JP2011055833A - Ｇｉｔｒリガンド及びｇｉｔｒリガンド関連分子及び抗体及びその使用 - Google Patents

Ｇｉｔｒリガンド及びｇｉｔｒリガンド関連分子及び抗体及びその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】グルココルチコイド誘導のＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）の新規なリガンドに関連する新規に単離し精製したポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。本発明はまた、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）に対する抗体を提供する。
【解決手段】ＧＩＴＲＬ及び／又はＧＩＴＲＬの調節因子を用いて、免疫システムの非制御から生じる障害（例えば、自己免疫障害、炎症性疾患、及び移植拒絶、並びに癌及び感染症）の診断、予測、その経過の監視の新規な方法。ＧＩＴＲＬ及びＧＩＴＲに関連するような新規な治療薬及び治療標的に指向し、免疫システムの非制御から生じる前記障害の介入（治療）及び予防の試験化合物をスクリーニング及び評価する方法。
【選択図】なし

Description

［０００１］本出願は、２００３年５月２３日出願の米国仮出願シリアルＮｏ．６０／４７２，８４４号、及び２００４年２月２６日出願の米国仮出願シリアルＮｏ．６０／５４７，９７５号の利益を主張し、両者はそのまま参照により本明細書に援用される。
［０００２］本発明は、ＮＩＨ内研究プロジェクト♯Ｚ０１−ＡＩ−０００２２４下で政府支援によりなされた。政府が本発明の一定の権利を有する。
発明の背景
発明の分野
［０００３］本発明は、グルココルチコイド誘導のＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）及びＧＩＴＲに関係するリガンド（ＧＩＴＲＬ）及びそれに関連する調節因子に関連する免疫システム（例えば、自己免疫障害、炎症性疾患、及び移植拒絶、及び癌及び感染症）の制御不能から生じる障害の診断、予測、進行の監視、及び治療の新規方法に指向する。本発明はさらに、新規治療法及び治療標的物に指向し、そして、ＧＩＴＲ及びＧＩＴＲＬに関連するような免疫システムの制御不能から生じる障害の療法（治療）及び予防のための試験化合物をスクリーニングし評価する方法に指向する。
関連する背景技術
［０００４］一般的に、Ｔリンパ球は、細胞を介した免疫に原因があり、他の白血球細胞の応答を増大又は抑制することによって制御的役割を演じる。Ｔリンパ球が免疫応答の抑制に役割を果たすという概念は周知である（例えば、Ｇｅｒｓｈｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８：７２３−３５を参照）。しかしながら、これらのサプレッサー細胞に対する標的抗原及びそれらの機能を調節する機構は未だに研究対象である。
［０００５］胸腺において発生する制御性Ｔ細胞の一群は、独特の膜抗原の発現によってエフェクターＴ細胞とは区別することができる。これらの制御性Ｔ細胞は、ＣＤ２５抗原を同時発現するＣＤ４＋Ｔ細胞（即ち、ＣＤ抗原を発現するＴ細胞）の亜種を作り出す。ＣＤ２５はまた、インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）α−鎖としても知られる。ＣＤ２５＋Ｔ細胞の同時移転又はそれとの再構築は、各種動物モデルにおける炎症性損傷及び自己免疫の両方の予防と関連する（Ｓｈｅｖａｃｈ（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４２３−４９を参照、本明細書に援用される）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞はまたインビトロでのＴ細胞活性の阻害、及び同時培養におけるＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の養子関係の抑制と関連している（Ｓｈｅｖａｃｈ、上述）。
［０００６］２０年以上前に、いくつかの自己反応性Ｔ細胞が中心的な寛容の機構を免れ、胸腺誘導の制御性Ｔ細胞の調節下でその周辺に存在することが示された。１９９５年に、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ及び共同研究者らは、ＩＬ−２Ｒのα鎖（即ち、ＣＤ２５）を天然に発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の小さな母集団が器官特異的な自己応答性Ｔ細胞の調節と関係付けられることを示した（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１５１−６４）。具体的には、彼らは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の免疫不全な宿主への移転が自己免疫疾患の範囲に導き、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の同時移転により妨げ得ることを示した（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．、上述）。その後の研究は、ウイルス性、細菌性及び原虫感染に対する免疫応答の抑制においてＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を関連付けている（Ａｓｅｆｆａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３２３２−４１；Ｂｅｌｋａｉｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４２０：５０２−０７；Ｈｉｓａｅｄａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：２９−３０；Ｋｕｒｓａｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：１５８５−９２；Ｌｕｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：１７５５−６２；Ｍａｌｏｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１１１−１９）。一緒に、これらの研究は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の除去が免疫応答を増大することを提供した。多くの試みがなされ、これらのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の活性及び、それらによる抑制が定義された。これらの細胞は、インビトロ及びインビボの両方のエフェクターＴ細胞機能を強力に抑制する胸腺誘導の細胞の独特の系統を表す。
［０００７］いくつかのインビトロ研究は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が、ＩＬ−２の転写を止めることによって、マイトジェン及び抗原の両方に反応してＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制することを示した（例えば、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ａｎｄ Ｓｈｅｖａｃｈ（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２８７−９６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１９６９−８０）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞と自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞とのインビボでの同時移転は、器官特異的な自己免疫の誘導とエフェクターフェーズの両方を抑制するのに十分である（Ｓｕｒｉ−Ｐａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：６６９−７７；Ｓｕｒｉ−Ｐａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１２１２−１８）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の他の特性は、外因性ＩＬ−２の不在でのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激に対する低応答性、細胞−細胞相互作用を介した免疫抑制、及びそれらの抑制性表現型を誘導するＴＣＲシグナリングに関する要求（しかしながら、それらが一度活性化されれば、それらの抑制性機能は抗原性刺激に独立である）を含む。ＣＤ２５発現の単なる獲得は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の刺激によって達成され得るので、抑制性表現型は含まないこともまた示されている。これらのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞はヒトに存在することが知られている（Ｓｈｅｖａｃｈ（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：Ｆ１−Ｆ６）。
［０００８］一研究は、変化した胸腺選択が制御性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の発生に関して要求されることを示した（Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３０１−０６）。加えて、ノックアウトマウスを用いた研究は、ＩＬ−２合成と反応性に関与する分子がこれらの細胞の発生に関して要求されること；ＩＬ２又はＩＬ２Ｒβ、又はＢ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）、又はＣＤ２８全部について遺伝的に不全のマウスがＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞における重篤な減少を有し、これらのマウスのいくつかの周辺に結果としてリンパ腺症及び過剰増殖となる（Ｐａｐｉｅｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３７１−７８；Ｓａｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：４３１−４０；Ｋｕｍａｎｏｇｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：３５３−６０）。
［０００９］最近まで、当該技術は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋を介した免疫システムの抑制に関与する機構、例えば、抗原特異性、抑制の獲得に関与する分子、及び抑制のエフェクターフェーズに関与する細胞表面分子又は短期作動のサイトカインを決定することができなかった；自己免疫の変更におけるＣＤ２５＋Ｔ細胞の分子標的は同様にほとんど未知のままであった。現在、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞における遺伝子チップ解析の使用を通じて遺伝子の差異による発現を調べることによって、いくつかのＣＤ２５＋特異遺伝子が存在することを示している（ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：３１１−２３；同様に米国特許出願１０／１９４，７５４を参照、参照により本明細書に完全に援用される）。これらの遺伝子は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞上に優先的に発現することが決定され、治療的な干渉のための標的、及び自己免疫障害、炎症性疾患及び移植拒絶のためのスクリーニング方法、並びに癌及び感染症のためのスクリーニング方法として役立てることができる。
［００１０］重要なことに、ＣＤ２５＋細胞において差別的に発現するものと決定された遺伝子の１つは、グルココルチコイド誘導のＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）である（ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，上述）。ＧＩＴＲは、細胞表面の膜貫通タンパク質受容体であり、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの一員である。ＧＩＴＲは、非活性化Ｔ細胞上に構築的に存在することが示されている（Ｇａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：３３−４１；ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，上述；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１３５−４２）。ＧＩＴＲは、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）と称する別の膜貫通タンパク質に結合する。ＧＩＴＲに対する作動性抗体は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制活性を廃止することが示されており、これらの細胞の活性を制御することにおいてＧＩＴＲに対して機能的な役割を示す（ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，上述）。別の研究によって、特異的モノクローナル抗体を用いたＧＩＴＲの刺激がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を介した抑制を廃止し、それによって、自己免疫を誘導することが確かめられた（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，上述）。これらの研究は、ＧＩＴＲがＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のより信頼のあるマーカーであるという提案へと導いた（Ｕｒａｕｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：７０８−１６）；しかしながら、ＧＩＴＲの上方制御はまたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の活性化後に発生するので、ＧＩＴＲ発現だけは、この一部の集合を専ら区別しない（ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，上述；Ｓｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，上述）。
［００１１］ＧＩＴＲはＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞に関するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制活性の制御において重要であるので、ＧＩＴＲと相互作用する新規分子を同定し特徴付けることが期待される。ＧＩＴＲと相互作用するそのような新規分子は、本明細書に開示される。加えて、これらの分子の調節因子が提供される。
発明の概要
［００１２］本発明は、ヒトＧＩＴＲＬの新規マウスホモログのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を提供する。本発明はまたマウスＧＩＴＲＬに対する抗体を提供する。本発明はまた作動性ＧＩＴＲ−ＧＩＴＲＬ結合を誘導することによる免疫抑制を逆転する、及び、例えば、ＧＩＴＲＬ活性を阻害する（例えば、ＧＩＴＲとＧＩＴＲＬとの間の相互作用を遮断する）中和抗体の使用を通じて、ＧＩＴＲ−ＧＩＴＲＬ結合を拮抗することによる免疫抑制を回復又は増強する方法の両方を提供する。そのような免疫抑制の逆転、又は回復／増強は、制御不能の免疫応答、例えば、自己免疫障害、炎症性疾患及び移植拒絶、及び癌や感染症に起因する様々な障害の治療に有益である。本発明の方法は、ＧＩＴＲＬ及びＧＩＴＲの操作に指向し、限定されないが、マウスＧＩＴＲＬ及びＧＩＴＲ及びそれらのホモログを含み；これらのホモログのうちヒトＧＩＴＲＬ及びヒトＧＩＴＲが特異的に含まれる。
［００１３］本発明は、ＧＩＴＲに関する新規なリガンド（ＧＩＴＲＬ）に関連する新規な単離し精製したポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。本発明はまたＧＩＴＲＬに対する抗体を提供し、並びに自己免疫障害、炎症性疾患、及び移植拒絶、及び癌及び感染症の治療、診断、予測及びそれらの進行の監視の方法をも提供する。本発明の一態様では、開示した方法及び分子は、自己免疫障害、炎症性疾患、及び移植拒絶、並びに癌及び感染症を含む疾患又は障害の治療中の免疫応答の結果を操作するために使用することができる。別の態様では、開示した本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、ＧＩＴＲとＧＩＴＲＬとの間の相互作用を、例えば、ＧＩＴＲＬの発現又は活性を下方制御することによって、又はＧＩＴＲＬへの結合することによって遮断し又は阻害し、しかし、ＧＩＴＲシグナルを誘導しないものであり、免疫システムの抑制を回復又は増強するために使用することができる。別の態様では、ＧＩＴＲ及びＧＩＴＲＬとの間の相互作用は、小分子によって遮断され又は阻害され得る。これらのタイプの制御（即ち、これらの態様）は、自己免疫障害及びいくつかの炎症性疾患、及び同様又は関連した障害の治療において、並びに移植拒絶の治療において最も利益となるであろうということは当業者によって賞賛されるであろう。別の態様において、例えば、ＧＩＴＲＬの発現又は活性を上方制御することによって、又はＧＩＴＲに作動的に結合することによって、ＧＩＴＲシグナルを誘導する本発明の開示したポリヌクレオチド及びポリペプチドは、免疫システムを逆転し、遮断し、又は廃止するために使用され得る。別の態様において、ＧＩＴＲ及びＧＩＴＲＬとの間の相互作用は、小分子によって増強され又は模倣され得る。これらのタイプの制御は、癌などの治療、並びに感染症の治療に最も利益となるであろうということは、当業者によって賞賛されるであろう。当業者はまた、これらの新規な療法と確立した他の療法とを組合わせることの可能な利益に気づくであろう。
［００１４］一態様において、本発明は、配列番号：１又は配列番号：３のヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子を提供する。別の態様において、核酸分子は、少なくとも１つの発現調節配列に実施可能に連結される。別の態様において、その核酸分子でトランスフォーム又はトランスフェクトした宿主細胞が提供される。
［００１５］別の態様において、本発明は、配列番号：１又は配列番号：３の単離した対立遺伝子を提供する。別の態様において、本発明は、配列番号：３のヌクレオチド配列を含む単離した遺伝子を提供する。
［００１６］別の態様において、本発明は、配列番号：１又は配列番号：３に記載されるヌクレオチド配列、又はそれに相補的な配列に高ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする単離した核酸分子を提供する。
［００１７］別の態様において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は前記タンパク質の活性な断片をコードするタンパク質の断片をコードする単離した核酸分子を提供する。別の態様において、核酸分子、又はその断片は、少なくとも１つの発現調節配列に実施可能に連結される。別の態様において、少なくとも１つの発現調節配列に実施可能に連結した、単離した核酸分子、又はその断片でトランスフォーム又はトランスフェクトした宿主細胞が提供される。別の態様において、本発明は、体細胞及び生殖細胞が単離した核酸分子、又はその断片を含有するヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。別の態様において、本発明は、体細胞及び生殖細胞が配列番号：１又は配列番号：３のヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含有するヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。
［００１８］別の態様において、配列番号：１又は配列番号：３に記載されるヌクレオチド配列、又はそれに相補体に高ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする単離した核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む単離したタンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列、又はその活性な断片を含む単離したタンパク質を提供する。
［００１９］別の態様において、本発明は、配列番号：１又は配列番号：３のヌクレオチド配列、又はその断片に相補的なヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子を提供し、ここで、細胞における核酸分子の発現はＧＩＴＲＬの産生の減少に帰着する。別の態様において、核酸分子、又はその断片は、少なくとも１つの発現調節配列に実施可能に連結される。別の態様において、少なくとも１つの発現調節配列に実施可能に連結した単離した核酸、又はその断片でトランスフォーム又はトランスフェクトした宿主細胞が提供される。別の態様において、本発明は、体細胞及び生殖細胞が単離した核酸、又はその断片を含有するヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。
［００２０］別の態様において、本発明は、配列番号：１又は配列番号：３のヌクレオチド配列、又はその断片を含む核酸分子に対応するｍＲＮＡに相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供し、ここで、オリゴヌクレオチドはＧＩＴＲＬの発現を阻害する。別の態様において、本発明は、配列番号：１又は配列番号：３のヌクレオチド配列、又はその断片を含む核酸分子に対応するｓｉＲＮＡ分子を提供し、ｓｉＲＮＡ分子がＧＩＴＲＬの発現を阻害する。
［００２１］別の態様において、本発明は、配列番号：１又は配列番号：３に記載されるヌクレオチド配列、又はそれに相補的なヌクレオチド配列に高ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする単離した核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む単離したタンパク質に特異的に結合することができる単離した抗体を提供する。別の態様において、抗体は、ＧＩＴＲＬ活性を中和する。別の態様において、抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５３６６を有する５Ｆ１、又はＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５３３７を有する１０Ｆ１２である。別の態様において、抗体は、５Ｆ１又は１０Ｆ１２の抗原結合断片を含む。別の態様において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列を含む単離したタンパク質、又はその活性な断片に特異的に結合することができる単離した抗体を提供する。別の態様において、抗体は、ＧＩＴＲＬ活性を中和する。別の態様において、抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５３３６を有する５Ｆ１、又はＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５３３７号を有する１０Ｆ１２である。別の態様において、抗体は、５Ｆ１又は１０Ｆ１２の抗原結合断片を含む。
［００２２］別の態様において、本発明は、ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用を阻害し又は遮断することができる試験化合物をスクリーニングする方法であって、ＧＩＴＲＬ及びＧＩＴＲを含有する試料を試験化合物と接触させ、そして、試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用が化合物と接触していない試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用と比較して減少するかどうかを決定する工程を含み、それによって、化合物で接触した試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用の減少がＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用を阻害し又は遮断するものとして化合物を同定する前記方法に関する。別の態様において、同定した化合物は、自己免疫障害、炎症性疾患、又は移植拒絶の危険にある患者又はそれと診断された患者を治療する方法、患者からＴ細胞を単離し、同定した化合物で単離したＴ細胞を処置し、そして、処理したＴ細胞を患者に移動し戻す工程を含む方法に使用される。別の態様において、同定した化合物は、自己免疫障害、炎症性疾患、又は移植拒絶の危険にある患者又はそれと診断された患者を治療する方法、同定した化合物を患者に投与することを含む方法に使用される。別の態様において、本発明は、化合物を患者に投与する前に患者からのエフェクターＴ細胞の第一の数を検出し、化合物を患者に投与した後に患者からのエフェクターＴ細胞の第二の数を検出し、そして、第一の数と第二の数とを比較する工程を含む、患者における同定した化合物の効力をアッセイする方法を提供し、それによって、第一の数と比較した場合、第二の数におけるエフェクターＴ細胞の数の減少は、化合物が患者における自己免疫障害、炎症性疾患、又は移植拒絶を治療する方法に効果的であることを示す。別の態様において、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
［００２３］別の態様において、本発明は、ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用を増強し又は模倣することができる試験化合物をスクリーニングする方法であって、ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとを含有する試料を試験化合物で接触し、そして、試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲＬとの相互作用が、化合物で接触していない試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用と比較して増加しているかどうかを決定する工程を含む方法を提供し、それによって、化合物で接触した試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用の増加は、ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用を増加させ又は模倣するものとしての化合物を同定する。別の態様において、同定した化合物は、癌又は感染症の危険にある患者又はそれと診断された患者を治療する方法であって、患者からＴ細胞を単離し、単離したＴ細胞を同定した化合物で処理し、そして、処理したＴ細胞を患者に移して戻す工程を含む前記方法を提供する。別の態様において、同定した化合物は、癌又は炎症性疾患の危険にある患者又はそれと診断された患者を治療する方法に使用され、該方法は同定した化合物を患者に投与することを含む。別の態様において、本発明は、患者における同定した化合物の効率を評価する方法であって、患者に化合物を投与する前に患者からエフェクターＴ細胞の第一の数を検定し、患者に化合物を投与した後に患者からエフェクターＴ細胞の第二の数を検定し、そして、第一の数と第二の数とを比較する工程を含み、それによて、第一の化合物と比較した場合、第二の数におけるエフェクターＴ細胞の数の有意な増加は、化合物が患者における癌又は感染症の治療に有効であることを示す前記方法を提供する。別の態様において、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
［００２４］別の態様において、本発明は、患者における自己免疫障害、炎症性疾患、又は移植拒絶を診断する方法であって、患者からの試料中のＧＩＴＲＬ遺伝子産物の試験量を検出し、そして、試験量と対照試料中のＧＩＴＲＬの正常量とを比較することを含む前記方法を提供し、それによって、正常な量をはるかに超えた試験量は、自己免疫障害、炎症性疾患、又は移植拒絶の診断における陽性の指標を提供する。別の態様において、本発明は、患者における癌又は感染症を診断する方法であって、患者からの試料量中のＧＩＴＲＬ遺伝子産物の試験量を検出し、そして、試験量と対照試料中のＧＩＴＲＬ遺伝子産物の正常量とを比較する工程を含む前記方法を提供し、正常量をはるかに下回る試験量は、癌又は感染症の診断に陽性の指標を提供する。
［００２５］別の態様において、本発明は、患者にＧＩＴＲアンタゴニストを投与することを含む、自己免疫障害、炎症性疾患、又は移植拒絶の危険にある患者又はそれと診断された患者を治療する方法を提供する。別の態様において、該方法は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制に対する患者におけるエフェクターＴ細胞の感受性を維持するように（例えば、そのような感受性を維持するための有効な量で）、ＧＩＴＲアンタゴニストを投与することを含む。別の態様において、ＧＩＴＲアンタゴニストは、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体、中和抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲ含有融合タンパク質、ＧＩＴＲの活性な断片を含有する融合タンパク質、拮抗性小分子、アンチセンスＧＩＴＲＬ核酸分子、及びｓｉＲＮＡ ＧＩＴＲＬ核酸分子から成る群から選択される。別の態様において、自己免疫障害又は炎症性疾患は、慢性関節リウマチ、脳脊髄炎、骨関節炎、多発性硬化症、自己免疫胃炎、全身性紅斑性狼瘡、乾癬及び他の感染性皮膚病、Ｉ型糖尿病、喘息、アレルギー、並びにクローン病及び潰瘍性大腸炎を含む感染性腸疾患から成る群から選択される。
［００２６］別の態様において、本発明は、癌又は感染症の危険にある患者又はそれと診断された患者を治療する方法であって、ＧＩＴＲアゴニストを患者に投与することを含む前記方法を提供する。別の態様において、該方法は、ＧＩＴＲアゴニストが患者におけるエフェクターＴ細胞に同時刺激性シグナルを提供し、そして、患者においてＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制にエフェクターＴ細胞をより少ない感受性とするように（例えば、そのようなシグナルを提供する有効量で）ＧＩＴＲアゴニストを投与することを含む。別の態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、そして、作動性ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される。
［００２７］別の態様において、本発明は、エフェクターＴ細胞を含有する細胞群の増殖を誘導する方法であって、細胞群にＧＩＲＴアゴニストを投与することを含む前記方法を提供する。別の態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、及び作動性ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される。別の態様において、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
［００２８］別の態様において、本発明は、エフェクターＴ細胞を含有する細胞群の増殖を阻害する方法であって、細胞群にＧＩＴＲアンタゴニストを投与することを含む前記方法を提供する。別の態様において、ＧＩＴＲアンタゴニストは、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体、中和抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲの活性な断片を含有する融合タンパク質、拮抗性小分子、アンチセンスＧＩＴＲＬ核酸分子、及びｓｉＲＮＡ ＧＩＴＲＬ核酸分子から成る群から選択される。別の態様において、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の態様において、ＧＩＴＲアンタゴニストは、５Ｆ１又は１０Ｆ１２である。
［００２９］別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の存在下でエフェクターＴ細胞を含む細胞群の抑制を阻害又は遮断する方法であって、細胞群にＧＩＴＲアゴニストを投与することを含む前記方法を提供する。別の態様において、該方法は、ＧＩＴＲアゴニストがエフェクターＴ細胞に同時刺激性シグナルを提供し、そして、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制により少ない感受性とする（例えば、そのようなシグナルを提供する有効量で）ようにＧＩＴＲアゴニストを投与することを含む。別の態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、及び作動性ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される。別の態様において、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
［００３０］別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の存在下でエフェクターＴ細胞を含む細胞群を抑制する方法であって、該細胞群にＧＩＴＲアンタゴニストを投与することを含む前記方法を提供する。別の態様において、該方法は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制にエフェクターＴ細胞の感受性を維持する（例えば、そのような感受性を維持するのに有効な量で）ようにＧＩＴＲアンタゴニストを投与することを含む。別の態様において、ＧＩＴＲアンタゴニストは、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体、中和抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲの活性な断片を含有する融合タンパク質、拮抗性小分子、アンチセンスＧＩＴＲＬ核酸分子、及びｓｉＲＮＡ ＧＩＴＲＬ核酸分子から成る群から選択される。別の態様において、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ４＋細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の態様において、ＧＩＴＲアンタゴニストは５Ｆ１又は１０Ｆ１２である。
［００３１］別の態様において、本発明は、配列番号：１又は配列番号：３の核酸配列、又はそれらの断片に相補的なヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子で細胞群を処置することを含み、ここで、細胞における核酸分子の発現がＧＩＴＲＬの産生の減少に帰着する、細胞群におけるＧＩＴＲＬの発現を阻害する方法を提供する。別の態様において、本発明は、配列番号：１又は配列番号：３のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又はそれらの断片に対応するｍＲＮＡに相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドで細胞群を処置することを含み、ここで、オリゴヌクレオチドがＧＩＴＲＬの発現を阻害する、細胞群におけるＧＩＴＲＬの発現を阻害する方法を提供する。
［００３２］別の態様において、本発明は、細胞群におけるＧＩＴＲＬの発現を阻害する方法であって、配列番号：１又は配列番号：３のヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子に対応するｍＲＮＡに標的とされるｓｉＲＮＡ分子で細胞群を処置することを含む、前記方法を提供する。別の態様において、本発明は、細胞群におけるＧＩＴＲＬの発現を阻害する方法であって、配列番号：１又は配列番号：３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子に対応するｍＲＮＡに標的とされるｓｉＲＮＡで細胞群を処置することを含む前記方法を提供する。
［００３３］別の態様において、本発明は、細胞群におけるＧＩＴＲＬの発現を阻害する方法であって、ＧＩＴＲＬをコードする核酸分子にアンチセンス・オリゴヌクレオチドで細胞群を処置することを含む前記方法を提供する。別の態様において、本発明は、細胞群におけるＧＩＴＲＬの発現を阻害する方法であって、ＧＩＴＲＬをコードするｍＲＮＡに標的とされるｓｉＲＮＡ分子で細胞群を処置することを含む前記方法を提供する。
［００３４］別の態様において、本発明は、細胞群におけるＧＩＴＲＬの発現を阻害する方法であって、配列番号：１又は配列番号：３のヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子、配列番号：２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする単離した核酸分子又は該タンパク質の活性な断片をコードするその断片で細胞群をトランスフォーム又はトランスフェクトすることによって細胞群を処置することを含み、ここで、核酸分子が少なくとも１つの発現調節配列に実施可能に連結している前記方法を提供する。
［００３５］別の態様において、本発明は、インビトロ又はエクスビボでＧＩＴＲアゴニストと接触しているエフェクターＴ細胞群を提供する。別の態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲＬ、又はＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、作動性小分子、及び作動性抗ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される。別の態様において、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ４＋細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
［００３６］別の態様において、本発明は、患者における癌又は感染症を治療する方法であって、エフェクタ−Ｔ細胞群を得る工程、ＧＩＴＲアゴニストで該群を処置する工程、そして、癌又は感染症で悩まされている患者に処置した群を投与する工程を含む前記方法を提供する。別の態様において、ＧＩＴＲはアゴニストは、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、作動性小分子、及び作動性抗ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される。別の態様において、患者は、癌に悩まされ、そして、処置した群は腫瘍ワクチンとして使用される。
［００３７］別の態様において、本発明は、ＧＩＴＲアゴニスト及び薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、作動性小分子、及び作動性抗ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される。
［００３８］別の態様において、本発明は、ＧＩＴＲアンタゴニスト及び薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の態様において、ＧＩＴＲアンタゴニストは、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体、中和抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲを含有する融合タンパク質、ＧＩＲＴの活性な断片を含有する融合タンパク質、拮抗性小分子、アンチセンスＧＩＴＲＬ核酸分子、及びｓｉＲＮＡ ＧＩＴＲＬ核酸分子から成る群から選択される。別の態様において、抗体は、５Ｆ１又は１０Ｆ１２の抗原結合断片を含む。
