JP5515104B1 - 抗酸菌の増殖促進剤、これを添加して培養する抗酸菌の培養方法、及び、これを含有する抗酸菌の培養用培地 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ウシRegIIIγレクチンを有効成分として含有する抗酸菌の増殖促進剤と;培地に、前記増殖促進剤を添加して培養することを特徴とする、抗酸菌の培養方法と;前記増殖促進剤を含有する抗酸菌の培養用培地と;を提供するものである。
【選択図】 なし
Description
特に遅発育抗酸菌は、その検出に数ヶ月かかるものもある。
中でも、我が国で家畜伝染病の一つに指定されているヨーネ病の原因菌であるヨーネ菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis)は、培養に数ヶ月を必要とする。
培養期間は、菌種によって異なるが、寒天培地では、通常、1〜2ヶ月間、液体培地では、2週間〜1ヶ月以上培養される。ヨーネ菌の初代分離には、寒天培地では、2〜4ヶ月、液体培地では、2週間〜2ヶ月間の培養を必要としている(例えば、非特許文献1参照)。
近年、諸外国においてヨーネ菌がヒトから分離されるとの報告がなされており、本菌の公衆衛生上の問題についても注目を集めていることから、本菌の迅速な検出法の開発が求められており、そのために抗酸菌を迅速に増殖させることのできる方法が強く求められている。
また、検体中の抗酸菌数が少ない場合には、従来の寒天培地、液体培地では、検出率が低いため、検体中の抗酸菌数を大量に増殖させることのできる方法が求められている。
次に、本発明は、抗酸菌を迅速に、しかも大量に増殖させることのできる、抗酸菌の培養方法を提供することを目的とするものである。
さらに、本発明は、抗酸菌の増殖を、迅速に、しかも著しく促進することのできる、抗酸菌の培養用培地を提供することを目的とするものである。
(1)ウシRegIIIγレクチンを有効成分として含有する抗酸菌の増殖促進剤に関するものである。
(2)以下の(a)又は(b)に示される蛋白質を有効成分として含有する抗酸菌の増殖促進剤に関するものである。
(a)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗酸菌の増殖促進活性を有する蛋白質
(3)抗酸菌が、ヨーネ菌である前記(1)又は(2)に記載の増殖促進剤に関するものである。
(4)抗酸菌を抗酸菌の培養用培地を用いて培養する方法において、抗酸菌と前記(1)又は(2)に記載の増殖促進剤とを混合し感作して前処理した後、これを前記培地に接種して抗酸菌を培養することを特徴とする、抗酸菌の培養方法に関するものである。
(5)抗酸菌を抗酸菌の培養用培地を用いて培養する方法において、前記培地に、前記(1)又は(2)に記載の増殖促進剤を添加して抗酸菌を培養することを特徴とする、抗酸菌の培養方法に関するものである。
(6)抗酸菌が、ヨーネ菌である前記(4)又は(5)に記載の培養方法に関するものである。
(7)前記(1)又は(2)に記載の増殖促進剤を含有する抗酸菌の培養用培地に関するものである。
(8)抗酸菌が、ヨーネ菌である前記(7)に記載の培養用培地に関するものである。
次に、本発明によれば、抗酸菌を迅速に、しかも大量に増殖させることのできる、抗酸菌の培養方法が提供される。
さらに、本発明によれば、抗酸菌の増殖を、迅速に、しかも著しく促進することのできる、抗酸菌の培養用培地が提供される。
本発明の第1の態様の抗酸菌の増殖促進剤は、ウシRegIIIγ(Regenerating islet-derived 3 gamma)レクチンを有効成分として含有するものである。
また、本発明の第2の態様は、抗酸菌を抗酸菌の培養用培地を用いて培養する方法において、抗酸菌と上記第1の態様の増殖促進剤(ウシRegIIIγレクチンを有効成分として含有する抗酸菌の増殖促進剤)とを混合し感作して前処理した後、これを前記培地に接種して抗酸菌を培養することを特徴とする、抗酸菌の培養方法である。
次に、本発明の第3の態様は、抗酸菌を抗酸菌の培養用培地を用いて培養する方法において、前記培地に、上記第1の態様の増殖促進剤(ウシRegIIIγレクチンを有効成分として含有する抗酸菌の増殖促進剤)を添加して抗酸菌を培養することを特徴とする、抗酸菌の培養方法である。
さらに、本発明の第4の態様は、上記第1の態様の増殖促進剤(ウシRegIIIγレクチン有効成分として含有する抗酸菌の増殖促進剤)を含有する抗酸菌の培養用培地である。
RegIIIγ遺伝子は、26アミノ酸のシグナルペプチドを含む172アミノ酸からなる蛋白をコードしている。RegIIIγは分泌蛋白質で、再生組織に発現される。分泌部位は、膵臓、胃、大腸、前立腺である。
ヒト、マウスのRegIIIγについては、C型レクチン(糖を結合する際にCaを要求)であること;正常で腸管に発現して、炎症性腸疾患で増強すること;パネート細胞から分泌されること;グラム陽性菌のペプチドグリカンに付いて殺菌すること;が報告されている。
