JP2023554376A

JP2023554376A - キメラ抗原受容体（ｃａｒ）スペーサー修飾のｃａｒｔ細胞機能の増強

Info

Publication number: JP2023554376A
Application number: JP2023536337A
Authority: JP
Inventors: コルホネン、マッティ; コスキ、ヤン
Original assignee: オリオンコーポレーション
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2023-12-27
Also published as: CA3202112A1; EP4262844A1; KR20230121129A; US20240109978A1; AU2021402100A1; WO2022129692A1; AU2021402100A9; CN116600820A

Abstract

本発明は、ＣＡＲＴ細胞療法におけるＦｃ受容体（ＦｃＲ）発現細胞によるオフターゲット結合を回避する不活性かつ修飾可能なスペーサーを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。スペーサーは、シグナル調節タンパク質アルファのＩｇ様Ｃ１ドメインに基づく。

Description

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に基づくＴ細胞療法は、血液がんのための新しい治療様式であり、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）および非ホジキンリンパ腫の難治性および再発患者の治療において目立った結果を示している。しかしながら、その先端療法において、現在のＣＡＲは、以前に特定されたか、今後特定される可能性のある副作用を防ぐことにより、高い効率かつ許容可能な細胞毒性を達成するために改良される必要がある。オフターゲット細胞とのスペーサー関連の相互作用を回避するためＣＡＲを微調整することや、最適なスペーサー修飾を比較することは、広く研究されておらず、細胞毒性応答性を調整するためのより正確な洞察が必要である。

細胞膜と抗原結合ドメインとの間のその構造的機能を有するスペーサーは、ＣＡＲ関連抗原非依存性シグナル伝達または抗原依存性シグナル伝達の微調整に重要な役割を有する。一般に使用されるＣＡＲは、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）定常ドメイン、ＣＤ８－アルファまたはＣＤ２８の細胞外ドメイン、ＮＧＦＲ（Ｃａｓｕｃｃｉら、２０１８）またはＮＫＧ２Ｄ（Ｓｅｎｔｍａｎら、２０１４）の細胞外部分から構成される。典型的なＩｇＧ系ＣＡＲ（ＩｇＧ１－ＣＡＲ）におけるＦｃ領域のＩｇＧ１－ＣＨ２ドメインは、ＦｃＲ発現骨髄細胞、通常単球またはマクロファージと、またはＮＫ細胞と相互作用し、骨髄細胞活性化および炎症を誘導し得る（Ａｌｍａａｓｂａｋら、２０１５）。ＣＡＲに結合するＦｃＲは、ＣＡＲＴ細胞活性化およびＦｃＲ発現骨髄細胞の破壊、肺でのＣＡＲＴ細胞の隔離、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）およびＣＡＲＴ細胞活性の全体的な低下を引き起こす可能性がある（Ａｌｍａａｓｂａｋら、２０１５、Ｈｏｍｂａｃｈら、２０１０、Ｈｕｄｅｃｅｋら、２０１５）。オフターゲット細胞との不要な相互作用と考えられる副作用は、機能的な治療用ＣＡＲＴ細胞を達成するために回避されなければならない。

シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）ファミリー（例えばＳＨＰＳ、ＣＤ１７２としても知られる）メンバーは、白血球機能調節に関与する膜タンパク質である（ｖａｎＢｅｅｋら、２００５）。ＳＩＲＰファミリーメンバーの細胞外領域は、典型的には１つのＩｇ様Ｖ型ドメインおよび２つのＩｇ様Ｃ１型ドメインから構成される。ＳＩＲＰ－アルファ（ＳＨＰＳ－１、ＢＩＴ、ＭＦＲ、ＣＤ１７２ａ、ｐ８４としても知られる）は、１つのＩｇ様Ｖ型ドメイン、Ｉｇ様Ｃ１－１型ドメインおよびＩｇ様Ｃ１－２型ドメインからなる典型的な細胞外領域を有するＳＩＲＰファミリーメンバーである（ｖａｎＢｅｅｋら、２００５）。ＳＩＲＰ－アルファの細胞外領域は、細胞外ではＮ－末端のそのＶ型Ｉｇ様ドメインを介して標的リガンドＣＤ４７に結合することだけが知られているが（ＨａｔｈｅｒｌｅｙＤら、２００９）、ＳＩＲＰ－アルファのＩｇ様Ｃ１型ドメインは現在不活性骨格として知られている。

本発明は、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰ－アルファ）の少なくとも１つのＩｇ様Ｃ１ドメインまたはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む細胞外スペーサーを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。

いくつかの実施形態において、ＳＩＲＰ－アルファのＩｇ様Ｃ１ドメインは、（ｉ）配列番号１に係る１型ドメインまたはそのフラグメントまたはそのバリアント；または（ii）配列番号２に係る２型ドメインまたはそのフラグメントまたはそのバリアントから選択される。

いくつかの実施形態において、細胞外スペーサーは、ＳＩＲＰ－アルファのＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、細胞外スペーサーは、少なくとも１つの多量化ドメインをさらに含み、多量化ドメインまたは複数の多量化ドメインは、配列番号４または配列番号８０に係るＩｇＧ１ヒンジ領域、配列番号８１に係るＩｇＧ２ヒンジ領域、配列番号８２に係るＩｇＧ３ヒンジ領域、配列番号８３に係るＩｇＧ４ヒンジ領域、および／または配列番号３に係るＣＤ２８の細胞外ドメイン、および／またはそれらのフラグメントおよびバリアントから選択される。いくつかの実施形態において、多量化ドメインまたは複数の多量化ドメインは、配列番号４に係るＩｇＧ１ヒンジ領域またはそのフラグメントおよび／または配列番号３に係るＣＤ２８の細胞外ドメインまたはそのフラグメントから選択される。いくつかの実施形態において、多量化ドメインまたは複数の多量化ドメインは、配列番号８３に係るＩｇＧ４ヒンジ領域またはそのフラグメントおよび／または配列番号３に係るＣＤ２８の細胞外ドメインまたはそのフラグメントから選択される。

いくつかの実施形態において、細胞外スペーサーは、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとのあいだに置かれる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）である。

いくつかの実施形態において、細胞外スペーサーは、少なくとも１つのジスルフィド架橋によりＣＡＲを二量化する。細胞外ＣＤ２８は、１つのジスルフィド架橋を含む。ＩｇＧヒンジ領域は、２つのジスルフィド架橋を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、１つのジスルフィド架橋、２つのジスルフィド架橋または３つのジスルフィド架橋で二量化する。

本発明はまた、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０または配列番号６１に係るアミノ酸配列を含む細胞外スペーサーを含むＣＡＲに関する。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、いずれかの先の細胞外スペーサードメイン、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、および任意には共刺激ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体またはそのフラグメントを含む。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、腫瘍抗原またはがん抗原を標的とする。腫瘍抗原は、Ｙｕら、２０２０およびＴｏｗｎｓｅｎｄら、２０１８に論評されているＣＤ１９、ＨＥＲ－２、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＴＡＡ、ＧＤ２、ＭＳＬＮ、ＥＧＦＲ、ＥＢＶ、ＧＰＣ３、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１から選択することができる。本発明のＣＡＲにより標的化される腫瘍抗原は、好ましくはＣＤ１９またはＨＥＲ－２から選択される。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜タンパク質の膜貫通ドメインから選択される。膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ８アルファ、ＯＸ４０Ｌ受容体（ＣＤ１３４としても知られる）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られる）、ＣＤ３、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３イプシロンまたはＣＤ３ゼータまたはそれらのフラグメントから選択することができる。好ましい実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号２３に係るＣＤ２８の膜貫通ドメインまたはそのフラグメントを含む。

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２８、ＦｃガンマＲＩＩＩ、ＦｃＲ細胞質尾部またはチロシンキナーゼまたはそれらのフラグメントの細胞内ドメインから選択することができる。好ましい実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２５に係るＣＤ３ゼータの細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む。

ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ８アルファ、ＯＸ４０Ｌ受容体（ＣＤ１３４としても知られる）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られる）、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＭＹＤ８８－Ｄ４０またはそれらのフラグメントまたはそれらのバリアントから選択することができる。ＣＡＲの共刺激ドメインは、好ましくは、配列番号２４に係る細胞内ＣＤ２８またはそのフラグメントを含む。

本発明は、
ｉ．単鎖
可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）；
ii．ＩｇＧヒンジドメイン；
iii．シグナル調節タンパク質アルファ－１のＩｇ様Ｃ１の１型および／またはＩｇ様Ｃ１の２型ドメイン；
iv．ＣＤ３ゼータ；
ｖ．ＣＤ２８膜貫通ドメイン；
Vi．任意には、ＣＤ２８細胞外ドメインおよび／またはＣＤ２８細胞内ドメイン
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）にも関する。

本発明はまた、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６または配列番号６７に係るアミノ酸配列を含むかまたはからなるＣＡＲに関する。

本発明は、さらに先に記載されたＣＡＲのいずれかをコードするポリヌクレオチドに関する。

本発明はまた、先に記載されたＣＡＲのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

本発明は、先に記載されたＣＡＲのいずれかまたはそれをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞にも関する。いくつかの実施形態において、細胞はＴ細胞である。

本発明はさらに、スペーサードメインに（ｉ）ＩｇＧヒンジドメイン、（ii）シグナル調節タンパク質アルファ－１のＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、（iii）シグナル調節タンパク質アルファ－１のＩｇ様Ｃ１の２型ドメイン、または（iv）ＣＤ２８細胞外フラグメントから少なくとも２つのドメインを選択することによりＣＡＲの長さを調節する方法であって、結果として種々の長さを有するキメラ抗原受容体が得られる方法にも関する。