［００３９］別の態様において、本発明は、ＧＩＴＲアゴニスト、及び、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、癌抗原、腫瘍関連抗原、及びそれらの断片から成る群より選択される抗原を含むワクチンアジュバントを提供する。別の態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲＬ、又はＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、作動性小分子、及び作動性抗ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される。
［００４０］別の態様において、本発明は、ＧＩＴＲアンタゴニスト、及び、自己抗原、アミロイドペプチドタンパク質、アロ抗原、移植抗原、アレルゲン、及びそれらの断片から成る群から選択される抗原を含むワクチンアジュバントを提供する。別の態様において、ＧＩＴＲアンタゴニストは、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体、中和抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲの活性な断片を含有する融合タンパク質、拮抗性小分子、アンチセンスＧＩＴＲＬ核酸分子、及びｓｉＲＮＡ ＧＩＴＲＬ核酸分子から成る群から選択される。別の態様において、抗体は、５Ｆ１又は１０Ｆ１２の抗原結合断片を含む。
［００４１］別の態様において、本発明は、ＧＩＴＲＬ活性を中和することができる試験化合物をスクリーニングする方法であって、ＧＩＴＲＬ及び中和抗体を含有する試料化合物で接触させる工程、及びＧＩＴＲＬと試料中の中和抗体との相互作用が、ＧＩＴＲＬと化合物で接触していない試料中の中和抗体との相互作用と比較した場合に減少するかどうかを決定する工程を含み、ＧＩＴＲＬと化合物で接触した試料中の中和抗体との相互作用の減少が、ＧＩＴＲＬと中和抗体との相互作用を阻害又は遮断するものとして化合物を同定する前記方法を提供する。別の態様において、抗体は５Ｆ１又は１０Ｆ１２である。
［００４２］別の態様において、本発明は、エフェクターＴ細胞を含む細胞群に同時刺激性シグナルを提供する方法であって、ＧＩＴＲアゴニストを投与することを含む前記方法を提供する。別の態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲＬ、又はＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲの活性な断片を含有する融合タンパク質、及び作動性抗ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択されるタンパク質である。別の態様において、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ４＋細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
［００４３］図１は、マウス（ｍ）とヒト（ｈ）のＧＩＴＲＬに対するアミノ酸配列の整列（ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックスに基づく；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１９を参照）を示す。 ［００４４］図２は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のＧＩＴＲＬ：ＧＩＴＲ結合の効果についての実験結果を示す。チミジン取り込みを細胞増殖を評価する手段として測定する（ＣＰＭ）。図２Ａは、作動性抗ＧＩＴＲ抗体がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を刺激するが、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を刺激しないことを示す。図２Ｂは、ＧＩＴＲＬを発現しているＹＢ２／０細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の増殖を刺激することを示す。 ［００４５］図３Ａは、ＹＢ２／０細胞（〜５０，０００）によって発現したＧＩＴＲＬ、並びに作動性抗ＧＩＴＲ抗体（２μｇ／ｍｌ）が新たに単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋サプレッサーＴ細胞（＃サプレッサー）によって産生される抑制（即ち、負の％抑制）を逆転した。図３Ｂは、５０，０００より少ない（即ち、〜３，０００〜２５，０００）数のＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞は投与量に依存して部分的に抑制を逆転することができたことを示す。 ［００４６］図４は、活性化したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を新たに単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の代わりに使用した場合、ＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞（〜５０，０００）は抑制を逆転しなかったことを示す；同様の結果が作動性抗ＧＩＴＲ抗体を用いて得られた。 ［００４７］図５Ａ及び５Ｂは、新たに単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって産生される抑制のＧＩＴＲＬ誘導の逆転はそれ自身、抗ＧＩＴＲＬ抗体（「抗ＧＩＴＲＬ」＝５Ｆ１抗体）の存在下で逆転（即ち、抑制の回復）することができたことを示す。図５Ｂは、対照抗体（「対照Ｉｇ」）は抑制を回復しなかったことを示す追加実験を含む。 ［００４８］図６は、抗ＧＩＴＲＬ抗体がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在下で抑制を増強だけすることができることを示す。図６Ａは、抗ＧＩＴＲＬ抗体（５Ｆ１）の存在下でリンパ節細胞の増殖の抑制を示す。図６Ｂは、リンパ節細胞群がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇にした場合に、抗ＧＩＴＲＬ抗体の抑制活性の欠如を示す。 ［００４９］図７は、リンパ組織の細胞に発現しているＧＩＴＲＬの分布を示す。図７Ａ：磁気ビーズでＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から濃縮したＣＤ１１＋ｃ細胞について、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、及び抗ＧＩＴＲＬ抗体で染色することによって、フローサイトメトリー解析を実行した。ＧＩＴＲＬ発現は、抗ＧＩＴＲＬ抗体で染色したＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＣＤ４−ＣＤ８＋をゲートにした一群の蛍光強度（塗りつぶしたヒストグラム）と、アイソタイプの対照抗体で染色したこれらの細胞の蛍光強度（塗りつぶしていないヒストグラム）とを比較することによって決定した。図７Ｂ：脾臓の樹状突起細胞及びＢ−１ Ｂ細胞によるＧＩＴＲＬの発現は、新たに単離したＢＡＬＢ／ｃ ＣＤ１１ｃ＋脾臓ＤＣ（上段のヒストグラムパネル）及びＣＤ１１ｃｌｏｗＢ２２０＋形質細胞ＤＣ（下段ヒストグラムパネル）を抗ＧＩＴＲＬ ｍＡｂ（塗りつぶしたヒストグラム）又はアイソタイプの対照抗体（塗りつぶしていないヒストグラム）で染色し、フローサイトメトリー解析を実行することによって決定した。図７Ｃ（上段のヒストグラムパネル）：抗ＧＩＴＲＬ抗体で染色した、全脾臓細胞中のＢ２２０＋ Ｂ細胞の蛍光強度（塗りつぶしたヒストグラム）、及びＣＤ１１ｂ＋Ｂ２２０＋をゲートした腹膜（ｐｅｒＣ）Ｂ−１ Ｂ細胞の蛍光強度（実線の塗りつぶしていないヒストグラム）をアイソタイプの対照で染色した細胞の蛍光強度（破線の塗りつぶしていないヒストグラム）と比較した。図７Ｃ（下段のヒストグラムパネル）：ＧＩＴＲＬ抗体で染色した（塗りつぶしたヒストグラム）及びアイソタイプ抗体で染色した（塗りつぶしていないヒストグラム）ｐｅｒＣマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋Ｂ２２０−細胞）の比較を示す。図７Ｄ：胸腺細胞をＣＤ４、ＣＤ８、及びＧＩＴＲＬ又はアイソタイプ対照のいずれかの発現について染色した。抗ＧＩＴＲＬ抗体で染色した、ＣＤ４＋ＣＤ８−（上段左４分の１）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（上段右４分の１）、及びＣＤ４−ＣＤ８＋（下段右４分の１）細胞の蛍光強度（塗りつぶしたヒストグラム）を、アイソタイプの対照抗体で染色したこれらの細胞の蛍光強度（塗りつぶしていないヒストグラム）と比較した。図７Ｅ：ゲートとしたＣＤ４４＋ＣＤ２５−（Ｒ１）、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋（Ｒ２）、ＣＤ４４−ＣＤ２５＋（Ｒ３）又はＣＤ４４−ＣＤ２５−（Ｒ４）胸腺前駆体によるＧＩＴＲＬの発現を、抗ＧＩＴＲＬ抗体で染色したこれらの細胞の蛍光（塗りつぶしたヒストグラム）とアイソタイプの対照抗体で染色したこれらの細胞の蛍光（塗りつぶしていないヒストグラム）を比較することによって決定した。図７Ｆ：刺激していないリンパ節細胞は、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２５抗体、及び／又は抗ＧＩＴＲＬ抗体で染色した。ＣＤ４＋ＣＤ８−（上段左４分の１）、及びＣＤ４−ＣＤ８＋でない（下段右４分の１）は、さらにこれらの細胞によってＣＤ２５の発現に関して描写した。ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２５−（上段右ヒストグラムパネル）、ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２５＋（下側右ヒストグラムパネル）又はＣＤ４−ＣＤ８＋（下段（中央）ヒストグラムパネル）でゲートしたリンパ節細胞によるＧＩＴＲＬの発現は、抗ＧＩＴＲＬ抗体で染色したこれらの細胞の蛍光強度（塗りつぶされたヒストグラム）とアイソタイプの対照抗体で染色したこれらの細胞の蛍光強度（塗りつぶされていないヒストグラム）とを比較することによって決定した。結果は、５つの独立の実験によって示される。 ［００５０］図８は、刺激後のＧＩＴＲＬのＡＰＣによる下方制御を示す。図８Ａ：精製した脾臓Ｂ２２０＋Ｂ細胞又は全腹膜（ＰｅｒＣ）Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｂ＋Ｂ−１ Ｂ細胞によるＧＩＴＲＬの発現がポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）、ＣｐＧｓ（ＯＤＮ１８２６、１μＭ）、抗ＣＤ４０及びＩＬ−４（それぞれ、１０μｇ／ｍｌ及び２０ｎｇ／ｍｌ）、及び抗ＩｇＭ（ヤギ抗ＩｇＭμ鎖のＦ（ａｂ’）２断片、１μｇ／ｍｌ）で処理後の異なる時間点について決定した。抗ＧＩＴＲＬ染色刺激細胞（塗りつぶされたヒストグラム）、抗ＧＩＴＲＬ染色無刺激（中間）細胞（実線塗りつぶしていないヒストグラム）及びアイソタイプの対照抗体染色差異号（破線塗りつぶしていないヒストグラム）の蛍光強度を示す。図８Ｂ：４８時間の培養時間後の抗ＣＤ３ｍＡｂ（０．５μｇ／ｍｌ）で処理した全脾臓細胞中に存在するＢ２２０＋Ｂ細胞によるＧＩＴＲＬの発現は、無刺激のＢ２２０＋Ｂ細胞（実線塗りつぶしていないヒストグラム）とアイソタイプの対照抗体で染色したＢ２２０＋Ｂ細胞（破線塗りつぶしていないヒストグラム）によるＧＩＴＲＬの発現と比較した。図８Ｃ：指定した時間点でＬＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）と一緒にして又は一緒にしないで培養した後の精製したＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓによるＧＩＴＲＬ（上段のヒストグラムパネル）及びＢ７．２（即ち、ＣＤ８６）（下段のヒストグラムパネル）の発現。図８Ｄ：可溶性の抗ＣＤ３ｍＡｂ（０．５μｇ／ｍｌ）の不在又は存在下で４８時間の培養時間後のＣＤ４＋又はＣＤ８＋発現細胞にゲートした全脾臓細胞によるＧＩＴＲＬ発現。グラフは、２ないし４の独立した実験を代表する；全実験は、ＢＡＬＢ／ｃマウスから単離した組織を用いて実行した。 ［００５１］図９は、リンパ細胞増殖の阻害におけるＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ相互作用の遮断の効果を示す。図９Ａ及び図９Ｂについては、バーはｓ．ｄ．値を示す。図９Ａ：ＣＤ２５＋細胞（それぞれ、全体又はΔ２５）と一緒に又は一緒にしないでリンパ節細胞（ＬＮ；１×１０５）及び脾臓細胞（Ｓｐ；０．５×１０５）の増殖（ｙ軸）は、可溶性抗ＣＤ３の様々な濃度（ｘ軸）で７２時間培養後に決定した。細胞を精製した抗ＧＩＴＲＬ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ；黒丸）又はＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌ；白丸）のいずれかの存在下でインキュベートした。結果は、３つの独立した実験を代表する。図９Ｂ：ＣＤ４＋ＣＤ２５−又はＣＤ８＋Ｔ細胞は、５×１０４の照射した（３０００Ｒ）Ｔ枯渇ＡＰＣ及び５×１０４の照射した（８０００Ｒ）ＹＢ２／０−ＧＩＴＲＬ（白丸）又は対照ＹＢ２／０（黒丸）細胞の存在下で培養した。培養物は、様々な濃度の可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂ（ｘ軸）で活性化し、そして、増殖（ｙ軸）は、７２時間の培養時間後に測定した。図９Ｃ：抗ＧＩＴＲ抗体で染色した精製ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の平均の蛍光（ｘ軸）は、照射した（３０００Ｒ）Ｔ枯渇脾臓細胞の存在下で可溶性ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）での活性化後の様々な時間点で決定した。結果は、少なくとも２つの独立した実験で示した。 ［００５２］図１０は、ＣＤ２５−Ｔ細胞によるＧＩＴＲ発現が抑制の復帰を要求することを示す。図１０Ａ：野生型マウス由来の照射したＡＰＣ（５×１０４）及び可溶性抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）と２μｇ／ｍｌの抗ＧＩＴＲ抗体（黒丸）又はアイソタイプの対照抗体（白丸）でインキュベートした異なるノックアウトマウス［（Ａａ）ＣＤ４＋ＣＤ２５−：ＧＩＴＲ＋／＋，ＣＤ４＋ＣＤ２５＋：ＧＩＴＲ＋／＋；（Ａｂ）ＣＤ４＋ＣＤ２５−：ＧＩＴＲ＋／＋，ＣＤ４＋ＣＤ２５＋：ＧＩＴＲ−／−；（Ａｃ）ＣＤ４＋ＣＤ２５−：ＧＩＴＲ−／−，ＣＤ４＋ＣＤ２５＋：ＧＩＴＲ＋／＋，及び（Ａｄ）ＣＤ４＋ＣＤ２５−：ＧＩＴＲ−／−，ＣＤ４＋ＣＤ２５＋：ＧＩＴＲ−／−］由来のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（５×１０４）と異なるノックアウトマウス由来の様々な数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｘ軸）との同時培養物の増殖は、３Ｈ−チミジン取り込み（ｃｐｍ；ｙ軸）を測定することにｙって決定した。図１０Ｂ：同時培養物の増殖は、照射した（３０００Ｒ）のラットＡＰＣの存在下で、様々な数のマウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ｘ軸）と（Ｂａ）マウスＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞又は（Ｂｂ）ラットＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のいずれかで上述したように（図１０Ａ）実行した。培養物は、ラット及びマウスの抗ＣＤ３（各０．２５μｇ／ｍｌ）の両方に対する抗体のカクテルを用いて刺激し、２μｇ／ｍｌのアイソタイプの対照抗体（ラットＩｇＧ；白丸）又は抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１；黒丸）のいずれかで処理した。バーは、三重の培養における増殖から計算したｓ．ｄ．値を示す。図１０Ｃ：アイソタイプの対照抗体（ラットＩｇＧ；左パネル）又は抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１；右パネル）を用いて１：８のサプレッサーとレスポンダーの比で同時培養したＣＦＳＥ染色したマウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（上段パネル）及びラットＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（下段パネル）を描写した。マウス及びラットのＴ細胞の一群は、特異的な抗ＣＤ４抗体で染色することによって区別した。結果は、２ないし４の独立した実験を代表する。 ［００５３］図１１は、ＧＩＴＲシグナルが内因性の制御性Ｔ細胞によって仲介される抑制を克服することを要求することを示す。図１１Ａ：Ｂ６（野生型）、ＧＩＴＲ＋／−、ＣＤ２８−／−及びＧＩＴＲ−／−マウス由来のＣＦＳＥ標識したリンパ節（ＬＮ）細胞（５×１０４）を異なる濃度の可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂ（ｘ軸）で７２時間培養した。全ＬＮ細胞は、外因性のＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）なしに（Ａｓ）又はとともに培養した。ｓ．ｄ．値を示すバーは、明瞭性のために削除した。図１１Ｂ：ＣＤ２８−／−、ＧＩＴＲ−／−、ＧＩＴＲ＋／＋又はＧＩＴＲ＋／−動物から単離したＣＤ４＋及びＣＤ８＋をゲートとしたリンパ節Ｔ細胞のフローサイトメトリー評価を培養７２時間後に実行した。結果は、可溶性抗ＣＤ３の０．６３μｇ／ｍｌ濃度に対応している（図１１Ａに示す通り）。図１１Ｃ：ＣＤ２５発現のフローサイトメトリー解析は、無刺激のままの（破線塗りつぶされていないヒストグラム）、ＧＩＴＲ−／−マウスから得た（実線塗りつぶされていないヒストグラム）、及びＧＩＴＲ＋／＋マウスから得た（塗りつぶされたヒストグラム）Ｈ−２Ｄｂ陽性ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞について実行した。ＧＩＴＲ−／−又はＧＩＴＲ＋／＋マウスから得たＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞によるＣＤ２５発現は、抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で、１：２のサプレッサーとレスポンダーの比でＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の不存在（左ヒストグラムパネル）又は存在（右ヒストグラムパネル）下で、野生型マウスのＬＮ ＡＰＣとともに２４時間培養後に決定した。ＣＤ２５発現はまた、５０Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２の不存在（上段ヒストグラムパネル）又は存在（下段ヒストグラムパネル）下で決定した。上記の結果は、３つの独立した実験の代表である。 ［００５４］図１２は、ＣＤ２８依存性同時刺激がＧＩＴＲ発現と反応性を増強することを示す。図１２Ａ：プレートに結合した抗ＣＤ３、及び２μｇ／ｍｌのプレートに結合したハムスターアイソタイプ（「ａＣＤ３」）又はプレートに結合した抗ＣＤ２８（「ａＣＤ３＋ａＣＤ２８」）のいずれかで７２時間培養後に精製したＣＤ４＋ＣＤ２５−又はＣＤ８＋Ｔ細胞（２．５×１０４）によるＧＩＴＲ発現のフローサイトメトリー解析。図１２Ｂ（左ヒストグラムパネル）：抗ＣＤ８０／８６（各１０μｇ／ｍｌ）抗体（即ち、抗Ｂ７．１／７．２抗体）のカクテルと一緒に又は一緒にしないで照射したＴ細胞枯渇脾臓細胞及び可溶性抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で７２時間培養したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の抗ＧＩＴＲ染色。図１２Ｂ（右ヒストグラムパネル）：ＩＬ−２及びＩＬ−２Ｒαに対する抗体のカクテルと一緒に又は一緒にしないで照射したＴ細胞枯渇脾臓細胞及び可溶性抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で７２時間培養したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の抗ＧＩＴＲ染色。図１２Ｃ：抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ（２μｇ／ｍｌ；「ＤＴＡ−１」）又はアイソタイプの対照抗体（２μｇ／ｍｌ；「ラットＩｇＧ」）のいずれかを加えて、抗ＣＤ８０／８６ ｍＡｂ（各１０μｇ／ｍｌ；「ａＢ７」）の存在下又は不存在下で評価した。バーは、ｓ．ｄ．値を示す。結果は、２ないし３の独立した実験の代表である。 ［００５５］図１３は、ＧＩＴＲに結合するＧＩＴＲＬがエフェクターＴ細胞への同時刺激性シグナルを提供することを示す。図１３Ａ：エフェクターＧＩＴＲ＋／ＴＣＲ＋ＨＴ−２Ｔ細胞（４×１０４）単独（白色バー）の増殖、又は１×１０４の対照ＹＢ２／０細胞（網目バー）若しくはＧＩＴＲＬ発現ＹＢ２／０細胞（塗りつぶされたバー）との同時培養における増殖は、ＨＴ−２細胞当たり１又は２の抗ＣＤ３ビーズの不存在又は存在下で、３Ｈ−チミジンの取り込み（ｃｐｍ；ｙ軸）を測定することによって決定した。図１３Ｂ：細胞当たり２つの抗ＣＤ３ビーズと同時培養した４×１０４のＨＴ−２細胞の増殖、及び１×１０４のＧＩＴＲＬ発現ＹＢ２／０細胞、及び抗ＧＩＴＲＬ抗体（５Ｆ１．１；黒丸）又はアイソタイプの対照抗体（ｒＩｇＧ１；白丸）の濃度増加（ｎｇ／ｍｌ；ｘ軸）は、３Ｈ−チミジンの取り込み（ｃｐｍ；ｙ軸）を測定することによって決定した。図１３Ｃ：細胞当たり２つの抗ＣＤ３ビーズと同時培養した４×１０４のＨＴ−２細胞の増殖、及び１×１０４のＧＩＴＲＬ発現ＹＢ２／０細胞、及び４つの異なる抗ＧＩＴＲＬ抗体：５Ｆ１．１（黒丸）、ＭＧＬＴ−１０（黒四角）、ＭＧＴＬ−１５（白四角）又はポリクローナル抗体（白丸）の濃度増加は、３Ｈ−チミジンの取り込み（ｃｐｍ；ｙ軸）を測定することによって決定した。 ［００５６］図１４は、抗ＧＩＴＲＬ抗体と結合するＧＩＴＲ−ＧＩＴＲＬを遮断することが、ＰＬＰ誘導の実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の養子転移を妨げることを示す。マウスにおけるＥＡＥの発症率を評価した。１５０μｇのＰＬＰペプチドで免疫し、そして、３つの異なる条件：１０μｇ／ｍｌのＰＬＰ単独（白丸）、１０μｇ／ｍｌのＰＬＰと１０μｇ／ｍｌのアイソタイプの対照抗体（ＣＫＯ１；黒丸）、又は１０μｇ／ｍｌのＰＬＰと抗ＧＩＴＲＬ抗体（５Ｆ１．１；黒四角）で３日間、エクスビボで再刺激したメスのＳＬＪマウスから単離した５×１０６の脾臓細胞をマウスに注入した。ＥＡＥの発症率は、５２日間（ｘ軸）モニターし、０ないし５のスケールでスコアをとった（ｙ軸）。
発明の詳細な説明
［００５７］抑制活性の逆転を産むＧＩＴＲに対する抗体は作動性シグナルを産生するようなので、ＧＩＴＲＬによるＧＩＴＲの積極的な関与はまた、制御性Ｔ細胞の抑制活性を阻害することもできるであろうことは予測された。適切な試薬の欠如は、以前、より生理学的条件下でＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬの詳細な機能的解析を予測していた。ここで、ＧＩＴＲＬのマウスオルソログは同定され、そして、ＧＩＴＲＬのマウスオルソログに特異的に結合する拮抗性抗体は、即ち、ヒトＧＩＴＲＬと交差反応せずに生じた。
［００５８］この試薬を用いて、ＧＩＴＲＬの組織分布と制御を調べた。加えて、Ｔ細胞の抑制を制御するＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ相互作用の能力をＧＩＴＲ−／−マウスを用いて調査した。ＣＤ２５−及びＣＤ２５＋Ｔ細胞の両方はＧＩＴＲを発現するため、程度が変化するにもかかわらず、作動性抗ＧＩＴＲ抗体で同時培養物の処理に応じてサプレッサー機能の阻害を示す以前の研究は、ＧＩＴＲの関与の細胞標的に関するはっきりしない結果を生んだ。ここで、同時培養試験における野生型及びＧＩＴＲ−／−マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の組み合わせを用いて、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋サプレッサーＴ細胞ではなく、ＣＤ４＋ＣＤ２５−レスポンダーにおけるＧＩＴＲの連結は抑制を廃止することを要求することが見出された。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の不存在で、ＧＩＴＲ−／−Ｔ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生理学的な数の存在下で全体として抑制されるが、ＧＩＴＲ−／−Ｔ細胞は野生型動物に類似した増殖応答を実行した。これらの結果は、第一に、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ関与が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の阻害効果に耐性のエフェクターＴ細胞にする、以前には定義されていないシグナルを提供することを示唆する。つまり、第二の感染性シグナルに続くＧＩＴＲＬ発現の下方制御が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋を介した抑制を促進し、激しいエフェクター細胞応答の有害な結果を妨げるかもしれない。
［００５９］本研究は、ＧＩＴＲとそのリガンド、ＧＩＴＲＬとの相互作用を裏打ちするメカニズム、特にＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（抑制活性の標的となると伝統的に理解されている）における効果に関するメカニズムに新しい光を射している。まとめると、ＧＩＴＲ−／−マウスを用いて、抑制を廃止する抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ（ＧＩＴＲに対する作動性マウス抗体）の容量は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞ではなく、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞への作用によって仲介されるように示された（以前にいくつかの研究によって提案されている）。ＡＰＣ（抗原提示細胞）は構築的にＧＩＴＲＬを発現し、続くトール用の受容体シグナルを下方制御している。ＧＩＴＲ−／−マウスＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は増殖応答を蓄積することができるが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の生理学的な数の存在下では増殖することができない。このように、ＧＩＴＲＬは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞に対して重要なシグナルを提供し、他のエフェクター細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、免疫応答の初期にＣＤ４＋ＣＤ２５＋を介した制御に耐性にする。炎症刺激によるＧＩＴＲＬの下方制御は、例えば、癌又は感染性損傷の過程でのサプレッサー活性に対するエフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞）の感受性を増強するかもしれない。
［００６０］この目的のために、本発明は、ヒトＧＩＴＲＬの新規なマウスホモログのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を提供する。ヒトＧＩＴＲＬは同定されている（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：６０５６−６１；Ｇｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９：２１５−１８）；加えて、ごく最近、いくつかのグループは、マウスＧＩＴＲリガンドのクローニングを報告した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
［００６１］一側面において、本発明は、ヒトＧＩＴＲＬの新規なマウスホモログのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列、そして、その活性な断片及び／又は融合タンパク質を提供する。本発明のＧＩＴＲＬポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲＬの発現を修飾するポリヌクレオチド、例えば、ＧＩＴＲＬの発現を上方制御できるＧＩＴＲＬポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／又はＧＩＴＲＬの発現を下方制御するアンチセンス及び／又はＲＮＡｉ ＧＩＴＲＬポリヌクレオチドを含む。細胞及び／又は動物におけるＧＩＴＲＬの発現を調節するそのようなポリヌクレオチドの使用はまた提供される。ＧＩＴＲＬポリペプチドに加えて、本発明はまた、他のアゴニストポリペプチド、例えば、ＧＩＴＲＬの活性な断片及び／又はＧＩＴＲＬを模倣することができ、即ち、エフェクターＴ細胞におけるＧＩＴＲ活性を含むＧＩＴＲＬ融合タンパク質を提供する。ＧＩＴＲＬポリヌクレオチドを含有するトランスフォームした宿主細胞及びトランスジェニック動物もまた本発明の範囲内である。
［００６２］別の側面において、本発明の新規なマウスＧＩＴＲＬポリペプチドに特異的に結合する（即ち、ヒトＧＩＴＲＬに結合しない）抗体が提供される。具体的には、ＧＩＴＲＬの活性を阻害する中和抗体（例えば、ＧＩＴＲの結合からＧＩＴＲＬを妨げる抗体）は提供される；これらの抗体は、ＧＩＴＲＬの活性を中和する（即ち、ＧＩＴＲＬを不効果にする）と言うことができる。本発明の中和抗体は、ＧＩＴＲＬ活性を阻害するＧＩＴＲＬに対する非ヒト及びヒト抗体、並びにＧＩＴＲＬ活性を阻害する本発明の非ヒト抗体のキメラ化及び／又はヒト化バージョンを含む。抗体の半減期、安定性又はアフィニティーを増加するように機能でき、又は抗体のエフェクター機能を修飾するように機能できる１以上の突然変異を有することができる拮抗性抗体もまた本発明の範囲内に含まれる。
［００６３］本発明の別の側面は、ＧＩＴＲＬポリヌクレオチド及びポリペプチドは、それらのヒトホモログを含むが限定されず、細胞、器官又は被験体のＧＩＴＲの活性を調節することができる化合物を同定するために使用されるスクリーニングアッセイを提供する。本発明はまた、同定した化合物の効果を評価する方法を提供し、それにより、患者におけるＴ細胞の数を、同定した化合物の投与前後に決定する。加えて、本発明は、同定した化合物を用いて患者又は被験体を治療する方法を提供する。
［００６４］ＧＩＴＲ活性を調節することができる試験化合物、例えば、ＧＩＴＲアゴニスト又はＧＩＴＲアンタゴニストをスクリーニングする方法を提供することに加えて、本発明は、免疫系の不制御に関する障害、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患及び移植拒絶、そして癌及び感染症を診断し、予測し、それらの進行を監視する方法を提供する。
［００６５］ＧＩＴＲＬ及び本発明の関連する分子を用いるための方法はまた、本明細書に開示され、免疫系の不制御に関係する障害の療法治療のための作動性ＧＩＴＲ分子（即ち、ＧＩＴＲＬポリヌクレオチド、ＧＩＴＲＬポリペプチド、それらの活性な断片及び／又はそれらの活性なタンパク質、作動性小分子、及び作動性ＧＩＴＲ抗体）、及び拮抗性ＧＩＴＲ分子（即ち、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、中和ＧＩＴＲ抗体、中和ＧＩＴＲＬ抗体、拮抗性小分子、及びＧＩＴＲ融合タンパク質）を含む。例えば、自己免疫障害、移植拒絶、及び／又は他の炎症性疾患の危険にあるか、又はそれと診断された患者を治療する方法であって、ＧＩＴＲアンタゴニスト、例えば、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体を患者に投与することを含む前記方法が提供される；また、癌又は感染症の危険にある患者か、又はそれと診断された患者を治療する方法であって、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬ、その作動性融合タンパク質を投与することを含む方法が提供される。その代わりに、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬ（その作動性融合タンパク質を含む）、又はＧＩＴＲアンタゴニスト、例えば、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体若しくは拮抗性ＧＩＴＲ融合タンパク質を投与を介してそれぞれＴ細胞の増殖を誘導し又は阻害する方法が提供される。同様に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在下でＴ細胞の抑制を遮断し又は増強する方法であって、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬ（その作動性融合タンパク質を含む）、又はＧＩＴＲアンタゴニスト、例えば、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体をそれぞれ投与することを含む方法が提供される。ＧＩＴＲＬポリペプチド及び関連する分子（そのアゴニスト融合タンパク質を含む）で処理したＴ細胞群は、本発明の範囲内であり、そして、癌又は感染症を治療する方法において、患者に投与してもよい。処置の他の方法が提供され、自己免疫障害、炎症性疾患、又は移植拒絶の危険にある患者又はそれと診断された患者を、ＧＩＴＲ活性を減少する作動性化合物で処理する方法を含み、そして、癌又は感染症の危険にある患者又はそれと診断された患者をＧＩＴＲ活性を増加する作動性化合物で処理する方法を含む。ＧＩＴＲＬポリヌクレオチド、ポリペプチド及び関連する分子（作動性ＧＩＴＲＬ融合タンパク質及び拮抗性抗ＧＩＴＲＬ抗体を含む）を含む本発明の医薬組成物、例えば、ワクチンアジュバントはまた、本発明の範囲内である。本発明の方法は、ＧＩＴＲＬ及びＧＩＴＲに指向され、限定されてないが、マウスＧＩＴＲＬ及びＧＩＴＲ及びそれらのホモログを含み；特に、これらのホモログの中にヒトＧＩＴＲＬ及びＧＩＴＲが含まれる。
ＧＩＴＲＬポリヌクレオチド及びポリペプチド
［００６６］本発明は、ＧＩＲＴに対する新規なリガンド（ＧＩＴＲＬ）に関連する新規に単離し精製したポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。本発明の遺伝子、ポリヌクレオチド、タンパク質、及びポリペプチドは、限定されないが、マウスＧＩＴＲＬ及びそのホモログを含む。
［００６７］例えば、本発明は、マウスＧＩＴＲＬをコードする精製し単離したポリヌクレオチドを提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ及び化学的に合成したＤＮＡ配列を含む。
［００６８］この新規なリガンドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、マウスＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡと称し、配列番号：１に記載される。本発明のポリヌクレオチドはまた、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１、又はその相補体にハイブリダイズし、及び／又は全長のマウスＧＩＴＲＬの実質的な生物学的活性を保持するポリペプチド（即ち、活性な断片）をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含む配列番号：１に記載される配列の連続的な部分を含む。
［００６９］この新規なリガンドをコードするゲノムＤＮＡ（マウスＧＩＴＲＬゲノムＤＡＮと称する）のヌクレオチド配列は、配列番号：３に記載される。本発明のポリヌクレオチドはまた、ストリンジェントな条件下で、配列番号：３、又はその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び／又は全長のマウスＧＩＴＲＬの実質的な生物学的活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含む配列番号：３に記載する配列の連続的な部分を含む。
［００７０］マウスＧＩＴＲＬのアミノ酸配列は、配列番号：２に記載される。本発明のポリペプチドはまた、少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む配列番号：２に記載の配列の連続的な部分を含む。本発明の好ましいポリペプチドは、全長のマウスＧＩＴＲＬの実質的な生物学的活性を保持する配列番号：２に記載の配列のいずれかの連続的な部分を含む。本発明ののポリヌクレオチドはまた、上述したようなマウス起源のそれらのポリヌクレオチドに加えて、配列番号：２に記載されるアミノ酸配列又はその連続的な部分をコードするポリヌクレオチド、又は周知の遺伝子コードの縮重にのみよる上述したポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドを含む。
［００７１］本発明の単離したポリヌクレオチドは、開示したポリヌクレオチドをコードする配列に同一又は類似した配列を有する核酸を同定し、単離するためにハイブリダイゼーションプローブ及びプライマーとして使用してもよい。核酸を同定し、単離するためのハイブリダイゼーション方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション及びノーザンハイブリダイゼーションが含まれ、当業者に周知である。
［００７２］ハイブリダイゼーション反応は、異なるストリンジェントな条件で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、いずれか２つの核酸分子が互いにハイブリダイズするであろう困難性を含む。好ましくは、各々ハイブリダイズするポリヌクレオチドが、減じたストリンジェントな条件、より好ましくはストリンジェントな条件、及び最も好ましくは高ストリンジェントな条件下で、その対応するポリヌクレオチドにハイブリダイズする。ストリンジェンシーの条件の例は、下記の表１に示される：高度にストリンジェンシーな条件は、例えば、条件Ａ−Ｆと同様に少なくともストリンジェントなものである；ストリンジェントな条件は、例えば、条件Ｇ−Ｌと同様に少なくともストリンジェントなものである；そして、減じたストリンジェンシーな条件は、例えば、条件Ｍ−Ｒと同様に少なくともストリンジェントな条件である。
Figure 2011055833
１ハイブリッドの長さはハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズした領域について予期されるものである。未知な配列の標的ポリヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズする場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズするポリヌクレオチドのそれであると想定される。既知のポリヌクレオチドがハイブリダイズした場合、ハイブリッドの長さはポリヌクレオチドの配列を整列し、最適な配列相補性の領域（単数又は複数）を同定することによって決定され得る。
２ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、及び１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ハイブリダイゼーション緩衝液及び洗浄緩衝液中のＳＳＣと置換され得る；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間実行する。
ＴＢ ＊−ＴＲ ＊：５０塩基対より短い長さと想起されるハイブリッドについてのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度Ｔｍ（℃）よりも５−１０℃低く、Ｔｍは、次の式に従って決定される。１８塩基対より短い長さのハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。１８と４９塩基対の間の長さのハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｎａ＋）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎは、ハイブリッドにおける塩基の数であり、Ｎａ＋は、ハイブリダイゼーション緩衝液におけるナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣのＮａ＋＝０．１６５Ｍ）。
