TW202043460A

TW202043460A - 一種新穎的ｃｄ１６陽性自然殺手細胞及一種培養ｃｄ１６陽性自然殺手細胞的方法

Info

Publication number: TW202043460A
Application number: TW109101729A
Authority: TW
Inventors: 鄭紫妃; 李佳芸; 李皓剛; 林彥良; 蕭晴文; 賴彥達; 鄭郁蓓; 楊琇萍; 蕭世嘉
Original assignee: 育世博生物科技股份有限公司
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2020-12-01
Also published as: US20220073878A1; WO2020150475A4; WO2020150475A1; AU2020209217B2; TWI771643B; CA3125503A1; JP7335001B2; CN113811315A; EP3911340A1; EP3911340A4; AU2020209217A1; JP2022523637A

Abstract

本發明提供一種人類CD16陽性自然殺手細胞系。所述人類CD16陽性自然殺手細胞系不包含合成的、基因改造的或特意提供的編碼CD16受體多核苷酸，同時為一非致瘤性細胞系。因此，所述人類CD16陽性自然殺手細胞系在用於疾病治療時可提供可觀的長期安全性。

Description

一種新穎的CD16陽性自然殺手細胞及一種培養CD16陽性自然殺手細胞的方法

本發明是關於一種CD16陽性自然殺手細胞和一種培養CD16陽性自然殺手細胞的方法；特別是關於一種非基因轉殖且沒有致癌性的CD16陽性自然殺手細胞系，和一種能大量增殖CD16陽性自然殺手細胞並維持CD16表達的培養方法。

自然殺手(NK)細胞是淋巴細胞，為先天免疫系統(innate immune system)中的一個重要組成，其最廣為人知的功能為對病毒感染的先天防禦(innate defense)及對腫瘤細胞的免疫監測(surveillance)。在人體中，自然殺手細胞常透過沒有T細胞受體複合物(T cell receptor complex；CD3陰性)，但有神經元黏附分子(neural cell adhesion molecule；CD56陽性)而被正統地識別。在人體周邊血液中，自然殺手細胞主要有兩大亞群，其中大多數(超過90%)的周邊血液自然殺手細胞為CD3陰性CD56低表達CD16陽性自然殺手細胞，而少部分(10%)的周邊血液自然殺手細胞為CD3陰性CD56高表達CD16陰性自然殺手細胞(Orange JS,2013)。

CD16受體(FcγRIII，是一種IgG Fc區的受體，可結合於IgG抗體上的Fc部分)是人類自然殺手細胞在執行抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(antibody-dependent cell cytotoxicity；ADCC)作用時所必須的。在人體中，編碼CD16受體的多核苷酸位於一號染色體q臂的1q23.3位點(1q23.3)。表達CD16受體的人類自然殺手細胞可透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用殺死多種目標細胞，例如癌細胞、腫瘤細胞和被人類免疫缺乏病毒(HIV)所感染的細胞(Rezvani K and Rouce RH,2015；Littwitz-Salomon et al,2016；Eileen Scully and Galit Alter,2016)。舉腫瘤細胞為例，表達腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens；例如人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，稱為HER2)的腫瘤細胞能與內源性IgG抗體(endogenous IgG antibodies)或經臨床核准且靶向腫瘤相關抗原的治療性IgG抗體(clinically approved therapeutic IgG antibodies targeting the tumor-associated antigens；如賀癌平(trastuzumab)、莫須瘤(rituximab)、或西妥昔單抗(cetuximab))結合。一旦一自然殺手細胞所表達的CD16受體(IgG Fc的受體，FcγRIII)與內源性IgG抗體或經臨床核准的治療性IgG抗體的Fc區域結合，將誘發自然殺手細胞媒介的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用，且該自然殺手細胞將進而釋放細胞毒性因子(cytotoxic factors)導致腫瘤細胞死亡(Rezvani K and Rouce RH,2015)。

使用CD16陽性自然殺手細胞治療癌症的方法主要有兩種。第一種方法包含以下步驟：(a)取得自體或異體血液；(b)從自體或異體血液中分離出自體或異體的原代CD16陽性自然殺手細胞(primary CD16⁺ natural killer cells；原代CD16陽性NK細胞)；(c)體外增殖自體或異體的原代CD16陽性自然殺手細胞；然後(d)將增殖的自體或異體原代CD16陽性自然殺手細胞注射回一癌症病患的靜脈，使病患體內將有足夠的CD16陽性自然殺手細胞，以釋放細胞毒性因子(cytotoxic factors)，透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用導致癌細胞死亡。然而，由於經過幾週的短期培養後，原代CD16陽性自然殺手細胞即會老化甚至凋亡的事實，為了長期治療，必須不斷從自體或異體血液中取得原代CD16陽性自然殺手細胞。除此之外，已有研究指出，用現存的方法培養高純度的CD16陽性自然殺手細胞族群(亦即，CD16陽性自然殺手細胞數量等於或高於99%)四天之後所取得的所有培養的細胞中，只有10%的細胞還表達CD16。換句話說，現存的CD16陽性自然殺手細胞體外培養方法，無法讓增殖後的自然殺手細胞穩定表達CD16。因此，上述方法不僅在維持CD16陽性自然殺手細胞供應源上存在著困難，同時也缺乏能在體外穩定增殖CD16陽性自然殺手細胞的方法。這些問題往往使癌症病人在取得足夠量的CD16陽性自然殺手細胞上產生困難，同時也很難讓癌症治療每次都能順利地進行。除此之外，上述方法也需要面臨著因為個體細胞差異而使療效難以控制的問題。

第二種方法涉及一種NK-92細胞系(寄存編號ATCC CRL-2407)。NK-92細胞系是從一名患有惡性非霍奇金式淋巴瘤(malignant non-Hodgkin’s lymphoma)的50歲高加索男子的血液中分離出來的一種CD16陰性自然殺手細胞系。NK-92細胞系可以被持續地繼代培養而沒有老化跟死亡的問題，同時該NK-92細胞系對免疫力不全的小鼠(immune compromised mice)沒有致癌性(tumorigenic)。在經過γ射線照射過後，NK-92細胞系對同種異體(allogeneic)的人類個體也沒有致癌性(carcinogenic)，因此有某種程度上的可利用性。然而，因為NK-92細胞系未表達CD16受體，所以它無法透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用來摧毀癌細胞。因此，為了取得一種能表達CD16受體且可行使抗體依賴性細胞介導的細胞毒性的基因轉殖CD16NK-92細胞系，上述的第二種方法需要透過基因轉殖的技術將CD16受體基因轉殖到NK-92細胞系中。然後，將轉染了CD16的NK-92細胞系注射到癌症病患的靜脈；因此，癌症病患體內將有足夠的CD16陽性自然殺手細胞，以釋放細胞毒性因子(cytotoxic factors)而透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用導致癌細胞死亡。可惜的是，醫學界和一般民眾對基因轉殖的免疫細胞在人體循環系統中的長期安全性有所疑慮。因此，上述方法的開發受到了相當大程度的限制。

因此，仍急需一種可以被持續地繼代培養，非基因轉殖、沒有致癌性的細胞系和一種可以大量增殖CD16陽性自然殺手細胞並維持CD16表達的培養方法。

本發明提供一種可以被持續地繼代培養且沒有老化和死亡問題的自然殺手細胞系。

本發明的第二目的為提供一種在經過至少三個月的增殖後仍能穩定地表達CD16陽性受體的自然殺手細胞。

本發明的另一目的為提供一種非基因轉殖的CD16陽性自然殺手細胞系。

本發明的另一目的為提供一種對免疫力不全的小鼠不具致癌性的CD16陽性自然殺手細胞系。

本發明的另一目的為提供一種在經過γ射線照射後，對同種異體的人類個體沒有致癌性的CD16陽性自然殺手細胞系。

本發明的另一目的為提供一種可以大量增殖CD16陽性自然殺手細胞系的培養方法。

本發明的另一目的為提供一種可以使CD16陽性自然殺手細胞在增殖後穩定表達CD16受體的培養方法。

本發明的另一個目的為提供一種實質上富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物，其中該組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞數至少為5×10⁵個，且基於組成物中的總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於5%；該人類CD16陽性自然殺手細胞具有以下特徵：在經過至少三個月的繼代培養後仍保持其增殖的能力。

本發明提供了一種具有下列特徵的人類自然殺手細胞：

i)表達一CD16受體；

ii)在經過至少三個月的繼代培養後仍保持其增殖的能力；以及

iii)包含一被表達的編碼CD16受體的多核苷酸序列，其中該被表達的編碼CD16受體的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送進細胞內的。

較佳者，該人類自然殺手細胞在經過至少一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月或十一個月的繼代培養後仍能增殖。

較佳者，該人類自然殺手細胞在經過至少一年、兩年或三年的繼代培養後仍能增殖。

較佳者，該人類自然殺手細胞對一免疫能力低下的小鼠不具致癌性。

較佳者，該免疫力不全的小鼠為一SCID/Beige鼠、一NOD/SCID鼠、一NSG鼠、或一裸鼠。

本發明更提供一種實質富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物，其中該組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞數至少為5×10⁵個，且基於組成物中的總細胞數為100%時，該人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於5%；該人類CD16陽性自然殺手細胞具有以下特徵：

i)表達一CD16受體，

ii)在經過至少三個月的繼代培養後仍保持其增殖的能力，以及

iii)包含一被表達中的編碼CD16受體的多核苷酸序列，其中該編碼CD16受體的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送進細胞內的。

較佳者，該組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞數為5×10⁵~5×10⁹個。

較佳者，該組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞數為1×10⁶、1.1×10⁶、5×10⁶、5.1×10⁶、1×10⁷、1.1×10⁷、5×10⁷、5.1×10⁷、1×10⁸、1.1×10⁸、5×10⁸、5.1×10⁸、1×10⁹、1.1×10⁹、或5×10⁹個。

較佳者，基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的總量為5%~100%。

較佳者，基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於5%、7%、9%、10%、12%、15%、19%、20%、22%、25%、29%、30%、32%、35%、39%、40%、42%、45%、49%、 50%、52%、55%、59%、60%、62%、65%、69%、70%、72%、75%、79%、80%、82%、85%、89%、或95%。

較佳者，該CD16受體為一CD16a受體或一CD16b受體。

較佳者，所述被表達的編碼CD16a受體或CD16b受體的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送進細胞內的。

一種取得一實質富含人類CD16陽性自然殺手細胞組成物的方法；該方法包含：

(a)取得一群寄存編號為ATCC CRL-2047的人類周邊血液自然殺手細胞；

(b)將該群人類周邊血液自然殺手細胞與一種對一CD16受體具有專一性的抗體接觸；以及

(c)將被抗體專一性地結合的細胞分離，從而取得該實質富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物；

其中，該人類CD16陽性自然殺手細胞包含一被表達的編碼一CD16受體的多核苷酸，且該被表達的編碼CD16受體的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送進細胞內的。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞在經過至少三個月的繼代培養後仍能保持其增殖的能力。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞在經過至少一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、或十一個月的繼代培養後仍能保持其增殖的能力。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞在經過至少一年、兩年、或三年的繼代培養後仍能保持其增殖的能力。

較佳者，該被表達的編碼CD16受體的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送進細胞內的。

較佳者，該組成物中，基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於80%。

較佳者，基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於5%。

較佳者，基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於50%。

較佳者，溶解於培養基中的葡萄糖的濃度大於1500mg/L。

較佳者，該培養基是充分通氣的，溶解於培養基中的氧氣的濃度維持在一個穩定的範圍，或是溶解於培養基中的葡萄糖的濃度為1500~5000mg/L。

較佳者，溶解於該培養基中的葡萄糖的濃度為2500、2501、3500、3501、4000、或4500mg/L。

較佳者，組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞數至少為5×10⁵個，且基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於5%。

較佳者，組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞數為5×10⁵~5×10⁹個。

較佳者，組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞數為1×10⁶、1.1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、1.1×10⁷、5×10⁷、5.1×10⁷、1×10⁸、1.1×10⁸、5×10⁸、5.1×10⁸、1×10⁹、1.1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、1.1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹、1.1×10¹¹、5×10¹¹、5.1×10¹¹、1×10¹²、1.1×10¹²、5×10¹²、5.1×10¹²、1×10¹³、1.1×10¹⁴、5×10¹⁴、1×10¹⁵、1.1×10¹⁵、5×10¹⁵、1×10¹⁶、1.1×10¹⁶、5×10¹⁶、5.1×10¹⁶、1×10¹⁷、1.1×10¹⁷、5×10¹⁷、5.1×10¹⁷、1×10¹⁸、1.1×10¹⁸、5×10¹⁸、1×10¹⁹、1.1×10¹⁹、5×10¹⁹、1×10²⁰、1.1×10²⁰、5×10²⁰、5.1×10²⁰、1×10²¹、1.1×10²¹、5×10²¹、5.1×10²¹、1×10²²、1.1×10²²、5×10²²、1×10²³、1.1×10²³、5×10²³、1×10²⁴、1.1×10²⁴、5×10²⁴、5.1×10²⁴、1×10²⁵、1.1×10²⁵、5×10²⁵、5.1×10²⁵、1×10²⁶、1.1×10²⁶、5×10²⁶、1×10²⁷、1.1×10²⁷、5×10²⁷、1×10²⁸、1.1×10²⁸、5×10²⁸、5.1×10²⁸、1×10²⁹、1.1×10²⁹、5×10²⁹、5.1×10²⁹、1×10³⁰、1.1×10³⁰、5×10³⁰、1×10³¹、1.1×10³¹、5×10³¹、1×10³²、1.1×10³²、5×10³²、5.1×10³²、1×10³³、1.1×10³³、5×10³³、5.1×10³³、1×10³⁴、1.1×10³⁴、5×10³⁴、1×10³⁵、1.1×10³⁵、5×10³⁵、1×10³⁶、1.1×10³⁶、5×10³⁶、5.1×10³⁶、1×10³⁷、1.1×10³⁷、5×10³⁷、5.1×10³⁷、1×10³⁸、1.1×10³⁸、5×10³⁸、1×10³⁹、1.1×10³⁹、5×10³⁹、5.1×10³⁹、1×10⁴⁰、1.1×10⁴⁰、5×10⁴⁰個。較佳者，組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞數為1×10⁶~1×10⁴¹個。

較佳者，基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的總數為5%~100%。

較佳者，基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於5%、7%、9%、10%、12%、15%、19%、 20%、22%、25%、29%、30%、32%、35%、39%、40%、42%、45%、49%、50%、52%、55%、59%、60%、62%、65%、69%、70%、72%、75%、79%、80%、82%、85%、89%、或95%。

本發明還提供一種培養和擴增人類CD16陽性自然殺手細胞的方法；該方法包含

(x)在一容器中，將人類CD16陽性自然殺手細胞與一包含人類血小板裂解物(human platelet lysate)和介白素-2(IL-2)的培養基接觸；以及

(y)培養細胞數日；

其中該人類CD16陽性自然殺手細胞包含一被表達的編碼一CD16受體的多核苷酸，同時該被表達的編碼CD16受體的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送進細胞內的。

較佳者，溶解於培養基中的葡萄糖的濃度大於1500mg/L。

較佳者，步驟(y)包含以下子步驟：

(y1)培養該細胞至少一天；以及

(y2)繼代培養該細胞至少三個月。

較佳者，其中步驟(y2)為繼代培養該細胞至少一週、兩週、三週，一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、或十一個月。

較佳者，其中步驟(y2)為繼代培養該細胞至少一年、兩年、或三年。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞在經過至少三個月的繼代培養後仍能保持其增殖能力。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞在經過至少一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、或十一個月的繼代培養後仍能保持其增殖能力。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞在經過至少一年、兩年、或三年的繼代培養後仍能保持其增殖能力。