なお、ウシRegIIIγ precursor については、NCBI[アメリカ生物工学(バイオテクノロジー)情報センター]に、NCBI Reference Sequence: NP_001019705.2 として登録されている。
ここでウシRegIIIγ precursor は、配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。また、ウシRegIIIγレクチンは、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。従って、プロセシング後のウシRegIIIγレクチンのアミノ酸配列(シグナルペプチドを除いた配列)が、配列表の配列番号1に示されていることになる。
また、ウシRegIIIγ precursor 、つまり配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子DNAが、配列表の配列番号4に示されている。
結核菌群としては、例えば M. tuberculosis(ヒト型結核菌)、M. bovis(ウシ型結核菌)などを挙げることができる。
癩菌群としては、例えばM. leprae(ライ菌)などを挙げることができる。
本発明によれば、このヨーネ菌を迅速に増殖させることができる。従って、本発明は、ヨーネ病の検査に有効に利用することができる。
抗酸菌を培養するにあたっては、通常、抗酸菌とウシRegIIIγ(Regenerating islet-derived 3 gamma)レクチンを混合し感作して前処理した後、これを培地に接種して抗酸菌を培養してもよいし、或いは、抗酸菌培養時に、培養用培地に、ウシRegIIIγ(Regenerating islet-derived 3 gamma)レクチンを、抗酸菌の増殖促進剤の有効成分として添加して培養してもよい。
また、本発明の第3の態様に示したように、抗酸菌培養時に、培養用培地に、抗酸菌の増殖促進剤[前記(1)で示した、ウシRegIIIγレクチンを有効成分として含有する抗酸菌の増殖促進剤、或いは前記(2)で示した、(a)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質又は(b)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗酸菌の増殖促進活性を有する蛋白質に示される蛋白質を有効成分として含有する抗酸菌の増殖促進剤]を添加して抗酸菌を培養することができる。
液体培地としては、Middlebrook 7H9 broth を基礎培地とした多くの培地が市販されている。
このような抗酸菌の培養用培地に、抗酸菌の増殖促進剤の有効成分として、ウシRegIIIγ(Regenerating islet-derived 3 gamma)レクチンを添加して培養する。
また、前処理法としてではなく、本発明の第3の態様に示したように、培養時に、Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis(ヨーネ菌)の増殖促進剤として用いる場合には、ヨーネ病検査マニュアル(2013.03.29版)に則り、ヨーネ菌の培養検査を行う際に、所定の寒天培地や液体培地にウシRegIIIγ(Regenerating islet-derived 3 gamma)レクチンを増殖促進剤の有効成分として添加する。
ヨーネ菌の培養検査に用いる培地としては、7H10MEY培地(マイコバクチン、卵黄液添加Middlebrook 7H10寒天培地)、マイコバクチン添加ハロルド培地等の寒天培地;BD BACTEC MGIT Para TB Medium等の液体培地が挙げられる。
また、本発明の第3の態様に示したような、培地に添加する場合のウシRegIIIγ(Regenerating islet-derived 3 gamma)レクチンの培地への添加量は、培養目的をはじめ、抗酸菌の種類や培地等により異なり一義的に定めることは困難であるが、10〜100μg/ml-培地、好ましくは20〜80μg/ml-培地、より好ましくは40〜60μg/ml-培地である。
(1)ウシRegIIIγレクチンの作製
ウシRegIIIγ遺伝子のシグナルペプチドを除く配列(配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列)をPCRで増幅後、ベクターへ挿入し、大腸菌を形質転換し、形質転換体を培養することで、組換え型蛋白質を生産した。
この組換え型蛋白質は、不溶性であるため、尿素を用いて可溶化後、アフィニティーカラムで精製、蛋白質をリフォールディング、バッファーをMES緩衝液(25mM MES, 25mM NaCl, 2mM CaCl2, pH6.0)で置換して、ウシRegIIIγレクチン(蛋白質分子量:19.136 kDa)を作製した。