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシーな条件の追加例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、９及び１１章、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌら、編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｔｓ．２．１０＆６．３−６．４、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９５）において提供され、参照により本明細書に援用される。
［００７３］本発明の単離したポリヌクレオチドは、開示したポリヌクレオチドの対立遺伝子の変異体をコードする配列を有するＤＮＡを同定し、単離するためのハイブリダイゼーションプローブ及びプライマーとして使用してもよい。対立遺伝子の変異体は、開示したポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに同一であり、有意な類似性を有するポリペプチドをコードする開示したポリヌクレオチドの選択的形体を自然に発生している。好ましくは、対立遺伝子は、開示したポリヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも９５％の同一性；最も好ましくは少なくとも９９％の同一性）を有する。
［００７４］本発明の単離したポリヌクレオチドはまた、開示したポリヌクレオチドにホモロガスなポリペプチドをコードする配列を有するＤＮＡを同定し、単離するためのハイブリダイゼーションプローブ及びプライマーとして使用してもよい。これらのホモロガスは、開示したポリペプチド及びポリヌクレオチドより異なる種から単離したポリヌクレオチド及びポリペプチドであり、又は同じ種内であり、しかし、開示したポリヌクレオチド及びポリペプチドに有意な配列類似性を有する。好ましくは、ポリヌクレオチドのホモログは、開示したポリヌクレオチドと少なくとも５０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性）を有し、一方、ポリペプチドのホモログは、開示したポリペプチドと少なくとも３０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも４５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも６０％の同一性）を有する。好ましくは、開示したポリヌクレオチド及びポリペプチドのホモログは、哺乳動物種から単離したものである。
［００７５］本発明の単離したポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドを発現する細胞及び組織、そして、それらが発現する条件を同定するためのハイブリダイゼーションプローブ及びプライマーとして使用してもよい。
［００７６］加えて、本発明の単離したポリヌクレオチドは、細胞又は器官における本発明のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を変化（即ち、増強、減少、又は修飾）するために使用してもよい。これらの対応する遺伝子は、本発明のｃＤＮＡポリヌクレオチド（例えば、配列番号：１）が誘導されるｍＲＮＡを産生するために転写する本発明のゲノムＤＮＡ配列（例えば、配列番号：３）である。
［００７７］本発明の遺伝子の変更した発現は、限定されないが、マウスＧＩＴＲＬ及びそのホモログを含み、様々な阻害性ポリヌクレオチド、例えば、アンチセンス・ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスＧＩＴＲＬ核酸分子）及び本発明の遺伝子から転写したｍＲＮＡに結合する及び／又は切断するリボザイムの使用を通じて細胞又は器官において達成してもよい（例えば、Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８１：２５１−５７；Ｓｉｏｕｄ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：５７５−８８）。そのような阻害性ポリヌクレオチドは、自己免疫障害、炎症性疾患、移植拒絶、及び類似又は関連する障害を予防し、又は治療するのに使用してもよい。
［００７８］本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド又はリボザイムは、本発明の遺伝子の完全なコード鎖又はその部分だけに相補的であり得る。又は、アンチセンス・ポリヌクレオチド又はリボザイムは、本発明の遺伝子のコード鎖の非コード領域に相補的であり得る。アンチセンス・ポリヌクレオチド又はリボザイムは、当該技術分野において周知の手法を用いて化学的な合成及び酵素的連結反応を用いて構築することができる。化学的に合成したポリヌクレオチドのヌクレオシド連結は、それらの配列特異性を増加するのと同じく、ヌクレアーゼを介した分解に耐性となる能力を高めるために修飾することができる。そのような連結修飾は、限定されないが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、モルホリノ、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）連結を含む（Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ ｅｔ ａｌ．，上述；Ｈｅａｓｍａｎ（２００２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４３：２０９−１４；Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１１５７−７９）。又は、これらの分子は、本発明のポリヌクレオチドがアンチセンス（即ち、リバース）配向にサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に生産することができる。
［００７９］本発明の阻害性ポリヌクレオチドはまた、高い特異性及びアフィニティーで二重鎖ＤＮＡの大溝に結合する三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を含む（Ｋｎａｕｅｒｔ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：２２４３−５１）。本発明の遺伝子の発現は、遺伝子の制御領域に相補的なＴＦＯを標的することによって阻害し、遺伝子の転写を妨げる三本のらせん構造を形成することができる。
［００８０］本発明の一態様において、本発明の阻害性ポリヌクレオチドは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子（例えば、ｓｉＲＮＡ ＧＩＴＲＬ核酸分子）である。これらのｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解を引き起こす短い（好ましくは１９−２５ヌクレオチド；最も好ましくは１９又は２１ヌクレオチド）二本鎖ＲＮＡ分子である。この分解は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる（例えば、Ｂａｓｓ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４２８−２９）。より下等な生物において原始的に同定されたＲＮＡｉは、効果的に哺乳動物細胞に当てはまり、そして、最近、Ｆａｓ ｍＲＮＡに標的とされたｓｉＲＮＡ分子で処理したマウスにおいて急性肝炎を妨げることを示している（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：３４７−５１）。加えて、最近、髄膜に輸送されたｓｉＲＮＡは、ラットにおける２つのモデル（アゴニスト誘導の痛みモデルと神経疾患の痛みモデル）での痛み応答を遮断することが報告されている（Ｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（５）：ｅ４９）。
［００８１］本発明のｓｉＲＮＡ分子は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子（１つは、標的ｍＲＮＡの部分と適合する）と一緒にアニーリングすることによって（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，５０６，５５９号）、又は必要な二本鎖部分を生産するためにそれ自身で折り返す一本のらせんＲＮＡの使用を通じて（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：６０４７−５２）発生することができる。ｓｉＲＮＡ分子は、化学的に合成する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−９８）又は一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いてインビトロ転写によって産生する（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，上述）ことができる。又は、ｓｉＲＮＡ分子は、センス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含有する発現ベクターを用いて、生物学的に、一次的（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，上述；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５５１５−２０）又は安定に（Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１４４３−４８）産生することができる。最近、初代ヒト細胞における標的ｍＲＮＡレベルの減少が、らせんＲＮＡを発現し、さらにｓｉＲＮＡに加工されるアデノウイルスベクターを用いて、効率的で配列特異的な方法で示された（Ａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：２３２５−３２）。
［００８２］本発明のポリヌクレオチドに標的とされるｓｉＲＮＡ分子は、当該技術分野において周知の基準に基づいて設計することができる（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ．２０：６８７７−８８）。例えば、標的ｍＲＮＡの標的セグメントは、好ましくは、ＡＡ（最も好ましい）、ＴＡ、ＧＡ、又はＣＡで始まるべきである；ｓｉＲＮＡ分子のＧＣ比は、好ましくは、４５−５５％であるべきである；ｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは、一列に３個の同じヌクレオチドを含有すべきではない；ｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは、一列に７個の混合したＧ／Ｃを含有すべきではない；そして、標的セグメントは、好ましくは、標的ｍＲＮＡのＯＲＦ領域にあるべきであり、及び好ましくは、開始ＡＴＧの後に少なくとも７５ｂｐであり、終止コドンの前に少なくとも７５ｂｐであるべきである。これらの基準、又は他の既知な基準（例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３２６−３０）に基づいて、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、本発明のｍＲＮＡポリヌクレオチドに標的とされ、当業者によって設計され得る。
［００８３］生物における本発明の遺伝子の変更した発現はまた、本発明のゲノムポリヌクレオチドが導入されている非ヒトトランスジェニック動物の創作を通して達成してもよい。そのようなトランスジェニック動物は、本発明の遺伝子（即ち、トランス遺伝子）の複数のコピーを有する動物を含む。組織特異的な制御配列は、特別な細胞又は特別な発生段階に本発明のポリペプチドの直接発現に対するトランス遺伝子に実施可能に連結してもよい。胚操作及びマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物、具体的には、マウスのような動物を発生する方法は、当該技術分野において慣用的であり、周知である（例えば、Ｂｏｃｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１１：１１５−３２（２００２））。
［００８４］生物における本発明の遺伝子の変更した発現はまた、本発明のポリヌクレオチドに対応する内因性の遺伝子が、外因性のポリヌクレオチド配列の挿入を通じて崩壊する動物（即ち、ノックアウト動物）の創作を通じて達成してもよい。内因性の遺伝子のコード領域は崩壊してもよく、それによって、非機能性タンパク質を生じる。又は、内因性の遺伝子の上流の制御領域は、異なる制御要素で崩壊しても置換してもよく、依然として機能性タンパク質の変更した発現に帰着する。ノックアウト動物を発生する方法は、ホモロガス組換えを含み、当該技術分野において周知である（例えば、Ｗｏｌｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２５：３３６−４０（２００２））。
［００８５］本発明の単離したポリヌクレオチドは、実施可能に、発現の対照配列に連結し、及び／又は本発明のポリペプチドの組換え的な産生のための発現ベクターに接続してもよい。組換えタンパク質を発現する一般的な方法は、当該技術分野において周知である。そのような組換えタンパク質は、免疫システムの非制御に起因する障害の治療に使用するために可溶形体で発現してもよい；そのような障害は、例えば、癌および感染症、及び自己免疫疾患や炎症性疾患、そして、移植拒絶を含む。自己免疫障害及び炎症性疾患は、限定されないが、慢性関節リウマチ、脳脊髄炎、骨関節炎、多発性硬化症、自己免疫胃炎、全身性紅斑性狼瘡、乾癬及び他の感染性皮膚病、Ｉ型糖尿病、喘息、アレルギー、並びにクローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患を含む。
［００８６］発現ベクターは、本明細書で使用されるように、連結される他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味するものと意図される。ベクターの１つの型はプラスミドであり、追加のＤＮＡセグメントを接続してもよい環状の二本鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに接続してもよい。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自発的に複製できる（例えば、細菌性複製起源を有する細菌性ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に応じて宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより、宿主のゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、実施可能に連結されている遺伝子の発現に指向することができる。そのようなベクターは、本明細書では、組換え発現ベクター（又は、単純に発現ベクター）として言及される。一般的に、組換えＤＮＡ技術における用途の発現ベクターは、しばしばプラスミドの形体である。本明細書では、プラスミドは最も共通に使用されるベクターの形態であるため、プラスミド及びベクターは、相互に変えて使用することができる。しかしながら、本発明は、均等な機能を提供するウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）のような他の発現ベクターの形体を含むことを意図する。
［００８７］一態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬポリペプチドを創作するために使用され、その活性な断片及び／又は融合ポリペプチドを含み、それらはまた本発明の範囲内にある。例えば、ＧＩＴＲＬポリペプチド又はその活性な断片は、第二の部分、例えば、免疫グロブリン又はその断片（例えば、そのＦｃ結合断片）に融合していてもよい。いくつかの態様において、第一のポリペプチドは全長ＧＩＴＲＬポリペプチドを含む。又は、第一のポリペプチドは、全長のＧＩＴＲＬポリペプチドよりも短いものを含んでもよい。加えて、ＧＩＴＲＬの可溶形体は、「リンカー」配列を介して、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合してもよい。他の融合タンパク質、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｌｅｘ−Ａ、チオレドキシン（ＴＲＸ）又はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を有するものも使用してもよい。
［００８８］融合タンパク質は、追加的に、ＧＩＴＲＬ又はＧＩＴＲＬ断片を第二の部分につなぐリンカー配列を含んでもよい。そのようなリンカー配列の使用は、当該技術分野において周知である。例えば、融合タンパク質は、ペプチドリンカー、例えば、アミノ酸の長さにして約２ないし２０、より好ましくは１０未満のペプチドリンカーを含むことができる。一態様において、ペプチドリンカーは、２アミノ酸の長さであってもよい。
［００８９］別の態様において、融合タンパク質は、そのＮ末端で異種のシグナル配列（即ち、ＧＩＴＲＬ核酸によってコードされるポリペプチドには存在しないポリペプチド配列）を含む。例えば、別のタンパク質からのシグナル配列は、ＧＩＴＲＬポリペプチドと融合してもよく、その活性な断片及び／又は融合タンパク質を含む。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳動物の宿主細胞）では、ＧＩＴＲＬの発現及び／又は分泌は異種のシグナル配列を通じて増加され得る。
［００９０］融合タンパク質に含むことができるシグナル配列は、ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号：１１）である。所望されれば、１以上のアミノ酸は、ＧＩＴＲＬ残基を含む第一のポリペプチド残基と第二のポリペプチド残基との間に追加的に挿入することができる。第二のポリペプチドは、好ましくは可溶性である。いくつかの態様では、第二のポリペプチドは、連結したポリペプチドの半減期（例えば、血清の半減期）を増加する。いくつかの態様では、第二のポリペプチドは、第二のＧＩＴＲＬポリペプチドとの融合ポリペプチドの関連を促進する配列を含む。好ましい態様において、第二のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの領域を少なくとも含む。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，５１６，９６４号；第５，２２５，５３８号；第５，４２８，１３０号；５，５１４，５８２号；５，７１４，１４７号；及び、第５，４５５，１６５号に記載され、参照により本明細書に援用される。
［００９１］本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ手法によって産生することができる。例えば、異なるポリペプチド配列についてコードするＤＮＡ断片は、慣用的な手法、例えば、接続のための平滑末端処理した（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）又は付着末端処理した（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）末端の使用、適切な末端を与えるための制限酵素消化、所望されない接合を避けるための適切なアルカリホスファターゼ処理としての密着末端の代用、及び酵素的接続に従ってフレームを合わせて一緒に接続される。別の態様では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む慣用的な手法により合成することができる。又は、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、キメラ遺伝子配列を発生するために続いてアニール及び再増幅され得る２つの連続した遺伝子断片の間の相補的な突出に生じるアンカープライマーを用いて実行することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編集）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２を参照）。さらに、融合残基（例えば、免疫グロブリンの重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターは、商業的に利用できる。ＧＩＴＲＬをコードする核酸は、融合残基が免疫グロブリンタンパク質にフレームを合わせて連結されるような発現ベクターにクローニングされ得る。いくつかの態様では、ＧＩＴＲＬ融合ポリペプチドは、オリゴマー、例えば、二量体又は三量体として存在する。
［００９２］多くの細胞株は、本発明のポリペプチドの組換え発現に対して適した宿主細胞として作用することができる。哺乳動物の宿主細胞株は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、並びに初代組織及び初代組織片のインビトロ培養由来の細胞株を含む。
［００９３］又は、酵母のような下等な真核生物又は原核生物における本発明のポリペプチドを組換え的に産生することができるかもしれない。潜在的に適した酵母株は、サッカロマイセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シュイゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、及びカンジダ株を含む。潜在的に適した細菌株は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む。本発明のポリペプチドが酵母又は細菌で作製されるならば、機能性を得るために、例えば、リン酸化又は糖付加によってそれらの修飾することが必要であるかもしれない。そのような共有結合物は、周知な化学的又は酵素的方法を用いて達成することができる。
［００９４］細菌の発現は、組換えタンパク質を取り入れている封入体の形成に帰着してもよい。つまり、組換えタンパク質のリフォルディングは、活性またはより活性な物質を産生するために要求してもよい。細菌の封入体由来の正しく折り畳まれた異種タンパク質を得るいくつかの方法は、当該技術分野において既知である。これらの方法は、一般的に、封入体からタンパク質を可溶化すること、次いで、カオトロピック（ｃｈａｏｔｏｒｏｐｉｃ）試薬を用いて完全にタンパク質を変性することに関する。システイン残基がタンパク質の一次アミノ酸配列に存在する場合、しばしば、ジスルフィド結合の正しい形成を許す環境下でのリフォルディングを達成することが必要である（レドックスシステム）。リフォルディングの一般的な方法は、Ｋｏｈｎｏ（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：１８７−９５に開示される。欧州０４３３２２５、及び特許出願米国シリアル第０８／１６３，８７７は、他の適切な方法を記載する。
［００９５］本発明のポリペプチドはまた、本発明の単離したポリペプチドを、１以上の昆虫発現ベクター、例えば、バキュロウイルスベクターにおける適切な対照配列に実施可能に連結し、そして、昆虫細胞発現システムを使用することによって組換え的に産生してもよい。バキュロウイルス／Ｓｆ９発現システムについての材料と方法は、キットの形体で商業的に利用可能である（例えば、ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。
［００９６］ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬタンパク質、その活性な断片及び／又は融合タンパク質は、所望のタンパク質を発現するために必要な培養条件で培養のトランスフォームした宿主細胞を成長することによって調製してもよい。適した宿主細胞における組換え発現に続いて、本発明のポリペプチドは、次いで、培養液又は細胞抽出物から既知の精製手法、例えば、ゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製してもよい。ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬタンパク質、その活性な断片及び／又は融合タンパク質の可溶形体は、コンディション培地から精製することができる。例えば、本発明のＧＩＴＲＬタンパク質の膜結合形体は、発現細胞からの全膜画分を調製し、及び、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のような非イオン性の界面活性剤で膜を抽出することによって精製することができる。精製はまた、本発明のポリペプチドに結合するために既知の試薬を用いたアフィニティークロマトグラフィーを含んでもよい。これらの精製過程はまた、天然源を含む他の供給源から本発明のポリペプチドを精製するために使用してもよい。前述したように、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬタンパク質、その活性な断片及び／又は融合タンパク質はまた、トランスジェニック動物の産物として、例えば、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、又はヒツジのミルクの成分として発現してもよく、ＧＩＴＲアゴニストをコードするポリヌクレオチド配列を含有する体細胞又は生殖細胞によって特徴付けられる。
［００９７］ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬタンパク質、その活性な断片及び／又は融合タンパク質を精製するために使用することができる方法は、当業者に既知である。例えば、本発明のＧＩＴＲＬタンパク質は、商業的に利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎウルトラろ過ユニットを用いて濃縮してもよい。濃縮工程の後、濃縮物を精製マトリックス、例えば、ゲルろ過媒体に供することができる。又は、アニオン交換樹脂を使用することができ、例えば、ペンダント・ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）基である。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に共通して使用される他のタイプであり得る。又は、陽イオン交換工程を使用することができる。適した陽イオン交換器は、スルホプロピル又はカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスを含む。スルホプロピル基が好ましい（例えば、Ｓ−セファロース（登録商標）カラム）。ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬタンパク質、その活性な断片及び／又は融合タンパク質の培養上清からの精製はまた、コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール（登録商標）若しくはチバクロンブルー３ＧＡ セファロース（登録商標）のようなアフィニティー樹脂を通す；又は、フェニルエーテル、ブチルエーテル、若しくはプロピルエーテルのような樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーによる；又はイムノアフィニティークロマトグラフィーによる１以上のカラム工程を含んでもよい。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用する１以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程は、ＧＩＴＲＬタンパク質をさらに精製するために使用することができる。ＧＩＴＲＬタンパク質に対する抗体を含むアフィニティーカラムはまた、既知の方法に従って精製に使用することができる。前述の精製工程のいくつか又は全部はまた、様々な組合せ又は他の既知の方法で、実質的に精製した単離した組換えタンパク質を提供するために使用することができる。好ましくは、単離したＧＩＴＲＬタンパク質は、他の哺乳動物タンパク質を実質的にないように精製する。
［００９８］又は、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬタンパク質、その活性な断片及び／又は融合タンパク質はまた、精製を促進する形体で組換え的に発現してもよい。例えば、ポリペプチドは、タンパク質、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、又はチオレドキン（ＴＲＸ）との融合物として発現してもよい。そのような融合タンパク質の発現及び精製のキットは、それぞれ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商業的に利用可能である。ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬタンパク質、その活性な断片及び／又は融合タンパク質はまた、小さなエピトープでタグが付され、その後、エピトープに対する特異的な抗体を用いて同定及び精製することができる。好ましいエピトープは、ＦＬＡＧエピトープであり、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から商業的に利用可能である。
［００９９］ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬタンパク質、その活性な断片及び／又は融合タンパク質はまた、既知の慣用的な化学合成によって産生してもよい。そのようなポリペプチドを化学的に合成する方法は、当業者に周知である。そのような化学合成のポリペプチドは、天然の精製したポリペプチドと共通して生物学的性質を有し、このように、天然のポリペプチドに対して生物学的に活性な又は免疫学的な置換体として使用してもよい。
［０１００］ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬタンパク質、その活性な断片及び／又は融合タンパク質はまた、開示されたポリペプチドとは構造的に異なる分子（例えば、僅かに変更した配列を有する）を包含するが、しかし、開示されたポリペプチドと同様な生化学的な性質を実質的に有する（例えば、機能的に非必須アミノ酸残基だけが変化している）。そのような分子は、天然に発生する対立遺伝子の変異体を含み、そして、変更、代用、置換、挿入、又は欠損を含有する意図的に処理した変異体を含む。そのような変更、代用、置換、挿入、又は欠損のための手法は、当業者にとって既知である。いくつかの態様において、ＧＩＴＲＬポリペプチド残基は、タンパク質分解により耐性なＧＩＴＲＬ配列（突然変異していない配列と比較して）に帰着する天然に発生するＧＩＴＲＬ配列（野生型）における突然変異を有する変異のＧＩＴＲＬポリペプチドとして提供される。
［０１０１］本明細書に開示される、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ＧＩＴＲＬ，その活性な断片及び／又は融合タンパク質の発生の方法は、ＧＩＴＲアンタゴニスト、特に可溶性ＧＩＴＲタンパク質、その活性な断片及び／又は融合タンパク質を発生するために使用してもよい。当業者は、ＧＩＴＲアンタゴニスト、例えば、可溶性ＧＩＴＲ、その活性な断片、及び／又はその融合タンパク質を発生するために要求されるであろうすべてのものは、ＧＩＴＲの核酸配列又はアミノ酸配列であり、その両方は既知であることを認識するであろう。これらの配列を用いて、ＧＩＴＲアンタゴニスト、例えば、可溶性ＧＩＴＲ、その活性な断片、及び／又はその融合タンパク質は、上述したように、組換えＤＮＡ手法及び／又は化学的合成を用いて発生してもよい。
抗ＧＩＴＲＬ抗体
［０１０２］他の態様において、本発明は、ＧＩＴＲＬ、好ましくは、哺乳動物（例えば、マウス）ＧＩＴＲＬに特異的に結合し、ＧＩＴＲ活性を中和する抗体、又はその抗原結合断片としてＧＩＴＲアンタゴニストを提供する。
［０１０３］当業者は、本明細書に使用されるように、用語「抗体」は少なくとも１つの、及び好ましくは２つの、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書では、ＶＨとして略す）、及び少なくとも１つの、及び好ましくは２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書では、ＶＬとして略す）を含むタンパク質を意味する。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、超可変領性の領域に再分割することができ、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれ、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存されている領域で混在される。ＦＲ及びＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，及びＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照。これらは参照により本明細書に援用される）。各々のＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列している。
［０１０４］抗体はさらに、重鎖及び軽鎖の定常領域を含み、それによって、それぞれ、重及び軽イムノグロブリン鎖を形成する。一態様では、抗体は、２つの重イムノグロブリン鎖と２つの軽イムノグロブリン鎖の４量体であり、ここで、重及び軽イムノグロブリン鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって内部連結される。重鎖の定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。軽鎖の定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、典型的には、宿主組織又は因子に対する抗体の結合を仲介し、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な成分系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む。
［０１０５］免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子に実質的にコードされる１以上のポリペプチドから成るタンパク質を意味する。認識されたヒト免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。全長の免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄ、又は２１４個のアミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０個のアミノ酸）の可変領域及びＣＯＯＨ末端のカッパ又はラムダ定常領域によりコードされる。全長の免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄ、又は４４６個のアミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６個のアミノ酸）及び他の前述した定常領域遺伝子、例えば、ガンマ（約３３０個のアミノ酸をコードする）によりコードされる。免疫グロブリンの重鎖の定常領域遺伝子は、抗体クラス、即ち、アイソタイプ（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）についてコードする。抗体の抗原結合断片（又は単に「抗体部分」又は「断片」）は、本明細書で使用されるように、抗原（例えば、ＣＤ３）に特異的に結合する能力を保持する全長の抗体の１以上の断片を意味する。抗体の用語「抗原結合断片」に包含される結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから成る一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の一本の腕のＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−４６）；及び（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片、ＶＬ及びＶＨの２つのドメインは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を用いて、一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３を参照）を形成するためにＶＬ及びＶＨ領域が対となる一本のタンパク質鎖として調製することができる合成のリンカーによって接続することができる。そのような一本鎖の抗体はまた、抗体の用語「抗原結合断片」に包含されることが意図される。これらの抗体の断片は、当業者に知られる慣用的な手法を用いて得られ、そして、断片は、そのままの抗体であるのと同じ方法で用途についてスクリーニングされる。
［０１０６］当業者は、本発明のポリペプチド、例えば、マウスのＧＩＴＲＬに対する抗体の発生について本明細書に開示した方法が、他のタンパク質、例えば、ＧＩＴＲ又はヒトＧＩＴＲＬに対する抗体分子を発生するために使用することができることを認識するであろう。結果として、抗体分子を発生する方法は、開示されるような本発明のポリペプチドだけでなく、例えば、ＧＩＴＲ又はヒトＧＩＴＲＬに適用する。
［０１０７］本発明のポリペプチドの抗体分子、例えば、マウスＧＩＴＲＬに対する中和抗体は、限定されないが、マウスＧＩＴＲＬ及びそのホモログを含み、自己免疫障害、炎症性疾患、移植拒絶、及び同様の又は関連する障害を予防し又は治療するために使用してもよい。他の抗体分子、例えば、アゴニストＧＩＴＲ抗体は、癌、感染症、及び同様の及び関連する障害を治療するための本発明の方法に使用してもよい。そのような抗体分子は、当業者に周知の方法によって生産してもよい。例えば、モノクローナル抗体は、既知の方法に従ってハイブリドーマの発生により生産することができる。この手法により形成されるハイブリドーマは、次いで、標準的な方法、例えば、酵素連結免疫溶媒アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてスクリーニングし、本発明のポリペプチドで特異的に結合する抗体を生産する１以上のハイブリドーマを同定する。例えば、本発明のＧＩＴＲＬタンパク質はまた、ＧＩＴＲＬタンパク質と特異的に反応し、そして、受容体、即ち、ＧＩＴＲに対するリガンドの結合を阻害してもよいポリクローナル及びモノクローナル抗体を得る動物を免疫するために使用してもよい。同様に、ＧＩＴＲタンパク質はまた、ＧＩＴＲと特異的に反応するポリクローナル及びモノクローナル抗体を得るために使用してもよい。加えて、ペプチド免疫原は、カルボキシル末端にシステイン残基を含有してもよく、そして、カサガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなハプテンに結合させる。追加のペプチド免疫原は、チロシン残基を硫酸化したチロシン残基で置換することによって発生してもよい。そのようなペプチドを合成するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４；Ｋｒｓｔｅｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１１：１０に記載される。本発明の全長のポリペプチドは、免疫原として使用してもよく、又は、その代わりに、ポリペプチドの抗原ペプチド断片を使用してもよい。本発明のポリペプチドの抗原ペプチドは、少なくとも７個の連続するアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して生じた抗体がポリペプチドと特異的な免疫複合体を形成するようにエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基、及び最も好ましくは３０個のアミノ酸残基を含む。