いくつかの実施形態において、細胞外スペーサードメインは、Ｆｃ受容体に結合しないかまたは低減された結合親和性を有する。

スペーサー修飾ＣＡＲおよびＴ細胞エクスパンジョンの動態の模式図（ｎ＝３）である。模式モデルにおけるＣＡＲドメインと設計された構造。ＣＡＲ１ＳおよびＣＡＲＸ１Ｓは図には記載されていない。ＣＡＲ１ＳおよびＣＡＲＸ１Ｓは、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインがＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインであることを除き、ＣＡＲ２ＳおよびＣＡＲＸ２Ｓにそれぞれ対応する。スペーサー修飾ＣＡＲおよびＴ細胞エクスパンジョンの動態の模式図（ｎ＝３）である。Ｔ細胞生存能力が、トリパンブルーで評価され、Ｂｉｏ－ＲａｄＴＣ２０自動細胞計数器を用いて細胞を継代する前の２、３、６、８および１０日目に計数した。結果を標準偏差と共に平均値で示す。スペーサー修飾ＣＡＲおよびＴ細胞エクスパンジョンの動態の模式図（ｎ＝３）である。継代に基づくフォールドエクスパンジョンは、２～３日ごとに計数され、継代培養間のフォールドエクスパンジョンについて評価した。線は、異なるＣＡＲの平均値（ＳＤを伴う）を表す。スペーサー修飾ＣＡＲおよびＴ細胞エクスパンジョンの動態の模式図（ｎ＝３）である。１３日目のＣＡＲ発現は、フローサイトメトリーにより分析された。結果は、個々のデータの点と平均値（線）を示す。エクスパンジョン後の細胞表現型。Ｔ細胞産物（ｎ＝３）が１３日間エクスパンドされ、それらの表現型がフローサイトメトリーにより分析された。結果は、平均値を伴う個々のデータの点で示される。細胞表現型は、次の抗体の組み合わせ：Ｔ細胞ＣＤ３＋ＣＤ５６－；ＮＫＴ細胞ＣＤ３＋ＣＤ５６＋；ＮＫ細胞ＣＤ３－ＣＤ５６＋および他の細胞ＣＤ３－ＣＤ５６－により決定した。エクスパンジョン後の細胞表現型。Ｔ細胞産物（ｎ＝３）が１３日間エクスパンドされ、それらの表現型がフローサイトメトリーにより分析された。結果は、平均値を伴う個々のデータの点で示される。Ｔ細胞集団中のＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞集団。エクスパンジョン後の細胞表現型。Ｔ細胞産物（ｎ＝３）が１３日間エクスパンドされ、それらの表現型がフローサイトメトリーにより分析された。結果は、平均値を伴う個々のデータとして示される。ＮＫＴ細胞集団中のＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞集団。異なるメモリー表現型、疲弊および最終的に分化されたＴおよびＮＫＴ細胞の割合。結果（フローサイトメトリーにより測定された）は、最小値および最大値を伴う平均値を示す。エクスパンジョンの１３日目に、細胞はメモリー表現型について分析された。異なるメモリー表現型、疲弊および最終的に分化されたＴおよびＮＫＴ細胞の割合。結果（フローサイトメトリーにより測定された）は、平均値を伴う個々のデータの点を示す。ＳＣＭＳＣＭ様およびＣＭメモリー表現型は、まとめて「初期メモリー表現型」群として、そして「エフェクター表現型」群としてＥＭおよびＥｆｆに分類された。異なるメモリー表現型、疲弊および最終的に分化されたＴおよびＮＫＴ細胞の割合。結果（フローサイトメトリーにより測定された）は、平均値を伴う個々のデータの点を示す。細胞は、疲弊された（ＰＤ－１陽性）群および最終的に分化された（ＣＤ５７陽性）群として分析された。Ｔ細胞応答およびＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ－６細胞に対する細胞毒性。平均（黒水平線）および個々のデータの点が示される。ＣＡＲＴ細胞は、Ｎａｌｍ－６細胞と１：１のＥ：Ｔ比で１８時間共培養された。サイトカインは、フローサイトメトリーに基づくＣＢＡアレイを用いて培養物上清から分析された。Ｔ細胞応答およびＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ－６細胞に対する細胞毒性。平均（黒水平線）および個々のデータの点が示される。ＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ－６細胞によるＴ細胞の脱顆粒化は、ＧｏｌｆｉＳｔｏｐタンパク質輸送阻害剤の存在下での４時間の共培養後にＴ細胞におけるＣＤ１０７ａを染色することにより分析された。結果は、Ｔ細胞中のＣＤ１０７ａ発現細胞の％値と、その値からＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞のパーセンテージを示す。Ｔ細胞応答およびＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ－６細胞に対する細胞毒性。ルシフェラーゼ活性が、様々なＥ：Ｔ比でのルシフェラーゼ発現ＣＤ１９＋Ｎａｌｍ－６細胞に対するＣＡＲＴ細胞のインビトロ細胞毒性を分析するために測定された。平均±ＳＤが示される。ＦｃＲ発現ＴＨＰ－１単球とのＣＡＲＴ細胞相互作用。ＣＡＲＴ細胞は、単球と１：１（エフェクター細胞：オフターゲット細胞）比で共培養された。ＣＡＲＴ細胞の活性化は、細胞表面活性化マーカーを染色することにより（ＣＤ２５、ＣＤ６９；フローサイトメトリー）測定された。ＦｃＲ発現ＴＨＰ－１単球とのＣＡＲＴ細胞相互作用。ＣＡＲＴ細胞は、単球と１：１（エフェクター細胞：オフターゲット細胞）比で共培養された。ＣＡＲＴ細胞の活性化は、フローサイトメトリーに基づくＣＢＡアレイを用いてＣＡＲＴ細胞活性化誘導サイトカインを測定することにより（ＣＡＲＴ細胞：ＩＦＮ－ガンマおよびＩＬ－２）測定された。ＦｃＲ発現ＴＨＰ－１単球とのＣＡＲＴ細胞相互作用。ＣＡＲＴ細胞は、単球と１：１（エフェクター細胞：オフターゲット細胞）比で共培養された。ＣＡＲＴ細胞の活性化は、フローサイトメトリーに基づくＣＢＡアレイを用いて単球活性化誘導サイトカインを測定することにより（単球：ＩＬ－１ベータ）測定された。種々の長さのＣＡＲをコードするＪｕｒｋａｔＴ細胞のＣＡＲ発現および細胞毒性能。ＣＡＲ発現は、形質導入後（モック、ＣＡＲ２ＳおよびＩｇＧＣＡＲ）、または形質導入および陽性選抜後（ＣＡＲＭ、ＣＡＲＸＭ、ＣＡＲＬ、およびＣＡＲＸＬ）、フローサイトメトリーにより測定された。結果は等高線図に示される。種々の長さのＣＡＲをコードするＪｕｒｋａｔＴ細胞のＣＡＲ発現および細胞毒性能。インビトロ細胞毒性は、ＣＤ１９Ｎａｌｍ－６－Ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性化を種々のＥ：Ｔ比で測定することにより評価された。結果は平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。抗原結合ドメインを標的とするＨＥＲ－２を有するＣＡＲ、ＣＡＲＭのＨＥＲ－２陽性ＳＫＢＲ－３乳がん細胞に対する細胞毒性。ルシフェラーゼ活性は、ＨＥＲ－２標的ＣＡＲＴ細胞のルシフェラーゼ発現ＨＥＲ－２陽性ＳＫＢＲ－３細胞に対するインビトロ細胞毒性を様々なＥ：Ｔ比で定量することにより測定された。結果は平均値±ＳＤで示す。ＨＥＲ－２標的ＣＡＲＭを発現するＴ細胞のＨＥＲ－２陽性ＳＫＢＲ－３乳がん細胞に対する細胞毒性。ルシフェラーゼ活性は、ＨＥＲ－２標的ＣＡＲＴ細胞のルシフェラーゼ発現ＨＥＲ－２陽性ＳＫＢＲ－３細胞に対するインビトロ細胞毒性を様々なＥ：Ｔ比で定量することにより測定された。細胞エクスパンジョン、ＣＡＲ発現および修飾多量体化ドメインを有するＣＡＲコンストラクトの細胞毒性。ＣＡＲコンストラクト、ＣＡＲＭ、ＣＡＲＸＭ、ＣＡＲＭ１、ＣＡＲＸＭ２、ＣＡＲＸＭ３、ＣＡＲＭ４、ＣＡＲ２Ｓ５およびＣＡＲＭ６を有するレンチウイルスベクターで形質導入された同じドナー由来のＴ細胞のエクスパンジョン。エクスパンジョンフォールドは実験の開始時のＴ細胞の数と相関関係にある。エクスパンジョンフォールドは、１、３、６、８および１０日目に測定された。細胞エクスパンジョン、ＣＡＲ発現および修飾多量体化ドメインを有するＣＡＲコンストラクトの細胞毒性。ＣＡＲコンストラクトのキメラ抗原受容体発現。Ｔ細胞のキメラ抗原受容体発現は、抗体を用いて細胞の表面から検出された。ベクターコピー数は、単離したゲノムＤＮＡから定量ＰＣＲで測定された。生存細胞とベクターコピー数の割合は、ＣＡＲコンストラクト、ＣＡＲＭ、ＣＡＲＸＭ、ＣＡＲＭ１、ＣＡＲＸＭ２、ＣＡＲＸＭ３、ＣＡＲＭ４、ＣＡＲ２Ｓ５およびＣＡＲＭ６に対して示されている。細胞エクスパンジョン、ＣＡＲ発現および修飾多量体化ドメインを有するＣＡＲコンストラクトの細胞毒性。ＣＡＲ－エフェクターＴ細胞（ＣＡＲコンストラクト、ＣＡＲＭ、ＣＡＲＸＭ、ＣＡＲＭ１、ＣＡＲＸＭ２、ＣＡＲＸＭ３、ＣＡＲＭ４、ＣＡＲ２Ｓ５およびＣＡＲＭ６）の細胞毒性は、ＮＡＬＭ－６標的細胞と種々の比率で２４時間共培養された。エフェクター－標的（Ｅ：Ｔ）比４：１、２：１、１：１、０．５：１、０．２５：１、０．１２５：１および０．０６２５：１が使用された。標的特異的導入遺伝子（ルシフェラーゼ）の量が測定され、標的細胞のみに対する殺傷パーセンテージが決定された。

本発明の特徴および実施形態は、本開示において非限定的な例として説明される。本開示は、本開示に記載された特定の化合物、組成物、方法、用途に限定されるものとしてみなされるべきではない。当業者は、本発明および実施形態に対して明らかな修飾および変形を行うことができるということが理解されるべきである。本出願に使用される単数形ａ、ａｎ、ｔｈｅは、１つまたは複数を指す。

