CN103554267A

CN103554267A - 一种具有抗菌功能的融合蛋白及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN103554267A
Application number: CN201310481238.6A
Authority: CN
Inventors: 范阔海; 王志瑞; 姜俊兵; 李宏全
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2014-02-05

Abstract

本发明公开了一种具有抗菌功能的融合蛋白及其构建方法和应用，所述融合蛋白由经修饰的小鼠Reg3α抗菌蛋白和6个组氨酸组成，是含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽，其构建方法是将Reg3α与表达质粒pwPICZalpha连接构成重组表达质粒pwPICZalpha-Reg3α，线性化后整合到毕赤酵母基因组中，挑取阳性克隆诱导表达，进而以ProteinPureNi-NTA树脂和强阳离子交换树脂纯化得到。本发明构建的融合蛋白具有抗staphylococcus的能力，可用于生产动物饲养用抗菌蛋白。

Description

一种具有抗菌功能的融合蛋白及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，特别是涉及一种利用基因工程重组技术构建的Reg3α融合蛋白，以及该融合蛋白的构建方法和应用。

背景技术

Reg3α(Regenerating islet-derived protein 3 alpha)属于C型凝集素超家族，对革兰氏阳性耐药细菌具有显著的直接杀伤和抑制效果，其主要依赖C端结构域与细菌细胞壁肽聚糖的结合作用，以补体杀伤的模式对革兰氏阳性菌的细胞壁进行作用。在组织受损的状态下，Reg3α的表达不仅能促进细胞的增殖，而且能防止伤口感染，有助于伤口愈合。另外，Reg3α对于急性炎症的发生具有一定的抑制作用，能缓解炎症因子的过度产生所造成的组织损伤。综上所述，Reg3α具有抑制病原微生物生长、促进细胞增殖以及抑制损伤部位炎症因子过表达的功能，有望成为治疗感染、炎症和组织受损的新型药物。

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统，它既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等，同时还避免了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷。除此之外，由于其在蛋白质表达方面还具有以下几个其它表达系统所不可比拟的优点，使得该系统成为目前研究最多、应用最广泛的真核表达系统之一：1）它所携带的aox启动子是一种强有力的启动子，受甲醇严格诱导调控而表达，所以可严格调控外源蛋白的表达；2）可以对表达蛋白进行糖基化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、脂类酰化等一系列的翻译后修饰，从而使其表达的蛋白具有生物活性；3）表达量高，迄今为止，已有300多种异源蛋白在该表达系统中获得了高效表达，如破伤风毒素片段C可达12g/L，而明胶的表达量甚至达到了14.8g/L；4）外源基因的表达产物既可存在于胞内，又可通过其特有的信号肽α-因子或天然蛋白本身的信号肽分泌至细胞外，同时，该系统自身分泌的蛋白非常少，这大大简化了纯化过程；5）整合入外源基因的重组子表达系统十分稳定，有文献报道，通过同源重组整合入外源基因的重组子表达系统可连续培养50代，却未见外源基因丢失的现象；6）糖基化程度低，毕赤酵母中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为8-14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50-150甘露糖残基要短得多，同时，由于毕赤酵母不能象酿酒酵母那样在核心多糖末端形成α-1,3末端甘露糖，使得它的蛋白抗原性远远低于后者，因而更适合于治疗用途；7）该表达系统由于对营养要求低，培养基成份简单廉价，可进行高密度高产量的发酵培养，便于工业化生产。利用毕赤酵母构建的高效表达系统能够显著提高蛋白的产量，从而降低蛋白的生产成本，对蛋白的工业化生产具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗菌功能的融合蛋白，以及所述融合蛋白的构建方法和应用。

本发明的融合蛋白是由经过修饰的小鼠Reg3α抗菌蛋白和6个组氨酸组成，所述融合蛋白是含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽。

