, 부종 및 발적을 야기하는, 손상 또는 감염 부위에서의 백혈구의 축적 및 혈관의 팽창을 의미하다.
"만성 염증"은 염증 원인이 지속되고 그 제거가 어렵거나 불가능한 염증을 의미한다.
"자가면역 염증"은 자가면역 질환과 연관된 염증을 의미한다.
"관절염성 염증"은 관절염과 연관된 염증을 의미한다.
"염증성 장 질환" 또는 "IBD"는 위장관의 염증을 특징으로 하는 만성 질환이다. IBD는 대장 및/또는 직장에 영향을 주는 궤양성 대장염, 및 전체 위장계에 영향을 줄 수 있지만 보다 일반적으로는 소장 (회장) 및 가능하게는 대장에 영향을 주는 크론병을 포함한다
용어 "유효량"은 언급된 특정 목적을 달성하는 분자 (예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 효능제, 또는 길항제)의 농도 또는 양이다. "유효량"은 경험적으로 결정될 수 있다. "치료 유효량"은 언급된 치료 효과를 달성하기 위해 효과적인 분자의 농도 또는 양이다. 이 양도 경험적으로 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 제한하고/하거나 세포의 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 Il31, Il25, Y90 및 Re186), 화학요법제, 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체 내에서 세포, 특히 임의의 유전자를 과다발현하는 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 상기 유전자를 과다발현하는 세포의 비율을 유의하게 감소시키는 것이다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 시기에) 차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 물질, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지로까지 이어질 수 있다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p.13]에서 볼 수 있다.
용어 "시토킨"은 세포간 매개자로서 다른 세포 집단에 대해 작용하는 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 관용어이다. 상기 시토킨의 예는 림포킨, 모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토킨에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 전구인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 형성 호르몬 (LH); 간 성장인자; 섬유모세포 성장인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; ; 림프독소-α 및 -β, 뮬러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-회합 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판-성장인자; 전환 성장인자 (TGF), 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-16, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-α 또는 TNF-β; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 시토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양액으로부터의 단백질 및 천연 서열 시토킨의 생물학적 활성 균등물을 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "염증 세포"는 염증 반응을 향상시키는 세포, 예를 들어 단핵 세포, 호산구, 대식세포, 및 다형핵 호중구 (PMN)를 나타낸다.
II . 본 발명의 조성물 및 방법
A. 항-미생물 폴리펩티드 (AMP) 및 그의 조정인자
본 발명의 항-미생물 폴리펩티드 (AMP)는 미생물 병원체에 대한 항-미생물 면역반응을 매개하거나 다른 방식으로 영향을 주는 폴리펩티드이다. 본 발명의 AMP는 LT, IL-6, IL-22, IL-23 (예를 들어, IL-23 p19 또는 IL-23 p40 포함), 및 Reg 수퍼패밀리의 유전자에 의해 코딩되는 Reg 또는 Reg-관련 단백질을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. Reg 수퍼패밀리는 인간, 래트, 및 마우스로부터의 Reg 및 Reg-관련 유전자를 포함하고, 4개의 하위클래스, 즉 타입 I, II, III, 및 IV로 분류된다. 예를 들어, 타입 I은 인간 REG Iα, 인간 REG Iβ, 래트 RegI, 및 마우스 RegI을 포함하고; 타입 II는 마우스 RegII를 포함하고; 타입 III은 인간 REG III, 인간 HIP/PAP (간세포 암종-장-췌장에서 발현되는 유전자/췌장염-연관 단백질을 코딩하는 유전자), 래트 PAP/펩티드23, 래트 RegIII/PAPII, 래트 PAP III, 마우스 RegIIIα, RegIIIβ, RegIIIγ, 마우스 RegIIIδ, 및 햄스터 INGAP (소도 신생-연관 단백질)를 포함한다. 타입 IV는 인간 REG IV를 함유한다. 추가로, 인간 Reg-관련 서열 (RS)은 위유전자로 보고된 서열이다. 한 실시태양에서, REG 단백질은 REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III, REG IV, 및 Reg-관련 서열 (RS)을 포함하고 이로 제한되지 않는 인간 REG 유전자 패밀리의 멤버에 의해 코딩된다.
일부 측면에서, 본 발명의 AMP의 아미노산 서열은 다음 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다: 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 서열 18, 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42, 서열 44, 서열 46, 서열 48, 서열 50, 서열 52, 서열 54, 및 서열 56.
다른 측면에서, 본 발명의 AMP를 코딩하는 핵산 서열은 다음 군 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함한다: 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 15, 서열 17, 서열 19, 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 47, 서열 49, 서열 51, 서열 53, 및 서열 55.
본 발명의 AMP의 활성은 또다른 AMP 또는 동일한 AMP의 활성에 비해 증가 또는 감소 및/또는 차별적으로 조절될 수 있다. 본 발명의 AMP의 활성의 예는 AMP 발현, 신호 전달, 결합 파트너에 대한 결합, 항-미생물 활성, 또는 그의 다른 생물학적 또는 면역학적 활성을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 본 발명의 AMP의 활성의 증가는 대상에서 항-미생물 면역반응을 향상시키거나 유도한다.
한 실시태양에서, 본 발명의 AMP는 IL-22와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 폴리펩티드, 예를 들어 미생물 병원체 (예를 들어, 세균 또는 바이러스)에 의한 감염에 대한 숙주 저항성을 매개하는 IL-22 신호 전달 경로의 상류 또는 하류에 위치하는 폴리펩티드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 AMP의 예는 LT, IL-6, IL-18, 및 IL-23 (예를 들어, IL-23 p19 또는 IL-23 p40 포함)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 조정인자는 AMP의 활성을 직접 또는 간접적으로 조정하는 폴리펩티드 및 핵산 분자 (예를 들어, DNA 분자 또는 RNA 분자)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 조정의 예는 본 발명의 AMP의 활성의 증가, 감소, 유도 또는 활성화, 억제, 또는 조절 (예를 들어, 상향 또는 하향 조절)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 조정인자는 IL-22 결합 단백질 (BP) 활성을 감소시키거나 억제하여 IL-22 활성을 증가시킴으로써 IL-22 활성을 간접적으로 조정한다. 추가의 실시태양에서, 조정인자는 IL-22 BP의 IL-22에 대한 결합을 감소시키거나 억제하여 IL-22 활성을 증가시킨다.
일부 실시태양에서, 조정인자는 폴리펩티드, 예를 들어 AMP에 결합하거나 다른 방식으로 상호작용하여 AMP의 활성을 증가, 유도 또는 조절하는 폴리펩티드이다. 한 실시태양에서, 조정인자는 AMP의 활성을 조정하는 융합 폴리펩티드이다.
한 실시태양에서, 조정인자는 AMP에 결합하는 항체이다. 특정 실시태양에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 다른 실시태양에서, 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편으로부터 선택되는 항체 단편이다. 다른 실시태양에서, 항체는 융합 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 융합 폴리펩티드)이다. 다른 실시태양에서, 항체는 키메라 항체이다. 특정 실시태양에서, 항체는 인간화 항체이다. 다른 실시태양에서, 항체는 인간 항체이다. 다른 실시태양에서, 항체는 인간, 비-인간 영장류, 또는 다른 포유동물 (예를 들어, 돼지, 양, 토끼, 마멋, 래트, 또는 마우스)로부터 선택되는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시태양에서, 항체는 AMP 효능제이다.
특정 실시태양에서, 조정인자는 재조합 AMP 또는 AMP를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)이다.
다른 특정 실시태양에서, 조정인자는 세포에서 발현될 수 있는 재조합 AMP 또는 AMP를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)이다.
본 발명의 AMP는 천연 전장 또는 성숙 AMP 및 그의 변이체를 포함한다. AMP 변이체는 AMP를 코딩하는 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변경을 도입하고/하거나 목적하는 항-미생물 폴리펩티드의 합성에 의해 제조될 수 있다. 당업자는 아미노산 변경이 본 발명의 폴리펩티드의 번역후 프로세싱의 변경, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 막 고정 특성의 변경을 야기할 수 있음을 이해할 것이다.
천연 AMP 또는 본원에서 설명되는 AMP의 다양한 도메인 내의 변이는 예를 들어 임의의 기술 및 예를 들어 미국 특허 5,364,934에 제시된 보존적 및 비-보존적 돌연변이에 대한 가이드라인을 사용하여 발생시킬 수 있다. 변이는 천연 서열 AMP에 비해 AMP의 아미노산 서열을 변경시키는, AMP를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 목적하는 AMP의 하나 이상의 도메인에서 적어도 하나의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 어느 아미노산 잔기가 목적하는 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정할 때의 지침은 AMP의 서열을 공지의 상동성 단백질 분자와 비교하고 높은 상동성 구역에서 이루어지는 아미노산 서열 변경의 수를 최소화함으로써 제시될 수 있다. 아미노산 치환은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 교체, 예를 들어 류신을 세린으로의 교체, 즉, 보존적 아미노산 교체의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에 걸칠 수 있다. 허용되는 변이는 서열에 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 생성되는 변이체를 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 제시되는 활성에 대해 시험함으로써 결정할 수 있다.
특정 실시태양에서, 목적하는 보존적 치환은 바람직한 치환의 표제 하에 표 3에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변경시키면, 하기 표 3에 예시적인 치환으로 명명된 또는 아미노산 종류에 대해 아래에서 상세히 설명하는 보다 큰 변화가 도입되고, 생성물을 스크리닝할 수 있다.
Figure 112010036081610-pct00001
AMP 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 생물학적 특성의 실질적인 변형은, (a) 치환 영역 내 폴리펩티드 백본의 구조, 예를 들어 시트 또는 나선 입체형태, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크성 (bulk)을 유지하는 것에 미치는 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음 군으로 분류할 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 상기 종류의 하나의 멤버를 다른 종류와 교환하는 것을 수반할 것이다. 상기 치환된 잔기는 보존적 치환 부위에 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비-보존된) 부위 내에도 도입될 수 있다.
변이는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 올리고뉴클레오티드-매개 (부위 지정) 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이 유발을 사용하여 달성할 수 있다. 부위 지정 돌연변이 유발 ([Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)]; [Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)]), 카세트 돌연변이 유발 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 대해 수행하여 변이체 AMP를 코딩하는 DNA를 생산할 수 있다.
본 발명의 AMP 또는 다른 폴리펩티드의 단편도 본원에서 제공된다. 상기 단편은 N-말단 또는 C-말단에서 말단 절단될 수 있거나, 또는 예를 들어 전장 천연 단백질에 비해 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정 단편은 본 발명의 AMP 또는 폴리펩티드의 목적하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여된다. 따라서, 특정 실시태양에서, 본 발명의 AMP 또는 다른 폴리펩티드의 단편은 생물학상 활성이다. 특정 실시태양에서, 전장 AMP의 단편은 N-말단 신호 펩티드 서열이 결여된다. 특정 실시태양에서, 전장 AMP의 단편은 막-결합된 AMP의 가용형이다. 예를 들어, AMP의 가용형은 막횡단 도메인의 전부 또는 실질적인 부분이 결여될 수 있다.
본 발명의 AMP 또는 다른 폴리펩티드의 공유 변형이 본 발명의 범위에 포함된다. 한 종류의 공유 변형은 본 발명의 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기와, 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제의 반응을 포함한다. 2관능성 물질을 사용한 유도체화는 예를 들어 항체 정제에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 상기 폴리펩티드를 가교결합시키는데, 및 그 반대로 적용하는데 유용하다. 흔히 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산을 갖는 에스테르, 동종2관능성 이미도에스테르, 예를 들어 디숙신이미딜 에스테르, 예를 들어 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 2관능성 말레이미드, 예를 들어 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드의 다른 종류의 공유 변형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변경을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 본 발명의 목적을 위해, 본 발명의 폴리펩티드의 천연 서열에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 삭제 (근원적인 글리코실화 부위의 제거 또는 화학적 및/또는 효소적 수단에 의한 글리코실화의 제거에 의해), 및/또는 폴리펩티드의 천연 서열에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미하고자 한 것이다. 또한, 이 구문은 천연 단백질의 글리코실화의 정성적 변화, 존재하는 다양한 탄수화물 모이어티의 특성 및 비율의 변화를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다. 한 실시태양에서, 키메라 분자는 항-태그 항체가 그에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 폴리펩티드의 상기 에피토프-태깅된 (tagged) 형태의 존재는 태깅된 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공함으로써 에피토프 태그에 결합하는 항-태그 항체 또는 다른 종류의 친화도 매트릭스를 사용하는 친화도 정제에 의해 AMP를 쉽게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 그의 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering. 3(6):547-553 (1990)]를 포함한다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science. 255:192-194 (1992)]; α-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]를 포함한다.
다른 실시태양에서, 키메라 분자는 본 발명의 폴리펩티드와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 구역의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태 ("면역어드헤신"으로도 불림)의 경우, 상기 융합체는 IgG 분자의 Fc 구역을 포함할 수 있다. Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 구역 대신에 본 발명의 폴리펩티드 (예를 들어, AMP 또는 그의 폴리펩티드 조정인자)의 가용형을 사용하는 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 면역글로불린 융합체는 힌지, IgG1 분자의 CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 구역을 포함한다. 면역글로불린 융합체의 생산에 대해서는, 또한 1995년 6월 27일 등록된 미국 특허 5,428,130을 참조한다.
1. 폴리펩티드의 제조
본 발명의 폴리펩티드는 통상적인 재조합 방법에 의해, 예를 들어 AMP 또는 그의 폴리펩티드 조정인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포의 배양에 의해 제조될 수 있다. 임의의 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 예를 들어, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이, 또는 효모일 수 있다. 본원에서 설명되는 임의의 폴리펩티드를 생산하는 방법이 추가로 제공되고, 이는 숙주 세포를 목적하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고 세포 배양액으로부터 목적하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 본원에서 설명되는 임의의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 상기 키메라 분자의 예는 면역글로불린의 에피토프 태그 서열 또는 Fc 구역에 융합된 본원에서 설명되는 임의의 폴리펩티드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위해 당업계에 공지된 다른 방법도 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 그의 일부를 코딩하는 서열은 고상 기술을 이용한 직접 펩티드 합성 (예를 들어, [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)]; [Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)] 참조)에 의해 생산될 수 있다. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화 기술에 의해 수행할 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems; 미국 캘리포니아주 포스터 시티) 펩티드 합성기를 제조사의 지시에 따라 사용하여 달성할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 다양한 부분은 별개로 화학적으로 합성되고, 전장 폴리펩티드 또는 그의 일부를 생산하기 위해 화학적 또는 효소에 의한 방법을 사용하여 조합될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현된 폴리펩티드는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 다음 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 이온 교환 컬럼 상의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱 (chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, Sephadex G-75를 사용한 겔 여과; 오염물, 예를 들어 Ig를 제거하기 위해 단백질 A 세파로스 (Sepharose) 컬럼; 및 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프-태깅된 형태에 결합하는 금속 킬레이팅 컬럼. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있고, 상기 방법은 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)]; [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springcr-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 생산 방법의 특성 및 생산되는 특정 폴리펩티드에 따라 결정될 것이다. LT 폴리펩티드는 태깅된 LT 폴리펩티드, 예를 들어 LTα-태깅된 폴리펩티드 (서열 61)을 발현시킴으로써 정제될 수 있다.
2. 유전자 발현의 검출
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현은 당업계에서 다양한 방법에 의해, 예를 들어 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 발현을 검출함으로써 검출될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드의 유전자 발현을 검출함으로써, 예를 들어 상기 유전자를 발현하는 조직을 확인할 수 있다. 유전자 발현은 당업계에 공지된 특정 방법, 예를 들어 노던 블로팅 (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]); 정량적 PCR; 또는 본원에서 제공되는 서열을 기초로 한 적절하게 표지된 프로브를 사용한 계내 혼성화를 사용하여 측정될 수 있다. 별법으로, 유전자 발현은 면역학적 방법, 예를 들어 조직 절편의 면역조직화학적 염색 및 유전자 산물의 직접 발현을 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정될 수 있다. 샘플 유체의 면역조직화학적 염색 및/또는 분석에 유용한 항체는 본원에서 제공되는 임의의 항체를 포함한다. 편리하게는, 항체는 예를 들어 본 발명의 AMP를 코딩하는 천연 서열에 대해; AMP 서열의 단편을 포함하는 합성 펩티드에 대해; 또는 AMP 폴리펩티드 또는 그의 단편 (합성 펩티드 포함)에 융합된 외인성 서열에 대해 제조될 수 있다.
B. 항체
상기한 또는 아래에서 설명되는 임의의 폴리펩티드에 결합하는 항체가 제공된다. 한 실시태양에서, 본 발명의 AMP에 결합하여 AMP 활성을 조정하는, 예를 들어 AMP의 활성을 증가시키는 단리된 항체가 제공된다. 예시적인 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 인간, 이중특이적, 및 이종컨쥬게이트 (heteroconjugate) 항체를 포함한다. 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편일 수 있다. 한 실시태양에서, IL-22에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 하나의 상기 실시태양에서, 항체는 본 발명의 AMP의 활성을 부분적으로 또는 완전히 증가시킨다.
본 발명의 AMP에 결합하는 예시적인 모노클로날 항체가 본원에서 설명된다. 이들 항체는 3F11.3 ("3F11"), 11H4.4 ("11H4"), 및 8E11.9 ("8E11")로 지정된 항-IL-22 항체, 및 7E9.10.8 ("7E9"), 8A12.32 ("8A12"), 8H11.32.28 ("8H11"), 및 12H5로 지정된 항-IL-22R 항체를 포함한다. 한 실시태양에서, 임의의 상기 항체를 생산하는 하이브리도마가 제공된다. 한 실시태양에서, IL-22에 대한 결합을 위해 3F11.3, 11H4.4, 또는 8E11.9와 경쟁하는 모노클로날 항체가 제공된다. 다른 실시태양에서, 3F11.3, 11H4.4, 또는 8E11.9와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체가 제공된다. 다른 실시태양에서, IL-22R에 대한 결합을 위해 7E9, 8A12, 8H11, 또는 12H5와 경쟁하는 모노클로날 항체가 제공된다. 한 실시태양에서, 7E9, 8A12, 8H11, 또는 12H5와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체가 제공된다. 항체의 다양한 실시태양을 아래에 제시한다:
1. 폴리클로날 항체
항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 면역화제 및 필요한 경우 어쥬번트의 1회 이상의 주사에 의해 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및/또는 어쥬번트는 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에게 주사될 것이다. 면역화제는 목적하는 폴리펩티드, 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성인 것으로 알려진 단백질에 면역화제를 컨쥬게이팅시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 어쥬번트의 예는 프로인트 (Freund) 완전 어쥬번트 및 MPL-TDM 어쥬번트 (모노포스포릴 리피드 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험을 실시하지 않으면서 당업자에 의해 선택될 수 있다.
2. 모노클로날 항체
항체는 별법으로 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화제로 면역화된다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 일반적으로 목적하는 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 요구될 경우 말초혈 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유동물 공급원이 요구될 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불사화 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불사화 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 대체로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 불사화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마의 배양 배지는 일반적으로 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)를 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
바람직한 불사화 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하고, 배지, 예를 들어 HAT 배지에 민감한 세포이다. 보다 바람직한 불사화 세포주는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 매나서스)로부터 얻을 수 있는 쥐 골수종 주이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 ([Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]).
이어서, 하이브리도마 세포를 배양하는 배양 배지를 목적하는 폴리펩티드에 결합하는 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사 면역 측정법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정한다. 상기 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)].
목적하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 하위클로닝하고 표준 방법 (Goding, 상기 문헌)으로 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배지는 예를 들어 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
하위클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제될 수 있다.
모노클로날 항체는 목적하는 활성(들)을 갖는 항체를 스크리닝하기 위해 조합 라이브러리를 사용함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특징을 갖는 항체에 대하여 상기 라이브러리를 스크리닝하는 각종 방법이 당업계에 공지되어 있다. 그러한 방법은 일반적으로 문헌 [Hoogenboom et al. (2001) in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ)]에 기재되어 있고, 특정 실시태양에서는 문헌 [Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1073-1093]에 기재되어 있다.
원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 코트 단백질에 융합된 항체 가변 구역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 상기 파지 라이브러리는 목적하는 항원에 대하여 친화도 크로마토그래피에 의해 패닝 (panning)된다. 목적하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되어, 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론은 항원으로부터 용출되고, 추가의 사이클의 항원 흡착/용출에 의해 더욱 농축될 수 있다. 본 발명의 임의의 항체는 목적하는 파지 클론에 대해 선택하기 위해 적합한 항원 스크리닝 과정을 설계한 후, 목적하는 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 설명된 적합한 불변 구역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항체 클론을 구성함으로써 얻을 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열을 결정한다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 삽입되고, 이 벡터는 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성하기 위해, 본래 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 형질감염시킨다. 또한, DNA는 예를 들어 상동성 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열을 치환시키거나 (미국 특허 4,816,567; Morrison et al., 상기 문헌), 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드가 본 발명의 항체의 불변 도메인을 대신하거나, 본 발명의 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대신하여 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.
3. 1가 항체
또한, 1가 항체가 제공된다. 1가 항체의 제조 방법도 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄는 중쇄 가교결합을 방지하기 위해서 일반적으로 Fc 구역의 임의의 지점에서 말단 절단된다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 다른 아미노산 잔기로 대체되거나 결실되어 가교결합을 방지한다.
1가 항체를 제조하기 위해 시험관내 방법도 적합하다. 그의 단편, 특히 Fab 단편을 생산하기 위한 항체의 소화는 당업계에 공지된 일상적인 기술을 사용하여 달성할 수 있다.
4. 항체 단편
항체 단편이 제공된다. 항체 단편은 전통적인 수단, 예를 들어 효소 소화, 재조합 기술에 의해 생성할 수 있다. 특정 상황에서는, 온전한 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 보다 작은 크기의 단편은 신속한 소실을 가능하게 하고, 충실성 종양에 대한 접근성을 개선시킬 수 있다. 특정 항체 단편의 검토에 대해서는 문헌 [Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134]을 참조한다.
항체 단편 생산을 위해 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 상기 단편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 ([Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]) 참조). 그러나, 상기 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되고 이로부터 분비되어 다량의 상기 단편을 쉽게 생산하게 할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의한 바와 같이 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 다른 방법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접 단리될 수 있다. 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편이 미국 특허 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 실시태양에서, 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185; 미국 특허 5,571,894; 및 미국 특허 5,587,458 참조). Fv 및 sFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이고, 따라서 생체내 사용 동안 비특이적 결합의 감소에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 효과기 단백질의 융합체를 생성시키도록 제조될 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌]을 참조한다. 또한, 항체 단편은 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
5. 인간화 항체
인간화 항체가 제공된다. 비-인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그에 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 일반적으로 "도입 (import)" 가변 도메인으로부터 취한 "도입" 잔기로서 종종 언급된다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 및 공동연구자의 방법 ([Jones et al. (1986) Nature, 321: 522-525], [Riechmann et al. (1988) Nature, 332: 323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science, 239: 1534-1536])을 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 상응하는 서열로 대체된 키메라 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성 감소를 위해 중요할 수 있다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 것과 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체의 인간 프레임워크로서 허용된다 ([Sims et al. (1993) J. Immunol., 151:2296]; [Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol., 196:901]). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위집단의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 복수개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 ([Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]).
항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 일반적으로 더욱 바람직하다. 이를 달성하기 위해서, 한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모서열 및 상이한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 그려 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 조사를 통해 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련이 있다.
6. 인간 항체
인간 항체가 또한 제공된다. 인간 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기한 바와 같이 공지의 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 제조할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 예를 들어 문헌 ([Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984)], [Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)])에 기재되어 있다.
면역화시에, 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어 마우스)를 생산하는 것이 또한 가능해 졌다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다고 기재되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스에서 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 시험 접종시에 인간 항체를 생성시킬 것이다. 예를 들어, 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255 (1993)] 및 [Bruggermann et al., Year in Immunol, 7: 33 (1993)])을 참조한다.
또한, 유전자 셔플링을 사용하여 비-인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도할 수 있고, 여기서 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅 (imprinting)"으로도 불리는 상기 방법에 따라, 상기한 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 얻은 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 비-인간 사슬/인간 사슬 scFv 또는 Fab 키메라의 집단을 생성시킨다. 항원으로 선택하면, 비-인간 사슬/인간 사슬 키메라 scFv 또는 Fab가 단리되는데, 이때 인간 사슬이 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 사슬의 제거시에 파괴되는 항원 결합 부위를 복구한다 - 즉, 에피토프가 인간 사슬 파트너 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 나머지 비-인간 사슬을 대체하기 위해 상기 과정을 반복하면 인간 항체를 얻게 된다 (1993년 4월 1일 공개된 PCT WO 93/06213 참조). CDR 이식에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 상기 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전한 인간 항체를 제공한다.
7. 이중특이적 항체
또한, 이중특이적 항체가 제공된다. 이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시태양에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 특정 실시태양에서, 결합 특이성 중 하나는 목적하는 폴리펩티드에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시태양에서, 이중특이적 항체는 목적하는 폴리펩티드의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 목적하는 폴리펩티드, 예를 들어 세포 표면 폴리펩티드를 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수도 있다. 이들 항체는 TAT226-결합 아암, 및 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐과 같은 세포독성제에 결합하는 아암을 보유한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Millstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마 (quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하는데, 이 중에서 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 1993년 5월 13일 공개된 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 개시되어 있다.
상이한 방법에 따라, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 예를 들어 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 특정 실시태양에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3종의 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비율이 최적 수율을 제공하는 실시태양에서 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 높은 융통성을 제공한다. 그러나, 동일 비율의 2종 이상의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율로 일어나거나 상기 비율이 특별한 유의성을 갖지 않는 경우에는 하나의 발현 벡터 내에 2종 또는 3종의 모든 폴리펩티드 사슬의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
상기 접근법의 한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
다른 방법에 따르면, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 처리될 수 있다. 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)으로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티 (cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체 (homodimer)에 비해 이종이량체 (heterodimer)의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 바이오틴에 커플링될 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/00373 및 EP 03089) 제안되었다. 이종컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에서 기재되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서는 무손상 항체가 단백질 분해 방식으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비소산나트륨의 존재하에 환원된다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관내에서 유도 화학 커플링 반응에 적용되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발시킬 수 있었다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양액으로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 상기 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 다른 메카니즘을 제공하였다. 이 단편은 동일한 사슬 상의 두개의 도메인 사이에 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 강제로 페어링되고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 다른 제조 전략도 보고된 바 있다 ([Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)] 참조).
2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 [Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)].
8. 다가 항체
또한, 다가 항체가 제공된다. 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 빠르게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3개 이상인 (예를 들어 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고, 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이루어진다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fc 영역 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 특정 실시태양에서, 다가 항체는 3 내지 약 8개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이루어진다). 이러한 한 실시태양에서, 다가 항체는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬 (예를 들어 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 사슬을 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
9. 단일-도메인 항체
단일-도메인 항체도 제공된다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 특정 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크. (Domantis, Inc., 미국 매사추세츠주 왈탐); 예를 들어, 미국 특허 6,248,516 B1 참조). 한 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 이루어진다.
10. 항체 변이체
일부 실시태양에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구조물이 요구되는 특성을 갖는다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 최종 구조물에 가해지게 할 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조될 때 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이 유발을 위해 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불린다. 여기서, 표적 잔기들의 잔기 또는 기가 확인되고 (예, arg, asp, his, lys 및 glu과 같은 대전된 잔기), 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 주도록 중성 또는 음으로 대전된 아미노산 (예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체된다. 이어서, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 이들 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고, 발현된 면역글로불린은 목적하는 활성에 대해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어 ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합체를 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 폴리펩티드의 글리코실화는 대개 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 의미한다. 트리펩티드 서열, 즉 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄로의 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 상기 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세일갈락토스아민, 갈락토스, 또는 크실로스 중 하나가 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신도 사용될 수 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 상기 트리펩티드 서열 (N-연결 글리코실화 부위에 대해)이 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. 또한, 변형은 본래 항체의 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 결실 또는 치환에 의해 수행될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 여기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스가 결핍된 성숙 탄수화물 구조를 갖는 항체는 미국 특허 출원 공개 2003/0157108 A1 (Presta, L.)에 기재되어 있다. 또한, US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)을 참조한다. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물에 이등분 (bisecting) N-아세틸글루코스아민 (GlcNAc)을 갖는 항체는 WO 2003/011878 (Jean-Mairet 등)과 미국 특허 6,602,684 (Umana 등)에 언급되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당 내에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체는 WO 1997/30087 (Patel 등)에 보고되어 있다. 또한, Fc 영역에 부착된 변경된 탄수화물을 갖는 항체에 관하여는 WO 1998/58964 (Raju, S.)와 WO 1999/22764 (Raju, S.)를 참조한다. 또한, 변경된 글리코실화가 존재하는 항원 결합 분자에 대해서는 US 2005/0123546 (Umana et al.)을 참조한다.