本発明および実施形態を実施するために、当業者は、生物学、分子生物学、微生物学、化学、生化学、免疫学および腫瘍学の一般的な技術および方法を使用することができる。一般的な技術および方法は、文献、例えば実験室マニュアルおよび実験室プロトコルに記載されている。そのような文献は、例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌである。使用される技術用語および科学用語は、科学文献および技術辞書に基づき当業者に理解される一般的な意味を有する。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または（ＣＡＲｓ）は、特異的抗原に結合し細胞活性化に関与している受容体タンパク質を意味する。ＣＡＲｓは、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインおよび任意に共刺激ドメインを含む。ＣＡＲを発現する細胞は、特異的抗原に結合することができ、結果として細胞を活性化する。ＣＡＲ細胞は、好ましくはＴ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞である。

スペーサードメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインである。それは、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとの間に位置し、それらを接続する。スペーサードメインは、ＣＡＲのシグナル伝達を微調整する役割を有する。

免疫グロブリン（Ｉｇ）に基づくスペーサードメインは、免疫グロブリンＦｃ領域に由来するか、または免疫グロブリンＦｃ領域由来のフラグメントを含む。免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＥ由来であってもよい。ＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来であってもよい。ＩｇＧに基づくスペーサードメインは、ＩｇＧＦｃ領域由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＧ定常領域ＣＨ２およびＣＨ３を有するＩｇＧに基づくスペーサードメインは、例えばＨｏｍｂａｃｈら、２０１０に記載されている。

例えばＳＨＰＳ、ＣＤ１７２としても知られる、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）ファミリーのメンバーは、白血球機能調節に関与する膜タンパク質である（ｖａｎＢｅｅｋら、２００５）。ＳＩＲＰファミリーメンバーの細胞外領域は、典型的には、１つのＩｇ様Ｖ型ドメインおよび２つのＩｇ様Ｃ１型ドメインから構成される。ＳＩＲＰ－アルファ（ＳＨＰＳ－１、ＢＩＴ、ＭＦＲ、ＣＤ１７２ａ、ｐ８４としても知られる）は、１つのＩｇ様Ｖ型ドメイン、Ｉｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを有する典型的な細胞外領域を有するＳＩＲＰファミリーメンバーである（ｖａｎＢｅｅｋら、２００５）。ＳＩＲＰ－アルファの細胞外領域は、細胞外で、そのＶ型のＩｇ様ドメインを介してＮ末端で標的リガンドＣＤ４７に結合することのみが知られている（ＨａｔｈｅｒｌｅｙＤら、２００９）が、ＳＩＲＰ－アルファのＩｇ様Ｃ１型ドメインは、現在不活性な骨格として知られている。Ｉｇ様ドメインは、典型的には約４×２．５×２．５ｎｍの寸法を有する。ＳＩＲＰ－アルファのアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｐ７８３２４でＵｎｉＰｒｏｔデータベースに存在している。

細胞外スペーサードメイン
本発明のスペーサードメインは、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰ－アルファ）の少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含む。シグナル調節タンパク質アルファは、本願全体を通してＳＩＲＰ－アルファと略される。ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１ドメインは、１型ドメイン（配列番号１）および／または２型ドメイン（配列番号２）から選択される。一実施形態において、スペーサーは、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインを含む。別の実施形態において、スペーサーは、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを含む。別の実施形態において、スペーサーは、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを含む。スペーサーは、複数のＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよび／またはＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを含むことができる。

スペーサーは、多量化ドメインを含むことができる。多量化ドメインはＣＡＲモノマーを多量化する。多量化においては、ＣＡＲは、ＣＡＲモノマーから二量体、三量体、四量体、五量体または多量体を形成する。好ましくは、ＣＡＲは２つのＣＡＲモノマーから形成される二量体を形成する。多量化ドメインは、ＣＡＲのモノマー間に結合を形成することができる。好ましくは、モノマー間の結合は、ジスルフィド架橋である。好ましくは、多量化ドメインは、モノマー間に少なくとも１つ、２つまたは３つのジスルフィド結合を形成する。本発明のいくつかの実施形態において、スペーサーの多量化ドメインは、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＩｇＧ２ヒンジ領域、ＩｇＧ３ヒンジ領域、ＩｇＧ４ヒンジ領域、細胞外ＣＤ２８ドメインまたはそれらのフラグメントまたはバリアントの群から選択される。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ＩｇＧ１ヒンジ領域またはそのフラグメントを含む多量化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジ領域またはそのフラグメントを含む多量化ドメインを含む。好ましい実施形態において、多量化ドメインは、配列番号４に係るアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、多量化ドメインは、配列番号８０または配列番号８３に係るアミノ酸配列を含む。ＩｇＧ１ヒンジ領域またはそのフラグメントは、一方の端からＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１型ドメインに結合し、他方の端からＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する。ＩｇＧ４ヒンジ領域またはそのフラグメントは、一方の端からＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１型ドメインに結合し、他方の端からＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する。組み合わせのために追加のリンカー配列が使用されてもよい。別の実施形態において、スペーサーは、細胞外ＣＤ２８ドメインまたはそのフラグメントを含む多量化ドメインを含む。好ましい実施形態において、多量化ドメインは配列番号３に係るアミノ酸配列を含む。細胞外ＣＤ２８ドメインまたはそのフラグメントは、一方の端からＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１型ドメインに結合し、他方の端から膜貫通ドメインに、例えばＣＤ２８の膜貫通ドメイン（配列番号２３）に結合する。組み合わせのために追加のリンカー配列が使用されてもよい。スペーサーは、複数の多量化ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ＩｇＧ１ヒンジ領域と細胞外ＣＤ２８ドメインとの両方を含む。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジ領域と細胞外ＣＤ２８ドメインとの両方を含む。

スペーサードメインは、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとの間に置かれ、それらを連結する。スペーサードメインは、ＣＡＲの抗原シグナル伝達を微調整する役割を有する。本発明において、スペーサーの長さは、スペーサーにおける種々のドメインおよびそれらの組み合わせを用いて調節可能である。その結果、スペーサーの長さが異なり、ＣＡＲのその抗原への結合が最適化される。いくつかの実施形態において、スペーサーにおけるドメインは、ＳＩＲＰ－アルファのＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、ＳＩＲＰ－アルファのＩｇ様Ｃ１の２型ドメイン、細胞外ＣＤ２８ドメインおよび／またはＩｇＧヒンジ領域および／またはそれらのフラグメントまたはバリアントから選択することができる。表１は、異なる長さのスペーサーを結果として生じる選択されたドメインを含む種々のＣＡＲスペーサーのアミノ酸配列を表す（配列番号１０～１８、５６～６１）。

免疫グロブリン（Ｉｇ）に基づくＣＡＲにおいて、ＣＨ２ドメインは、骨髄性細胞のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と相互作用する。ＦｃＲを発現する骨髄性細胞は、例えば、単球、マクロファージ、およびＮＫ細胞である。ＣＡＲに結合するＦｃＲは、ＣＡＲＴ細胞活性化やＦｃＲ発現骨髄性細胞の破壊、肺におけるＣＡＲＴ細胞の隔離（sequestration）、活性化誘発性細胞死（ＡＩＣＤ）およびＣＡＲＴ細胞活性の総合的な減少を導く可能性がある（Ａｌｍａａｓｂａｋら、２０１５、Ｈｏｍｂａｃｈら、２０１０、Ｈｕｄｅｃｅｋら、２０１５）。オフターゲット細胞との望まれない相互作用および考えられる副作用は、機能的な治療的ＣＡＲＴ細胞を獲得するために回避しなければならない。

本発明において、スペーサードメインは、少なくとも１つのシグナル調節タンパク質アルファのＩｇ様Ｃ１ドメインまたはそのフラグメントを含む。Ｉｇ様Ｃ１ドメインは、１型ドメインおよび／または２型ドメインから選択される。好ましくは、スペーサーは、Ｉｇ様Ｃ１の１型ドメインとＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを含む。本発明のスペーサードメインは、結果として機能的作用を生じる骨髄性細胞のＦｃＲと相互作用しない。本発明のＣＡＲを有するＴ細胞は、オフターゲット結合により引き起こされるＣＡＲＴ細胞活性化、ＦｃＲ発現骨髄性細胞の破壊、肺におけるＣＡＲＴ細胞の隔離、活性化誘発性細胞死（ＡＩＣＤ）およびＣＡＲＴ細胞活性の総合的な減少をもたらさない。

本発明の好ましい実施形態において、スペーサードメインは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列またはそれらのバリアントまたはフラグメントを含む。それらのバリアントは、配列番号１０～１８のいずれかに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する。スペーサードメインのアミノ酸配列は、表１にまとめられている。

本発明の好ましい実施形態において、スペーサードメインは、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０または配列番号６１またはそれらのバリアントまたはフラグメントを含む。それらのバリアントは、配列番号５６～６１のいずれかに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する。スペーサードメインのアミノ酸配列は、表１にまとめられている。

配列番号１０に係るＣＡＲスペーサーＸＳは、ＩｇＧ１ヒンジ領域およびＣＤ２８細胞外フラグメントを含む。

配列番号１１に係るＣＡＲスペーサー１Ｓは、ＩｇＧ１ヒンジ領域およびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインを含む。

配列番号１２に係るＣＡＲスペーサー２Ｓは、ＩｇＧ１ヒンジ領域およびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを含む。

配列番号１３に係るＣＡＲスペーサーＸ１Ｓは、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＣＤ２８細胞外フラグメントを含む。

配列番号１４に係るＣＡＲスペーサーＸ２Ｓは、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＣＤ２８細胞外フラグメントを含む。

配列番号１５に係るＣＡＲスペーサーＭは、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを含む。

配列番号１６に係るＣＡＲスペーサーＸＭは、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＣＤ２８細胞外フラグメントを含む。

配列番号１７に係るＣＡＲスペーサーＬは、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメイン、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを含む。

配列番号１８に係るＣＡＲスペーサーＸＬは、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメイン、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＣＤ２８細胞外フラグメントを含む。

配列番号５６に係るＣＡＲスペーサーＭ１は、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを含む。

配列番号５７に係るＣＡＲスペーサーＸＭ２は、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＣＤ２８細胞外フラグメントを含む。

配列番号５８に係るＣＡＲスペーサーＸＭ３は、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＣＤ２８細胞外フラグメントを含む。