［０１０８］モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ技術の当業者に既知の他の方法によって発生してもよい。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代替として、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチド（例えば、ＧＩＴＲＬ）又はＧＩＴＲを用いて組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって同定し、単離してもよく、それによって本発明のポリペプチド、又はＧＩＴＲにそれぞれ結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離する。ファージディスプレイライブラリーを生成し、スクリーニングするための手法及び商業的に利用可能なキットは、当業者にとって既知である。加えて、抗体ディスプレイライブラリーを発生し、スクリーニングするための使用に具体的に受け入れやすい方法及び試薬の例は、文献に見出すことができる。例えば、「コンビナトリアル抗体ディスプレイ」方法は、特定の抗原特異性を有する抗体断片を同定し、単離するために開発され、そして、モノクローナル抗体を生産するために利用することができる（コンビナトリアル抗体ディスプレイの記載については、例えば、Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５；Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３を参照）。動物を上述したような抗原で免疫した後、結果として生じるＢ細胞プールの抗体レパートリーがクローニングされる。オリゴマープライマーの混合物及びＰＣＲを使用することによって、免疫グロブリン分子の多様な母集団の可変領域のＤＮＡ配列を得るための方法は、一般的に既知である。例えば、５’リーダー（シグナルペプチド）配列及び／又はフレームワーク１（ＦＲ１）配列に対応する混合したオリゴヌクレオチドプライマー、並びに保存された３’定常領域に対するプライマーは、いくつかのマウス抗体由来の重鎖及び軽鎖の可変領域のＰＣＲ増幅のために使用することができる（Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：１５２−５６）。同様の戦略はまた、ヒト抗体由来のヒト重鎖及び軽鎖の可変領域を増幅するために使用することができる（Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６−１１０）。
［０１０９］ポリクローナル血清及び抗体は、本発明のポリペプチドを用いて適切な対象を免疫することによって生産してもよい。免疫した対象における抗体の力価は、標準的な手法、例えば、固相化したマーカータンパク質を用いるＥＬＩＳＡを用いて経時的に経過をみてもよい。所望により、本発明のポリペプチドに対して指向される抗体分子は、対象又は培養の媒体から単離し、さらに周知の手法、例えば、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、ＩｇＧ分画を得てもよい。
［０１１０］本発明のポリペプチドに対する抗体の断片は、当該技術分野において周知の方法に従って、抗体の切断によって生産してもよい。例えば、免疫学的に活性なＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、ペプシンのような酵素を用いて抗体を処理することにより発生してもよい。
［０１１１］加えて、本発明のポリペプチドに対するキメラのヒト化した及び一本鎖の抗体は、ヒト及びヒト以外の部分を含み、標準的な組換えＤＮＡ手法及び／又は組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを用いて生産してもよい。ヒト化した抗体はまた、内因性の免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖遺伝子を発現せず、ヒトの重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生産してもよい。例えば、作動性ＧＩＴＲＬに指向されるヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、マウスの免疫グロブリン遺伝子よりヒト免疫グロブリン遺伝子を運搬するトランスジェニックマウスを用いて生産してもよい。次いで、興味のある抗体で免疫したこれらのトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞を使用して、ヒトタンパク質由来のエピトープについての特異的アフィニティーを有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを生産するために用いてもよい（例えば、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９１／００９０６；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９１／１０７４１；Ｌｏｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９２／０３９１８；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９２／０３９１７；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−５９；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ（１９９３）Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：３３−４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７２０−２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１３２３−２６を参照）。
［０１１２］キメラ抗体は、キメラ免疫グロブリン鎖を含み、当該技術分野において既知の組換えＤＮＡ手法により生産することができる。例えば、マウス（又は他の種）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子は、マウスＦｃをコードする領域を除去するために制限酵素で消化し、そして、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の均等な部分を置換する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，国際特許公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａ，ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願１８４，１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈ，欧州特許出願１７１，４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願１７３，４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−２６；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４９；及びＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−５９）。
［０１１３］抗体又は免疫グロブリン鎖は、当該技術分野において既知の方法によってヒト化してもよい。ヒト化した抗体は、ヒト化した免疫グロブリン鎖を含み、抗原の結合に直接関係しないＦｖ可変領域の配列をヒトＦｖ可変領域由来の均等な配列で置換することによって発生してもよい。ヒト化抗体を発生する一般的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号により提供され、これらの内容は全て参照により本明細書に援用される。それらの方法は、少なくとも１つの重鎖及び軽鎖由来の免疫グロブリンＦｖ可変領域の全て又は一部をコードする核酸配列を単離し、操作し、そして発現することを含む。そのような核酸配列の供給源は、当業者に周知であり、例えば、方向付けされた標的に対する抗体を生産するハイブリドーマから得てもよい。ヒト化抗体、又はその断片をコードする組換えＤＮＡは、次いで、適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
［０１１４］ヒト化若しくはＣＤＲグラフト化抗体分子又は免疫グロブリンは、ＣＤＲグラフティング又はＣＤＲ置換により生産してもよく、ここで、免疫グロブリン鎖の１個、２個、又は全てのＣＤＲは、置換することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−２５；Ｖｅｙｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−６０；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号を参照し、全ての内容は、参照により本明細書に援用される。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するために使用してもよいＣＤＲグラフティング方法を記載し（英国特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ；Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号）、その内容は参照により本明細書に援用される。特定のヒト抗体の全て又はＣＤＲは、ヒトでないＣＤＲの少なくとも一部で置換してもよく、又は、ＣＤＲのいくつかのみがヒトでないＣＤＲで置換してもよい。方向付けされた抗原に対するヒト化抗体の結合について要求されるＣＤＲの数を置換することは、唯一必要である。
［０１１５］抗体の他の部分、例えば、定常領域を、例えば、欠失、付加、又は置換することによって修飾されているモノクローナル、キメラ及びヒト化抗体はまた、本発明の範囲内にある。例えば、抗体は、（ｉ）定常領域を欠失することによって；（ｉｉ）定常領域を他の定常領域、例えば、抗体の半減期、安定性、又はアフィニティーを増加しようとする定常領域、又は別の種若しくは抗体クラス由来の定常領域と置換することによって；又は（ｉｉｉ）例えば、グリコシル化部位の数、エフェクター細胞機能、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、補体の固定などを変更するための定常領域における１以上のアミノ酸を修飾することによって、修飾することができる。
［０１１６］抗体の定常領域を変更する方法は、当該技術分野において既知である。変更した機能、例えば、細胞上のＦｃＲのようなエフェクターリガンド又は補体のＣ１成分についての変更したアフィニティーを有する抗体は、抗体の定常部分の少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基で置換することによって生産することができる（例えば、ＥＰ３８８，１５１Ａ１、Ｕ．Ｓ．５，６２４，８２１及びＵ．Ｓ．５，６４８，２６０を参照し、全ての内容は、参照により本明細書に援用される）。マウス（又は他の種）免疫グロブリンへの同様のタイプの変更は、これらの機能を減少し、又は削除するために適用してもよい。そのような変更は、当該技術分野において既知である。
［０１１７］例えば、ＦｃＲ（例えば、ＦｃガンマＲ１）又はＣ１ｑについての抗体（例えば、ヒトＩｇＧのようなＩｇＧ）のＦｃ領域のアフィニティーを、特定の残基を側鎖上の適切な機能を有する残基で置換することによって、又はグルタミン酸若しくはアスパラギン酸のような荷電した機能基、又はフェニルアラニン、チロシン、トリプロファンもしくはアラニンを導入することによって変更することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．５，６２４，８２１を参照）。
［０１１８］本発明の抗ＧＩＴＲＬ抗体は、上清、細胞溶解物中の、又は細胞表面上のＧＩＴＲＬポリペプチドを単離し、精製し、及び／又は同定するために使用してもよい。本発明において開示される抗体はまた、臨床試験法の一部としてＧＩＴＲＬタンパク質レベルを監視するために診断的に使用することができ、又は、ＧＩＴＲＬ抗体の抗原を含む細胞若しくは組織に対する治療的モジュレーターを標的とするために臨床的に使用することができる。例えば、本発明の小分子のような治療薬、又は他の治療薬は、ＧＩＴＲＬを発現する細胞又は組織に対する治療薬を標的とするために、ＧＩＴＲＬ抗体に連結することができる。ＧＩＴＲＬタンパク質に結合する中和及び非中和抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はまた、免疫システムの不制御に関係する状態、例えば、自己免疫疾患の治療に有用であってもよい。これらの中和モノクローナル抗体は、ＧＩＴＲに結合するＧＩＴＲＬを遮断することができるかもしれない。本発明はさらに、ＧＩＴＲＬと特異的に反応する抗体を含む組成物を提供する。同様に、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲを単離し、精製し及び／又は検出するために、又はＧＩＴＲを含む細胞又は組織に対する治療的モジュレーターを臨床的に標的とするために有用であってもよい。ＧＩＴＲに対する作動性抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はまた、免疫系の不制御に関係する状態、例えば、癌又は感染症の治療に有用であってもよい。これらの作動性抗体は、ＧＩＴＲ活性を誘導することができてもよい。このように、本発明はさらに、ＧＩＴＲに対する抗体を含む組成物を提供する。
ＧＩＴＲＬスクリーニングアッセイ
［０１１９］本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、細胞又は生物体においてＧＩＴＲＬの活性、及びそれによるＧＩＴＲを調節することができ、及びそれによる免疫応答の潜在的な制御因子である薬学的な試薬、又は試薬のためのリード化合物を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用してもよい。例えば、ＧＩＴＲＬを含有する試料（天然又は組換えのいずれか）は、多種の試験化合物（生物学的試薬又は小有機分子）の１つと接触することができ、そして、処置した試料の各々におけるＧＩＴＲＬの活性は、異なる試験化合物と接触させていない試料又は接触させた試料におけるＧＩＴＲＬの活性と比較することができる。そのような比較は、いずれかの試験化合物が、１）ＧＩＴＲＬの発現又は活性のレベルの実質的な減少、それによるＧＩＴＲＬ（例えば、免疫抑制を保持し又は増強する化合物）の阻害剤を示唆する；又は２）ＧＩＴＲＬの発現又は活性のレベルの実質的な増加、それによるＧＩＴＲＬ（例えば、免疫抑制を復活する化合物）の活性因子を示唆する、に帰着するかどうかを決定するであろう。一態様において、ＧＩＴＲＬ活性を調節することができる試験化合物の同定は、ハイスループットスクリーニングアッセイ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＢＲＥＴ（バイオルミネッセンス・レゾナンス・エネルギー移動）、及びＦＲＥＴ（蛍光レゾナンス・エネルギー移動）アッセイ、並びにＥＬＩＳＡ及びセルベースドアッセイを用いて実行される。
小分子
［０１２０］自己免疫障害、炎症性疾患、又は移植拒絶に悩まされている（又はその危険がある）生物体（又は患者）における、又はそのような障害に関係するそのような生物体（又は患者）由来の細胞におけるＧＩＴＲ活性の減少はまた、ＧＩＴＲを拮抗する、即ちその活性を阻害する小分子（通常、有機小分子）の使用を通じて達成してもよい。新規な拮抗性小分子は、上述のスクリーニング方法によって同定してもよく、そして、下記の本発明の処置方法において使用してもよい。反対に、癌又は感染症に悩まされている（又はその危険がある）生物体（又は患者）における、又はそのような障害に関係するそのような生物体（又は患者）由来の細胞におけるＧＩＴＲ活性の増加はまた、ＧＩＴＲを作動する、即ちその活性を増強する小分子（通常、有機小分子）の使用を通じて達成してもよい。新規な作動性小分子は、上述のスクリーニング方法によって同定してもよく、そして、下記の癌及び／又は炎症性疾患を治療する方法において使用してもよい。
自己免疫障害及び癌の診断、予測、及びその経過の監視のための方法
［０１２１］動物モデル、具体的にはマウスモデルにおいて研究されている免疫学的メカニズムは、ヒトの免疫システムに翻訳可能であってもよく、そしてしばしば翻訳可能であることは当該技術分野において周知である。このように、本明細書において開示される実施例は、マウスモデルでのＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御細胞による免疫抑制におけるＧＩＴＲの役割を示すけれども、例えば、自己免疫障害、炎症性障害及び移植拒絶、並びに癌及び感染症のような免疫システムの非制御に関わる障害を診断し、予測し、及び監視する開示した方法は、ヒトにおけるそのような障害を診断し、予測し及び監視するために特に有用であろう。開示した方法の実施において、当業者は、ＧＩＴＲ及びＧＩＴＲＬのヒトホモログ、並びにヒトＧＩＴＲアゴニスト及びアンタゴニストが、ヒトにおけるそのような障害を診断し、予測し、及び監視する請求した方法において使用してもよいことを認識するであろう。
［０１２２］本発明は、ＧＩＴＲ活性の上方制御を検出すること、例えば、ＧＩＴＲＬの上方制御を検出することによって、患者における自己免疫障害（例えば、ＧＩＴＲＬのレベルの増加に直接的又は間接的に関連する）の診断、予測、及びその過程の監視の方法を提供し、限定されないが、ヒト患者におけるそのような方法の使用を含む。当業者は、これらの方法が、同様に炎症性疾患及び移植拒絶に適用し得ることを認識するであろう。これらの方法は、ＧＩＴＲＬポリヌクレオチド又はその断片、ＧＩＴＲＬポリペプチド又はその部分（その融合タンパク質を含む）、又はＧＩＴＲＬに対する抗体若しくはその誘導体、又はＧＩＴＲＬポリヌクレオチドの調節因子及び／又は本明細書に記載されるポリペプチドを含むグループの少なくとも１つを含むプレパック診断キットを利用することによって実行してもよく、例えば、臨床の場で慣用的に使用してもよい。加えて、当業者は、ＧＩＴＲＬの上方制御がまた、免疫細胞の数をカウントするような間接的な方法によって検出できることも認識したであろう。
［０１２３］「診断」又は「診断すること」は、病理学的状態の存在又は不在を同定することを意味する。診断方法は、対象（ヒト又はヒトでない哺乳動物）由来の生物学的試料におけるＧＩＴＲＬ遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はポリペプチド、その断片を含む）の試験量を決定し、そして、ＧＩＴＲＬ遺伝子産物についての試験量と、正常量又は範囲（即ち、自己免疫障害を被っていない既知の個体由来の量又は範囲）とを比較することによってＧＩＴＲＬの上方制御を検出することを含む。特定の診断方法は、自己免疫障害の最終的な診断を提供しないかもしれないが、その方法が診断に手助けとなる正の指示を提供すれば、十分である。
［０１２４］本発明はまた、ＧＩＴＲ活性の上方制御を検出すること、例えば、ＧＩＴＲＬの上方制御を検出することによってそのような自己免疫障害を予防する方法を提供する。「予測」又は「予測すること」は、病理学的な状態の起こり得る発生及び／又は重大性を予期することを意味する。予防方法は、患者由来の生物学的試料中のＧＩＴＲＬ遺伝子産物の試験量を決定し、そして、その試験量と、ＧＩＴＲＬ遺伝子産物についての予防量又は範囲（即ち、自己免疫障害の変化する重大性を有する個人由来の量又は範囲）とを比較することを含む。試験試料におけるＧＩＴＲＬ遺伝子産物の様々な量は、自己免疫障害についてのある種の予防と一致する。特定の予防レベルでのＧＩＴＲＬ遺伝子産物の量の検出は、患者の予防を提供する。
［０１２５］本発明はまた、ＧＩＴＲ活性の上方制御を検出すること、例えば、ＧＩＴＲＬの上方制御を検出することによって、そのような自己免疫障害の過程や経過を監視する方法を提供する。監視方法は、１回目及び２回目に患者から採取した生物学的試料中のＧＩＴＲＬ遺伝子産物の試験量を決定し、そして、その量を比較することを含む。１回目と２回目との間のＧＩＴＲＬ遺伝子産物の量の変化は、自己免疫障害の過程の変化を示し、量の減少は、自己免疫障害の鎮静を示し、そして、量の増加は、自己免疫障害の進行を示す。そのような監視のアッセイはまた、自己免疫障害に対して治療される患者における特定の治療的処置の効率を評価するために有用である。
［０１２６］上記で概要した方法におけるＧＩＴＲＬの発現の増加は、体液（例えば、全血、血漿、及び尿）、細胞（例えば、全細胞、細胞分画、及び細胞抽出物）、及び組織を含む様々な生物学的試料において検出することができる。生物学的試料はまた、組織学的目的のために採取した生検及び凍結切片のような組織切片を含む。好ましい生物学的試料は、血液、血漿、リンパ、組織生検、尿、ＣＳＦ（脳脊髄液）、滑液、及びＢＡＬ（気管支肺胞洗浄）を含む。生物学的試料の解析は、患者由来の細胞又は組織の除去を必ずしも要求しないことは賞賛されるであろう。例えば、ＧＩＴＲＬ遺伝子産物に結合する適切に標識した試薬（例えば、抗体、核酸）は、患者に投与され、標準的なイメージング技術（例えば、ＣＡＴ、ＮＭＲ（ＭＲＩ）、及びＰＥＴ）を用いて視覚化（標的に結合した場合）され得る。
［０１２７］本発明の診断及び予測アッセイにおいて、ＧＩＴＲＬ遺伝子産物が検出され、定量化され、試験量を生じる。次いで、試験量は、正常量又は範囲と比較される。正常量又は範囲を非常に超えた量は、自己免疫障害の診断において陽性の兆候である。ＧＩＴＲＬ遺伝子産物の検出及び定量の具体的な方法は、下記に示す。
［０１２８］ＧＩＴＲＬ遺伝子産物の正常量又は基底レベルは、いずれかの特定の試料タイプ及び母集団について決定され得る。一般的に、ＧＩＴＲＬタンパク質又はｍＲＮＡの基底（正常）レベルは、正常（即ち、健常）患者由来の生物学的試料におけるＧＩＴＲＬタンパク質又はｍＲＮＡの量を測定することによって決定される。又は、ＧＩＴＲＬ遺伝子産物の正常値は、羅漢した（又は羅漢した可能性のある）試験細胞又は組織が採取された同じ患者から採取した健常な細胞又は組織における量を測定することによって決定され得る。ＧＩＴＲＬ遺伝子産物の量（正常量又は試験量のいずれか）は、細胞当たり、全タンパク質当たり、又は体積基準当たり決定され、又は発現され得る。試料の細胞量を決定するためには、当業者は、生物学的試料が採取されたタイプの細胞において、構築的に発現した遺伝子産物又は既知のレベルで発現した他の遺伝子産物のレベルを測定することができる。
［０１２９］本発明のアッセイ方法は、相対値がこれらの方法の多くの応用に十分であるため、ＧＩＴＲＬ遺伝子産物の絶対値の測定を必ずしも要求しないことをは賞賛されるであろう。それはまた、ＧＩＴＲＬ遺伝子産物の量又は大量に加えて、変異の又は異常なＧＩＴＲＬ遺伝子産物又はそれらの発現パターン（例えば、突然変異した転写物、切断されたポリペプチド）は、正常な遺伝子産物と発現パターンと比較することによって同定してもよい。
［０１３０］本発明の診断、予測、及び監視アッセイは、生物学的試料におけるＧＩＴＲＬ遺伝子産物を検出し、定量することに関係する。ＧＩＴＲＬ遺伝子産物は、ＧＩＴＲＬ ｍＲＮＡ及びＧＩＴＲＬポリペプチドを含み、両者は、当業者に周知の方法を用いて測定することができる。
［０１３１］例えば、ＧＩＴＲＬ ｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーションを基礎としたアッセイ、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、ドット及びスロットブロット、及びオリゴヌクレオチドアレイを用いて直接検定し、及び定量することができる。ハイブリダイゼーションを基礎としたアッセイは、プローブ核酸が標的核酸にハイブリダイズするアッセイを意味する。いくつかのフォーマットにおいて、標的、プローブ、又は両者は固相化される。固相化した核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は別のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであってもよく、そして、天然に又は天然でなく発生するヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又は骨格を含んでもよい。本発明の使用のための核酸プローブ配列を選択する方法は、ＧＩＴＲＬの核酸配列に基づき、当該技術分野において周知である。
［０１３２］又は、ＧＩＴＲＬ ｍＲＮＡは、検出及び定量の前に増幅することができる。そのような増幅を基礎としたアッセイは、当該技術分野において周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ−酵素−連結免疫溶媒アッセイ（ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ）、及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む。増幅したＧＩＴＲＬ遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を生産し及び検出するためのプライマー及びプローブは、ＧＩＴＲＬの核酸配列に基づいて、当業者に過度の実験なしに容易に設計し及び生産することができる。増幅したＧＩＴＲＬ遺伝子産物は、例えば、ゲル電気泳動によって；プローブ核酸に対するハイブリダイゼーションによって；配列決定によって；蛍光、燐光、又は放射活性シグナルの検出によって；又はいずれかの様々な周知な方法によって直接的に解析してもよい。加えて、標的核酸配列の増幅によって生産されるシグナルを増加する方法は、当業者に周知である。当業者は、どの増幅方法を使用するとしても、当該技術分野において既知の多様な定量方法（例えば定量ＰＣＲ）は、ＧＩＴＲＬ遺伝子産物の定量が期待されれば、使用してもよいことを認識するであろう。
［０１３３］ＧＩＴＲＬポリペプチド（又はその断片）は、上述の抗ＧＩＴＲＬ抗体を使用する様々な周知の免疫学的アッセイを用いて検出することができる。免疫学的アッセイは、ＧＩＴＲＬポリペプチド（又はその断片）に特異的に結合する抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ｓｃＦｖ、及びその断片）を利用するアッセイを意味する。本発明の実施に適したそのような周知の免疫学的アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降、免疫蛍光、蛍光活性細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、及びウェスタンブロッティングを含む。ＧＩＴＲＬポリペプチドはまた、標識したＧＩＴＲを用いて検出することができる。
［０１３４］当業者は、後述の方法が自己免疫障害、及び、限定されないが、慢性関節リウマチ、脳脊髄炎、骨関節炎、多発性硬化症、自己免疫胃炎、全身性紅斑狼瘡、乾癬及び他の感染性皮膚病、Ｉ型糖尿病、喘息、アレルギー、並びにクローン病及び潰瘍性大腸炎を含む感染性腸疾患を含む他の疾患（例えば、炎症性疾患）に適用することができることを理解するであろう。
［０１３５］当業者はまた、後述する方法又はそれに基づく改変はまた、ＧＩＴＲ活性の下方制御を検出すること、例えば、ＧＩＴＲＬの下方制御を検出することによって、患者における（ＧＩＴＲＬのレベルの減少を直接的又は関節的に関係する）様々な癌及び炎症性疾患を診断し、予測し、その経過を監視するために使用することができ、限定されないが、ヒトの患者にそのような方法を使用することを含むことを認識するであろう。
治療におけるＧＩＴＲＬ及び関連する分子の使用
［０１３６］本出願人は、彼らがエフェクターＴ細胞上のＧＩＴＲのＧＩＴＲＬ、又は他のＧＩＴＲアゴニストによる結合が、エフェクターＴ細胞に対する同時刺激性シグナルを提供し、ここで、そのようなシグナルがエフェクターＴ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による感受性をより少なくし、抗ＣＤ３又は他の活性化シグナルに応答して増殖するエフェクターＴ細胞の能力を増加することを認識する第一人者であると信じている。マウスモデルはメカニズムを発見するために使用したけれども、マウスモデルにおいて研究した免疫学的メカニズムはヒト免疫システムに翻訳可能であるかもしれなく、そして、しばしば翻訳可能であるということは当該技術分野において周知である。そのように、免疫システムの非制御に関連する障害、例えば、自己免疫障害、炎症性障害及び移植拒絶、並びに癌及び感染症を治療するために、ＧＩＴＲＬ及び関連する分子、即ち、ＧＩＴＲアゴニスト又はＧＩＴＲアンタゴニストを用いるための開示した方法は、ヒトにおけるそのような障害を治療するために特に有用であろう。開示した方法を実施するには、当業者は、ＧＩＴＲ及びＧＩＴＲＬのヒトホモログ、並びにヒトＧＩＴＲアゴニスト及びアンタゴニストが、ヒトにおける自己免疫障害、炎症性障害及び移植拒絶、並びに癌及び感染症の治療において、ＧＩＴＲＬ及びＧＩＴＲＬ関連タンパク質、即ち、ＧＩＴＲアゴニスト及びアンタゴニストを使用する請求された方法において使用してもよい。
［０１３７］本明細書に開示したＧＩＴＲＬ関連分子、即ち、ＧＩＴＲアゴニスト及びアンタゴニストは、上述の方法を用いて同定されたＧＩＴＲＬポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド活性の調節因子を含み、インビトロ、エクスビボで使用することができ、又は医薬組成物に導入され、及び、例えば、ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、中和抗ＧＩＴＲ抗体、及び／又は中和抗ＧＩＴＲＬ抗体）の投与によって自己免疫障害を治療し、又は、例えば、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬポリヌクレオチド、ＧＩＴＲＬポリペプチド、又はその融合タンパク質、作動性小分子及び／又は作動性抗ＧＩＴＲ抗体）の投与によって癌を治療するために、インビボで個人に投与され得る。そのようなＧＩＴＲＬ及び／又は関連する分子（モジュレーターを含む）は、限定されないが、マウスＧＩＴＲＬ及びそのホモログ（及びそのような分子に対する抗体）を含み、そして、そのようなホモログは、限定されないが、ヒトＧＩＴＲＬを含む。ＧＩＴＲＬ及び／又はＧＩＴＲＬ関連分子を投与するかどうかの決定において考慮すべきいくつかの薬理遺伝学的アプローチは、当業者に周知であり、ゲノム広範関連、候補遺伝子アプローチ、及び遺伝子発現プロファイリングを含む。本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路（例えば、経口組成物は、一般的に、不活性な希釈剤又は食用の担体を含む）に適合するように製剤化される。投与経路の他の非制限の例は、非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮、及び直腸投与を含む。各々意図した経路に適合した医薬組成物は、当該技術分野において周知である。
［０１３８］ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストは、薬学的に受容可能な担体と組合わせた場合、医薬組成物として使用してもよい。そのような組成物は、ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニスト及び担体に加えて、様々な希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、及び当該技術分野において周知の他の材料を含有してもよい。用語「薬学的に受容可能な」とは、活性成分の生物学的活性の効果と干渉しない無毒な材料を意味する。担体の特性は、投与経路に依存するであろう。
［０１３９］本発明の医薬組成物はまた、サイトカイン、リンホカイン、又は他の血液凝固因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、及びエリスロポイエチンを含有してもよい。医薬組成物はまた、下記により詳細に記載されるように、抗サイトカイン抗体を含んでもよい。医薬組成物は、プラスミノーゲンアクチベータ及び第ＶＩＩＩ因子のような血液凝固又は抗血液凝固因子を含有してもよい。医薬組成物はさらに、下記により詳細に記載されるように、他の抗炎症医薬を含有してもよい。そのような付加因子及び／又は試薬は、ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストと相乗効果を生むために、またはＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストによって生じる副作用を最小化するために医薬組成物中に含めてもよい。反対に、ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストは、特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血液凝固若しくは抗血液凝固因子、又は抗炎症性試薬の副作用を最小化するために、そのサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血液凝固若しくは抗血液凝固因子、又は抗炎症性試薬の製剤に含めてもよい。
［０１４０］本発明の医薬組成物は、ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストは、他の薬学的に許容可能な担体に加えて、ミセル、不溶性単相、液体結晶、又は水溶液中のラメラ相のように凝集した形体で存在する脂質のような両親媒性の試薬と一緒にするリポゾームの形体であってもよい。リポゾーム形成のための適した脂質は、限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などを含む。そのようなリポソーム形成のための調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；及び米国特許第４，７３７，３２３号に記載されるように当該技術分野における技術のレベル内であり、全ては参照により本明細書に援用される。
［０１４１］本明細書に使用されるように、用語「治療的に有効な量」は、有意な患者の利益、例えば、そのような患者の症状の改善、治癒、又は治癒速度の増加を示すのに十分である医薬組成物又は方法の各々の活性成分の全量を意味する。１つの活性成分に適用し、それだけを投与した場合、その用語は、その成分だけを意味する。組合せに適用した場合、その用語は、組合わせて、連続的に又は同時に投与したかどうか、治療的な効果に帰着する活性成分の組合わせた量を意味する。
［０１４２］本発明の治療又は使用の方法を実施するには、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬポリヌクレオチド又はそこから発現したＧＩＴＲＬポリペプチド）又はＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体又は中和抗ＧＩＴＲ抗体）の治療的な有効量は、患者、例えば、哺乳類（例えば、ヒト）に投与される。ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストは、本発明の方法に従って、単独で又は他の治療剤、例えば、サイトカイン、リンホカイン若しくは他の造血因子、又は抗炎症試薬を使用する処置のように、組合わせて投与してもよい。１以上の試薬と組合わせる場合、ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストは、第二の試薬と同時に、又は連続的のいずれかで投与してもよい。連続的に投与する場合、主治医は、例えば、ＧＩＴＲＬポリペプチド（又はその融合タンパク質）又は中和抗ＧＩＴＲＬ抗体を他の試薬と組合せて投与する適切な順番を決定するであろう。
［０１４３］治療的に有効な量のＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストを経口的に投与する場合、結合試薬は、錠剤、カプセル、粉末、液体又はエリキシール剤の形体であろう。錠剤の形体で投与する場合、本発明の医薬組成物は、追加して、ゼラチン又はアジュバントのような固体の担体を含有してもよい。錠剤、カプセル、及び粉末は、約５−９５％の結合試薬、及び好ましくは約２５−９０％の結合試薬を含有する。液体の形体で投与する場合、水、石油、動物若しくは植物の起源の油、例えば、ピーナッツ油、鉱油、大豆油、若しくはゴマ油、又は合成油のような液体の担体を加えてもよい。医薬組成物の液体の形体は、さらに、生理学的食塩水、デキシトロース若しくは他の糖溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールのようなグリコールを含有してもよい。液体の形体で投与する場合、医薬組成物は、結合試薬の重量で約０．５−９０％、及び好ましくは、結合試薬の重量で約１−５０％を含有する。
［０１４４］治療的に有効な量のＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストが静脈内、皮膚又は皮下に注射される場合、ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストは、発熱物質なしの、非経口的に受容可能な水溶液の形体であろう。そのような非経口的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等浸透性、安定性などを考慮して、当該技術分野における技術の範囲内である。静脈、皮膚、又は皮下注射の好ましい医薬組成物は、ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストに加えて、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、デキシトロース注射、デキストロース及び塩化ナトリウム注射、乳酸化リンガー注射のような等浸透圧性ベヒクル、又は当該技術分野において既知の他のベヒクルを含有すべきである。本発明の医薬組成物はまた、安定化剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、又は当該技術分野において既知の他の添加剤を含有してもよい。
［０１４５］本発明の医薬組成物中のＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストの量は、処置される状態の性格や苦しさ、及び患者が受けている前処理の性質に依存するであろう。最終的には、主治医が各々個人の患者を処置するためのＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストの量を決定するであろう。初期には、主治医は、ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストの低い投与量を投与し、患者の応答を観察するであろう。後期のＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストの投与量は、最適な治療効果が患者について得られるまで、投与してもよく、そして、その点で、投与量は一般的にさらに増加しない。本発明の方法を実施するために使用される様々な医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり、約０．１μｇないし約１００ｍｇの、例えば、ＧＩＴＲＬポリペプチド又は中和抗ＧＩＴＲＬ抗体を含有すべきである。
［０１４６］本発明の医薬組成物を用いる静脈（ｉ．ｖ．）治療の期間は、処置される疾患の苦しさ、及び各々の個人の患者の状態や潜在的な特異体質の応答に応じて変化するであろう。ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストの各適用の期間は、継続的なｉ．ｖ．投与の１２−２４時間の範囲であってもよいことは、意図される。又は、本発明の医薬組成物を用いる皮下（ｓ．ｃ．）治療は意図される。これらの治療は、毎日、毎週、又は、より好ましくは隔週、又は毎月投与することができる。ＧＩＴＲアゴニスト又はアンタゴニストが小分子である場合、治療薬は、毎日、日に２度、日に３度など投与してもよいことはまた意図される。最終的には、主治医は、本発明の医薬組成物を用いて、ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．治療の適した期間、又は小分子での治療、及び治療の投与時期を決定するであろう。
［０１４７］本発明のポリヌクレオチド及びタンパク質は、下記に同定した１以上の用途又は生物学的活性（本明細書に引用されるアッセイと関連するものを含む）を提示するために期待される。本発明のタンパク質について記載される用途又は活性は、そのようなタンパク質の投与又は使用によって、又はそのようなタンパク質（例えば、遺伝子治療又はＤＮＡの導入に適したベクターのように）をコードするポリヌクレオチドの投与又は使用によって提供されてもよい。
免疫応答を増強するためのＧＩＴＲＬ及び他のＧＩＴＲアゴニストの使用