특정 실시태양에서, 글리코실화 변이체는 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조에 푸코스가 결핍되어 있는 Fc 영역을 포함한다. 상기 변이체는 개선된 ADCC 기능을 갖는다. 임의로, Fc 영역은 ADCC를 추가로 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 Eu 넘버링)의 치환을 추가로 포함한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체에 관련이 있는 간행물의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; 문헌 ([Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)])을 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생산하는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 ([Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 공개 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al.), 특히 Example 11), 및 낙아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 낙아웃 CHO 세포 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]를 포함한다.
다른 종류의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항체 분자의 적어도 하나의 아미노산 잔기 대신에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이 유발을 위한 가장 흥미로운 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변형도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제하에 상기 표 3에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성의 목적하는 변경을 유도하면, 표 3에 "예시적인 치환"으로 명명된 또는 아미노산 종류에 대해 상기 상세히 설명한 보다 큰 실질적 변화가 도입되고, 생성되는 항체를 요구되는 결합 특성에 대해 스크리닝할 수 있다.
한 종류의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성되는 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 변형된 (예를 들어 개선된) 생물학적 특성을 가질 것이다. 그러한 치환 변이체를 생성하기 위한 간편한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙이다. 간단히 설명하면, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어 6-7개의 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체는 각 입자 내에 패키징된 파지 외피 단백질의 적어도 일부 (예를 들어, M13의 유전자 III 산물)에 대한 융합체로서 필라멘트상 파지 입자로부터 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 그들의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하는 스캐닝 돌연변이 유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)을 수행할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 이웃 잔기가, 본원에서 기재된 기술을 포함하여 당업계에 공지된 기술에 따른 치환에 대한 후보이다. 일단 그러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에서 기재된 기술을 포함하여 당업계에 공지된 기술을 사용하여 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조한다. 상기 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체의 Fc 영역에 1개 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 위치를 포함하여 1개 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
본원 명세서 및 선행기술의 교시 내용에 따르면, 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 야생형 상응 항체에 비해, 예를 들어 Fc 영역에 1개 이상의 변형을 포함할 수 있음이 고려된다. 그럼에도 불구하고, 상기 항체는 야생형 상응 항체에 비교할 때 치료 유용성에 필요한 실질적으로 동일한 특성을 보유할 것이다. 예를 들어, WO 99/51642에 기재된 바와 같이 변경된 (즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 야기하는 특정 변형이 Fc 영역에서 형성될 수 있다고 생각된다. 또한, Fc 영역 변이체의 다른 예에 대해서는 문헌 ([Duncan ＆ Winter Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 5,648,260; 미국 특허 5,624,821; 및 WO 94/29351)을 참고한다. WO 00/42072 (Presta) 및 WO 2004/056312 (Lowman)에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 상기 특허 공개의 내용은 본원에 참고로 구체적으로 포함된다 (또한, 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조). 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합 및 증가된 반감기를 갖는 항체는 US2005/0014934A1 (Hinton 등)에 기재되어 있다. 상기 항체는 Fc 영역의 FcRn에 대한 결합을 개선시키는 1개 이상의 치환을 그 내부에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 및 증가 또는 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 미국 특허 6,194,551 B1 및 WO 99/51642에 기재되어 있다. 상기 특허 공개의 내용은 본원에 참고로 구체적으로 포함된다. 또한, 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]도 참조한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 이종이량체화를 용이하게 하고/하거나 촉진시키는, Fc 영역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 계면에 변형을 포함하는 항체를 제공한다. 상기 변형은 제1 Fc 폴리펩티드 내에 돌출부를, 제2 Fc 폴리펩티드 내에 "캐비티"를 도입하는 것을 포함하고, 여기서 돌출부는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 복합체화를 촉진시키기 위해 캐비티 내에 위치할 수 있다. 상기 변형을 갖는 항체를 생성시키는 방법은 예를 들어 미국 특허 5,731,168에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
11. 항체 유도체
항체는 당업계에 공지되고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그의 물에서의 안정성 때문에 제조상의 잇점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있으며, 분지되거나 비분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 1개 초과의 중합체가 부착될 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 종류는 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건하에서 요법에 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려사항을 기초로 하여 결정될 수 있다.
다른 실시태양에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 컨쥬게이트가 제공된다. 한 실시태양에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)]. 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 항체는 표지되고/되거나 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 항체는 항-개별특이형 항체이다.
12. 이종컨쥬게이트 항체
이종컨쥬게이트 항체도 제공된다. 이종컨쥬게이트 항체는 2개의 공유 연결된 항체로 이루어진다. 그러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 항체는 가교결합제를 사용하는 것을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 시험관 내에서 제조할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성하여 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및 예를 들어 미국 특허 4,676,980에 개시된 것을 포함한다.
13. 효과기 기능 공학처리
예를 들어, 항체의 미생물 질환의 치료 효과를 향상시키도록 효과기 기능에 관하여 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)이 Fc 구역에 도입되어, 이 구역에서 사슬간 디술피드 결합이 형성될 수 있다. 향상된 항-미생물 활성을 갖는 동종이량체 항체는 이종2기능성 가교결합제를 사용하여 제조될 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 구역을 가져서 향상된 활성을 가질 수 있는 항체가 처리될 수 있다.
14. 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
한 실시태양에서 항체의 재조합 생산을 위해, 그를 코딩하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입시킨다. 항체를 코딩하는 DNA를 통상의 방법을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리하고 서열결정한다. 다수의 벡터가 이용될 수 있다. 벡터의 선택은 부분적으로는 사용되는 숙주 세포에 의해 결정된다. 일반적으로, 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 (일반적으로 포유동물)에서 기원한다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하여 임의의 이소형의 불변 영역이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있고, 상기 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 얻을 수 있음이 이해될 것이다.
a) 원핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생성:
(1) 벡터 제조
항체의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 생산 세포, 예를 들어 하이브리도마 세포로부터 단리되어 서열 결정될 수 있다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 일단 얻은 후에, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 원핵 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 입수가능하고 당업계에 공지된 많은 벡터를 본 발명의 목적에 이용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정 숙주 세포에 따라 결정될 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 벡터가 존재하게 되는 특정 숙주 세포와의 상용성에 따라 다양한 성분을 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보좀 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 상기 숙주와 함께 사용될 수 있다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 및 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 마킹 (marking) 서열을 포함한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 일반적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환시킨다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 함유하고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지도 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 상기 프로모터를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 카터 (Carter) 등의 미국 특허 5,648,237에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 상용성인 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 파지 벡터를 상기 숙주에 대한 형질전환 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 예를 들어 λGEM.TM.-11이 이. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있는 재조합 벡터 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2종 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 그의 발현을 조정하는 시스트론에 대해 상류 (5')에 위치하는 비번역 조절 서열이다. 원핵생물 프로모터는 전형적으로 두 종류의 프로모터, 즉 유도가능 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도가능 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 그의 제어하에 시스트론의 증가된 수준의 전사를 개시시키는 프로모터이다.
다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 매우 많은 프로모터가 공지되어 있다. 선택된 프로모터는, 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터를 둘다 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 일부 실시태양에서, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 가능하게 하기 때문에 이것이 이용된다.
원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균 (예를 들어 다른 공지의 세균 또는 파지 프로모터)에서 기능적인 다른 프로모터도 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있고, 따라서 당업자는 임의의 요구되는 제한 부위를 공급하기 위한 링커 또는 어댑터 (adaptor)를 사용하여 이들 서열을 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 작동가능하게 라이게이션시킬 수 있다 [Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269].
본 발명의 한 실시태양에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩티드의 막을 가로지른 전위 (translocation)를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 한 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내에 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택되는 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 천연인 신호 서열을 인식하여 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 발현 시스템의 두 시스트론 모두에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다.
다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있으며, 따라서 각 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄가 발현되고, 폴딩되고 조립되어 세포질 내에서 기능적 면역글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, 이. 콜라이 trxB- 균주)는 디술피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공함으로써, 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 폴딩 및 조립을 허용한다 [Proba and Pluckthun, Gene, 159:203 (1995)].
본 발명의 항체는 또한 발현된 폴리펩티드 성분의 정량적인 비율을 본 발명의 분비되고 적절하게 조립된 항체의 수율을 최대화하기 위해 조정할 수 있는 발현 시스템을 이용하여 생산될 수 있다. 이러한 조정은 적어도 부분적으로는 폴리펩티드 성분에 대한 번역 강도의 동시 조정에 의해 달성된다.
번역 강도의 조정을 위한 한 가지 기술은 미국 특허 제5,840,523호 (Simmons 등)에 개시되어 있다. 이는 시스트론 내의 번역 개시 영역 (TIR)의 변이체를 이용한다. 주어진 TIR에 대해, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체는 일정 범위의 번역 강도로 생성됨으로써, 상기 인자를 특정 사슬의 목적하는 발현 수준을 위해 조정하는 편리한 수단을 제공할 수 있다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변경시킬 수 있는 코돈 변화를 유발하는 통상적인 돌연변이 유발 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 실시태양에서, 뉴클레오티드 서열의 변경은 침묵 변경이다. TIR의 변경은 예를 들어 신호 서열의 변경과 함께 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열의 수 또는 간격의 변경을 포함할 수 있다. 돌연변이체 신호 서열을 생성하는 한 가지 방법은 신호 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 (즉, 변화가 침묵인) 코딩 서열의 시작점에서의 "코돈 뱅크 (codon bank)"의 생성이다. 이는 각각의 코돈의 제3 뉴클레오티드 위치의 변화에 의해 달성될 수 있으며, 또한 류신, 세린 및 아르기닌과 같은 일부 아미노산은 상기 뱅크를 제조하는데 있어서 복잡성을 추가할 수 있는 다수의 제1 및 제2 위치를 갖는다. 상기 돌연변이 유발 방법은 문헌 [Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 상세히 기재되어 있다.
한 실시태양에서, 각각의 시스트론에 대한 일정 범위의 TIR 강도를 갖는 벡터의 세트가 생성된다. 상기 제한된 세트는 각각의 사슬의 발현 수준뿐만 아니라 다양한 TIR 강도 조합 하에서 목적하는 항체 생성물의 수율의 비교를 제공한다. TIR 강도는 미국 특허 제5,840,523호 (Simmons 등)에 상세히 기재된 바와 같이 리포터 유전자의 발현 수준을 정량화함으로써 측정될 수 있다. 번역 강도 비교를 기초로 하여, 본 발명의 발현 벡터 구조물에 조합되도록 목적하는 개별 TIR을 선택한다.
본 발명의 항체 발현에 적합한 원핵 숙주 세포는 원시세균 및 진정세균, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 세균의 예는 에스케리치아 (Escherichia) (예를 들어 이. 콜라이), 바실러스 (Bacilli) (예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis)), 장내세균 (Enterobacteria), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 (예를 들어, 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 시겔라 (Shigella), 리조비아 (Rhizobia), 비트레오실라 (Vitreoscilla), 또는 파라코커스 (Paracoccus)를 포함한다. 한 실시태양에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 한 실시태양에서, 이. 콜라이 세포가 본 발명에서 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예로는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR (미국 특허 5,639,635)을 갖는 균주 33D3를 비롯한 균주 W3110 (문헌 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 번호 27,325) 및 그의 유도체를 들 수 있다. 다른 균주 및 그의 유도체, 예를 들어 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 비, 이. 콜라이λ 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 상기 예는 제한적이 아니라 예시적이다. 한정된 유전자형을 갖는 임의의 상기 언급된 세균의 유도체를 제작하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 세균 세포 내의 레플리콘의 복제능을 고려하여 적절한 세균을 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, 이. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종은 pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하는데 사용될 경우 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 억제제는 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
(2) 항체 생산
숙주 세포를 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양시킨다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 DNA를 원핵 숙주 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 세균 세포에 일반적으로 사용된다. 또다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 이용되는 또다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 원핵 세포를 당업계에 공지되고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예는 필수 영양 보충물이 부가된 루리아 브로쓰 (luria broth) (LB)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 구조를 기초로 하여 선택된 선별제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포를 성장시키기 위한 배지에 첨가된다.
또한, 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 보충물이, 단독으로 또는 복합 질소 공급원과 같은 또다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되어 적절한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포를 적합한 온도에서 배양한다. 특정 실시태양에서, 이. 콜라이의 성장 온도는 예를 들어 약 20℃ 내지 약 39℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 및 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 특정 실시태양에서, 이. 콜라이에 대해, pH는 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0이다.
유도가능 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용될 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건하에서 유도된다. 본 발명의 한 실시태양에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사 제어에 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도용의 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 한 실시태양에서, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, 문헌 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 구조물에 따라 다양한 다른 인듀서가 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 원형질막 공간 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 일반적으로 삼투압 충격, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 세포가 분쇄되면, 세포 파쇄물 또는 온전한 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은 예를 들어 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 별법으로, 단백질을 배양 배지 내로 옮기고, 그 안에서 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상등액을 여과하고 농축하여 생성된 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를 추가로 단리하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 검정과 같은 통상적으로 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 항체 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 (fed-batch) 발효 절차는 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 특정 실시태양에서 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 상기 발효기는 산소 및 영양물, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분배시키는 교반기 추진기를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 부피 용량으로 대략 100 리터 이하인 발효기에서의 발효를 지칭하며, 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 과정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포를 적합한 조건하에서 목적하는 밀도, 예를 들어 약 180 내지 220의 OD550으로 성장시킨 후에 개시되며, 이 단계에서 세포는 초기 정지상이다. 당업계에 공지되고 상기 기재된 바와 같이, 사용되는 벡터 구조물에 따라 다양한 인듀서를 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12 내지 50시간 동안 유도하지만, 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간이 사용될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선시키기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 적절한 조립 및 폴딩을 개선시키기 위해, Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤페론 (chaperone) 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)와 같은 샤페론 단백질을 과발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 동시에 형질전환시킬 수 있다. 샤페론 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산된 이종 단백질의 적절한 폴딩 및 가용성을 용이하게 하는 것으로 입증되었다 (문헌 [Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605]; 조지오 (Georgiou) 등의 미국 특허 6,083,715; 조지오 등의 미국 특허 6,027,888; [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105]; [Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113]; [Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210]).
발현된 이종 단백질 (특히, 단백질 분해에 감수성인 단백질)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질 분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이들의 조합물과 같은 공지된 세균 프로테아제를 코딩하는 유전자에서 유전자 돌연변이(들)를 수행하도록 변형될 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 이용가능하며, 예를 들어 문헌 ([Joly et al. (1998), 상기 문헌]; 조지오 등의 미국 특허 5,264,365; 조지오 등의 미국 특허 5,508,192; [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)])에 기재되어 있다.
한 실시태양에서, 단백질 분해 효소가 결핍되고 1종 이상의 샤페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로 사용된다.
(3) 항체 정제
한 실시태양에서, 본원에서 생산된 항체를 추가의 검정 및 사용을 위해 추가로 정제하여 실질적으로 균질한 제제를 수득한다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 다음 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 면역친화도 또는 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법, 및 예를 들어 세파덱스 (Sephadex) G-75를 이용한 겔 여과.
한 실시태양에서, 고체상 상에 고정된 단백질 A가 본 발명의 항체 생성물의 면역친화도 정제에 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고 친화도로 결합하는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로부터의 41 kD 세포벽 단백질이다 [Lindmark et al., (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]. 단백질 A가 고정되는 고체상은 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 컬럼 또는 제어된 공극 유리 컬럼 또는 규산 컬럼일 수 있다. 일부 용도에서, 컬럼을 글리세롤과 같은 시약으로 코팅하여 가능하게는 오염물의 비특이적 부착을 방지한다.
정제의 제1 단계로서, 상기 기재된 바와 같은 세포 배양액으로부터 유래된 제제를 단백질 A가 고정된 고체상에 적용하여 관심 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하게 할 수 있다. 그 후, 고체상을 세척하여 고체상에 비-특이적 결합된 오염물을 제거한다. 최종적으로, 목적하는 항체를 용출에 의해 고체상으로부터 회수한다.
b) 진핵 숙주 세포를 사용한 항체의 생성:
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 일반적으로 다음 중 하나 이상의 비제한적인 성분을 포함한다: 신호 서열, 복제 기점, 1종 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
(1) 신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 신호 서열, 또는 관심 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱된 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단된) 것일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다. 이러한 전구체 영역을 위한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임 (reading frame)으로 라이게이션된다.
(2) 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 그 이유는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다.
(3) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커로도 지칭되는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 관련이 있는 경우에는 영양요구성 결핍을 보충하거나, (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양물을 공급하는 단백질을 코딩한다.
선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선별 처리시에도 생존한다. 이러한 우세한 선별의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능 마커의 다른 예는 항체 핵산, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 섭취하는데 감응성이 있는 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, 일부 실시태양에서, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 우선 메토트렉세이트 (Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인할 수 있다. 일부 실시태양에서, 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.
별법으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또다른 선별가능 마커, 예를 들어 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 이것으로 함께 형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선별가능 마커에 대한 선별제, 예를 들어 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 미국 특허 4,965,199를 참조한다.
(4) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인식되고 관심 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 진핵 세포에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 예를 들어, 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT 풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발부로부터 70 내지 80개 염기 상류에 존재하는 또다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 특정 실시태양에서, 임의의 또는 모든 상기 서열이 진핵 발현 벡터 내에 적합하게 삽입될 수 있다.
포유동물 숙주 세포 내의 벡터로부터의 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성일 경우 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 조절될 수 있다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기점을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 사이토메갈로바이러스의 극초기 (immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 4,419,446에 기재되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터 티미딘 키나제 프로모터의 조절하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현시키는 것에 대해 기재한 문헌 [Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)]을 참조한다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스의 장쇄 말단 반복부가 프로모터로서 사용될 수도 있다.
(5) 인핸서 요소 성분
고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 (bp 100-270) 쪽의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소를 기재한 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 벡터에서 위치 5' 또는 3'에서 항체 폴리펩티드 코딩 서열로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터부터 부위 5'에 위치한다.
(6) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 수도 있다. 상기 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상 얻을 수 있다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. W0 94/11026 및 그에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
(7) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯하여 본원에 기재된 보다 고등한 진핵 세포를 포함한다. 배양 (조직 배양)시 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양으로 성장시키기 위해 하위클로닝된 293 또는 293 세포 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)]; 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니스 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위해 상기한 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양한다.
(8) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄 (Ham) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 (Dulbecco) 개질 이글 (Eagle) 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 ([Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985)에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 버퍼 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물이 또한 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
(9) 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내에서 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되면, 제1 단계로서, 입자형 파쇄물, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축할 수 있다. 단백질 분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 편리한 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 [Lindmark et al. J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 [Guss et al. EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)]. 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 아가로스일 수 있지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이.티. 베이커 (J.T. Baker), 미국 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전도 회수되는 항체에 따라 사용될 수 있다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 예를 들어 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는, 약 2.5-4.5의 pH의 용출 버퍼를 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 추가의 정제 단계에 적용될 수 있다.
일반적으로, 연구, 시험 및 임상 용도로 사용하기 위한 항체의 제조를 위한 다양한 방법은 당업계에 널리 확립되어 있으며, 상기한 방법과 일치하고/하거나 특정 관심 항체에 대해 당업자에 의해 적절한 것으로 간주된다.
C. 효능제 및 길항제
본 발명의 AMP의 효능제 및 길항제가 제공된다. 상기 AMP 조정인자는 본 발명에 포함되고, 본원에서 제시되는 미생물 질환의 치료에 유용하다.
한 실시태양에서, 본 발명의 AMP의 효능제 또는 길항제는 항체, 예를 들어 IL-22 항체 또는 항-IL-22R 항체이다. 특정 실시태양에서, 항-IL-22 항체는 IL-22와 IL-22R의 상호작용을 촉진하는 효능성 항체이다. 다른 실시태양에서, 항-IL-22 항체는 IL-22와 IL-22R의 상호작용을 완전히 또는 부분적으로 차단하는 길항성 항체이다. 특정 실시태양에서, 항-IL-22R 항체는 IL-22R의 세포외 리간드 결합 도메인에 결합한다. 예를 들어, 항-IL-22R 항체는 서열 3의 대략 아미노산 18-228로부터 발견되는 인간 IL-22R의 세포외 리간드 결합 도메인에 결합할 수 있다.
특정 실시태양에서, IL-22 효능제는, IL-22BP에 결합하고 IL-22BP의 IL-22에 대한 결합을 차단하거나 억제하여 IL-22 활성 (예를 들어, IL-22R에 대한 결합)을 유도하거나 증가시키는 항체이다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 AMP의 효능제 또는 길항제는 AMP에 결합하는 올리고펩티드이다. 한 실시태양에서, 올리고펩티드는 IL-22R의 세포외 리간드 결합 도메인에 결합한다. 올리고펩티드는 공지의 올리고펩티드 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있거나 또는 재조합 기술을 사용하여 제조하고 정제될 수 있다. 상기 올리고펩티드의 길이는 대체로 적어도 약 5개 아미노산, 별법으로 길이가 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개 아미노산이다. 상기 올리고펩티드는 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험을 수행하지 않으면서 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대해 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공개 WO 84/03506 및 WO84/03564; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol, 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]; [Lowman, H. B. et al. (1991) Biochemlstry, 30: 10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363], 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
또다른 실시태양에서, 본 발명의 AMP의 효능제 또는 길항제는 본원에서 설명되는 올리고펩티드 또는 항체 이외의 다른 AMP에 결합하는 유기 분자이다. 유기 분자는 예를 들어 소분자일 수 있다. 한 실시태양에서, 유기 분자는 IL-22R의 세포외 도메인에 결합한다. 본 발명의 AMP에 결합하는 유기 분자는 공지의 방법을 사용하여 확인되고 화학적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). 상기 유기 분자의 크기는 대체로 약 2000 달톤 미만, 별법으로 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이고, 본 발명의 AMP에 결합할 수 있는 그러한 유기 분자는 공지의 기술을 사용하여 과도한 실험을 수행하지 않으면서 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, PCT 공개 WO00/00823 및 WO00/39585 참조).
특정 실시태양에서, IL-22 효능제는, IL-22BP에 결합하고 IL-22BP의 IL-22에 대한 결합을 차단하거나 억제하여 IL-22 활성 (예를 들어, IL-22R에 대한 결합)을 유도하거나 증가시키는 유기 분자이다.
특정 실시태양에서, IL-22 길항제는 가용성 IL-22 수용체, 예를 들어 막 결합되지 않은 IL-22R의 형태이다. 상기 가용형의 IL-22R은 IL-22에 대한 결합을 위해 막-결합된 IL-22R과 경쟁할 수 있다. 특정 실시태양에서, 가용형의 IL-22R은 IL-22R의 세포외 도메인의 전부 또는 리간드 결합 부분, 예를 들어 서열 3의 아미노산 18-228을 포함하는 폴리펩티드의 전부 또는 리간드 결합 부분을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 가용형의 IL-22R에는 막횡단 도메인이 결여된다. 예를 들어, 가용형의 인간 IL-22R에는 서열 3의 대략 아미노산 229-251의 막횡단 도메인의 전부 또는 실질적인 부분이 결여될 수 있다.
IL-22에 대한 천연 발생 가용성 수용체가 보고된 바 있다 ([Dumoutier L. et al., "Cloning and characterization of IL-22 binding protein, a natural antagonist of IL-1O-related T cell-derived inducible factor/IL-22," J. Immunol. 166:7090-7095 (2001)]; 및 [Xu W. et al., "A soluble class II cytokine receptor, IL-22RA2, is a naturally occurring IL-22 antagonist," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:9511-9516 (2001)] 참조). 이 수용체는 당업계에서 다양하게 지정된 "IL-22BP" 또는 "IL-22RA2"이다. 인간 IL-22BP의 서열을 도 4에 제시한다. 본원에서 사용되는 용어 "IL-22BP" 또는 "IL-22 결합 단백질"은 달리 나타내지 않으면 임의의 척추동물 공급원, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류 (예를 들어 인간 및 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)로부터의 임의의 천연 IL-22BP를 의미한다.
또다른 실시태양에서, IL-22의 길항제는 IL-22 또는 IL-22R 유전자의 발현을 감소시키는 (즉, IL-22 또는 IL-22R 유전자의 전사 및/또는 IL-22 또는 IL-22R mRNA의 번역을 감소시키는) 안티센스 핵산이다. 특정 실시태양에서, 안티센스 핵산은 IL-22 또는 IL-22R을 코딩하는 핵산 (DNA 또는 RNA)에 결합한다. 특정 실시태양에서, 안티센스 핵산은 길이가 약 10-30개 뉴클레오티드 (두 수치 사이의 모든 값을 포함)인 올리고뉴클레오티드이다. 특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당-포스포디에스테르 백본 (또는 다른 당 연결, 예를 들어 WO 91/06629에 기재된 포스포로티오에이트 연결)을 포함하고, 상기 변형된 당-포스포디에스테르 백본은 내인성 뉴클레아제에 저항성이다. 한 실시태양에서, 안티센스 핵산은 IL-22 또는 IL-22R을 코딩하는 mRNA의 분해 및/또는 감소된 전사 또는 번역을 야기하는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 특정 실시태양에서, 안티센스 핵산은 "RNA 간섭" ("RNAi")에 의해 표적 핵산을 감소시키는 RNA이다. RNAi에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Novina et al. (2004) Nature 430: 161-164]을 참조한다. 상기 RNA는 예를 들어 짧은 간섭 RNA (siRNA) 및 microRNA로부터 유도된다. siRNA는 예를 들어 길이가 약 18-26개 뉴클레오티드인 이중 가닥 올리고리보뉴클레오티드로서 합성될 수 있다 (상기 문헌).
또다른 실시태양에서, IL-22의 효능제가 제공된다. 예시적인 효능제는 천연 IL-22 또는 IL-22R; 천연 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 보유하는 IL-22 또는 IL-22R의 단편, 변이체, 또는 변형된 형태; IL-22R에 결합하여 활성화시킬 수 있는 물질; 및 IL-22 또는 IL-22R 또는 IL-22 또는 IL-22R을 코딩하는 핵산의 과다발현을 유도하는 물질을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
D. 제약 제제
본 발명은 제약 제제를 제공한다. 한 실시태양에서, 제약 제제는 1) 활성 물질, 예를 들어, 상기한 임의의 폴리펩티드, 항체, 효능제, 또는 길항제; 및 2) 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 제약 제제는 적어도 하나의 추가의 치료제를 추가로 포함한다.
제약 제제는 목적하는 순도를 갖는 물질을 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 보관을 위해 제조한다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 이에는 버퍼, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예컨대, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.
리포펙션 (lipofection) 또는 리포좀도 물질을 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 물질이 항체 단편인 경우, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 최소 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 구역 서열을 기초로 하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자가 고안될 수 있다. 상기 펩티드는 화학적으로 합성되고/되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7889-7893 (1993)] 참조). 또한, 본원에 개시된 항체는 면역리포좀으로서 제제화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 예를 들어 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 77: 4030 (1980)]; 및 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 향상된 리포좀은 미국 특허 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 액체 조성물을 사용하는 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하도록 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 컨쥬게이팅될 수 있다. 화학요법제 (예를 들어 독소루비신)는 임의로 리포좀 내에 함유된다 (문헌 [Gabizon et al. J. National Gancer Inst. 81(19):1484 (1989)] 참조).