較佳者，該被表達的編碼CD16受體的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或非不是被意送進細胞內的。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞表達CD2分子(CD2陽性)。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞表達NKp44、NKp46、NKG2D、或CD107a。

本發明提供一種具有以下特徵的人類自然殺手細胞：

i)表達一CD16受體；

ii)在經過至少三個月的繼代培養後仍保持其增殖能力；以及

iii)包含一被表達的編碼CD16受體的CD16A基因，其中該被表達的CD16A基因位於一號染色體的q臂。

較佳者，該被表達的CD16A基因位於一號染色體q臂的第1q23.3位點。

本發明提供一種具有以下特徵的人類自然殺手細胞：

i)表達一CD16受體；

iii)包含一被表達的編碼CD16受體的CD16A基因，其中該被表達的CD16A基因的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被特意送進細胞內的。

較佳者，該被表達的CD16A基因的多核苷酸序列不是合成的、不是基因改造的且/或不是被造特意送進細胞內的。

本發明提供一種人類自然殺手細胞，其為

(A)寄存在NPMD且具有寄存序號NITE BP-03017；或

(B)具有以下特徵：

i)表達一CD16受體；

iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意遞送(deliberately delivered)的編碼CD16受體的多核苷酸，或

y)通過使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)分析細胞的基因組去氧核醣核酸(genomic DNA)，被CD16 F176F探針檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)與被CD16 F176V探針檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)的比例等於或大於1，其中CD16 F176F探針的序列為SEQ ID NO：11，且CD16 F176V探針的序列為SEQ ID NO：12。

較佳者，該CD16受體為一CD16a受體或一CD16b受體。

較佳者，一被表達的編碼CD16受體的多核苷酸位於一號染色體q臂的第1q23.3位點。

較佳者，該細胞對一免疫力不全的小鼠不具致癌性(non-tumorigenic)。

較佳者，在經過γ射線照射過後，該細胞對一同種異體的個體不具致癌性(non-tumorigenic)。

較佳者，一編碼CD16受體的多核苷酸包含一SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：19核苷酸序列。

較佳者，該CD16受體包含一SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：20胺基酸序列。

較佳者，該細胞更包含一失活的腫瘤抑制基因(inactive tumor suppressor gene)或一經突變且高度表達的致癌基因(highly expressed oncogene)。

較佳者，該細胞能媒介一抗體依賴性細胞介導的細胞毒性反應，且該細胞為一雄性細胞。

較佳者，該細胞還包含至少一複合於該細胞的外因性靶向單元(exogenous targeting unit)，其中該外因性靶向單元包含一靶向部分(targeting moiety)，該靶向部分的特徵在於：

(a)它對一目標細胞上的一生物標記展現專一性連結(binding)；

(b)它不是一種核酸(nucleic acid)；以及

(c)它不是由該細胞產生。

較佳者，該外因性靶向單元是透過共軛(conjugated)於該靶向部分的一第一鏈接器(first linker)和共軛於該細胞的一第二鏈接器(second linker)之間的一種作用力(interaction)，複合於該細胞。

較佳者，該第一鏈接器是一第一多核苷酸，或該第二鏈接器是一第二多核苷酸。

較佳者，該靶向部分包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)。

較佳者，該第一多核苷酸包含一段單股區域(single-stranded region)。

較佳者，該第一鏈接器是一第一多核苷酸，且該第二鏈接器是一第二多核苷酸。

較佳者，該第一鏈接器和該第二鏈接器是選自下列組群：一DNA結合結構域(DNA binding domain)和一目標DNA、一白胺酸拉鍊型構型(leucine zipper)和一目標DNA、生物素(biotin)和抗生物素蛋白(avidin)、生物素和鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)、攜鈣素結合蛋白(calmodulin binding protein)和攜鈣素(calmodulin)、一荷爾蒙和一荷爾蒙受體、凝集素(lectin)和一種碳水化合物(carbohydrate)、一細胞膜受體和一受體配體(receptor ligand)、一酵素和一受質(substrate)、一抗原和一抗體、一促效劑(agonist)和一拮抗劑(antagonist)、能雜交的多核苷酸序列分子(polynucleotide hybridizing sequences)、一核酸適體(aptamer)及一目標分子、一鋅指蛋白(zinc finger)和一目標DNA。

較佳者，該第一鏈接器包含一第一反應基團(first reactive group)，且該第二鏈接器包含一第二反應基團(second reactive group)，且其中該細胞藉由第二反應基團和第一反應基團間的一種反應(reaction)所形成的一共價鍵(covalent bond)複合於(complexed to)該靶向部分(targeting moiety)。

較佳者，該靶向部分包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)。

較佳者，該第二鏈接器包含一聚乙二醇區域(PEG region)。

較佳者，該靶向部分和該細胞間的間隔長度為1nm到400nm，或該靶向部分和該細胞間的間隔長度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、60、70、80、90、100、130、170、200、230、270、300、330、或370nm。

較佳者，該外因性靶向單元包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)，該抗原結合單元與癌症抗原(cancer antigen)、醣脂(glycolipid)、醣蛋白(glycoprotein)、呈現於一造血群系細胞上的分化抗原叢(cluster of differentiation antigen present on cells of a hematopoietic lineage)、γ-麩胺醯基轉胜肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白(adhesion protein)、荷爾蒙、生長因子(growth factor)、細胞激素、配體受體(ligand receptor)、離子通道、膜結合形式的一免疫球蛋白μ鏈(membrane-bound form of an immunoglobulin μ)、甲型胎兒蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反應蛋白(C-reactive protein)、嗜鉻血液細胞分泌素A(chromogranin A)、上皮黏蛋白抗原(epithelial mucin antigen)、人類上皮細胞特異抗原(human epithelium specific antigen)、路易士(a)(Lewis(a))抗原、多重抗藥性相關蛋白(multidrug resistance related protein)、Neu致癌基因蛋白(Neu oncogene protein)、神經元特異性烯醇酶(neuron specific enolase)、P型醣蛋白、多重抗藥性相關抗原、p170、多重抗藥性相關抗原、前列腺特異性抗原(prostate specific antigen)、神經細胞黏附分子(NCAM)、神經節苷脂分子(ganglioside molecule)、MART-1、熱休克蛋白(heat shock protein)、唾液酸多醣(sialylTn)、酪胺酸酶(tyrosinase)、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成長因子受體(EGF-R)、血管內皮生長因子(VEGF)、或黑色素瘤相關抗原(MAGE)結合。

較佳者，該抗原結合單元(antigen-binding unit)是一種抗癌症抗原的抗體，且該癌症抗原選自HER2/neu(ERBB2)、人類表皮生長因子受體3(HER3)(ERBB3)、上皮成長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、GD2、細胞毒性T細胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮細胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白16(MUC16))、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(計畫性死亡-配體1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(間皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、CD3、巨噬細胞移行抑制因子(MIF)、葉酸受體α(folate receptor alpha；FOLR1)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、運鐵蛋白受體(TfR)、黏蛋白1(MUC1)、CD25(介白素-2受體(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受體(CSF1R))、介白素1B(IL1B)、CD105(內皮糖蛋白(Endoglin))、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、介白素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生長素2(angiopoietin 2)、神經纖毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴細胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(腫瘤壞死因子受體超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密連蛋白1(Claudin1)(CLDN1)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相關細胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纖維母細胞生長因子受體3(FGFR3)、一種殺手細胞免疫球蛋白樣受體(a killer-cell immunoglobulin-like receptors；KIRs)、一種腫瘤壞死因子(TNF)受體蛋白(a TNF receptor protein)、一種免疫球蛋白、一種細胞激素受體(a cytokine receptor)、一種整合素(integrin)、激活自然殺手細胞的受體(activating NK cell receptors)及其組合。

較佳者，該靶向部分是藉由一耦合基團(coupling group)共軛於(conjugated to)該第一多核苷酸，其中所述耦合基團為一NHS酯(NHS ester)、其他活化後的酯(ester)、一烷基或醯基鹵(alkyl or acyl halide)、一雙功能化的交聯劑(bifunctional crosslinker)或順丁烯二醯亞胺基團(maleimide group)。

較佳者，該第一多核苷酸或第二多核苷酸包含一從下列選出的序列：20個核苷酸單元的多聚CA(20-mer poly-CA)、20個核苷酸的多聚GGTT(20-mer poly-GGTT)、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、23個核苷酸單元的序列SEQ ID NO：7(23-mer SEQ ID NO：7)、和SEQ ID NO：10。

較佳者，該靶向部分對該生物標記(biological marker)的結合親和力(binding affinity)小於250nM，或該靶向部分對該生物標記的結合親和力為5nM、10nM、40nM、90nM、130nM、或170nM。

較佳者，該第一多核苷酸的長度或該第二多核苷酸的長度為4nt到500nt。較佳者，該第一多核苷酸的長度或第二多核苷酸的長度為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、160、220、300、400、或480nt。

較佳者，第一鏈接器和第二鏈接器的結合親和力小於250nM。較佳者，第一鏈接器和第二鏈接器的結合親和力為5nM、10nM、40nM、90nM、130nM、或170nM。

較佳者，該第一鏈接器或該第二鏈接器共軛(conjugated)在該靶向單元的一原生功能基團(native functional group)或該細胞的一表面上，其中該原生功能基團為一胺基酸、一糖基(sugar)或一胺基(amine)。

較佳者，該靶向部分為一胜肽、蛋白質、或核酸適體(aptamer)。

本發明提供一種實質上富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物，其中、該組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞數至少為5×10⁵個，且基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於5%；該人類CD16陽性自然殺手細胞為

(A)寄存在NPMD且具有寄存編號NITE BP-03017；或

(B)具有以下特徵：

i)表達一CD16受體；

y)通過使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)分析細胞的基因組去氧核醣核酸(genomic DNA)，能被CD16 F176F探針檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)與能被CD16 F176V探針檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)的比例等於或大於1，其中CD16 F176F探針的序列為SEQ ID NO：11，且CD16 F176V探針的序列為SEQ ID NO：12。

較佳者，該CD16受體為一CD16a受體或一CD16b受體。

較佳者，一編碼CD16受體的多核苷酸位於一號染色體q臂的第1q23.3位點。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞對一免疫力不全的小鼠不具致癌性。

較佳者，在經過γ射線照射過後，該人類CD16陽性自然殺手細胞對一同種異體的個體沒有致癌性。

較佳者，該CD16受體包含一為SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：20胺基酸序列。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞更包含一失活的腫瘤抑制基因(inactive tumor suppressor gene)或一突變過且高度表達的致癌基因(oncogene)。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞能媒介一抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應(ADCC)，且該細胞為一雄性細胞(male cell)。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞更包含至少一複合於(complexed to)該人類CD16陽性自然殺手細胞的外因性靶向單元(exogenous targeting unit)，其中所述外因性靶向單元包含一靶向部分(targeting moiety)，該靶向部分的特徵在於：

(a)它對一目標細胞上的一生物標記(biological marker)展現專一性連結(binding)；

(b)它不是一種核酸(nucleic acid)；以及

(c)它不是由該人類CD16陽性自然殺手細胞產生。

較佳者，該外因性靶向單元是透過共軛(conjugated)於靶向部分的一第一鏈接器(first linker)和共軛於該人類CD16陽性自然殺手細胞的一第二鏈接器(second linker)之間的一種作用力(interaction)，複合於該人類CD16陽性自然殺手細胞。

較佳者，所述靶向部分包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)。

較佳者，所述第一多核苷酸包含一段單股區域(single-stranded region)。

較佳者，該第一鏈接器和該第二鏈接器是選自下列組群：一DNA結合結構域(DNA binding domain)和一目標DNA、一白胺酸拉鍊型構型(leucine zipper)和一目標DNA、生物素(biotin)和抗生物素蛋白(avidin)、生物素和鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)、攜鈣素結合蛋白(calmodulin binding protein)和攜鈣素(calmodulin)、一荷爾蒙和一荷爾蒙受體、凝集素(lectin)和一種碳水化合物(carbohydrate)、一細胞膜受體和一受體配體(receptor ligand)、一酵素和一受質(substrate)、一抗原和一抗體、一促效劑(agonist)和一拮抗劑(antagonist)、複數個能雜交的多核苷酸序列分子(polynucleotide hybridizing sequences)、一核酸適體(aptamer)及一目標分子、一鋅指蛋白(zinc finger)和一目標DNA。

較佳者，該第一鏈接器包含一第一反應基團(first reactive group)，且該第二鏈接器包含一第二反應基團(second reactive group)，其中該人類CD16陽性自然殺手細胞藉由第二反應基團和第一反應基團間的一種反應(reaction)所形成的一共價鍵(covalent bond)複合於(complexed to)該靶向部分(targeting moiety)。

較佳者，該靶向部分包含一抗原結合區(antigen-binding unit)。

較佳者，該第二鏈接器包含一聚乙二醇(PEG)區域。

較佳者，該靶向部分和該人類CD16陽性自然殺手細胞間的間隔長度為1nm到400nm。

較佳者，該外因性靶向單元包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)，該抗原結合單元與癌症抗原、醣脂、醣蛋白、呈現於一造血群系細胞上的分化抗原叢、γ-麩胺醯基轉胜肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白、荷爾蒙、生長因子、細胞激素、配體受體、離子通道、膜結合形式的一免疫球蛋白μ鏈、甲型胎兒蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反應蛋白、嗜鉻血液細胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人類上皮細胞特異抗原、路易士(a)(Lewis(a))抗原、多重抗藥性相關蛋白、Neu致癌基因蛋白、神經元特異性烯醇酶(enolase)、P型醣蛋白、多重抗藥性相關抗原、p170、多重抗藥性相關抗原、前列腺特異性抗原、神經细胞黏附分子(NCAM)、神經節苷脂分子、MART-1、熱休克蛋白、唾液酸多醣(sialylTn)、酪胺酸酶、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成長因子受體(EGF-R)、血管內皮生長因子(VEGF)、或黑色素瘤相關抗原(MAGE)結合。

較佳者，該抗原結合單元是一種抗癌症抗原的抗體，且該癌症抗原選自HER2/neu(ERBB2)、人類表皮生長因子受體3(HER3)(ERBB3)、上皮成長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、GD2、細胞毒性T細胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮細胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白16(MUC16))、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(計畫性死亡-配體1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(間皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、CD3、巨噬細胞移行抑制因子(MIF)、葉酸受體α(folate receptor alpha；FOLR1)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、運鐵蛋白受體(TfR)、黏蛋白1(MUC1)、CD25(介白素-2受體(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受體(CSF1R))、介白素1B(IL1B)、CD105(內皮糖蛋白(Endoglin))、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、介白素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生長素2(angiopoietin 2)、神經纖毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴細胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(腫瘤壞死因子受體超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密連蛋白1(Claudin1)(CLDN1)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相關細胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纖維母細胞生長因子受體3(FGFR3)、一種殺手細胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptors；KIRs)、一種腫瘤壞死因子(TNF)受體蛋白(TNF receptor protein)、一種免疫球蛋白、一種細胞激素受體、一種整合素(integrin)、激活自然殺手細胞的受體(activating NK cell receptors)及其組合。

較佳者，該第一多核苷酸或第二多核苷酸的序列包含一從下列選出的序列：20個核苷酸單元的多聚CA(20-mer poly-CA)、20個核苷酸的多聚GGTT(20-mer poly-GGTT)、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、23個核苷酸單元的序列SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：10。