［０１４８］一側面において、本発明は、免疫細胞又は免疫細胞群をＧＩＴＲアゴニスト、例えば、本発明のＧＩＴＲＬポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド（例えば、その融合タンパク質）、及び／又はＧＩＴＲの活性を増加し又は増強する作動性抗ＧＩＴＲ抗体で接触することによって、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、エフェクターＴ細胞）の増殖を増加するための方法を提供する。これらの方法は、少なくとも部分的には、作動性抗ＧＩＴＲ抗体がＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞増殖のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞仲介による抑制を逆転にした（実施例５）という発見に基づく。その方法はまた、部分的には、例えば、ＧＩＴＲＬ又は作動性抗ＧＩＴＲ抗体によるＧＩＴＲ結合がエフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５−及ＣＤ８＋Ｔ細胞）の増殖を誘導する（実施例９及び実施例１３）という発見に基づく。出願人はまた、ＧＩＴＲＬによるＧＩＴＲ結合がエフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）への同時刺激性シグナルを提供し、それにより、ＣＤ４＋ＣＤ２５−制御性Ｔ細胞によって仲介された抑制を克服し、そして、抗ＣＤ３に応答して増殖するエフェクターＴ細胞の能力を増加し；即ち、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬポリペプチド、その活性な断片、及び／又は作動性抗ＧＩＴＲ抗体）によるエフェクターＴ細胞に発現したＧＩＴＲの結合が、エフェクターＴ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制にほとんど感受性をもたないようにするということを示す。従って、エフェクターＴ細胞におけるＧＩＴＲ活性を刺激するＧＩＴＲアゴニストは、それ自身によって、又は抗原、例えば、アジュバント（例えば、ワクチンアジュバント）と一緒に使用し、例えば、癌及び感染性障害の治療に使用するために、インビボでの免疫応答を上方制御することができる。
［０１４９］一態様において、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬポリヌクレオチド、ポリペプチド、その活性な断片及び／又は融合タンパク質、作動性小分子及び／又は作動性抗ＧＩＴＲ抗体）は、種々の免疫不全及び障害（重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を含む）の治療、例えば、Ｔ細胞の成長及び増殖の上方制御に有用であってもよい。これらの免疫不全は、遺伝的であり、又はウイルス（例えば、ＨＩＶ）、並びに細菌又は真菌感染によって引き起こされてもよく、又は自己免疫障害に起因してもよい。さらに具体的には、ウイルス、細菌、真菌又は他の感染によって引き起こされる感染症は、本発明のタンパク質に用いて治療可能であってもよく、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、結核菌、リーシュマニア属、マラリア属、及びカンジダのような種々の真菌感染を含む。当然に、この点においては、本発明のタンパク質はまた、免疫システムへのブースとが、例えば、癌の治療に所望され得る場合には、有用であり得る。
［０１５０］免疫応答の上方制御の手段として、抗原提示細胞（ＡＰＣ）抗原の上方制御（例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２、及びＢ７．３の上方制御）はまた治療に有用であってもよい。免疫応答の上方制御は、既存の免疫応答を増強し、又は初期の免疫応答を引き出す形体であってもよい。例えば、樹状突起細胞の抗原提示機能の刺激を通じて免疫応答を増強することは、ウイルス感染の場合に有用であり得る。加えて、インフルエンザのような全身性ウイルス疾患、共通のかぜ、及び脳炎は、刺激性形体抗原提示分子、例えば、樹状突起細胞抗原を全身的に投与することによって緩和してもよい。
［０１５１］又は、抗ウイルス免疫応答は、患者からのＴ細胞の除去、抗原でパルスしたプロフェッショナルＡＰＣ（例えば、Ｂ細胞、マクロファージ及び／又は樹状突起細胞）及びＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬポリヌクレオチド、ポリペプチド、その活性な断片及び／又は融合タンパク質、作動性小分子及び／又は作動性抗ＧＩＴＲ抗体）を用いてエクスビボで同時刺激することによって感染した患者に増強してもよい。ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬポリヌクレオチド、ポリペプチド、その活性な断片及び／又は融合タンパク質、及び／又は作動性抗ＧＩＴＲ抗体）は、可溶性タンパク質として又はＡＰＣによって発現されるように供給してもよい。抗ウイルス免疫応答を増強する別の方法は、患者から感染した細胞を単離し、それらに本明細書に記載されるような本発明のＧＩＴＲＬタンパク質をコードする核酸でトランスフェクトすることであり、それにより、細胞は、それらの表面にタンパク質の全部又は一部を発現し、そして、トランスフェクトした細胞を患者に再び導入する。感染した細胞は、今や、エフェクターＴ細胞にインビボで同時刺激性シグナル、即ち、感染した細胞によるＧＩＴＲＬタンパク質、又はその活性な断片の発現を輸送することができ、そして、そのようなＧＩＴＲＬタンパク質のエフェクターＴ細胞上のＧＩＴＲへの結合は、エフェクターＴ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制にほとんど感受性がないようにすることができた。
［０１５２］別の応用において、ＡＰＣ抗原機能の上方制御又は増強は、腫瘍免疫の導入に有用であってもよい。本発明の少なくとも１つのペプチドをコードする核酸でトランスフェクトした腫瘍細胞（例えば、肉腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、神経芽種、及び悪性腫瘍）は、患者における腫瘍特異的寛容を克服するために患者に投与することができる。所望により、腫瘍細胞は、ペプチドの組合せを発現するためにトランスフェクトすることができる。例えば、患者から得た腫瘍細胞は、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲポリペプチド、その活性な断片及び／又は融合タンパク質、及び／又は作動性抗ＧＩＴＲ抗体）の発現を、単独で、又はＢ７．２様の活性を有するペプチドのみ若しくはＢ７．１様の活性を有するペプチドなどの組合せとの併用で指向する発現ベクターを用いてエクスビボでトランスフェクトすることができる。トランスフェクトされた腫瘍細胞は、患者に戻され、トランスフェクトされた細胞表面上でのペプチドの発現に帰着する。又は、遺伝子治療手法は、インビボでのトランスフェクションについての腫瘍細胞を標的とするために使用することができる。
［０１５３］ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬポリペプチド、その活性な断片及び／又は融合タンパク質、作動性小分子及び／又は作動性抗ＧＩＴＲ抗体）の存在は、腫瘍細胞の表面上のＡＰＣ抗原（例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２など）の活性を有するペプチドとの組合せで、Ｔ細胞に必要な同時刺激性シグナルを与え、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞を介した免疫応答を誘導する。加えて、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子を欠損している、又は十分量のＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子を再発現しない腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質及びβ２ミクログロブリンタンパク質又はＭＨＣクラスＩＩα鎖及びＭＨＣクラスＩＩβ鎖タンパク質の全て又は一部をコードする核酸（又は対応するヒトＨＬＡ核酸）でトランスフェクトし、それにより、細胞表面上でＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩタンパク質（又は対応するＨＬＡ分子）を発現することができる。ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬポリペプチド、その活性な断片及び／又は融合タンパク質、及び／又は作動性抗ＧＩＴＲ抗体）、及び／又はＡＰＣ抗原の活性を有するペプチドと結合している適切なクラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣの発現は、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞を介した免疫応答を誘導する。場合により、ＭＨＣクラスＩＩ関連タンパク質、例えば、一定の鎖の発現を遮断するアンチセンス構築物をコードする遺伝子はまた、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬポリペプチド、その活性な断片及び／又は融合タンパク質、及び／又は作動性抗ＧＩＴＲ抗体）及び／又はＡＰＣ抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡで同時トランスフェクトし、腫瘍関連抗原の提示を促進し、そして、腫瘍特異的免疫性を誘導することができる。このように、ヒト患者におけるＴ細胞を介した免疫応答の誘導は、患者における腫瘍特異的な寛容を克服するために十分であり得る。
［０１５４］他の態様において、本発明のＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬポリペプチド、その活性な断片及び／又は融合タンパク質、その融合タンパク質、作動性小分子、及び／又は作動性抗ＧＩＴＲ抗体）は、ワクチンアジュバントとして使用してもよい。アジュバントは、それ自身が弱い免疫原である種々の抗原に対する免疫応答の発生及びプロファイルを増強及び／又は進める能力を有する免疫調節化合物である。サイトカイン及び／又はリンホカインは、アジュバントとして使用することができる。適したアジュバントの選択は、アジュバントがない場合に発生しないであろう良い体液性及び細胞性免疫応答を誘導することができる。特に、アジュバントは、ワクチンにおけるサブユニット及びペプチド抗原に対する免疫応答を増強するのに有意な効果を有する。それらの刺激活性はまた、タンパク質抗原に対して指向された抗原特異的免疫応答の発生に利点がある。強力な粘膜応答、高い血清力価、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）の誘導、及び激しい細胞応答を要求する多様な抗原について、アジュバント及びサイトカイン／リンホカインの組合せは、大部分の抗原調製によっては提供されない刺激を提供する。
［０１５５］本明細書で使用されるように、語句「ワクチンアジュバント」又は「ワクチン治療」は、抗原（例えば、ウイルス、寄生虫及び細菌ポリペプチド、タンパク質又はペプチド）、又は他の抗原（例えば、腫瘍又は癌細胞ポリペプチド、タンパク質又はペプチド）、若しくは、抗原に対する免疫応答を増強し、抑制し又はさもなければ調節するための抗原をコードするポリヌクレオチドと組合わせて、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬポリヌクレオチド、ＧＩＴＲＬポリペプチド、その活性な断片、その融合タンパク質、及び／又はアゴニストＧＩＴＲ抗体）の使用を意味するものと意図される。この定義の目的については、「組合せ」は、抗原と結合して、抗原（併用して又は併用しないで）と同時に、又は抗原と続けて使用することを意味する。
［０１５６］用語「ワクチンアジュバント組成物」は、注射可能な溶液又は懸濁液を調製するための慣用的な方法で、免疫学的に受容可能な希釈剤又は担体を付加的に誘導するワクチンアジュバントを意味する。ワクチンアジュバント組成物は、ＧＩＴＲアゴニストによって引き出される免疫応答をさらに増強する試薬を付加的に誘導してもよい。例えば、ワクチンアジュバント組成物は、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標）；Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）又はモノホスホリル脂質Ａ及びその誘導体及び類似体を付加的に誘導してもよい。ＭＰＬ（登録商標）は、１−１００μｇ／投与量の範囲で使用することができる。
［０１５７］ワクチン治療のために使用される抗体は、免疫原性及び非免疫原性タンパク質から誘導されたタンパク質、ペプチド又はポリペプチド、並びに次のいずれか：糖類、タンパク質、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、又は他の巨大分子成分、又はその断片を誘導する。この節に使用されるように、「ペプチド」は、一連の少なくとも６個のアミノ酸を含み、そして、少なくとも１個の抗原決定因子を含有し、一方、「ポリペプチド」は、ペプチドより長い分子であるが、全長のタンパク質を構築しない。本明細書に使用されるように、「断片」は、糖、タンパク質、ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド、又は他の巨大分子成分の部分を含むが、全部よりは少ない部分を含む。
［０１５８］本明細書に使用されるように、用語「有効なアジュバント量」は、脊椎動物の宿主において増加した免疫応答を引き出すのに適している、本明細書に記載されるアジュバント併用剤の投与量を意味する。具体的な投与量は、宿主の年齢、体重及び医学的な状態、並びに投与及び抗原の方法に部分的に依存するであろう。
［０１５９］本発明のワクチンアジュバント組成物は、限定されないが、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、非経口、皮内、経皮（例えば、国際出願ＷＯ９８／２０７２３、参照により本明細書に援用される）、筋内、腹腔内、皮下、静脈内及び動脈内を含む様々な経路によって、ヒト又はヒトでない脊椎動物に投与することができる。抗原成分又は抗原組成物のの成分の量は、抗原の正体、並びに患者の年齢、体重及び医学的状態、並びに投与方法に部分的に依存して変化するであろう。また、適した投与量は、当業者によって容易に決定される。要求されないが、アジュバントの抗原及び組合せは、同時に投与されることが好ましい。抗原組成物の投与回数及び投与量処方は、同様に当業者によって容易によって決定される。いくつかの例において、アジュバント併用剤のアジュバントの特性は、必要とされる投与回数又は投与量処方の経時を減少してもよい。
［０１６０］本発明のアジュバント併用剤は、限定されないが、ヒト及びヒトでない脊椎動物を感染するウイルス、細菌、真菌又は寄生虫の微生物を含む幅広い様々な病原性微生物由来、又は癌細胞若しくは細胞（例えば、肉腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、神経芽腫、及び悪性腫瘍）由来の幅広い様々な抗原と組合わせた使用に適している。抗原は、タンパク質、並びに下記の：糖類、タンパク質、ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド、癌若しくは腫瘍細胞、又は他の巨大分子成分のいずれかの断片から誘導されるペプチド又はポリペプチドを含んでもよい。いくつかの例において、１以上の抗原は、抗原性組成物に含まれる。
［０１６１］本発明のアジュバント併用剤を含有する期待されるウイルス性ワクチンは、限定されずに、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、パラミクソウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス・タイプ１−３、インフルエンザウイルス、単純疱疹、ヒトサイトメガロウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリチウイルス（ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻腔気管炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、トリ感染性滑液嚢疾患ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレク疾患ウイルス、ブタ呼吸器及び生殖症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、及び種々の脳炎ウイルスによって引き越される疾患の予防及び／又は治療に指向されたものを含む。
［０１６２］本発明のアジュバント併用剤を含有する期待される細菌性ワクチンは、限定されないが、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）・インフルエンザ（分類可能及び分離不能の両方）、ヘモフィラス・ソムヌス（ｓｏｍｎｕｓ）、モラクセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉｓ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ビブリオ・コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、コリネバクテリウム・ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリマイクロバクテリウム結核菌−マイクロバクテリウム細胞内複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）、プロテウス・ミラビス変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチルス胸膜肺炎菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びマイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）によって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療に指向するものを含む。
［０１６３］本発明のアジュバント併用剤を含有する真菌病原体に対する期待されるワクチンは、限定されないが、コウジカビ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）、分芽菌（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス菌（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコッカス菌（Ｃｒｙｔｃｏｃｃｕｓ）及びヒストプラスマ菌（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）によって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療に指向するものを含む。
［０１６４］本発明のアジュバント併用剤を含有する寄生虫に対する期待されるワクチンは、限定されないが、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ）、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）及びニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）によって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療に指向するものを含む。
［０１６５］脊椎動物の宿主に治療的又は予防的抗癌効果を引き出す期待されるワクチンは、本発明のアジュバント併用剤を含有し、限定されないが、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５、ＭＡＧＥ−３、ＥＧＦＲ、ＨＥＬＰ、ＧＣＣ、ＣＤ６６−ｃ、プロスタミン、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＡＤＧ１２及びＴＡＤＧ１５を含む癌抗原又は腫瘍関連抗原を利用するものを含む。
［０１６６］ＨＩＶ及びＳＩＶの場合において、抗原性組成物は、当該ウイルスから誘導される少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は断片を含む。いくつかの例では、多様なＨＩＶ又はＳＩＶタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び／又は断片は、抗原性組成物に含められる。
［０１６７］本発明のアジュバント併用製剤はまた、ポリヌクレオチドワクチン（ＤＮＡワクチンとしても知られる）にアジュバントとして封入に適している。そのようなワクチンはさらに、ブピビカニン（ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ）（米国特許第５，５９３，９７２号を参照し、それは参照により本明細書に援用される）のような促進試薬を含む。
［０１６８］１）抗原提示細胞の機能、例えば、樹状突起細胞の機能を刺激する；２）患者からＴ細胞を取り出し、それらをエクスビボで同時刺激し、及び、それらを患者に再導入する；３）腫瘍免疫を誘導するために腫瘍細胞をトランスフェクトする；そして、４）当該技術分野において周知であるワクチンアジュバントを使用する方法（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ：ａ ｊｏｕｒｎｅｙ ｆｒｏｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（１）：７−１０；Ｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：２９４−３０９；Ｖａｌｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２１６７−７３）。
免疫細胞活性を減少するためのＧＩＴＲアンタゴニストの使用
［０１６９］さらに別の側面において、本発明は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制に対するエフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の感受性、又はその母集団を維持するための方法を特徴とする。該方法は、Ｔ細胞の母集団をＧＩＴＲＬアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、中和抗ＧＩＴＲ抗体、及び／又は中和抗ＧＩＴＲ抗体）と免疫細胞又は母集団の活性を阻害するのに十分な量で接触することを含んでもよい。ＧＩＴＲのアンタゴニストはまた、免疫応答の抑制が期待される患者に投与してもよい。これらの状態は、例えば、自己免疫障害（例えば、関節炎障害）、炎症性疾患、又は臓器移植を含む。
［０１７０］これらの方法は、少なくとも部分的には、例えば、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体を用いることによるＧＩＴＲ活性の減少が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋仲介の抑制を保持し（実施例１３）、即ち、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制にエフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の感受性を維持するという発見に基づく。加えて、出願人は、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体とのエフェクターＴ細胞のインキュベーションがマウスの実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）における疾患を改善することを示している（実施例１４）。加えて、ＧＩＴＲアンタゴニスト、即ち、ＧＩＴＲ活性（例えば、抗ＧＩＴＲＬ抗体）を阻害する分子は、例えば、移植拒絶、炎症性疾患、及び自己免疫障害を含む免疫細胞関連の病状を治療し又は防ぐために、インビボでＣＤ４＋ＣＤ２５＋
Ｔ細胞による抑制に対するエフェクターＴ細胞の感受性を維持するために使用してもよい。
［０１７１］ＧＩＴＲアンタゴニストを用いる方法はまた、エフェクターＴ細胞の活性（例えば、増殖、分化、生存）を阻害するために使用してもよく、このように、様々な免疫障害を治療し又は防ぐために使用することができる。治療され又は防がれることができる障害の制限されない例は、限定されないが、移植拒絶、自己免疫疾患（例えば、糖尿病、関節炎（慢性関節リウマチ、若年慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、乾癬性関節炎）、多発性硬化症、脳脊髄炎、筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン疾患、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、脊椎関節炎、強直性脊椎炎、内因性喘息、アレルギー性喘息、紅斑性皮膚狼瘡、強皮症、膣炎、直腸炎、薬物性発疹、ハンセン逆反応、癩性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳脊髄炎、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブン・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、バセドウ病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺炎を含む）、移植対宿主疾患、及びアトピー性アレルギーのようなアレルギーを含む。ＧＩＴＲアンタゴニスト、例えば、中和ＧＩＴＲＬ抗体の投与を含む方法を用いて治療され得る好ましい障害は、関節炎障害（例えば、慢性関節リウマチ、若年慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、乾癬性関節炎、及び強直性脊椎炎（好ましくは慢性関節リウマチ））、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、狼瘡（ＳＬＥ）、ＩＢＤ、クローン病、喘息、脈管炎、アレルギー、強皮症及び乾癬を含む。
［０１７２］別の態様において、ＧＩＴＲアンタゴニスト単独、又は、本明細書に記載される他の治療試薬（例えば、ＴＮＦアンタゴニスト）との組合せは、多発性ミエローマ及び関連Ｂリンパ球悪性腫瘍を治療するために使用することができる（Ｂｒｅｎｎｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９（１０）：３７５６−６２）。
［０１７３］ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はに対する中和抗体）を用いて、様々な方法で免疫応答を調節することは可能である。下方制御は、すでに進行中の免疫応答を阻害し又は遮断する形体であってもよく、又は免疫応答の誘導を妨げることに関係してもよい。活性化したＴ細胞の機能は、Ｔ細胞応答の抑制を増強することによって、又は特異的なＴ細胞の寛容によって、又はその両方によって阻害してもよい。Ｔ細胞応答の免疫抑制は、一般的に、抑制試薬にＴ細胞を連続的に晒すことを要求する活性であり、非抗原性特異的プロセスである。寛容は、Ｔ細胞における非応答性又はアネルギーを含むことに関係し、一般的に、抗原性特異的であり、寛容試薬への曝露が止んだ後に持続する。操作的に、寛容は、寛容試薬なしに特異的抗原に再曝露に応じてＴ細胞応答の欠如によって示される。
［０１７４］抗原提示細胞抗原（例えば、Ｂ７．１）の１以上の機能を下方制御し、又は妨げること、及びこのように活性化したＴ細胞による高レベルのリンホカイン合成を妨げることは、組織、皮膚及び器官移植の状況、及び移植対宿主疾患（ＧＶＨＤ）において有用であろう。例えば、Ｔ細胞機能の遮断は、組織移植における組織破壊の減少に帰着すべきである。典型的には、組織移植において、移植の拒絶は、Ｔ細胞による外来物のようなその認識を介してして開始され、移植を破壊する免疫応答が続く。移植前に、ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、中和抗ＧＩＴＲ抗体、及び／又は中和抗ＧＩＴＲＬ抗体）と、Ｂ７リンパ球抗原とその免疫細胞上の天然のリガンド（例えば、Ｂ７．２活性を有するペプチドの可溶な一量体のみ、又は別のＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７．１）の活性を有するペプチドの一量体若しくは遮断抗体との組合せ）を用いてＢ７リンパ球抗原の相互作用を阻害し、又は遮断する分子との組合せの投与は、対応する同時刺激性のシグナルを伝達することなく、免疫細胞上の天然のリガンドにその分子を結合することに導くことができる。この方法におけるＢ７リンパ球抗原機能を遮断することは、免疫細胞、例えば、エフェクターＴ細胞によってサイトカイン合成を妨げ、つまり、免疫抑制のように演じる。さらに、同時刺激の欠如はまた、Ｔ細胞の免疫原性を減少するのに十分であり、それにより患者における寛容を誘導してもよい。Ｂ７リンパ球の抗原遮断試薬による長期の寛容の誘導が、これらの遮断試薬の繰り返される投与の必要性を避けることができる。患者における十分な免疫抑制又は寛容を達成することはまた、Ｂリンパ球抗原の併用の機能を遮断するために必要であってもよい。
［０１７５］器官移植拒絶又はＧＶＨＤを妨げる特定の処断試薬の効率は、ヒトにおける効率を予測する動物モデルを用いて評価することができる。使用し得る適したシステムの例は、ラットにおける同種心臓移植、及びマウスにおけるアフリカツメガエルの膵臓ランゲルハンス島移植を含み、両者は、Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７８９−９２及びＴｕｒｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１１０２−０５に記載されるように、インビボでのＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質の免疫抑制効果を調べるために使用した。加えて、ＧＶＨＤのマウスモデル（例えば、Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，ｐｐ．８４６−４７）は、その疾患の発生上のインビボでのＢリンパ球抗原機能を遮断する効果を決定するために使用することができる。
［０１７６］ＡＰＣ抗原の機能を遮断することはまた、自己免疫疾患を処置するために治療的に有効であり得る。多くの自己免疫障害は、自己の組織に対して反応的であり、疾患の病理学に関係するサイトカイン及び自己抗体の生産を促進するＴ細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性Ｔ細胞の活性化を妨げることは、疾患の症状を減少し、又は取り除くかもしれない。ＡＰＣ抗原の受容体：リガンドの相互作用を邪魔することによってＴ細胞上の同時刺激を遮断する試薬と組合わせて、ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）を投与することは、Ｔ細胞活性を阻害し、そして疾患のプロセスに関係してもよい自己抗体又はＴ細胞誘導のサイトカインの生産を妨げるために使用することができる。加えて、遮断試薬と組合わせて、ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）は、自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的な寛容を誘導してもよく、疾患から長期の救済に導くことができる。自己免疫疾患を妨げ、又は緩和することにおけるこれらの試薬の効率は、ヒトの自己免疫疾患の多くの十分に特徴付けられた動物モデルを用いて決定することができる。例は、マウスの実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス又はＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性紅斑性狼瘡、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウス及びＢＢラットにおける糖尿病、及びマウス実験的重症筋無力症を含む（例えば、Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，ｐｐ．８４０−５６を参照）。
［０１７７］一態様において、ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）は、その医薬組成物を含み、併用療法、即ち、他の試薬、例えば、病理学的な状態又は障害、例えば、免疫障害及び炎症性疾患を治療するために有用である治療的試薬と組合わせて投与する。本文における用語「組合わせて」は、試薬が、実質的に同時期に、同時に又は連続して与えられることを意味する。連続して与えられる場合、第二化合物の投与の開始に、２つの化合物の第一が、好ましくは、処置の部位で効果的な濃度でまだ検出可能である。
［０１７８］例えば、併用治療は、１以上のＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）を含み、１以上の付加的な治療的試薬、例えば、詳細には下記に記載されるように、１以上のサイトカイン及び成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症試薬と同時に製剤化され、及び／又は同時に投与することができる。さらに、本明細書に記載される１以上のＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）は、本明細書に記載されるような治療用試薬の２以上と併用して使用してもよい。そのような併用治療薬は、投与される治療用試薬のより低い投与量を有効に利用することができ、このように、可能な毒性、又は様々な単剤療法と関連した合併症を避けることができる。さらに、本明細書に開示される治療用試薬は、ＧＩＴＲＬ受容体経路とは異なる経路で行動し、及びこのように、ＧＩＴＲアンタゴニストの効果、即ち、エフェクターＴ細胞がＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制に対する感受性を維持する効果を増強し及び／又は相乗作用を与えることが期待される。
［０１７９］ＧＩＴＲＬアンタゴニストと組合わせて使用される好ましい治療用試薬は、自己免疫及びその後の炎症性応答における異なる段階で干渉する試薬である。一態様において、本明細書に記載される１以上のＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）は、１以上の付加的な試薬、例えば、他のサイトカイン又は成長因子アンタゴニスト（例えば、可溶性受容体、ペプチド阻害剤、小分子、リガンド融合剤）；又は他の標的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片（例えば、他のサイトカイン若しくは成長因子、それらの受容体、又は他の細胞表面分子に結合する抗体）；及び抗炎症性サイトカイン又はそのアゴニストと同時に製剤化され、及び／又は同時に投与されてもよい。本明細書に記載されるＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）と組合わせて使用することができる試薬の制限のない例は、限定されないが、１以上のインターロイキン（ＩＬ）又はその受容体、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、及びＩＬ−２２のアンタゴニスト；サイトカイン若しくは成長因子又はそれらの受容体のアンタゴニスト、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＬＴ、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦを含む。ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）はまた、例えば、ＣＤ１５４（ｇｐ３９若しくはＣＤ４０Ｌ）、又はＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１及びＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１を含む、細胞表面分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０、又はそれらのリガンドに対する抗体の阻害税と組合わせることができる（Ｙｕｓｕｆ−Ｍａｋａｇｉａｎｓａｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２２：１４６−６７）。本明細書に記載されるＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）と併用して使用し得る好ましいアンタゴニストは、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦａ、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、及びＩＬ−２２のアンタゴニストを含む。
［０１８０］これらの試薬の例は、ＩＬ−１２アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−１２（好ましくはヒトＩＬ−１２）に結合するキメラ、ヒト化又はインビトロで発生した抗体（又はその抗原結合断片）、例えば、ＷＯ００／５６７７２に開示した抗体；ＩＬ−１２受容体阻害剤、例えば、ヒトＩＬ−１２受容体に対する抗体；及びＩＬ−１２受容体の可溶性断片、例えば、ヒトＩＬ−１２受容体を含む。ＩＬ−１５アンタゴニストの例は、ＩＬ−１５又はその受容体に対する抗体（又はその抗原結合断片）、例えば、ヒトＩＬ−１５又はその受容体に対するキメラ、ヒト化、ヒト又はインビトロで発生した抗体、ＩＬ−１５受容体の可溶性断片、及びＩＬ−１５結合タンパク質を含む。ＩＬ−１８アンタゴニストの例は、抗体、例えば、ヒトＩＬ−１８に対するキメラ、ヒト化、ヒト又はインビトロで発生した抗体（又はその抗原結合断片）、ＩＬ−１８受容体の可溶性断片、及びＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ、Ｍａｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２８）を含む。ＩＬ−１アンタゴニストの例は、インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤、例えば、Ｖｘ７４０、ＩＬ−１アンタゴニスト、例えば、ＩＬ−１ＲＡ（Ａｎｉｋｉｎｒａ，Ａｍｇｅｎ）、ｓＩＬ１ＲＩＩ（Ｉｍｍｕｎｅｘ）、及び抗ＩＬ−１受容体抗体（又はその抗原結合断片）を含む。
［０１８１］ＴＮＦアンタゴニストの例はＴＮＦ（例えば、ヒトＴＮＦａ）に対するキメラ、ヒト化、ヒト又はインビトロで発生した抗体（又はその抗原結合断片）、例えば、Ｄ２Ｅ７（ヒトＴＮＦａ抗体、Ｕ．Ｓ．６，２５８，５６２）、ＣＤＰ−５７１／ＣＤＰ−８７０／ＢＡＹ−１０−３３５６（ヒト化抗ＴＮＦａ抗体；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦａ抗体；ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ、Ｃｅｎｔｏｒｃｏｒ）；抗ＴＮＦ抗体断片（例えば、ＣＰＤ８７０）；ＴＮＦ受容体の可溶性断片、例えば、ｐ５５若しくはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体は又はその誘導体、例えば、７５ｋｄ ＴＮＦＴＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤ ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質、Ｅｎｂｒｅｌ（商標）；Ｉｍｍｕｎｅｘ；タンパク質Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９４）３７：Ｓ２９５；Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．（１９９６）４４：２３５Ａ）、ｐ５５ｋｄ ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（５５ｋＤ ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ））；酵素アンタゴニスト、例えば、ＴＮＦａ変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤（例えば、アルファスルホニルヒドロキサミン酸誘導体、ＷＯ０１／５５１１２、及びＮ−ヒドロキシホルムアミドＴＡＣＥ阻害剤ＧＷ３３３３、−００５、又は−０２２）；及びＴＮＦ−ｂｐ／ｓ−ＴＮＦＲ（可溶性ＴＮＦ結合タンパク質；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）３９（９）（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：Ｓ２８４；Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．−Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇ（１９９５）２６８：３７−４２）を含む。好ましいＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ受容体の可溶性断片、例えば、ｐ５５若しくはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体又はその誘導体、例えば、７５ｋｄ ＴＮＦＲ−ＩｇＧ、及びＴＮＦａ変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤である。