물질은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
물질의 지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 물질을 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 미세구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들어 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 봉입된 항체 또는 면역컨쥬게이트가 장기간 동안 신체에서 유지될 때, 이들은 37℃에서 습기에 노출될 때 변성 또는 응집되어 생물학적 활성 및 가능하게는 면역원성의 변경을 야기할 수 있다. 관련되는 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 습기 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성할 수 있다.
본원의 제약 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 2 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 2 이상의 활성 화합물을 함유하는 제약 제제는 1) IL-22의 적어도 하나의 효능제, 예를 들어 IL-22에 결합하는 항체 및/또는 IL-22R에 결합하는 항체; 및 2) IL-6 또는 IL-23에 결합하는 적어도 하나의 항체 (여기서, 2)에 나열된 임의의 수의 항체는 임의의 조합으로 선택될 수 있다)를 포함한다. 다른 실시태양에서, 제약 제제는 상보성 활성을 갖는 2 이상의 활성 화합물을 함유한다.
E. 치료 방법
본 발명은 미생물 질환의 치료 방법을 추가로 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 AMP 또는 AMP의 조정인자를 포함하는 유효량의 제약 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 미생물 질환의 치료 방법을 제공하고, 상기 AMP는 LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23, REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III, REG IV 및 Reg-관련 서열 (RS)로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 한 실시태양에서, 질환은 EHEC- 또는 EPEC-유발 설사, 염증성 장 질환 (IBD) 또는, 보다 특히, 궤양성 대장염 (UC) 및 크론병 (CD)이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 AMP 또는 AMP의 조정인자를 포함하는 유효량의 제약 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 미생물 병원체 (예를 들어, 세균 또는 바이러스)에 의한 감염의 치료 방법을 제공하고, 여기서 AMP는 LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23, REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III, REG IV 및 Reg-관련 서열 (RS)로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 세포를 AMP 또는 AMP의 조정인자와 접촉시키는 것을 포함하는, 미생물 병원체 (예를 들어, 세균 또는 바이러스)로 감염된 대상의 세포에서 AMP의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 여기서 AMP는 LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23, REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III (예를 들어, REG IIIβ 또는 REGIIIγ), REG IV 및 Reg-관련 서열 (RS)로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 대상의 세포를 AMP 또는 AMP의 조정인자를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시키는 것을 포함하는, 대상에서 미생물 질환의 치료 방법을 제공하고, 여기서 AMP는 LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23, REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III, REG IV 및 Reg-관련 서열 (RS)로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 한 실시태양에서, 질환은 EHEC- 또는 EPEC-유발 설사, 염증성 장 질환 (IBD) 또는, 보다 특히 궤양성 대장염 (UC) 또는 크론병 (CD)이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 세포를 AMP 또는 AMP의 조정인자를 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시키는 것을 포함하는, 미생물 병원체 (예를 들어, 세균 또는 바이러스)로 감염된 대상의 세포에서 AMP의 활성을 조정하는 방법을 제공하고, 여기서 AMP는 LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23, REG Iα, REG Iβ, HIP/PAP, REG III (예를 들어, REG IIIβ 또는 REGIIlγ), REG IV 및 Reg-관련 서열 (RS)로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
미생물 병원체의 예는 세균 또는 바이러스를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 미생물 병원체는 세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 세균이다. 특정 실시태양에서, 세균은 그람 음성 세균이다. 다른 실시태양에서, 세균은 부착 또는 소멸형 (A/E) 세균, 및 보다 특히 장출혈성 에스체리키아 콜라이 (EHEC) 또는 장병원성 이. 콜라이 (EPEC)이다. 한 실시태양에서, 세균은 장병원성이고, 이. 콜라이 (EHEC)는 이. 콜라이 O157:H7 또는 이. 콜라이 O55:H7이다.
본 발명의 치료 방법은 본 발명의 하나 이상의 조성물 또는 제약 제제를 포함한다. 상기 방법은 달리 나타내지 않으면 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법을 포함한다.
다양한 실시태양에서, 본 발명은 AMP-매개된 신호 전달 경로 및/또는 ThIL -17 세포 기능을 자극하거나 억제함으로써 항-미생물 면역반응을 조정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 미생물 질환의 치료에 유용하다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명은 예를 들어 AMP-매개된 신호 전달 경로, 및 IL-22 및/또는 IL-23 매개된 신호 전달 경로를 자극함으로써 항-미생물 면역반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 시토킨-매개된 신호 전달 경로를 자극하거나 억제함으로써 항-미생물 면역반응을 조정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명은 시토킨-매개된 신호 전달 경로, 예를 들어, IL-22 및/또는 IL-23 신호 전달 경로를 자극함으로써 항-미생물 면역반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 ThIL -17 세포 기능을 자극하거나 억제함으로써 항-미생물 면역반응을 조정하는 방법을 제공한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 AMP 효능제를 생물학적 시스템에 제공하는 것을 포함하는, 생물학적 시스템에서 AMP-매개된 신호 전달 경로를 자극하는 방법을 제공한다. 상기 생물학적 시스템의 예는 시험관내 세포 배양 시스템 또는 생체 내의 유기체 내의 포유동물 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 AMP 길항제를 생물학적 시스템에 제공하는 것을 포함하는, 생물학적 시스템에서 AMP-매개된 신호 전달 경로를 억제하는 방법을 제공한다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 IL-22 또는 IL-22 효능제를 생물학적 시스템에 제공하는 것을 포함하는, 생물학적 시스템에서 IL-23 및/또는 IL-22 매개된 신호 전달 경로를 자극함으로써 생물학적 시스템에서 항-미생물 면역반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, IL-22 효능제는 IL-22이다. 다른 실시태양에서, IL-22 효능제는 IL-22에 결합하는 항체이다.
다른 실시태양에서, IL-22 길항제를 생물학적 시스템에 제공하는 것을 포함하는, 생물학적 시스템에서 IL-23-매개된 신호 전달 경로를 억제하는 방법이 제공된다. 한 실시태양에서, IL-22의 길항제는 항체, 예를 들어 중화 항-IL-22 항체 및/또는 중화 항-IL-22R 항체이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 ThIL -17 세포를 IL-23 매개된 신호 전달 경로를 매개하는 AMP의 효능제 (예를 들어, IL-23, IL-6, 또는 IL-22)에 노출시키는 것을 포함하는, ThIL -17 세포 기능의 자극 방법을 제공한다. 상기 방법은 미생물 질환의 치료에 유용하다. 한 실시태양에서, IL-22 효능제는 IL-22이다. 다른 실시태양에서, IL-22 효능제는 IL-22에 결합하는 항체이다.
다른 실시태양에서, ThIL -17 세포를 IL-23 매개된 신호 전달 경로를 매개하는 AMP의 길항제 (예를 들어, IL-23, IL-6, 또는 IL-22)에 노출시키는 것을 포함하는, ThIL -17 세포 기능을 억제하는 방법이 제공된다. 한 실시태양에서, 길항제는 항-IL-22 항체, 예를 들어, 중화 항-IL-22 항체이다.
예시적인 ThIL -17 세포 기능은 세포-매개된 면역의 자극 (지연형 과민반응); 선천 면역 세포, 예를 들어 골수양 세포 (예를 들어, 단핵구 및 호중구)의 염증 부위로의 동원; 및 조직 내로의 염증 세포 침윤의 자극을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, ThIL -17 세포 기능은 IL-23 및/또는 IL-22에 의해 매개된다.
본 발명의 조성물은 공지된 방법, 예를 들어 정맥내 투여, 예를 들어 볼러스 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입, 근내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 경막내, 경구, 국소, 또는 흡입 (비내, 폐내) 경로에 따라 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 폴리펩티드 및 항체의 정맥내 또는 흡입 투여가 바람직하다.
미생물 질환의 치료 또는 심도 감소를 위해, 본 발명의 조성물의 적절한 투여량은 상기 규정된 바와 같은 치료하고자 하는 질환의 종류, 질환의 심도 및 과정, 물질이 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 기시행된 요법, 환자의 임상 병력 및 화합물에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 의해 좌우될 것이다. 화합물은 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료 기간에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다.
예를 들어, 질환의 종류 및 심도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 아니면 연속식 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 내지 20 mg/kg)의 폴리펩티드 또는 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 투여량 후보이다. 전형적인 1일 투여량 범위는 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상일 수 있다. 병태에 따라서 수일 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우에, 치료는 질환 증상이 목적하는 수준으로 억제될 때까지 지속한다. 그러나, 기타 투여 용법도 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링한다.
F. 진단 방법 및 검출 방법
한 실시태양에서, 본 발명은 항체의 AMP에 대한 결합을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 AMP에 대한 항체와 접촉시키고, 항체와 AMP 사이에 복합체가 형성되는지를 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 AMP의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상으로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플에서 AMP를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하는, 대상에서 미생물 질환의 치료를 모니터링하는 방법을 제공하고, 시험 샘플 내의 발현 수준이 검출된다. 검출은 정성적 또는 정량적 검출일 수 있다. 한 실시태양에서, 시험 샘플은 혈액 또는 혈청을 포함한다. 한 실시태양에서, AMP를 코딩하는 유전자의 발현 수준의 검출은 (a) 항-AMP 항체를 포유동물로부터 얻은 시험 샘플과 접촉시키고, (b) 시험 샘플에서 항체와 AMP 사이의 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함한다. 항체는 검출가능한 표지에 연결될 수 있다. 복합체 형성은 예를 들어 광학 현미경, 유동 세포 분석법, 형광분석법, 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 모니터링될 수 있다. 시험 샘플은 미생물 질환이 존재하는 것으로 의심되는 개체로부터 얻을 수 있다.
한 실시태양에서, AMP 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준의 검출은 유전자로부터 mRNA 전사 수준의 검출을 포함한다. mRNA 전사 수준은 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 정량적으로 또는 정성적으로 검출될 수 있다. 또한, mRNA 전사 수준은 직접 검출되거나 또는 mRNA로부터 생성된 cDNA의 수준을 검출함으로써 간접적으로 검출될 수 있다. mRNA 전사 수준을 검출하기 위한 예시적인 방법은 실시간 정량적 RT-PCR 및 혼성화-기반 분석, 예를 들어 마이크로어레이-기반 분석 및 필터-기반 분석, 예를 들어 노던 블로트를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 항체의 AMP에 대한 결합을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 AMP에 대한 항체와 접촉시키고, 항체와 AMP 사이에 복합체가 형성되는지를 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 AMP의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 적합한 포장물 내에 항-AMP 항체를 함유하는 진단 키트에 관한 것이다. 키트는 바람직하게는 AMP 검출을 위해 항체를 사용하는 설명서를 포함한다. 한 실시태양에서, 진단 키트는 미생물 질환을 진단하기 위한 것이다. 한 실시태양에서, 진단 키트는 미생물 감염을 진단하기 위한 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 AMP 및/또는 그의 조정인자를 포함하는 키트를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 각각 본 발명의 AMP 또는 그의 조정인자를 포함하는 하나 이상의 제약 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
G. 분석
1. 세포 기반 분석 및 동물 모델
면역 질병에 대한 세포 기반 분석 및 동물 모델이 본 발명의 특정 실시태양의 실시에 유용하다. 하기 실시예에서 제시되는 특정 세포 기반 분석은 예를 들어 IL-22 길항제 또는 효능제의 효능 시험에 유용하다.
또한, 생체내 동물 모델도 본 발명의 특정 실시태양의 실시에 유용하다. 예시적인 동물 모델도 하기 실시예에서 설명된다. 상기 모델의 생체내 특성을 통해 인간 환자에서 반응을 예측할 수 있다. 면역 관련 질병의 동물 모델은 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물을 모두 포함한다. 비-재조합 동물 모델은 예를 들어 설치류, 예를 들어, 쥐 모델을 포함한다. 상기 모델은 표준 기술, 예를 들어, 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신장 피막하 이식 등을 사용하여 동계 (syngeneic) 마우스 내로 세포를 도입함으로써 생성시킬 수 있다.
이식편 대 숙주병 모델은 MHC 항원 및 작은 이식 항원에 대한 T 세포 반응성을 평가하기 위한 수단을 제공한다. 이식편 대 숙주병은 면역적격 (immunocompetent) 세포가 면역억제 또는 관용성 환자 내로 이식될 때 발생한다. 공여 세포는 숙주 항원을 인식하고 반응한다. 반응은 치명적인 심한 염증으로부터 경증의 설사 및 체중 감소까지 상이할 수 있다. 이식편 대 숙주병을 평가하기 적합한 절차는 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기, unit 4.3]에 기재되어 있다.
피부 동종이식 거부에 대한 동물 모델은 생체내 조직 파괴를 매개하는 T 세포의 능력을 시험하는 수단 및 이식 거부에서의 그의 역할의 척도이다. 가장 통상적인 허용되는 모델은 쥐 꼬리-피부 이식편을 이용한다. 반복된 실험은 피부 동종이식 거부가 항체가 아니라 T 세포, 헬퍼 T 세포 및 킬러-효과기 T 세포에 의해 매개됨을 보여주었다 (Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992). 적합한 절차는 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기, unit 4.4]에 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 화합물을 시험하기 위해 사용될 수 있는 다른 이식 거부 모델은 문헌 [Tanabe, M. et al., Transplantation (1994) 58:23] 및 [Tinubu, S. A. et al., J. Immunol. (1994) 4330-4338]에 기재된 동종이형 심장 이식 모델이다.
접촉 과민반응은 세포 매개된 면역 기능에 대한 간단한 생체내 분석이다 (지연형 과민반응). 이 절차에서, 지연형 과민반응 반응을 야기하는 외인성 합텐 (hapten)에 대한 피부 노출이 측정 및 정량된다. 접촉 민감성은 초기 감작기 (sensitizing phase) 및 유발기 (elicitation phase)를 수반한다. 유발기는 T 림프구가 이전에 접촉한 바 있는 항원을 만날 때 발생한다. 부종 및 염증이 발생하고, 이 때문에 상기 모델은 인간 알레르기 접촉성 피부염의 우수한 모델이 된다. 적합한 절차는 문헌 [Current Protocols in Immunology, Eds. J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., 1994, unit 4.2]에 상세히 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Grabbe, S. and Schwarz, T, Immim. Today 19(1): 37-44 (1998)]을 참조한다.
추가로, 본 발명의 조성물은 건선-유사 질병의 동물 모델에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 마우스가 병리조직학적 피부 병변 유사 건선을 보이는, 문헌 [Schon, M. P. et al., Nat. Med. (1997) 3:183]에 기재된 scid/scid 마우스 모델에서 시험될 수 있다. 다른 적합한 모델은 문헌 [Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Path. (1995) 146:580]에 기재된 바와 같이 제조된 인간 피부/scid 마우스 키메라이다. 다른 적합한 모델은 인간 예비건선 (prepsoriatic) 피부를 AGR129 마우스에 이식하여 건선 피부 병변을 발생시킨 문헌 [Boyman et al., J. Exp Med. (2004) 199(5):731-6]에 기재되어 있다.
본원에서 확인된 폴리펩티드를 코딩하는 결함 또는 변경된 유전자를 갖는 낙아웃 동물은 그 유전자가 변경되는, 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 DNA 분자 사이의 상동성 재조합의 결과로서 제조할 수 있다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 확립된 기술에 따라 그 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하기 위해 사용할 수 있다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나 다른 유전자, 예를 들어 통합을 모니터링하기 위해 사용될 수 있는 선택가능 마커를 코딩하는 유전자로 대체될 수 있다. 일반적으로, 수 kb의 비변경된 측면 (flanking) DNA (5' 및 3' 말단 모두의)가 벡터에 포함된다 [예를 들어, 상동성 재조합 벡터의 설명에 대해서는 문헌 [Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)] 참조]. 벡터는 배아 줄기 세포주 (예를 들어, 전기천공에 의해) 내로 도입되고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동성 재조합되는 세포가 선택된다 [예를 들어, 문헌 [Li et al., Cell, 69:915 (1992)] 참조]. 이어서, 선택된 세포는 응집 키메라를 형성하기 위해서 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 포배 내로 주사된다 (예를 들어, 문헌 [Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152] 참조). 이어서, 키메라 배아를 적합한 위임신 (pseudopregnant) 암컷 대리모 동물 내로 착상시키고, 배아를 출산하여 "낙아웃" 동물을 생성시킬 수 있다. 그의 생식 세포에 상동성 재조합된 DNA를 보유하는 자손체는 표준 기술에 의해 확인되고, 동물의 모든 세포가 상동성 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 번식시키기 위해 사용될 수 있다. 낙아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 상태 및 폴리펩티드의 부재로 인한 그들의 병리학적 상태의 발병에 대해 방어하는 그의 능력에 대해 특성화될 수 있다.
2. 약물 후보에 대한 스크리닝 분석
약물 후보에 대한 스크리닝 분석은 본원에서 확인된 폴리펩티드 또는 그의 생물학상 활성 단편에 결합하거나 이와 복합체를 형성하거나, 또는 폴리펩티드와 다른 세포 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하기 위해 고안된다. 상기 스크리닝 분석은 화학물질 라이브러리의 고효율 (high-throughput) 스크리닝이 가능하여 소분자 약물 후보 확인에 특히 적합한 분석을 포함할 것이다. 고려되는 소분자는 합성 유기 또는 무기 화합물, 예를 들어 펩티드, 바람직하게는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-면역글로불린 융합체, 및 특히 항체, 예를 들어 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-개별특이형 항체, 및 상기 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화 형태, 및 인간 항체 및 항체 단편 (이로 제한되지 않음)을 포함한다. 분석은 당업계에 잘 특성이 결정된 다양한 방식, 예를 들어 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포 기반 분석으로 수행될 수 있다. 모든 분석은 폴리펩티드가 시험 화합물과 상호작용하도록 허용하는 조건 하에서 충분한 시간 동안 시험 화합물을 본원에서 확인된 폴리펩티드와 접촉시킬 것을 필요로 한다는 점에서 공통적이다.
결합 분석에서, 상호작용은 결합이고, 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 단리 또는 검출될 수 있다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드 또는 시험 화합물은 공유 또는 비-공유 부착에 의해 고상, 예를 들어 미량적정판 상에 고정된다. 비-공유 부착은 일반적으로 폴리펩티드 또는 시험 화합물의 용액으로 고체 표면을 코팅하고 건조시킴으로써 달성된다. 별법으로, 폴리펩티드에 특이적인 고정된 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체를 사용하여 폴리펩티드를 고체 표면에 고정시킬 수 있다. 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비-고정된 성분을 고정된 성분, 예를 들어 고정된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 수행된다. 반응이 완료될 때, 비-반응된 성분은 예를 들어 세척에 의해 제거되고, 고체 표면 상에 고정된 복합체가 검출된다. 본래 비-고정된 성분이 검출가능한 표지를 보유하는 경우에, 표면에 고정된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 나타낸다. 본래 비-고정된 성분이 표지를 보유하지 않을 경우에, 복합체 형성은 예를 들어 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
시험 화합물이 본원에서 확인된 특정 폴리펩티드와 상호작용하지만 결합하지는 않는 경우, 그의 단백질과의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용의 검출을 위해 당업계에 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다. 상기 분석은 전통적인 방법, 예를 들어 가교결합, 동시-면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시-정제를 포함한다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)]에 개시된 바와 같이 문헌 [Fields and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989)]; [Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)]에 기재된 효모-기반 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성제, 예를 들어 효모 GAL4는 2개의 물리적으로 분리된 모듈형 도메인으로 구성되고, 상기 도메인 중의 하나는 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 다른 하나는 전사 활성화 도메인으로 기능한다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현 시스템 (일반적으로 "이중 하이브리드 (two-hybrid) 시스템"으로 불림)은 상기 특성을 이용하고, 2개의 하이브리드 단백질을 사용하며, 여기서 한 단백질에서 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합되고, 다른 단백질에서는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 융합된다. GAL4-활성화된 프로모터의 조절 하에서의 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 의해 결정된다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질을 사용하여 검출된다. 이중 하이브리드 기술을 사용하여 두 특이적인 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전한 키트 (MATCHMAKER™)는 클론테크 (Clontech)로부터 상업적으로 이용가능하다. 또한, 상기 시스템은 특정 단백질 상호작용에 관련되는 단백질 도메인의 매핑 (mapping) 및 이들 상호작용에 중요한 아미노산 잔기 위치의 정확한 제시로까지 확장될 수 있다.
본원에서 확인된 폴리펩티드 및 다른 세포내 또는 세포외 성분(들)의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하기 위해서, 폴리펩티드와 성분의 상호작용을 허용하는 조건 하에서 폴리펩티드 및 성분을 함유하는 반응 혼합물을 제조할 수 있다. 시험 화합물이 상호작용을 억제하는 능력을 시험하기 위해서, 반응 혼합물을 시험 화합물의 부재 및 존재 하에 제조한다. 시험 화합물의 존재 하에서 폴리펩티드와 성분의 상호작용이 감소하면, 시험 화합물은 폴리펩티드와 성분의 상호작용을 억제하는 것으로 언급된다.
특정 실시태양에서, AMP의 효능제 또는 길항제를 확인하는 방법은 AMP를 후보 효능제 또는 길항제 분자와 접촉시키고, AMP와 정상적으로 연관되는 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함한다. 상기 활성은 하기 실시예에서 설명되는 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
한 실시태양에서, 본 발명은 IL-22 폴리펩티드를 후보 효능제 분자와 접촉시키고, IL-22 폴리펩티드와 정상적으로 연관되는 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함하는, IL-22 폴리펩티드의 효능제를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 활성은 하기 실시예에서 설명되는 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
3. 항체 결합 분석
항체 결합 연구는 임의의 공지의 분석 방법, 예를 들어 경쟁 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석으로 수행될 수 있다 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).
경쟁 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하기 위해 시험 샘플 분석물과 경쟁하는 표지된 표준품의 능력에 의존한다. 시험 샘플 내의 표적 단백질의 양은 항체에 결합되는 표준품의 양과 반비례한다. 결합되는 표준품의 양의 결정을 용이하게 하기 위해, 항체는 바람직하게는 경쟁 전 또는 후에 불용화됨으로써, 항체에 결합된 표준품 및 분석물이 결합되지 않은 표준품 및 분석물로부터 편리하게 분리될 수 있다.
샌드위치 분석은 검출되는 단백질의 상이한 면역원성 부분, 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 수반한다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 분석물은 고체 지지체 상에 고정된 제1 항체에 의해 결합되고, 이어서 제2 항체가 분석물에 결합하여 불용성의 3부분으로 구성된 복합체를 형성한다. 예를 들어, 미국 특허 4,376,110을 참조한다. 제2 항체는 자체가 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있거나 (직접 샌드위치 분석) 또는 검출가능한 모이어티로 표지된 항면역글로불린 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 분석). 예를 들어, 한 종류의 샌드위치 분석은 ELISA 분석이고, 여기서 검출가능한 모이어티는 효소이다.
또한, 항체가 결합하는 항원의 세포 위치를 결정하기 위해 면역조직화학을 사용할 수 있다. 면역조직화학을 위해, 조직 샘플은 새로 채취하거나 또는 동결되거나 또는 파라핀에 포매되고, 방부제, 예를 들어 포르말린으로 고정될 수 있다.
제품
다른 실시태양에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 미생물 질환의 진단 또는 치료에 유용한 조성물을 포함하는 제품을 제공한다. 제품은 용기 및 설명서를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 병태의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물을 보유하고 있고, 멸균 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 활성 물질은 대체로 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 효능제, 또는 길항제이다. 용기 상의 또는 용기에 부속된 설명서 또는 라벨은 조성물이 선택된 질병의 진단 또는 치료를 위해 사용됨을 나타낸다. 제품은 제약상 허용되는 버퍼, 예를 들어 포스페이트 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 물질, 예를 들어 기타 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 사용설명서가 존재하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은
(a) AMP 또는 그의 조정인자 (예를 들어, IL-22 효능제)를 포함하는 조성물;
(b) 상기 조성물을 보유하는 용기; 및
(c) 미생물 질환의 치료에서 상기 효능제의 사용을 나타내는, 상기 용기에 부착된 라벨, 또는 상기 용기 내에 포함된 포장 삽입물
을 포함하는 제품을 제공한다. 조성물은 유효량의 효능제를 포함할 수 있다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이고, 예시 목적으로 본원에 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다. 본원에 제공된 상세한 설명을 고려하여 다양한 다른 실시태양이 실시될 수 있음이 이해된다.
실시예에서 언급되는 상업적으로 이용가능한 시약은 달리 지시하지 않으면 제조자의 지시에 따라 사용되었다. 다음 실시예 및 명세서 전체에서 ATCC 기탁 번호로 확인된 세포의 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션이다.
본원에 제시된 데이타는 IL-22이 A/E 세균 병원체의 초기 감염 동안 적응 면역반응 및 선천 상피 방어를 연결시키는 핵심 시토킨 중 하나임을 처음으로 입증한다. 본원에 제시한 바와 같이, RegIIIβ 및 RegIIIγ의 유도는 또한 IL-22가 다양한 세균 감염을 제어하는데 더 넓은 기능을 할 수 있음을 나타낼 수 있다. 데이타는 감염성 질병 및 자가면역 질병에서 Th17 세포 및 그들의 효과기 시토킨의 역할을 추가로 지지한다. 마지막으로, 본 연구는 IL-22 및 그의 하류 생성물, 예를 들어 RegIIIβ 및 RegIIIγ가 특정 감염성 질병의 치료에 유익할 수 있음을 나타낸다.
실시예 1: IL -23은 감염성 질병 과정 동안 IL -22 조절에 필수적이다.
본원의 데이타는 IL-23이 감염성 질병의 과정 동안 IL-22 조절에 필수적임을 입증한다.
두 IL-22 수용체 쌍, 즉, IL-22R 및 IL-10Rβ 사슬은 야생형 C57B1/6 마우스의 GI관에서 발현된다 (도 1A). 십이지장, 공장, 회장, 및 결장에서 그들의 발현은 IL-22가 과다형성을 유도하는 것으로 나타난 조직인 피부에서의 발현보다 더 높다. 이와 일관되게, 결장 상피 세포 및 상피하 근섬유모세포는 모두 IL-22에 반응하는 것으로 보고되었다. 씨. 로덴티움 감염 동안, IL-22는 야생형 마우스의 결장에서 유도되었고 (도 1B), IL-23의 p19 및 p40 서브유닛 (도 1C-D), 및 IL-6 (도 1E)을 비롯한 Th17 세포 분화를 촉진하는 시토킨도 유도되었다. 이들 시토킨은 모두 신속하게 유도되었고, 피크 발현은 대략 접종 4일 후였다. 이와 반대로, IL-17 유도는 보다 느린 운동학을 갖고, 그의 최대 수준은 접종 12일 후에 도달하였다 (도 1F).
IL-23 또는 IL-6은 시험관 내에서 T 세포로부터 IL-22 생산을 촉진하므로, 본 발명자들은 씨. 로덴티움 감염 동안 IL-22 생산의 조절에서 그들의 역할을 먼저 규정하고자 하였다. 씨. 로덴티움 감염 후의 야생형, p19-/-, p40-/- 및 IL-6-/- 마우스의 생존율을 비교할 때, 본 발명자들은 일관되게 p40-/- 군 (도 1G) 또는 p19-/- 군 (데이타 비제시)으로부터의 모든 마우스가 접종 10일 후에 죽었음을 발견하였다. 흥미롭게도, IL-6-/- 군에서 대략 제12일에 60% 사망률이 또한 관찰되었고 (도 1G), 이는 씨. 로덴티움 감염의 전체 제어를 위해 IL-6이 특정 정도로 요구됨을 나타낸다. 이어서, 본 발명자들은 p19-/- 및 IL-6-/- 마우스 모두에서 IL-22 및 IL-17 발현을 검사하였다 (도 1H). IL-17 발현은 p19-/- 마우스에서 변경되지 않은 한편 (15), IL-22의 유도는 야생형 마우스에 비해 p19-/- 마우스에서 감소되었다. 그러나, IL-6-/- 마우스에서, IL-22의 피크 수준은 야생형 마우스의 수준에 대등한 반면, 그의 유도는 유의하게 지연되었다 (도 1H). 또한, IL-6-/- 마우스에서, IL-17의 유도는 유의하게 감소되었고, 이는 IL-17 생산에 대한 IL-6의 필수적인 역할과 일치한다.
감염된 마우스로부터의 결장의 생체외 배양액에서 ELISA에 의해 IL-22/IL-17 단백질을 직접 측정함으로써 씨. 로덴티움 감염 동안 p19-/- 마우스로부터 IL-22/IL-17 생산의 운동학 및 IL-22 유도의 부재를 확인하였다 (도 11). 이들 데이타는 IL-23이 감염성 질병 과정 동안 IL-22 조절에 필수적임을 처음으로 입증한다.
이들 데이타는 IL-23이 감염성 질병 과정 동안 IL-22 조절에 필수적임을 처음으로 입증한다.
실시예 2: 미생물 감염을 제어하는데 있어서 IL -23의 생물학에 기여하는 IL-22는 핵심적인 하류 효과기 시토킨이다 .
IL-23 결핍 및 IL-6-/- 마우스에서 IL-22의 변경된 조절은 IL-22가 씨. 로덴티움 감염에 대한 숙주 방어에서 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다. IL-22의 역할을 추가로 검사하기 위해, IL-22-/- 마우스에 씨. 로덴티움을 접종하였다. 야생형 한배 새끼는 일시적으로 체중이 감소하였지만 6일 후 완전히 회복할 수 있는 한편, IL-22-/- 마우스는 씨. 로덴티움 감염 이후에 체중이 계속 감소하였다 (도 2A). 약 80%의 IL-22-/- 마우스가 씨. 로덴티움 접종 12일 후에 빈사 상태가 되거나 죽었다 (도 2A). 제8일의 감염된 IL-22-/- 마우스로부터의 결장의 조직학적 분석으로 WT 마우스에 비해 증가된 점막 두께를 입증하였다 (도 2B). 동시에, 점막하 염증이 또한 증가하였다 (화살표, 도 2B). 또한, 대조 마우스에서 씨. 로덴티움 감염은 대부분 표면적인 한편, IL-22-/- 마우스에서 다수의 세균은 결장 음와 (crypt) 내로 깊이 침투하였다 (화살표, 도 2C). 항-IL-22R 항체를 사용한 FACS 분석 (도 12)에 의해 IL-22R은 E-카드헤린 양성 1차 쥐 결장 상피 세포에 의해 발현되었지만, CD45+ 상피내 림프구 (IEL) 또는 고유판 단핵 세포 (LPMC)에 의해 발현되지 않았음이 밝혀졌다 (도 12A). 이와 유사하게, 1차 인간 결장 상피 세포는 또한 IL-22R을 발현하였다 (도 12B). 이들 데이타는 결장 상피 세포가 IL-22에 의해 직접 표적화되었음을 제안한다.
이들 데이타는 씨. 로덴티움 감염에 대한 숙주 방어에서 IL-22의 중요성을 지지하고, IL-22가 미생물 감염을 제어하는데 있어서 IL-23의 생물학에 기여하는 핵심적인 하류 효과기 시토킨 중 하나일 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: IL -17A 및 IL -17F 경로는 씨. 로덴티움 감염에 대한 숙주 방어를 위해 요구되지 않는다.
씨. 로덴티움에 대한 IL-6-/- 마우스에서 숙주 방어의 부분 손상은 또한 이들 마우스에서 IL-22의 지연된 유도에 의해 설명될 수 있다 (도 1H, 좌측 패널). 그러나, 씨. 로덴티움 감염된 IL-6-/- 마우스에서 치사율은 IL-17을 상향 조절하지 못하기 때문일 수 있음이 또한 가능하다 (도 1H, 우측 패널). IL-17 경로는 많은 세포외 세균 감염, 예를 들어 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae)의 제어에 중요하다. IL-17은 IL-17R 및 IL-17RC를 통해 신호전달하고 (D. Toy et al., J Immunol 177, 36 (July 1, 2006)), 상피 세포를 비롯한 많은 세포 종류로부터 염증유발 반응을 유도한다 (J. Witowski, K. Ksiazek, A. Jorres, Cell Mol Life Sci 61, 567 (Mar, 2004)). 씨. 로덴티움 감염 동안 IL-17 경로의 역할을 분석하기 위해, IL-17RC-/- 마우스를 생성하였다 (도 5). 야생형 한배 새끼에 비해, IL-17RC-/- 마우스에서 T 세포, B 세포 및 다른 면역 세포의 발달 또는 조성의 면에서 명백한 결함은 없었다 (데이타 비제시). 그러나, IL-17RC-/- 마우스의 꼬리 끝 (도 5C) 또는 폐 조직 (데이타 비제시)으로부터 생성된 섬유모세포는 IL-17A 또는 IL-17F로 자극할 때 IL-6을 완전히 생산할 수 없었고, 이는 IL-17RC가 IL-17A 및 IL-17F 매개된 기능에 필수적인 수용체임을 나타낸다. 씨. 로덴티움 접종 이후에, IL-17RC-/- 마우스 및 야생형 한배 새끼는 임의의 유의한 체중 감소 (도 2D) 또는 결장에서 임의의 조직학적 차이 (데이타 비제시)를 보이지 않으면서 감염의 경과 동안 생존하였다.
이들 결과는 IL-17A 및 IL-17F 경로가 씨. 로덴티움 감염에 대한 숙주 방어에 요구되지 않았음을 나타내고, 이는 결함성 IL-17 생산이 IL-6-/- 마우스에서 관찰된 사망률의 주요 원인일 가능성을 직접적으로 배제한다. 따라서, IL-6-/- 마우스에서 관찰된 IL-22의 지연된 유도는 이들 마우스가 감염에서 생존할 수 없었던 이유일 수도 있다. 그러나, IL-6의 하류의 다른 인자가 또한 중요할 수 있다. IL-6-/- 마우스로부터의 결과는 IL-22의 조기 유도가 숙주가 치사율을 방지하기 위해 씨. 로덴티움 감염에 대한 충분한 반응을 시작하기 위해 중요할 수 있음을 시사한다.
실시예 3: IL -22는 세균 감염의 초기 단계에서 중요한 역할을 한다.
숙주가 치사를 방지하기 위해 씨. 로덴티움 감염에 대한 충분한 반응을 시작하기 위해 IL-22의 초기 유도가 중요한지 결정하기 위해, 항-IL-22 중화 항체를 씨. 로덴티움 접종의 제0 또는 제8일 후에 시작하여 격일로 투여하였다. 예상된 바와 같이, 세균 접종과 동시에 항-IL-22 mAb를 투여받은 마우스는 체중이 계속 감소하고, 모두 접종 12일 후에 빈사 상태가 되거나 죽었다. 이와 반대로, 모든 이소형 대조 항체 처리된 동물은 생존하였다 (도 2E). 접종 8일 후에 시작하여 항-IL-22 mAb를 투여받은 마우스는 이소형 mAb 처리된 마우스와 유사한 결과를 보였고, 감염으로부터 완전히 회복한다.
따라서, 이들 데이타는 IL-22가 씨. 로덴티움 감염의 초기 단계에서 중요한 역할을 하지만, 세균이 근절되는 숙주 방어의 후기상에서는 어떠한 역할을 하지 않음을 나타낸다.
실시예 4: IL -19, IL -20 및 IL -24는 세균 감염에 대한 숙주 방어에 불필요하다.
다른 IL-10 패밀리 시토킨인 IL-19, IL-20 및 IL-24는 모두 인간 표피 각질세포에서 IL-22에 의해 유도되는 것과 유사한 생물학적 기능을 유도한다 (S.M. Sa et al., J Immunol 178, 2229 (February 15, 2007)). IL-19, IL-20 및 IL-24는 씨. 로덴티움 감염 동안 야생형 마우스 결장에서 모두 상향 조절된다 (도 6). 따라서, 이들은 씨. 로덴티움 감염 동안 IL-22과 유사한 역할을 할 수 있다. IL-19는 IL-20Rα 및 IL-20Rβ 사슬을 통해 신호전달한다. IL-20 및 IL-24는 2개의 상이한 수용체 쌍, 즉, IL-20Rα/IL-20Rβ 및 IL-22R/IL-20Rβ를 통해 신호전달할 수 있다 (J.C. Renauld, Nature Reviews Immunology 3, 667 (2003)). 따라서. IL-20Rβ는 이들 3개의 시토킨에 대한 공통 수용체 사슬이다. GI관에서, IL-20Rα 및 IL-20Rβ 사슬의 발현은 피부에서 이들 사슬의 발현보다 유의하게 더 낮다 (도 7).
씨. 로덴티움 감염 동안 상기 3개의 시토킨의 역할을 중요하게 다루기 위해, IL-20Rβ-/- 마우스를 생성하였다 (도 8). 이들 마우스는 야생형 마우스에 비해 유사한 림프구 조성을 갖는 정상 발달 및 모든 주요 림프계 기관에서의 발달을 보였다 (데이타 비제시). 이들 마우스로부터 귀 피부는 재조합 IL-20으로 처리할 때 S100 패밀리 단백질을 상향 조절하지 못하였고, 이는 생체 내에서 IL-20 신호 전달의 결함을 나타낸다 (도 8C).
IL-20Rβ-/- 마우스는 씨. 로덴티움 감염에서 생존하였고 또한 야생형 마우스도 생존하였고 (도 2F), 이는 IL-19, IL-20 및 IL-24가 씨. 로덴티움에 대한 숙주 방어에 불필요함을 나타낸다.
실시예 5: IL -22 결핍은 씨. 로덴티움 감염의 초기 단계 동안 상피 통합성을 손상시킬 수 있다.
본 발명자들은 씨. 로덴티움 감염 동안 IL-22의 하류 메카니즘을 검사하였다. 제0일에 항-IL-22 mAb로 처리된 IL-22-/- 마우스 및 야생형 마우스는 씨. 로덴티움의 접종의 제8일 후의 대조 마우스에 비해 더 심한 피 섞인 설사를 발병하고 직장 탈출의 발생률이 증가하였다 (데이타 비제시). IL-22-/- 마우스 (데이타 비제시) 또는 제0일 항-IL-22 mAb 처리된 마우스로부터의 결장은 대조 마우스에 비해 접종 10일 후에 비후하고 짧아졌고 (도 3A), 또한 더 작은 맹장을 가졌다. 조직학적 분석으로 IL-22 신호 전달이 결여되는 결장에서 염증 증가가 추가로 밝혀졌다 (도 3B). 또한, IL-22-/- 및 항-IL-22 mAb 처리된 마우스 모두에서 현저한 다초점성 점막 궤양 형성 및 다수 초점의 전층 염증이 존재하였다 (도 3C 및 도 9). 또한, IL-22-/- 마우스의 장간막 림프절, 비장 및 간에서 세균 부하 (burden)는 야생형 마우스에 비해 유의하게 증가하였다. 흥미롭게도, 야생형 마우스 및 IL-22-/- 마우스의 결장에서 세균 부하의 차이는 무시할 정도였다 (도 3D). 이들 결과와 일관되게, 특히 IL-22-/- 마우스의 간에서 전신 세균 확산의 증거가 또한 존재하였고, 여기서 색전성 미세농양 형성이 있는 다초점성 간세포 괴사가 명백하였다 (도 3E).
결론적으로, 이들 데이타는 씨. 로덴티움 감염의 초기 단계 동안 IL-22-/- 마우스에서 상피 통합성이 손상됨을 나타낸다.
실시예 6: IL -22 결핍은 항-세균 IgG 역가의 감소를 일으킨다.
이전의 연구에서 세균의 청소에 있어서 항-씨. 로덴티움 항체의 필수적인 역할이 확립되었다. 감염 후 야생형 마우스로부터 혈청을 전달하면 씨. 로덴티움 시험접종 후 CD4-/- 마우스를 사멸로부터 완전히 구조하였다 (10). 본 연구에서, IL-22 결핍 마우스는 야생형 마우스에서 항체 반응이 완전히 발달하지 않을 때 약 제8일에 시작하여 빈사 상태가 되거나 죽었다 (도 3F). 제8일에, 항-씨. 로덴티움 항체 역가는 야생형 마우스에서 제16일에 비해 50배 더 적었다. 그러나, 야생형 및 IL-22-/- 마우스로부터 제8일에 항-씨. 로덴티움 항체의 역가를 비교하면, 야생형 마우스에 비해 IL-22-/- 마우스에서 항-씨. 로덴티움 IgG 역가가 예상치 않게 유의하게 감소하였다 (도 3G). 이와 반대로, IL-22-/- 마우스에서 총 IgG, IgM, IgA 또는 항-씨. 로덴티움 IgM 및 IgA 역가는 감소하지 않았다 (도 10A 및 데이타 비제시). 추가로 IgG 하위형 분석으로 접종 8일 후에 야생형 또는 IL-22-/- 마우스에서 항-씨. 로덴티움 IgG1은 존재하지 않았지만, 다른 항-씨. 로덴티움 IgG 하위형, 예를 들어 IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3는 모두 IL-22-/- 마우스에서 유의하게 감소하였다 (도 10B). 항-세균 특이적 IgG의 차이가 이 시점에 결장으로부터 씨. 로덴티움의 청소에 기여한 것 같지는 않았고, 이는 특히 IgG는 결장 점막 내강에 표적화되지 않기 때문이고, 야생형 및 IL-22-/- 마우스 모두에서 결장 세균 부하는 유사하였다 (도 3D). 순환 항-씨. 로덴티움 IgG가 장 상피 장벽을 통한 씨. 로덴티움의 침투를 제어하고 전신 확산을 방지하는데 중요할 수 있음이 가능하고, 이는 최근의 연구에서 순환 IgG가 씨. 로덴티움의 전신 청소를 위해 요구되지만 분비형 IgA 또는 IgM은 요구되지 않음이 입증되었기 때문이다 (C. Maaser et al., Infect. Immun. 72, 3315 (June 1, 2004)). IL-22 결핍이 항-세균 IgG 역가의 감소를 일으키는 방식은 불명확하다. IL-22가 B 세포에 대해 직접적으로 작용하는 것 같지는 않고, 이는 IL-22R의 발현이 B 세포 상에서 검출가능하지 않기 때문이다 (S. Lccart et al., Int. Immunol. 14, 1351 (November 1, 2002)). 그렇더라도, 감소된 항-씨. 로덴티움 IgG는 씨. 로덴티움 감염 동안 IL-22-/- 마우스에서 결함성 숙주 방어 반응에 기여하는 인자 중 하나일 수 있다.
실시예 7: IL -22는 세균 감염 동안 결장 상피 세포로부터 항-미생물 렉틴, 예를 들어 RegIII β 및 RegIII γ의 유도에 필수적이었다.
생체 외에서 비감염된 야생형 마우스로부터의 결장 조직의 IL-22 처리는 마이크로어레이 분석에 의해 많은 항-미생물 단백질, 예를 들어 S100A8, S100A9, RegIIIβ, RegIIIγ, 합토글로빈, SAA3 및 락토트랜스페린을 상향 조절하였다 (도 4A, 19, 및 20). 이들 단백질의 유도는 실시간 RT-PCR에 의해 확인하였다 (도 4B 및 데이타 비제시). 그러나, 씨. 로덴티움 감염 동안, S100A8, S100A9, RegIIIβ 및 RegIIIγ만이 야생형 마우스에 비해 IL-22-/- 마우스에서 차별적으로 발현되었다 (도 4C). 다른 모든 유전자는 유도되지 않거나 야생형 대 IL-22-/- 마우스의 결장에서 상이하지 않았다 (데이타 비제시). S100A8 및 S100A9 모두의 발현은 제4일 및 제6일에 야생형 결장에서보다 IL-22-/- 마우스의 결장에서 다소 더 높았고, 이는 이들 단백질의 차별적인 발현이 씨. 로덴티움 감염 동안 IL-22-/- 마우스에서 관찰된 증가된 사망률을 초래할 가능성이 거의 없음을 제안한다. 야생형 및 IL-22-/- 마우스 사이에서 감염된 상피의 숙주 방어에서 중요한 단백질 (L Ganz, Science 286, 420 (October 15, 1999))인 데페신의 발현의 차이는 발견되지 않았다 (데이타 비제시). 흥미롭게도, 야생형 마우스에서 관찰된 RegIIIβ 및 RegIIIγ의 상향 조절은 씨. 로덴티움 접종 후에 IL-22-/- 마우스에서 완전히 폐지되었고 (도 4C), 이는 이들 2개의 단백질이 씨. 로덴티움 감염을 제어하는데 잠재적인 기능을 가졌음을 나타낸다. RegIIIβ 및 RegIIIγ는 모두 분비형 C-타입 렉틴 단백질의 패밀리에 속한다 (H.L. Cash, C.V. Whitham, L.V. Hooper, Protein Expression and Purification 48, 151 (2006)). RegIIIβ 및 RegIIIγ 발현 수준은 세균 콜로니화에 반응하여 및 마우스에서 다른 염증 자극 이후에 극적으로 증가한다 ([S.A. Keilbaugh et al., Gut 54, 623 (May 1, 2005)]; [H. Ogawa et al., Inflammatory Bowel Diseases 9, 162 (2003)]; [H. Ogawa, K. Fukushima, I. Sasaki, S. Matsuno, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 279, G492 (Sep, 2000)]).