ヨーネ菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ATCC19698株;ヨーネ菌標準株)を、0.1% Tween 80加PBSで、それぞれ104,105,106cfu/ml に希釈し、各100μl(103,104,105cfu)に、上記(1)で作製されたウシRegIIIγレクチン 191μgを加え、37℃、5%CO2において 2 時間感作後、ヨーネ菌の培養用寒天培地[7H10MEY培地(マイコバクチン、卵黄液添加Middlebrook 7H10寒天培地)]に希釈して 100μl/plate 接種し、ヨーネ菌のコロニーが生えてきた日数(ヨーネ菌のコロニーが確認されるまでの日数)を調べた。結果を図1に示す。
次に、ヨーネ菌104cfu を接種した場合、従来の培地では、ヨーネ菌のコロニーが確認されるまで30日かかるところが、これにウシRegIIIγレクチンを添加することにより、19日に短縮されることが分かる。
さらに、ヨーネ菌103cfu を接種した場合、従来の培地では、ヨーネ菌のコロニーが確認されるまで57日かかるところが、これにウシRegIIIγレクチンを添加することにより、35日に短縮されることが分かる。
特に、ヨーネ菌の接種菌数が少ない方が、両者の差が顕著になる傾向があることが分かる。
この結果、従来技術で2〜3ヶ月必要である培養日数が、ウシRegIIIγレクチンをヨーネ菌と混合して接種することで、1ヶ月半で十分であると判断される。
ヨーネ菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ATCC19698株;ヨーネ菌標準株)を、0.1% Tween 80加PBSで、それぞれ104,105,106cfu/ml に希釈し、各100μl(103,104,105cfu)に、実施例1(1)で作製されたウシRegIIIγレクチン 191μgを加え、37℃、5%CO2において 2 時間感作後、ヨーネ菌の培養用液体培地[BACTEC MGIT Para TB 培地;BD BACTEC MGIT Para TB Medium (BD Code No.:245154)液体培地(7ml)に以下の培地組成に示すものを混合したもの]に全量を接種した(ウシRegIIIγレクチンの最終濃度は、10μM)。
接種日から増殖菌がプラトーに達するまで、約 4 日毎に培養チューブから100μl採取し、100℃、8 分の加熱法によりDNA抽出後、QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Quiagen社、Cat. No.:204143)を用い、ヨーネ菌DNA量を定量した。結果を図2〜4に示す。
次に、図3によれば、ヨーネ菌104cfu を接種した場合、従来の培地では、ヨーネ菌が明らかに増殖したと考えられるDNA量が1pg/tube に達するまでに24日かかるところが、これにウシRegIIIγレクチンを添加することにより、17日に短縮されることが分かる。
さらに、図4によれば、ヨーネ菌103cfu を接種した場合、従来の培地では、ヨーネ菌が明らかに増殖したと考えられるDNA量が1pg/tube に達するまでに29日かかるところが、これにウシRegIIIγレクチンを添加することにより、20日に短縮されることが分かる。
特に、ヨーネ菌の接種菌数が少ない方が、両者の差が顕著になる傾向があることが分かる。
(1)抗酸菌A、即ちヨーネ菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ATCC19698株;ヨーネ菌標準株)を、0.1% Tween 80加PBSで、105cfu/ml に希釈し、希釈したヨーネ菌100μl(104cfu)に、実施例1(1)で作製されたウシRegIIIγレクチン 191μgを加え、37℃、5%CO2において 2 時間感作後、ヨーネ菌の培養用寒天培地[7H10MEY培地(マイコバクチン、卵黄液添加Middlebrook 7H10寒天培地)]に希釈して 100μl/plate 接種し、接種 1ヶ月後のコロニー数を数えた。結果を図5に示す。
・B:Mycobacterium avium subsp. avium serovar 1 (トリ型結核菌)
・C:Mycobacterium avium subsp. hominissuis serovar 4
・D:Mycobacterium intracellulare serovar 7
・E:Mycobacterium bovis BCG Tokyo
下記F〜Iで示す各種一般細菌を、PBSで、105cfu/ml に希釈し、希釈した一般細菌E〜H各100μl(104cfu)に、実施例1(1)で作製されたウシRegIIIγレクチン 191μgを加え、37℃、5%CO2において 2 時間感作後、LB寒天培地[培地組成は、LB Broth (Difco 244620)、2% Bacto Agar (Difco 214010)であり、シャーレに20mlずつ分注して用いた。]に希釈して 100μl/plate 接種し、接種 1日後のコロニー数をそれぞれ数えた。結果を図6に示す。