較佳者，該靶向部分對該生物標記(biological marker)的結合親和力(binding affinity)小於250nM。

較佳者，該第一多核苷酸的長度或該第二多核苷酸的長度為4nt~500nt。

較佳者，該第一鏈接器(first linker)和該第二鏈接器(second linker)的結合親和力(binding affinity)小於250nM。

較佳者，該第一鏈接器或該第二鏈接器共軛(conjugated)在靶向單元的一原生功能基團(native functional group)或人類CD16陽性自然殺手細胞的一表面上，其中所述原生功能基團為一胺基酸、一糖基(sugar)或一胺基(amine)。

較佳者，該靶向部分為一胜肽、蛋白質或核酸適體(aptamer)。

本發明提供一種取得一實質富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物的方法；該方法包含：

(b)將該群人類周邊血液自然殺手細胞與一種對一CD16受體具專一性的抗體接觸；以及

其中該人類CD16陽性自然殺手細胞為：

(A)寄存在NPMD且具有寄存序號NITE BP-03017；或

(B)具有以下特徵：

i)表達一CD16受體；

ii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意遞送(deliberately delivered)的編碼CD16受體的多核苷酸，或

y)通過使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)分析細胞的基因組去氧核醣核酸(genomic DNA)，能被CD16 F176F探針檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)與能被CD16 F176V探針檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)的比例等於或大於1，其中CD16 F176F探針的序列為SEQ ID NO：11，且 CD16 F176V探針的序列為SEQ ID NO：12。

較佳者，該抗體至少對一CD16a受體或一CD16b受體其中之一具有專一性。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞在經過至少一週的繼代培養後仍能保持其增殖的能力。

較佳者，在經過γ射線照射過後，該人類CD16陽性自然殺手細胞對一同種異體的個體不具致癌性。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞更包含一失活的腫瘤抑制基因(inactive tumor suppressor)或一突變過且高度表達的致癌基因(oncogene)。

較佳者，在該組成物中，基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於5%。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞能媒介一抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應(ADCC)，且該人類CD16陽性自然殺手細胞為雄性細胞。

較佳者，步驟(c)包含下列子步驟：

(c1)將被抗體專一性地結合的細胞分離出來；

(c2)在一容器中，讓被抗體專一性地結合的細胞與一含有人類血小板裂解物(human platelet lysate)和介白素-2(IL-2)的培養基接觸；以及

(c3)培養細胞複數日，從而取得該實質富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物。

較佳者，該容器為高速細胞培養擴增裝置(G-Rex culture devices)。

較佳者，該容器包含一可透氣(air-permeable)且不透水(water-impermeable)的用於接種細胞的底面(bottom)。

較佳者，溶於培養基中的葡萄糖的濃度為1500~5000mg/L。

較佳者，該組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞數至少為5×10⁵個，且基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於5%。

本發明提供一種培養和擴增人類CD16陽性自然殺手細胞的方法；該方法包含：

(x)在一容器中，讓人類CD16陽性自然殺手細胞和一包含0.5~10vol%的人類血小板裂解物(human platelet lysate)及100~3000IU/mL介白素-2(IL-2)的培養基接觸；以及

(y)培養細胞複數日。

較佳者，該培養基含有1vol%、2vol%、3vol%、4vol%、5vol%、6vol%、7vol%、8vol%、9vol%、10vol%、11vol%、12vol%、13vol%、14vol%、或15vol%的人類血小板裂解物(humanplatelet lysate)。較佳者，該培養基含有0.5~20vol%的人類血小板裂解物。較佳者，該培養基含有100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、或3000IU/mL的介白素-2(IL-2)。

較佳者，溶於培養基中的葡萄糖的濃度為1500~5000mg/L。

較佳者，步驟(y)包含下列子步驟：

(y1)培養細胞至少一天；以及

(y2)繼代培養細胞至少一個月。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞為：

(A)寄存在NPMD且具有寄存編號NITE BP-03017；或

(B)具有以下特徵：

i)表達一CD16受體；以及

y)通過使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)分析細胞的基因組去氧核醣核酸，能被CD16 F176F探針檢測到的去氧核醣核酸分子與能被CD16 F176V探針檢測到的去氧核醣核酸分子的比例等於或大於1，其中CD16 F176F探針的序列為SEQ ID NO：11，且CD16 F176V探針的序列為SEQ ID NO：12。

較佳者，該人類CD16陽性自然殺手細胞更含有一失活的腫瘤抑制基因(inactive tumor suppressor)或一突變過且高度表達的致癌基因(oncogene)。

本發明提供一種治療癌症、自體免疫疾病、神經疾病、人類免疫不全病毒(HIV)感染、造血細胞相關疾病、代謝症候群、病原性疾病、病毒感染、細菌感染的方法，包含給一有需要的個體施用一種含有一有效劑量的一人類自然殺手細胞的組成物；所述人類自然殺手細胞為：

(A)寄存在NPMD且具有寄存編號NITE BP-03017；或

(B)具有以下特徵：

i)表達一CD16受體；

y)通過使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)分析該人類自然殺手細胞的基因組去氧核醣核酸，能被CD16 F176F探針檢測到的去氧核醣核酸分子與能被CD16 F176V探針檢測到的去氧核醣核酸分子的比例等於或大於1，其中CD16 F176F探針的序列為SEQ ID NO：11，且CD16 F176V探針的序列為SEQ ID NO：12。

較佳者，該人類自然殺手細胞更包含至少一外因性靶向單元(exogenous targeting unit)複合於(complexed to)該人類自然殺手細胞，其中該外因性靶向單元包含一靶向部分(targeting moiety)，該靶向部分的特徵在於：

(b)它不是一種核酸(nucleic acid)；以及

(c)它不是由該人類自然殺手細胞產生。

較佳者，該外因性靶向單元是透過共軛於靶向部分的一第一鏈接器，和共軛於人類自然殺手細胞上的一第二鏈接器之間的一種作用力，複合於人類自然殺手細胞上。

較佳者，該第一鏈接器(first linker)是一第一多核苷酸(first polynucleotide)，或該第二鏈接器(second linker)是一第二多核苷酸(second polynucleotide)。

較佳者，該靶向部分包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)。

較佳者，該第一鏈接器和該第二鏈接器是選自下列群組：一DNA結合結構域(DNA binding domain)和一目標DNA、一白胺酸拉鍊型構型和一目標DNA、生物素和抗生物素蛋白、生物素和鏈黴霉抗生物素蛋白、攜鈣素結合蛋白和攜鈣素、一荷爾蒙和一荷爾蒙受體、凝集素和一種碳水化合物、一細胞膜受體和一受體配體、一酵素和一受質、一抗原和一抗體、一促效劑和一拮抗劑、複數個能雜交的多核苷酸序列分子、一核酸適體及一目標分子、一鋅指蛋白和一目標DNA。

較佳者，所述第一鏈接器包含一第一反應基團(first reactive group)，且第二鏈接器包含一第二反應基團(second reactive group)，其中人類自然殺手細胞藉由第二反應基團和第一反應基團的一種反應(reaction)所形成的一共價鍵(covalent bond)複合於(complexed to)靶向部分。

較佳者，該靶向部分包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)。

較佳者，該第二鏈接器含有一聚乙二醇(PEG)區域。

較佳者，該靶向部分和該人類自然殺手細胞間的間隔長度為1nm到400nm。

較佳者，該外因性靶向單元包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)，所述抗原結合單元與癌症抗原、醣脂、醣蛋白、呈現於一造血群系細胞上的分化抗原叢、γ-麩胺醯基轉胜肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白、荷爾蒙、生長因子、細胞激素、配體受體、離子通道、膜結合形式的一免疫球蛋白μ鏈、甲型胎兒蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反應蛋白、嗜鉻血液細胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人類上皮細胞特異抗原、路易士(a)(Lewis(a))抗原、多重抗藥性相關蛋白、Neu致癌基因蛋白、神經元特異性烯醇酶(enolase)、P型醣蛋白、多重抗藥性相關抗原、p170、多重抗藥性相關抗原、前列腺特異性抗原、神經细胞黏附分子(NCAM)、神經節苷脂分子、MART-1、熱休克蛋白、唾液酸多醣(sialy1Tn)、酪胺酸酶、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成長因子受體(EGF-R)、血管內皮生長因子(VEGF)、或黑色素瘤相關抗原(MAGE)結合。

較佳者，該抗原結合單元是一種抗癌症抗原的抗體，且該癌症抗原選自HER2/neu(ERBB2)、人類表皮生長因子受體3(HER3)(ERBB3)、上皮成長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、GD2、細胞毒性T細胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326 (上皮細胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白16(MUC16))、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(計畫性死亡-配體1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(間皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、CD3、巨噬細胞移行抑制因子(MIF)、葉酸受體α(folate receptor alpha；FOLR1)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、運鐵蛋白受體(TfR)、黏蛋白1(MUC1)、CD25(介白素-2受體(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受體(CSF1R))、介白素1B(IL1B)、CD105(內皮糖蛋白(Endoglin))、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、介白素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生長素2(angiopoietin 2)、神經纖毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴細胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(腫瘤壞死因子受體超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密連蛋白1(Claudin1)(CLDN1)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相關細胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纖維母細胞生長因子受體3(FGFR3)、一種殺手細胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptors；KIRs)、一種腫瘤壞死因子(TNF)受體蛋白(TNF receptor protein)、一種免疫球蛋白、一種細胞激素受體、一種整合素(integrin)、激活自然殺手細胞的受體(activating NK cell receptors)、及其組合。

較佳者，該第一多核苷酸或第二多核苷酸包含一從下列選出的序列：20個核苷酸單元的多聚CA(20-mer poly-CA)、20個核苷酸的多聚GGTT(20-mer poly-GGTT)、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、23個核苷酸單元的序列SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：10。

較佳者，該靶向部分(targeting moiety)對該生物標記(biological marker)的結合親和力(binding affinity)小於250nM。較佳者，該靶向部分對該生物標記的結合親和力為5nM、10nM、40nM、90nM、130nM、或170nM。

較佳者，該第一多核苷酸的長度或該第二多核苷酸的長度為4nt~500nt。較佳者，該第一多核苷酸的長度或該第二多核苷酸的長度為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、160、220、300、400、或480nt。

較佳者，該第一鏈接器(first linker)和該第二鏈接器(second linker)的結合親和力(binding affinity)小於250nM。較佳者，第一鏈接器和第二鏈接器的結合親和力為2、10、25、50、62、70、85、100、102、110、125、150、162、170、185、200、202、210、225、或250nM。

較佳者，該第一鏈接器或該第二鏈接器共軛(conjugated)在該靶向單元(targeting unit)的一原生功能基團(native functional group)或該細胞的一表面，其中該原生功能基團為一胺基酸、一糖基(sugar)或一胺基(amine)。

較佳者，該CD16受體是一CD16a受體或一CD16b受體。

較佳者，該人類自然殺手細胞更包含一失活的腫瘤抑制基因 (inactive tumor suppressor gene)或一經突變且高度表達的致癌基因(oncogene)。