RegIIIβ 또는 RegIIIγ는 결장 음와 내로 깊이 씨. 로덴티움의 침입을 방지할 수 있고, 이는 IL-22-/- 대 야생형 마우스의 결장으로부터 세균 부하의 차이가 보이지 않았기 때문이다 (도 3D). 별법으로, RegIIIβ 또는 RegIIIγ 단백질은 장 염증의 상황에서 상피 수복 및/또는 보호에서 일정 역할을 하는 자가분비 성장 인자로서 작용할 수 있다 ([H. Ogawa et al., Inflammatory Bowel Diseases 9, 162 (2003)]; [S.L. Pull, J.M. Doherty, J.C. Mills, J.I. Gordon, T.S. Stappenbeck, PNAS 102, 99 (January 4, 2005)]; [V. Moucadel et al., Eur J Cell Biol 80, 156 (Feb, 2001)]).
실시예 8: 적응 면역은 씨. 로덴티움 감염에 대한 IL -22 매개 초기 숙주 방어에 필수적이지 않다.
상기 데이타는 선천 면역 및 적응 면역 모두에서 IL-22의 역할을 제안하였다. 따라서, 씨. 로덴티움 감염 동안 선천 면역 대 적응 면역에서 IL-22의 기능을 엄격하게 검사하기 위해 재조합 활성화 유전자 2 결핍 (Rag2-/-) 마우스를 사용하였다. Rag2-/- 마우스는 B 및 T 세포가 결핍되고 그 결과 항-씨. 로덴티움 항체 반응을 시작하지 못하기 때문에 점차 체중이 감소하고, 결국 약 제30일에 빈사 상태가 되거나 죽었다 (도 13A). p19-/- 또는 IL-22-/- 마우스와 달리, Rag2-/- 마우스는 감염의 처음 2주 동안 그들의 체중이 10% 초과로 감소하거나 죽지 않았다. 또한, 항-IL-22 mAb로 처리한 Rag2-/- 마우스는 항-IL-22 mAb로 처리한 WT 마우스 (도 2E)에 유사하게 체중이 매우 빠르게 감소하였다 (도 13A). 항-IL-22 mAb로 처리한 모든 Rag2-/- 마우스는 약 제10일에 빈사 상태가 되거나 죽었다 (도 13). 이들 데이타는 IL-22 경로가 Rag2-/- 마우스에서 여전히 활성이고, IL-22는 적응 면역의 부재 하에 씨. 로덴티움 감염의 초기상 동안 마우스를 죽음으로부터 보호하기 위해 필수적임을 제안한다. Rag2-/- 마우스에서 항체 생산의 결핍 단독으로는 감염 이후에 신속한 체중 감소 및 초기 죽음을 일으키지 않았기 때문에, 이들 데이타는 또한 항-씨. 로덴티움 IgG 역가의 감소가 씨. 로덴티움 감염 이후에 IL-22-/- 마우스에서 관찰된 이환율 및 사망률에 대한 불충분한 원인이었음을 나타낸다.
Rag2-/- 마우스에서 IL-22 생산은 씨. 로덴티움 감염 이후에 WT 마우스의 생산에 대등하였다 (도 13B). 이와 반대로, IL-17A의 유도는 Rag2-/- 마우스에서 유의하게 감소하였다 (도 13B 및 C). 따라서, T 세포 및 B 세포는 상기 모델에서 IL-22의 공급원이 아니었다. 항-IL-22 mAb를 사용한 면역조직화학적 염색 (도 15)으로 씨. 로덴티움으로 감염된 WT 마우스의 결장에서 IL-22 양성 세포를 검출하였지만, 비감염된 결장 또는 감염된 IL-22-/- 마우스의 결장에서는 검출되지 않았다. IL-22 양성 세포는 주로 Rag2-/- 마우스의 결장에서 CD11c+ 세포 클러스터와 동시에 존재하지만 (도 13D), F4/80, Gr-1, 또는 DX5 양성 세포와는 동시에 존재하지 않았다 (데이타 비제시). 또한, IL-23은 시험관 내에서 CD11c+ DC로부터 직접적으로 IL-22 생산을 유도하였다 (도 13E). 함께 살펴보면, 본 데이타는 DC가 씨. 로덴티움 감염 동안 IL-22 생산의 주요 공급원 중 하나이고, IL-23이 DC로부터 IL-22 생산을 직접 촉진할 수 있음을 입증한다.
실시예 9: RcgIII 는 세균 감염 동안 중요한 역할을 한다.
흥미롭게도, 야생형 마우스에서 관찰된 RegIIIβ 및 RegIIIγ의 상향 조절은 씨. 로덴티움 접종 후에 IL-22-/- 마우스 (도 4C) 및 p19-/-마우스 (도 16)에서 완전히 폐지되었다. RegIIIβ 및 RegIIIγ는 분비형 C-타입 렉틴 단백질의 패밀리에 속한다. 본 발명자들은 다른 패밀리 멤버, 예를 들어 RegI, RegII, RegIIIα 및 RegIIIδ (도 17)이 또한 씨. 로덴티움 감염된 결장에서 상향 조절되지만 RegIV는 상향 조절되지 않고 (데이타 비제시), 그들의 유도는 IL-22-/- 마우스에서 완전히 폐지되었음을 발견하였다. 외인성 마우스 RegIIIγ 융합 단백질 (rmRegIIIγ)은 IL-22-/- 마우스를 씨. 로덴티움 감염에 의해 유도된 체중 감소로부터 유의하게 보호하였고, 약 50%의 rmRegIIIγ 융합 단백질 처리된 동물은 감염에서 생존한 반면, 100%의 대조 처리된 IL-22-/- 마우스는 빈사 상태가 되거나 죽었다 (도 14A). 이들 데이타는 Reg 패밀리 단백질, 예를 들어 RegIIIγ가 IL-22의 하류의 씨. 로덴티움 감염에서 필수적인 기능을 매개한다는 가설을 지지한다.
마지막으로, IL-23/IL-22/Reg 축의 존재는 인간 시스템에서 또한 입증되었다. 인간 IL-23은 인간 DC로부터 hIL-22 생산을 유도한다 (도 14B). 1차 인간 결장 상피 세포 (도 12B) 및 인간 결장 상피 세포주인 HT29 및 HCT15는 IL-22R을 발현한다 (도 14C). 시험관 내에서, 1차 인간 결장 상피 세포는 서서히 성장하고, 팽창 동안 점차 IL-22R의 발현을 손실한다 (데이타 비제시). 따라서, 인간 IL-22에 대한 반응을 시험하기 위해 결장 상피 세포주를 사용하였다. IL-22는 이들 결장 상피 세포주 (도 14D)에서 STAT3 활성화를 유도하였고, RegIIIβ 및 RegIIIγ는 모두 IL-22에 의해 유의하게 유도되었다 (도 14E). 중요하게는, 인간 RegIIIγ 융합 단백질 (rhRegIIIγ)은 rmRegIIIγ 융합 단백질과 마찬가지로 또한 IL-22-/- 마우스의 사망률을 대조 처리된 IL-22-/- 마우스에서의 100% 사망률에 대해 씨. 로덴티움 감염 이후에 40%로 감소시켰다 (도 18). 결론적으로, 본 데이타는 인간 GI관에서 세균 감염, 특히 A/E 세균 감염을 제어하는데 있어서 IL-22 경로가 필수적인 역할을 할 수 있음을 시사한다.
요약
본 발명자들은 본원에서 IL-22가 부착 및 소멸형 (A/E) 세균 병원체에 대한 초기 숙주 방어에서 필수적인 역할을 함을 입증한다.
본원의 데이타는 IL-22가 2개의 메카니즘을 통해 장 상피 장벽의 통합성을 보호하고, 전신 확산과 함께 세균 침습을 방지함을 나타낸다. 첫 번째로, IL-22는 초기 항-세균 IgG 반응의 유도에 관여한다. 두 번째로, IL-22는 세균 감염 동안 결장 상피 세포로부터 항-미생물 렉틴, 예를 들어 RegIIIβ 및 RegIIIγ의 유도를 위해 필수적이다. 이들 메카니즘 중 하나 또는 둘 모두의 결핍은 씨. 로덴티움 감염 동안 IL-22-/- 마우스에서 증가한 전신 확산 및 사망률과 함께 손상된 숙주 방어 반응에 기여할 수 있다.
적응 면역 반응은 이들 병원체의 청소를 위해 필수적이지만 (L. Bry, M.B. Brenner, J Immunol 172, 433 (January 1, 2004)), 초기 감염기 동안 면역 세포에 의해 생산되는 시토킨, 예를 들어 IL-22도 또한, 병원성 세균의 숙주 내로의 전신 침습을 방지하기 위해 장 상피 세포가 전체 항-미생물 반응 및 상처 치유 반응을 유도하는데 필요하다. 본원에 제시한 바와 같이, RegIIIβ 및 RegIIIγ의 유도는 또한 IL-22가 다양한 세균 감염을 제어하는데 더 넓은 기능을 할 수 있음을 나타낸다. 데이타는 감염성 질병 및 자가면역 질병에서 Th17 세포 및 그들의 효과기 시토킨의 역할을 추가로 지지한다. 마지막으로, 본 연구는 IL-22 및 그의 하류 생성물, 예를 들어 RegIIIβ 및 RegIIIγ가 특정 감염성 질병의 치료에 유익할 수 있음을 나타낸다.
물질 및 방법
마우스
C57B1/6, IL-I2p40-/- 및 IL-6-/- 마우스는 잭슨 래보래토리 (Jackson Laboratory)로부터 구입하였다. IL-22-/- 마우스 및 IL-12p19-/- 마우스는 이전에 설명된 바와 같이 생성하였다 (11, 도 5). IL-17RC-/- 및 IL-20Rβ-/- 마우스는 설명된 방법 (도 5 및 도 8)을 이용하여 렉시콘 파마슈티칼스 (Lexicon Pharmaceuticals; 미국 텍사스주 더 우드랜드)에서 생성하였다. 간단히 설명하면, 낙아웃 마우스를 도시된 표적화 벡터를 사용하는 표준 상동성 재조합에 의해 제조하였다. 표적화 벡터를 129 균주 ES 세포 내로 전기천공하고, 표적화된 클론을 확인하였다. 표적화된 클론을 숙주 포배 내로 미세주사하여 키메라를 생산한다. 키메라를 C57B1/6 동물과 함께 사육하여 F1 이형접합체를 생산한다. 이형접합체는 이종교배하여 F2 야생형, 이형접합체 및 동형접합체 코호트 (cohort)를 생산한다. 이들 연구에 사용된 마우스는 3개의 프라이머의 풀 (pool)을 사용하는 PCR을 통해 꼬리 DNA에 의해 유전자형을 결정하였다. IL-20Rβ-/- 마우스의 야생형 대립유전자 증폭에 사용된 프라이머는 5'-GTG GAA GCT ACT TGA TGA GTA GGG-3' (p1) 및 5'-AGA TGC GAA AAT GGA GAT TAA AAG-3' (p2)이었고, 이는 595 bp 생성물을 생산하였다. IL-20Rβ-/- 마우스의 돌이변이체 대립유전자 증폭에 사용된 프라이머는 5'-CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AG-3' (p3) 및 p2이었고, 이는 351 bp 생성물을 생산하였다. IL-17RC-/- 마우스의 야생형 대립유전자 증폭에 사용된 프라이머는 5'-GAG CCT GAA GAA GCT GGA AA-3' (P3) 및 5'-CAA GTG TTG GCA GAG ATG GA-3' (P2)이었고, 이는 534 bp 생성물을 생산하였다. IL-17RC-/- 마우스의 돌이변이체 대립유전자 증폭에 사용된 프라이머는 5'-TCG CCT TCT TGA CGA GTT CT-3' (P1) 및 P2이었고, 이는 404 bp 생성물을 생산하였다.
세균 균주 및 마우스의 감염
6-8주령의 마우스를 8 h 동안 굶긴 후 2x109 씨. 로덴티움 균주 DBS100 (ATCC 51459; 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션)을 마우스당 200 ㎕의 총 부피로 경구 접종하였다. 굶기는 동안, 동물을 물에 접근하도록 하였다. 접종 및 모든 후속 조작은 BL-2 생물안전 캐비넷 내에서 수행하였다. 동물을 접종 후에 먹이에 접근하도록 하였다. 세균은 37℃에서 밤새 LB 브로쓰 내에서 진탕하면서 인큐베이션하여 준비하였다. 세균의 상대 농도는 OD600에서 흡광도를 측정하여 평가하였고, 투여된 CFU를 확인하기 위해 각각의 접종 배양액을 연속 희석하고 플레이팅하였다.
조직 수집, 조직학 및 CFU 계수
대조 마우스 또는 감염된 마우스를 설명된 바와 같이 접종하였다. 전혈, 비장, 간, 장간막 림프절, 및 결장의 샘플을 무균 조건 하에 제거하였다. 결장은 항문관까지 절개하고, 말단의 0.5-cm 조각을 CFU 분석에 사용하였다. 근위 세그먼트를 10% 중성 완충 포르말린 내에 고정시켰다. 조직 병리학을 평가하기 위해 절편을 H&E로 염색하였다. 비장, 간, 장간막 림프절 및 결장을 계량하고 균질화하였다. 균질화물을 연속 희석하고 MacConkey 아가 (레멜 (Remel))에 삼중으로 플레이팅하였다. 씨. 로덴티움 콜로니는 분홍색 콜로니로서 확인되었다. 콜로니를 37℃에서 24 h 인큐베이션 후에 계수하여 조직 1 g당 log10 CFU를 결정하였다.
RNA 단리 및 실시간 RT - PCR
세포 및 조직 RNA를 RNeasy 미니 키트 (퀴아젠 (Qiagen))에 의해 제조자의 지시에 따라 단리하였다. 실시간 RT-PCR을 TaqMan 1-단계 RT-PCR 마스터 믹스 (master mix) 시약 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 프라이머 및 프로브를 사용하여 ABI 7500 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems)) 상에서 수행하였다. 프라이머 및 프로브에 대한 서열은 다음과 같았다: mIL-22, 전방향, 5'-TCC GAG GAG TCA GTG CTA AA-3', 역방향, 5'-AGA ACG TCT TCC AGG GTG AA-3', 및 프로브, 5'-TGA GCA CCT GCT TCA TCA GGT AGC A-3' (FAM, TAMRA); mIL-17A, 전방향, 5'-GCT CCA GAA GGC CCT CAG A-3', 역방향, 5'-CTT TCC CTC CGC ATT GAC A-3', 및 프로브, 5'-ACC TCA ACC GTT CCA CGT CAC-3' (FAM, TAMRA); 마우스 리보좀 하우스키핑 (housekeeping) 유전자 RPF-19, 전방향, 5'-GCA TCC TCA TGG AGC ACA T-3', 역방향, 5'-CTG GTC AGC CAG GAG CTT-3', 및 프로브, 5'-CTT GCG GGC CTT GTC TGC CTT-3' (FAM, TAMRA); mIL-19, 전방향, 5'-AGC CTG GAT TGA CAG GAA TC-3', 역방향, 5'-GAT AAT CAG ACG AGG CGT TTC-3', 및 프로브, 5'-TCT GGA AAC TCC TGC AGC CTG ACA C-3' (FAM, TAMRA); mIL-20, 전방향, 5'-TTT GGG AGA ACT AGG CAT TCT T-3', 역방향, 5'-TCT TGG ACA GGA GTG TTC TCA-3', 및 프로브, 5'-CAG CCT CTC CAC TTT CAT CTA TAG CAT CTC C-3' (FAM, TAMRA); mIL-24, 전방향, 5'-GCT CTC CAT GCC ATT TCA A-3', 역방향, 5'-TGG CCA AGG GTC TGA AGT-3', 및 프로브, 5'-TGT ACA TCC CTG CTG TCC TCA AGG C-3' (FAM, TAMRA); mIL-6, 전방향, 5'-TCC AAT GCT CTC CTA ACA GAT AAG-3', 역방향, 5'-CAA GAT GAA TTG GAT GGT CTT G-3', 및 프로브, 5'-TCC TTA GCC ACT CCT TCT GTG ACT CCA-3' (FAM, TAMRA); mS100A8, 전방향, 5'-TGT CCT CAG TTT GTG CAG AAT ATA AA-3', 역방향, 5'-TCA CCA TCG CAA GGA ACT CC-3', 및 프로브 5'-CGA AAA CTT GTT CAG AGA ATT GGA CAT CAA TAG TGA-3' (FAM, TAMRA); mS100A9, 전방향, 5'-GGT GGA AGC ACA GTT GGC A-3', 역방향, 5'-GTG TCC AGG TCC TCC ATG ATG-3', 및 프로브, 5'-TGA AGA AAG AGA AGA GAA ATG AAG CCC TCA TAA ATG-3' (FAM, TAMRA); mRegIIIγ, 전방향, 5'-ATG GCT CCT ATT GCT ATG CC-3', 역방향, 5'-GAT GTC CTG AGG GCC TCT T-3', 및 프로브, 5'-TGG CAG GCC ATA TCT GCA TCA TAC C-3' (FAM, TAMRA); mPAP/HIP/RegIIIβ, 전방향, 5'-ATG GCT CCT ACT GCT ATG CC-3', 역방향, 5'-GTG TCC TCC AGG CCT CTT T-3', 및 프로브, 5'-TGA TGC AGA ACT GGC CTG CCA-3' (FAM, TAMRA); mIL-12p40, 전방향, 5'-ACA TCT ACC GAA GTC CAA TGC A-3', 역방향, 5'-GGA ATT GTA ATA GCG ATC CTG AGC-3', 및 프로브, 5'-TGC ACG CAG ACA TTC CCG CCT-3' (FAM, FAMRA); mIL-23p19, 전방향, 5'-GGT GGC TCA GGG AAA TGT-3', 역방향, 5'-GAC AGA GCA GGC AGG TAC AG-3', 및 프로브, 5'-CAG ATG CAC AGT ACT CCA GAC AGC AGC-3' (FAM, TAMRA); mIL-20Rβ, 전방향, 5'-CAG GTG CTT CCA GTC CGT CT-3', 역방향, 5'-CTC TCC TGG AAT CCC CAA AGT-3', 및 프로브, 5'-CAG CAC AGA TGC CAA CGG CCT CAT-3' (FAM, TAMRA); mIL-20Rα, 전방향, 5'-CTG GCC GCT TCG GGA CGC-3', 역방향, 5'-AAC CAC AGA AGA CAC AAG GAA CTG-3', 및 프로브, 5'-TCT GCT GCT GGC CGC TTC GG-3' (FAM, TAMRA); mIL-22R, 전방향, 5'-GCT GGA CTC CCT TGT GTG T-3', 역방향, 5'-CAC ATG GCC TCA GTC TCA A-3', 및 프로브, 5'-CGC GGG ACC CTC ATC CTT TG-3' (FAM, TAMRA); mIL-10Rβ, 전방향, 5'-TCC ACA GCA CCT GAA GGA GTT-3', 역방향, 5'-GGA GGG AAG GAG AAC AGC AGA-3', 및 프로브, 5'-TGG GCC ACC CCC ATC ACA GC-3' (FAM, TAMRA). 반응은 이중으로 실행하고, 샘플은 대조 하우스키핑 유전자 RPL-19에 대해 표준화하고 ΔΔCt 방법에 따라 보고하였다: ΔΔCt = ΔCt샘플 - ΔCt참조.
Ig ELISA
분석은 이전에 설명된 바와 같이 수집된 전혈로부터의 혈청에 대해 수행하였다 (10). 간단히 설명하면, ELISA 플레이트 (넝크)를 열-사멸시킨 씨. 로덴티움 또는 PBS 중에 1/1000으로 희석한 염소 항-마우스 Ig 포획 Ab로 코팅하였다 (서던바이오테크 (SouthernBiotech)). 코팅된 플레이트를 PBS + 0.05% 트윈 20 내에서 세척하고, 1 h 동안 300 ㎕의 차단 버퍼 (PBS + 0.5% BSA + 10 PPM Proclin)으로 차단시키고 세척한 후, 연속 희석시킨 표준품 (마우스 모노클로날 IgA, IgG, IgG3 및 IgM (서던바이오테크); IgG1, IgG2a 및 IgG2b 이소형 (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich); 마우스 IgG2c (베틸 래보래토리스 (Bethyl Laboratories)) 또는 미지물을 첨가하였다. 샘플을 4시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 5회 세척하고, Ig 이소형은 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 컨쥬게이팅된 염소 항-마우스 IgA, IgM, IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, 및 IgG3 (서던바이오테크)를 사용하여 검출하고, 분석 희석제 (PBS + 0.5% BSA + 0.05% 트윈 20 + 10 PPM 프로클린, pH 7.4)에 1/4,000으로 희석하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 세척한 후, TMB 퍼옥시다제 기질을 각각의 웰에 첨가하고 15분 동안 발색시킨 후, 중지 용액 (1 M 인산)을 각각의 웰에 첨가하였다. 흡광도를 몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices; 미국 캘리포니아주 서니베일) 플레이트 판독기에서 OD450에서 450 nm에서 판독하였다.
시험관 내 결장 배양
결장을 C57B1/6 마우스로부터 제거하였다. 냉 PBS로 깨끗이 한 후, 결장을 세로로 절단하였다. 결장을 2.5 ㎍/ml의 푼지존 (Fungizone)-암포테리신 B, 10 ㎍/ml 겐타미신, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (모두 깁코 (GIBCO), 인비트로겐 (Invitrogen))을 함유하는 10 ml HBSS (미디어테크 (Mediatech)) 버퍼와 함께 100 mm 페트리 접시 (Petri dish)에 넣었다. 결장을 페트리 접시의 가장자리에서 부드럽게 긁어 점막을 제거하고, 새로운 HBSS 버퍼와 함께 새로운 페트리 접시에 옮겼다. 결장을 1-2 mm 조각으로 절단하고, 24-웰 플레이트에 10% 열 불활성화 FCS (하이클론 (HyClone)), 2.5 ㎍/ml의 푼지존-암포테리신 B, 10 ㎍/ml 겐타미신, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 버퍼 내에 50 mg 결장/1 ml/웰로 옮겼다. 10 ㎍/ml의 IL-22 (알앤디 시스템즈 (R&D systems))를 배양액에 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다.
마이크로어레이 분석
총 RNA 샘플의 양 및 품질은 각각 ND-1000 분광광도계 (나노드롭 테크놀로지스 (Nanodrop Technologies)) 및 Bioanalyzer 2100 (애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies))를 사용하여 결정하였다. Cy-염료 표지된 cRNA 및 어레이 혼성화의 준비를 위한 방법은 애질런트 테크놀로지스에서 제공되었다. 간단히 설명하면, 애질런트의 Low RNA Input Fluorescent Linear 증폭 키트를 사용하여 총 RNA 샘플을 이중 가닥 cDNA, 및 이어서 Cy-염료 표지된 cRNA로 전환시켰다. 표지된 cRNA를 RNeasy 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. cRNA 수율 및 Cy-염료 혼입은 ND-1000 분광광도계를 사용하여 결정하였다. 750 ng의 표지된 cRNA를 단편화시키고 제조사의 계내 혼성화 키트-플러스에 설명된 바와 같이 애질런트의 전체 마우스 게놈 어레이에 혼성화시켰다. 모든 샘플을 Cy5로 표지하고, Cy3 표지된 보편적 마우스 참조물 (스트라타젠 (Stratagene))에 대해 혼성화시켰다. 혼성화 후에, 어레이를 세척하고, 건조시키고, 애질런트의 DNA 마이크로어레이 스캐너 상에서 스캐닝하였다. 애질런트의 Feature Extraction 소프트웨어 8.5를 사용하여 획득된 어레이 영상을 분석하였다. 마이크로어레이 데이타 클러스터링을 위해 (도 20), 발현 데이타를 표준 방법에 의해 애질런트 로그-비 (log-ratio) 데이타로 처리하였다. 선택된 유전자는 피어슨 상관 계수에 의해 가장 크게 연관된 벡터의 반복 응집에 의해 클러스터링하였고, 여기서 응집된 벡터에 대한 데이타는 평균 연관법에 의해 요약되었다.
시험관 내 마우스 꼬리 끝 섬유모세포 배양 및 자극
꼬리 끝 섬유모세포 (TTF)를 확립하기 위해, IL-17RC-/- 성체 마우스 및 야생형 한배 새끼로부터의 꼬리를 벗기고, 1 cm 조각으로 갈고, 배양 접시에 넣고, 고글루코스 DMEM (10% FCS, 2 nm 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 함유) 내에서 5일 동안 인큐베이팅하였다. 이식편 조각으로부터 이동한 세포를 새로운 플레이트 (계대 (passage) 2)로 옮기고 동일한 배지 내에 유지하였다. 자극 실험을 위해 계대 3의 TTF를 사용하였다. TTF를 24-웰 플레이트 내로 1.2x105/웰의 밀도로 접종하였다. 접종 24시간 후에, 재조합 쥐 IL-17A 및 IL-17F (알앤디 시스템즈)를 배양 배지에 다양한 농도로 첨가하였다. 세포 배양 상등액을 시토킨의 첨가 24시간 후에 수거하고, 쥐 IL-6의 수준을 제조자의 지시에 따라 마우스 IL-6 ELISA 세트 (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences))에 의한 효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 측정하였다.
생체 내에서 쥐 IL -22의 차단
차단 항-마우스 IL-22 (클론 8E11, 이소형 마우스 IgG1) mAb (11)를 씨. 로덴티움 감염 전에 (제0일) 또는 감염 8일 후에 (제8일) 150 ㎍/마우스의 용량으로 격일로 복강내 주사하였다. 특정 대조군에 또한 이소형 대조군 IgG1 mAb를 투여하였다.
통계학
통계적 유의성은 Prism 소프트웨어 (그래프패드 (GraphPad))를 사용하는 1-웨이 (way) 또는 2-웨이 ANOVA에 의해 계산하였다. 모든 p 값≤0.05은 유의한 것으로 간주되고, 문헌에 나타낸다. 달리 명시하지 않으면, 데이타가 제시되는 모든 연구는 적어도 2회의 독립적인 실험을 대표한다.
상기한 발명은 이해의 명료함을 위한 목적으로 예시 및 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되었지만, 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용되는 모든 특허 및 학술 문헌의 개시내용은 그 전문이 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
실시예 10: LT 경로는 시트로박터 로덴티움 감염 동안 IL -22에 의해 매개된 다.
IL-22이 LT 차단에 의해 유발된 사망률에 대해 중요한지 결정하는 것을 돕기 위해, 본 발명들은 구조 (rescue) 실험을 수행하였고, 여기서 LTbR-Fc 처리와 동시에 마우스에서 IL-22를 발현시켰다. IL-22 발현을 위해 사용한 방법은 마우스 IL-22를 코딩하는 플라스미드 DNA의 유체역학적 (hydrodynamic) 꼬리 정맥 전달이었다. 인간 LTbR-Ig는 다음과 같이 구성하였다: 세포외 도메인 (위치 1 내지 위치 224; 서열 57)을 포함하는 인간 LTbR을, LTbR 서열 하류의 인간 IgG1 Fc 구역 (서열 58)을 코딩하는 변형된 pRK5 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 단백질을 CHO 세포에서 과다발현시키고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 쥐 LTbR.Ig는 다음과 같이 구성하였다: 세포외 도메인 (위치 1 내지 위치 222; 서열 59)을 포함하는 쥐 LTbR을, LTbR 서열 하류의 쥐 IgG2a Fc 구역 (서열 60)을 코딩하는 변형된 pRK5 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
도 21에서, LTbR-Fc가 IL-22 차단에 유사한 체중 감소 곡선 (도 21 우측 패널) 및 사망 곡선 (도 21 좌측 패널)을 생성함을 발견하였고, 이 때문에 LT와 IL-22 사이의 관계를 검사하였다. 씨. 로덴티움 감염은 결장에서 IL-22의 초기 발현을 일으킨다.
도 21은 시트로박터 로덴티움을 접종한 마우스의 생존율을 도시한 것이다. 6-8주령의 Balb/c 마우스를 8 h 동안 굶긴 후 2x109 씨. 로덴티움 균주 DBS100 (ATCC 51459; 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션)을 마우스당 200 ㎕의 총 부피로 경구 접종하였다. 굶기는 동안, 동물을 물에 접근하도록 하였다. 접종 및 모든 후속 조작은 BL-2 생물안전 캐비넷 내에서 수행하였다. 동물을 접종 후에 먹이에 접근하도록 하였다. 세균은 37℃에서 밤새 LB 브로쓰 내에서 진탕하면서 인큐베이션하여 준비하였다. 세균의 상대 농도는 OD600에서 흡광도를 측정하여 평가하였고, 투여된 CFU를 확인하기 위해 각각의 접종 배양액을 연속 희석하고 플레이팅하였다. 접종 일에, 마우스에게 또한 150 ㎍의 항-gp120 mAb, 항-IL-22 8E11 mAb, 또는 LTbR-Fc를 매주 3회 주사하였다.
LT 경로는 IL -22 생산에 중요한 다수의 상류 위치를 조절한다. 도 22는 씨. 로덴티움 감염 후에 LT 경로에 대한 데이타를 제공한다. A, C, E. 결장을 씨. 로덴티움 감염 후에 상이한 시점에서 수거하였다. 마우스에게 150 ㎍ 항-gp120 또는 LTbR-Fc를 격일로 주사하였다. RNA를 퀴아젠 RNeasy 키트를 사용하여 추출하였다. Taqman 분석을 수행하여 제0일 시점에 비해 IL-22, RegIIg, p19, 또는 p40의 발현을 결정하였다. B. 감염 후 제4일에, 결장을 수집하였다. 냉 PBS로 깨끗이 한 후, 결장을 세로로 절단하였다. 결장을 2.5 ㎍/ml의 푼지존-암포테리신 B, 10 ㎍/ml 겐타미신, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (모두 깁코, 인비트로겐)을 함유하는 10 ml HBSS (미디어테크) 버퍼와 함께 100 mm 페트리 접시에 넣었다. 결장을 페트리 접시의 가장자리에서 부드럽게 긁어 점막을 제거하고, 새로운 HBSS 버퍼와 함께 새로운 페트리 접시에 옮겼다. 결장을 1-2 mm 조각으로 절단하고, 24-웰 플레이트에 10% 열 불활성화 FCS (하이클론), 2.5 ㎍/ml의 푼지존-암포테리신 B, 10 ㎍/ml 겐타미신, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 버퍼 내에 50 mg 결장/1 ml/웰로 옮겼다. 10 ㎍/ml의 rmIL-22 (알앤디 시스템즈)를 배양액에 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. IL-22 ELISA를 위해 상등액을 수집하였다. D. 제6일 결장 고유판 세포. CD11c+ 및 MHC II+에 의해 결정된 DC. 결장을 수거하고, 2% FBS 및 10 mM HEPES를 함유하는 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS (인비트로겐)로 씻어냈다. 결장을 세로로 절단한 후, 2-4 cm 조각으로 절편화하고, 조각을 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS, 2% FBS, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, 및 1 mM DTT (시그마-알드리치)와 함께 10 cm 접시에 옮겼다. IEL 분획을 수집하고, 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 45분 인큐베이션한 후에 폐기하였다. LPMC 단리를 위해, 남아있는 상피층을 벗겨내고, 결장 조각을 깍둑썰기하고, 10% PCS, 20 mM HEPES, 및 0.5 mg/ml 콜라게나제/디스파제를 함유하는 RPMI (로슈 다이아그노스틱스 (Roche Diagnostics))에 넣었다. 결장 조각을 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 단리된 상피 세포를 세척하고 FACS 분석에 사용하였다.
도 22에서, LTbR-Fc가 IL-22, 및 IL-22에 의해 유도되는 것으로 나타난 RegIIIg의 유도를 차단하였음을 발견하였다 (도 22A-C). 수지상 세포는 이전에 IL-22를 생산하는 것으로 나타났고, 본 발명자들은 감염 6일 후에 결장의 고유판에서 DC 수가 근소하게 감소한 것을 발견하였다 (도 22D). LTbR-Fc에 의해 유발된 IL-22의 감소는 아마도 IL-23의 손실로 인한 것이고. 이는 p19 및 p40 발현이 모두 감염 동안 LTbR-Fc 처리에 의해 억제되기 때문이다 (도 22E).
IL -22는 LTbR 처리된 마우스에서 보이는 결함을 부분적으로 구조한다. 도 23은 LTbR 처리된 마우스에 대한 IL-22의 효과에 관한 데이타를 제공한다. A. IL-22 플라스미드의 꼬리 정맥 주사 후에 혈청에서 IL-22의 발현, 및 결장에서 RegIIIg의 발현의 시험. B. IL-22 플라스미드를 사용한 LTbRFc 효과의 구조.
제-1일에, 동물을 계량하고 분류하고, 여분의 마우스를 안락사시켰다. 계량 후에, 모든 동물을 14 h 동안 굶겼다. 다음날 (제0일), 모든 마우스에게 200 ㎕ PBS 중의 2-4 X109 CFU의 씨. 로덴티움을 경구 접종하였다. 150 ㎍ 대조 mAb 또는 Fc 융합 단백질을 200 ㎕ PBS 내에서 세균 접종과 동일한 날에 시작하여 2주 동안 매주 3회 i.p. 주사하였다. 먹이는 접종 후에 조사자가 다시 공급하였다. 6시간 후에, 플라스미드 DNA를 꼬리 정맥에 주사하였다. 꼬리 정맥 주사 실험: 1) DNA 구성체 (pRK 벡터 또는 pRK-mIL-22)를 링거 용액에 10 ㎍/마우스/주사의 최종 용량을 제공하는 농도로 희석시켰다. 2) 각각의 마우스에게 링거 용액 중 DNA를 함유하는 용액 약 1.6 ml을 꼬리 정맥에서 정맥내 주사하였다. 3) 용량은 최대 DNA 흡수를 위해 4-5초 (최대 8초)에 걸쳐 볼러스 정맥내 주사 (꼬리 정맥)로서 투여하였다. 마우스를 체온을 증가시키고 혈관을 확장시키기 위해 가열 요소를 갖는 원추형 아크릴 구속기 내에 마취하지 않고 구속하였다. 4) 일회용 멸균 시린지를 각각의 동물에 대해 사용하였다. 동물을 임상적으로 정상일 때까지 계속 모니터링하였다. 5) 동물을 투약 후 적어도 20분 동안 임의의 부정적인 임상 징후에 대해 관찰하였다. 동물이 투약 후 1시간까지 임상적으로 정상이 아니면, 이들을 안락사시키거나 임상적으로 정상일 때까지 모니터링하였다. 빈사 상태의 동물을 안락사시켰다. 모든 조작을 BL-2 생물안전 캐비넷 내에서 수행하였다. 감염 동안, 빈사 상태의 동물, 또는 완화되지 않은 고통 또는 직장 탈출을 보이는 동물을 안락사시켰다.
마우스를 4주 동안 매일 모니터링하였다. LTbR-Fc 처리된 마우스가 빈사 상태가 될 수 있는 제5일 내지 제17일에, 마우스를 주말을 포함하여 매일 2회 모니터링하였다. 배설물을 매주 수집하여 씨. 로덴티움의 CFU를 측정하였다. 연구 동안 마우스를 매주 1회 계량하였다. 마우스가 15% 이상의 체중 감소를 보이면 매일 계량하였다. 체중 감소가 20%를 초과하면, 마우스를 안락사시켰다. 연구의 끝에, 모든 마우스를 안락사시키고, 조직학, RNA 또는 FACS 분석을 위해 비장 및 결장을 수집하였다.
도 23A에 제시된 바와 같이, 주사 2시간 후에 시작하여 마우스 혈청에서 IL-22의 발현을 검출할 수 있고, 여기서 발현은 72시간에 감소한다. 또한 결장에서 RegIIIg의 발현을 검출할 수 있고, 이는 활성 IL-22가 상기 방식으로 발현될 때 결장에 대해 작용할 수 있음을 제안한다. IL-22는 감염 동안 LTb-Fc 처리에 의해 유도된 사망률 및 체중 감소를 부분적으로 구조할 수 있었다 (도 23B).
IL -22 mAb (8 E11 )를 사용한 마우스의 처리. 도 24는 IL-22 mAb 8E11를 사용한 처리가, 감소된 결장 소포, 손상된 B/T 세포 조직, 및 결장에서 감소된 DC, T 세포 및 B 세포 수를 야기하는 것을 입증하는 데이타를 보여준다. A. 감염 6일 후에, 결장을 수거하고 세로로 절개하였다. 2% FBS, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, 및 1 mM DTT를 함유하는 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS 내에서 30분 인큐베이션 후에, 결장을 부드럽게 긁어 상피 세포를 제거하였다. 소포는 백색의 둥근 덩어리로서 확인되었다. 군당 5마리의 마우스가 존재하고, 각각의 결장을 계수하고 발견된 총 소포 또는 발견된 1 mm 초과의 총 소포로서 플로팅하였다. B. 감염 6일 후에, 결장을 냉 PBS로 씻어내고 OCT 내에서 급속 냉동시켰다. 6 마이크로미터 절편을 절단하고, 건조시킨 후, 아세톤 내에서 고정시켰다. 절편을 10% 혈청으로 차단하고, 항-CD5 FFFC 및 항-B220 APC와 함께 각각 10 ㎍/ml에서 인큐베이팅하였다. 영상은 NIKON BX61 현미경에서 캡쳐하였다. C. 감염 6일 후에, 결장 고유판 세포를 상기 설명한 바와 같이 단리하였다. FAC 분석을 수행하여, 8E11 처리 후의 수지상 세포, CD3 T 세포, 및 B 세포의 수를 결정하였다.
도 24에 제시된 바와 같이, 마우스를 IL-22 차단 항체 또는 LTbR-Fc로 처리하고, IL-22가 결장 림프 구조의 형성에 일정 역할을 할 수 있을지 결정하기 위해 감염 6일 후에 결장 내의 림프 소포를 계수하였다. 본 발명자들은 1 mm를 초과하는 소포가 감소한 것을 발견하였고, 이는 IL-22 및 LT가 감염 후에 소포 크기 증가에 중요할 수 있음을 제안한다 (도 24A). 조직학적 분석에서는 차단 IL-22는 소포의 T 및 B 세포 대역을 파괴하는 한편, LT 차단은 유사한 효과를 가졌음을 보여준다 (도 24B). 이어서, IL-22의 차단이 결장 고유판 내의 세포수 변화를 야기하는지 결정하였다. 본 발명자들은 IL-22 차단이 감염 동안 DC, T 세포, 및 B 세포 수의 감소를 야기함을 밝혔다. 결론적으로, IL-22는 림프 소포 형성에 중요한 것으로 보이고, 결장에서 림프독소 경로의 중요한 하류 성분일 수 있다.
Sequence Listing <110> Genentech, Inc. Abbas, Alexander R. Danilenko, Dimitry M. de Sauvage, Frederic J. Ghilardi, Nico P. Modrusan, Zora Ouyang, Wenjun Valdez, Patricia A. Zheng, Yan <120> Compositions and Methods for Treatment of Microbial Disorders <130> GNE-0303PCT <140> Not yet Assigned <141> Herewith <150> 60/986,170 <151> 2007-11-07 <150> 61/013,620 <151> 2007-12-13 <150> 61/015,620 <151> 2007-12-20 <160> 61 <210> 1 <211> 1131 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cattctgccc tcgagcccac cgggaacgaa agagaagctc tatctcccct 50 ccaggagccc agctatgaac tccttctcca caagcgcctt cggtccagtt 100 gccttctccc tggggctgct cctggtgttg cctgctgcct tccctgcccc 150 agtaccccca ggagaagatt ccaaagatgt agccgcccca cacagacagc 200 cactcacctc ttcagaacga attgacaaac aaattcggta catcctcgac 250 ggcatctcag ccctgagaaa ggagacatgt aacaagagta acatgtgtga 300 aagcagcaaa gaggcactgg cagaaaacaa cctgaacctt ccaaagatgg 350 ctgaaaaaga tggatgcttc caatctggat tcaatgagga gacttgcctg 400 gtgaaaatca tcactggtct tttggagttt gaggtatacc tagagtacct 450 ccagaacaga tttgagagta gtgaggaaca agccagagct gtgcagatga 500 gtacaaaagt cctgatccag ttcctgcaga aaaaggcaaa gaatctagat 550 gcaataacca cccctgaccc aaccacaaat gccagcctgc tgacgaagct 600 gcaggcacag aaccagtggc tgcaggacat gacaactcat ctcattctgc 650 gcagctttaa ggagttcctg cagtccagcc tgagggctct tcggcaaatg 700 tagcatgggc acctcagatt gttgttgtta atgggcattc cttcttctgg 750 tcagaaacct gtccactggg cacagaactt atgttgttct ctatggagaa 800 ctaaaagtat gagcgttagg acactatttt aattattttt aatttattaa 850 tatttaaata tgtgaagctg agttaattta tgtaagtcat atttatattt 900 ttaagaagta ccacttgaaa cattttatgt attagttttg aaataataat 950 ggaaagtggc tatgcagttt gaatatcctt tgtttcagag ccagatcatt 1000 tcttggaaag tgtaggctta cctcaaataa atggctaact tatacatatt 1050 tttaaagaaa tatttatatt gtatttatat aatgtataaa tggtttttat 1100 accaataaat ggcattttaa aaaattcagc a 1131 <210> 2 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser 1 5 10 15 Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val 20 25 30 Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln 35 40 45 Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile 50 55 60 Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser 65 70 75 Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu 80 85 90 Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly 95 100 105 Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu 110 115 120 Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser 125 130 135 Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu 140 145 150 Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr 155 160 165 Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln 170 175 180 Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu 185 190 195 Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg 200 205 210 Gln Met <210> 3 <211> 2347 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctgtttcagg gccattggac tctccgtcct gcccagagca agatgtgtca 50 ccagcagttg gtcatctctt ggttttccct ggtttttctg gcatctcccc 100 tcgtggccat atgggaactg aagaaagatg tttatgtcgt agaattggat 150 tggtatccgg atgcccctgg agaaatggtg gtcctcacct gtgacacccc 200 tgaagaagat ggtatcacct ggaccttgga ccagagcagt gaggtcttag 250 gctctggcaa aaccctgacc atccaagtca aagagtttgg agatgctggc 300 cagtacacct gtcacaaagg aggcgaggtt ctaagccatt cgctcctgct 350 gcttcacaaa aaggaagatg gaatttggtc cactgatatt ttaaaggacc 400 agaaagaacc caaaaataag acctttctaa gatgcgaggc caagaattat 450 tctggacgtt tcacctgctg gtggctgacg acaatcagta ctgatttgac 500 attcagtgtc aaaagcagca gaggctcttc tgacccccaa ggggtgacgt 550 gcggagctgc tacactctct gcagagagag tcagagggga caacaaggag 600 tatgagtact cagtggagtg ccaggaggac agtgcctgcc cagctgctga 650 ggagagtctg cccattgagg tcatggtgga tgccgttcac aagctcaagt 700 atgaaaacta caccagcagc ttcttcatca gggacatcat caaacctgac 750 ccacccaaga acttgcagct gaagccatta aagaattctc ggcaggtgga 800 ggtcagctgg gagtaccctg acacctggag tactccacat tcctacttct 850 ccctgacatt ctgcgttcag gtccagggca agagcaagag agaaaagaaa 900 gatagagtct tcacggacaa gacctcagcc acggtcatct gccgcaaaaa 950 tgccagcatt agcgtgcggg cccaggaccg ctactatagc tcatcttgga 1000 gcgaatgggc atctgtgccc tgcagttagg ttctgatcca ggatgaaaat 1050 ttggaggaaa agtggaagat attaagcaaa atgtttaaag acacaacgga 1100 atagacccaa aaagataatt tctatctgat ttgctttaaa acgttttttt 1150 aggatcacaa tgatatcttt gctgtatttg tatagttaga tgctaaatgc 1200 tcattgaaac aatcagctaa tttatgtata gattttccag ctctcaagtt 1250 gccatgggcc ttcatgctat ttaaatattt aagtaattta tgtatttatt 1300 agtatattac tgttatttaa cgtttgtctg ccaggatgta tggaatgttt 1350 catactctta tgacctgatc catcaggatc agtccctatt atgcaaaatg 1400 tgaatttaat tttatttgta ctgacaactt ttcaagcaag gctgcaagta 1450 catcagtttt atgacaatca ggaagaatgc agtgttctga taccagtgcc 1500 atcatacact tgtgatggat gggaacgcaa gagatactta catggaaacc 1550 tgacaatgca aacctgttga gaagatccag gagaacaaga tgctagttcc 1600 catgtctgtg aagacttcct ggagatggtg ttgataaagc aatttagggc 1650 cacttacact tctaagcaag tttaatcttt ggatgcctga attttaaaag 1700 ggctagaaaa aaatgattga ccagcctggg aaacataaca agaccccgtc 1750 tctacaaaaa aaatttaaaa ttagccaggc gtggtggctc atgcttgtgg 1800 tcccagctgt tcaggaggat gaggcaggag gatctcttga gcccaggagg 1850 tcaaggctat ggtgagccgt gattgtgcca ctgcatacca gcctaggtga 1900 cagaatgaga ccctgtctca aaaaaaaaaa tgattgaaat taaaattcag 1950 ctttagcttc catggcagtc ctcaccccca cctctctaaa agacacagga 2000 ggatgacaca gaaacaccgt aagtgtctgg aaggcaaaaa gatcttaaga 2050 ttcaagagag aggacaagta gttatggcta aggacatgaa attgtcagaa 2100 tggcaggtgg cttcttaaca gccctgtgag aagcagacag atgcaaagaa 2150 aatctggaat ccctttctca ttagcatgaa tgaacctgat acacaattat 2200 gaccagaaaa tatggctcca tgaaggtgct acttttaagt aatgtatgtg 2250 cgctctgtaa agtgattaca tttgtttcct gtttgtttat ttatttattt 2300 atttttgcat tctgaggctg aactaataaa aactcttctt tgtaatc 2347 <210> 4 <211> 328 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe 1 5 10 15 Leu Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val 20 25 30 Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met 35 40 45 Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp 50 55 60 Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu 65 70 75 Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys 80 85 90 His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His 95 100 105 Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln 110 115 120 Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn 125 130 135 Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr 140 145 150 Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro 155 160 165 Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val 170 175 180 Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu 185 190 195 Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val 200 205 210 Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser 215 220 225 Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 230 235 240 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser 245 250 255 Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser 260 265 270 Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys 275 280 285 Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys 290 295 300 Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr 305 310 315 Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 320 325 <210> 5 <211> 1145 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 attctctccc cagcttgctg agccctttgc tcccctggcg actgcctgga 50 cagtcagcaa ggaattgtct cccagtgcat tttgccctcc tggctgccaa 100 ctctggctgc taaagcggct gccacctgct gcagtctaca cagcttcggg 150 aagaggaaag gaacctcaga ccttccagat cgcttcctct cgcaacaaac 200 tatttgtcgc aggaataaag atggctgctg aaccagtaga agacaattgc 250 atcaactttg tggcaatgaa atttattgac aatacgcttt actttatagc 300 tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag cttgaatcta 350 aattatcagt cataagaaat ttgaatgacc aagttctctt cattgaccaa 400 ggaaatcggc ctctatttga agatatgact gattctgact gtagagataa 450 tgcaccccgg accatattta ttataagtat gtataaagat agccagccta 500 gaggtatggc tgtaactatc tctgtgaagt gtgagaaaat ttcaactctc 550 tcctgtgaga acaaaattat ttcctttaag gaaatgaatc ctcctgataa 600 catcaaggat acaaaaagtg acatcatatt ctttcagaga agtgtcccag 650 gacatgataa taagatgcaa tttgaatctt catcatacga aggatacttt 700 ctagcttgtg aaaaagagag agaccttttt aaactcattt tgaaaaaaga 750 ggatgaattg ggggatagat ctataatgtt cactgttcaa aacgaagact 800 agctattaaa atttcatgcc gggcgcagtg gctcacgcct gtaatcccag 850 ccctttggga ggctgaggcg ggcagatcac cagaggtcag gtgttcaaga 900 ccagcctgac caacatggtg aaacctcatc tctactaaaa atacaaaaaa 950 ttagctgagt gtagtgacgc atgccctcaa tcccagctac tcaagaggct 1000 gaggcaggag aatcacttgc actccggagg tagaggttgt ggtgagccga 1050 gattgcacca ttgcgctcta gcctgggcaa caacagcaaa actccatctc 1100 aaaaaataaa ataaataaat aaacaaataa aaaattcata atgtg 1145 <210> 6 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala 1 5 10 15 Met Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp 20 25 30 Glu Asn Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu 35 40 45 Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln 50 55 60 Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg 65 70 75 Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp 80 85 90 Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu 95 100 105 Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys 110 115 120 Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile 125 130 135 Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln 140 145 150 Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys 155 160 165 Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 170 175 180 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 185 190 <210> 7 <211> 1147 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cgaccaggtt ctccttcccc agtcaccagt tgctcgagtt agaattgtct 50 gcaatggccg ccctgcagaa atctgtgagc tctttcctta tggggaccct 100 ggccaccagc tgcctccttc tcttggccct cttggtacag ggaggagcag 150 ctgcgcccat cagctcccac tgcaggcttg acaagtccaa cttccagcag 200 ccctatatca ccaaccgcac cttcatgctg gctaaggagg ctagcttggc 250 tgataacaac acagacgttc gtctcattgg ggagaaactg ttccacggag 300 tcagtatgag tgagcgctgc tatctgatga agcaggtgct gaacttcacc 350 cttgaagaag tgctgttccc tcaatctgat aggttccagc cttatatgca 400 ggaggtggtg cccttcctgg ccaggctcag caacaggcta agcacatgtc 450 atattgaagg tgatgacctg catatccaga ggaatgtgca aaagctgaag 500 gacacagtga aaaagcttgg agagagtgga gagatcaaag caattggaga 550 actggatttg ctgtttatgt ctctgagaaa tgcctgcatt tgaccagagc 600 aaagctgaaa aatgaataac taaccccctt tccctgctag aaataacaat 650 tagatgcccc aaagcgattt tttttaacca aaaggaagat gggaagccaa 700 actccatcat gatgggtgga ttccaaatga acccctgcgt tagttacaaa 750 ggaaaccaat gccacttttg tttataagac cagaaggtag actttctaag 800 catagatatt tattgataac atttcattgt aactggtgtt ctatacacag 850 aaaacaattt attttttaaa taattgtctt tttccataaa aaagattact 900 ttccattcct ttaggggaaa aaacccctaa atagcttcat gtttccataa 950 tcagtacttt atatttataa atgtatttat tattattata agactgcatt 1000 ttatttatat cattttatta atatggattt atttatagaa acatcattcg 1050 atattgctac ttgagtgtaa ggctaatatt gatatttatg acaataatta 1100 tagagctata acatgtttat ttgacctcaa taaacacttg gatatcc 1147 <210> 8 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr 1 5 10 15 Leu Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly 20 25 30 Gly Ala Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser 35 40 45 Asn Phe Gln Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala 50 55 60 Lys Glu Ala Ser Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile 65 70 75 Gly Glu Lys Leu Phe His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr 80 85 90 Leu Met Lys Gln Val Leu Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe 95 100 105 Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro 110 115 120 Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu Ser Thr Cys His Ile Glu 125 130 135 Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val Gln Lys Leu Lys Asp 140 145 150 Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile Lys Ala Ile Gly 155 160 165 Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala Cys Ile 170 175 <210> 9 <211> 1049 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 aaaacaacag gaagcagctt acaaactcgg tgaacaactg agggaaccaa 50 accagagacg cgctgaacag agagaatcag gctcaaagca agtggaagtg 100 ggcagagatt ccaccaggac tggtgcaagg cgcagagcca gccagatttg 150 agaagaaggc aaaaagatgc tggggagcag agctgtaatg ctgctgttgc 200 tgctgccctg gacagctcag ggcagagctg tgcctggggg cagcagccct 250 gcctggactc agtgccagca gctttcacag aagctctgca cactggcctg 300 gagtgcacat ccactagtgg gacacatgga tctaagagaa gagggagatg 350 aagagactac aaatgatgtt ccccatatcc agtgtggaga tggctgtgac 400 ccccaaggac tcagggacaa cagtcagttc tgcttgcaaa ggatccacca 450 gggtctgatt ttttatgaga agctgctagg atcggatatt ttcacagggg 500 agccttctct gctccctgat agccctgtgg gccagcttca tgcctcccta 550 ctgggcctca gccaactcct gcagcctgag ggtcaccact gggagactca 600 gcagattcca agcctcagtc ccagccagcc atggcagcgt ctccttctcc 650 gcttcaaaat ccttcgcagc ctccaggcct ttgtggctgt agccgcccgg 700 gtctttgccc atggagcagc aaccctgagt ccctaaaggc agcagctcaa 750 ggatggcact cagatctcca tggcccagca aggccaagat aaatctacca 800 ccccaggcac ctgtgagcca acaggttaat tagtccatta attttagtgg 850 gacctgcata tgttgaaaat taccaatact gactgacatg tgatgctgac 900 ctatgataag gttgagtatt tattagatgg gaagggaaat ttggggatta 950 tttatcctcc tggggacagt ttggggagga ttatttattg tatttatatt 1000 gaattatgta cttttttcaa taaagtctta tttttgtggc taaaaaaaa 1049 <210> 10 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp 1 5 10 15 Thr Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp 20 25 30 Thr Gln Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp 35 40 45 Ser Ala His Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly 50 55 60 Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp 65 70 75 Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu 80 85 90 Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly 95 100 105 Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro 110 115 120 Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu 125 130 135 Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Gln Gln Ile Pro Ser Leu 140 145 150 Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Phe Lys Ile 155 160 165 Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val Phe 170 175 180 Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro 185 <210> 11 <211> 808 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gatataaagc tcctacagct acctggcctg agaagccaac tcagactcag 50 ccaacagaga ttgttgattt gcctcttaag caagagattc attgcagctc 100 agcatggctc agaccagctc atacttcatg ctgatctcct gcctgatgtt 150 tctgtctcag agccaaggcc aagaggccca gacagagttg ccccaggccc 200 ggatcagctg cccagaaggc accaatgcct atcgctccta ctgctactac 250 tttaatgaag accgtgagac ctgggttgat gcagatctct attgccagaa 300 catgaattcg ggcaacctgg tgtctgtgct cacccaggcc gagggtgcct 350 ttgtggcctc actgattaag gagagtggca ctgatgactt caatgtctgg 400 attggcctcc atgaccccaa aaagaaccgc cgctggcact ggagcagtgg 450 gtccctggtc tcctacaagt cctggggcat tggagcccca agcagtgtta 500 atcctggcta ctgtgtgagc ctgacctcaa gcacaggatt ccagaaatgg 550 aaggatgtgc cttgtgaaga caagttctcc tttgtctgca agttcaaaaa 600 ctagaggcaa ctggaaaata catgtctaga actgatccag caattacaac 650 ggagtcaaaa attaaaccgg accatctctc caactcaact caacctggac 700 actctcttct ctgctgagtt tgccttgtta atcttcaata gttttaccta 750 ccccagtctt tggaacccta aataataaaa ataaacatgt ttccactatt 800 gtgctgtc 808 <210> 12 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Gln Thr Ser Ser Tyr Phe Met Leu Ile Ser Cys Leu Met 1 5 10 15 Phe Leu Ser Gln Ser Gln Gly Gln Glu Ala Gln Thr Glu Leu Pro 20 25 30 Gln Ala Arg Ile Ser Cys Pro Glu Gly Thr Asn Ala Tyr Arg Ser 35 40 45 Tyr Cys Tyr Tyr Phe Asn Glu Asp Arg Glu Thr Trp Val Asp Ala 50 55 60 Asp Leu Tyr Cys Gln Asn Met Asn Ser Gly Asn Leu Val Ser Val 65 70 75 Leu Thr Gln Ala Glu Gly Ala Phe Val Ala Ser Leu Ile Lys Glu 80 85 90 Ser Gly Thr Asp Asp Phe Asn Val Trp Ile Gly Leu His Asp Pro 95 100 105 Lys Lys Asn Arg Arg Trp His Trp Ser Ser Gly Ser Leu Val Ser 110 115 120 Tyr Lys Ser Trp Gly Ile Gly Ala Pro Ser Ser Val Asn Pro Gly 125 130 135 Tyr Cys Val Ser Leu Thr Ser Ser Thr Gly Phe Gln Lys Trp Lys 140 145 150 Asp Val Pro Cys Glu Asp Lys Phe Ser Phe Val Cys Lys Phe Lys 155 160 165 Asn <210> 13 <211> 773 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 aagccacctc aagtggacaa ggcacttacc aacagagatt gctgatttgc 50 tccttaagca agagattcac tgccgctaag catggctcag accaactcgt 100 tcttcatgct gatctcctcc ctgatgttcc tgtctctgag ccaaggccag 150 gagtcccaga cagagctgcc taatccccga atcagctgcc cagaaggcac 200 caatgcctat cgctcctact gctactactt taatgaagac cctgagacct 250 gggttgatgc agatctctat tgccagaaca tgaattcagg caacctggtg 300 tctgtgctca cccaggcgga gggtgccttc gtggcctcac tgattaagga 350 gagtagcact gatgacagca atgtctggat tggcctccat gacccaaaaa 400 agaaccgccg ctggcactgg agtagtgggt ccctggtctc ctacaagtcc 450 tgggacactg gatccccgag cagtgctaat gctggctact gtgcaagcct 500 gacttcatgc tcaggattca agaaatggaa ggatgaatct tgtgagaaga 550 agttctcctt tgtttgcaag ttcaaaaact agaggaagct gaaaaatgga 600 tgtctagaac tggtcctgca attactatga agtcaaaaat taaactagac 650 tatgtctcca actcagttca gaccatctcc tccctaatga gtttgcatcg 700 ctgatcttca gtaccttcac ctgtctcagt ctctagagcc ctgaaaaata 750 aaaacaaact tatttttatc cag 773 <210> 14 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ala Gln Thr Asn Ser Phe Phe Met Leu Ile Ser Ser Leu Met 1 5 10 15 Phe Leu Ser Leu Ser Gln Gly Gln Glu Ser Gln Thr Glu Leu Pro 20 25 30 Asn Pro Arg Ile Ser Cys Pro Glu Gly Thr Asn Ala Tyr Arg Ser 35 40 45 Tyr Cys Tyr Tyr Phe Asn Glu Asp Pro Glu Thr Trp Val Asp Ala 50 55 60 Asp Leu Tyr Cys Gln Asn Met Asn Ser Gly Asn Leu Val Ser Val 65 70 75 Leu Thr Gln Ala Glu Gly Ala Phe Val Ala Ser Leu Ile Lys Glu 80 85 90 Ser Ser Thr Asp Asp Ser Asn Val Trp Ile Gly Leu His Asp Pro 95 100 105 Lys Lys Asn Arg Arg Trp His Trp Ser Ser Gly Ser Leu Val Ser 110 115 120 Tyr Lys Ser Trp Asp Thr Gly Ser Pro Ser Ser Ala Asn Ala Gly 125 130 135 Tyr Cys Ala Ser Leu Thr Ser Cys Ser Gly Phe Lys Lys Trp Lys 140 145 150 Asp Glu Ser Cys Glu Lys Lys Phe Ser Phe Val Cys Lys Phe Lys 155 160 165 Asn <210> 15 <211> 807 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 aaaccatacc atatcccacc agagagtgac tcctgattgc ctcctcaagt 50 cgcagacact atgctgcctc ccatggccct gcccagtgta tcttggatgc 100 tgctttcctg cctcatgctg ctgtctcagg ttcaaggtga agaaccccag 150 agggaactgc cctctgcacg gatccgctgt cccaaaggct ccaaggccta 200 tggctcccac tgctatgcct tgtttttgtc accaaaatcc tggacagatg 250 cagatctggc ctgccagaag cggccctctg gaaacctggt gtctgtgctc 300 agtggggctg agggatcctt cgtgtcctcc ctggtgaaga gcattggtaa 350 cagctactca tacgtctgga ttgggctcca tgaccccaca cagggcaccg 400 agcccaatgg agaaggttgg gagtggagta gcagtgatgt gatgaattac 450 tttgcatggg agagaaatcc ctccaccatc tcaagccccg gccactgtgc 500 gagcctgtcg agaagcacag catttctgag gtggaaagat tataactgta 550 atgtgaggtt accctatgtc tgcaagttca ctgactagtg caggagggaa 600 gtcagcagcc tgtgtttggt gtgcaactca tcatgggcat gagaccagtg 650 tgaggactca ccctggaaga gaatattcgc ttaattcccc caacctgacc 700 acctcattct tatctttctt ctgtttcttc ctccccgctg tcatttcagt 750 ctcttcattt tgtcatacgg cctaaggctt taaagagcaa taaaattttt 800 agtctgc 807 <210> 16 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Leu Pro Pro Met Ala Leu Pro Ser Val Ser Trp Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Cys Leu Met Leu Leu Ser Gln Val Gln Gly Glu Glu Pro Gln 20 25 30 Arg Glu Leu Pro Ser Ala Arg Ile Arg Cys Pro Lys Gly Ser Lys 35 40 45 Ala Tyr Gly Ser His Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser Pro Lys Ser 50 55 60 Trp Thr Asp Ala Asp Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Ser Gly Asn 65 70 75 Leu Val Ser Val Leu Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Val Ser Ser 80 85 90 Leu Val Lys Ser Ile Gly Asn Ser Tyr Ser Tyr Val Trp Ile Gly 95 100 105 Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Glu Gly Trp 110 115 120 Glu Trp Ser Ser Ser Asp Val Met Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Arg 125 130 135 Asn Pro Ser Thr Ile Ser Ser Pro Gly His Cys Ala Ser Leu Ser 140 145 150 Arg Ser Thr Ala Phe Leu Arg Trp Lys Asp Tyr Asn Cys Asn Val 155 160 165 Arg Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Thr Asp 170 175 <210> 17 <211> 784 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 aaaccatacc atatcccacc agagagtcgc agacactatg ctgcctccca 50 tggccctgcc cagtgtatct tggatgctgc tttcctgcct catgctgctg 100 tctcaggttc aaggtgaaga accccagagg gaactgccct ctgcacggat 150 ccgctgtccc aaaggctcca aggcctatgg ctcccactgc tatgccttgt 200 ttttgtcacc aaaatcctgg acagatgcag atctggcctg ccagaagcgg 250 ccctctggaa acctggtgtc tgtgctcagt ggggctgagg gatccttcgt 300 gtcctccctg gtgaagagca ttggtaacag ctactcatac gtctggattg 350 ggctccatga ccccacacag ggcaccgagc ccaatggaga aggttgggag 400 tggagtagca gtgatgtgat gaattacttt gcatgggaga gaaatccctc 450 caccatctca agccccggcc actgtgcgag cctgtcgaga agcacagcat 500 ttctgaggtg gaaagattat aactgtaatg tgaggttacc ctatgtctgc 550 aagttcactg actagtgcag gagggaagtc agcagcctgt gtttggtgtg 600 caactcatca tgggcatgag accagtgtga ggactcaccc tggaagagaa 650 tattcgctta attcccccaa cctgaccacc tcattcttat ctttcttctg 700 tttcttcctc cccgctgtca tttcagtctc ttcattttgt catacggcct 750 aaggctttaa agagcaataa aatttttagt ctgc 784 <210> 18 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Leu Pro Pro Met Ala Leu Pro Ser Val Ser Trp Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Cys Leu Met Leu Leu Ser Gln Val Gln Gly Glu Glu Pro Gln 20 25 30 Arg Glu Leu Pro Ser Ala Arg Ile Arg Cys Pro Lys Gly Ser Lys 35 40 45 Ala Tyr Gly Ser His Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser Pro Lys Ser 50 55 60 Trp Thr Asp Ala Asp Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Ser Gly Asn 65 70 75 Leu Val Ser Val Leu Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Val Ser Ser 80 85 90 Leu Val Lys Ser Ile Gly Asn Ser Tyr Ser Tyr Val Trp Ile Gly 95 100 105 Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Glu Gly Trp 110 115 120 Glu Trp Ser Ser Ser Asp Val Met Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Arg 125 130 135 Asn Pro Ser Thr Ile Ser Ser Pro Gly His Cys Ala Ser Leu Ser 140 145 150 Arg Ser Thr Ala Phe Leu Arg Trp Lys Asp Tyr Asn Cys Asn Val 155 160 165 Arg Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Thr Asp 170 175 <210> 19 <211> 1002 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gggagggtcc cttcctcagg gagcacagga actctgagac tcagcaaggg 50 tgtcctggga gggctcgggg atgggagagt acacagattc acaactcatt 100 cagaactgta gaagatgatg gatgtgacca agatcacttt agtcctaggg 150 gactagagaa ggaaaatgac atgaggcagt ggggtatctg tgtgttctcc 200 cactgaccac gctttcttta gtgactcctg attgcctcct caagtcgcag 250 acactatgct gcctcccatg gccctgccca gtgtatcttg gatgctgctt 300 tcctgcctca tgctgctgtc tcaggttcaa ggtgaagaac cccagaggga 350 actgccctct gcacggatcc gctgtcccaa aggctccaag gcctatggct 400 cccactgcta tgccttgttt ttgtcaccaa aatcctggac agatgcagat 450 ctggcctgcc agaagcggcc ctctggaaac ctggtgtctg tgctcagtgg 500 ggctgaggga tccttcgtgt cctccctggt gaagagcatt ggtaacagct 550 actcatacgt ctggattggg ctccatgacc ccacacaggg caccgagccc 600 aatggagaag gttgggagtg gagtagcagt gatgtgatga attactttgc 650 atgggagaga aatccctcca ccatctcaag ccccggccac tgtgcgagcc 700 tgtcgagaag cacagcattt ctgaggtgga aagattataa ctgtaatgtg 750 aggttaccct atgtctgcaa gttcactgac tagtgcagga gggaagtcag 800 cagcctgtgt ttggtgtgca actcatcatg ggcatgagac cagtgtgagg 850 actcaccctg gaagagaata ttcgcttaat tcccccaacc tgaccacctc 900 attcttatct ttcttctgtt tcttcctccc cgctgtcatt tcagtctctt 950 cattttgtca tacggcctaa ggctttaaag agcaataaaa tttttagtct 1000 gc 1002 <210> 20 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Leu Pro Pro Met Ala Leu Pro Ser Val Ser Trp Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Cys Leu Met Leu Leu Ser Gln Val Gln Gly Glu Glu Pro Gln 20 25 30 Arg Glu Leu Pro Ser Ala Arg Ile Arg Cys Pro Lys Gly Ser Lys 35 40 45 Ala Tyr Gly Ser His Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser Pro Lys Ser 50 55 60 Trp Thr Asp Ala Asp Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Ser Gly Asn 65 70 75 Leu Val Ser Val Leu Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Val Ser Ser 80 85 90 Leu Val Lys Ser Ile Gly Asn Ser Tyr Ser Tyr Val Trp Ile Gly 95 100 105 Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Thr Glu Pro Asn Gly Glu Gly Trp 110 115 120 Glu Trp Ser Ser Ser Asp Val Met Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Arg 125 130 135 Asn Pro Ser Thr Ile Ser Ser Pro Gly His Cys Ala Ser Leu Ser 140 145 150 Arg Ser Thr Ala Phe Leu Arg Trp Lys Asp Tyr Asn Cys Asn Val 155 160 165 Arg Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Thr Asp 170 175 <210> 21 <211> 847 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ccatccctga gatcttttta taaaaaaccc agtctttgct gaccagacaa 50 agcataccag atctcaccag agagtcgcag acactatgct gcctcccatg 100 gccctgccca gtgtgtcctg gatgctgctt tcctgcctca ttctcctgtg 150 tcaggttcaa ggtgaagaaa cccagaagga actgccctct ccacggatca 200 gctgtcccaa aggctccaag gcctatggct ccccctgcta tgccttgttt 250 ttgtcaccaa aatcctggat ggatgcagat ctggcttgcc agaagcggcc 300 ctctggaaaa ctggtgtctg tgctcagtgg ggctgaggga tccttcgtgt 350 cctccctggt gaggagcatt agtaacagct attcatacat ctggattggg 400 ctccatgacc ccacacaggg ctctgagcct gatggagatg gatgggagtg 450 gagtagcact gatgtgatga attactttgc atgggagaaa aatccctcca 500 ccatcttaaa ccctggccac tgtgggagcc tgtcaagaag cacaggattt 550 ctgaagtgga aagattataa ctgtgatgca aagttaccct atgtctgcaa 600 gttcaaggac tagggcaggt gggaagtcag cagcctgagc ttggcgtgca 650 gctcatcatg gacatgagac cagtgtgaag actcaccctg gaagagaata 700 ttctccccaa actgccctac ctgactacct tgtcatgatc ctccttcttt 750 ttcctttttc ttcaccttca tttcaggctt ttctctgtct tccatgtctt 800 gagatctcag agaataataa taaaaatgtt actttatact taaaaaa 847 <210> 22 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Leu Pro Pro Met Ala Leu Pro Ser Val Ser Trp Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Cys Leu Ile Leu Leu Cys Gln Val Gln Gly Glu Glu Thr Gln 20 25 30 Lys Glu Leu Pro Ser Pro Arg Ile Ser Cys Pro Lys Gly Ser Lys 35 40 45 Ala Tyr Gly Ser Pro Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser Pro Lys Ser 50 55 60 Trp Met Asp Ala Asp Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Ser Gly Lys 65 70 75 Leu Val Ser Val Leu Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Val Ser Ser 80 85 90 Leu Val Arg Ser Ile Ser Asn Ser Tyr Ser Tyr Ile Trp Ile Gly 95 100 105 Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly Asp Gly Trp 110 115 120 Glu Trp Ser Ser Thr Asp Val Met Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Lys 125 130 135 Asn Pro Ser Thr Ile Leu Asn Pro Gly His Cys Gly Ser Leu Ser 140 145 150 Arg Ser Thr Gly Phe Leu Lys Trp Lys Asp Tyr Asn Cys Asp Ala 155 160 165 Lys Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Lys Asp 170 175 <210> 23 <211> 947 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 ccatccctga gatcttttta taaaaaaccc agtctttgct gaccagacaa 50 agcataccag atctcaccag agagtcctag gggactacag aaggaaaaag 100 acaagaggca gtaggatatc tgtgtgtcct cccgctgacc acacttcctt 150 tagtgacccg attgcctcct caagtcgcag acactatgct gcctcccatg 200 gccctgccca gtgtgtcctg gatgctgctt tcctgcctca ttctcctgtg 250 tcaggttcaa ggtgaagaaa cccagaagga actgccctct ccacggatca 300 gctgtcccaa aggctccaag gcctatggct ccccctgcta tgccttgttt 350 ttgtcaccaa aatcctggat ggatgcagat ctggcttgcc agaagcggcc 400 ctctggaaaa ctggtgtctg tgctcagtgg ggctgaggga tccttcgtgt 450 cctccctggt gaggagcatt agtaacagct attcatacat ctggattggg 500 ctccatgacc ccacacaggg ctctgagcct gatggagatg gatgggagtg 550 gagtagcact gatgtgatga attactttgc atgggagaaa aatccctcca 600 ccatcttaaa ccctggccac tgtgggagcc tgtcaagaag cacaggattt 650 ctgaagtgga aagattataa ctgtgatgca aagttaccct atgtctgcaa 700 gttcaaggac tagggcaggt gggaagtcag cagcctgagc ttggcgtgca 750 gctcatcatg gacatgagac cagtgtgaag actcaccctg gaagagaata 800 ttctccccaa actgccctac ctgactacct tgtcatgatc ctccttcttt 850 ttcctttttc ttcaccttca tttcaggctt ttctctgtct tccatgtctt 900 gagatctcag agaataataa taaaaatgtt actttatacg taaaaaa 947 <210> 24 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Leu Pro Pro Met Ala Leu Pro Ser Val Ser Trp Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Cys Leu Ile Leu Leu Cys Gln Val Gln Gly Glu Glu Thr Gln 20 25 30 Lys Glu Leu Pro Ser Pro Arg Ile Ser Cys Pro Lys Gly Ser Lys 35 40 45 Ala Tyr Gly Ser Pro Cys Tyr Ala Leu Phe Leu Ser Pro Lys Ser 50 55 60 Trp Met Asp Ala Asp Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Ser Gly Lys 65 70 75 Leu Val Ser Val Leu Ser Gly Ala Glu Gly Ser Phe Val Ser Ser 80 85 90 Leu Val Arg Ser Ile Ser Asn Ser Tyr Ser Tyr Ile Trp Ile Gly 95 100 105 Leu His Asp Pro Thr Gln Gly Ser Glu Pro Asp Gly Asp Gly Trp 110 115 120 Glu Trp Ser Ser Thr Asp Val Met Asn Tyr Phe Ala Trp Glu Lys 125 130 135 Asn Pro Ser Thr Ile Leu Asn Pro Gly His Cys Gly Ser Leu Ser 140 145 150 Arg Ser Thr Gly Phe Leu Lys Trp Lys Asp Tyr Asn Cys Asp Ala 155 160 165 Lys Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Lys Asp 170 175 <210> 25 <211> 1285 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 ataagacttt tatggatgga ttgtttttct caaataatat tatcgctttg 50 tgactaaagt aaagattatt aattcctgag gcaagaagat ataaaagctc 100 cagaaacgtt gactgggacc actggagaca ctgaagaagg caggggccct 150 tagagtcttg gttgccaaac agatttgcag atcaaggaga acccaggagt 200 ttcaaagaag cgctagtaag gtctctgaga tccttgcact agctacatcc 250 tcagggtagg aggaagatgg cttccagaag catgcggctg ctcctattgc 300 tgagctgcct ggccaaaaca ggagtcctgg gtgatatcat catgagaccc 350 agctgtgctc ctggatggtt ttaccacaag tccaattgct atggttactt 400 caggaagctg aggaactggt ctgatgccga gctcgagtgt cagtcttacg 450 gaaacggagc ccacctggca tctatcctga gtttaaagga agccagcacc 500 atagcagagt acataagtgg ctatcagaga agccagccga tatggattgg 550 cctgcacgac ccacagaaga ggcagcagtg gcagtggatt gatggggcca 600 tgtatctgta cagatcctgg tctggcaagt ccatgggtgg gaacaagcac 650 tgtgctgaga tgagctccaa taacaacttt ttaacttgga gcagcaacga 700 atgcaacaag cgccaacact tcctgtgcaa gtaccgacca tagagcaaga 750 atcaagattc tgctaactcc tgcacagccc cgtcctcttc ctttctgcta 800 gcctggctaa atctgctcat tatttcagag gggaaaccta gcaaactaag 850 agtgataagg gccctactac actggctttt ttaggcttag agacagaaac 900 tttagcattg gcccagtagt ggcttctagc tctaaatgtt tgccccgcca 950 tccctttcca cagtatcctt cttccctcct cccctgtctc tggctgtctc 1000 gagcagtcta gaagagtgca tctccagcct atgaaacagc tgggtctttg 1050 gccataagaa gtaaagattt gaagacagaa ggaagaaact caggagtaag 1100 cttctagacc ccttcagctt ctacaccctt ctgccctctc tccattgcct 1150 gcaccccacc ccagccactc aactcctgct tgtttttcct ttggccatag 1200 gaaggtttac cagtagaatc cttgctaggt tgatgtgggc catacattcc 1250 tttaataaac cattgtgtac ataagaaaaa aaaaa 1285 <210> 26 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ser Cys Leu 1 5 10 15 Ala Lys Thr Gly Val Leu Gly Asp Ile Ile Met Arg Pro Ser Cys 20 25 30 Ala Pro Gly Trp Phe Tyr His Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe 35 40 45 Arg Lys Leu Arg Asn Trp Ser Asp Ala Glu Leu Glu Cys Gln Ser 50 55 60 Tyr Gly Asn Gly Ala His Leu Ala Ser Ile Leu Ser Leu Lys Glu 65 70 75 Ala Ser Thr Ile Ala Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Gln Arg Ser Gln 80 85 90 Pro Ile Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Gln Lys Arg Gln Gln Trp 95 100 105 Gln Trp Ile Asp Gly Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ser Trp Ser Gly 110 115 120 Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His Cys Ala Glu Met Ser Ser Asn 125 130 135 Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn Glu Cys Asn Lys Arg Gln 140 145 150 His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro 155 <210> 27 <211> 1087 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 27 ccaagaacga tagtcaattc cagaaaccgc tatgaagttc ctctctgcaa 50 gagacttcca tccagttgcc ttcttgggac tgatgctggt gacaaccacg 100 gccttcccta cttcacaagt ccggagagga gacttcacag aggataccac 150 tcccaacaga cctgtctata ccacttcaca agtcggaggc ttaattacac 200 atgttctctg ggaaatcgtg gaaatgagaa aagagttgtg caatggcaat 250 tctgattgta tgaacaacga tgatgcactt gcagaaaaca atctgaaact 300 tccagagata caaagaaatg atggatgcta ccaaactgga tataatcagg 350 aaatttgcct attgaaaatt tcctctggtc ttctggagta ccatagctac 400 ctggagtaca tgaagaacaa cttaaaagat aacaagaaag acaaagccag 450 agtccttcag agagatacag aaactctaat tcatatcttc aaccaagagg 500 taaaagattt acataaaata gtccttccta ccccaatttc caatgctctc 550 ctaacagata agctggagtc acagaaggag tggctaagga ccaagaccat 600 ccaattcatc ttgaaatcac ttgaagaatt tctaaaagtc actttgagat 650 ctactcggca aacctagtgc gttatgccta agcatatcag tttgtggaca 700 ttcctcactg tggtcagaaa atatatcctg ttgtcaggta tctgacttat 750 gttgttctct acgaagaact gacaatatga atgttgggac actattttaa 800 ttatttttaa tttattgata atttaaataa gtaaacttta agttaattta 850 tgattgatat ttattatttt tatgaagtgt cacttgaaat gttatatgtt 900 atagttttga aatgataacc taaaaatcta tttgatataa atattctgtt 950 acctagccag atggtttctt ggaatgtata agtttacctc aatgaattgc 1000 taatttaaat atgtttttaa agaaatcttt gtgatgtatt tttataatgt 1050 ttagactgtc ttcaaacaaa taaattatat tatattt 1087 <210> 28 <211> 211 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Met Lys Phe Leu Ser Ala Arg Asp Phe His Pro Val Ala Phe Leu 1 5 10 15 Gly Leu Met Leu Val Thr Thr Thr Ala Phe Pro Thr Ser Gln Val 20 25 30 Arg Arg Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr Thr Pro Asn Arg Pro Val 35 40 45 Tyr Thr Thr Ser Gln Val Gly Gly Leu Ile Thr His Val Leu Trp 50 55 60 Glu Ile Val Glu Met Arg Lys Glu Leu Cys Asn Gly Asn Ser Asp 65 70 75 Cys Met Asn Asn Asp Asp Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Lys Leu 80 85 90 Pro Glu Ile Gln Arg Asn Asp Gly Cys Tyr Gln Thr Gly Tyr Asn 95 100 105 Gln Glu Ile Cys Leu Leu Lys Ile Ser Ser Gly Leu Leu Glu Tyr 110 115 120 His Ser Tyr Leu Glu Tyr Met Lys Asn Asn Leu Lys Asp Asn Lys 125 130 135 Lys Asp Lys Ala Arg Val Leu Gln Arg Asp Thr Glu Thr Leu Ile 140 145 150 His Ile Phe Asn Gln Glu Val Lys Asp Leu His Lys Ile Val Leu 155 160 165 Pro Thr Pro Ile Ser Asn Ala Leu Leu Thr Asp Lys Leu Glu Ser 170 175 180 Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr Lys Thr Ile Gln Phe Ile Leu Lys 185 190 195 Ser Leu Glu Glu Phe Leu Lys Val Thr Leu Arg Ser Thr Arg Gln 200 205 210 Thr <210> 29 <211> 1951 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 29 agaaggaaca gtgggtgtcc aggcacatca gaccaggcag ctcgcagcaa 50 agcaaggtaa gttctctcct cttccctgtc gctaactccc tgcatctaga 100 ggctgtccag attcagactc caggggacag gctacccctg aaccaggcag 150 cgtgggagtg ggatgtgtcc tcagaagcta accatctcct ggtttgccat 200 cgttttgctg gtgtctccac tcatggccat gtgggagctg gagaaagacg 250 tttatgttgt agaggtggac tggactcccg atgcccctgg agaaacagtg 300 aacctcacct gtgacacgcc tgaagaagat gacatcacct ggacctcaga 350 ccagagacat ggagtcatag gctctggaaa gaccctgacc atcactgtca 400 aagagtttct agatgctggc cagtacacct gccacaaagg aggcgagact 450 ctgagccact cacatctgct gctccacaag aaggaaaatg gaatttggtc 500 cactgaaatt ttaaaaaatt tcaaaaacaa gactttcctg aagtgtgaag 550 caccaaatta ctccggacgg ttcacgtgct catggctggt gcaaagaaac 600 atggacttga agttcaacat caagagcagt agcagttccc ctgactctcg 650 ggcagtgaca tgtggaatgg cgtctctgtc tgcagagaag gtcacactgg 700 accaaaggga ctatgagaag tattcagtgt cctgccagga ggatgtcacc 750 tgcccaactg ccgaggagac cctgcccatt gaactggcgt tggaagcacg 800 gcagcagaat aaatatgaga actacagcac cagcttcttc atcagggaca 850 tcatcaaacc agacccgccc aagaacttgc agatgaagcc tttgaagaac 900 tcacaggtgg aggtcagctg ggagtaccct gactcctgga gcactcccca 950 ttcctacttc tccctcaagt tctttgttcg aatccagcgc aagaaagaaa 1000 agatgaagga gacagaggag gggtgtaacc agaaaggtgc gttcctcgta 1050 gagaagacat ctaccgaagt ccaatgcaaa ggcgggaatg tctgcgtgca 1100 agctcaggat cgctattaca attcctcatg cagcaagtgg gcatgtgttc 1150 cctgcagggt ccgatcctag gatgcaacgt tggaaaggaa agaaaagtgg 1200 aagacattaa ggaagaaaaa tttaaactca ggatggaaga gtcccccaaa 1250 agctgtcttc tgcttggttg gctttttcca gttttcctaa gttcatcatg 1300 acacctttgc tgatttctac atgtaaatgt taaatgcccg cagagccagg 1350 gagctaatgt atgcatagat attctagcat tccacttggc cttatgctgt 1400 tgaaatattt aagtaattta tgtatttatt aatttatttc tgcatttcac 1450 atttgtatac caagatgtat tgaatatttc atgtgctcgt ggcctgatcc 1500 actgggacca ggccctatta tgcaaattgt gagcttgtta tcttcttcaa 1550 cagctcttca atcagggctg cgtaggtaca ttagcttttg tgacaaccaa 1600 taagaacata atattctgac acaagcagtg ttacatattt gtgaccagta 1650 aagacatagg tggtatttgg agacatgaag aagctgtaaa gttgactctg 1700 aagagtttag cactagtttc aacaccaaga aagacttttt agaagtgata 1750 ttgataagaa accagggcct tctttagaag ggtacctaaa tttaaaagaa 1800 ttttgaaagg ctgggtatcg gtggtatatg cttttaattc cagcactcag 1850 gagaccaagg caggcagatc tctgtgagtt tgaggacagc ctggtgtaca 1900 gagggagttc cagcacagcc agtgccacac agaaattctg tctcaaaaac 1950 a 1951 <210> 30 <211> 335 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu 1 5 10 15 Leu Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val 20 25 30 Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr 35 40 45 Val Asn Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp 50 55 60 Thr Ser Asp Gln Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu 65 70 75 Thr Ile Thr