配列番号５９に係るＣＡＲスペーサーＭ４は、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。

配列番号６０に係るＣＡＲスペーサー２Ｓ５は、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。

配列番号６１に係るＣＡＲスペーサーＭ６は、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを含む。

上記ＣＡＲスペーサーはすべて、ドメインを互いに結合するリンカー配列を含んでもよい。すべてのＣＡＲスペーサーおよびそれらのアミノ酸配列は、表１にまとめられている。

抗原結合ドメイン
キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインは抗原を認識する。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、当該抗原のエピトープに結合する。抗原結合ドメインは、抗原に結合するタンパク質、ペプチド、またはそれらのミメティクスを含み得る。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体またはその機能的フラグメントである。抗体は、抗原のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリンを指す。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体またはその機能的フラグメントは、限定されるものではないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異的抗体、ナノボディ、ラクダ科抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、２価Ｆａｂ領域（Ｆ（ａｂ’）２）、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＡｂ）Ｆｖ、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２）を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、可変軽鎖可変（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を含む。

種々の抗原は、がんに関与することが知られている。がん関連抗原は、がん細胞により発現される抗原であってもよい。がん関連抗原は、がん細胞により過剰発現されてもよい。がん関連抗原は、遺伝子の変異した産物、またはがん細胞上にＣＡＲを用いて標的化することができるような量で発現される正常な遺伝子の産物であってもよい。がん関連抗原は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカン、プロテオリピッドまたはそれらの組み合わせのいずれかであってもよい。いくつかのがん関連抗原は、Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、２０１８、Ｙｕら、２０２０に総説されている。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、がん関連抗原に結合する。がん関連抗原は、例えば、既知のがん関連抗原から選択することができる。そのような抗原は、Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、２０１８、Ｙｕら、２０２０に総説されている。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインは、配列番号２２を含むｓｃＦｖまたは配列番号２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するそのバリアントである。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＨＥＲ－２に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ－２に結合する抗原結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、ＨＥＲ－２に結合する抗原結合ドメインは、配列番号５３を含むｓｃＦＶまたは配列番号５３に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するそのバリアントである。

膜貫通ドメイン
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜タンパク質の任意の膜貫通ドメインから選択されるかまたは誘導され得る。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ８アルファ、ＯＸ４０Ｌ受容体（ＣＤ１３４としても知られる）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られる）、ＣＤ３、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータの膜貫通ドメインであってもよい。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインまたはそのフラグメントまたはそのバリアントである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号２３に係るアミノ酸配列を含む。

シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞質性であってもよい。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する細胞において結果としてエフェクター機能を生じるシグナルを媒介する。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＡＲシグナルをＴ細胞活性化へと媒介することができる。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２８、ＦｃガンマＲＩＩＩ、ＦｃＲ細胞質尾部、チロシンキナーゼの細胞内ドメインから選択することができる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータまたはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２５に係るアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

共刺激ドメイン
ＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激ドメインを任意に含む。共刺激ドメインは、細胞質性であり、細胞増殖、表現型分化に影響を与え得る。ＣＡＲの共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ８アルファ、ＯＸ４０Ｌ受容体（ＣＤ１３４としても知られる）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られる）、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＭＹＤ８８－Ｄ４０またはそのフラグメントまたはそのバリアントから選択することができる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの共刺激ドメインは、細胞内ＣＤ２８またはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの共刺激ドメインは、配列番号２４に係るアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内または細胞質領域は、細胞内シグナル伝達ドメインと共刺激ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内領域は、ＣＤ３ゼータまたはそのフラグメントおよび細胞内ＣＤ２８ドメインまたはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞質領域は、配列番号２４に係るアミノ酸配列またはそのフラグメントおよび配列番号２５に係るアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

ＣＡＲ
ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインおよび任意には共刺激ドメインを含む。本発明のＣＡＲは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４または配列番号５４に係るアミノ酸配列またはそれらのバリアントまたはそれらのフラグメントから選択することができる。それらのバリアントは、配列番号２６～３４または配列番号５４のいずれかに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する。ＣＡＲの構造およびアミノ酸配列は、表１にまとめられている。

本発明のＣＡＲは、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７に係るアミノ酸配列またはそれらのバリアントまたはそれらのフラグメントから選択することができる。それらのバリアントは、配列番号６２～６７のいずれかに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する。ＣＡＲの構造およびアミノ酸配列は、表１にまとめられている。

配列番号２６に係るＣＡＲＸＳは、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ１ヒンジ領域およびＣＤ２８細胞外フラグメントを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号２７に係るＣＡＲ１Ｓは、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ１ヒンジ領域およびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号２８に係るＣＡＲ２Ｓは、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ１ヒンジ領域およびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号２９に係るＣＡＲＸ１Ｓは、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＣＤ２８細胞外ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号３０に係るＣＡＲＸ２Ｓは、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＣＤ２８細胞外ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号３１に係るＣＡＲＭは、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号３２に係るＣＡＲＸＭは、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＣＤ２８細胞外ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号３３に係るＣＡＲＬは、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメイン、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号３４に係るＣＡＲＸＬは、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメイン、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＣＤ２８細胞外ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号５４に係るＨＥＲ－２ＣＡＲＭは、抗原結合ドメインとしてＨＥＲ－２に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ１ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号６２に係るＣＡＲＭ１は、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号６３に係るＣＡＲＸＭ２は、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＣＤ２８細胞外ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号６４に係るＣＡＲＸＭ３は、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＣＤ２８細胞外ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号６５に係るＣＡＲＭ４は、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、ＩｇＧ４ヒンジ領域、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＩｇＧ４ヒンジ領域を、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号６６に係るＣＡＲ２Ｓ５は、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＩｇＧ４ヒンジ領域およびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインおよびＩｇＧ４ヒンジ領域を、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

配列番号６７に係るＣＡＲＭ６は、抗原結合ドメインとしてＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを、スペーサードメインとしてＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを、膜貫通ドメインとしてＣＤ２８フラグメントを、共刺激ドメインとしてＣＤ２８細胞内フラグメントを、そして細胞内シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ゼータフラグメントを含む。

上記ＣＡＲの全ては、ドメインを互いに結合するリンカー配列を含んでいてもよい。そのＣＡＲの全ておよびそれらのアミノ酸配列は、表１にまとめられている。

本発明のＣＡＲは、ＣＡＲＴ細胞および他の細胞療法において、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）発現細胞へのオフターゲット結合を回避する不活性かつ修飾可能なユニバーサルスペーサーを提供するために、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰアルファ）系骨格を有する。ＦｃＲを介する骨髄細胞とのオフターゲット結合は、ＣＡＲＴ細胞の妨害、サイトカイン産生の低下およびＣＡＲＴ細胞の総合的な機能障害を引き起こす。

ＳＩＲＰアルフ骨格を有する新規なＣＡＲはすべて、ＣＤ４⁺集団に有利なＣＤ４：ＣＤ８比の小さな変化を有し、にもかかわらず、従来のＩｇＧ系ＣＡＲと比較して同等の細胞毒性および機能性を有した。

ＳＩＲＰアルファ系ＣＡＲを担持するＴ細胞は、高レベルの初期活性化マーカーＣＤ６９およびＩＬ－２およびＩＦＮ－ガンマを発現するｈＩｇＧ－ＣＨ２ＣＨ３系ＣＡＲを有するＴ細胞とはコントロール的に、ＴＨＰ－１単球との共培養後に活性化レベルを示さなかった。ＩｇＧ系ＣＡＲを有するＴ細胞とは対照的に、ＩＬ－ベータの産生により測定される単球活性化もＳＩＲＰアルファＣＡＲＴ細胞において回避された。

ポリヌクレオチドおよびベクター
本発明は、本発明のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたは修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡまたは核酸アナログであり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に利用可能な任意の方法により、単離、精製、組み換え産生または合成することができる。ポリヌクレオチドのヌクレオシドは、化学的に修飾されていてもよい。核酸アナログは、ＤＮＡおよびＲＮＡと構造的に同様の化合物である。核酸アナログは、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、モルホリノであり得る。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のヌクレオシドアナログを含んでいてもよい。

同様の核酸配列が代替的なポリヌクレオチド配列によりコードされ得るということも理解されるべきである。本発明におけるコドンの最適化は、内因性受容体における頻度分析に基づく推定確率によるホモサピエンスコドンを用いて行った。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＡＲスペーサーをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２または配列番号４３から選択することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＡＲスペーサーをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２または配列番号７３から選択することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＡＲスペーサーをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２または配列番号５５から選択することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＡＲスペーサーをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８または配列番号７９から選択することができる。

本発明のＣＡＲコードするポリヌクレオチドは、発現カセットを形成してもよい。当該発現カセットは、本発明のＣＡＲをコードするための遺伝子情報を含有する。発現カセットは、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む。当該発現カセットは、抗原結合ドメインと、スペーサードメインと、膜貫通ドメインと、細胞内細胞シグナル伝達ドメインと、任意には共刺激ドメインのコード配列を含んでもよい。そのコード配列に加え、発現カセットは、プロモーター配列、エンハンサー配列、翻訳停止配列および転写終結配列から選択される配列を含んでもよい。本発明のＣＡＲをコードする発現カセットは、ウイルスまたは非ウイルスの方法で宿主細胞に導入され得る。

非ウイルスの方法において、ＣＡＲコードポリヌクレオチドは、例えば電流により標的細胞の脂質膜を開くこと、および／またはポリヌクレオチドを脂質エンベロープと結合することに基づく方法で宿主細胞に導入される。発現カセットは、ＣＡＲをコードするプラスミドにあってもよく、またはＣＡＲをコードするｍＲＮＡとしてあってもよい。発現カセットは、宿主細胞への統合を可能とするパーツを含んでもよい。任意の利用可能な非ウイルス遺伝子送達法が、当業者により選択され得る。そのような方法は、例えば、トランスフェクションおよびヌクレオフェクション法、リポソーム、カチオン剤およびエレクトロポーレーションの使用である。非ウイルスの方法およびそれらの使用は、Ｈａｒｒｉｓら、２０２０およびＲｉｅｄｌら、２０１８に総説されている。