較佳者，該人類自然殺手細胞能媒介一抗體依賴性細胞介導的細胞毒性反應，且該人類自然殺手細胞為一雄性細胞。

較佳者，該組成物中的人類自然殺手細胞數至少為5×10⁵個，且基於該組成物中的總細胞數為100%時，人類自然殺手細胞的數量為等於或大於5%。

較佳者，該個體為一人體。

較佳者，該方法是用於治療選自下列的癌症：棘皮瘤(Acanthoma)、腺細胞癌(Acinic cell carcinoma)、聽神經瘤(Acoustic neuroma)、肢端小痣性黑色素瘤(Acral lentiginous melanoma)、汗腺頂端汗腺瘤(Acrospiroma)、急性嗜酸性粒細胞白血病(Acute eosinophilic leukemia)、急性淋巴母細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia)、急性巨核母細胞白血病(Acute megakaryoblastic leukemia)、急性單核細胞白血病(Acute monocytic leukemia)、急性成熟骨髓芽球性白血病(Acute myeloblastic leukemia with maturation)、急性髓源型樹突狀細胞白血病(Acute myeloid dendritic cell leukemia)、急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia)、急性前髓細胞白血病(Acute promyelocytic leukemia)、牙釉母細胞瘤(Adamantinoma)、腺癌(Adenocarcinoma)、腺樣囊狀癌(Adenoid cystic carcinoma)、腺瘤(Adenoma)、牙源性腺瘤樣腫瘤(Adenomatoid odontogenic tumor)、腎上腺皮質癌(Adrenocortical carcinoma)、成人型T細胞白血病(Adult T-cell leukemia)、侵略性NK細胞白血病(Aggressive NK-cell leukemia)、愛滋病相關癌症 (AIDS-Related Cancers)、愛滋病相關淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)、肺泡狀軟組織肉瘤(Alveolar soft part sarcoma)、造釉細胞性纖維瘤(Ameloblastic fibroma)、肛門癌(Anal cancer)、間變性大細胞淋巴瘤(Anaplastic large cell lymphoma)、甲狀腺未分化癌(Anaplastic thyroid cancer)、血管免疫芽細胞性T細胞淋巴瘤(Angioimmunoblastic T-cell lymphoma)、血管平滑肌脂肪瘤(Angiomyolipoma)、血管肉瘤(Angiosarcoma)、闌尾癌(Appendix cancer)、星細胞瘤(Astrocytoma)、非典型畸胎/類橫紋肌細胞瘤(Atypical teratoid rhabdoid tumor)、基底細胞癌(Basal cell carcinoma)、類基底細胞癌(Basal-like carcinoma)、B細胞白血病(B-cell leukemia)、B細胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)、Bellini集合管癌(Bellini duct carcinoma)、膽道癌(Biliary tract cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、胚細胞瘤(Blastoma)、骨癌(Bone Cancer)、骨腫瘤(Bone tumor)、腦幹膠質瘤(Brain Stem Glioma)、腦瘤(Brain Tumor)、乳癌(Breast Cancer)、布倫內羅氏瘤(Brenner tumor)、支氣管腫瘤(Bronchial Tumor)、支氣管肺泡腺癌(Bronchioloalveolar carcinoma)、棕色瘤(Brown tumor)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、原發部位不明的癌(Cancer of Unknown Primary Site)、類癌瘤(Carcinoid Tumor)、上皮細胞癌(Carcinoma)、原位癌(Carcinoma in situ)、陰莖癌(Carcinoma of the penis)、原發部位不明轉移癌(Carcinoma of Unknown Primary Site)、癌肉瘤(Carcinosarcoma)、Castleman氏病(Castleman's Disease)、中樞神經系統胚胎性腫瘤(Central Nervous System Embryonal Tumor)、小腦星狀細胞瘤(Cerebellar Astrocytoma)、大腦星狀細胞瘤(Cerebral Astrocytoma)、子宮頸癌(Cervical Cancer)、膽管癌(Cholangiocarcinoma)、軟骨癌(Chondroma)、軟骨肉瘤 (Chondrosarcoma)、脊索瘤(Chordoma)、絨毛膜癌(Choriocarcinoma)、脈絡叢乳頭狀瘤(Choroid plexus papilloma)、慢性淋巴性白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia)、慢性單核細胞白血病(Chronic monocytic leukemia)、慢性粒細胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia)、慢性骨髓增生性疾病(Chronic Myeloproliferative Disorder)、慢性嗜中性白血病(Chronic neutrophilic leukemia)、透明細胞腫瘤(Clear-cell tumor)、大腸癌(Colon Cancer)、大腸直腸癌(Colorectal cancer)、顱咽管瘤(Craniopharyngioma)、皮膚T細胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma)、Degos氏病(Degos disease)、隆突性皮膚纖維肉瘤(Dermatofibrosarcoma protuberans)、皮樣囊腫(Dermoid cyst)、發育不良的小圓細胞瘤(Desmoplastic small round cell tumor)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma)、胚胎發育不良性神經上皮腫瘤(Dysembryoplastic neuroepithelial tumor)、胚胎性癌(Embryonal carcinoma)、內胚竇瘤(Endodermal sinus tumor)、子宮內膜癌(Endometrial cancer)、子宮內膜癌(Endometrial Uterine Cancer)、子宮內膜樣瘤(Endometrioid tumor)、腸道T細胞淋巴瘤(Enteropathy-associated T-cell lymphoma)、室管膜母細胞瘤(Ependymoblastoma)、室管膜瘤(Ependymoma)、上皮樣肉瘤(Epithelioid sarcoma)、紅血球性白血病(Erythroleukemia)、食道癌(Esophageal cancer)、敏感性神經胚細胞瘤(Esthesioneuroblastoma)、Ewing氏家族腫瘤(Ewing Family of Tumor)、Ewing氏家族肉瘤(Ewing Family Sarcoma)、Ewing氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、生殖細胞瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)、性腺外生殖細胞瘤(Extragonadal Germ Cell Tumor)、肝外膽管癌(Extrahepatic Bile Duct Cancer)、乳房外Paget氏病(Extramammary Paget's disease)、輸卵管癌(Fallopian tube cancer)、胎內胎(Fetus in fetu)、纖維瘤(Fibroma)、纖維肉瘤(Fibrosarcoma)、濾泡性淋巴瘤(Follicular lymphoma)、濾泡性甲狀腺癌(Follicular thyroid cancer)、膽癌(Gallbladder Cancer)、膽癌(Gallbladder cancer)、神經節膠質細胞瘤(Ganglioglioma)、神經節細胞瘤(Ganglioneuroma)、胃癌(Gastric Cancer)、胃淋巴癌(Gastric lymphoma)、腸胃道癌(Gastrointestinal cancer)、胃腸道類癌腫瘤(Gastrointestinal Carcinoid Tumor)、胃腸道基質腫瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor)、胃腸道基質腫瘤(Gastrointestinal stromal tumor)、生殖細胞瘤(Germ cell tumor)、胚細胞瘤(Germinoma)、妊娠絨毛膜癌(Gestational choriocarcinoma)、妊娠滋養細胞腫瘤(Gestational Trophoblastic Tumor)、骨巨細胞瘤(Giant cell tumor of bone)、多形性神經膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme)、神經膠質瘤(Glioma)、大腦神經膠瘤病(Gliomatosis cerebri)、球狀血管瘤(Glomus tumor)、升糖素瘤(Glucagonoma)、性腺胚瘤(Gonadoblastoma)、粒層細胞瘤(Granulosa cell tumor)、毛細胞白血病(Hairy Cell Leukemia)、毛細胞白血病(Hairy cell leukemia)、頭頸癌(Head and Neck Cancer)、頭頸癌(Head and neck cancer)、心臟癌(Heart cancer)、血管母細胞瘤(Hemangioblastoma)、血管外皮細胞瘤(Hemangiopericytoma)、血管肉瘤(Hemangiosarcoma)、血液惡性腫瘤(Hematological malignancy)、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma)、肝脾T細胞淋巴癌(Hepatosplenic T-cell lymphoma)、遺傳性乳癌與卵巢癌症候群(Hereditary breast-ovarian cancer syndrome)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s Lymphoma)、下咽癌 (Hypopharyngeal Cancer)、下視丘腦神經膠質瘤(Hypothalamic Glioma)、炎性乳腺癌(Inflammatory breast cancer)、眼內黑色素瘤(Intraocular Melanoma)、胰島細胞癌(Islet cell carcinoma)、胰島細胞瘤(Islet Cell Tumor)、少年性骨髓單核球白血病(Juvenile myelomonocytic leukemia)、卡波西氏肉瘤(Kaposi Sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma)、腎癌(Kidney Cancer)、肝門部膽管癌(Klatskin tumor)、Krukenberg氏瘤(Krukenberg tumor)、喉癌(Laryngeal Cancer)、喉癌(Laryngeal cancer)、惡性雀斑樣黑色素瘤(Lentigo maligna melanoma)、白血病(Leukemia)、白血病(Leukemia)、嘴唇及口腔癌症(Lip and Oral Cavity Cancer)、脂肪肉瘤(Liposarcoma)、肺癌(Lung cancer)、黃體瘤(Luteoma)、淋巴管瘤(Lymphangioma)、淋巴管肉瘤(Lymphangiosarcoma)、淋巴上皮瘤(Lymphoepithelioma)、淋巴細胞性白血病(Lymphoid leukemia)、淋巴瘤(Lymphoma)、巨球蛋白血症(Macroglobulinemia)、惡性纖維組織細胞瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma)、惡性纖維組織細胞瘤(Malignant fibrous histiocytoma)、惡性骨纖維組織細胞瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone)、惡性神經膠瘤(Malignant Glioma)、惡性間皮瘤(Malignant Mesothelioma)、惡性周邊神經鞘瘤(Malignant peripheral nerve sheath tumor)、惡性橫紋肌瘤(Malignant rhabdoid tumor)、惡性蠑螈瘤(Malignant triton tumor)、粘膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT lymphoma)、被套細胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma)、肥胖細胞白血病(Mast cell leukemia)、縱隔腔生殖細胞瘤(Mediastinal germ cell tumor)、縱隔腔腫瘤(Mediastinal tumor)、甲狀腺髓樣癌(Medullary thyroid cancer)、神經管胚細胞癌(Medulloblastoma)、神經管胚細胞癌 (Medulloblastoma)、髓上皮瘤(Medulloepithelioma)、黑色素瘤(Melanoma)、腦脊髓膜瘤(Meningioma)、Merkel氏細胞瘤(Merkel Cell Carcinoma)、間皮瘤(Mesothelioma)、間皮瘤(Mesothelioma)、原發不明鱗狀細胞癌之頸部轉移(Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary)、轉移性尿路上皮癌(Metastatic urothelial carcinoma)、混合米勒氏腫瘤(Mixed Mullerian tumor)、單核球白血病(Monocytic leukemia)、口癌(Mouth Cancer)、黏液癌(Mucinous tumor)、多發性內分泌腫瘤症候群(Multiple Endocrine NeoplasiaSyndrome)、多發性骨髓瘤(Multiple Myeloma)、多發性骨髓瘤(Multiple myeloma)、蕈狀肉芽腫(Mycosis Fungoides)、蕈狀肉芽腫(Mycosis fungoides)、骨髓增生性疾病(Myelodysplastic Disease)、骨髓增生異常症候群(Myelodysplastic Syndromes)、骨髓性白血病(Myeloid leukemia)、骨髓性肉瘤(Myeloid sarcoma)、骨髓增生性疾病(Myeloproliferative Disease)、黏液瘤(Myxoma)、鼻腔癌(Nasal Cavity Cancer)、鼻咽癌(Nasopharyngeal Cancer)、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、腫瘤(Neoplasm)、神經鞘瘤(Neurinoma)、神經母細胞瘤(Neuroblastoma)、神經母細胞瘤(Neuroblastoma)、神經纖維瘤(Neurofibroma)、神經瘤(Neuroma)、結節性惡性黑色素瘤(Nodular melanoma)、非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、非黑色素瘤的皮膚癌(Non melanoma Skin Cancer)、非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer)、眼部腫瘤(Ocular oncology)、寡星狀細胞瘤(Oligoastrocytoma)、寡樹突神經膠質瘤(Oligodendroglioma)、嗜酸細胞瘤(Oncocytoma)、視神經鞘腦膜瘤(Optic nerve sheath meningioma)、口腔癌(Oral Cancer)、口腔癌(Oral cancer)、口咽癌 (Oropharyngeal Cancer)、骨肉瘤(Osteosarcoma)、卵巢癌(Ovarian Cancer)、卵巢癌(Ovarian cancer)、上皮卵巢癌(Ovarian Epithelial Cancer)、卵巢生殖細胞腫瘤(Ovarian Germ Cell Tumor)、卵巢低惡性瘤(Ovarian Low Malignant Potential Tumor)、乳腺博德氏Paget疾病(Paget's disease of the breast)、肺上溝癌(Pancoast tumor)、胰臟癌(Pancreatic Cancer)、胰臟癌(Pancreatic cancer)、乳頭狀甲狀腺癌(Papillary thyroid cancer)、乳突瘤病(Papillomatosis)、副神經節瘤(Paraganglioma)、鼻竇癌(Paranasal Sinus Cancer)、甲狀旁腺腺瘤(Parathyroid Cancer)、陰莖癌(Penile Cancer)、血管周圍上皮樣細胞瘤(Perivascular epithelioid cell tumor)、咽癌(Pharyngeal Cancer)、嗜鉻細胞瘤(Pheochromocytoma)、中分化松果體實質腫瘤(Pineal Parenchymal Tumor of Intermediate Differentiation)、松果體母細胞瘤(Pineoblastoma)、垂體細胞瘤(Pituicytoma)、垂體腺瘤(Pituitary adenoma)、腦下垂體瘤(Pituitary tumor)、漿細胞腫瘤(Plasma Cell Neoplasm)、胸膜肺母細胞瘤(Pleuropulmonary blastoma)、多胚瘤(Polyembryoma)、T淋巴母細胞淋巴瘤(Precursor T-lymphoblastic lymphoma)、原發性中樞神經系統淋巴瘤(Primary central nervous system lymphoma)、原發性體液淋巴瘤(Primary effusion lymphoma)、原發性肝細胞癌(Primary Hepatocellular Cancer)、原發性肝癌(Primary Liver Cancer)、原發性腹膜癌(Primary peritoneal cancer)、原始神經外胚層腫瘤(Primitive neuroectodermal tumor)、前列腺癌(Prostate cancer)、腹膜假黏液瘤(Pseudomyxoma peritonei)、直腸癌(Rectal Cancer)、腎細胞癌(Renal cell carcinoma)、與在第15號染色體上NUT基因相關的呼吸道癌(Respiratory Tract Carcinoma Involving the NUT Gene on Chromosome 15)、視網膜胚細胞瘤(Retinoblastoma)、橫紋肌瘤(Rhabdomyoma)、橫紋肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma)、Richter轉化(Richter's transformation)、薦椎尾骨畸胎瘤(Sacrococcygeal teratoma)、唾液腺腫瘤(Salivary Gland Cancer)、肉瘤(Sarcoma)、神經鞘瘤(Schwannomatosis)、皮脂腺癌(Sebaceous gland carcinoma)、繼發性腫瘤(Secondary neoplasm)、精原細胞瘤(Seminoma)、漿液性腫瘤(Serous tumor)、支持間質細胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、性索間質腫瘤(Sex cord-stromal tumor)、Sezary症候群(Sezary Syndrome)、印戒細胞癌(Signet ring cell carcinoma)、皮膚癌(Skin Cancer)、小藍圓細胞腫瘤(Small blue round cell tumor)、小細胞癌(Small cell carcinoma)、小細胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)、小細胞淋巴癌(Small cell lymphoma)、小腸癌(Small intestine cancer)、軟組織肉瘤(Soft tissue sarcoma)、體抑素瘤(Somatostatinoma)、煤煙疣(Soot wart)、脊髓腫瘤(Spinal Cord Tumor)、脊髓腫瘤(Spinal tumor)、脾臟緣帶淋巴癌(Splenic marginal zone lymphoma)、鱗狀上皮細胞瘤(Squamous cell carcinoma)、胃癌(Stomach cancer)、表淺散播型黑色素瘤(Superficial spreading melanoma)、小腦幕上神經外胚層母細胞瘤(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumor)、表面上皮間質腫瘤(Surface epithelial-stromal tumor)、滑膜肉瘤(Synovial sarcoma)、T細胞急性淋巴性白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia)、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病(T-cell large granular lymphocyte leukemia)、T細胞白血病(T-cell leukemia)、T細胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)、T幼淋巴細胞白血病(T-cell prolymphocytic leukemia)、畸胎瘤(Teratoma)、末期淋巴癌(Terminal lymphatic cancer)、睪丸癌(Testicular cancer)、鞘細胞瘤(Thecoma)、咽喉癌(Throat Cancer)、胸腺癌 (Thymic Carcinoma)、胸腺癌(Thymoma)、甲狀腺癌(Thyroid cancer)、腎盂、輸尿管和過度上皮細胞癌(Transitional Cell Cancer of Renal Pelvis and Ureter)、移形上皮細胞癌(Transitional cell carcinoma)、臍尿管癌(Urachal cancer)、尿道癌(Urethral cancer)、泌尿生殖器腫瘤(Urogenital neoplasm)、子宮肉瘤(Uterine sarcoma)、葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma)、陰道癌(Vaginal Cancer)、瓦-馬二氏症(Verner Morrison syndrome)、疣狀癌(Verrucous carcinoma)、視覺通路神經膠質瘤(Visual Pathway Glioma)、外陰腫瘤(Vulvar Cancer)、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、華生氏腫瘤(Warthin's tumor)、威爾母氏腫瘤(Wilms' tumor)、其他癌症、及其組合。

較佳者，所述生物標記選自醣(carbohydrates)、醣脂(glycolipids)、醣蛋白(glycoproteins)、呈現在一造血群系細胞上的CD(分化簇)抗原，例如CD2、CD4、CD8、CD21等、γ-麩胺醯基轉胜肽酶(γ-glutamyltranspeptidase)、一種黏附蛋白(adhesion protein；例如細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、細胞間黏附分子-2(ICAM-2)、內皮細胞白血球黏附分子-1(ELAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1))、荷爾蒙、生長因子、細胞激素、和其他配體受體、離子通道、及膜結合形式的一免疫球蛋白μ鏈(the membrane-bound form of an immunoglobulin μ.Chain)。

較佳者，所述呈現在一造血群系細胞上的CD(分化簇)抗原為CD2、CD4、CD8、CD21或其他CD(分化簇)抗原。

較佳者，所述黏附蛋白為細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、細胞間黏附分子-2(ICAM-2)、內皮細胞白血球黏附分子-1(ELAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、或其他黏附蛋白。