Val Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys 80 85 90 His Lys Gly Gly Glu Thr Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His 95 100 105 Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe 110 115 120 Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly 125 130 135 Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys 140 145 150 Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val 155 160 165 Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Leu Asp 170 175 180 Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln Glu Asp Val 185 190 195 Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Ala Leu 200 205 210 Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser Phe 215 220 225 Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln 230 235 240 Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr 245 250 255 Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe 260 265 270 Phe Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu 275 280 285 Glu Gly Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser 290 295 300 Thr Glu Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln 305 310 315 Asp Arg Tyr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro 320 325 330 Cys Arg Val Arg Ser 335 <210> 31 <211> 866 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31 ggcacagctg gacctggtgg gggttctctg tggttccatg ctttctggac 50 tcctgcctgc tggctggagc tgctgacagg cctgacatct tctgcaacct 100 ccagcatcag gacaaagaaa gccgcctcaa accttccaaa tcacttcctc 150 ttggcccagg aacaatggct gccatgtcag aagactcttg cgtcaacttc 200 aaggaaatga tgtttattga caacacgctt tactttatac ctgaagaaaa 250 tggagacctg gaatcagaca actttggccg acttcactgt acaaccgcag 300 taatacggaa tataaatgac caagttctct tcgttgacaa aagacagcct 350 gtgttcgagg atatgactga tattgatcaa agtgccagtg aaccccagac 400 cagactgata atatacatgt acaaagacag tgaagtaaga ggactggctg 450 tgaccctctc tgtgaaggat agtaaaatgt ctaccctctc ctgtaagaac 500 aagatcattt cctttgagga aatggatcca cctgaaaata ttgatgatat 550 acaaagtgat ctcatattct ttcagaaacg tgttccagga cacaacaaga 600 tggagtttga atcttcactg tatgaaggac actttcttgc ttgccaaaag 650 gaagatgatg ctttcaaact cattctgaaa aaaaaggatg aaaatgggga 700 taaatctgta atgttcactc tcactaactt acatcaaagt taggtgggga 750 gggtttgtgt tccagaaaga tgattagcac acatgcgcct tgtgatgacc 800 tcgcctgtat ttccataaca gaatacccga ggctgcatga tttatagagt 850 aaacacgttt atttgt 866 <210> 32 <211> 192 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Met Ala Ala Met Ser Glu Asp Ser Cys Val Asn Phe Lys Glu Met 1 5 10 15 Met Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Pro Glu Glu Asn Gly 20 25 30 Asp Leu Glu Ser Asp Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala 35 40 45 Val Ile Arg Asn Ile Asn Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg 50 55 60 Gln Pro Val Phe Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser 65 70 75 Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu 80 85 90 Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser Val Lys Asp Ser Lys Met 95 100 105 Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met 110 115 120 Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser Asp Leu Ile Phe 125 130 135 Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu Phe Glu Ser 140 145 150 Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu Asp Asp 155 160 165 Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp Lys 170 175 180 Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 185 190 <210> 33 <211> 1121 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33 cctaaacagg ctctcctctc acttatcaac tgttgacact tgtgcgatct 50 ctgatggctg tcctgcagaa atctatgagt ttttccctta tggggacttt 100 ggccgccagc tgcctgcttc tcattgccct gtgggcccag gaggcaaatg 150 cgctgcccgt caacacccgg tgcaagcttg aggtgtccaa cttccagcag 200 ccgtacatcg tcaaccgcac ctttatgctg gccaaggagg ccagccttgc 250 agataacaac acagacgtcc ggctcatcgg ggagaaactg ttccgaggag 300 tcagtgctaa agatcagtgc tacctgatga agcaggtgct caacttcacc 350 ctggaagacg ttctgctccc ccagtcagac aggttccagc cctacatgca 400 ggaggtggta cctttcctga ccaaactcag caatcagctc agctcctgtc 450 acatcagcgg tgacgaccag aacatccaga agaatgtcag aaggctgaag 500 gagacagtga aaaagcttgg agagagtgga gagatcaagg cgattgggga 550 actggacctg ctgtttatgt ctctgagaaa tgcttgcgtc tgagcgagaa 600 gaagctagaa aacgaagaac tgctccttcc tgccttctaa aaagaacaat 650 aagatccctg aatggacttt tttactaaag gaaagtgaga agctaacgtc 700 catcatcatt agaagatttc acatgaaacc tggctcagtt gaaaaagaaa 750 atagtgtcaa gttgtccatg agaccagagg tagacttgat aaccacaaag 800 attcattgac aatattttat tgtcactgat gatacaacag aaaaataatg 850 tactttaaaa aattgtttga aaggaggtta cctctcattc ctttagaaaa 900 aaagcttatg taacttcatt tccatatcca atattttata tatgtaagtt 950 tatttattat aagtatacat tttatttatg tcagtttatt aatatggatt 1000 tatttataga aacattatct gctattgata tttagtataa ggcaaataat 1050 atttatgaca ataactatgg aaacaagata tcttaggctt taataaacac 1100 atggatatca taaaaaaaaa a 1121 <210> 34 <211> 179 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Met Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr 1 5 10 15 Leu Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Pro Val Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser 35 40 45 Asn Phe Gln Gln Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala 50 55 60 Lys Glu Ala Ser Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile 65 70 75 Gly Glu Lys Leu Phe Arg Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr 80 85 90 Leu Met Lys Gln Val Leu Asn Phe Thr Leu Glu Asp Val Leu Leu 95 100 105 Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro 110 115 120 Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ser Ser Cys His Ile Ser 125 130 135 Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn Val Arg Arg Leu Lys Glu 140 145 150 Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile Lys Ala Ile Gly 155 160 165 Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala Cys Val 170 175 <210> 35 <211> 1359 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 35 cgcttagaag tcggactaca gagttagact cagaaccaaa ggaggtggat 50 agggggtcca caggcctggt gcagatcaca gagccagcca gatctgagaa 100 gcagggaaca agatgctgga ttgcagagca gtaataatgc tatggctgtt 150 gccctgggtc actcagggcc tggctgtgcc taggagtagc agtcctgact 200 gggctcagtg ccagcagctc tctcggaatc tctgcatgct agcctggaac 250 gcacatgcac cagcgggaca tatgaatcta ctaagagaag aagaggatga 300 agagactaaa aataatgtgc cccgtatcca gtgtgaagat ggttgtgacc 350 cacaaggact caaggacaac agccagttct gcttgcaaag gatccgccaa 400 ggtctggctt tttataagca cctgcttgac tctgacatct tcaaagggga 450 gcctgctcta ctccctgata gccccatgga gcaacttcac acctccctac 500 taggactcag ccaactcctc cagccagagg atcacccccg ggagacccaa 550 cagatgccca gcctgagttc tagtcagcag tggcagcgcc cccttctccg 600 ttccaagatc cttcgaagcc tccaggcctt tttggccata gctgcccggg 650 tctttgccca cggagcagca actctgactg agcccttagt gccaacagct 700 taaggatgcc caggttccca tggctaccat gataagacta atctatcagc 750 ccagacatct accagttaat taacccatta ggacttgtgc tgttcttgtt 800 ttgtttgttt tgcgtgaagg gcaaggacac cattattaaa gagaaaagaa 850 acaaacccca gagcaggcag ctggctagag aaaggagctg gagaagaaga 900 ataaagtctc gagcccttgg ccttggaagc gggcaagcag ctgcgtggcc 950 tgaggggaag ggggcggtgg catcgagaaa ctgtgagaaa acccagagca 1000 tcagaaaaag tgagcccagg ctttggccat tatctgtaag aaaaacaaga 1050 aaaggggaac attatacttt cctgggtggc tcagggaaat gtgcagatgc 1100 acagtactcc agacagcagc tctgtacctg cctgctctgt ccctcagttc 1150 taacagaatc tagtcactaa gaactaacag gactaccaat acgaactgac 1200 aaatactacc actatgacct gtgacaaagc tgcatattta ttaagtggga 1250 agggaacttt tgatattatt tatccttgta acagtataga tgatggttat 1300 ttattctatt tataaggaat tatgtatttt ttttttcaat aaagatttat 1350 ttatgtggc 1359 <210> 36 <211> 196 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Met Leu Asp Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp 1 5 10 15 Val Thr Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp 20 25 30 Ala Gln Cys Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp 35 40 45 Asn Ala His Ala Pro Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu 50 55 60 Glu Asp Glu Glu Thr Lys Asn Asn Val Pro Arg Ile Gln Cys Glu 65 70 75 Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys 80 85 90 Leu Gln Arg Ile Arg Gln Gly Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu 95 100 105 Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly Glu Pro Ala Leu Leu Pro Asp Ser 110 115 120 Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu 125 130 135 Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu Thr Gln Gln Met Pro Ser 140 145 150 Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro Leu Leu Arg Ser Lys 155 160 165 Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala Ile Ala Ala Arg Val 170 175 180 Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu Val Pro Thr 185 190 195 Ala <210> 37 <211> 759 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 37 acaccatcca gatctctgga agacagacaa gatgctgcct ccaacagcct 50 gctccgtcat gtcctggatg ctgctctcct gcctgatgct cttatctcag 100 gttcaaggtg aagactccct gaagaatata ccctccgcac gcattagttg 150 ccccaagggc tcccaggctt atggctccta ctgctatgcc ttgtttcaga 200 taccacagac ctggtttgat gcagaactgg cctgccaaaa gaggcctgga 250 ggacacctcg tatctgtgct caatagcgct gaggcttcat tcttgtcctc 300 catggtgaag agaacaggaa acagctacca atacacttgg attgggctcc 350 atgaccccac tctgggtgca gaacccaatg gaggtggatg ggaatggagt 400 aacaatgacg tgatgaatta ctttaactgg gagaggaacc catctactgc 450 cttagaccgt gctttctgtg gcagcttgtc aagagcttct ggatttctaa 500 aatggagaga tatgacatgt gaggtgaagt tgccctatgt ctgcaaattt 550 actggttaaa cttatcagac agcaaacatc ccgaatttgt cttgaagagc 600 atcatggaca agggacaaaa tgtgaagact cacctagaaa aagcattttc 650 tatctacagt ccacattaga gccttaatct gctctttcca tatctgtctt 700 tagtcctttt ggtataagtt tgggctcaat tctaaaataa aaataagctt 750 tctgtcaca 759 <210> 38 <211> 175 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Met Leu Pro Pro Thr Ala Cys Ser Val Met Ser Trp Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Cys Leu Met Leu Leu Ser Gln Val Gln Gly Glu Asp Ser Leu 20 25 30 Lys Asn Ile Pro Ser Ala Arg Ile Ser Cys Pro Lys Gly Ser Gln 35 40 45 Ala Tyr Gly Ser Tyr Cys Tyr Ala Leu Phe Gln Ile Pro Gln Thr 50 55 60 Trp Phe Asp Ala Glu Leu Ala Cys Gln Lys Arg Pro Gly Gly His 65 70 75 Leu Val Ser Val Leu Asn Ser Ala Glu Ala Ser Phe Leu Ser Ser 80 85 90 Met Val Lys Arg Thr Gly Asn Ser Tyr Gln Tyr Thr Trp Ile Gly 95 100 105 Leu His Asp Pro Thr Leu Gly Ala Glu Pro Asn Gly Gly Gly Trp 110 115 120 Glu Trp Ser Asn Asn Asp Val Met Asn Tyr Phe Asn Trp Glu Arg 125 130 135 Asn Pro Ser Thr Ala Leu Asp Arg Ala Phe Cys Gly Ser Leu Ser 140 145 150 Arg Ala Ser Gly Phe Leu Lys Trp Arg Asp Met Thr Cys Glu Val 155 160 165 Lys Leu Pro Tyr Val Cys Lys Phe Thr Gly 170 175 <210> 39 <211> 769 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 39 aagacacctt ggtctcagcc tgcagagatc gttgagttgc atcctaagca 50 aaagactgtc tgctgctcag catggctagg aacgcctact tcatcctgct 100 ctcatgcctg atcgtcctgt ctccaagcca aggccaggaa gctgaagaag 150 acctgccatc tgccaggatc agttgcccag aaggttccaa tgcctacagc 200 tcctattgtt actacttcac tgaagaccgt ttaacttggg ctgatgcaga 250 tcttttttgc cagaacatga attcaggcta cctggtgtca gttctcagtc 300 aggctgaggg caactttgtg gcctctctga ttaaggagag tggcactaca 350 gacgccaatg tctggactgg actccatgat cccaaaagga atcgtcgctg 400 gcactggagc agtgggtctc tgtttctcta caaatcctgg gcaactgggt 450 ctcctaacag ttccaatcgt ggctactgtg tatctctgac ttcaaacaca 500 ggatacaaga aatggaagga tgacaactgt gatgcccaat actcatttgt 550 ctgcaagttc aaaggctgaa gtcacctgaa aaaaaatagt catataaagc 600 aaaattgaaa ttactatagt gtcagaaatt aaattggacc atctatcaaa 650 agcaaattag atcctgtctt cctggagaga cattcttgct tcactgtcct 700 atggtacctg tatctccatt attttctgga aatttgcaca actgaaataa 750 aaacaccttt acaatgttg 769 <210> 40 <211> 165 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 Met Ala Arg Asn Ala Tyr Phe Ile Leu Leu Ser Cys Leu Ile Val 1 5 10 15 Leu Ser Pro Ser Gln Gly Gln Glu Ala Glu Glu Asp Leu Pro Ser 20 25 30 Ala Arg Ile Ser Cys Pro Glu Gly Ser Asn Ala Tyr Ser Ser Tyr 35 40 45 Cys Tyr Tyr Phe Thr Glu Asp Arg Leu Thr Trp Ala Asp Ala Asp 50 55 60 Leu Phe Cys Gln Asn Met Asn Ser Gly Tyr Leu Val Ser Val Leu 65 70 75 Ser Gln Ala Glu Gly Asn Phe Val Ala Ser Leu Ile Lys Glu Ser 80 85 90 Gly Thr Thr Asp Ala Asn Val Trp Thr Gly Leu His Asp Pro Lys 95 100 105 Arg Asn Arg Arg Trp His Trp Ser Ser Gly Ser Leu Phe Leu Tyr 110 115 120 Lys Ser Trp Ala Thr Gly Ser Pro Asn Ser Ser Asn Arg Gly Tyr 125 130 135 Cys Val Ser Leu Thr Ser Asn Thr Gly Tyr Lys Lys Trp Lys Asp 140 145 150 Asp Asn Cys Asp Ala Gln Tyr Ser Phe Val Cys Lys Phe Lys Gly 155 160 165 <210> 41 <211> 692 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 41 agtattcatt attcctagct gacagaaatt attgatttag aatttaaatc 50 gaagactgtc tgctgatcag catggctcag aacaatgtat accttatcct 100 gttcttatgc ctgatgttcc tgtcatacag ccaaggccag gtagctgaag 150 aagacttccc cttggctgaa aaagaccttc cttctgccaa aatcaactgc 200 ccagagggtg ccaacgccta tggttcctac tgttattatc taattgaaga 250 ccgtttgacc tggggggagg ctgatctctt ttgccagaac atgaatgcag 300 gtcacctggt gtcaatactc agccaggctg agagcaactt tgtggcctcg 350 ctggttaagg agagtggtac tacagcttcc aatgtctgga ctggacttca 400 tgaccctaaa agtaaccgtc gttggcactg gagcagtggc tccctatttc 450 tcttcaagtc atgggccact ggagctccaa gcactgccaa ccgtggttat 500 tgtgtatcgc tgacttcaaa cacagcatac aaaaaatgga aggacgaaaa 550 ctgtgaggca cagtactcct ttgtctgcaa gttcagagcc taaagtcacc 600 tgaagaacag atgtgcagaa ctctgttact atatattata aatgaaagaa 650 gaccatctat ctgcaaaata aatactcttt cctgtaataa ct 692 <210> 42 <211> 173 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Met Ala Gln Asn Asn Val Tyr Leu Ile Leu Phe Leu Cys Leu Met 1 5 10 15 Phe Leu Ser Tyr Ser Gln Gly Gln Val Ala Glu Glu Asp Phe Pro 20 25 30 Leu Ala Glu Lys Asp Leu Pro Ser Ala Lys Ile Asn Cys Pro Glu 35 40 45 Gly Ala Asn Ala Tyr Gly Ser Tyr Cys Tyr Tyr Leu Ile Glu Asp 50 55 60 Arg Leu Thr Trp Gly Glu Ala Asp Leu Phe Cys Gln Asn Met Asn 65 70 75 Ala Gly His Leu Val Ser Ile Leu Ser Gln Ala Glu Ser Asn Phe 80 85 90 Val Ala Ser Leu Val Lys Glu Ser Gly Thr Thr Ala Ser Asn Val 95 100 105 Trp Thr Gly Leu His Asp Pro Lys Ser Asn Arg Arg Trp His Trp 110 115 120 Ser Ser Gly Ser Leu Phe Leu Phe Lys Ser Trp Ala Thr Gly Ala 125 130 135 Pro Ser Thr Ala Asn Arg Gly Tyr Cys Val Ser Leu Thr Ser Asn 140 145 150 Thr Ala Tyr Lys Lys Trp Lys Asp Glu Asn Cys Glu Ala Gln Tyr 155 160 165 Ser Phe Val Cys Lys Phe Arg Ala 170 <210> 43 <211> 837 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 43 gcccttcctt caaatcctat cataaagcag tcacctttgt cctgacaaac 50 catctcagat ctctacaaga gagacaagat gctgcctcac ctggtcctca 100 acagtatttc ctggatgctg ctctcctgcc tgttgtttgt atttcaggta 150 caaggtgaag acttccagaa ggaagtgccc tctccacgta ccagctgccc 200 catgggttac aaggcttatc gctcccactg ctatgcctta gttatgacac 250 ctaaatcctg gtttcaagca gatctggtct gccagaagag accctcagga 300 catctcgtgt ctattcttag tggaggtgag gcttcctttg tgtcctcctt 350 ggtgaacggc agagtggaca actaccaaga catctggatt gggctccatg 400 atccaacaat gggtcaacaa cccaatggag gtggatggga gtggagtaac 450 tccgatgtgc tgaattatct taactgggat ggggatcctt cctctactgt 500 caaccgtggt cactgtggga gtctgacagc aagttcaggg tttctgaagt 550 ggggagacta ttactgcgat gggacattac catttgtctg caagttcaag 600 cagtagacaa gcagcatcca gcatttatca tgaagctccc catgacaagg 650 gatgaaatac aagaattcac ccggcaaggc tgtacttgct ttacagttgt 700 gcatcagact tattctggtt ttctgtcctc tttcatccat ctccttcccc 750 ttacttcagg cttttcaata tagttcctgc tttgcaatct tgcagataaa 800 taataaatac aacattttgg ttttactttt gtgtttt 837 <210> 44 <211> 175 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Met Leu Pro His Leu Val Leu Asn Ser Ile Ser Trp Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Cys Leu Leu Phe Val Phe Gln Val Gln Gly Glu Asp Phe Gln 20 25 30 Lys Glu Val Pro Ser Pro Arg Thr Ser Cys Pro Met Gly Tyr Lys 35 40 45 Ala Tyr Arg Ser His Cys Tyr Ala Leu Val Met Thr Pro Lys Ser 50 55 60 Trp Phe Gln Ala Asp Leu Val Cys Gln Lys Arg Pro Ser Gly His 65 70 75 Leu Val Ser Ile Leu Ser Gly Gly Glu Ala Ser Phe Val Ser Ser 80 85 90 Leu Val Asn Gly Arg Val Asp Asn Tyr Gln Asp Ile Trp Ile Gly 95 100 105 Leu His Asp Pro Thr Met Gly Gln Gln Pro Asn Gly Gly Gly Trp 110 115 120 Glu Trp Ser Asn Ser Asp Val Leu Asn Tyr Leu Asn Trp Asp Gly 125 130 135 Asp Pro Ser Ser Thr Val Asn Arg Gly His Cys Gly Ser Leu Thr 140 145 150 Ala Ser Ser Gly Phe Leu Lys Trp Gly Asp Tyr Tyr Cys Asp Gly 155 160 165 Thr Leu Pro Phe Val Cys Lys Phe Lys Gln 170 175 <210> 45 <211> 788 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 45 cccggggcga aatcacctct gagctgtcaa agcattgcag acctctgtat 50 agacagatat accatggtgt ctcacaagac ccttcatagc atgtcctgga 100 tgctactgtg ttgcctgatg tccctttctt gggtacaagg ggaacaatcc 150 cagaaaaaac tgtcttctcc acgcatcagc tgtccccaag aagcccaagc 200 ttatggctcc tattgctatt tactgattct ggaaccacag acctgggcta 250 atgcagagat ccactgccag aagcatttct caggacacct ggcatttctg 300 ctcacttatg gggaaattat ctttgtgtcc tctctggtga aaaacagttt 350 gaccacattc ccatacatct ggattggact ccatgatctg tcacttggga 400 gtttgcccaa tgaaaatgga tggaagtgga gcagctctga ccctctgacc 450 ttctataact gggagatccc accctccatg tctgcacacc acggttactg 500 cgcagctttg tctcaggcct caggttatca gaagtggaga gattattatt 550 gtgacccaac atttccctat gtctgcaaat tcaagggtta ggccagttct 600 gatttcaact gcctgaaagt atcctgaaga tcacatagac aaaggagcga 650 gcatgatggc tcaccaagaa agtccttctc acaccccgac accgaattcc 700 tcatctcatc tctgctgttc ttccataagt gtattctctg gggactctgg 750 cctaaggatt cggagaacta taataaaatt tagtcaat 788 <210> 46 <211> 175 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Met Val Ser His Lys Thr Leu His Ser Met Ser Trp Met Leu Leu 1 5 10 15 Cys Cys Leu Met Ser Leu Ser Trp Val Gln Gly Glu Gln Ser Gln 20 25 30 Lys Lys Leu Ser Ser Pro Arg Ile Ser Cys Pro Gln Glu Ala Gln 35 40 45 Ala Tyr Gly Ser Tyr Cys Tyr Leu Leu Ile Leu Glu Pro Gln Thr 50 55 60 Trp Ala Asn Ala Glu Ile His Cys Gln Lys His Phe Ser Gly His 65 70 75 Leu Ala Phe Leu Leu Thr Tyr Gly Glu Ile Ile Phe Val Ser Ser 80 85 90 Leu Val Lys Asn Ser Leu Thr Thr Phe Pro Tyr Ile Trp Ile Gly 95 100 105 Leu His Asp Leu Ser Leu Gly Ser Leu Pro Asn Glu Asn Gly Trp 110 115 120 Lys Trp Ser Ser Ser Asp Pro Leu Thr Phe Tyr Asn Trp Glu Ile 125 130 135 Pro Pro Ser Met Ser Ala His His Gly Tyr Cys Ala Ala Leu Ser 140 145 150 Gln Ala Ser Gly Tyr Gln Lys Trp Arg Asp Tyr Tyr Cys Asp Pro 155 160 165 Thr Phe Pro Tyr Val Cys Lys Phe Lys Gly 170 175 <210> 47 <211> 1024 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 47 ccgactcaag ctgaaaaagg cagggttctc ggagtgttgc ttccaatcag 50 attgcaggtc taggagaatc cacaaaaaag agaagaaaag aaaagaaaaa 100 aactggaacg ggctctgagg gccttgaaat caaagcattg aagtatcatc 150 tccatcgaaa gaggaagatg gcttacaaag gcgtgcggct actcttactg 200 ctgagctggg tagctggccc cgaagtcctg agcgatatct tgagacccag 250 ctgtgcccca ggatggtttt actataggtc ccactgctat ggatacttcc 300 ggaagctaag aaactggtct catgctgagc tggagtgtca gtcatatgga 350 aatggatccc atctggcatc tgtcttgaat caaaaggaag ccagtgtcat 400 atcaaagtac ataactggct atcagagaaa cctgcctgtg tggattggcc 450 tgcatgaccc acaaaagaag caattatggc agtggactga tgggtctaca 500 aacctgtaca gacgctggaa tcccaggaca aagagtgaag ccaggcattg 550 cgctgagatg aaccccaagg ataaattctt aacttggaac aaaaatggat 600 gtgccaaccg ccaacacttc ctgtgcaagt ataagacata gagcaaaaat 650 caagcgtcta ccagccttgc acaaactctt cccacttccc tctcacctgg 700 tggctgatct aatcattatc ccagagtaaa cactgtagca aacattgagg 750 aggcctccag ggcactggct atcaagccct gcttagcatg gtgggacagt 800 ggcttccggt ctcagagttt agcatggtgg gacggtgact tccggtctca 850 gagattagca tggtgggaca agggcttctg gtctccgtgt tcactctaca 900 atcctttctg gtactcccct tccctctcat tgtcttaaac agcaatgctt 950 aacaagctag aaatgtgctt tcttgactac tgcgtctctg tcaaaccagt 1000 aaagttttgg agccaagaaa cagc 1024 <210> 48 <211> 157 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 Met Ala Tyr Lys Gly Val Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ser Trp Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Glu Val Leu Ser Asp Ile Leu Arg Pro Ser Cys Ala 20 25 30 Pro Gly Trp Phe Tyr Tyr Arg Ser His Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg 35 40 45 Lys Leu Arg Asn Trp Ser His Ala Glu Leu Glu Cys Gln Ser Tyr 50 55 60 Gly Asn Gly Ser His Leu Ala Ser Val Leu Asn Gln Lys Glu Ala 65 70 75 Ser Val Ile Ser Lys Tyr Ile Thr Gly Tyr Gln Arg Asn Leu Pro 80 85 90 Val Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Gln Lys Lys Gln Leu Trp Gln 95 100 105 Trp Thr Asp Gly Ser Thr Asn Leu Tyr Arg Arg Trp Asn Pro Arg 110 115 120 Thr Lys Ser Glu Ala Arg His Cys Ala Glu Met Asn Pro Lys Asp 125 130 135 Lys Phe Leu Thr Trp Asn Lys Asn Gly Cys Ala Asn Arg Gln His 140 145 150 Phe Leu Cys Lys Tyr Lys Thr 155 <210> 49 <211> <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 1 atgacaccac ctgaacgtct cttcctccca agggtgtgtg gcaccaccct acacctcctc 61 cttctggggc tgctgctggt tctgctgcct ggggcccagg ggctccctgg tgttggcctc 121 acaccttcag ctgcccagac tgcccgtcag caccccaaga tgcatcttgc ccacagcacc 181 ctcaaacctg ctgctcacct cattggagac cccagcaagc agaactcact gctctggaga 241 gcaaacacgg accgtgcctt cctccaggat ggtttctcct tgagcaacaa ttctctcctg 301 gtccccacca gtggcatcta cttcgtctac tcccaggtgg tcttctctgg gaaagcctac 361 tctcccaagg ccacctcctc cccactctac ctggcccatg aggtccagct cttctcctcc 421 cagtacccct tccatgtgcc tctcctcagc tcccagaaga tggtgtatcc agggctgcag 481 gaaccctggc tgcactcgat gtaccacggg gctgcgttcc agctcaccca gggagaccag 541 ctatccaccc acacagatgg catcccccac ctagtcctca gccctagtac tgtcttcttt 601 ggagccttcg ctctgtag <210> 50 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 MTPPERLFLPRVCGTTLHLLLLGLLLVLLPGAQGLPGVGLTPSAAQTARQHPKMHLAHSTLKPAAHLIGDPSK QNSLLWRANTDRAFLQDGFSLSNNSLLVPTSGIYFVYSQVVFSGKAYSPKATSSPLYLAHEVQLFSSQYPFHV PLLSSQKMVYPGLQEPWLHSMYHGAAFQLTQGDQLSTHTDGIPHLVLSPSTVFFGAFAL <210> 51 <211> <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 1 atgggggcac tggggctgga gggcaggggt gggaggctcc aggggagggg ttccctcctg 61 ctagctgtgg caggagccac ttctctggtg accttgttgc tggcggtgcc tatcactgtc 121 ctggctgtgc tggccttagt gccccaggat cagggaggac tggtaacgga gacggccgac 181 cccggggcac aggcccagca aggactgggg tttcagaagc tgccagagga ggagccagaa 241 acagatctca gccccgggct cccagctgcc cacctcatag gcgctccgct gaaggggcag 301 gggctaggct gggagacgac gaaggaacag gcgtttctga cgagcgggac gcagttctcg 361 gacgccgagg ggctggcgct cccgcaggac ggcctctatt acctctactg tctcgtcggc 421 taccggggcc gggcgccccc tggcggcggg gacccccagg gccgctcggt cacgctgcgc 481 agctctctgt accgggcggg gggcgcctac gggccgggca ctcccgagct gctgctcgag 541 ggcgccgaga cggtgactcc agtgctggac ccggccagga gacaagggta cgggcctctc 601 tggtacacga gcgtggggtt cggcggcctg gtgcagctcc ggaggggcga gagggtgtac 661 gtcaacatca gtcaccccga tatggtggac ttcgcgagag ggaagacctt ctttggggcc 721 gtgatggtgg ggtga <210> 52 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 MGALGLEGRGGRLQGRGSLLLAVAGATSLVTLLLAVPITVLAVLALVPQDQGGLVTETADPGAQAQQGLGFQKLPEEEPETDL SPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRA GGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVG <210> 53 <211> <212> DNA <213> Mus musculus <400> 53 1 atgacactgc tcggccgtct ccacctcttg agggtgcttg gcacccctcc tgtcttcctc 61 ctggggctgc tgctggccct gcctctaggg gcccagggac tctctggtgt ccgcttctcc 121 gctgccagga cagcccatcc actccctcag aagcacttga cccatggcat cctgaaacct 181 gctgctcacc ttgttgggta ccccagcaag cagaactcac tgctctggag agcaagcacg 241 gatcgtgcct ttctccgaca tggcttctct ttgagcaaca actccctcct gatccccacc 301 agtggcctct actttgtcta ctcccaggtg gttttctctg gagaaagctg ctcccccagg 361 gccattccca ctcccatcta cctggcacac gaggtccagc tcttttcctc ccaatacccc 421 ttccatgtgc ctctcctcag tgcgcagaag tctgtgtatc cgggacttca aggaccgtgg 481 gtgcgctcaa tgtaccaggg ggctgtgttc ctgctcagta agggagacca gctgtccacc 541 cacaccgacg gcatctccca tctacacttc agccccagca gtgtattctt tggagccttt 601 gcactgtag <210> 54 <211> <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 MTLLGRLHLL RVLGTPPVFL LGLLLALPLG AQGLSGVRFS AARTAHPLPQ KHLTHGILKPAAHLVGYPSK QNSLLWRAST DRAFLRHGFS LSNNSLLIPT SGLYFVYSQV VFSGESCSPRAIPTPIYLAH EVQLFSSQYP FHVPLLSAQK SVYPGLQGPW VRSMYQGAVF LLSKGDQLSTHTDGISHLHF SPSSVFFGAFAL <210> 55 <211> <212> DNA <213> Mus musculus <400> 55 1 atgacactgc tcggccgtct ccacctcttg agggtgcttg gcacccctcc tgtcttcctc 61 ctggggctgc tgctggccct gcctctaggg gcccagggac tctctggtgt ccgcttctcc 121 gctgccagga cagcccatcc actccctcag aagcacttga cccatggcat cctgaaacct 181 gctgctcacc ttgttgggta ccccagcaag cagaactcac tgctctggag agcaagcacg 241 gatcgtgcct ttctccgaca tggcttctct ttgagcaaca actccctcct gatccccacc 301 agtggcctct actttgtcta ctcccaggtg gttttctctg gagaaagctg ctcccccagg 361 gccattccca ctcccatcta cctggcacac gaggtccagc tcttttcctc ccaatacccc 421 ttccatgtgc ctctcctcag tgcgcagaag tctgtgtatc cgggacttca aggaccgtgg 481 gtgcgctcaa tgtaccaggg ggctgtgttc ctgctcagta agggagacca gctgtccacc 541 cacaccgacg gcatctccca tctacacttc agccccagca gtgtattctt tggagccttt 601 gcactgtag <210> 56 <211> <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 MGTRGLQGLG GRPQGRGCLL LAVAGATSLV TLLLAVPITV LAVLALVPQD QGRRVEKIIGSGAQAQKRLD DSKPSCILPS PSSLSETPDP RLHPQRSNAS RNLASTSQGP VAQSSREASAWMTILSPAAD STPDPGVQQL PKGEPETDLN PELPAAHLIG AWMSGQGLSW EASQEEAFLRSGAQFSPTHG LALPQDGVYY LYCHVGYRGR TPPAGRSRAR SLTLRSALYR AGGAYGRGSPELLLEGAETV TPVVDPIGYG SLWYTSVGFG GLAQLRSGER VYVNISHPDM VDYRRGKTFF GAVMVG <210> 57 <211> <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 ATGCTCCTGCCTTGGGCCACCTCTGCCCCCGGCCTGGCCTGGGGGCCTCTGGTGCTGGGCCTCTTCGGGCTCCTGGCAGC ATCGCAGCCCCAGGCGGTGCCTCCATATGCGTCGGAGAACCAGACCTGCAGGGACCAGGAAAAGGAATACTATGAGCCCC AGCACCGCATCTGCTGCTCCCGCTGCCCGCCAGGCACCTATGTCTCAGCTAAATGTAGCCGCATCCGGGACACAGTTTGT GCCACATGTGCCGAGAATTCCTACAACGAGCACTGGAACTACCTGACCATCTGCCAGCTGTGCCGCCCCTGTGACCCAGT GATGGGCCTCGAGGAGATTGCCCCCTGCACAAGCAAACGGAAGACCCAGTGCCGCTGCCAGCCGGGAATGTTCTGTGCTG CCTGGGCCCTCGAGTGTACACACTGCGAGCTACTTTCTGACTGCCCGCCTGGCACTGAAGCCGAGCTCAAAGATGAAGTT GGGAAGGGTAACAACCACTGCGTCCCCTGCAAGGCAGGGCACTTCCAGAATACCTCCTCCCCCAGCGCCCGCTGCCAGCC CCACACCAGGTGTGAGAACCAAGGTCTGGTGGAGGCAGCTCCAGGCACTGCCCAGTCCGACACAACCTGCAAAAATCCAT TAGAGCCACTGCCCCCAGAGATGTCAGGAGGG <210> 58 <211> <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 CGCGCCCAGGTCACCGACAAAGCTGCGCACTATACTCTGTGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTC AGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGG GAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCT CCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAT <210> 59 <211> <212> DNA <213> Mus musculus <400> 59 ATGCGCCTGCCCCGGGCCTCCTCTCCCTGCGGCCTGGCCTGGGGGCCACTCCTGCTGGGACTCAGCGGGCTTCTGGTGGC CTCTCAGCCCCAGCTGGTGCCCCCTTATCGCATAGAAAACCAGACTTGCTGGGACCAGGACAAGGAATACTACGAGCCCA TGCACGACGTCTGCTGCTCCCGCTGTCCCCCAGGCGAGTTTGTCTTTGCGGTATGCAGCCGCAGCCAAGACACGGTTTGC AAGACTTGCCCCCATAATTCCTATAATGAACACTGGAACCATCTCTCCACCTGCCAGCTGTGCCGCCCCTGTGACATTGT GCTGGGCTTTGAGGAGGTTGCCCCTTGCACCAGCGATCGGAAAGCCGAGTGCCGCTGTCAGCCGGGGATGTCCTGTGTGT ATCTGGACAATGAGTGTGTGCACTGTGAGGAGGAGCGGCTTGTACTCTGCCAGCCTGGCACAGAAGCCGAGGTCACAGAT GAAATTATGGATACTGACGTCAACTGTGTCCCCTGTAAGCCGGGACACTTCCAGAACACTTCCTCCCCTCGAGCCCGCTG TCAACCCCATACCAGATGTGAGATCCAGGGCCTGGTGGAGGCAGCTCCAGGTACCTCCTACTCGGATACCATCTGTAAAA <210> 60 <211> <212> DNA <213> Mus musculus <400> 60 CTCGAGGACCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATC TTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGA TGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATT ACGACAGTACTCTACGCGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAG GTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATA TGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAG ACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGT TCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCA CGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATGAAAGCTTGGCCGCCATGGCCC <210> 61 <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 MKHQHQHQHQHQHQMHQAQTARQHPK- MHLAHSTLKPAAHLIGDPSKQNSLLWRANTDRAFLQDGFSLSNNSLLVPTSGIYFVYSQVVFSGKAYSPKATSSPLYLAHE VQLFSSQYPFHVPLLSSQKMVYPGLQEPWLHSMYHGAAFQLTQGDQLSTHTDGIPHLVLSPSTVFFGAFAL