［０１８２］他の態様において、本明細書に記載されるＧＩＴＲアンタゴニストは、１以上の下記：ＩＬ−１３アンタゴニスト、例えば、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３）及び／又はＩＬ−１３に対する抗体；ＩＬ−２アンタゴニスト、例えば、ＤＡＢ４８６−ＩＬ−２及び／又はＤＡＢ３８９−ＩＬ−２（ＩＬ−２融合タンパク質；セラゲン、例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９３）３６：１２２３）、及び／又はＩＬ−２Ｒに対する抗体、例えば、抗Ｔａｃ（ヒト化抗ＩＬ−２Ｒ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９０）５０（５）：１４９５−５０２）と組合わせて投与することができる。さらに別の併用剤は、ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）を、非枯渇抗ＣＤ４阻害剤（ＩＤＥＣ−ＣＥ９．１／ＳＢ２１０３９６；非枯渇霊長類化抗ＣＤ４抗体；ＩＤＥＣ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）と組合わせて含む。さらに他の好ましい併用剤は、抗体、可溶性受容体又はアンタゴニストリガンド；並びにｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−４（ＤＮＡＸ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；ＩＬ−１０（ＳＣＨ５２０００；組換えＩＬ−１０ＤＮＡＸ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；ＩＬ−１３及びＴＧＦ−β、及びそのアゴニスト（例えば、作動性抗体）を含む、同時刺激性経路ＣＤ８０（Ｂ７．１）又はＣＤ８６（Ｂ７．２）のアンタゴニストを含む。
［０１８３］他の態様において、１以上のＧＩＴＲアンタゴニストは、１以上の炎症性薬物、免疫抑制剤剤、又は代謝的若しくは酵素的阻害剤と同時に製剤化し、及び／又は同時に投与することができる。本明細書に記載されるＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）と組合わせて使用することができる薬物又は阻害剤の非制限的な例は、限定されないが、１以上の：非ステロイド性抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）、例えば、イブプロフェン、テニダップ（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）３９（９）（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：Ｓ２８０）を参照）、ナプロキセン（例えば、Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｐｏｒｔ（１９９６）７：１２０９−１３）、メロキシカム、ピロキシカム、ジクロフェナック、及びインドメタシン；スルファサラジン（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）３９（９）（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：Ｓ２８１；コルチコステロイド、例えば、プレドニソロン；サイトカイン抑制性抗炎症性薬物（ＣＳＡＩＤ）；ヌクレオチドバイオ合成の阻害剤、例えば、プリンバイオ合成の阻害剤、ホレートアンタゴニスト（例えば、メトトレキセート（Ｎ−［４−［［２，４−ジアミノ−６−プテリジニル］メチル］メチルアミノ］ベンゾイル）−Ｌ−グルタミン酸）；及びピリミジンバイオ合成、例えば、ジヒドロオロテート・デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤（例えば、レフルノミド（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ１３１；Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６）４５：１０３−０７）を含む。ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）と組合わせて使用するための好ましい治療用試薬は、ＮＳＡＩＤ、ＣＳＡＩＤ、（ＤＨＯＤＨ）阻害剤（例えば、レフルノミド）、及びホレートアンタゴニスト（例えば、メトトレキセート）を含む。
［０１８４］追加の阻害剤の例は、１以上の：コルチコステロイド（経口、吸引及び局所注射）；及びｍＴＯＲ阻害剤、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステル・ラパマイシン誘導体、例えば、ＣＣＩ−７７９（Ｅｌｉｔ（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ３（８）：１２４９−５３；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ３（２）：２９５−３０４）；ＴＮＦａ又はＩＬ−１（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８若しくはＭＡＰキナーゼ阻害剤）のような前炎症性サイトカインによるシグナリングと干渉する試薬；ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、及びその変異体、例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ８１）；ホスホジエスレラーゼ阻害剤、例えば、Ｒ９７３４０１（ホスホジエステラーゼ・タイプＩＶ阻害剤；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ２８２を参照）；ホスホリパーゼ阻害剤、例えば、細胞質ゾルのホスホリパーゼ２（ｃＰＬＡ２）（例えば、トリフルオロメチルケトン類似体（Ｕ．Ｓ．６，３５０，８９２）；血管内皮細胞成長因子又は成長因子受容体、例えば、ＶＥＧＦ阻害剤及び／又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤；及び血管新生阻害剤を含む。ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）と組合わせて使用するための好ましい治療用試薬は、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）；ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン）又はラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステル・ラパマイシン誘導体、例えば、ＣＣＩ−７７９）；ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブ及びその変異体；及びホスホリパーゼ、例えば、細胞質ゾルのホスホリパーゼ２（ｃＰＡＬ２）、例えば、トリフルオロメチルケトン類似体を含む。
［０１８５］ＧＩＴＲＬアンタゴニストと組合わせることができる治療用阻害剤の追加の例は、１以上の：６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）；アザチオプリン・スルファサラジン；メサラジン；オルサラジン・クロロキニン／ヒドロキシクロロキン；ペニシルアミン；アウロチオルナレート（筋内及び経口）；アザチオプリン；コクヒシン（ｃｏｃｈｉｃｉｎｅ）；ベータ−２アドレノレセプターアゴニスト（サルブタモル、テルブタリン、サルメテラル）；キサンチン（セオフィリン、アルニノフィリン）；クロモグリケート；ネドクロミル；ケトチフェン；イプラトロピウム及びオキシトロピウム；マイコフェノレート・モフェチル；アデノシン作動性抗血液凝固試薬；相補的阻害剤；及びアドレナリン作用試薬を含む。
［０１８６］特異的免疫障害を治療し又は防ぐための他の治療用試薬と組合わせた、本明細書に開示されるＧＩＴＲアンタゴニストの使用は、下記にさらに詳細に開示される。
［０１８７］ＧＩＴＲアンタゴニストが組合わせることができる、関節炎障害（例えば、慢性リューマチ関節炎、炎症性関節炎、慢性リューマチ関節炎、若年慢性リューマチ関節炎、骨関節炎及び乾癬性関節炎）を治療し又は予防するための試薬の非制限的な例は、下記：本明細書に記載されるＩＬ−１２アンタゴニスト、ＮＳＡＩＤ；ＣＳＡＩＤ；ＴＮＦ、例えば、ＴＮＦａ、本明細書に記載されるアンタゴニスト、本明細書に記載される非枯渇の抗ＣＤ４抗体；本明細書に記載されるＩＬ−２拮抗性抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦａ、又はそのアゴニスト；本明細書に記載されるＩＬ−１又はＩＬ−１受容体アンタゴニスト；本明細書に記載されるホスホジエステラーゼ阻害剤；本明細書に記載されるＣＯＸ−２阻害剤；イロプロスト（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ２８２）及びタリドミド関連薬物（例えば、セルゲン）；レフノミド；プラスミノーゲン活性化の阻害剤、例えば、トラネキサミン酸；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ２８４を参照）；サイトカイン阻害剤、例えば、Ｔ−６１４；例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ２８２を参照）；プロスタグランジンＥ１（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ２８２を参照）；アザチオプリン（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ２８１を参照）；インターロイキン−１変換酵素の阻害剤（ＩＣＥ）；ｚａｐ−７０及び／又はｌｃｋ阻害剤（チロシンキナーゼｚａｐ−７０又はｌｃｋの阻害剤）；本明細書に記載される血管内皮細胞成長因子又は血管内皮細胞成長因子受容体の阻害剤；コルチコステロイド抗炎症性薬物（例えば、ＳＢ２０３５８０）；ＴＮＦ変換酵素阻害剤；ＩＬ−１１（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ２９６を参照）；ＩＬ−１３（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ３０８を参照）；ＩＬ−１７（例えば、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（１９９６）Ｖｏｌ．Ｎｏ．９（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｓ１２０を参照）；ゴールド；ペニシルアミン；クロロキン；ヒドロキシクロロキン；クロラムブシル；シクロホスファミド；シクロスポリン；全リンパ腫照射；抗胸腺細胞グロブリン；ＣＤ５−毒素；経口投与ペプチド及びコラーゲン；ロベンザリット・ヂスオディウム；サイトカイン制御試薬（ＣＲＡ）ＨＰ２２８及びＨＰ４６６（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３０２；Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；可溶性相補的受容体１（ＴＰ１０；Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）；プレドニソン；オルゴテイン；グリコサミノグリカン・ポリスルフェート；ミノシクリン；抗ＩＬ２Ｒ抗体；海洋の及び植物の脂質（魚及び植物の種の脂肪酸；例えば、ＤｅＬｕｃａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．２１：７５９−７７）；アウラノフィン；ヘニルブタゾン；メクロフェナン酸；フルフェナミン酸；静脈内免疫グロブリン；ジレウトン；マイコフェノン酸（ＲＳ−６１４４３）；タクロリムス（ＦＫ−５０６）；シロリムス（ラパマイシン）；アミプリローゼ（テラフェクチン）；クラドリビン（２−クロロデオキシアデノシン）；及びアザリビンの１以上を含む。好ましい併用剤は、メトトレキセート又はレフノミド、及び適度の若しくは重篤な慢性リューマチ関節炎の場合のシクロスポリンと組合わせて、ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）を含む。
［０１８８］関節炎障害を治療するためのＧＩＴＲと組合わせて使用するための阻害剤の好ましい例は、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦに結合する、キメラ、ヒト化、ヒト又はインビトロで発生した抗体、又はその抗原結合断片；ＴＮＦ受容体の可溶性断片、例えば、ｐ５５又はｐ７５ヒトＴＮＦ受容体その誘導体、例えば、７５ｋｄ ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤ ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質、エンブレル（商標））、ｐ５５ｋＤ ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；ＴＮＦ酵素アンタゴニスト、タンパク質ＴＮＦａ変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤）；ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２のアンタゴニスト；Ｔ細胞及びＢ細胞枯渇試薬（例えば、抗ＣＤ４又は抗ＣＤ２２抗体）；小分子阻害剤、例えば、ＣＣＩ−７７９；ｃｏｘ−２及びｃＰＬＡ２阻害剤；ＮＳＡＩＤ；ｐ３８阻害剤、ＴＰＬ−２、Ｍｋ−２及びＮＦｋｂ阻害剤；ＲＡＧＥ又は可溶性ＲＡＧＥ；Ｐ−セレクチン又はＰＳＧＬ−１阻害剤（例えば、小分子阻害剤、それに対する抗体、例えば、Ｐ−セレクチンに対する抗体）；エストロゲン受容体ベータ（ＥＲＢ）アゴニスト又はＥＲＢ−ＮＦｋｂアンタゴニストを含む。１以上のＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）と一緒に同時投与し、及び／又は同時に製剤化することができる最も好ましい追加の治療用試薬は、１以上の：ＴＮＦ受容体の可溶性断片、例えば、ｐ５５又はｐ７５ヒトＴＮＦ受容体又はその誘導体、例えば、７５ｋｄ ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤ ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合例えば、エンブレル（商標））；メトトレキセート、レフルノミド、又はシロリムス（ラパマイシン）又はその類似体、例えば、ＣＣＩ−７７９を含む。
［０１８９］ＧＩＴＲアンタゴニストが併用される、多発性硬化症を治療し又は予防するための試薬の非制限的な例は、下記：インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ（例えば、アボネックス（商標）；Ｂｉｏｇｅｎ）及びインターフェロン−１ｂ（ベータセロン（商標）；Ｃｈｉｒｏｎ／Ｂｅｒｌｅｘ）；共重合体１（Ｃｏｐ−１；Ｃｏｐａｘｏｎｅ（商標）；Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；高圧酸素；静脈内免疫グロブリン；クラドリビン；本明細書に記載されるＴＮＦアンタゴニスト；コルチコステロイド；プレドニソロン；メチルプレドニソロン；アザチオプリン；シクロホスファミド；シクロスポリン；メトトレキセート；４−アミノピイジン；及びチザニジンを含む。ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）と組合わせて使用することができる追加のアンタゴニストは、ヒトサイトカイン又は成長因子、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−１１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、及びＰＤＧＦに対する抗体又はそのアンタゴニストを含む。本明細書に記載されるＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）は、他の細胞表面分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０又はそれらのリガンドに対する抗体と組合わせることができる。ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）はまた、メトトレキセート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、マイコフェノレート・モフェチル、レフロノミド、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、プレドニソロンのようなコルチコステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシン作動性抗血液凝固試薬、相補的阻害剤、アドレナリン作用試薬、本明細書に記載される前炎症性サイトカインによるシグナリングと干渉する試薬、ＩＬ−Ｉｂ変換酵素阻害剤（例えば、Ｖｘ７４０）、抗Ｐ７ｓ、ＰＳＧＬ、ＴＡＣＥ阻害剤、キナーゼ阻害剤のようなＴ細胞シグナリング阻害剤、金属ロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチロプリン、６−メルカプトプリン、血管新生変換酵素阻害剤、本明細書に記載される可溶性サイトカイン受容体及びその誘導体、及び抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦ）のような試薬と組合わせることができる。
［０１９０］ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）が組み合わされ得る多発性硬化症の治療用試薬の好ましい例は、インターフェロンｂ、例えば、ＩＦＮｂ−１ａ及びＩＦＮｂ−１ｂ；コパキソン、コルチコステロイド、ＩＬ−１阻害剤、ＴＮＦ阻害剤、ＣＤ４０リガンド及びＣＤ８０に対する抗体、及びＩＬ−１２アンタゴニストを含む。
［０１９１］ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、中和抗ＧＩＴＲ抗体、及び／又は中和ＧＩＴＲＬ抗体）が組み合わされ得る炎症性腸疾患（例えば、クローン疾患、潰瘍性大腸炎）を治療し又は予防するための試薬の非制限的な例は、下記：ブデノシド；上皮細胞成長因子；コルチコステロイド；シクロスポリン、スルファサラジン；アミノサリクレート；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジン；抗酸化剤；トロンボキサン阻害剤；ＩＬ−１受容体拮抗性抗ＩＬ−１モノクローナル抗体；抗ＩＬ−６モノクローナル抗体；成長因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；本明細書に記載されるＴＮＦアンタゴニスト；ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及び／又はＴＧＦｂサイトカイン又はそのアゴニスト（例えば、作動性抗体）；ＩＬ−１１；プレドニソロン、デキサメタゾン又はブデソニドのグルクロニド−又はデキストラン−結合プロドラッグ；ＩＣＡＭ−１アンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３０２；Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；可溶性相補的受容体１（ＴＰ１−；Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；叙放性メサラジン；メトトレキセート；血小板活性化因子（ＰＡＦ）のアンタゴニスト；シプロフロキサシン；及びリグノカインを含む。
［０１９２］一態様において、ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、中和ＧＩＴＲ抗体、及び／又は中和ＧＩＴＲＬ抗体）は、免疫応答、例えば、移植拒絶又はグラフト−ｖ−宿主の制御に関係する他の標的に使用すれる１以上の抗体と組合わせて使用することができる。本発明のＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、中和ＧＩＴＲ抗体、及び／又は中和ＧＩＴＲＬ抗体）が組み合わされ得る免疫応答を治療し又は予防するための試薬の非制限の例は、下記：制限されないが、ＣＤ２５（インターロイキン−２受容体−ａ）、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０（Ｂ７．１）及び／又はＣＤ８６（Ｂ７．２）を含む他の細胞表面分子に対する抗体を含む。さらに別の態様において、ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、中和ＧＩＴＲ抗体、及び／又は中和ＧＩＴＲＬ抗体）は、一般的な免疫抑制試薬、例えば、シクロスポリンＡ又はＦＫ５０６と組合わせて使用される。
［０１９３］他の態様において、ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、中和ＧＩＴＲ抗体、及び／又は中和ＧＩＴＲＬ抗体）は、自己免疫障害、炎症性疾患又は移植拒絶に対するワクチンアジュバントのように使用される。これらのタイプの障害の治療のためのアジュバントの組合せは、標的とされる自己抗原、例えば、自己免疫に関する自己抗原、例えば、ミエリン塩基性タンパク質；炎症性自己抗原、例えば、アミロイドペプチドタンパク質、又は移植抗原、例えば、アロ抗原由来の幅広い種類抗原と組合わせて使用するのに適している。抗原は、タンパク質由来のペプチド又はポリペプチド、並びに下記：糖類、タンパク質、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、自己抗原、アミロイドペプチドタンパク質、移植抗原、アレルゲン、又は他の巨大分子成分のいずれかの断片を含んでもよい。
［０１９４］例えば、脊椎宿主におけるアレルゲンへの応答を緩和するための期待されるワクチンは、本発明のアジュバント併用剤を含有し、アレルゲン又はその断片を含有するものである。そのようなアレルゲンの例は、米国特許第５，８３０，８７７号及び公開された国際特許出願ＷＯ９９／５１２５９に記載され、全体において参照により本明細書に援用され、そして、花粉、昆虫毒、動物のふけ、真菌の胞子及び薬物（例えば、ペニシリン）を含む。ワクチンは、アレルギー反応の既知の原因であるＩｇＥ抗体の産生を干渉する。別の例では、本発明のアジュバント併用剤を含有する、脊椎宿主におけるアミロイド堆積によって特徴付けられる疾患を予防し又は治療するための期待されるワクチンは、
アミロイドペプチドタンパク質（ＡＰＰ）の部分を含有するものを含む。この疾患は、アルツハイマー病、アミロイドーシス又はアミロイド発生疾患のように様々に意味する。このように、本発明のワクチンは、本発明のアジュバント併用剤プラスＡβペプチド、並びにＡβペプチドの断片、及びＡβペプチド又はその断片に対する抗体を含む。
［０１９５］１）抗原提示細胞機能を下方制御すること；及び２）免疫抑制を管理するための併用療法の方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ １７：１０３−１１；Ｋｕｗａｎａ（２００２）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７３：Ｓ１９−Ｓ２２；Ｒｉｆｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｂｌｏｃｋａｄｅ：ａ ｓｔｅｐ ｔｏｗａｒｄ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７３：Ｓ１−Ｓ２；Ｍａｎｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｔｈｅ ａｒｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｎｕｒｓ．Ｑ．２７：６１−６４）。
［０１９６］本発明の別の側面は、従って、ＧＩＴＲアンタゴニスト（例えば、ＧＩＴＲＬ阻害性ポリヌクレオチド、拮抗性小分子、及び／又はＧＩＴＲ及び／又はＧＩＴＲＬに対する中和抗体）と他の治療用化合物の併用した投与を実行するためのキットに関する。一態様において、キットは、薬学的な担体において製剤化される１以上の結合試薬、及び少なくとも１つの試薬、例えば、１以上の別々の医薬調製物において、適しているもとして製剤化される治療用試薬を含む。
［０１９７］本発明は、新規なマウスｃＤＮＡ、マウスＧＩＴＲＬを指示する新規なリガンドポリペプチドをコードする、指示したマウスＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡ、並びにＧＩＴＲＬに対する新規な抗体に関する下記の実施例によって説明される。当業者は、マウスＧＩＴＲＬの全てのホモログに適している実施例の手法を理解するであろう。
実施例
［０１９８］本発明の理解を手助けする下記に設置される実施例は、限定されないが、いずれの方法におけるその範囲を含み、そして、制限するために構築されるべきではない。実施例は、慣用的な方法、例えば、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）、ＰＣＲ、ノーザン及びインサイチュハイブリダイゼーション、又はベクターの構築に使用される方法、そのようなベクター及びプラスミドへのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、そのようなベクター及びプラスミドの宿主細胞への導入、及びそのようなベクター及びプラスミド由来のポリペプチドの宿主細胞内での発現の詳細な記載を含まない。そのような方法は、当業者に周知である。
実施例１
ＧＩＴＲＬ ＤＮＡ配列の同定
実施例１．１ マウスＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡ及びゲノム配列の同定
［０１９９］２つのアプローチがマウスＧＩＴＲＬホモログを同定するために採用された。１つのアプローチでは、ヒトＧＩＴＲＬのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＸ０７７０１５由来）は、ｄｉｖ１；ｄｉｖ２；ｄｉｖ３；ｄｉｖ４；ｇｂｄｉｖ ｃｕ；Ｃｅｌｅｒａマウス（ｃｍ）に対するＴｂｌａｓｔｎ検索；及びｄｒａｆｔ ｍｏｕｓｅ−ｄｎａデータベースで使用した。ゲノム配列ｇａ ６９７７２８６２．ｃｍ ４は、調査するための可能なヒットの１つとして同定された。間違ったアミノ酸配列は、ヒトＧＩＴＲＬのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＸ０７７０１５）を用いて、マスクしていないＣｅｌｅｒａマウスゲノムアセンブリー（ｃｍ）に対するＴｂｌａｓｔｎ検索において、期待値（Ｅ）＝１０（デフォルト）、１００及び１０００を用いて同定した。ゲノム配列ｇａ ｘ５ｊ８ｂ７ｗｊ５ ０４１．ｃｍ ａａ ２は、間違ったアミノ酸配列を含有するゲノム配列として同定した。
［０２００］別のアプローチでは、ヒトＧＩＴＲＬのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ ００５０９２）はマスクしていないＣｅｌｅｒａマウスゲノムアｓｓンブリー（ｃｍ）に対するＴｂｌａｓｔｎ検索において、デフォルト期待値（Ｅ）＝１０及び１００を用いて使用した。ゲノム配列ｇａ ｘ５ｊ８ｂ７ｗ７ｗｊ５ ０４１．ｃｍ ａａ ２は３つの高いスコアリングペアー（ＨＳＰ）領域を含有するゲノム配列として同定された。
［０２０１］推定のマウスｃＤＮＡ配列は、上述のＴｂｌａｓｔｎ検索において得られた３つのＨＳＰ領域に基づいて構築した。このｃＤＮＡ配列は、Ｃｅｌｅｒａ由来の対応するヒトゲノム配列（ｇａ ｘ２ｈｔｂｌ３ｖｕｄ５ ６６．ｃｈ ｒ２５ｈ １）を有する３つのヒトエクソン配列、及びＣｅｌｅｒａ由来の対応するマウスゲノム配列（ｇａ ｘ５ｊ８ｂ７ｗ７ｗｊ５ ６６．ｃｈ ａａ ２）を有する３つ誘導のマウスの推定のエクソン配列との間の整列の比較に基づいて編集した。この編集は、ヒト配列についえのスプライス結合を考慮した。編集したマウスＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡ配列は、１７３個のアミノ酸の一部に対応する、５１９ｂｐ（５２２ｂｐの配列をコードする）のオープンリーディングフレームを含有する。
［０２０２］プライマーは、マウスＧＩＴＲＬゲノム配列の推定のエクソンに基づいて設計し、マウスの胸腺ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって対応する物理的なｃＤＮＡクローンを単離するために使用した。フォワード（配列番号：４）及びリバース（配列番号：５）ＰＣＲプライマーの配列は：５’ＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＧ３’（フォワードプライマー）、及び５’ＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＣＡＧＧＣＡＴＴＡＡＧＡＴＧ３’（リバースプライマー）であった。
［０２０３］結果の断片をサブクローニングし、そして、ＤＮＡ配列を標準的な方法を用いて決定した。結果の断片は、すべての３つの予期したエクソンを含むマウスＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡの存在を確認した（下記参照）。この断片は、この結果のｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅によって、ｃＤＮＡの最終のコーディングセグメント（２つのアミノ酸）を含めるために伸長した。この工程についてのフォワード（配列番号：６）及びリバース（配列番号：７）ＰＣＲプライマーの配列は：
５’ＴＴＴＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＧ３’（フォワードプライマー）、及び
５’ＴＴＴＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＣＡＧＧＣＡＴ３’（リバースプライマー）であった。
［０２０４］フォワードＰＣＲプライマーは、ＳａｌＩ部位、翻訳開始のためのＫｏｚａｋ配列、及び開始のメチオニンをコードするＡＴＧを含有した。リバースプライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含有した。ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩ部位は、方向性サブクローニングについて使用し、そして、最終のｃＤＮＡクローンの配列決定を実行した。
［０２０５］全長のマウスＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡ配列及びその推定したアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：１及び配列番号：２に記載される。ヒトＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡ（配列番号：８）及びマウスＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡ配列の整列は、６９．６％の同一性を示した。ヒトＧＩＴＲＬアミノ酸（配列番号：９）及びマウスＧＩＴＲＬアミノ酸配列（図１）の整列は、５４．１％の同一性及び６９．６％の類似性を示した。この程度のアミノ酸の同一性は、ヒト及びマウスの他のＴＮＦＲリガンドのホモログの間に一般的に存在するものと類似する（Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５１７−２６）。
［０２０６］クローニングしたマウスＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡ配列（配列番号：１）と公開され利用可能なマウスのデータベースとの比較は、マウスＧＩＴＲＬのコード領域における一本鎖ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を示した（配列番号：２のアミノ酸位置１５７でのアスパラギンからスレオニンへの変化に起因する、エクソン３における配列番号：１のヌクレオチド位置４７０でのＡ／Ｃトランスバージョン）。
［０２０７］マウスＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡ配列と上述のＣｅｌｅｒａ（ｇａ ｘ５ｊ８ｂ７ｗ７ｗｊ５ ０４１．ｃｍ ａａ ２）との比較は、マウスＧＩＴＲＬ遺伝子座が、マウスとヒトＧＩＴＲＬとの間に良く保存されるエクソンサイズ及び位置を伴う、３つのエクソン及び２つのイントロン（下記の表２を参照）を含有する。マウスＧＩＴＲＬゲノムＤＮＡ配列は、配列番号：３に記載される。
Figure 2011055833
［０２０８］マウスＧＩＴＲＬのゲノム構造（表２）とヒトＧＩＴＲＬのゲノム構造（下記の表３）との比較は、エクソンサイズとイントロン位置がヒト及びマウスのＧＩＴＲＬゲノムＤＮＡ配列間でよく保存されていることを示す。ヒトＧＩＴＲＬゲノムＤＮＡ配列は、配列番号：１０に示される。
Figure 2011055833
実施例１．２ マウスＧＩＴＲＬの疎水性プロファイル
［０２０９］マウスＧＩＴＲＬの疎水性プロファイルは、ＴｏｐＰｒｅｄ（Ｃｌａｒｏｓ ａｎｄ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６８５−６）によって決定した。マウスＧＩＴＲＬのアミノ酸残基（配列番号：２）に対する疎水性スコアのプロットはヒトＧＩＴＲＬに類似する、アミノ酸２５−５０の間に近接して局在した１つの推定の疎水性領域を示した。この疎水性セグメントは、タイプＩＩの膜貫通タンパク質についての予期した膜貫通領域に対応する。
実施例２ マウスＧＩＴＲＬの組織発現
［０２１０］マウスＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡ配列（配列番号：１）に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、及びリアルタイムＰＣＲによって、ＧＩＴＲＬ発現についていくつかのマウス組織試料を試験した（例えば、Ｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：９８６−９４；Ｍｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１０２６−３１；Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：３８６−４０１）。
［０２１１］ノーザンハイブリダイゼーションは、心臓、脾臓、肺、リンパ節、腎臓、及び肝臓においてかろうじて検出可能な転写物を示したが、その後のインサイチュハイブリダイゼーションは、心臓、脾臓、リンパ節及び胸腺においてＧＩＴＲＬ発現を示した。これらの組織におけるＧＩＴＲＬ発現は、一般的に、心臓の心膜及び心内膜の細胞、脾臓の白色の髄質、リンパ節の皮質、パラ皮質及び髄管ゾーン、及び胸腺の皮質及び髄管ゾーンに限定された。
［０２１２］胸腺、脾臓及びリンパ節におけるＧＩＴＲＬ発現は、さらにリアルタイムＰＣＲ解析によって確かめた。ＧＩＴＲＬは、一次Ｂリンパ細胞である脾臓及びリポポリサッカリド（ＬＰＳ）で刺激された脾臓細胞において最も高いレベルで発現した。ＧＩＴＲＬ発現のほとんど無いくらいに低いレベルが、胃、脳、及び腎臓で検出された。リアルタイムＰＣＲ解析はまた、脾臓及びＬＰＳ芽細胞よりは少ない程度であるが、肝臓、活性化したＣＤ２５−細胞、活性化したＣＤ２５＋細胞、及びコンカナバリンＡで活性化したリンパ節細胞におけるＧＩＴＲＬ転写物を示した。増殖期にないＣＤ２５−又はＣＤ２５＋細胞ではＧＩＴＲＬ発現は検出されなかった。未成熟でありＬＰＳ刺激の骨髄由来の樹状突起細胞（ＤＣ）のリアルタイムＰＣＲ解析はまた、ＬＰＳによる２４時間刺激により増加し、しかしＬＰＳ刺激の４８時間後には基準線以下に減少する未成熟ＤＣによる基準線のＧＩＴＲＬ発現を示した。ＧＩＴＲＬ発現はまた、試験した全ての内皮細胞株（ｂＥＮＤ３、Ｃ１６６、ＥＯＭＡ、ＭＳＩ及びＳＶＥＣ４−１０）において変化する程度で検出され、及び細胞株をＬＰＳで刺激した場合に相対的に変化しないままであることが示された。対象的に、ＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡは、特定の器官の下記の未刺激のマウス細胞株：Ｅ１０Ｔ細胞株、Ｔ２胎児胸腺株、Ｔ１０形質細胞腫、ＥＬ４胸腺腫、ＢＡＦ３及びＰＲＥＢプレＢ細胞株、Ｂ９ Ｂ細胞ハイブリドーマ、ＤＡ１Ｇ単球、ＦＢＭＤ−１胎児骨髄、Ｐ１９胚癌腫、ＭＤＦ肝臓、及びＥ１４胚幹細胞株においてＰＣＲでは検出されなかった。
実施例３ 組換えマウスＧＩＴＲＬの機能的発現
実施例３．１ ＧＩＴＲＬの細胞表面ＧＩＴＲへの結合
［０２１３］実施例１で単離したマウスｃＤＮＡが機能的ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）をコードしているかを決定するために、ＦＬＡＧエピトープに融合したマウスＧＩＴＲＬ（ＧＩＴＲＬ−Ｆｌａｇ−Ｃｏｓ）又はＦＬＡＧエピトープに融合した対照のマウスＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ−Ｆｌａｇ−Ｃｏｓ）を発現するＣｏｓ細胞をマウスＧＩＴＲを発現する細胞（ＧＩＴＲ−２９３Ｔ）とともに様々な時間の長さでインキュベートした。細胞−細胞相互作用は、フィコエリトリン標識した抗Ｆｌａｇ抗体（ＰＥ−ＦＬＡＧ）及びフルオレセイン・イソシアネート（ＦＩＴＣ）標識した抗ＧＩＴＲを用いてフローサイトメトリーで検出した。ＧＩＴＲ−２９３Ｔ及びＧＩＴＲＬ−Ｆｌａｇ−Ｃｏｓ細胞の同時遠心後のすでに１分で、約９０％のＧＩＴＲ−２９３Ｔ細胞（ＦＩＴＣ蛍光で検出される）は、ＦＬＡＧ（ＰＥ蛍光で検出される）について同時染色され、ＧＩＴＲ−２９３Ｔ細胞がＧＩＴＲＬ−Ｆｌａｇ−Ｃｏｓ細胞に結合したことを示し、そして、この相互作用は、実験の全６０分を通じて認められた。対象的に、ＩＬ−２１Ｒ−Ｆｌａｇ−Ｃｏｓ細胞とともにインキュベートしたＧＩＴＲ−２９３Ｔ細胞は、遠心６０分後でさえ、ＦＬＡＧについて有意に同時染色されなかった。これらのデータは、実施例１で単離したマウスｃＤＮＡが細胞表面のＧＩＴＲを結合することができる機能的ＧＩＴＲＬをコードしていることを示す。
実施例３．２ 可溶性ＧＩＴＲへのＧＩＴＲＬの結合
［０２１４］ＧＩＴＲに結合するマウスＧＩＴＲＬの能力は、マウスＧＩＴＲＬを発現するＣｏｓ細胞（ＧＩＴＲＬ−Ｃｏｓ）又は擬似でトランスフェクトしたＣｏｓ細胞を人ＩｇＧのＦｃ部分（ＧＩＴＲ−Ｆｃ）又は対照のヒトＩｇＧ（ＨＩｇＧ）に融合した組換えＧＩＴＲと一緒にインキュベートすることによって確かめた。ＧＩＴＲＬへのＧＩＴＲ−Ｆｃの結合は、ＦＩＴＣを結合したロバの抗ヒト抗体（ＦＩＴＣ−Ａｂ）を用いてフローサイトメトリーにより決定した。ＧＩＴＲ−Ｆｃと一緒にＧＩＴＲＬ−Ｃｏｓ細胞のインキュベーションは、対照のＨＩｇＧと一緒にＧＩＴＲＬ−Ｃｏｓ細胞のインキュベーション（７．９％）と比較してＦＩＴＣ−Ａｂ結合（２８．８％）において３．６倍の増加に帰着した。非染色のＧＩＴＲＬ−Ｆｃ、ＣＴＬＡ−４：Ｆｃ融合タンパク質とＦＩＴＣ−Ａｂとを一緒にインキュベートしたＧＩＴＲＬ−Ｃｏｓ細胞、ＦＩＴＣ−ＡｂのみをインキュベートしたＧＩＴＲＬ−Ｃｏｓ細胞は、蛍光を示さなかった。処置し又は処置していない擬似でトランスフェクトしたＣｏｓ細胞のいずれも何ら適した蛍光を示さなかった。これらのデータは、実施例１で単離したマウスｃＤＮＡが可溶性ＧＩＴＲに結合できる機能性ＧＩＴＲＬをコードすることを示す。
実施例４
ＧＩＴＲＬへのマウスＧＩＴＲＬの結合はＣＤ４＋ＣＤ２５＋
細胞の増殖に帰着する