上述融合蛋白的基因由编码小鼠Reg3α成熟肽的cDNA序列、6个组氨酸cDNA序列、限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ位点的cDNA序列以及符合毕赤酵母表达偏好性的基因序列组成，所述融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述Reg3α融合蛋白的构建方法包括如下步骤：

1)．表达载体的构建：SEQ ID NO.2所示人工合成的Reg3α基因序列上设计有限制性内切酶的酶切位点，将Reg3α基因序列与表达质粒pwPICZalpha以同样的限制性内切酶酶切后连接在一起，通过双酶切检测，筛选出含有Reg3α基因序列的重组表达质粒pwPICZalpha-Reg3α；

2)．酵母表达系统的构建：使用限制性内切酶线性化pwPICZalpha-Reg3α，通过电转化方法将Reg3α基因序列整合到毕赤酵母基因组中，将转化后的菌体悬液涂布于含有Zeocin的YPD平板上，30℃培养诱导筛选单菌落出现，挑取单菌落进行小剂量诱导表达，SDS-PAGE检测表达上清确认阳性克隆；

3)．融合蛋白的纯化和活性检测：挑选阳性克隆菌落进行大剂量诱导表达，表达上清采用ProteinPure Ni-NTA树脂和强阳离子交换树脂纯化，通过SDS-PAGE和Western blot检测纯化的融合蛋白。

本发明Reg3α是一种优良的抗菌蛋白，抑菌圈实验检测融合蛋白的抗菌活性具有抗staphylococcus的能力，这些特点使得Reg3α可以作为抗生素的候选替代品来进行研究。

本发明即是基于上述抗菌蛋白和毕赤酵母的优点，以毕赤酵母表达基因工程抗菌蛋白，能够大量生产动物饲养所急需的、可以替代抗生素的动物自身基因表达的抗菌蛋白，为市场提供无毒无害、健康的绿色产品。并且对抗菌蛋白的进一步开发和利用将产生很高的经济价值和巨大的社会效益。

附图说明

图1 是ProteinPure Ni-NTA 树脂纯化Reg3α的SDS-PAGE电泳图。

图2 是强阳离子交换树脂纯化Reg3α的SDS-PAGE电泳图。

图3 是重组Reg3α的Western blot分析图。

图4 是重组Reg3α的抑菌效果图，图中：1）氨苄青霉素；2）PBS；3）重组Reg3α。

具体实施方式

1、所用试剂及其配制

（1）LB（Luria-Bertani）液体培养基：取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 5g，溶解于800mL ddH₂O中，10M NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌（121℃，1.034×10⁵Pa）20min，4℃保存。

（2）LB（Luria-Bertani）固体培养基：按每1000mL ddH₂O加15g琼脂粉，向LB液体培养基中加入琼脂粉，高压灭菌，4℃保存。

（3）贮备液：

10×YNB（13.4%，含硫酸铵而不含氨基酸）：将34g YNB和100g硫酸铵热溶于1000mL ddH₂O中，过滤除菌，4℃保存。

500×生物素（0.02%）：20mg生物素溶于100mL ddH₂O中，过滤除菌，4℃保存。

10×葡萄糖（20%）：200g葡萄糖溶于1000mL ddH₂O中，高压灭菌，4℃保存。

10×甲醇（5%甲醇）：5mL甲醇与95mL ddH₂O混匀，过滤除菌，4℃保存。

10×甘油（10%甘油）：100mL甘油与900mL ddH₂O混匀，过滤除菌或高压灭菌，室温保存。

1M磷酸氢二钾缓冲液，pH=7.0：132mL 1M K₂HPO₄与868mL 1M KH₂PO₄混合，高压灭菌，室温保存。

10×酸水解酪素（10%酸水解酪素）：100g酸水解酪素溶于1000mL ddH₂O中，高压灭菌，4℃保存。

（4）YPD培养基（1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖）：10g酵母提取物、20g蛋白胨溶于900mL ddH₂O中，加入20g琼脂制YPD板，高压灭菌，再加100mL 10×葡萄糖，4℃保存备用。