Claims (29)

  1. IL-22를 포함하는 폴리펩티드의 유효량을 포함하는, 대상에서 염증성 장 질환(IBD)인 미생물 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
  2. IL-22 활성을 증가시키는 IL-22 효능제의 유효량을 포함하고, IL-22 효능제가 하기 군으로부터 선택되는, 대상에서 염증성 장 질환(IBD)인 미생물 질환을 치료하기 위한 제약 조성물:
    (a) IL-22-Fc 융합 폴리펩티드;
    (b) IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 핵산;
    (c) IL-22 융합 폴리펩티드;
    (d) 항-IL-22 항체 또는 그의 생물학적 활성 단편;
    (e) 항-IL-22 모노클로날 항체; 및
    (f) 항-IL-22 인간화 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정맥내(intravenous), 근내(intramuscular), 복강내(intraperitoneal), 뇌척수내(intracerebrospinal), 피하(subcutaneous), 관절내(intraarticular), 활액내(intrasynovial), 경막내(intrathecal), 경구(oral), 국소(topical), 또는 흡입(inhalation) 투여를 위한 제약 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 정맥내 투여를 위한 제약 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 염증성 장 질환(IBD)이 크론병인 제약 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 염증성 장 질환(IBD)이 궤양성 대장염인 제약 조성물.
  7. IL-22를 포함하는 제약 조성물을 포함하는, 대상에서 염증성 장 질환(IBD)인 미생물 질환을 치료하기 위한 키트.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
KR1020107012426A 2007-11-07 2008-11-07 미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법 KR101867606B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US98617007P 2007-11-07 2007-11-07
US60/986,170 2007-11-07
US1362007P 2007-12-13 2007-12-13
US61/013,620 2007-12-13
US1562007P 2007-12-20 2007-12-20
US61/015,620 2007-12-20
PCT/US2008/082890 WO2009062102A2 (en) 2007-11-07 2008-11-07 Compositions and methods for treatment of microbial disorders