・F:Staphylococcus epidermids ATCC14990(グラム陽性菌)
・G:Streptcoccus suis NCTC10234(グラム陽性菌)
・H:Escherichia coli ATCC23736(グラム陰性菌)
・I:Enterobacter cloacae ATCC13047(グラム陰性菌)
一方、図6によれば、一般細菌に関しては、ウシRegIIIγレクチンを添加していない培地とウシRegIIIγレクチンを添加している培地とで、一般細菌の培養菌数は同等であり、両者間に差異は認められなかった。
してみれば、ウシRegIIIγレクチンは、各種抗酸菌に対して特異的に増殖を促進する働きがあると判断される。
(1)前記した抗酸菌B〜Dを 0.1% Tween 80加PBSで、それぞれ105cfu/ml に希釈し、各100μl(104cfu)に、実施例1(1)で作製されたウシRegIIIγレクチン 191μgを加え、37℃、5%CO2において 2 時間感作後、7H9培地[(Middlebrook 7H9 液体培地);培地組成は、Middlebrook 7H9 Broth (Difco 271310)、0.5%グリセリン、10% Middlebrook OADC Enrichment(BD BBL, Code No.:211886)であり、チューブに8.5mlずつ分注して用いた。]に全量を接種した(ウシRegIIIγレクチンの最終濃度は、10μM)。
接種日から増殖菌がプラトーに達するまで、約 4 日毎に培養チューブから100μl採取し、100℃、8 分の加熱法によりDNA抽出後、QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Quiagen社、Cat. No.:204143)を用い、抗酸菌共通遺伝子 heat-shock protein genes(hsp65)を増幅するPCRを実施し、抗酸菌DNA量を定量した。結果を図7〜9に示す。
接種日から増殖菌がプラトーに達するまで、約 4 日毎に培養チューブから100μl採取し、100℃、8 分の加熱法によりDNA抽出後、QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Quiagen社、Cat. No.:204143)を用い、抗酸菌共通遺伝子 heat-shock protein genes(hsp65)を増幅するPCRを実施し、抗酸菌DNA量を定量した。結果を図10に示す。
次に、図8によれば、Mycobacterium avium subsp. hominissuis serovar 4 を接種した場合、従来の培地では、菌が明らかに増殖したと考えられるDNA量が1pg/tube に達するまでに4日かかるところが、これにウシRegIIIγレクチンを添加することにより、2日に短縮されることが分かる。
さらに、図9によれば、Mycobacterium intracellulare serovar 7を接種した場合、従来の培地では、菌が明らかに増殖したと考えられるDNA量が1pg/tube に達するまでに9日かかるところが、これにウシRegIIIγレクチンを添加することにより、3日に短縮されることが分かる。
さらに、図10によれば、Mycobacterium bovis BCG Tokyoを接種した場合、従来の培地では、菌が明らかに増殖したと考えられるDNA量が1pg/tube に達するまでに23日かかるところが、これにウシRegIIIγレクチンを添加することにより、16日に短縮されることが分かる。
Claims (8)
- ウシRegIIIγレクチンを有効成分として含有する抗酸菌の増殖促進剤。
- 以下の(a)又は(b)に示される蛋白質を有効成分として含有する抗酸菌の増殖促進剤。(a)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗酸菌の増殖促進活性を有する蛋白質
- 抗酸菌が、ヨーネ菌である請求項1又は2に記載の増殖促進剤。
- 抗酸菌を抗酸菌の培養用培地を用いて培養する方法において、抗酸菌と請求項1又は2に記載の増殖促進剤とを混合し感作して前処理した後、これを前記培地に接種して抗酸菌を培養することを特徴とする、抗酸菌の培養方法。
- 抗酸菌を抗酸菌の培養用培地を用いて培養する方法において、前記培地に、請求項1又は2に記載の増殖促進剤を添加して抗酸菌を培養することを特徴とする、抗酸菌の培養方法。
- 抗酸菌が、ヨーネ菌である請求項4又は5に記載の培養方法。
- 請求項1又は2に記載の増殖促進剤を含有する抗酸菌の培養用培地。
- 抗酸菌が、ヨーネ菌である請求項7に記載の培養用培地。
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