（5）YPG培养基（1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、1.0%甘油）：10g酵母提取物、20g蛋白胨溶于900mL ddH₂O中，高压灭菌，再加100mL 10×甘油，4℃保存备用。

（6）BMMYC培养基（1.34%YNB、4×10^-5%生物素、0.5%甲醇、1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、1.0%酸水解酪素）：10g酵母提取物、20g蛋白胨溶于600mL ddH₂O中，高压灭菌，冷却至室温，加100mL 1M磷酸氢二钾缓冲液，pH=7.0、100mL 10×YNB、2mL 500×生物素、100mL 10×甲醇、100mL 10×酸水解酪素混匀，4℃保存。

2、Reg3α基因序列的优化和获得

根据NCBI登陆的小鼠Reg3α基因序列(Gene ID：19694)和酵母菌密码子偏好性，对Reg3α的基因序列进行优化，为了便于纯化，在C端加入6个组氨酸（6×His tag），在序列的5’和3’端引入XhoⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点。优化后的Reg3α基因序列由Invitrogen公司合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3、表达载体的构建

利用XhoⅠ和EcoRⅠ两个限制性内切酶对合成的Reg3α和质粒pwPICZalpha进行双酶切，酶切后产物进行琼脂糖电泳并采用胶回收试剂盒回收DNA片段并进行连接。

用XhoⅠ和EcoRⅠ对连接产物进行双酶切鉴定，验证基因片段正确插入，该重组表达质粒命名为pwPICZalpha-Reg3α。

在无菌Eppendorf管中7μL双酶切的目的基因片段，1μL双酶切的质粒，1μL T4连接酶，1μL连接酶缓冲液，混匀，4℃连接12h；将10μL连接产物加入到90μL感受态大肠杆菌TOP10中，混匀，42℃热激90s转化，加入400μL LB液体培养基，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在Zeocin抗性的LB固体培养基上，37℃培养过夜。从转化的平板上挑取6个菌落接种到含Zeocin的5mL LB液体培养基中，37℃过夜培养。用质粒提取试剂盒提取质粒。

4、融合蛋白的表达

1）小剂量诱导表达

利用限制性内切酶SacⅠ将5-10μg重组表达质粒pwPICZalpha-Reg3α进行线性化，采用PCR产物纯化试剂盒回收线性化的pwPICZalpha-Reg3α，加入到90μL感受态毕赤酵母X-33中，混匀，冰浴5min后电击转化，加入1mL山梨醇后，30℃放置2h，将菌液涂布在Zeocin抗性的YPD固体培养基上，30℃培养3-4d。从转化的平板上挑取6个菌落接种到含Zeocin的5mL YPD液体培养基中，30℃250rpm培养24h，3500rpm离心，弃上清后加入5mL YPG液体培养基，30℃250rpm培养24h，3500rpm离心弃掉上清，加入2mL BMMYC液体培养基，27℃225rpm培养48h，每隔12h补充一次甲醇，使甲醇浓度维持在0.5%。3500rpm离心后收集上清液，SDS-PAGE分析上清液。

2）大剂量诱导表达

挑取一个阳性菌落接种到YPD液体培养基中，30℃250rpm培养24h作为种子培养液，取13mL种子培养液接种到250mL YPD液体培养基中，30℃250rpm培养24h，30℃250rpm培养24h，3500rpm离心，弃上清后加入250mL YPG液体培养基，30℃250rpm培养24h，3500rpm离心弃掉上清，加入125mL BMMYC液体培养基，27℃225rpm培养48h，每隔12h补充一次甲醇，使甲醇浓度维持在0.5%。3500rpm离心后收集上清液，SDS-PAGE分析上清液。

5、融合蛋白的纯化

1）ProteinPure Ni-NTA树脂纯化

在诱导表达的上清液中加入终浓度为50mM磷酸钠，0.3M氯化钠，10mM咪唑和10mM pH 8.0 Tris-HCl，用0.45μm滤器过滤。取10mL ProteinPure Ni-NTA树脂装入XK16/20层析柱中，柱子装好后与恒流泵相连，用10倍体积的Buffer