ウイルス法では、宿主細胞に本発明のＣＡＲコードヌクレオチドを導入するためにウイルスベクターが使用される。ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、ＣＡＲコード材料、パッケージング材料およびエンベロープ関連材料を含む発現カセットを含有するプラスミドを用いて作製することができる。プラスミドは、例えば、ｐＲＲＬ．ＳＩＮ－１９、ＲＳＶ－ｒｅｖ、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥおよびｐＭＤ．Ｇから選択することができる。他の発現カセット材料は、キメラ５’ＬＴＲ－パッケージングシグナル－ＲＥＶ－応答エレメント－プロモーター－トランスジーンカセット、ＲＥＶ発現プラスミド、マトリックスおよびカプシドおよびヌクレオカプシド用前駆体タンパク質用および逆転写酵素およびインテグラーゼ成分用前駆体用発現ベクター、例えばＶＳＶ－Ｇなどのエンベロープタンパク質用発現ベクターから選択することができる。そのようなプラスミドは、宿主細胞に導入され、ＣＡＲ発現カセットインサートを含有する自己不活性化ウイルス粒子の産生を生じる。そのようなベクターは、カセットをレシピエント細胞ゲノムに組み込まれ得る。当業者は、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するために、利用可能なウイルス系の方法を使用してもよい。ウイルスベクターとその関連方法は、例えば、参考文献Ｄｕｌｌら、１９９８、Ｌｅｖｉｎｅら、２０１６に記載されている。

細胞
本発明の宿主細胞は、本発明のＣＡＲを発現する細胞を意味する。本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスまたは非ウイルスの方法により宿主細胞に導入され得る。宿主細胞は、真核細胞または原核細胞であり得る。原核細胞は、例えば細菌の細胞であり得る。真核細胞は、例えば動物細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞であり得る。宿主細胞は、培養細胞株であってもよい。そのような細胞株は、例えば、ＮＫ９２またはＪｕｒｋａｔＴ細胞であり得る。宿主細胞は、例えば動物、植物、真菌、昆虫などの生命体から単離することができる。好ましくは、宿主細胞はヒトから単離される。宿主細胞は、例えば、血液細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は血液細胞であり、より好ましくは白血球である。宿主細胞は、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球から選択される白血球であってもよい。宿主細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）および／またはＢリンパ球（Ｂ細胞）またはプラズマ細胞から選択される白血球であってもよい。好ましくは、本発明の宿主細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ（Ｔ_H）細胞、細胞傷害性Ｔ（Ｔ_C）細胞、制御性Ｔ（Ｔ_reg）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞であり得る。Ｔ細胞は、特異的細胞表面分子、例えばＴ細胞ＣＤ３、Ｔ_H細胞ＣＤ４、Ｔ_c細胞ＣＤ８を発現することができる。種々のメモリー表現型には、ナイーブＴ細胞、ステムセルメモリー様Ｔ（ＴＳＣＭ－様）細胞、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞、ステムセルメモリーＴ（ＴＳＣＭ）細胞、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）細胞がある。メモリー表現型は、細胞表面分子発現、例えばＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７などに基づき同定することができる。メモリーＴ細胞およびそれらの細胞表面マーカーは、表２にまとめられている。メモリーＴ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８を発現し得る。宿主細胞は、単一の細胞型を含んでもよく、異なる細胞型の集団を含んでもよく、好ましくは、宿主細胞は、特定のＴ細胞型または特定のＮＫ細胞型、または複数のＴ細胞型および／または複数のＮＫ細胞型を含む集団を含み得る。本発明において、宿主細胞は、異なる細胞型の細胞集団、例えば血液サンプルから単離された末梢血単核細胞であってもよい。宿主細胞は、末梢血単核細胞から単離されたＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、それらの表面にＣＤ３を発現する細胞として理解される。細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、種々のＴ細胞表現型、メモリーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、ＮＫ細胞を含んでもよい。細胞は、具体的には、例えばＣＤ３、ＣＤ４、および／またはＣＤ８などの細胞表面マーカーを発現し得る。細胞集団中の異なる細胞型の集団は異なり得る。

細胞集団は、Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞を含み得る。好ましくは、宿主細胞集団は、８０％超、８６％超または９０％超のＴ細胞を含む。好ましくは、宿主細胞集団は、１５％未満、１３％未満または９％未満のＮＫＴ細胞を含む。好ましい実施態様において、宿主細胞集団は、８６％超のＴ細胞と１３％未満のＮＫＴ細胞を含む。宿主細胞のＴ細胞は、例えば、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性細胞を含み得る。宿主細胞集団はＴ細胞を含んでもよく、４０％未満の細胞はＣＤ５７陽性および／またはＰＤ－１陽性である。

本発明のＣＡＲ、スペーサー修飾ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、スペーサー修飾ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターおよび／または本発明のＣＡＲを発現する細胞は、ＣＡＲの抗原結合ドメインにより標的とされる抗原に関連する疾患を治療するために使用することができる。ＣＡＲが抗原に結合すると、抗原を発現する標的細胞に細胞毒性を生じる。本発明のＣＡＲを発現する細胞は、がん疾患の細胞療法において、好ましくは血液悪性腫瘍、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）および非ホジキンリンパ腫の難治性および再発性患者の治療において使用することができる。ＣＡＲ発現細胞、好ましくはＴ細胞の標的抗原は、例えば、ＣＤ１９、ＨＥＲ－２、および例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、２０１８およびＹｕら、２０２０に総説されているがん関連抗原から選択される他のがん関連標的抗原であり得る。治療用ＣＡＲＴ細胞は、がん免疫療法において使用することができる。治療用ＣＡＲＴ細胞は、自己または同種異系であり得る。自己細胞は、患者から単離され、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドがベクターによりその細胞に導入され、そしてＣＡＲを発現する細胞が患者に戻される。同種異系の細胞は、異なる個体から単離されるが、患者の細胞と遺伝的に似ている。

ＣＡＲ発現細胞、好ましくはＴ細胞は、医薬組成物で患者に投与され得る。医薬組成物は、ＣＡＲ発現細胞に加えて、他の薬学的に活性な薬剤、防腐剤および／または緩衝物質を含んでもよい。

実施例１材料および方法
ＣＡＲの設計
ＦＭＣ６３抗体クローン可変領域の配列（ジーンバンク：イムノグロブリン軽鎖、可変領域；ＣＡＡ７４６６０．１およびイムノグロブリン重鎖、可変領域；ＣＡＡ７４６５９．１）を、ＣＤ１９標的化単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を設計するために修飾した。可変軽鎖および可変重鎖は、４つのカノニカルＧＧＧＧＳ－リンカーでつないだ。ＩｇＧ１－ＣＨ１－ドメイン由来のヒンジ領域は、ＣＤ１９結合ドメインにそのスペーサーをつなぐために使用した。抗原結合ドメインおよび細胞膜とのあいだのスペーサーは、ＳＩＲＰ－アルファＩｇ様Ｃ１－１型および／またはＣ１－２型ドメインから構築された。ＳＩＲＰ－アルファの一次構造は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（Ｐ７８３２４）から得られ、ホモサピエンスコドンを用いて頻度分布に基づく推定見込みにより逆翻訳された。いくつかのスペーサー構造がＴ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８の付加的な細胞外フラグメントを含むために構築された。膜貫通（ＴＭ）および細胞内（ＩＣ）配列は、Ｔ細胞受容体のＴ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８由来および細胞内Ｔリンパ球活性化ドメイン由来であった（ＴＣＲ、ＣＤ３ゼータ－鎖、ＵｎｉｐｒｏｔＰ２０９６３－３、ＣＤ２８、ＵｎｉｐｒｏｔＰ１０７４７）。種々のＣＡＲのアミノ酸配列は、表１にまとめられている。

ヒトＡｂ４Ｄ５（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２）抗体クローンは、ＨＥＲ－２標的化単鎖可変領域フラグメントを設計するために使用された。ＨＥＲ－２標的化ＣＡＲコンストラクトにおいて、ＣＡＲの他のドメインはＣＤ１９標的化ＣＡＲＭと同じであった。ＨＥＲ－２標的化ＣＡＲは、その他はＣＤ１９標的化ＣＡＲと同様に製造した。

ＩｇＧ１－に基づくＣＡＲ（ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１－ＣＨ２－ＣＨ３スペーサー、ＣＤ２８膜貫通および細胞内ドメイン、およびＣＤ３ゼータ－シグナル伝達ドメイン）が陽性コントロールとして使用された。ＦｃＲ－結合部位不含コントロールはＣＤ２８に基づくＣＡＲ（ＣＡＲＸＳ；ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ、ＣＤ２８由来のＩｇＧヒンジ領域、細胞外、膜貫通および細胞内配列ならびにＣＤ３ゼータ－シグナル伝達ドメイン由来の細胞内配列）であった。形質転換後の標的細胞に対する（ＣＡＲ－）Ｔ細胞特異的相互作用を評価するため、陰性形質転換コントロール、空のｐＬＶ－ベクター（モック）が使用された。

Ｔ細胞エクスパンジョン
ＣＡＲＴ細胞は、既に説明されているように（Ｋａａｒｔｉｎｅｎら、２０１７）軟膜から単離された末梢血単核細胞から製造された。Ｔ細胞培養物において、５％ヒトＡＢ－血清（セララボ社、オビエド、スペイン）および１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、ノバルティス社、バーゼル、スイス）で補完されたＸ－ＶＩＶＯ（ロンザ社、バーゼル、スイス）培地を使用した。Ｔ細胞密度は、０～２日目に１×１０⁶細胞／ｍｌに調整され、そして３日目に、ベクターを洗浄後、Ｔ細胞密度は新鮮な培養培地を添加することにより０．５×１０⁶細胞／ｍｌに調整された。Ｔ細胞は、２日目に、種々のＣＡＲ構造をコードする配列を含む第三世代レンチウイルスベクター（Ｋｏｐｏｎｅｎら、２００３）またはモックベクターを用いて変換された。ＣＡＲＴ細胞は、１０日目まで培養され、その後、さらなる細胞機能分析を待つために凍結された。ＣＡＲＴ細胞の機能性を評価するために、１０日目のＣＡＲＴ細胞が解凍され、細胞密度０．５×１０６細胞／ｍｌに調整され、分析前に１３日目まで培養された。メモリー表現型検査のため、ＣＡＲＴ細胞は凍結することなく１３日目まで培養された。

細胞株
ＮＡＬＭ－６（ＣＤ１９＋Ｂ系統、急性リンパ性白血病、ＡＬＬ）細胞、ＴＨＰ－１（ＦｃＲ＋単球、急性単球性白血病）細胞およびＥ６．１ＪｕｒｋａｔＴ細胞は、１０％ウシ胎児血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、ＵＳＡ）、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍのストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で補完されたＲＰＭＩ－１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）中で培養された。さらに、ＪｕｒｋａｔＴ細胞の場合は、２ｍＭのＬ－グルタミンが添加された。ＮＡＬＭ－６－ｌｕｃ細胞株はＤｕｆｖａら、２０１９に記載されたように産生された。