［０２１５］細胞増殖におけるＧＩＴＲＬ：ＧＩＴＲ結合の効果は、約５０，０００個のマウスＴ細胞を約５０，０００個の放射したＴ細胞を枯渇した脾臓細胞、及びＧＩＴＲ結合タンパク質の様々な濃度の存在又は不存在下で６５−７２時間、１００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で刺激することによって決定した。２つのＧＩＴＲ結合タンパク質は、これらのアッセイ：作動性抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５：３１１−２３を参照；米国特許出願１０／１９４，７５４も参照）又は修飾したラットＹＢ２／０細胞の表面に発現したマウスＧＩＴＲＬ（ＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０）で使用した。細胞増殖は、細胞を１μＣｉ３Ｈ−チミジンで培養の少なくとも６−１２時間パルスし、次いで、シンチレーションカウンティングで３Ｈ−チミジンの取り込みを測定することによってアッセイした。
［０２１６］図２Ａに示すように、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、抗ＧＩＴＲ抗体のいずれの濃度でも応答しなかった。対照的に、抗ＧＩＴＲ抗体は、試験した全ての濃度でＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を刺激した。例えば、試験した最も低い力価の抗ＧＩＴＲ抗体（約０．０２μｇ／ｍｌ）の存在下でＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の培養は、抗ＧＩＴＲ抗体の不在で培養した細胞に比べ、３Ｈ−チミジンの取り込みにおいて約３倍の増加（約１５，０００ｃｐｍ）に帰着した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞増殖を刺激する抗ＧＩＴＲ抗体の能力は、約０．３μｇ／ｍｌの抗体濃度で約４５，０００の頂部に達し、抗ＧＩＴＲ抗体の不在で培養した細胞と比べて、３Ｈ−チミジンの取り込みにおいて約９倍の増加に対応する。
［０２１７］抗ＧＩＴＲ抗体で観察した結果に類似して、ＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を刺激しなかった（図２Ｂ）。対照的に、ＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増殖を著しく刺激した。例えば、約１０，０００のＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞の存在下でＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の培養は、等数の修飾していないＹＢ２／０細胞の存在下で培養した細胞と比べて、３Ｈ−チミジンの取り込みにおいて約４−５倍の増加に帰着した。ＹＢ２／０細胞の数の約５０，０００までの増加は、等数の修飾していないＹＢ２／０細胞の存在下で培養した細胞と比べて、３Ｈ−チミジンの取り込みにおいて約１５倍の増加に帰着した（図２Ｂ）。
実施例５
ＧＩＴＲへのマウスＧＩＴＲＬの結合は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を介したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の抑制を逆転する
［０２１８］これらの実施例において使用したＴ細胞抑制アッセイは、以前に開示されている（例えば、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ａｎｄ Ｓｈｅｖａｃｈ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１８３−９０；ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：３１１−２３；両者は参照により本明細書に援用される）。簡単には、約５０，０００個のＣＤ４＋ＣＤ２５−応答性Ｔ細胞は、約５０，０００個の放射したＴ細胞を枯渇した脾臓細胞、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、及び様々な数の新鮮に単離した抑制性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在下で培養した。次いで、約５０，０００個の放射したＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞又は２μｇ／ｍｌの作動性抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤ４＋ＣＤ２５−増殖の抑制を逆転する能力は、３Ｈ−チミジンの取り込みをシンチレーションカウンティングを介して測定することによってアッセイした。
［０２１９］図３Ａに示されるように、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、投与量に依存した方法で、ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞の増殖を減少した。抗ＧＩＴＲ抗体及びＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞の両方は、試験したＣＤ４＋ＣＤ２５＋抑制性細胞の全範囲の数に対して、ＣＤ４＋ＣＤ２５−増殖の抑制を完全に逆転することができた。このように、ＧＩＴＲＬによるその受容体ＧＩＴＲへの結合は、ＧＩＴＲへのアゴニストＧＩＴＲ抗体の結合のように、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の抑制性機能を遮断した。抑制を逆転するＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞の能力は、投与量に依存する方法で起こり、約３，０００個より少ないＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞は、少なくとも部分的に、このアッセイにおいて抑制を逆転し又は減少した（図３Ｂ）。修飾していないＹＢ２／０又はＧＩＴＲを発現しているＹＢ２／０細胞のいずれも、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を介した抑制に賞賛される効果はなかった（図３Ａ）。
［０２２０］新鮮に単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞で得られた結果とは対照的に、ＧＩＴＲＬ：ＧＩＴＲ結合は、抗ＣＤ３抗体、Ｔ細胞を枯渇した脾臓細胞、及びＩＬ−２で活性化したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって介される抑制に殆どないし全く効果がなかった（図４）。抗ＧＩＴＲ抗体又は約５０，０００個のＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞の添加のいずれも約２５，０００個の活性化したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって介される抑制を逆転することはできなかった。しかしながら、より少ない活性化したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞がアッセイに添加した場合（例えば、約１，５００−１２，５００個）、抗ＧＩＴＲＬ固体及びＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞は、抑制を部分的に減少することができたが、完全には排除できなかった。
実施例６
抗マウスＧＩＴＲＬ抗体はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって介される抑制を復帰する
実施例６．１ 抗マウスＧＩＴＲＬ抗体の単離
［０２２１］マウスＧＩＴＲＬに特異的な抗体は、マウスＧＩＴＲＬ ｃＤＮＡを発現するラットＹＢ２／０細胞（ＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０）でラットを免疫することによって生産した。当該技術分野において周知の方法を用いて、抗体ハイブリドーマを作製し、フローサイトメトリーを用いてマウスＧＩＴＲＬを発現するＰｈｏｅｎｉｘ細胞に対してスクリーニングした。擬似でトランスフェクトしたＰｈｏｅｎｉｘ対照細胞ではなく、ＧＩＴＲＬ−Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞に特異的に結合する２つの抗体、５Ｆ１及び１０Ｆ１２を同定した。これらの抗体ハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に２００３年７月２２日に寄託し；ＡＴＣＣ受託番号は、ハイブリドーマ５Ｆ１についてＰＴＡ−５３３６、及びハイブリドーマ１０Ｆ１２についてＰＴＡ５３３７である。
実施例６．２ 抗マウスＧＩＴＲＬ抗体は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制活性におけるＧＩＴＲＬの効果を遮断する
［０２２２］上述の実施例５に記載されるように、細胞表面でＧＩＴＲＬを発現するＹＢ２／０は、新鮮に単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって介されるＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞増殖の抑制を逆転することができた。抗ＧＩＴＲＬ抗体がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を介した抑制を復帰できるかを決定するために、実施例５に記載されるＴ細胞抑制アッセイが、５Ｆ１又は１０Ｆ１２の抗ＧＩＴＲＬ抗体のいずれか、又は対照抗体の存在又は不存在下で実行した。
［０２２３］実施例５に見られるように、ＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞の存在下でＣＤ４＋ＣＤ２５−応答性Ｔ細胞及び新鮮に単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋抑制性Ｔ細胞の培養は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞増殖の抑制の完全な逆転に帰着した（図５Ａ及び５Ｂ）。５Ｆ１抗ＧＩＴＲＬ抗体を含有する１０％のハイブリドーマ培養上清のアッセイへの添加は、部分的に（図５Ｂ）ないし殆ど完全に（図５Ａ）、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋を介した抑制の逆転に帰着した。１０Ｆ１２抗ＧＩＴＲＬ抗体の添加は、同様の結果を与えた。期待されるように、対照抗体（「対照Ｉｇ」）の存在は、抑制を逆転するためにＧＩＴＲＬ−ＹＢ２／０細胞の能力に賞賛される効果はなかった。これらのデータは、抗ＧＩＴＲＬ抗体は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の抑制活性を止めるＧＩＴＲＬの能力を遮断することを示した。
実施例６．３ 抗マウスＧＩＴＲＬ抗体はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在下でのみＴ細胞応答を抑制する
［０２２４］リンパ節細胞培養物は、様々な濃度の作動性抗ＣＤ３抗体の存在下で、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の枯渇前（図６Ａ）と枯渇後（図６Ｂ）で刺激し、そして、増殖をシンチレーションカウンティングを介して３Ｈ−チミジンの取り込みを決定することによって測定した。増殖における抗ＧＩＴＲＬ抗体の効果を決定するために、５Ｆ１抗ＧＩＴＲＬ抗体を含有する１０％のハイブリドーマの培養上清を並行培養に添加した。
［０２２５］図６Ａに示すように、細胞を約０．０７５μｇ／ｍｌないし約０．７５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体で刺激した場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有するリンパ節細胞の増殖を抑制した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有するリンパ節細胞を１．０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体で刺激した場合は、抗ＧＩＴＲＬ抗体の存在下では抑制は見られなかった。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含有するリンパ節細胞培養を用いて得られた結果とは対照的に、抗ＧＩＴＲＬ抗体の添加は、一般的に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇したリンパ節細胞培養物に抑制効果はなかった（図６Ｂ）。一緒にして、これらのデータは、抗ＧＩＴＲＬ抗体はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞に発現するＧＩＴＲと他の細胞に発現するＧＩＴＲＬとの間の相互作用を遮断すること、そして、このＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ相互作用の遮断は、免疫抑制を復帰するためのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の制御機能を増強することを示唆する。
実施例７
リンパ様組織におけるＧＩＴＲＬ発現細胞の分布
［０２２６］作動性抗ＧＩＴＲＬ抗体は、フローサイトメトリーによってマウス組織のＧＩＴＲＬの発煙を調べるために使用した。ＣＤ４のみ、ＣＤ８のみ、又はＣＤ４及びＣＤ８を発現する新鮮に単離したＣＤ１１ｃ＋脾臓樹状突起細胞（ＤＣ）の部分集合は、低レベルのＧＩＴＲＬを構築的に発現した（図７Ａ）。しかしながら、ＧＩＴＲＬの表面発現は、ＣＤ１１ｃｌｏｗＢ２２０＋形質細胞様樹状突起細胞のうち顕著に高かった（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００１）。図７Ｂにおいて、抗ＧＩＴＲＬ ｍＡｂ又はアイソタイプの対照での染色は、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の新鮮に単離したＣＤ１１ｃ＋脾臓ＤＣの指示した部分集合体においてなされた。
［０２２７］同様に、新鮮に単離したＢ２２０＋脾臓Ｂ細胞は、より高いレベルであるけれども、腹膜のＢ−１ Ｂ細胞（ｐｒｅＣ ＣＤ１１ｂ＋Ｂ２２０＋）と同様に、ＧＩＴＲＬを構築的に発現した（図７Ｃ、下）。
［０２２８］選択を受けている胸腺細胞の部分集合は、測定可能な量のＧＩＴＲＬを発現しなかった（図７Ｄ）。対照的に、図７Ｅに示されるように、ＧＩＴＲＬの発現は、ＣＤ４−ＣＤ８−胸腺前駆体のすべての部分集合に検出でき、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋（Ｒ２）及びＣＤ４４−ＣＤ２５＋（Ｒ３）部分集合は最も高いレベルで発現した。
［０２２９］ＧＩＴＲＬは、刺激していないリンパ節細胞では検出できなかった（図７Ｆ）。ＧＩＴＲＬはまた、刺激していない脾臓Ｔ細胞では検出できなかった（データ示さず）。これらのデータは、選択を受けていないＴ細胞（図７Ｄ）又は抹消の増殖期にないＴ細胞（刺激していないリンパ節及び脾臓細胞；図７Ｆ、及びデータ示さず）ではなく、プロフェッショナルな抗原提示細胞（ＤＣ、Ｂ細胞及びマクロファージ；図７Ａ−７Ｃ）及び胸腺ＣＤ４−ＣＤ８−前駆体さいぼう（図７Ｆ）によるＧＩＴＲＬの発現を示した。これらのデータは、実施例２に示されるノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、及びリアルタイムＰＣＲによって得られるデータと相関した（上述）。
実施例８
ＡＰＣはＴＬＲ刺激後のＧＩＴＲＬを下方制御する
［０２３０］ＧＩＴＲＬ発現におけるＢ細胞活性の効果は、トール様受容体（ＴＬＲ）リガンド、又は抗ＣＤ４０及びＩＬ−４、又は抗ＩｇＭで処理した後に調べた。脾臓Ｂ細胞（Ｂ２２０＋脾臓細胞）又は腹膜Ｂ−１ Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｂ＋ＰｅｒＣ）の刺激は、急速であり一時的なＧＩＴＲＬの上方制御に帰着し、殆どの処置の４時間後に見られた（図８Ａ）。刺激の４８−６０時間後には、発現は、安定した刺激前を下回るように下がった。例外は、腹膜腔由来のポリＩ：Ｃで処理したＢ−１ Ｂ細胞であり、試験した時間点の間でこの下方制御を示さなかった。期待されるように、ＣＤ８６のレベルは、全てのグループで実験の過程で増加し、観察されたＧＩＴＲＬの下方制御は、細胞死に派生しなかったことを示した。
［０２３１］抗ＣＤ４０及びＩＬ−３で処理した後のＢ細胞によって発現したＧＩＴＲＬの減少は、Ｔ細胞ヘルプの供給の後に変化することができた。全脾臓細胞のうちＢ細胞によるＧＩＴＲＬ発現は、抗ＣＤ３抗体と一緒に培養した後に評価した。これらの培養条件下で、Ｂ２２０＋脾臓細胞におけるＧＩＴＲＬ発現はまた、４８時間後に下方制御された（図８Ｂ）。このように、Ｔ細胞活性の生理学的なレベルはまた、脾臓Ｂ細胞によるＧＩＴＲＬの発現における減少へと導いた。
［０２３２］脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣは、磁気ビーズで濃縮し、ＬＰＳの存在下で培養１２及び３６時間後にＧＩＴＲＬの発現を調べた。ＤＣは、初期の１２時間、培養液又はＬＰＳで発現したＧＩＴＲＬで培養し、ＬＰＳにより適度の上方制御を誘導した。しかしながら、３６時間まで、ＧＩＴＲＬの発現は、ＬＰＳで処理したＤＣ、並びに培養液のみで培養したものでは検出できなかった。図８Ｃは、指定した時間でのＬＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）と伴に、又は伴わない培養後に、精製したＣＤ１１ｃ＋ＣＤによるＧＩＴＲＬ（上部のヒストグラムパネル）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）（下部のヒストグラムパネル）の発現を示す。示すように、ＣＤ８６（Ｂ７．２）発現は、期待されるように上方制御された（Ｂａｕｃｈｅｒｅａｕ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，１９９８）。培養液で培養した脾臓ＤＣによるＧＩＴＲＬ発現の減少は、インビトロでの培養中に発生する「自発的な」ＣＤ成熟（Ｖｒｅｍｅｃ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｍａｎ，１９９７）はＧＩＴＲＬの発現を下方制御するのに十分である。このため、ＤＣはＢ細胞について示された同じ処置に供されたけれども、ＬＰＳ刺激後の結果のみが示される。別の公開された報告（Ｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）の結果に類似して、骨髄由来のＤＣはＧＩＴＲＬを構成的に発現し、そして、そのような発現は、様々なＴＬＲリガンドでの処置後にたった僅かに減少したことが見出された（データ示さず）。
［０２３３］ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方は、可溶性抗ＣＤ３抗体の不在（「＋Ｍｅｄ．」）又は存在（「＋ａＣＤ３」）下で脾臓細胞の培養４８時間後にＧＩＴＲＬの測定可能なレベルを発現し（図８Ｄ）、前リアルタイムＰＣＲを確かめた（実施例２もまた参照）。
実施例９
ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ相互作用の遮断はリンパ球増殖を阻害する
［０２３４］ＧＩＴＲＬはＡＰＣによって構成的に発現したので、及び、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ相互作用がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制性機能を廃止するように提案したので、２次のリンパ節様器官に耐性のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の内因性の母集団によって仲介される抑制を増強する抗ＧＩＴＲＬ抗体の能力を試験した。全リンパ節細胞（ＬＮ）、全脾臓細胞（Ｓｐ）、及びＣＤ２５＋細胞を枯渇したＬＮ又はＳｐ（Δ２５）の増殖応答の比較をし、各細胞は、抗ＧＩＴＲＬ抗体（黒丸）又は対照抗体（ラットＩｇＧ；白丸）で培養した。抗ＧＩＴＲＬ抗体の添加は、全リンパ節細胞の増殖応答を減少し（図９Ａ、上左）、より小さい程度まで全脾臓細胞の増殖応答を減少した（図９Ａ、下左）。しかしながら、阻害性効果はまた、ＣＤ２５＋細胞を枯渇した培養で見られ（図９Ａ、上右（ＬＮ）；下右（Ｓｐ））、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ相互作用はＣＤ２５−Ｔ細胞について同時刺激を提供するという可能性が上昇した。
［０２３５］この可能性を直接試験するために、精製したＣＤ４＋ＣＤ２５−及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖応答が、ＡＰＣ及びＧＩＴＲＬを発現するＹＢ２／０の存在下で試験した。ＣＤ４＋ＣＤ２５−及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、ＧＩＴＲＬ発現細胞の存在下で実質的に増加し（図９Ｂ）、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の抗ＣＤ３の低い濃度で具体的に明白となった。
［０２３６］増殖期にないＴ細胞がＧＩＴＲの低いレベルでのみ発現するので、抗ＧＩＴＲＬ抗体はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞に作用することによってその効果を仲介することが矛盾しているようであるかもしれない。しかしながら、ＧＩＴＲＬ発現がＴ細胞活性後に急速に上方制御されることを示すことによってその矛盾は解決され（図９Ｃ）、活性化後４８−７２時間で最大のレベルに達する。これらの結果は、可能性のＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ相互作用が制御ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞と独立してＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞に影響を与え得ることを支持する。
実施例１０
抑制の回復はＣＤ２５−Ｔ細胞によるＧＩＴＲ発現を要求する
［０２３７］以前の研究は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるＧＩＴＲの連結は、それらの抑制性容量を阻害したことを示唆した（ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ，２００２；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，２００２）。しかしながら、活性化したＴ細胞はまたＧＩＴＲを発現するので、本出願人は、抑制の廃止に帰着するＧＩＴＲ関与の関連する細胞性標的を決定するように努めた。ＧＩＴＲ＋／＋及びＧＩＴＲ−／−マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の組合せを用いる同時培養において、抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ（ＤＴＡ−１）の存在又は不存在のいずれかにおいて増殖を測定した（図１０）。以前に報告されるように（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，２００２）、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の両方がＧＩＴＲを発現した場合、同時培養への抗ＧＩＴＲ ｍＡｂの添加は、アイソタイプの抗体を受け入れる同時培養と比較して、増殖応答の増加に帰着した（図１０Ａ、パネルａ）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ではなくＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞が同時培養においてＧＩＴＲを発現した場合、抗ＧＩＴＲ抗体の添加は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞がＧＩＴＲを発現した場合に見られるのと同様のＴ細胞増殖における増大へと導いた（図１０Ａ、パネルｂ）。しかしながら、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＧＩＴＲ−／−及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＧＩＴＲ＋／＋Ｔ細胞の同時培養において、抗ＧＩＴＲ抗体の添加は、増加に影響しない（図１０Ａ、パネルｃ）。期待されるように、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＧＩＴＲ−／−及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＧＩＴＲ−／−Ｔ細胞の同時培養への抗ＧＩＴＲ抗体の添加はまた、Ｔ細胞の増加に影響しなかった（図１０Ａ、パネルｄ）。上述と同様に結果は、商業的に得られるポリクローナル抗ｍＧＩＴＲ抗体の調製で得られた（データを示さず）。
［０２３８］抑制の廃止はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって発現されるＧＩＴＲの連結の共通配列であったという仮説を支持する強力な証拠は、以前の研究で得られ、ラットのレスポンダー及びマウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の組合せを使用した（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，２００２）。これらの研究において使用される抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ（ＤＴＡ−１）をラットにおいて生成したが、結論としてラット細胞に結合しなかった（ｉｄ）。上述したものに類似の実験は、ラットＣＤ４＋ＣＤ２５−レスポンダー、マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋サプレッサー、及び照射したラットＡＰＣの同時培養を用いて実行した（図１０Ｂ、パネルｂ）。同時培養したＣＤ４＋ＣＤ２５−レスポンダー、マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋サプレッサー、及び照射したラットＡＰＣを対照としてインキュベートした（図１０Ｂ、パネルａ）。ＧＩＴＲが増殖期にないＣＤ２５−母集団に架橋できなかったとしても（図１０Ｂ、パネルａ）、ＧＩＴＲ−／−マウスから得られたデータに類似して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋を介した抑制の廃止は発生しなかった（図１０Ｂ、パネルｂ）。
［０２３９］ラット／マウスシステムの更なる解析は、フローサイトメトリーによって、ラットＣＤ４＋ＣＤ２５−及びマウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の同時培養によりＣＦＳＥの希釈を調べることによって達成した。アイソタイプの対照抗体の存在下で、ラットＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、１：８のレスポンダーに対するサプレッサーの比で培養した場合、マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞によって部分的にのみ抑制した（図１０Ｃ、左ヒストグラムパネル）。しかしながら、抗ＧＩＴＲ抗体の添加は、マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の付加的な拡張、及びラットＴ細胞の抑制における結果としての増加へと導いた（図１０Ｃ、右ヒストグラムパネル）。ＧＩＴＲ連結後のマウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の増加したＣＦＳＥ希釈は、遮断抗ＣＤ２５抗体の添加によって部分的に阻害することができ、レスポンダーＴ細胞によって初期になされたＩＬ−２はまた、この拡張について要求されなかった（データ示さず）。加えて、これらの結果は、レスポンダーＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＧＩＴＲの増加は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を介した抑制を克服するために要求されることを明確に示す。
実施例１１
ＧＩＴＲシグナルの発現は内因性の制御性Ｔ細胞によって仲介される抑制を制御し克服するために要求される
［０２４０］ＣＤ２８及びＧＩＴＲの両方は、Ｔ細胞の活性化中の同時刺激性シグナルを提供しているようなので、本出願人は、初期の応答の間に明確な役割を果たすのかどうかを決定するように努めた。内因性のリンパ節ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存否において、及び該因性ＩＬ−２の存否において、Ｔ細胞増殖を促進するＧＩＴＲ及びＣＤ２８の能力を比較した（図１１）。増殖研究について使用した同じ試料は、７２時間の培養期間の後、ＣＦＳＥについて同時にアッセイした。外因性ＩＬ−２の不在下で、ＧＩＴＲ−／−及びＣＤ２８−／−の両方の動物由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は増殖しなかった（図１１Ａ、パネルａ）。ＧＩＴＲ＋／−動物由来のＬＮ細胞は、野生型及びＧＩＴＲ−／−動物との間の表現型の中間体を示した（図１１Ａ、パネルａ）。野生型マウス由来のＴ細胞応答は、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の希釈後に有意に増強し、これらの培養条件下での抑制は、正常なリンパ節に存在するＣＤ２５＋Ｔ細胞によって仲介されることを示す（図１１Ａ、パネルａとｂとの比較）。最も重要なことに、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の不存在で、ＧＩＴＲ−／−マウス由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ節Ｔ細胞の応答は、３Ｈ−チミジン取り込み（図１１Ａ、パネルｂ）及びＣＳＦＥ希釈（図１１Ｂ、上段のパネル）によって評価されるように野生型のマウスと比較することができる。しかしながら、７２時間後、ＣＤ２８−／−動物のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の不在でさえ増殖しなかった（図１１Ａ、パネルｂ）。
［０２４１］外因性のＩＬ−２がそのままのリンパ節細胞の培養に添加した場合に、応答の変化する異なるパターンが観察された。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、３Ｈ−チミジン取り込み（図１１Ａ、パネルｃ）、又はＣＦＳＥ希釈の欠如（図１１Ｂ、中間のパネル類）によって評価されるように、ＧＩＴＲの不在で完全に阻害した。対照的に、ＣＦＳＥプロファイルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が測定した増殖に多いに関係することを示した（図１１Ｂ）けれども、ＣＤ２８−／−動物由来のＴ細胞の測定可能な増殖は、３Ｈ−チミジン取り込みによって検出した（図１１Ａ、パネルｃ）。ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下で、全ての動物のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を枯渇したリンパ節は、３Ｈ−チミジン取り込み（図１１Ａ、パネルｄ）及びＣＦＳＥ希釈（図１１Ｂ、下段のパネル類）によって評価したように増殖の同様のレベルを示した。一緒になって、これらの結果は、ＧＩＴＲ−／−及びＣＤ２８−／−マウスにおけるＴ細胞活性の欠如が区別されることを示す。
［０２４２］外因性ＩＬ−２の存在下で増殖するＧＩＴＲ−／−マウスのリンパ節に存在する全Ｔ細胞の阻害は、高アフィニティーＩＬ−２受容体の発現がこれらの動物に影響しないかもしれないことを示唆した。ＩＬ−２Ｒα鎖の発現は、そのリガンドによって初期に誘導するので（Ｄｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｍａｋｅｋ ａｎｄ Ａｓｈｗｅｌｌ，１９８５）、この鎖を発現するＧＩＴＲ−／−マウス由来の抗ＣＤ３で活性化したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の能力は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の存否、及びＩＬ−２の存否で試験した（図１１Ｃ）。制御性Ｔ細胞の存在下で、同時培養へのＩＬ−２の添加は、培養２４時間後、ＧＩＴＲ−／−ではなく、ＧＩＴＲ＋／＋のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞によるＣＤ２５の増加した発現に帰着した（図１１Ｃ、下段右ヒストグラムパネル）。しかしながら、ＩＬ−２を誘導するＣＤ２５の発現を受けるＧＩＴＲ−／−ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の能力は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を除去することによって容易に戻すことができた（図１１Ｃ、下段左ヒストグラムパネル）。このように、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在で、ＧＩＴＲ−／−Ｔ細胞によるＩＬ−２応答性における減損は、野生型細胞におけるＣＤ２５発現を誘導するのに十分な外因性ＩＬ−２の濃度の存在下で高アフィニティーＩＬ−２受容体を発現することができないことに少なくとも部分的には依存していた。
実施例１２
ＣＤ２８依存性の同時刺激はＧＩＴＲ発現及び応答性を増強する
［０２４３］上記に提示したデータは、ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＧＩＴＲ又はＣＤ２８のいずれかの増加が、レスポンダーＴ細胞に抑制を逃れ得るようにするシグナルを提供するが、この過程に関わるシグナルの性質は不明のままであった。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の存在下でＩＬ−２によるＣＤ２８−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖応答の部分的な救済は、ＣＤ２８／Ｂ７シグナリングがＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ相互作用に対するＴ細胞の感受性を制御するかもしれないことを示唆した。さらに、以前の研究は、ＣＤ２８−ＣＤ８０／ＣＤ８６相互作用がいくつかのＴＮＦＲファミリーメンバーの発現を増強することができることを示している（Ｇｉｆｆｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）。このように、本出願人は、ＧＩＴＲに関連するこの可能性を調べた。ＣＤ２８−／−又は野生型マウス由来の精製したＣＤ４＋ＣＤ２５−及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、刺激を受けないままであるか、又はプレートに結合した抗ＣＤ２８抗体の存否でプレートに結合した抗ＣＤ３抗体の低い濃度で活性化されるかのいずれかであった（図１２Ａ）。抗ＣＤ３抗体にだけ晒した野生型Ｔ細胞は、ほんの僅かにＧＩＴＲを制御したけれども、ＣＤ４＋ＣＤ２５−及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方によるＧＩＴＲの発現は、抗ＣＤ２８の包含によって顕著に増大した。
［０２４４］同様に、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＧＩＴＲ発現の上方制御は、抗ＣＤ８０／ＣＤ８６（抗Ｂ７．１／Ｂ７．２）の添加によって著しく阻害した（図１２Ｂ、左ヒストグラムパネル）。ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞によるＧＩＴＲの上方制御が抗ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ ｍＡｂを含有する培養において妨げなかったので、ＧＩＴＲ抗ＣＤ８０／８６を含有する培養におけるＧＩＴＲ発現の阻害は、ＩＬ−２の減少した産生に派生しなかった（図１２Ｂ（右ヒストグラムパネル））。
［０２４５］ＣＤ２８由来の同時刺激シグナルによって誘導されたＧＩＴＲの増加した発現は、ＧＩＴＲシグナリングに対する増加した応答に相関した（図１２Ｃ）。抗ＧＩＴＲ抗体の添加は、野生型マウス由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の両方の増殖を実質的に増強した（図１２Ｃ、左パネル）。しかしながら、抗ＣＤ８０／ＣＤ８６はこれらの培養に添加した場合、抗ＧＩＴＲ抗体の存在は、唯一、試験した抗ＣＤ３の濃度範囲を超えて、ＧＩＴＲ＋／＋ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（図１２Ｃ、ＧＩＴＲ＋／＋、上段左；ＧＩＴＲ−／−、上段右）及びＧＩＴＲ＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１２Ｃ、ＧＩＴＲ＋／＋、下段左；ＧＩＴＲ−／−、下段右）の増殖を最低限に増加した。抗ＧＩＴＲでの処置は、ＧＩＴＲ−／−マウス由来の精製したＣＤ４＋ＣＤ２５−及びＣＤ８＋Ｔ細胞の応答に影響しなかった（図１２Ｃ、右パネル）。これらのデータは、ＣＤ２８を介したシグナルが、ＩＬ−２産生の同時刺激とは異なり、ＧＩＴＲ発現を増強し、そして、ＧＩＴＲを介したシグナリングを促進することを示唆する。
実施例１３
ＧＩＴＲへのＧＩＴＲＬ結合はエフェクターＴ細胞への同時刺激性シグナルを提供する
［０２４６］４万個のエフェクターＨＴ−２ Ｔヘルパー細胞（ＧＩＴＲ＋／ＴＣＲ＋）を下記の試薬：１）１：１又は１：２の比の抗ＣＤ３で被服したビーズ、２）ＧＩＴＲＬを発現するように修飾していない（ＹＢ２／０親）、又はＧＩＴＲＬを発現するように修飾している（ＹＢ２／０ ｍｕＧＩＴＲＬ）のいずれかであった１万個のＹＢ２／０細胞、そして、３）濃度増加しているアイソタイプの対照抗体又は４つの異なる抗ＧＩＴＲＬ抗体（５Ｆ１、ＭＧＴＬ−１０、ＧＭＴＬ−１５、又はポリクローナル抗ＧＩＴＲＬ抗体）の存否で培養した。４４時間の培養器官の少なくとも５時間については、３Ｈ−チミジンの取り込みによって増殖を測定した。図１３Ａは、ＧＩＴＲＬが抗ＣＤ３で刺激したＴ細胞の増殖を増大することを示す。加えて、ＧＩＴＲＬを介したＴ細胞増殖の増大は、５Ｆ１抗体で遮断するが、アイソタイプの対照抗体（図１３Ｂ）、及び商業的に利用できるＭＧＴＬ−１０、ＭＧＴＬ−１５及びポリクローナル抗ＧＩＴＲＬ抗体（図１３Ｃ）では遮断しないかもしれない。これらの結果は、ＧＩＴＲＬが同時刺激性シグナルを提供すること、また、５Ｆ１がＧＩＴＲＬに対する中和抗体であることの更なる証拠を提供する。
実施例１４
抗ＧＩＴＲＬ抗体を用いたＧＩＴＲ−ＧＩＴＲＬ結合の遮断は実験的な自己免疫の脳脊髄炎を誘導するＰＬＰの養子移転を妨げる
［０２４７］９週齢のメスＳＪＬマウスを完全なＦｒｅｕｎｄアジュバント中の１５０μｇのＰＬＰペプチド（アミノ酸１３９−１５１）［ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ（配列番号：１２）］で免疫した。免疫１０日後、脾臓細胞を回収し、１０μｇ／ｍｌの抗体（抗ＧＩＴＲＬ抗体又は対照抗体）の不在（処理なし）又は存在下で１０μｇ／ｍｌのＰＬＰ（アミノ酸１３９−１５１）で３日間、エクスビボで再刺激した。再刺激後、５×１０６個の脾臓細胞を１０週齢の実験を受けていないＳＪＬマウスに養子的に移転し、実験的自己免疫の脳脊髄炎についてマウスを５２日間監視し、０から５のスケールで測定した。いずれの抗体も不在（処置なし）で再刺激した脾臓細胞を受け入れたマウス、及び対照抗体（ＣＫ０１）の存在下で再刺激した脾臓細胞を受け入れたマウスのそれぞれ４０％と８０％でＥＡＥが発症した（図１４）。加えて、処置なしの脾臓細胞を受け入れた動物と、対照抗体で処置した脾臓細胞を受け入れた動物との間での疾患スケールでの有意な違いはなかった。顕著に、抗ＧＩＴＲＬ抗体（５Ｆ１）の存在下で再刺激した脾臓細胞を受け入れたマウスのいずれもＥＡＥ（ｐ＝０．００２３対対照抗体処置）を発症しなかった（図１４）。これらのデータは、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ経路の処断が抑制を克服するＣＤ２５−Ｔ細胞の能力を制限し、それによって自己免疫応答に影響するそれらの能力を下方制御することを示唆する。