較佳者，該細胞更包含一合成的、基因改造的且/或被特意遞送(deliberately delivered)的編碼嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor；CAR)的多核苷酸，該嵌合抗原受體包含一靶向結合單鏈可變片段(target-binding single-chain variable fragment；scFv)抗一種抗原(against an antigen)選自：CD2、CD3δ(CD3 delta)、CD3ε(CD3 epsilon)、CD3γ(CD3gamma)、CD4、CD7、CD8a、CD8、CD11a(整合素αL(ITGAL))、CD11b(整合素αM(ITGAM))、CD11c(整合素αX(ITGAX))、CD11d(整合素αD(ITGAD))、CD18(整合素β2(ITGB2))、CD19(B4)、CD27(腫瘤壞死因子受體超家族7(TNFRSF7))、CD28、CD29(整合素β1(ITGB1))、CD30(腫瘤壞死因子受體超家族8(TNFRSF8))、CD40(腫瘤壞死因子受體超家族5(TNFRSF5))、CD48(信號淋巴細胞激活分子家族成員2(SLAMF2))、CD49a(整合素α1(ITGA1))、CD49d(整合素α4(ITGA4))、CD49f(整合素α6(ITGA6))、CD66a(癌胚抗原相關細胞黏附分子1(CEACAM1))、CD66b(癌胚抗原相關細胞黏附分子8(CEACAM8))、CD66c(癌胚抗原相關細胞黏附分子6(CEACAM6))、CD66d(癌胚抗原相關細胞黏附分子3(CEACAM3))、CD66e(癌胚抗原相關細胞黏附分子5(CEACAM5))、CD69(C型凝集素結構域家族2(CLEC2))、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關α鏈(B-cell antigen receptor complex-associated alpha chain))、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關β鏈(B-cell antigen receptor complex-associated beta chain))、CD84(信號淋巴細胞激活分子家族成員5(SLAMF5))、CD96(Tactile)、CD100(腦信號蛋白4D(SEMA4D))、CD103(整合素αE(ITGAE))、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(信號淋巴細胞激活分子家族成員1(SLAMF1))、CD158A(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL1(KIR2DL1))、CD158B1(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL2(KIR2DL2))、CD158B2(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL3(KIR2DL3))、CD158C(殺手細胞免疫球蛋白樣受體3DP1(KIR3DP1))、CD158D(殺手細胞免疫球蛋白樣受體DL4(KIRDL4))、CD158F1(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL5A(KIR2DL5A))、CD158F2(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL5B(KIR2DL5B))、CD158K(殺手細胞免疫球蛋白樣受體3DL2(KIR3DL2))、CD160(BY55)、CD162(P選擇素醣蛋白配體(SELPLG))、CD226(DNAX輔助分子1(DNAM1))、CD229(信號淋巴細胞激活分子家族成員3(SLAMF3))、CD244(信號淋巴細胞激活分子家族成員4(SLAMF4))、CD247(CD3-ξ；CD3-zeta)、CD258(LIGHT)、CD268(B細胞活化因子受體(BAFFR))、CD270(腫瘤壞死因子受體超家族14(TNFSF14))、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(計畫性死亡-1(PD-1))、CD314(NKG2D)、CD319(信號淋巴細胞激活分子家族成員7(SLAMF7))、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(信號淋巴細胞激活分子家族成員6(SLAMF6))、CD353(信號淋巴細胞激活分子家族成員8(SLAMF8))、CD355(細胞毒性及調節T細胞分子(CRTAM))、CD357(腫瘤壞死因子受體超家族18(TNFRSF18))、可誘導T細胞共刺激分子(inducible T cell co-stimulator；ICOS)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、NKp80(殺手細胞凝集素樣受體基因家族成員1(KLRF1))、介白素-2R β(IL-2R beta)、介白素-2R γ(IL-2R gamma)、介白素-7R α(IL-7R alpha)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、信號淋巴細胞激活分子家族成員9(SLAMF9)、T細胞活化銜接因子(LAT)、GADS(GrpL)、SLP-76(淋巴細胞胞漿蛋白2(LCP2))、PAG1/CBP、一CD83配體(CD83 ligand)、Fcγ受體(Fc gamma receptor)、MHC1類分子(MHC class 1 molecule)、MHC2類分子(MHC class 2 molecule)、一種腫瘤壞死因子(TNF)受體蛋白(TNFreceptor protein)、一種免疫球蛋白、一種細胞激素受體(cytokine receptor)、一種整合素(integrin)、活化自然殺手細胞受體(activating NK cell receptors)、一種類鐸受體(Toll-like receptor)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、B細胞成熟抗原(BCMA)、計畫性死亡-配體1(PD-L1)、及其組合。

較佳者，該細胞能媒介一抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應。

本發明提供一種治療癌症、自體免疫疾病、神經疾病、人類免疫不全病毒(HIV)感染、造血細胞相關疾病、代謝症候群、病原性疾病、病毒感染、或細菌感染的方法，包含將一種含有一有效劑量的一人類自然殺手細胞的組成物施用於一有需要的個體；該人類自然殺手細胞包含一合成的、基因改造的且/或被特意遞送(deliberately delivered)的編碼嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor；CAR)的多核苷酸，該嵌合抗原受體包含一靶向結合單鏈可變片段(target-binding single-chain variable fragment；scFv)抗一種抗原(against an antigen)選自：CD2、CD3δ(CD3 delta)、CD3ε(CD3 epsilon)、CD3γ(CD3 gamma)、CD4、CD7、CD8a、CD8、CD11a(整合素αL(ITGAL))、CD11b(整合素αM(ITGAM))、CD11c(整合素αX(ITGAX))、CD11d(整合素αD(ITGAD))、CD18(整合素β2(ITGB2))、CD19(B4)、CD27(腫瘤壞死因子受體超家族7(TNFRSF7))、CD28、CD29(整合素β1(ITGB1))、CD30(腫瘤壞死因子受體超家族8(TNFRSF8))、CD40(腫瘤壞死因子受體超家族5(TNFRSF5))、CD48(信號淋巴細胞激活分子家族成員2(SLAMF2))、CD49a(整合素α1(ITGA1))、CD49d(整合素α4(ITGA4))、CD49f(整合素α6(ITGA6))、CD66a(癌胚抗原相關細胞黏附分子1(CEACAM1))、CD66b(癌胚抗原相關細胞黏附分子8(CEACAM8))、CD66c(癌胚抗原相關細胞黏附分子6(CEACAM6))、CD66d(癌胚抗原相關細胞黏附分子3(CEACAM3))、CD66e(癌胚抗原相關細胞黏附分子5(CEACAM5))、CD69(C型凝集素結構域家族2(CLEC2))、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關α鏈(B-cell antigen receptor complex-associated alpha chain))、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關β鏈(B-cell antigen receptor complex-associated beta chain))、CD84(信號淋巴細胞激活分子家族成員5(SLAMF5))、CD96(Tactile)、CD100(腦信號蛋白4D(SEMA4D))、CD103(整合素αE(ITGAE))、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(信號淋巴細胞激活分子家族成員1(SLAMF1))、CD158A(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL1(KIR2DL1))、CD158B1(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL2(KIR2DL2))、CD158B2(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL3(KIR2DL3))、CD158C(殺手細胞免疫球蛋白樣受體3DP1(KIR3DP1))、CD158D(殺手細胞免疫球蛋白樣受體DL4(KIRDL4))、CD158F1(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL5A(KIR2DL5A))、CD158F2(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL5B(KIR2DL5B))、CD158K(殺手細胞免疫球蛋白樣受體3DL2(KIR3DL2))、CD160(BY55)、CD162(P選擇素醣蛋白配體(SELPLG))、CD226(DNAX輔助分子1(DNAM1))、CD229(信號淋巴細胞激活分子家族成員3(SLAMF3))、CD244(信號淋巴細胞激活分子家族成員4(SLAMF4))、 CD247(CD3-ξ；CD3-zeta)、CD258(LIGHT)、CD268(B細胞活化因子受體(BAFFR))、CD270(腫瘤壞死因子受體超家族14(TNFSF14))、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(計畫性死亡-1(PD-1))、CD314(NKG2D)、CD319(信號淋巴細胞激活分子家族成員7(SLAMF7))、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(信號淋巴細胞激活分子家族成員6(SLAMF6))、CD353(信號淋巴細胞激活分子家族成員8(SLAMF8))、CD355(細胞毒性及調節T細胞分子(CRTAM))、CD357(腫瘤壞死因子受體超家族18(TNFRSF18))、可誘導T細胞共刺激分子(inducible T cell co-stimulator；ICOS)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、NKp80(殺手細胞凝集素樣受體基因家族成員1(KLRF1))、介白素-2R β(IL-2R beta)、介白素-2R γ(IL-2R gamma)、介白素-7R α(IL-7R alpha)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、信號淋巴細胞激活分子家族成員9(SLAMF9)、T細胞活化銜接因子(LAT)、GADS(GrpL)、SLP-76(淋巴細胞胞漿蛋白2(LCP2))、PAG1/CBP、一CD83配體(CD83 ligand)、Fcγ受體(Fc gamma receptor)、MHC1類分子(MHC class 1 molecule)、MHC2類分子(MHC class 2 molecule)、一種腫瘤壞死因子(TNF)受體蛋白(TNF receptor protein)、一種免疫球蛋白、一種細胞激素受體(cytokine receptor)、一種整合素(integrin)、活化自然殺手細胞受體(activating NK cell receptors)、一種類鐸受體(Toll-like receptor)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、B細胞成熟抗原(BCMA)、計畫性死亡-配體1(PD-L1)及其組合，且該人類自然殺手細胞是：