フローサイトメトリー
細胞は、抗ヒト抗体での染色の前に１％パラフォルムアミド（１０分、＋４℃）で固定した。コントロールとして、蛍光マイナス１（ＦＭＯ）および／または適切アイソタイプコントロールが使用された。サンプルをＢＤＦＡＣＳＡｒｉａ IIｕサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社、フランクリンレイクス、ＵＳＡ）にかけ、結果をＦｌｏｗＪｏ（バージョン１０．５．３、ＢＤバイオサイエンス社）ソフトウェアを用いて解析した。

ＣＡＲＴ細胞のメモリー表現型検査
エクスパンジョン後、Ｔ細胞サブタイプおよび残留ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞（表２）は、次のＢＤバイオサイエンス社の抗ヒト抗体：ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）－蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＣＤ４（クローンＳＫ３）－ＢＤＨｏｒｉｚｏｎ（商標）ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ（商標）５１０（ＢＶ５１０）、ＣＤ８（ＲＰＡ－Ｔ８）－ＢＤＨｏｒｉｚｏｎ（商標）ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ（商標）４２１（ＢＶ４２１）、ＣＤ５６（クローンＢ１５９）－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）を用いて染色された。メモリーＴ細胞表現型は、ＣＤ２７（クローンＭ－Ｔ２７１）－ペリジニン－クロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）共役シアニン５．５（Ｃｙ５．５）、ＣＤ４５ＲＡ（クローンＨＩ１００）－ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＯ（クローンＵＣＨＬ１）－フィコエリスリン（ＰＥ）共役シアニン７（Ｃｙ７）およびＣＤ９５（クローンＤＸ２）－ＰＥを用いて同定された。

Ｔ細胞メモリー表現型は、表２に示される発現マーカーを用いてＣＤ４およびＣＤ８サブ集団に対して定義された。ターミナルエフェクター表現型へのＴ細胞の成熟および疲弊を特定するために、ＣＤ５７（クローンＮＫ－１）－ＢＤＨｏｒｉｚｏｎ（商標）ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ（商標）４２１（ＢＶ４２１）およびＣＤ２７９（クローンＭＩＨ４）－ＡＦ６４７に対する抗体が使用された。プログラムされた細胞死タンパク質１の発現（ＣＤ２７９）およびＴ細胞ターミナルエフェクター誘導マーカーＣＤ５７はＣＤ９５＋ＣＤ２７＋／－ＣＤ４５ＲＯ＋／－集団において評価された。ＣＡＲ発現は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ－抗ヒトイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇ（Ｈ＋Ｌ）共役ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ジャクソンイムノリサーチ社、ウエストグローブ、ＵＳＡ）を用いて測定された。

細胞毒性アッセイ
スペーサー修飾ＣＡＲの細胞毒性効力を評価するために、細胞はＬｕｃ⁺ＮＡＬＭ－６細胞と種々のＴ細胞：Ｂ細胞比（エフェクター：標的－比、Ｅ：Ｔ）で１８時間共培養された。共培養の終わりに、ルシフェリン（ＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬、プロメガ社）が加えられ、生標的細胞の存在が、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒＰｌｕｓＭｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅマイクロプレートリーダー（ＢＭＧラブテック社）を用いて製造者の取扱説明書にしたがい定量された。

脱顆粒アッセイ
標的細胞に誘導されたＴ細胞の脱顆粒を測定するために、細胞はＮＡＬＭ－６標的細胞と１：１（Ｅ：Ｔ）比で４時間、リソソーム関連膜タンパク質１（ＣＤ１０７ａ）抗体（ＰＥ共役、クローンＨ４Ａ３、ＢＤバイオサイエンス社）およびＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）タンパク質輸送阻害剤（ＢＤバイオサイエンス社）の存在下で共培養された。脱顆粒は、フローサイトメトリーで測定された共培養物における全Ｔ細胞からの細胞表面発現ＣＤ１０７ａ⁺Ｔ細胞の集団として評価された。

単球とのＣＡＲＴ細胞相互作用を証明する分析
単球に結合するＣＡＲＴ細胞の効果を分析するために、Ｔ細胞はＴＨＰ－１単球と１：１比で１８時間、＋３７℃で共培養された。Ｔ細胞上の細胞表面活性化マーカーＣＤ２５（クローンＢＣ９６、バイオレジェンド社）およびＣＤ６９（クローンＦＮ５０、ＢＤバイオサイエンス社）は、フローサイトメトリーを用いて測定され、そして細胞培養培地は、活性化誘導サイトカイン（単球：ＩＬ－１ベータおよびＣＡＲＴ細胞：ＩＦＮ－ガンマおよびＩＬ－２）のさらなる分析のために回収された。

サイトカインアッセイ
細胞傷害アッセイから（ＩＦＮ－ガンマおよびＩＬ－２）、および単球とのＣＡＲＴ細胞相互作用を証明する分析から（ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－２およびＩＬ－１β）からの活性化誘導サイトカインを定量するために、細胞培養培地（エフェクター：標的比；１：１）が、製造者の取扱説明書にしたがいＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃＢｅａｄＡｒｒａｙ（ＩＬ－２、ＩＦＮ－ガンマおよびＩＬ－１ベータと共にＣＢＡヒト可溶性タンパク質マスターバッファーキットＣＢＡＦｌｅｘＳｅｔｓ、ＢＤバイオサイエンス社）で分析された。結果は、ＦＣＡＰアレイソフトウェアｖ３．０（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて解析された。

抗体結合およびＣＡＲ陽性ＪｕｒｋａｔＴ細胞の磁気マイクロビーズ選択
ＳＩＲＰ－アルファ結合抗体（ＳＥ１２Ｂ６；Ｓｅｉｆｆｅｒｔら、２００１）は、製造者の取扱説明書にしたがいＬＹＮＸＲａｐｉｄＰｌｕｓＣｙ５抗体結合キット（バイオ－ラッド社、ミルテニーバイオテック社）を用いてシアニン５（Ｃｙ５）蛍光色素と結合された。ＪｕｒｋａｔＴ細胞は、製造者の取扱説明書にしたがい単一細胞分離（抗－Ｃｙ５／抗－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７マイクロビーズ、ミルテニーバイオテック社）を利用することにより選択され、その発現はフローサイトメトリーにより確認された。

実施例２Ｔ細胞エクスパンジョンおよびＣＡＲ発現
ＣＡＲコンストラクト、ＣＡＲＸＳ、ＣＡＲＸＭ、およびＣＡＲＭは、モノクローナル抗体ＦＭＣ６３由来のｓｃＦｖ部分、ＳＩＲＰ－アルファのＩｇ様Ｃ１－１型およびＩｇ様Ｃ１－２型ドメイン由来の細胞外スペーサー、ＩｇＧヒンジ領域および／またはＣＤ２８、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメインおよびＣＤ２８およびＣＤ３ゼータ由来の細胞内ドメイン（図１Ａ）を含む。ＣＡＲは、ｈＰＧＫ－プロモーターのもとレンチウイルスベクター（ｐＬＶ）を用いてＴ細胞に形質導入された（ＫｏｐｏｎｅｎＪＫら、２００３）。

種々のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、１３日以内に４８～２６０倍にエクスパンドされた（図１Ｂ）。エクスパンジョン速度に有意差はなかったが、ＣＡＲＸＭ形質導入細胞は、よりゆっくりとした増殖の傾向を示した。増殖データにおける相違が初期段階において見られたとしても、ＣＡＲＭおよびＸＭは、ＩｇＧ１－ＣＡＲと対照的に１０日目で細胞を解凍した後、増殖に特徴的な第２のピークを有するように見える。

エクスパンジョンの２日目に、Ｔ細胞は、ＣＡＲ遺伝子担持レンチウイルスでまたはモックベクターで安定的に形質導入された。その細胞の製造後、１３日目で細胞を、ＣＡＲ発現について分析し、空ベクター導入Ｔ細胞のＣＡＲ抗体結合結果（モック１３．２５±５．２）を差し引くことにより測定されたところ、細胞の２５．３％～８８．８％において検出された（平均±ＳＤ；ＩｇＧ１－ＣＡＲ８８．８±５．６、ＣＡＲＭ４５．０±２２．６、ＣＡＲＸＭ６０．６±２２．６およびＣＡＲＸＳ２５．３±１４．３）（図１Ｄ）。

すべてのＣＡＲは、Ｔ細胞上に成功裡に発現されたが、培養６日目後のＣＡＲＸＳ、ＣＡＲＭ、およびＣＡＲＸＭＴ細胞のエクスパンジョン率は、ＩｇＧ－ＣＡＲおよびモックＴ細胞のエクスパンジョン率よりも幾分低いようであった（図１Ｃ）。

実施例３種々のＣＡＲ発現細胞間でのＴ細胞表現型および成熟の特徴付け
エクスパンジョンの１３日後、大部分の細胞（８６％～９０％）はＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６－）であり、９～１３％のＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）を含み、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）による非常に僅かな追加寄与または残りはＣＤ３－ＣＤ５６－細胞であった（図２Ａ）。細胞表現型に加え、ついでＴ細胞メモリー表現型を評価した。先に、我々は、ＣＡＲＴ細胞のエクスパンジョンのあいだＩＬ－２の濃度がＴ細胞メモリー表現型に影響することを報告した（ＫａａｒｔｉｎｅｎＴら、２０１７）。そのため、我々は、Ｔ細胞の過剰な分化を防ぐため、培養物中１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を使用した。Ｔ細胞メモリー表現型のレパートリーは、図３Ａに示されている。Ｔ細胞のメモリー表現型に対するエクスパンジョンプロセスと種々のＣＡＲとの効果をより簡便に区分けするため、我々は、Ｔ細胞メモリーサブグループの初期メモリーグループ（＝Ｔｓｃｍ、Ｔｓｃｍ様およびＴｃｍ）およびエフェクター（＝ＴｅｍおよびＴｅｆｆ）グループにグループ分けした（図３Ｂ）。エクスパンジョンの１３日目まで、ＳＩＲＰ－アルファ系ＣＡＲＭおよびＣＡＲＸＭを備えるＴ細胞は、ＣＤ４＋細胞への分化を好む傾向があり（図２Ｂ）、その中のエフェクターＴ細胞の割合は、初期メモリー細胞のより強い優勢を示すＣＤ８細胞と対照的により高い傾向があった。にもかかわらず、異なるドナー間でのばらつきのため、Ｔメモリー細胞分化において種々のＣＡＲに関連した有意差は検出されなかった。それ以外では、メモリー表現型は同じであり、ＰＤ－１表面発現およびＴ細胞ターミナルエフェクター成熟関連マーカーＣＤ５７による増殖能で測定された疲弊レベルも同じであった。エクスパンジョンの１３日目後、ほとんどのＣＤ４およびＣＤ８細胞は、疲弊マーカーＣＤ５７およびＰＤ－１に対して陰性であり（６６．２～７９．９％）、少数がその表面マーカーの片方または両方を発現した（図３Ｃ）。この場合もやはり、ＣＡＲは、Ｔ細胞における疲弊マーカー発現に特異的に影響しなかった。