実施例１５
実験手法
実施例１５．１：抗体及び試薬
［０２４８］フローサイトメトリー又は機能研究について使用される全ての抗体は、以下を除き、ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎからであり、トリカラー標識したａＣＤ４（クローンＣＴ−ＣＤ４）及びａＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２）はＣａｌｔａｇ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）から購入し、ＭＧＴＬ−１０、ＭＧＴＬ−１５、及びポリクローナル抗ＧＩＴＲＬ抗体は、Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ヤギ抗ＩｇＭμ鎖の精製したＦ（ａｂ’）２断片は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。抗ＩＬ−２（クローンＳ４Ｂ６）は腹水流体として使用した。ヒト組換えＩＬ−２は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から得た。ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、及びＴ細胞濃縮カラムはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。（クローン５Ｆ１；同じくクローン１０Ｆ１２）及び抗ＧＩＴＲ（クローンＤＴＡ−１）及びＰＬＰペプチドは、「内部」で調製した。抗Ｂ２２０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８、ＣＤ４及びＰＥ磁気ビーズはＭｉｔｅｎｙｉ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）から購入した。
実施例１５．２：マウス
［０２４９］ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７Ｂ１／６マウス（６−８週齢のメス）はＮＣＩ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ａｎｉｍａｌ ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から購入した。ＣＤ２８−／−マウスは、Ａｌｆｒｅｄ Ｓｉｎｇｅｒ博士（ＮＩＨ／ＮＣＩ）から提供を受けた。ＧＩＴＲ＋／−胎児（Ｓｖ１２９ｘＢ６）はＣ．Ｒｉｃａｒｒｄｉ（Ｐｅｒｕｇｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｉｔａｌｙ）（Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）から提供された。再誘導したＧＩＴＲ＋／−マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで一度、戻し交配し、結果の後継者はＰＣＲによって突然変異の対立遺伝子についてスクリーニングした。同定したＧＩＴＲ＋／−後継者は、次いで、ＧＩＴＲ＋／−マウスを発生するように交雑させた。全てのマウスは、ＳＰＦ（特異的病原菌なし）の条件下でＮＩＨ／ＮＩＡＩＤ ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓで飼育され収容した。
実施例１５．３：ｃＤＮＡクローニング及び発現
［０２５０］ヒトＧＩＴＲＬ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ ００５０９２）についてのアミノ酸配列は、ｍＧＩＴＲＬのＣｅｌｅｒａデータベースを探索するために使用した。ゲノム配列ｇａ ｘ５ｊ８ｂ７ｗ７ｗｊ５ ０４１．ｃｍ ａａ ２は、３つの高スコア対（ＨＳＰ）領域を含有した。これらの領域がマウスのＧＩＴＲＬのエクソンに対応するという仮定に基づいて、ＰＣＲ増幅用のプライマーを設計した。フォワードプライマー（５’−ＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＧ−３’）（配列番号：４）及びリバースプライマー（５’−ＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＣＡＧＧＣＡＴＴＡＡＧＡＴＧ−３’）（配列番号：５）は、マウス胸腺ライブラリーからｃＤＮＡクローンをサブクローニングした。結果の断片をサブクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。次の全長のクローンは、５’−ＴＴＴＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＧ−３’（フォワード）（配列番号：６）及び５’−ＴＴＴＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＣＡＧＧＣＡＴ−３’（リバース）（配列番号：７）プライマーを用いて前述の構築物からＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ断片は、ＧＦＰ−ＲＶレトロウイルスベクター（Ｏｕｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）にサブクローニングし、最終のｃＤＮＡクローンの配列決定を行った。このベクターは、次いで、Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＰｈｏｅｎｉｘ細胞の上清を用いて、ＹＢ２／０細胞株に遺伝子導入した。ＧＦＰ発現ＹＢ２／０細胞は、次いで、ＦＡＣＳソートされ、培養に維持した。予期したｍＧＩＴＲＬアミノ酸配列は、別のグループ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）のものと同一であるが、それらの配列の４８位のアミノ酸でアラニンからバリンへの置換があった。
実施例１５．４：モノクローナル抗体の産生及び精製
［０２５１］ＬｅｗｉｓラットをＣＦＡ中の１００×１０６個のＹＢ２／０−ＧＩＴＲＬで一度、ｓ．ｑ．で免疫した。２週間後、これらのラットは、ＩＦＡ中の１００×１０６個のＹＢ２／０−ＧＩＴＲＬ細胞でｓ．ｑ．で免疫した。２週間後、ラットをＰＢＳ中の５０×１０６個のＹＢ２／０−ＧＩＴＲＬでブーストした。４日後、脾臓を回収し、前記されるように細胞融合した（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。結果物のハイブリドーマの上清をＰｈｏｅｎｉｘ−ＧＩＴＲＬ及びＰｈｏｅｎｉｘ細胞を用いて、フローサイトメトリーでスクリーニングした。プロテインＧを充填したカラムを用いて、細胞培養上清から抗体を精製し、溶出した抗体はＰＢＳに対して透析した。
実施例１５．５：細胞精製
［０２５２］マウスの周辺リンパ節からＴ細胞を精製した。ＣＤ２５＋Ｔ細胞を磁気ビーズで標識し、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｍ，ＣＡ）により製造業者のプロトコールに従って精製した。ＣＤ２５＋細胞の純度は、典型的には９７−９９パーセントの間であった。陰性画分に残存している細胞は、その後、抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８のマイクロビーズで標識し、ａｕｔｏＭＡＣＳで陽性選択手法を用いて精製した。純度は、通常、９０−９５パーセントであった。Ｔ細胞を枯渇した脾臓の懸濁液は、ａｕｔｏＭＡＣＳを用いてＴｈｙ１．２＋細胞を枯渇することで赤血球溶解懸濁液から調整した。Ｂ２２０＋細胞は、抗Ｂ２２０マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて、同様のやり方で脾臓細胞から精製し、冷却ＨＢＳＳの１０ｍｌで腹腔（ＰｅｒＣ）を洗い流すことによって調製した。脾臓ＤＣについては、脾臓細胞の懸濁液を記載した（Ｖｒｅｍｅｃ ｅｔ ａｌ．，２０００）のと同じ方法で調製した。脾臓ＤＣは、次いで、抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いて懸濁液から精製した。得られたＤＣ懸濁液は、通常、８５−９０パーセントの純度であった。ラットＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞は、ＰＥ抗ラットＣＤ２５（ＯＸ−３９）抗体、続く抗ＰＥマイクロビーズを用いてＣＤ２５＋細胞のラット脾臓細胞を枯渇することで発生させた。枯渇後、ＣＤ４＋細胞は、次いで、抗ラットＣＤ４マイクロビーズを用いて枯渇した画分から選択した。
実施例１５．６：インビトロ増殖アッセイ
［０２５３］抑制アッセイは、記載されるように実行した（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ａｎｄ Ｓｈｅｖａｃｈ，１９９８）。簡単には、（５×１０４）細胞は、９６ウェルの平底プレートで０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ ｍＡｂ（２Ｃ１１）の存在下で、照射（３０００Ｒ）したＴ細胞を枯渇した脾臓細胞（５×１０４）と一緒に、ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）で培養した。同じ培養に、ＧＩＴＲに特異的な抗体又はラットＩｇアイソタイプを最終濃度２μｇ／ｍｌで添加した。滴定した数のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞をサプレッサー：レスポンダーの最終比を０：１、１：２、１：４、又は１：８で添加した。７２時間培養の最後の５−８時間に１μＣｉの３Ｈ−チミジンで培養物をパルスし、他の指示がなければ３重で実行した。ラット及びマウスのＴ細胞の同時培養を同様の方法で準備をしたが、照射（３０００Ｒ）したＣＤ４を枯渇したラット脾臓細胞は、ＡＰＣとして使用し、ラットとマウスのＴｓａｉｂｏｕは、抗らったＣＤ３（０．２５μｇ／ｍｌ）及び抗マウスＣＤ３（０．２５μｇ／ｍｌ）ｍＡｂのカクテルを用いて刺激した。
実施例１５．７：リンパ節細胞のインビトロ培養とＣＦＳＥ標識
［０２５４］ＣＤ２５＋を枯渇したリンパ節細胞の懸濁液を上述したようにａｕｔｏＭＡＣＳで調製した。３７℃の温浴中で、８分間、２μＭの濃度でＣＦＳＥで細胞を標識した。次いで、完全なＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。その後、ｒｈＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）の存在又は不存在下で、９６ウェルプレートで細胞（５×１０４／ウェル）を培養した。
実施例１６
考察
［０２５５］ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の機能におけるＧＩＴＲの役割は、ＧＩＴＲに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体がＣＤ２５＋Ｔ細胞及びＣＤ２５−Ｔ細胞の同時培養系に添加した場合、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制効果を逆転してという証拠から推察された（ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＧＩＴＲ試薬に有望な標的であるらしく、これは、新たに外植したＣＤ２５＋Ｔ細胞が、増殖期にないＣＤ２５−Ｔ細胞より高いレベルでＧＩＴＲを発現し、そして、ＩＬ−２とともに抗ＧＩＴＲ抗体はＴＣＲシグナルの不在下でＣＤ２５−Ｔ細胞ではなく、ＣＤ２５＋の増殖の引き金となったためである。さらに、Ｓｈｉｍｉｚｕらは、マウスＣＤ２５＋サプレッサー及びラットレスポンダーＴ細胞の同時培養系に、ラット細胞では反応しないラット抗ｍＧＩＴＲ ｍＡｂを添加した場合、抑制の逆転が観察された。これらの研究は、作動性抗ＧＩＴＲ抗体、及び、恐らく、その生理学的なリガンドによってＧＩＴＲの関与は、両者がＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制活性を阻害し、そして、内因性のＩＬ−２に対するＣＤ２５＋Ｔ細胞の非応答性を逆転するシグナルを発生したという仮説を導いた。
［０２５６］実験は、これらの研究を拡張し確認する試みのために設計し、マウスＧＩＴＲＬをクローニングし、その組織分布を解析し、そして、野生型及びＧＩＴＲ−／−マウス由来のＣＤ２５＋Ｔ細胞及びＣＤ２５−Ｔ細胞の混合物を用いることによる作動性抗ＧＩＴＲ抗体の標的を最終的に決定した。まとめると、本研究は、抗ＧＩＴＲ抗体及びＧＩＴＲＬが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞による抑制のそれらの最低基準を生じる独特のシグナルをＣＤ２５−Ｔ細胞に与えることによって、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制効果を廃止することを示す。本研究は、ＧＩＴＲＬはＡＰＣの細胞表面上で選択的に発現することを示し、Ｂ−１ Ｂリンパ球では最も高い発現レベルであり；慣習的なＢ−２ Ｂリンパ球、マクロファージ、及びＢ２２０＋ＤＣでは中間レベルであり；そして、Ｂ２２０−ＤＣの一部の集合体ではより低いレベルである。ＧＩＴＲＬは、増殖期にないＡＰＣ上に発現するＴＮＦスーパーファミリーのメンバーのうち独特であり、その発現は、Ｂ細胞受容体、ＣＤ４０、又は異なるトール様受容体を誘引することによって下方制御される。ＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバー（４−１ＢＢ−Ｌ、ＯＸ４０−Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ７０、Ｃ３０−Ｌ）は、増殖期にないＡＰＣにおいて検出できず、それらの発現は、トール様の受容体刺激を通してＡＰＣの活性化により上方制御される（Ｃｒｏｆｔ，２００３）。本研究は、細胞表面からのＧＩＴＲＬ発現の下方制御が可溶性ＧＩＴＲＬの分泌により達成するかどうかを扱ったものではないが、Ｔｏｎｅら（２００３）は、ＤＣ、マクロファージ及びＢ細胞のＬＰＳ刺激がＧＩＴＲＬ ｍＲＮＡの下方制御に帰着すると報告している。増殖期にないＡＰＣにおけるＧＩＴＲＬの発現は、Ｔ細胞活性化の過程の初期に機能することを強く示唆する。内皮細胞（Ｇｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、活性化したＴ細胞、及びある部分集合のＤＮ胸腺細胞を含む他の細胞タイプはまた、ＧＩＴＲＬを発現することを示し、そして、これらの後者の細胞タイプにおけるこの分子の機能は決定されたままである。
［０２５７］ＣＤ２５−Ｔ細胞単独の活性を増大するための抗ＧＩＴＲ抗体及びＧＩＴＲＬ発現細胞の両者の能力、並びにＣＤ２５＋Ｔ細胞の不在下でＣＤ２５−Ｔ細胞の活性を部分的に阻害する抗ＧＩＴＲＬの能力は、これらの試薬の細胞標的（単数又は複数）の注意深い再試験を促した。野生型及びＧＩＴＲ−／−マウス由来のＣＤ２５−Ｔ細胞及びＣＤ２５−Ｔ細胞の同時培養系への抗ＧＩＴＲの添加は、抗体を介した抑制の逆転の標的がＣＤ２５−Ｔ細胞であることを示した。これはさらに、培養系におけるラットＣＤ２５−レスポンダー及びマウスＣＤ２５＋サプレッサーＴ細胞を用いる実験によって支持され、最終的に、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の部分集合におけるＧＩＴＲ接続がそれらの抑制機能を廃止しないことを示した。実際に、ＣＦＳＥ希釈の試験は、ＧＩＴＲ接続が培養系におけるＣＤ２５＋Ｔ細胞の拡張を促し、結果として、ラットＣＤ２５−レスポンダーの抑制を増強した。したがって、可能性として、抗ＧＩＴＲ処理したラット／マウスの同時培養における増殖の増強は、Ｓｈｉｍｉｚｕら（２００２）によって報告され、ラットＴ細胞、実際には、マウスＣＤ２５＋サプレッサーＴ細胞の反映した増殖に依存していると想定された。これは、３Ｈ−チミジンの取り込みだけを測定することによっては明らかにならなかった。
［０２５８］１つの以前の報告では、ＧＩＴＲ欠損Ｔ細胞がＴＣＲ刺激に過剰応答であることを示唆した（Ｒｏｎｇｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。しかしながら、本観察へのそれらの観察の外挿は、報告が精製したＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の応答を解析せず、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の役割を評価しなかったように困難である。本研究において、ＧＩＴＲ−／−マウス由来の高度に精製したＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の応答は、対象のそれと比較することができた。しかしながら、生理学的数の制御性Ｔ細胞において、ＧＩＴＲ−／−動物由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両者は、ＣＤ３架橋に完全に応答しなかった。この結果は、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬの不在下で、抑制が有力であることを明らかに示した。確かに、ＧＩＴＲ−／−マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の活性化の抑制は、非常に強力であったので、高濃度の外因性ＩＬ−２の添加によって克服することができず、野生型ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の応答における非常に高い数のＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制効果を正常に廃止する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ａｎｄ Ｓｈｅｖａｃｈ，１９９８）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の抑制効果は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＧＩＴＲ−／−レスポンダー群によるＩＬ−２産生及びＣＤ２５の発現の両方の阻害によって仲介され、正常なＣＤ８＋Ｔ細胞応答におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の効果について以前に記載したもの（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏ ａｎｄ Ｓｈｅｖａｃｈ，２００１）に似ている。
［０２５９］ＧＩＴＲ及びＣＤ２８によって誘導された同時刺激性シグナルは、区別されるが、相互に関係するようであった。制御性Ｔ細胞の不在下で、ＧＩＴＲ−／−マウス由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の応答は、野生型マウス由来の細胞のそれらと同一であった。対照的に、本研究に使用される培養条件下では、ＣＤ２８−／−マウス由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は非応答的であった。反対に、ＩＬ−２を制御性Ｔ細胞を含有する培養系に添加した場合、ＧＩＴＲ−／−マウス由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の応答は復活せず、一方、ＣＤ２８−／−マウス由来のＣＤ８＋細胞の応答は部分的に復活した。他方、ＣＤ２８とＧＩＴＲとの間の潜在的な同時操作の関係及び共有したシグナル階層は、下記：（１）ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞はＣＤ２８架橋の不在下でＧＩＴＲを上方制御しないこと、そして（２）抗ＣＤ８０／ＣＤ８６抗体はＧＩＴＲ発現の上方制御と抗ＧＩＴＲ抗体に対する応答性の両方を顕著に阻害したことの証拠によって支持された。このように、結果は、Ｔ細胞の活性化中のＣＤ２８−ＣＤ８０／ＣＤ８６シグナル経路の追加の重要な機能が、ＧＩＴＲの発現及び機能を増強することによるＣＤ２５＋を介した抑制に耐性であるＴ細胞を許可するはずであることを示唆する。
［０２６０］他の公開された研究（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）によって示唆された結果に類似して、これらの研究は、制御性Ｔ細胞の不在下で、ＣＤ２５−Ｔ細胞におけるＧＩＴＲの連結が有る程度の同時刺激を提供したことを示す。しかしながら、ＧＩＴＲ連結は、ＣＤ２８と同じ方法でＣＤ２５−Ｔ細胞を同時刺激することについて要求されず、それは、ＧＩＴＲ−／−マウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞が野生型Ｔ細胞と類似して応答するためである。本出願人は、免疫応答の経過の初期にＧＩＴＲＬによるＣＤ４＋ＣＤ２５−及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の両方におけるＧＩＴＲの関与が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制効果に耐性であるように、例えば、より感受性でないようにエフェクター細胞群にするために主に役立つという見解を好む。応答の経過中に、炎症性シグナルは、最終的に、ＧＩＴＲＬ発現の下方制御に帰着し、それにより、ＣＤ２５＋を介した抑制に対するエフェクター細胞の感受性を増加する。感染症の試薬に対するＣＤ２５＋を介した免疫応答の抑制がインビボでいつ発生するかに関しての利用できるデータはごく限られているが、いくつかの研究は、かなりの炎症に対する二次的な組織損傷を妨げるために、応答の開始時期というよりは、応答時期の短縮を操作することを示唆していた（Ｓｕｖａｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＩＬ−２の存在下で、ＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるＧＩＴＲの関与がそれらの拡張を誘導することを指摘するべきである（ＭｃＨｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００２）。増殖期にないＡＰＣにおけるＧＩＴＲＬによるＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるＧＩＴＲのインビトロの関与が、免疫応答の過程において、初期にエフェクターＴ細胞によって分泌されるＩＬ−２の存在において、制御性Ｔ細胞の非特異的な拡張に帰着するという可能性を残す。この非特異的な拡張は、応答の後期におけるエフェクター細胞の活性を阻害するように機能する抗原特異的なサプレッサー細胞のプールのその後の発生に決定的となるかもしれない。
［０２６１］本出願人は、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ相互作用の操作が、インビボで制御性Ｔ細胞機能を操作する効果的な方法であることを証明するかもしれないことを以前に提案した（ＭｃＨｕｇｈ ａｎｄ Ｓｈｅｖａｃｈ，２００２）。この概念は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が抗ＧＩＴＲ抗体の標的であったことを示唆するデータに基づくものであるが、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ相互作用が重要な治療の標的を示すケースでさえある。このように、作動性抗ＧＩＴＲ抗体又は作動性ＧＩＴＲＬ−Ｆｃを用いた治療は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の抑制効果に耐性な、例えば、感受性を少なくするようにすべきであり、そして、癌への免疫応答の関与（単独で又は他の腫瘍治療剤、例えば、腫瘍ワクチンと組合わせて使用する）について、及びウイルス、細菌などを含む感染性病原体（単独で又は感染試薬についてワクチンを弱めるワクチンアジュバントのような感染性病原体の他の治療薬と組合わせて使用する）について、癌及び感染症を治療するために効果的であることを証明すべきである。ＧＩＴＲアゴニストを用いて、例えば、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体又はＧＩＴＲ−Ｆｃの使用を通して、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ相互作用の阻害は、抑制に対するエフェクターＴ細胞の最低基準値を低くすべきであり、このように、自己免疫障害、炎症性疾患、移植（又はグラフト）拒絶、及びグラフト対宿主疾患の予防及び／又は治療に有用であるべきである。
参考文献
［０２６２］下記の参考文献は、本明細書においていくつかの著者／年の引例について十分な引例である：
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Claims (54)

  1. 配列番号：１又は配列番号：３のヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子。
  2. 少なくとも１つの発現調節配列に実施可能に連結している、請求項１に記載の単離した核酸分子。
  3. 請求項２の核酸分子でトランスフォーム又はトランスフェクトした宿主細胞。
  4. 配列番号：１又は配列番号：３に記載した核酸配列、又はその相補体に高度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする単離した核酸分子。
  5. 配列番号：２のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号：２のアミノ酸配列の活性な断片をコードする単離した核酸分子。
  6. 少なくとも１つの発現調節配列に実施可能に連結している、請求項５に記載の単離した核酸分子。
  7. 請求項６の単離した核酸分子でトランスフォーム又はトランスフェクトした宿主細胞。
  8. 体細胞及び生殖細胞が配列番号：１又は配列番号：３のヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含有するヒト以外のトランスジェニック動物。
  9. 請求項４の単離した核酸によってコードされたアミノ酸配列を含む単離したタンパク質。
  10. 配列番号：２のアミノ酸配列又はその活性な断片を含む単離したタンパク質。
  11. 配列番号：１若しくは配列番号：３のヌクレオチド配列、又はその断片に相補的なヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子であって、細胞における該核酸分子の発現がＧＩＴＲＬの生産の減少に帰着する、前記単離した核酸分子。
  12. 少なくとも１つの発現調節配列に実施可能に連結している、請求項１１に記載の単離した核酸分子。
  13. 配列番号：１若しくは配列番号：３のヌクレオチド配列、又はその断片を含む核酸分子に対応するｍＲＮＡに相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドであって、ＧＩＴＲＬの発現を阻害する、前記アンチセンス・オリゴヌクレオチド。
  14. 配列番号：１若しくは配列番号：３のヌクレオチド配列、又はその断片を含む核酸分子に対応するｓｉＲＮＡ分子であって、ＧＩＴＲＬの発現を阻害する、前記ｓｉＲＮＡ分子。
  15. 請求項１０のタンパク質に特異的に結合することができる単離した抗体。
  16. ＧＩＴＲＬ活性を中和する、請求項１５に記載の抗体。
  17. ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５３３６の５Ｆ１、又はＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５３３７の１０Ｆ１２である、請求項１６に記載の抗体。
  18. ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用を阻害することができる試験化合物をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
    ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲを含有する試料を化合物と接触させ；そして
    試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用が、化合物と接触していない試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用と比較して減少するかどうかを決定する
    ことを含み、それによって、化合物と接触した試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用の減少がＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用を阻害する化合物として同定する、前記方法。
  19. ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用を増大又は模倣することができる試験化合物をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
    ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲを含有する試料を化合物と接触させ；そして
    試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用が、化合物と接触していない試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用と比較して減少するかどうかを決定する
    ことを含み、それによって、化合物と接触した試料中のＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用の増加がＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの相互作用を増大又は模倣する化合物として同定する、前記方法。
  20. 患者における自己免疫障害、炎症性疾患、又は移植拒絶を診断する方法であって、下記の工程：
    患者由来の試料中のＧＩＴＲＬ遺伝子産物の試験量を検出し；そして
    その試験量と対照試料中のＧＩＴＲＬ遺伝子産物の正常量とを比較する
    ことを含み、それによって、正常量を有意に上回る試験量が自己免疫障害、炎症性疾患、又は移植拒絶の診断において陽性の指標を提供する、前記方法。
  21. 患者における癌又は感染症を診断する方法であって、下記の工程：
    患者由来の試料中のＧＩＴＲＬ遺伝子産物の試験量を検出し；そして
    その試験量と対照試料中のＧＩＴＲＬ遺伝子産物の正常量とを比較する
    ことを含み、それによって、正常量を有意に下回る試験量が癌又は感染症の診断の陽性の指標を提供する、前記方法。
  22. ＧＩＴＲアンタゴニストを患者に投与することを含む、自己免疫障害、炎症性疾患、又は移植拒絶の危険にある患者、又はそれを患っていると診断された患者を治療する方法。
  23. ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制に対する患者のエフェクターＴ細胞の感受性を維持するように、ＧＩＴＲアンタゴニストを投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. ＧＩＴＲアンタゴニストが、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体、中和抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲの活性な断片を含有する融合タンパク質、拮抗性（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ）小分子、アンチセンスＧＩＴＲＬ核酸分子、及びｓｉＲＮＡ ＧＩＴＲＬ核酸分子から成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  25. 自己免疫障害又は炎症性疾患が、慢性関節リウマチ、脳脊髄炎、骨関節炎、多発性硬化症、自己免疫胃炎、全身性紅斑性狼瘡、乾癬及び他の炎症性皮膚病、Ｉ型糖尿病、喘息、アレルギー、並びにクローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患から成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  26. 自己免疫障害が多発性硬化症である、請求項２２に記載の方法。
  27. ＧＩＴＲアゴニストを患者に投与することを含む、癌又は炎症性疾患の危険にある患者、又はそれを患っていると診断された患者を治療する方法。
  28. ＧＩＴＲアゴニストが患者におけるエフェクターＴ細胞に同時刺激性シグナルを提供し、及びエフェクターＴ細胞を患者におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制にほとんど感受性でないようにするようにＧＩＴＲアゴニストを投与することを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. ＧＩＴＲアゴニストが、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、及び作動性（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  30. エフェクターＴ細胞を含有する細胞群にＧＩＴＲアゴニストを投与することを含む、該細胞群の増殖を誘導する方法。
  31. ＧＩＴＲアゴニストが、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、及び作動性ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. エフェクターＴ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項３０に記載の方法。
  33. エフェクターＴ細胞を含有する細胞群にＧＩＴＲアンタゴニストを投与することを含む、該細胞群の増殖を阻害する方法。
  34. ＧＩＴＲアンタゴニストが、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体、中和抗ＧＩＴＲ中性抗体、ＧＩＴＲを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲの活性な断片を含有する融合タンパク質、拮抗性小分子、アンチセンスＧＩＴＲＬ核酸分子、及びｓｉＲＮＡ ＧＩＴＲＬ核酸分子から成る群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. エフェクターＴ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項３３に記載の方法。
  36. エフェクターＴ細胞を含む細胞群にＧＩＴＲアゴニストを投与することを含む、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の存在下で該細胞群の抑制を遮断する方法。
  37. ＧＩＴＲアゴニストがエフェクターＴ細胞に同時刺激性シグナルを提供し、及びエフェクターＴ細胞をＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制にほとんど感受性でないようにするようにＧＩＴＲアゴニストを投与することを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. ＧＩＴＲアゴニストが、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、及び作動性ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  39. エフェクターＴ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項３６に記載の方法。
  40. エフェクターＴ細胞を含む細胞群にＧＩＴＲアンタゴニストを投与することを含む、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の存在下で該細胞群を抑制する方法。
  41. ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞による抑制に対するエフェクターＴ細胞の感受性を維持するように、ＧＩＴＲアンタゴニストを投与することを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. ＧＩＴＲアンタゴニストが、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体、中和抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲの活性な断片を含有する融合タンパク質、拮抗性小分子、アンチセンスＧＩＴＲＬ核酸分子、及びｓｉＲＮＡ ＧＩＴＲＬ核酸分子から成る群から選択される、請求項４０に記載の方法。
  43. エフェクターＴ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項４０に記載の方法。
  44. エフェクターＴ細胞群を得る工程、ＧＩＴＲアゴニストで該細胞群を処置する工程、そして処置した細胞群を癌又は感染症に悩まされている患者に投与する工程を含む、癌又は感染症を治療する方法。
  45. ＧＩＴＲアゴニストが、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、作動性小分子、及び作動性抗ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 患者が癌で悩まされ、そして、前記の処置した群が腫瘍ワクチンとして使用される、請求項４４に記載の方法。
  47. ＧＩＴＲアゴニスト及び薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物。
  48. ＧＩＴＲアゴニストが、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、作動性小分子、及び作動性抗ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. ＧＩＴＲアンタゴニスト及び薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物。
  50. ＧＩＴＲアンタゴニストが、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体、中和抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲの活性な断片を含有する融合タンパク質、拮抗性小分子、アンチセンスＧＩＴＲＬ核酸分子、及びｓｉＲＮＡ ＧＩＴＲＬ核酸分子から成る群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. ＧＩＴＲアゴニスト、並びにウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、癌抗原、腫瘍関連抗原、及びそれらの断片から成る群から選択される抗原を含むワクチンアジュバント。
  52. ＧＩＴＲアゴニストが、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性な断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性な断片を含有する融合タンパク質、作動性小低分子、及び作動性抗ＧＩＴＲ抗体から成る群から選択される、請求項５１に記載のワクチンアジュバント。
  53. ＧＩＴＲアンタゴニスト、並びに自己抗原、アミロイドペプチドタンパク質、アロ抗原、移植抗原、アレルゲン、及びそれらの断片から選択される抗原を含むワクチンアジュバント。
  54. ＧＩＴＲアンタゴニストが、中和抗ＧＩＴＲＬ抗体、中和抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲの活性な断片を含有する融合タンパク質、拮抗性小分子、アンチセンスＧＩＴＲＬ核酸分子、及びｓｉＲＮＡ ＧＩＴＲＬ核酸分子から成る群から選択される、請求項５３に記載のワクチンアジュバント。
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