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167030030A Division KR20160129099A (ko) 2007-11-07 2008-11-07 미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100096137A KR20100096137A (ko) 2010-09-01
KR101867606B1 true KR101867606B1 (ko) 2018-06-18

Family

ID=40551983

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107012426A KR101867606B1 (ko) 2007-11-07 2008-11-07 미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법
KR1020167030030A KR20160129099A (ko) 2007-11-07 2008-11-07 미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167030030A KR20160129099A (ko) 2007-11-07 2008-11-07 미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법

Country Status (26)

Country Link
US (4) US20090202475A1 (ko)
EP (3) EP2217263A2 (ko)
JP (3) JP5985150B2 (ko)
KR (2) KR101867606B1 (ko)
CN (5) CN104888193A (ko)
AU (1) AU2008323770B2 (ko)
CA (1) CA2705007A1 (ko)
CO (1) CO6280406A2 (ko)
DK (1) DK2514436T3 (ko)
ES (1) ES2662845T3 (ko)
HK (2) HK1214137A1 (ko)
HR (1) HRP20180445T1 (ko)
HU (1) HUE038588T2 (ko)
IL (2) IL205623A0 (ko)
LT (1) LT2514436T (ko)
MX (1) MX2010005108A (ko)
NO (1) NO2514436T3 (ko)
PH (1) PH12013501074A1 (ko)
PL (1) PL2514436T3 (ko)
PT (1) PT2514436T (ko)
RS (1) RS57021B1 (ko)
RU (1) RU2503460C2 (ko)
SG (2) SG10202007210RA (ko)
SI (1) SI2514436T1 (ko)
WO (1) WO2009062102A2 (ko)
ZA (1) ZA201003113B (ko)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101361968B (zh) 2007-08-06 2011-08-03 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素-22在治疗脂肪肝中的应用
CA2741566A1 (en) * 2008-11-03 2010-06-03 Schering Corporation Inflammatory bowel disease biomarkers and related methods of treatment
WO2011046616A2 (en) * 2009-10-15 2011-04-21 New York University Methods for modulating bacterial infection
WO2011127344A2 (en) * 2010-04-08 2011-10-13 University Of Virginia Patent Foundation Method to detect and treat infectious or inflammatory diarrhea
CN102260343A (zh) 2010-05-25 2011-11-30 健能隆医药技术（上海）有限公司 重组人g-csf二聚体在治疗神经损伤疾病中的用途
CN102380091A (zh) 2010-08-31 2012-03-21 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素-22在治疗病毒性肝炎中的应用
CA2842969C (en) 2011-07-25 2018-03-27 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Use of g-csf dimer in preparation of medicament for treatment of neurodegenerative diseases
WO2013085715A1 (en) * 2011-12-05 2013-06-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Graphene-biomolecule bioelectronic devices
CN102559759A (zh) * 2011-12-19 2012-07-11 西安交通大学医学院第一附属医院 Hip/pap重组腺病毒及其抗溃疡性结肠炎的应用
CN103182072B (zh) 2011-12-27 2017-05-03 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素‑22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途
KR101431324B1 (ko) * 2012-08-20 2014-08-20 성균관대학교산학협력단 ＷＫＹＭＶｍ 펩티드를 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US9314504B2 (en) * 2013-03-14 2016-04-19 Taipei Medical University Use of members of IL-10 cytokine family
TR201809571T4 (tr) * 2013-03-15 2018-07-23 Hoffmann La Roche Ll-22 polipeptidleri ile ıl-22 fc füzyon proteinleri ve kullanım yöntemleri.
WO2014139182A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Shenzhen Hightide Biopharmaceutical, Ltd. Compositions and methods of using islet neogenesis peptides and analogs thereof
WO2015054386A1 (en) * 2013-10-08 2015-04-16 Georgia State University Research Foundation, Inc Compositions including il-18 and il-22 and their use in anti-viral therapies
CN103554267A (zh) * 2013-10-15 2014-02-05 山西农业大学 一种具有抗菌功能的融合蛋白及其构建方法和应用
JP5515104B1 (ja) * 2013-10-25 2014-06-11 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 抗酸菌の増殖促進剤、これを添加して培養する抗酸菌の培養方法、及び、これを含有する抗酸菌の培養用培地
CN104623637A (zh) 2013-11-07 2015-05-20 健能隆医药技术（上海）有限公司 Il-22二聚体在制备静脉注射药物中的应用
AU2014346554B2 (en) 2013-11-07 2020-06-04 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd Methods of use for IL-22 in the treatment of gastrointestinal graft vs. host disease
CN109206484B (zh) * 2015-11-20 2021-06-18 深圳市南山区人民医院 一种用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段
CN109328069B (zh) 2016-04-15 2023-09-01 亿一生物医药开发(上海)有限公司 Il-22在治疗坏死性小肠结肠炎中的用途
EP4137509A1 (en) * 2016-05-18 2023-02-22 ModernaTX, Inc. Combinations of mrnas encoding immune modulating polypeptides and uses thereof
CA3070182A1 (en) * 2017-07-13 2019-01-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Reg3alpha for use in the protection of oxygen sensitive gram-positive bacteria
WO2022192419A2 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods of treating inflammatory bowel disease (ibd) with anti- tnf-blockade
CN113304247B (zh) * 2021-04-01 2024-03-19 上海市儿科医学研究所 Reg4蛋白及其在抵抗肠炎伤寒沙门氏菌感染中的应用
CN114409758A (zh) * 2022-01-24 2022-04-29 上海市儿科医学研究所 Reg4抗菌肽治疗致病性大肠埃希菌感染的应用
CN114344451B (zh) * 2022-01-25 2023-09-26 上海市肺科医院 Reg4抗菌肽治疗铜绿假单胞菌感染性肺炎的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002029098A2 (en) * 2000-10-05 2002-04-11 Isis Innovation Limited Genetic factors affecting the outcome of viral infections
KR20060022289A (ko) * 2003-06-23 2006-03-09 제네틱스 인스티튜트, 엘엘씨 인터류킨-22 에 대한 항체 및 그의 용도

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
WO1984003506A1 (en) 1983-03-08 1984-09-13 Commw Serum Lab Commission Antigenically active amino acid sequences
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US5683688A (en) 1984-05-31 1997-11-04 Genentech, Inc. Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions
NZ215865A (en) 1985-04-22 1988-10-28 Commw Serum Lab Commission Method of determining the active site of a receptor-binding analogue
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5571689A (en) 1988-06-16 1996-11-05 Washington University Method of N-acylating peptide and proteins with diheteroatom substituted analogs of myristic acid
US5663143A (en) 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
EP0498843B1 (en) 1989-10-24 1996-06-12 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
CA2086264C (en) 1990-06-27 2002-12-24 Jeffrey L. Browning Surface complexed lymphotoxin
JPH06500011A (ja) 1990-06-29 1994-01-06 ラージ　スケール　バイオロジー　コーポレイション 形質転換された微生物によるメラニンの製造
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
WO1992009300A1 (en) 1990-11-21 1992-06-11 Iterex Pharmaceuticals Ltd. Partnership Synthesis of equimolar multiple oligomer mixtures, especially of oligopeptide mixtures
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
ATE149570T1 (de) 1992-08-17 1997-03-15 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
ES2304786T3 (es) 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
AU2660397A (en) 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US20010023070A1 (en) * 1998-05-29 2001-09-20 Reinhard Ebner Interleukins-21 and 22
CA2329274A1 (en) * 1998-05-29 1999-12-02 Steven M. Ruben Interleukin-21
US6335155B1 (en) 1998-06-26 2002-01-01 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules
WO2000039585A1 (en) 1998-12-28 2000-07-06 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Identifying small organic molecule ligands for binding
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6939545B2 (en) * 1999-04-28 2005-09-06 Genetics Institute, Llc Composition and method for treating inflammatory disorders
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
US20030170823A1 (en) * 1999-12-23 2003-09-11 Presnell Scott R. Novel cytokine ZCYTO18
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
FR2833011B1 (fr) * 2001-12-04 2004-10-29 Univ Claude Bernard Lyon Nouvelle proteine a activite inhibitrice de l'il-6
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
AU2003234706A1 (en) 2002-04-15 2003-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to tl5
WO2004003144A2 (en) * 2002-07-01 2004-01-08 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to reg iv
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
AU2003301059A1 (en) * 2002-12-18 2004-07-22 Wyeth Methods for screening, treating and diagnosing inflammatory bowel disease and compositions thereof
GB2401040A (en) * 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
EP2481287B1 (en) * 2003-08-01 2016-07-20 Stratatech Corporation Human skin equivalents expressing exogenous polypeptides
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
US20050277593A1 (en) * 2004-05-24 2005-12-15 Washington University Therapeutic uses of Reg protein
RU2302460C1 (ru) * 2005-11-02 2007-07-10 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (СО РАН) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBi101-IL18, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ ИНТЕРЛЕЙКИНА-18 ЧЕЛОВЕКА В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ
EP2029171A1 (en) * 2006-06-19 2009-03-04 Wyeth a Corporation of the State of Delaware Methods of modulating il-22 and il-17

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002029098A2 (en) * 2000-10-05 2002-04-11 Isis Innovation Limited Genetic factors affecting the outcome of viral infections
KR20060022289A (ko) * 2003-06-23 2006-03-09 제네틱스 인스티튜트, 엘엘씨 인터류킨-22 에 대한 항체 및 그의 용도

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. 290(4):G827-38(2006.04.) *
Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. 290(4):G827-38(2006.04.)*
Eur. J. Immunol. 36(5):1309-1323(2006.05.) *
Eur. J. Immunol. 36(5):1309-1323(2006.05.)*
NCBI Accession No. AAH67509.(2006. 07. 15.) *
NCBI Accession No. AY358890.(2003. 10. 03.) *
NCBI GenBank Accession No. AAH67509.(2006. 07. 15.) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2514436B1 (en) 2017-12-20
SI2514436T1 (en) 2018-04-30
LT2514436T (lt) 2018-04-10
US20130052159A1 (en) 2013-02-28
CN101951945A (zh) 2011-01-19
HK1259102A1 (zh) 2019-11-22
JP2016117760A (ja) 2016-06-30
JP6266486B2 (ja) 2018-01-24
CN108815508A (zh) 2018-11-16
EP3360567A1 (en) 2018-08-15
ZA201003113B (en) 2015-08-26
EP2514436A2 (en) 2012-10-24
KR20100096137A (ko) 2010-09-01
CO6280406A2 (es) 2011-05-20
MX2010005108A (es) 2010-05-27
JP2011503102A (ja) 2011-01-27
RU2010122982A (ru) 2011-12-20
PT2514436T (pt) 2018-03-21
JP2015003924A (ja) 2015-01-08
US20210338778A1 (en) 2021-11-04
WO2009062102A2 (en) 2009-05-14
RU2503460C2 (ru) 2014-01-10
IL258730A (en) 2018-06-28
RS57021B1 (sr) 2018-05-31
CA2705007A1 (en) 2009-05-14
AU2008323770B2 (en) 2014-08-07
CN102172395A (zh) 2011-09-07
JP5985150B2 (ja) 2016-09-06
HRP20180445T1 (hr) 2018-04-20
PL2514436T3 (pl) 2018-06-29
US20090202475A1 (en) 2009-08-13
EP2217263A2 (en) 2010-08-18
NO2514436T3 (ko) 2018-05-19
ES2662845T3 (es) 2018-04-10
SG185972A1 (en) 2012-12-28
HK1214137A1 (zh) 2016-07-22
WO2009062102A3 (en) 2009-09-24
KR20160129099A (ko) 2016-11-08
HUE038588T2 (hu) 2018-10-29
EP2514436A3 (en) 2013-01-16
AU2008323770A2 (en) 2010-12-09
US20110280828A1 (en) 2011-11-17
CN103142999A (zh) 2013-06-12
SG10202007210RA (en) 2020-08-28
CN104888193A (zh) 2015-09-09
DK2514436T3 (en) 2018-03-12
IL205623A0 (en) 2010-11-30
AU2008323770A1 (en) 2009-05-14
PH12013501074A1 (en) 2015-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101867606B1 (ko) 미생물 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법
KR101453570B1 (ko) Ｉｌ-22 및 ｉｌ-22ｒ에 결합하는 항체를 포함하는,사이토카인 신호 전달과 관련된 질환 및 장애 치료용조성물 및 치료 방법
US7618632B2 (en) Method of treating or ameliorating an immune cell associated pathology using GITR ligand antibodies
US20080241130A1 (en) Methods and compositions for modulating il-17f/il-17a biological activity
AU2016259423B2 (en) Compositions and methods for treatment of microbial disorders
ZA200509143B (en) GITR ligand and GITR ligand-related molecules and antibodies and uses thereof
AU2016202280B2 (en) Compositions and methods for the treatment of diseases and disorders associated with cytokine signaling involving antibodies that bind to IL-22 and IL-22R
AU2014259514A1 (en) Compositions and methods for treatment of microbial disorders

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
J301 Trial decision

Free format text: TRIAL NUMBER: 2016101006140; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20161026

Effective date: 20180223

S901 Examination by remand of revocation
GRNO Decision to grant (after opposition)