実施例４ＣＡＲＴ細胞の活性化および細胞毒性活性
標的抗原を担持する細胞とのＣＡＲＴ細胞相互作用は、Ｔ細胞活性化および標的細胞の殺傷を誘導する。スペーサー修飾ＣＡＲコンストラクトを担持するＴ細胞が成功裡に産生できることを確立したら、次に我々は、標的依存活性化によるＣＡＲＴ細胞の機能的特徴を分析した。ＣＤ１９＋標的細胞によるＴ細胞活性化におけるＣＡＲ機能を分析するために、我々は、１：１のエフェクター：標的細胞比を用いる一晩の共培養からサイトカイン産生を測定した（図４Ａ）。異なるＣＡＲを担持するすべてのＴ細胞は、同様の量のＩＬ－２を産生し、ＣＡＲＭ担持細胞によるより高いＩＬ－２産生の有意でない傾向（～１．３倍）を伴った。ＩＦＮ－ガンマ産生に差は検出されなかった。

次いで、我々は、ＣＤ１９＋標的細胞との４時間の共培養に応答して脱顆粒するＴ細胞の能力を、ＣＤ１０７ａの細胞表面発現の状況を測定することにより調査した。ＣＡＲ発現細胞の集団は、標的細胞に応答して脱顆粒細胞のフラクションに直接関係付けられ（図４Ｂ）、ＣＡＲ発現細胞の機能性を確認した。ＩｇＧ１－ＣＡＲのＣＡＲ発現レベルは、ＣＡＲＭ、ＣＡＲＸＭまたはＣＡＲＸＳよりも高かったが、ＣＤ４＋細胞のＣＤ１０７ａ発現と同様であった。対して、ＩｇＧ１－ＣＡＲおよびＣＡＲＸＳは、ＣＤ８＋細胞において、ＣＡＲＭおよびＣＡＲＸＭよりも高いＣＤ１０７ａの発現を示した。

ＣＡＲ発現とＣＤ８＋細胞脱顆粒レベルの違いにもかかわらず、すべてのＣＡＲＴ細胞は、ＮＡＬＭ－６細胞標的に対して際立って同様の細胞毒性率を示した（図４Ｃ）。１８時間のＣＤ１９＋標的細胞との共培養実験において、すべてのＣＡＲＴ細胞株は、２：１（Ｅ：Ｔ）比で１００％の殺傷効力を、より低いＥ：Ｔ比でも同様の能力を証明した。

実施例５スペーサー修飾ＣＡＲＴ細胞は、「オフターゲット」の骨髄細胞では活性化を示さなかった
ＳＩＲＰ－アルファ系ＦｉＣＡＲは、Ｆｃ受容体発現骨髄細胞との相互作用を逃れるために設計された。我々は、骨髄細胞とのＣＡＲＴ細胞相互作用を、ＣＡＲＴ細胞をＴＨＰ－１単球と１：１（エフェクター：オフターゲット細胞；Ｅ：ＯＴ）比で共培養することにより評価した。ＣＡＲＴ細胞活性化は、細胞表面活性化マーカーＣＤ２５（長期活性化を示す）およびＣＤ６９（短期活性化を示す）について染色することにより（図５Ａ）、およびＣＡＲ関連活性化に応答してＴ細胞（図５Ｂ：ＣＡＲＴ細胞：ＩＦＮ－ガンマおよびＩＬ－２）および単球（図５Ｃ：単球；ＩＬ－１ベータ）により産生されるサイトカインを測定することによりされた。すべてのＣＡＲＴ細胞は、ＴＨＰ－１単球と共に、またはＴＨＰ－１単球なしで、ＣＤ２５活性化マーカーより高くまたはＣＤ２５活性化マーカーと同等で発現した。さらに、ＣＡＲＴ細胞とＴＨＰ－１単球との共培養において、Ｆｃ領域含有ＣＡＲ、ＩｇＧ１－ＣＡＲは、高いレベルの細胞表面初期活性化マーカーＣＤ６９を発現した。対して、スペーサー修飾ＣＡＲコンストラクトを有するＴ細胞、すなわちＣＡＲＸＳ、ＣＡＲＭおよびＣＡＲＸＭ細胞は、モックＴ細胞とともにＣＤ６９発現を示さなかった。同様の設定は、サイトカインの産生においてもみられ、ＴＨＰ－１が引き起こした活性化がサイトカインＩＬ－１ベータを誘導するのに加えたＩｇＧ１－ＣＡＲが引き起こした活性化はサイトカインＩＬ－２およびＩＦＮ－ガンマを誘導した。スペーサー修飾ＣＡＲＴ細胞は、ＴＨＰ－１単球と共に、またはＴＨＰ－１単球なしでモック導入コントロールＴ細胞とすべて同等の低いＩＬ－２およびＩＦＮ－ガンマレベルを産生した。さらに、スペーサー修飾Ｔ細胞との共培養中のＴＨＰ－１単球は、ＴＨＰ－１細胞単独またはモック導入コントロールＴ細胞と一緒のＴＨＰ－１細胞と同程度に低いレベルのＩＬ－１ベータを産生した。以上総合すると、これらのデータは、スペーサー修飾ＣＡＲＴ細胞のＦｃＲ－担持単球との共培養は、Ｔ細胞や単球の過度の活性化をもたらさないことを示している。

実施例６ＳＩＲＰ－アルファスペーサー長の修飾
ＣＡＲ骨格構造が、標的細胞上の膜近位抗原または膜遠位抗原の良好な結合のために修飾され得るかどうかをさらに調査するため、我々は、ＣＤ１９を標的化するための種々の長さのＣＡＲを設計した。ＳＩＲＰ－アルファの異なるＩｇ様Ｃ１ドメインを利用してスペーサー長を調節することにより、我々は、ＣＡＲＭまたはＣＡＲＸＭから別のＩｇ様Ｃ１ドメインを除去することにより、またはＣＡＲＭおよびＣＡＲＸＭに追加のＩｇ様Ｃ１ドメインを加えることにより、長さの調節されたＣＡＲを設計した。

まず、種々の長さのＣＡＲの高発現を確保するために、ＣＡＲ発現ＪｕｒｋａｔＴ細胞がシングルセルマイクロビーズ分離を用いて選択された。次いで、発現を測定するために、様々な長さのＣＡＲが、ビオチン化抗ヒトＣＤ１９ＣＡＲ検出試薬（ミルテニーバイオテック社）および第２抗体としてＡＰＣと結合させたビオチン抗体（ミルテニーバイオテック社）を用いて染色された。染色は、製造業者の取扱説明書にしたがい行った。すべての形質導入されたＪｕｒｋａｔＴ細胞培養物は、抗体への非特異的結合を示す空ベクターが形質導入されたモックＪｕｒｋａｔＴ細胞に対して、種々のＣＡＲの高い発現レベルを表示した（図６Ａ：ＣＡＲ２Ｓ９０．６％、ＣＡＲＬ８８．１％、ＣＡＲＸＬ９５．４％）。

さらに、様々な長さのＣＡＲの機能性を評価するために、ＣＡＲ形質導入ＪｕｒｋａｔＴ細胞のＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ－６－Ｌｕｃ細胞に対する細胞効力をいくつかのＥ：Ｔ比で検査した（図６Ｂ）。様々なＣＡＲ（ＣＡＲ２Ｓ、ＣＡＲＬおよびＣＡＲＸＬ）のいずれかを発現するＪｕｒｋａｔＴ細胞は、すべてＣＡＲＭ、ＣＡＲＸＭおよびＩｇＧ１系コントロールＣＡＲを備えたＪｕｒｋａｔＴ細胞と同様の殺傷効力を、Ｅ：Ｔ比に依存して０～２０％から６６．８～８２％で表示した。殺傷に対する陽性コントロールとして、我々は、優れた殺傷効力（４８～９４．７％）を示す初代Ｔ細胞を使用し、陰性コントロールとして、異なるＥ：Ｔ比で０～１５．４％の非ＣＡＲ関連殺傷効力を示すモック形質導入ＪｕｒｋａｔＴ細胞を使用した。

実施例７ＳＩＲＰアルファ骨格に基づくＣＡＲでのＨＥＲ－２標的化
スペーサーの長さが調製できることを示したのち、我々は、先のＣＡＲＭ構造におけるＣＤ１９標的ｓｃＦｖドメインをＨＥＲ－２標的ＳｃＦｖドメインに置き換えることにより新しいＣＡＲを設計した。ＨＥＲ－２標的ＣＡＲＭの機能を証明するために、ＣＡＲを初代Ｔ細胞に形質導入した。エクスパンジョン後、ＨＥＲ２標的ＣＡＲＴ細胞は、ＨＥＲ－２陽性ＳＫＢＲ－３－ｅＧＦＰ－Ｌｕｃ乳がん細胞と様々なエフェクター－標的（Ｅ：Ｔ）比で共培養された（図７）。１８時間の細胞毒性予備テスト（ｎ＝１）において、ＨＥＲ－２標的ＣＡＲＭで形質導入されたＴ細胞は、モック形質導入Ｔ細胞と比較してより高い殺傷効力を示し、それら自体でのＣＡＲ非依存性細胞殺傷はわずかであった。