(A)寄存在NPMD且具有寄存編號NITE BP-03017；或

(B)具有以下特徵：

i)表達一CD16受體；

ii)在經過至少3個月的繼代培養後仍保持其增殖的能力，以及

較佳者，該個體為一人體。

較佳者，該方法用於治療選自下列的癌症：棘皮瘤(Acanthoma)、腺細胞癌(Acinic cell carcinoma)、聽神經瘤(Acoustic neuroma)、肢端小痣性黑色素瘤(Acral lentiginous melanoma)、汗腺頂端汗腺瘤(Acrospiroma)、急性嗜酸性粒細胞白血病(Acute eosinophilic leukemia)、急性淋巴母細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia)、急性巨核母細胞白血病(Acute megakaryoblastic leukemia)、急性單核細胞白血病(Acute monocytic leukemia)、急性成熟骨髓芽球性白血病(Acute myeloblastic leukemia with maturation)、急性髓源型樹突狀細胞白血病(Acute myeloid dendritic cell leukemia)、急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia)、急性前髓細胞白血病(Acute promyelocytic leukemia)、牙釉母細胞瘤(Adamantinoma)、腺癌(Adenocarcinoma)、腺樣囊狀癌(Adenoid cystic carcinoma)、腺瘤(Adenoma)、牙源性腺瘤樣腫瘤(Adenomatoid odontogenic tumor)、腎上腺皮質癌(Adrenocortical carcinoma)、成人型T細胞白血病(Adult T-cell leukemia)、侵略性NK細胞白血病(Aggressive NK-cell leukemia)、愛滋病相關癌症(AIDS-Related Cancers)、愛滋病相關淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)、肺泡狀軟組織肉瘤(Alveolar soft part sarcoma)、造釉細胞性纖維瘤(Ameloblastic fibroma)、肛門癌(Anal cancer)、間變性大細胞淋巴瘤(Anaplastic large cell lymphoma)、甲狀腺未分化癌(Anaplastic thyroid cancer)、血管免疫芽細胞性T細胞淋巴瘤(Angioimmunoblastic T-cell lymphoma)、血管平滑肌脂肪瘤(Angiomyolipoma)、血管肉瘤(Angiosarcoma)、闌尾癌(Appendix cancer)、星細胞瘤(Astrocytoma)、非典型畸胎/類橫紋肌細胞瘤(Atypical teratoid rhabdoid tumor)、基底細胞癌(Basal cell carcinoma)、類基底細胞癌(Basal-like carcinoma)、B細胞白血病(B-cell leukemia)、B細胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)、Bellini集合管癌(Bellini duct carcinoma)、膽道癌(Biliary tract cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、胚細胞瘤(Blastoma)、骨癌(Bone Cancer)、骨腫瘤(Bone tumor)、腦幹膠質瘤(Brain Stem Glioma)、腦瘤(Brain Tumor)、乳癌(Breast Cancer)、布倫內羅氏瘤(Brenner tumor)、支氣管腫瘤(Bronchial Tumor)、支氣管肺泡腺癌(Bronchioloalveolar carcinoma)、棕色瘤(Brown tumor)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、原發部位不明的癌(Cancer of Unknown Primary Site)、類癌瘤(Carcinoid Tumor)、上皮細胞癌(Carcinoma)、原位癌(Carcinoma in situ)、陰莖癌(Carcinoma of the penis)、原發部位不明轉移癌(Carcinoma of Unknown Primary Site)、癌肉瘤(Carcinosarcoma)、Castleman氏病(Castleman's Disease)、中樞神經系統胚胎性腫瘤(Central Nervous System Embryonal Tumor)、小腦星狀細胞瘤(Cerebellar Astrocytoma)、大腦星狀細胞瘤(Cerebral Astrocytoma)、子宮頸癌(Cervical Cancer)、膽管癌(Cholangiocarcinoma)、軟骨癌(Chondroma)、軟骨肉瘤(Chondrosarcoma)、脊索瘤(Chordoma)、絨毛膜癌(Choriocarcinoma)、脈絡叢乳頭狀瘤(Choroid plexus papilloma)、慢性淋巴性白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia)、慢性單核細胞白血病(Chronic monocytic leukemia)、慢性粒細胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia)、慢性骨髓增生性疾病(Chronic Myeloproliferative Disorder)、慢性嗜中性白血病(Chronic neutrophilic leukemia)、透明細胞腫瘤(Clear-cell tumor)、大腸癌(Colon Cancer)、大腸直腸癌(Colorectal cancer)、顱咽管瘤(Craniopharyngioma)、皮膚T細胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma)、Degos氏病(Degos disease)、隆突性皮膚纖維肉瘤(Dermatofibrosarcoma protuberans)、皮樣囊腫(Dermoid cyst)、發育不良的小圓細胞瘤(Desmoplastic small round cell tumor)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma)、胚胎發育不良性神經上皮腫瘤(Dysembryoplastic neuroepithelial tumor)、胚胎性癌(Embryonal carcinoma)、內胚竇瘤(Endodermal sinus tumor)、子宮內膜癌(Endometrial cancer)、子宮內膜癌(Endometrial Uterine Cancer)、子宮內膜樣瘤(Endometrioid tumor)、腸道T細胞淋巴瘤(Enteropathy-associated T-cell lymphoma)、室管膜母細胞瘤(Ependymoblastoma)、室管膜瘤(Ependymoma)、上皮樣肉瘤(Epithelioid sarcoma)、紅血球性白血病(Erythroleukemia)、食道癌(Esophageal cancer)、敏感性神經胚細胞瘤(Esthesioneuroblastoma)、Ewing氏家族腫瘤(Ewing Family of Tumor)、Ewing氏家族肉瘤(Ewing Family Sarcoma)、Ewing氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、生殖細胞瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)、性腺外生殖細胞瘤(Extragonadal Germ Cell Tumor)、肝外膽管癌(Extrahepatic Bile Duct Cancer)、乳房外Paget氏病(Extramammary Paget's disease)、輸卵管癌(Fallopian tube cancer)、胎內胎(Fetus in fetu)、纖維瘤(Fibroma)、纖維肉瘤(Fibrosarcoma)、濾泡性淋巴瘤(Follicular lymphoma)、濾泡性甲狀腺癌(Follicular thyroid cancer)、膽癌(Gallbladder Cancer)、膽癌(Gallbladder cancer)、神經節膠質細胞瘤(Ganglioglioma)、神經節細胞瘤(Ganglioneuroma)、胃癌(Gastric Cancer)、胃淋巴癌(Gastric lymphoma)、腸胃道癌(Gastrointestinal cancer)、胃腸道類癌腫瘤(Gastrointestinal Carcinoid Tumor)、胃腸道基質腫瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor)、胃腸道基質腫瘤(Gastrointestinal stromal tumor)、生殖細胞瘤(Germ cell tumor)、胚細胞瘤(Germinoma)、妊娠絨毛膜癌(Gestational choriocarcinoma)、妊娠滋養細胞腫瘤(Gestational Trophoblastic Tumor)、骨巨細胞瘤(Giant cell tumor of bone)、多形性神經膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme)、神經膠質瘤(Glioma)、大腦神經膠瘤病(Gliomatosis cerebri)、球狀血管瘤(Glomus tumor)、升糖素瘤(Glucagonoma)、性腺胚瘤(Gonadoblastoma)、粒層細胞瘤(Granulosa cell tumor)、毛細胞白血病(Hairy Cell Leukemia)、毛細胞白血病(Hairy cell leukemia)、頭頸癌(Head and Neck Cancer)、頭頸癌(Head and neck cancer)、心臟癌(Heart cancer)、血管母細胞瘤(Hemangioblastoma)、血管外皮細胞瘤(Hemangiopericytoma)、血管肉瘤(Hemangiosarcoma)、血液惡性腫瘤(Hematological malignancy)、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma)、肝脾T細胞淋巴癌(Hepatosplenic T-cell lymphoma)、遺傳性乳癌與卵巢癌症候群(Hereditary breast-ovarian cancer syndrome)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s Lymphoma)、下咽癌(Hypopharyngeal Cancer)、下視丘腦神經膠質瘤(Hypothalamic Glioma)、延性乳腺癌(Intlammatory breast cancer)、眼內黑色素瘤(Intraocular Melanoma)、胰島細胞癌(Islet cell carcinoma)、胰島細胞瘤(Islet Cell Tumor)、少年性骨髓單核球白血病(Juvenile myelomonocytic leukemia)、卡波西氏肉瘤(Kaposi Sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma)、腎癌(Kidney Cancer)、肝門部膽管癌(Klatskin tumor)、Krukenberg氏瘤(Krukenberg tumor)、喉癌(Laryngeal Cancer)、喉癌(Laryngeal cancer)、惡性雀斑樣黑色素瘤(Lentigo maligna melanoma)、白血病(Leukemia)、嘴唇及口腔癌症(Lip and Oral Cavity Cancer)、脂肪肉瘤(Liposarcoma)、肺癌(Lung cancer)、黃體瘤(Luteoma)、淋巴管瘤(Lymphangioma)、淋巴管肉瘤(Lymphangiosarcoma)、淋巴上皮瘤(Lymphoepithelioma)、淋巴細胞性白血病(Lymphoid leukemia)、淋巴瘤(Lymphoma)、巨球蛋白血症(Macroglobulinemia)、惡性纖維組織細胞瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma)、惡性纖維組織細胞瘤(Malignant fibrous histiocytoma)、惡性骨纖維組織細胞瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone)、惡性神經膠瘤(Malignant Glioma)、惡性間皮瘤(Malignant Mesothelioma)、惡性周邊神經鞘瘤(Malignant peripheral nerve sheath tumor)、惡性橫紋肌瘤(Malignant rhabdoid tumor)、惡性蠑螈瘤(Malignant triton tumor)、粘膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT lymphoma)、被套細胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma)、肥胖細胞白血病(Mast cell leukemia)、縱隔腔生殖細胞瘤(Mediastinal germ cell tumor)、縱隔腔腫瘤(Mediastinal tumor)、甲狀腺髓樣癌(Medullary thyroid cancer)、神經管胚細胞癌(Medulloblastoma)、神經管胚細胞癌(Medulloblastoma)、髓上皮瘤(Medulloepithelioma)、黑色素瘤(Melanoma)、黑色素瘤(Melanoma)、腦脊髓膜瘤(Meningioma)、Merkel氏細胞瘤(Merkel Cell Carcinoma)、間皮瘤(Mesothelioma)、間皮瘤(Mesothelioma)、原發不明鱗狀細胞癌之頸部轉移(Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary)、轉移性尿路上皮癌(Metastatic urothelial carcinoma)、混合米勒氏腫瘤(Mixed Mullerian tumor)、單核球白血病(Monocytic leukemia)、口癌(Mouth Cancer)、黏液癌(Mucinous tumor)、多發性內分泌腫瘤症候群(Multiple Endocrine Neoplasia Syndrome)、多發性骨髓瘤(Multiple Myeloma)、多發性骨髓瘤(Multiple myeloma)、蕈狀肉芽腫(Mycosis Fungoides)、蕈狀肉芽腫(Mycosis fungoides)、骨髓增生性疾病(Myelodysplastic Disease)、骨髓增生異常症候群(Myelodysplastic Syndromes)、骨髓性白血病(Myeloid leukemia)、骨髓性肉瘤(Myeloid sarcoma)、骨髓增生性疾病(Myeloproliferative Disease)、黏液瘤(Myxoma)、鼻腔癌(Nasal Cavity Cancer)、鼻咽癌(Nasopharyngeal Cancer)、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、腫瘤(Neoplasm)、神經鞘瘤(Neurinoma)、神經母細胞瘤(Neuroblastoma)、神經母細胞瘤(Neuroblastoma)、神經纖維瘤(Neurofibroma)、神經瘤(Neuroma)、結節性惡性黑色素瘤(Nodular melanoma)、非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、非黑色素瘤的皮膚癌(Nonmelanoma Skin Cancer)、非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer)、眼部腫瘤(Ocular oncology)、寡星狀細胞瘤(Oligoastrocytoma)、寡樹突神經膠質瘤(Oligodendroglioma)、嗜酸細胞瘤(Oncocytoma)、視神經鞘腦膜瘤(Optic nerve sheath meningioma)、口腔癌(Oral Cancer)、口腔癌(Oral cancer)、口咽癌(Oropharyngeal Cancer)、骨肉瘤(Osteosarcoma)、骨肉瘤(Osteosarcoma)、卵巢癌(Ovarian Cancer)、卵巢癌(Ovarian cancer)、上皮卵巢癌(Ovarian Epithelial Cancer)、卵巢生殖細胞腫瘤(Ovarian Germ Cell Tumor)、卵巢低惡性瘤(Ovarian Low Malignant Potential Tumor)、乳腺博德氏Paget疾病(Paget's disease of the breast)、肺上溝癌(Pancoast tumor)、胰臟癌(Pancreatic Cancer)、胰臟癌(Pancreatic cancer)、乳頭狀甲狀腺癌(Papillary thyroid cancer)、乳突瘤病(Papillomatosis)、副神經節瘤(Paragangiioma)、鼻竇癌(Paranasal Sinus Cancer)、甲狀旁腺腺瘤(Parathyroid Cancer)、陰莖癌(Penile Cancer)、血管周圍上皮樣細胞瘤(Perivascular epithelioid cell tumor)、咽癌(Pharyngeal Cancer)、嗜鉻細胞瘤(Pheochromocytoma)、中分化松果體實質腫瘤(Pineal Parenchymal Tumor of Intermediate Differentiation)、松果體母細胞瘤(Pineoblastoma)、垂體細胞瘤(Pituicytoma)、垂體腺瘤(Pituitary adenoma)、腦下垂體瘤(Pituitary tumor)、漿細胞腫瘤(Plasma Cell Neoplasm)、胸膜肺母細胞瘤(Pleuropulmonary blastoma)、多胚瘤(Polyembryoma)、T淋巴母細胞淋巴瘤(Precursor T-lymphoblastic lymphoma)、原發性中樞神經系統淋巴瘤(Primary central nervous system lymphoma)、原發性體液淋巴瘤(Primary effusion lymphoma)、原發性肝細胞癌(Primary Hepatocellular Cancer)、原發性肝癌(Primary Liver Cancer)、原發性腹膜癌(Primary peritoneal cancer)、原始神經外胚層腫瘤(Primitive neuroectodermal tumor)、前列腺癌(Prostate cancer)、腹膜假黏液瘤(Pseudomyxoma peritonei)、直腸癌(Rectal Cancer)、腎細胞癌(Renal cell carcinoma)、與在第15號染色體上NUT基因相關的呼吸道癌(Respiratory Tract Carcinoma Involving the NUT Gene on Chromosome 15)、視網膜胚細胞瘤(Retinoblastoma)、橫紋肌瘤(Rhabdomyoma)、橫紋肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma)、Richter轉化(Richter's transformation)、薦椎尾骨畸胎瘤(Sacrococcygeal teratoma)、唾液腺腫瘤(Salivary Gland Cancer)、肉瘤(Sarcoma)、神經鞘瘤(Schwannomatosis)、皮脂腺癌(Sebaceous gland carcinoma)、繼發性腫瘤(Secondary neoplasm)、精原細胞瘤(Seminoma)、漿液性腫瘤(Serous tumor)、支持間質細胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、性索間質腫瘤(Sex cord-stromal tumor)、Sezary症候群(Sezary Syndrome)、印戒細胞癌(Signet ring cell carcinoma)、皮膚癌(Skin Cancer)、小藍圓細胞腫瘤(Small blue round cell tumor)、小細胞癌(Small cell carcinoma)、小細胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)、小細胞淋巴癌(Small cell lymphoma)、小腸癌(Small intestine cancer)、軟組織肉瘤(Soft tissue sarcoma)、體抑素瘤(Somatostatinoma)、煤煙疣(Soot wart)、脊髓腫瘤(Spinal Cord Tumor)、脊髓腫瘤(Spinal tumor)、脾臟緣帶淋巴癌(Splenic marginal zone lymphoma)、鱗狀上皮細胞瘤(Squamous cell carcinoma)、胃癌(Stomach cancer)、表淺散播型黑色素瘤(Superficial spreading melanoma)、小腦幕上神經外胚層母細胞瘤(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumor)、表面上皮間質腫瘤(Surface epithelial-stromal tumor)、滑膜肉瘤(Synovial sarcoma)、T細胞急性淋巴性白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia)、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病(T-cell large granular lymphocyte leukemia)、T細胞白血病(T-cell leukemia)、T細胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)、T幼淋巴細胞白血病(T-cell prolymphocytic leukemia)、畸胎瘤(Teratoma)、末期淋巴癌(Terminal lymphatic cancer)、睪丸癌(Testicular cancer)、鞘細胞瘤(Thecoma)、咽喉癌(Throat Cancer)、胸腺癌(Thymic Carcinoma)、胸腺癌(Thymoma)、甲狀腺癌(Thyroid cancer)、腎盂、輸尿管和過度上皮細胞癌(Transitional Cell Cancer of Renal Pelvis and Ureter)、移形上皮細胞癌(Transitional cell carcinoma)、臍尿管癌(Urachal cancer)、尿道癌(Urethral cancer)、泌尿生殖器腫瘤(Urogenital neoplasm)、子宮肉瘤(Uterine sarcoma)、葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma)、陰道癌(Vaginal Cancer)、瓦-馬二氏症(Verner Morrison syndrome)、疣狀癌(Verrucous carcinoma)、視覺通路神經膠質瘤(Visual Pathway Glioma)、外陰腫瘤(Vulvar Cancer)、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、華生氏腫瘤(Warthin's tumor)、威爾母氏腫瘤(Wilms' tumor)、其他癌症、及其組合。

“oNK”一詞代表(a)從具有寄存編號ATCC CRL-2407的人類周邊血液自然殺手細胞群中分離出來的非基因轉殖人類CD16陽性自然殺手細胞系；(b)利用揭露於實施例2.1中的培養方法，培養(a)所述的細胞複數日後所取得的非基因轉殖人類CD16陽性自然殺手細胞系；(c)寄存在NPMD且具有寄存序號NITE BP-03017的細胞；或(d)一具有以下特徵的人類自然殺手細胞：

i)表達一CD16受體；

ii)在經過至少三個月的繼代培養後仍保持其增殖的能力；和

S11~S13:步驟

S21~S23:步驟

圖1：取得一非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系的流程圖。

圖2A：未經CD16螢光標記抗體(CD16 fluorescent labeled antibody)標定的人類周邊血液自然殺手細胞群的二維點陣圖，其中該人類周邊血液自然殺手細胞群的寄存編號為ATCC CRL-2407。

圖2B：經CD16螢光標記抗體標定的人類周邊血液自然殺手細胞群的二維點陣圖，其中該人類周邊血液自然殺手細胞群的寄存編號為ATCC CRL-2407。

圖2C：將表達CD16受體的細胞自經利用CD16螢光標記抗體標定的人類周邊血液自然殺手細胞群中分離後的二維點陣圖。

圖3：培養人類CD16陽性自然殺手細胞之流程圖。

圖4：非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系於培養不同天數後的細胞存活率(cell viability)之折線圖。

圖5：比較經培養的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系和NK-92細胞系，對癌細胞的細胞毒殺功能之柱狀圖。

圖6A：比較不同數量的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系，對癌細胞的細胞毒殺活性之柱狀圖。

圖6B：比較不同數量的HER2抗體複合的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(anti-HER2 antibody-conjugated non-transgenic human CD16⁺ natural killer cell line)，透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用對癌細胞的細胞毒殺活性之柱狀圖。

圖7：比較HER2抗體複合的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(anti-HER2 antibody-conjugated non-transgenic human CD16⁺ natural killer cell line)和與HER2抗體共培養的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(anti-HER2 antibody co-cultured non-transgenic human CD16⁺ natural killer cell line)，透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用對癌細胞的細胞毒殺功能之柱狀圖。

圖8：比較非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系和轉殖CD16的NK-92細胞系，其基因型(genotype)之柱狀圖。

圖9A-9E：說明應用一標記一顏色的CD16a受體基因專一性測試探針和一標記另一顏色的參考探針的雙色FISH分析來檢測測人類自然殺手細胞中，基因轉殖的、合成的、基因改造的、或特意遞送的編碼CD16a 受體的DNA序列的原理。

圖10：非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用殺死癌細胞的細胞毒殺功能之柱狀圖。

圖11A：比較非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系和轉殖CD16的NK-92細胞系，在不同作用細胞(E)和目標細胞(T)比例時，殺死癌細胞的細胞毒殺功能之柱狀圖。

圖11B：比較非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系和轉殖CD16的NK-92細胞系，在不同作用細胞(E)和目標細胞(T)比例時，透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用殺死癌細胞的細胞毒殺功能之柱狀圖。

圖12A：人類血小板裂解物對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的總細胞數的影響之折線圖。

圖12B：人類血小板裂解物對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的細胞存活率的影響之折線圖。

圖12C：人類血小板裂解物對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的維持CD16表達量的影響之折線圖。

圖13A：低濃度的介白素-2(IL-2)對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的總細胞數的影響之折線圖。

圖13B：高濃度的介白素-2(IL-2)對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的總細胞數的影響之折線圖。

圖13C：低濃度的介白素-2(IL-2)對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的細胞存活率的影響之折線圖。

圖13D：高濃度的介白素-2(IL-2)對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的細胞存活率的影響之折線圖。

圖13E：低濃度的介白素-2(IL-2)對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的維持CD16表達量的影響之折線圖。

圖13F：高濃度的介白素-2(IL-2)對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的維持CD16表達量的影響之折線圖。

圖14A：透氣容器對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的總細胞數的影響之折線圖。

圖14B：透氣容器對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的細胞存活率的影響之折線圖。

圖14C：透氣容器對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同的培養天數後的維持CD16表達量的影響之折線圖。

下述為使用本發明的實施例和本發明的技術和特點對本發明的一詳細描述；然而，這些實施例並非用以限制本發明，因此凡其他未脫離本發明的精神和目標下，任何經熟悉此技術的人所做的更動或潤飾，均應包含在本發明的範圍內。

實施例一：取得非基因轉殖人類CD16陽性自然殺手細胞系。

請參照圖1。圖1為取得一種非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系的流程圖。本發明中用以取得一種非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系的方法至少包含以下步驟：

步驟S11：取得一群寄存編號為ATCC CRL-2407的人類周邊血液自然殺手細胞；

步驟S12：讓該人類周邊血液自然殺手細胞群與一種對一CD16受體有專一性的抗體接觸；

步驟S13：將被抗體專一性地結合的細胞分離出來，從而取得非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系。

較佳者，在步驟512中，CD16受體為一CD16a受體。

較佳者，在步驟S13中，係用流式細胞技術、磁珠(beads)、或任何含抗體修飾表面(antibody-modified surface)的材料來分離被抗體專一性地結合的細胞。

較佳者，『非基因轉殖人類CD16陽性自然殺手細胞系』一詞指的是非基因改造的人類CD16陽性自然殺手細胞系且/或沒有合成的或外因性多核苷酸序列的人類CD16陽性自然殺手細胞系。