平衡柱子，平衡好后上样，上样结束后用8倍体积的Buffer

冲洗柱子，再用8倍体积的Buffer Ⅱ洗脱目的蛋白并收集到8个不同的管中，整个过程的流速为5mL/min。用SDS-PAGE对纯化的蛋白进行分析，图1中的SDS-PAGE结果显示，目的蛋白集中在Buffer

的2号和3号管中。将含有目的蛋白的Buffer Ⅱ混合，装入3.5kDa透析袋中，在4℃条件下用含有20mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA pH8.0，5%甘油的透析液透析8h，每隔4h换一次透析液。

2）强阳离子交换树脂纯化

取10mL强阳离子交换树脂装入XK16/20层析柱中，柱子装好后与恒流泵连接，用10倍体积的Buffer Ⅲ平衡柱子，将透析好的样品上样，上样结束后用8倍体积的Buffer Ⅲ冲洗柱子，再分别用8倍体积的Buffer

Figure 2013104812386100002DEST_PATH_IMAGE003

和Buffer 洗脱目的蛋白，并将洗脱液收集到8个不同的管中，整个过程的流速为5mL/min。用SDS-PAGE对纯化的蛋白进行分析，由图2可知目的蛋白集中在Buffer

的1、2、3、4和5管中。将含有目的蛋白的Buffer

混合，采用超滤浓缩的方法对目的蛋白进行浓缩，然后装入3.5kDa的透析袋中，在4℃条件下用含有5%甘油的PBS透析8h，每隔4 h换一次PBS。用BCA试剂盒测定目的蛋白浓度，蛋白浓度为1mg/mL，说明该蛋白基因在毕赤酵母中得到高效表达。利用抗His标签抗体对该蛋白进行western blot分析，由图3结果确证其为所要表达的蛋白。

4、抑菌实验

将100μL葡萄球菌涂到LB固体培养上，在平板打4个直径为5mm的孔，在孔中分别加入50μL Reg3α（1mg/mL）、氨苄青霉素（100mg/mL）和PBS，37℃培养12h，观察并记录抑菌效果。

抑菌效果见图4，由图中可以看出重组Reg3α能够有效抑制葡萄球菌的生长，表明重组Reg3α能够作为潜在的抗菌药物进行进一步的开发研究。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种具有抗菌功能的融合蛋白，所述融合蛋白由经过修饰的小鼠Reg3α抗菌蛋白和6个组氨酸组成，为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽。

2.根据权利要求1所述的具有抗菌功能的融合蛋白，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1具有抗菌功能的融合蛋白的构建方法，包括如下步骤：

1)表达载体的构建：SEQ ID NO.2所示人工合成的Reg3α基因序列上设计有限制性内切酶的酶切位点，将Reg3α基因序列与表达质粒pwPICZalpha以同样的限制性内切酶酶切后连接在一起，通过双酶切检测，筛选出含有Reg3α基因序列的重组表达质粒pwPICZalpha-Reg3α；

2)酵母表达系统的构建：使用限制性内切酶线性化pwPICZalpha-Reg3α，通过电转化方法将Reg3α基因序列整合到毕赤酵母基因组中，将转化后的菌体悬液涂布于含有Zeocin的YPD平板上，30℃培养诱导筛选单菌落出现，挑取单菌落进行小剂量诱导表达，SDS-PAGE检测表达上清确认阳性克隆；

3)融合蛋白的纯化和活性检测：挑选阳性克隆菌落进行大剂量诱导表达，表达上清采用ProteinPure Ni-NTA树脂和强阳离子交换树脂纯化，通过SDS-PAGE和Western blot检测纯化的融合蛋白。

4.权利要求1具有抗菌功能的融合蛋白作为抗staphylococcus用抗生素的应用。