実施例８ｓｃＦｖ標的ＨＥＲ－２を有するＣＡＲＭを発現するＴ細胞の細胞毒性
Ｔ細胞は、健常ドナー軟膜から単離され、ＨＥＲ－２ＣＡＲＭ遺伝子コンストラクトを担持するレンチウイルスベクターにより種々の感染の多重度（ＭＯＩ）、１．２５、２．５および５で形質導入され、１１日間エクスパンドされた。ＨＥＲ－２を標的化する代替的ｓｃＦｖを有するＨＥＲ－２ＣＡＲＭを発現するＴ細胞（エフェクター細胞）は、ホタルルシフェラーゼ発現ＨＥＲ－２＋ＳＫＢＲ－３乳がん細胞（標的細胞）と、エフェクター－標的（Ｅ：Ｔ）比４：１、２：１、１：１、１：２、１：４および１：８で一緒に培養された。２４時間後、ルシフェリンが加えられ、生きている標的細胞が定量され、空ベクター（モック）形質導入Ｔ細胞と比較して、すべての異なるＥ：Ｔ比で高い殺傷効力を示した。

実施例９細胞エクスパンジョン、ＣＡＲ発現および修飾多量体化ドメインを有するＣＡＲコンストラクトの細胞毒性
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、末梢血単核細胞から磁気ビーズ（ミルテニーバイオテック社）を用いて精製された。精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＡＲコンストラクト（ＣＡＲＭ、ＣＡＲＸＭ、ＣＡＲＭ１、ＣＡＲＸＭ２、ＣＡＲＸＭ３、ＣＡＲＭ４、ＣＡＲ２Ｓ５、ＣＡＲＭ６）をコードするレンチウイルスベクターで形質導入され、ＩＬ－７およびＩＬ－１５（ミルテニーバイオテック社）を１２．５ｎｇ／ｍｌで含有する細胞培地においてエクスパンドされた。細胞の量と生存能力はエクスパンジョンを通して測定された。種々のＣＡＲコンストラクトがエクスパンジョンに対する効果について１０日目まで調べられた（図９Ａ）。種々のコンストラクトは、細胞エクスパンジョンに明らかに影響を及ぼさず、すべてのコンストラクトは、２０フォールドエクスパンジョン超に達した。

細胞は、それらのＣＡＲ発現についてフローサイトメトリーを用いて調べられた。ＣＡＲコンストラクトは、すべてのＣＡＲコンストラクトに存在する特定のドメインを検出するビオチン標識抗体により検出された（図９Ｂ）。ベクターコピー数（ＶＣＮ）は、ゲノムＤＮＡを単離し、導入遺伝子特異的プライマーを用いて統合遺伝子を検出することにより調べられた（図９Ｂ）。細胞集団においてはおおよそ１のＶＣＮで、細胞の５０％超が細胞の表面上にＣＡＲ導入遺伝子を発現した。

ＣＡＲ－Ｔ細胞（解凍後）は、ＣＤ１９＋ＮＡＬＭ－６標的細胞と種々のエフェクター（ＣＡＲ－Ｔ）および標的（がん）細胞の比率で２４時間共培養した。このとき、細胞は溶解され、標的細胞特異的（導入）遺伝子活性について測定した（図９Ｃ）。殺傷アッセイにおいて、ＣＡＲＭ、ＸＭ、Ｍ１およびＭ６は、他のＣＡＲコンストラクトよりも高い殺傷効力の傾向を示したが、すべてのコンストラクトは、非形質導入Ｔ細胞または空ベクター（モック）形質導入Ｔ細胞と比較して有意に上昇した標的細胞の殺傷効力を示した。

［参考文献］
Almaasbak H et al (2015) Inclusion of an IgG1-Fc spacer abrogates efficacy of CD19 CAR T cells in a xenograft mouse model. Gene Ther 22: 391-403.

Casucci M et al (2018) Extracellular NGFR spacers allow efficient tracking and enrichment of fully functional car-t cells co-expressing a suicide gene. Front Immunology 9

Carter P et al (1992) Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 89:4285-4289.

Dull et al (1998) A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J Virol 72 (11): 8463-8471.

Harris E et al (2020) Optimization of electroporation and other non-viral gene delivery strategies for T cells. Biotechnol Progress, e3066.

Hatherley D et al (2007) The structure of the macrophage signal regulatory protein α (SIRP-alpha) inhibitory receptor reveals a binding face reminiscent of that used by T cell receptors. J Biol Chem 282: 14567-14575.

Hatherley D et al (2009) Structure of signal-regulatory protein α: A link to antigen receptor evolution. J Biol Chem 284: 26613-26619.

Hombach A et al (2010) Adoptive immunotherapy with genetically engineered T cells: modification of the IgG1 Fc ‘spacer’ domain in the extracellular moiety of chimeric antigen receptors avoids ‘off-target’ activation and unintended initiation of an innate immune response. Gene Ther 17: 1206

Hudecek M et al (2015) The Nonsignaling Extracellular Spacer Domain of Chimeric Antigen Receptors Is Decisive for In Vivo Antitumor Activity. Cancer Immunol Res 3: 125-135.

Kaartinen T, Luostarinen A, Maliniemi P, et al (2017) Low interleukin-2 concentration favors generation of early memory T cells over effector phenotypes during chimeric antigen receptor T-cell expansion. Cytotherapy 19:689-702.

Koponen JK et al (2003) Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther 10: 459-466.

Levine B et al (2017) Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 4: 92-101

Riedl S et al (2018) Non-Viral Transfection of Human T Lymphocytes. Processes, 6, 188.

Seiffert M et al (2001) Signal-regulatory protein α (SIRPα) but not SIRPβ is involved in T-cell activation, binds to CD47 with high affinity, and is expressed on immature CD34+CD38- hematopoietic cells. Blood 97:2741-2749.

Sentman CL et al (2014) NKG2D CARs as Cell Therapy for Cancer. Cancer J 20: 156-159.

Townsend MH et al (2018) The expansion of targetable biomarkers for CAR T cell therapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 37:163

van Beek EM et al (2005) Signal Regulatory Proteins in the Immune System. J. Immunol. 175: 7781-7.

Yu JX et al (2020) Cancer cell therapies: the clinical trial landscape. Nature Reviews Drug Discovery 19, 583-584.

Claims

シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰ－アルファ）の少なくとも１つのＩｇ様Ｃ１ドメインまたはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む細胞外スペーサーを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
ＳＩＲＰ－アルファのＩｇ様Ｃ１ドメインが（ｉ）配列番号１に係る１型ドメインまたはそのフラグメントまたはそのバリアント；または（ii）配列番号２に係る２型ドメインまたはそのフラグメントまたはそのバリアントから選択される、請求項１記載のＣＡＲ。
細胞外スペーサーが、ＳＩＲＰ－アルファのＩｇ様Ｃ１の１型ドメインおよびＩｇ様Ｃ１の２型ドメインを含む、請求項１または２記載のＣＡＲ。
細胞外スペーサーが、少なくとも１つの多量体化ドメインをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
多量体化ドメインが、または複数の多量体化ドメインが、配列番号４または配列番号８０に係るＩｇＧ１ヒンジ領域、配列番号８１に係るＩｇＧ２ヒンジ領域、配列番号８２に係るＩｇＧ３ヒンジ領域、配列番号８３に係るＩｇＧ４ヒンジ領域から選択されるＩｇＧヒンジ領域および／または配列番号３に係るＣＤ２８の細胞外ドメインおよび／またはそれらのフラグメントまたはバリアントから選択される、請求項４記載のＣＡＲ。
多量体化ドメインが、または複数の多量体化ドメインが、配列番号４に係るＩｇＧ１ヒンジ領域またはそのフラグメントおよび／または配列番号３に係るＣＤ２８の細胞外ドメインまたはそのフラグメントから選択される、請求項４記載のＣＡＲ。
多量体化ドメインが、または複数の多量体化ドメインが、配列番号８３に係るＩｇＧ４ヒンジ領域またはそのフラグメントおよび／または配列番号３に係るＣＤ２８の細胞外ドメインまたはそのフラグメントから選択される、請求項４記載のＣＡＲ。
細胞外スペーサーが、膜貫通ドメインおよび抗原結合ドメインの間に位置し、かつそれらに結合している、請求項１～７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
抗原結合ドメインが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む請求項８記載のＣＡＲ。
スペーサーが、少なくとも１つのジスルフィド架橋によりＣＡＲを二量化する、請求項１～９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０または配列番号６１に係るアミノ酸配列を含む細胞外スペーサーを含むＣＡＲ。
（ｉ）請求項１～１１のいずれか１項に記載の細胞外スペーサー、（ii）抗原結合ドメイン、（iii）膜貫通ドメイン、（iv）細胞内シグナル伝達ドメイン、（ｖ）任意に、共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
抗原結合ドメインが抗体またはそのフラグメントを含む請求項１２記載のＣＡＲ。
抗原結合ドメインが単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１２記載のＣＡＲ。
抗原結合ドメインが腫瘍抗原を標的とする、請求項１２～１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
腫瘍抗原が、ＣＤ１９またはＨＥＲ－２から選択される請求項１５記載のＣＡＲ。
膜貫通ドメインが、配列番号２３に係るＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、請求項１２～１６のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインが、配列番号２５に係るＣＤ３ゼータの細胞内ドメインまたはそのフラグメントおよび／または配列番号２４に係るＣＤ２８の細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む請求項１２～１７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
（ｉ）単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）；
（ii）ＩｇＧヒンジドメイン；
（iii）シグナル調節タンパク質アルファ－１のＩｇ様Ｃ１の１型および／またはＩｇ様Ｃ１の２型ドメイン；
（iv）ＣＤ３ゼータ；
（ｖ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン；
（vi）任意には、ＣＤ２８細胞外ドメインおよび／またはＣＤ２８細胞内ドメイン
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号５４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６または配列番号６７に係るアミノ酸配列を、含むまたはからなる、ＣＡＲ。
請求項１～２０のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
請求項２１記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項１～２０のいずれか１項に記載のＣＡＲまたは請求項２１記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
細胞がＴ細胞である請求項２３記載の細胞。
少なくとも２つのドメインを、群（ｉ）ＩｇＧヒンジドメイン、（ii）シグナル調節タンパク質アルファ－１のＩｇ様Ｃ１の１型ドメイン、（iii）シグナル調節タンパク質アルファ－１のＩｇ様Ｃ１の２型ドメイン、または（iv）ＣＤ２８細胞外フラグメントからスペーサードメインに選択し、異なる長さのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生じる、キメラ抗原受容体の長さを調整する方法。
スペーサードメインがＦｃ受容体に結合しないか、またはＦｃ受容体と低い結合親和性を有する、請求項２５記載の方法。