以下提供較佳實施例的詳細描述。

實施例1.1標記(label)並分選(sorting)非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系。

本實施例由一實驗組和一對照組組成。將具有寄存編號ATCC CRL-2407的人類周邊血液自然殺手細胞群用100~1000xg的轉速離心3~5分鐘。移除上清液後，用一緩衝液重新懸浮人類周邊血液自然殺手細胞群。將該人類周邊血液自然殺手細胞群均勻分配到對照組和實驗組的細胞培養皿中。將實驗組的人類周邊血液自然殺手細胞群與CD16螢光標記抗體(CD16-PE-Cy7，一種抗CD16a受體和CD16b受體的抗體)混合，以標定人類周邊血液自然殺手細胞群中表達CD16受體的細胞；同時將對照組的人類周邊血液自然殺手細胞群與一等體積的緩衝液混合。將實驗組和對照組內的細胞分別離心，去除上清液後，加入一分選緩衝液(sorting buffer)，使細胞濃度調整成每毫升1×10⁷個細胞。最後，用一細胞分選儀(cell sorter)分析實驗組和對照組的細胞群。

其中，所述緩衝液為分選前緩衝液(Pre-Sort buffer)、流式細胞技術樣品製備緩衝液(Flow cytometry sample preparation buffers)或Dulbecco氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Dulbecco’s phosphate buffer saline；DPBS)。所述分選緩衝液為添加了胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)的分選前緩衝液、流式細胞技術樣品製備緩衝液或Dulbecco氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)。所述細胞分選儀為，例如一台型號為Becton Dickinson-FACS Aria IIIu的流式細胞儀。

較佳者，該分選緩衝液包含0.1~10%(體積百分比，vol%，v/v)的胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)。

較佳者，分選時間為1小時，分選速度為50~70000events/second。

利用細胞分選儀的前向散射光(FSC)和側向散色光(SSC)分別分析對照組和實驗組中的10,000個粒子後，在對照組的10,000個粒子中有6771個粒子為細胞(當粒子數為100%時，細胞數占67.7%)，而在實驗組的10,000粒子中有6944個粒子為細胞(當粒子數為100%時，細胞數占69.4%)。

圖2A顯示對照組細胞的螢光分析結果，圖2A為未經CD16螢光標記抗體(CD16 fluorescent labeled antibody)標定的人類周邊血液自然殺手細胞群的二維點陣圖，其中該人類周邊血液自然殺手細胞群的寄存編號為ATCC CRL-2407。圖2B顯示實驗組細胞的螢光分析結果，圖2B為經CD16螢光標記抗體標定的人類周邊血液自然殺手細胞群的二維點陣圖，其中該人類周邊血液自然殺手細胞群的寄存編號為ATCC CRL-2407。

圖2A和圖2B中，橫坐標為PE-CY7螢光強度的相對數值(用於該實驗中的CD16螢光標記抗體會發射PE-Cy7螢光)，縱座標為前向散色光(FSC)強度的相對數值。

圖2A的結果顯示，對照組中，6771個被分析的細胞皆不發射PE-Cy7螢光(0個細胞在長方型的區域內)。因此，在沒有CD16-PE-Cy7螢光標記抗體標定時，沒有其他與PE-Cy7螢光染料(fluorescent dye)相似波長的輻射光會干擾對照組細胞的實驗結果。

圖2B的結果顯示，實驗組內，6966個被分析的細胞，大多數都沒有PE-Cy7螢光，只有少數細胞有PE-Cy7螢光(只有174個細胞在長方形區域內)。因此，可以得知，實驗組內在10,000個粒子中有6944個為細胞，其中有174個細胞表現CD16受體，亦即，只有1.7%的粒子是表達CD16受體的細胞(174÷10000=1.7%)，並且只有2.5%~2.6%的細胞是表達CD16受體的細胞(174÷6944≒2.6%)。在實驗組中，以細胞濃度每毫升1×10⁷個細胞的條件為依據，每毫升實驗組的細胞溶液中包含大約2.6×10⁵個表達CD16受體的細胞。

為了取得高純度的CD16陽性細胞(在下文稱為『純化的CD16陽性細胞群』、『分離的oNK』或『分離的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系』)，從實驗組的細胞中分選出表達CD16受體的細胞。

請參閱圖2C，圖2C為將表達CD16受體的細胞自經利用 CD16螢光標記抗體標定的人類周邊血液自然殺手細胞群中分離後的二維點陣圖。圖2C的結果顯示，在純化的CD16陽性細胞群中，大多數的細胞發射PE-Cy7螢光，且表達CD16受體的細胞的純度高達99%。

前述純化的CD16陽性細胞群中的CD16受體表達細胞是非基因轉殖細胞；經過分析，所有前述純化的CD16陽性細胞群中的CD16受體表達細胞皆有CD3陰性CD56陽性的特徵，它們可以被持續地繼代培養且沒有致癌性；因此，前述純化的CD16陽性細胞群中的CD16受體表達細胞是一種新穎的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系。

實施例二：培養人類CD16陽性自然殺手細胞。

請參閱圖3。圖3是培養人類CD16陽性自然殺手細胞的流程圖。培養人類CD16陽性自然殺手細胞的方法至少包含以下步驟：

步驟S21：取得人類CD16陽性自然殺手細胞；

步驟S22：在容器中，讓人類CD16陽性自然殺手細胞與一含有人類血小板裂解物和介白素-2(IL-2)的培養基接觸；以及

步驟S23：培養人類CD16陽性自然殺手細胞數日以增殖人類CD16陽性自然殺手細胞。

下面闡述本發明的一培養一種非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系的具體實施例，但是本發明的應用並非侷限於此，亦即本發明也可被用於培養其他人類CD16陽性自然殺手細胞。例如，從自體或異體血液中分離出的原代人類CD16陽性自然殺手細胞、轉殖CD16的NK-92細胞系或其他人類CD16陽性自然殺手細胞。

實施例2.1 培養非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系。

步驟S21’：將從實施例一中分選出的純化的CD16陽性細胞群(表達CD16受體的細胞比例高達99%)離心，移除上清液。

步驟S22’：用1mL的細胞培養基重新懸浮細胞後，將該細胞懸浮液置入一第一容器中，使第一容器內的40mL細胞培養基中包含6.54×10⁵個非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞；所述細胞培養基包含：

0.5%~30%(體積百分比，vol%，v/v)的人類血小板裂解物；100~3000IU/mL的介白素2(IL-2)；以及DMEM培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、α-MEM培養基(alpha modification of Eagle's minimum essential medium)、或XVIVO 10培養基。

步驟S23’：經過數日培養後，取得一種富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物，在該富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物中，非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系的數量至少為5×10⁵個；所述的數日為例如一天到三年。

較佳者，所述的數日為一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、一年、兩年、或三年。

較佳者，該細胞培養基包含0.5%、1%、1.5%、1.6%、2%、2.5%、2.6%、3%、3.5%、3.6%、4%、4.5%、4.6%、5.0%、5.1%、5.5%、5.6%、6%、6.1%、6.5%、6.6%、7%、7.1%、7.5%、7.6%、8%、8.1%、8.5%、 8.6%、9%、9.1%、9.5%、9.6%、或10%(體積百分比，vol%，v/v)的人類血小板裂解物。

較佳者，該細胞培養基包含100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、或3000IU/mL的介白素2(IL-2)。

較佳者，步驟S23’更包含子步驟：

步驟S231’：經過數日培養後，細胞培養基中的細胞數達到第一細胞數，該第一細胞數為1.25×10⁶~5×10⁶；

步驟S232’：將細胞懸浮液置入一第二容器中，使第二容器中的細胞數為第一細胞數；經過數日培養後，細胞數達到第二細胞數，該第二細胞數為5×10⁷~1×10⁹；以及

步驟S233’：為了取得一富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物，將細胞懸浮液置入一第三容器中，使第三容器中的細胞數為第二細胞數；經過數日培養後，細胞數達到第三細胞數，該第三細胞數為例如5×10⁹或1×10⁴⁰。

其中，第一容器為例如一T25細胞培養瓶(T25 flask)或G-Rex六孔細胞培養盤。第二和第三容器含有一可透氣但不透水的薄膜或所述第二和第三容器可以讓溶氧濃度充分通氣，或是使溶解於培養基中的葡萄糖濃度維持在1500~5000mg/L。較佳者，該第二容器為例如G-Rex 100M透氣性懸浮細胞培養瓶(商品號81100，WILSON WOLF，美國)，該第三容器為例如G-Rex-500M透氣性懸浮細胞培養瓶(商品號85500S，WILSON WOLF，美國)。請參照這些容器的商品說明書的指示來使用G-Rex 6M 6孔細胞培養盤、G-Rex 100M透氣性懸浮細胞培養瓶、和G-Rex-500M透氣性懸浮細胞培養瓶。

在步驟S23’和S231’~S233’中，培養細胞時，一培養基中添加了0.5%~30%(體積百分比，vol%，v/v)的人類血小板裂解物和100~3000IU/mL的介白素2(IL-2)。同時該培養基為例如DMEM培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、α-MEM培養基(alpha modification of Eagle's minimum essential medium)、XVIVO 10培養基、或XVIVO 10無血清造血幹細胞培養基。

在步驟S23’和S231’~S233’中，細胞係被培養在37℃ and 5%二氧化碳的條件下。

實施例2.2檢測從實施例2.1中取得的經培養的細胞的細胞存活率(cell viability)。

將利用公開在實施例2.1的培養方法於培養不同天數後取得的每個細胞懸浮樣品與一等體積的台盼藍(Trypan blue)混合，觀察細胞數及細胞存活率。

實驗結果顯示，經培養7、16、21、28、37、42、49、65、92、97、103、134、166、184和202天後，細胞數分別達到1.61×10⁶、1.01×10⁹、2.53×10⁹、5.06×10⁹、1.01×10¹⁰、1.62×10¹⁰、3.24×10¹⁰、1.13×10¹¹、1.81×10¹⁵、3.25×10¹⁶、6.50×10¹⁷、1.35×10²²、3.24×10²⁷、1.30×10³³和1.04×10³⁹。請參閱圖4。圖4顯示，非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系經培養7、16、21、28、37、42、49、65、92、97、103、134、166、 184和202天後，細胞存活率維持在84~97%。因此，利用本發明的培養方法培養非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系，可使細胞數擴增至少1.59×10³³倍[(1.04×10³⁹)÷(6.54×10⁵)≒1.59×10³³]，同時在增殖後能有效地維持細胞存活率。

實施例三：檢測細胞狀態和細胞表面標誌。

實施例3.1 利用本發明的培養方法長期培養非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系

本實施例中有兩個實驗。第一批純化的CD16陽性細胞群和第二批純化的CD16陽性細胞群(兩批細胞中表達CD16受體細胞的比例皆高達99%)為利用實施例1.1的方法分選出來的，然後將第一批純化的CD16陽性細胞群和第二批純化的CD16陽性細胞群分別用實施例2.1的培養方法培養，以取得第一個實驗的細胞懸浮液和第二個實驗的細胞懸浮液。第一批純化的CD16陽性細胞群的總培養時間為35天，而第二批純化的CD16陽性細胞群被長期培養到至少第202天。

實施例3.2 檢測經培養的細胞的狀態

將從實施例3.1中不同時間點取得的每個細胞懸浮液樣品離心；移除上清液，將細胞重新懸浮至緩衝液中，然後與1μL的碘化丙啶(propidium iodide)混合。用細胞分選儀或流式細胞儀檢測細胞是否被碘化丙啶染色，以決定正在凋亡或已經死亡的細胞的百分比。

實施例3.3 檢測經培養的細胞的CD56、CD3和CD2表面標誌。

將從實施例3.1中不同時間點取得的每個細胞懸浮液樣品離心；移除上清液，將細胞重新懸浮至緩衝液中後，然後與1μL的CD56螢光標記抗體(商品號318304，Biolegend，美國)、1μL的CD3螢光標記抗體(商品號300410，Biolegend，美國)、及1mL的CD2螢光標記抗體(商品號300222，Biolegend，美國)混合，以同時標定表達CD56分子、CD3分子、且/或CD2分子的細胞。最後，用細胞分選儀或流式細胞儀分析細胞是否表現CD56分子、CD3分子、且/或CD2分子，並計算具有不同細胞表面標記的細胞的百分比。

實施例3.4 檢測經培養的細胞的CD16表面標誌。

將從實施例3.1中不同時間點取得的每個細胞懸浮液樣品離心；移除上清液，將細胞重新懸浮至緩衝液後，與1μL的CD16螢光標記抗體(商品號302016，Biolegend，美國)混合，以標定表達CD16受體的細胞。最後用細胞分選儀分析細胞是否表現CD16受體，並計算有CD16受體的細胞的百分比。

實施例3.5 檢測經培養的細胞的細胞毒性功能。

本實施例使用xCELLigence即時細胞分析系統(xCELLigence Real Time Cell Analysis System；xCELLigence RTCA系統，ACEA BiosciencesInc.，美國)檢測經培養的細胞對目標細胞的細胞毒殺能力。本實施例包含一用來進行細胞毒性測試的96孔xCELLigence E-盤(xCELLigence E-Plate)，將xCELLigence E-盤上的孔分成對照孔、實驗孔、和最大化裂解目標細胞的對照孔。本實施例中使用的作用細胞(effector cells)是從實施例3.1中培養不同時間點取得的細胞懸浮液，目標細胞(target cells)為SK-OV-3細胞系(HTB-77，購自ATCC)，SK-OV-3細胞系是一貼壁式卵巢癌細胞系。將SK-OV-3細胞種於對照孔、實驗孔、和最大化裂解目標細胞的對照孔中，每孔含有20000個SK-OV-3細胞，然後使其靜置30分鐘。

將從實施例3.1中取得的一細胞懸浮液樣品加入實驗孔中，作用細胞數和SK-OV-3細胞(目標細胞)數的比例為2、5和10；將與細胞懸浮液樣品十分之一等體積(tenth equal volume)的裂解緩衝液(lysis buffer)加入最大化裂解目標細胞的對照孔；對照組中不加任何樣品或裂解緩衝液。將該xCELLigence E-盤放入xCELLigence即時細胞分析系統，以檢測細胞在37℃和5%二氧化碳條件下的即時細胞指數(cell index(CI))變化。

其中，附著於xCELLigence E-盤底部的目標細胞數越多，xCELLigence即時細胞分析系統檢測到的細胞指數就越高。因此，細胞指數可以換算出實驗孔中被裂解的目標細胞(target cells that are lysed)的百分比。將實驗孔的細胞指數轉換成被裂解的目標細胞的百分比的公式為：

被裂解的目標細胞的百分比(%)=1-[(實驗孔的細胞指數-最大化裂解目標細胞對照孔的細胞指數)÷(對照孔的細胞指數-最大化裂解目標細胞對照孔的細胞指數)]×100%

請參照表一和表二。表一顯示從第一個實驗取得的細胞懸浮液的結果，表二顯示從第二個實驗取得的細胞懸浮液的結果。

在表一中，第一列的「天」代表培養天數；第二列的「PI⁺」代表以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，正在凋亡或已死亡的細胞的百分比；因為自然殺手細胞、CD4陽性T細胞和CD8陽性T細胞都為CD56陽性(Pernick，N，2018)，所以第三列的「CD56⁺」代表以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞、CD4陽性T細胞和CD8陽性T細胞的總細胞數的百分比；因為T細胞都為CD3陽性(Pernick,N,2018)，所以第四列的「CD3^-」代表以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，T細胞以外的細胞的百分比；因為自然殺手細胞、周邊血液T細胞和大多數的胸腺細胞都為CD2陽性(Pernick,N,2018)，且實施例三所測試的細胞是源自於(derived)周邊血液，所以第五列的「CD2⁺」代表以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞和T細胞的總細胞數的百分比；第六列的「CD56⁺CD3^-」代表以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞的百分比；第七列的「CD56⁺CD2⁺」代表以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞和T細胞總數的百分比；因為自然殺手細胞和巨噬細胞都表現CD16陽性(Pernick,N,2018)，且CD16參與了抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺(ADCC)作用，所以第八列的「CD16⁺」代表以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，有抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺功能的自然殺手細胞和巨噬細胞的總數量的百分比；第九列「CD56⁺CD16⁺」代表以自然殺手細胞(亦即，CD56陽性CD3陰性細胞)總數為100%時，有抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺功能的自然殺手細胞的百分比。

表二中一到八列所代表的意思與表一中相同；當第九列「毒殺測試」被標上「

」標記時，代表該細胞懸浮液中的細胞之細胞毒殺功能在某個時間點被同步測試且確認了該些細胞具有細胞毒殺功能。

表一顯示：(1)第一批純化的CD16陽性細胞群(其中人類CD16陽性自然殺手細胞系的比例高達99%)被培養7~35天後所取得的細胞懸浮液中，正在凋亡或已死亡的細胞百分比為5.65%~7.34%，因此，在培養期間，存活的細胞的百分比為92.66%~94.35%；(2)第一批純化的CD16 陽性細胞群被培養7~35天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞、CD4陽性的T細胞和CD8陽性的T細胞的總數的百分比為99.08%~99.56%；(3)第一批純化的CD16陽性細胞群被培養7~35天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，T細胞以外的細胞的百分比為99.88~100%；(4)第一批純化的CD16陽性細胞群被培養7~35天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞和T細胞總數的百分比為98.08~99.22%；(5)第一批純化的CD16陽性細胞群被培養7~35天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞的百分比為98.21~98.76%；(6)第一批純化的CD16陽性細胞群被培養7~35天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞和T細胞的總數的百分比為98.78~99.33%；(7)第一批純化的CD16陽性細胞群被培養7~35天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，有抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺功能的自然殺手細胞和巨噬細胞的總數的百分比為90.17~92.36%；(8)第一批純化的CD16陽性細胞群被培養7~35天後所取得的細胞懸浮液中，以自然殺手細胞(亦即，CD56陽性CD3陰性細胞)的總數為100%時，有抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺功能的自然殺手細胞的百分比為88.79~92.11%。

表一培養第一批純化的CD16陽性細胞群後所取得的細胞懸浮液的細胞狀態和細胞表面標誌測試結果

表二顯示：(1)第二批純化的CD16陽性細胞群(其中人類CD16陽性自然殺手細胞系的比例達99%)被培養7~202天後所取得的細胞懸浮液中，正在凋亡或已死亡的細胞的百分比為2.7%~10.5%，因此，在培養期間，存活的細胞的百分比為89.5%~97.3%；(2)第二批純化的CD16陽性細胞群被培養7~202天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞、CD4陽性的T細胞和CD8陽性的T細胞的總數的百分比為98.85%~99.65%；(3)第二批純化的CD16陽性細胞群培養7~202天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，T細胞以外的細胞的百分比為99.82~100%；(4)第二批純化的CD16陽性細胞群被培養7~202天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞和T細胞的總數的百分比為94.5~99.68%；(5)第二批純化的CD16陽性細胞群被培養7~202天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞的百分比為97.65%~99.05%；(6)第二批純化的CD16陽性細胞群被培養7~202天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，自然殺手細胞和T細胞的總數的百分比為97.83%~99.61%；(7)第二批純化的CD16陽性細胞群被培養7~202天後所取得的細胞懸浮液中，以細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，有抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺功能的自然殺手細胞和巨噬細胞的總數的百分比為83.88~94.04%；(8)第二批純化的CD16陽性細胞群被培養7~202天後，所取得的細胞懸浮液確實具有細胞毒殺功能。

以揭露於實施例2.1的培養方法培養28天後所取得的細胞懸浮液，已經被寄存在NPMD且具有寄存編號NITE BP-03017。本發明所揭露的結果顯示oNK細胞系在經過至少三個月的繼代培養後，仍能保持其增殖能力，因此，該細胞系可能含有失調的負責控制細胞生長的基因(deregulated genes responsible for cell growth control；例如，該oNK細胞系可能含有一失活的腫瘤抑制基因或一經突變且高度表達的致癌基因)。

表二培養第二批純化的CD16陽性細胞群所取得的細胞懸浮液的細胞狀態、細胞表面標誌、和細胞毒性測試結果

實施例四：非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系沒有致癌性。

本實施例使用六到八週大的雌性BALB/c裸鼠(購買自The Jackson Laboratory或BioLasco，台灣)。三十隻小鼠被任意的指派成六組，為一SK-OV-3組、Raji組、Daudi組、oNK組、γ射線照射過的ACE-oNK組、和DPBS組。

本實施例使用：一人類卵巢癌細胞系「SK-OV-3」(購買自ATCC；寄存編號為ATCC HTB-77)、人類B淋巴球母細胞系「Raji」(購買自ATCC；寄存編號為ATCC CCL-86)和「Daudi」(購買自ATCC；寄存編號為ATCC CCL-213)、以揭露於實施例2.1中的培養方法培養88天後所取得的一細胞懸浮液(本發明的經過88天培養的oNK懸浮液，稱為經88天培養的oNK懸浮液)、及一經γ射線照射過的ACE-oNK細胞懸浮液。下面描述製備γ射線照射過的ACE-oNK細胞懸浮液的方法。

γ射線照射過的ACE-oNK細胞懸浮液：揭露於實施例2.1的培養方法培養84天後所得的細胞懸浮液(本發明的經過84天培養的oNK懸浮液，稱為經84天培養的oNK懸浮液)，利用劑量為10Gy的γ射線照射。使用互補的一細胞鏈接器(cell linker)和一賀癌平(Trastuzumab)鏈接器(Trastuzumab linker)，使賀癌平(Trastuzumab)與經γ射線照射後的經84天培養的oNK懸浮液中的細胞(cells in the γ-ray irradiated 84-day cultured oNK suspension)結合，即取得γ射線照射過的ACE-oNK細胞懸浮液(γ-ray irradiated ACE-oNK cell suspension)。

使賀癌平(Trastuzumab)與細胞(例如：自然殺手細胞、經60 天培養的oNK懸浮液中的細胞、經γ射線照射後的經60天培養的oNK懸浮液中的細胞)結合(binding)的程序如下：

(A)製備細胞鏈接器(cell linker)並使細胞鏈接器與細胞結合，以製備一單鏈DNA共軛的細胞(cell-ssDNA conjugate)的步驟；

(B)，製備賀癌平(Trastuzumab)鏈接器並使賀癌平(Trastuzumab)鏈接器與賀癌平(Trastuzumab)結合，以製備單鏈DNA共軛的賀癌平(Trastuzumab-ssDNA conjugate)的步驟；

(C)混合單鏈DNA共軛的細胞和單鏈DNA共軛的賀癌平(Trastuzumab)，使單鏈DNA共軛的細胞和單鏈DNA共軛的賀癌平(Trastuzumab)透過細胞鏈接器與其位於賀癌平(Trastuzumab)鏈接器上的互補序列相結合，以製備賀癌平共軛的細胞(Trastuzumab-conjugated cells)。

其中步驟(A)的製備細胞鏈接器並使細胞鏈接器與細胞結合，包含下列步驟(a1)~(a4)：

步驟(a1)取得一第一單鏈DNA(first single strand DNA)，其中該第一單鏈DNA的序列為SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：7。

步驟(a2)第一單鏈DNA的5’端被改造成5’端為硫醇基的第一單鏈DNA(5’ end thiol-modified first single strand DNA)，以獲得細胞鏈接器貯備物(cell linker stock)。該細胞鏈接器貯備物也可從Integrated DNA Technologies商業上取得。對本領域技術人員而言，實際的改造方法是已知或顯而易見的(Zimmermann,J,2010)。

步驟(a3)將10~500μL的細胞鏈接器貯備物和0.1~10μL 的N-羥基琥珀醯亞胺-順丁烯二醯亞胺(NHS-Maleimide)(可從Fisher Scientific商業上取得)混合並反應1~60分鐘。

步驟(a4)將從步驟(a3)取得的混合物與1×10⁶~1×10⁸個細胞混合並反應1~60分鐘，以取得單鏈DNA共軛的細胞。

步驟(B)的製備賀癌平(Trastuzumab)鏈接器並使賀癌平(Trastuzumab)鏈接器與賀癌平(Trastuzumab)結合，包含下列步驟(b1)~(b4)：

步驟(b1)取得一第二單鏈DNA(second single strand DNA)，其中該第二單鏈DNA的序列為SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：10，且該第二單鏈DNA的序列是第一單鏈DNA的互補鏈(complementary strand)。

步驟(b2)第二單鏈DNA的5’端被改造成5’端為硫醇基的第二單鏈DNA(5’ end thiol-modified second single strand DNA)，以獲得一賀癌平(Trastuzumab)鏈接器貯備物(Trastuzumab linker stock)。此賀癌平(Trastuzumab)鏈接器貯備物也可從Integrated DNA Technologies商業上取得。對本領域技術人員而言，實際的改造方法是已知或顯而易見的(Zimmermann,J,2010)。

步驟(b3)將10~500μL的賀癌平(Trastuzumab)鏈接器貯備物和0.1~10μL的N-羥基琥珀醯亞胺-順丁烯二醯亞胺(NHS-Maleimide)(可從Fisher Scientific商業上取得)混合並反應1~60分鐘。

步驟(b4)將從步驟(b3)取得的混合物與10~100μL的賀癌平(Trastuzumab)貯備物(Trastuzumab stock)(可從Roche商業上取得)混合並反應10分鐘到3小時，以取得單鏈DNA共軛的賀癌平(Trastuzumab)。

混合單鏈DNA共軛的細胞和單鏈DNA共軛的賀癌平(Trastuzumab)，以取得賀癌平(Trastuzumab)共軛的細胞，例如經γ射線照射過的ACE-oNK懸浮液中的細胞。

1×10⁷個SK-OV-3細胞、1×10⁷個Raji細胞、1×10⁷個Daudi細胞、1×10⁷個經60天培養的oNK懸浮液中的細胞、和1×10⁷個經γ射線照射過的ACE-oNK懸浮液中的細胞，分別被懸浮於100μL的Dulbecco氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)中，以取得不同的細胞懸浮液。這些細胞懸浮液和100μL的Dulbecco氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)在第0天時，分別皮下植入(subcutameously implanted)至SK-OV-3組、Raji組、Daudi組、oNK組、經γ射線照射過的ACE-oNK組、和DPBS組的雌性BALB/c裸鼠中。在第14天、第21天、第24天、第42天和第59天觀察每隻小鼠中的腫瘤生長情形，並在第59天讓小鼠安樂死。

請參閱表三。表三顯示異種移植不同細胞系的裸鼠中，腫瘤生成的結果。

表三顯示在整個實驗過程中，DPBS組(陰性對照組)的小鼠沒有腫瘤生成(0/5，0%)，然而，在SK-OV-3組(陽性對照組)中，五隻小鼠皆有腫瘤生成(5/5，100%)。對異種移植淋巴細胞系Daudi的小鼠，在Daudi組的五隻小鼠中有四隻產生腫瘤(4/5，80%)，且腫瘤維持到實驗結束時(第59天)。對異種移植淋巴細胞系Raji的小鼠，在Raji組的五隻小鼠中有一隻在第42天前帶有可以檢測到的腫瘤，但在實驗結束時回到無法測量的大小。

對異種移植本發明的oNK細胞或經γ射線照射過的ACE-oNK細胞的小鼠，在oNK組和γ射線照射過的ACE-oNK組的小鼠中，整個實驗過程皆沒有腫瘤形成(0/5，0%)。這些實驗結果提供證據證明未經γ射線照射的oNK細胞(non-irradiated oNK cells)及賀癌平(Trastuzumab)共軛的經γ射線照射過的ACE-oNK細胞(Trastuzumab-conjugated irradiated ACE-oNK cells)不具致癌性且可以安全地用於未來的臨床應用和疾病治療。

表三異種移植不同細胞系的裸鼠的腫瘤生成結果。

實施例五：經培養的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系和NK-92細胞系間細胞毒性之比較

本實施例的實驗方法和實施例3.5的方法大致相同，除了(1)本實施例中所使用的作用細胞(effector cell)為①用公開在實施例2.1中的培養方法培養33天後所取得的細胞懸浮液(本發明的培養33天後的oNK細胞懸浮液，稱為經33天培養的oNK細胞懸浮液，其中人類CD16陽性自然殺手細胞系的比例為91.74%)，或②寄存序號為ATCC CRL-2407的人類周邊血液自然殺手細胞群(稱為NK-92懸浮液，其中如圖2B所示，NK-92細胞系的比例至少為98%，且該NK-92細胞系為一CD16陰性自然殺手細胞系)；以及(2)作用細胞數(經33天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞總數或NK-92懸浮液中的細胞總數)和SK-OV-3細胞(目標細胞)數的比例為2：1(ET2)。

請參照圖5。圖5為比較經培養的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系和NK-92細胞系，對癌細胞的細胞毒殺功能之柱狀圖。圖5顯示NK-92細胞系(一CD16陰性自然殺手細胞系，所以不能藉由抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用摧毀癌細胞)只毒殺2.40±5.52%的癌細胞，然而oNK細胞(非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞，該細胞沒有與靶向腫瘤相關抗原的IgG抗體連接或共培養，因此，未被活化而無法誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應)毒殺49.68±1.19%的癌細胞。

因此，此實驗結果顯示：與NK-92細胞(NK-92為一CD16陰性自然殺手細胞系，因此不能透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用來摧毀癌細胞)相比，未經活化誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應的oNK細胞能使細胞毒殺效果提升大約21倍(49.68÷2.4=21)。這是一無法預期的結果。

此外，根據此結果，申請人相信，如將人類CD16陽性自然殺手細胞系從經33天培養的oNK懸浮液(經培養的oNK)中分離出，並將CD16陰性自然殺手細胞系(NK-92)從NK-92懸浮液中分離出後，可觀察到相似的無法預期的結果。

實施例六：不同數量的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系間細胞毒性之比較

本實施例的實驗方法與實施例3.5的實驗方法大致相同，除了(1)本實施例中所使用的作用細胞為①用公開在實施例2.1中的培養方法培養X天後所取得的細胞懸浮液(本發明的培養X天的oNK懸浮液，其中人類CD16陽性自然殺手細胞系的比例為8.91%，稱為小量oNK細胞懸浮液)，②用公開在實施例2.1中的培養方法培養Y天後所取得的細胞懸浮液(本發明的培養Y天的oNK，其中人類CD16陽性自然殺手細胞系的比例為64.15%，稱為中量oNK細胞懸浮液)，③用公開在實施例2.1中的培養方法培養Z天後所取得的細胞懸浮液(本發明的培養Z天的oNK，其中人類CD16陽性自然殺手細胞系的比例為91.74%，稱為大量oNK細胞懸浮液)，④寄存編號為ATCC CRL-2407的人類周邊血液自然殺手細胞群(稱為NK-92懸浮液，其中如圖2B所示，NK-92細胞系的比例至少為98%，且該NK-92細胞系為一CD16陰性自然殺手細胞系)，⑤含有小量ACE-oNK-HER2細胞的懸浮液，⑥含有中量ACE-oNK-HER2細胞的懸浮液，或⑦含有大量ACE-oNK-HER2細胞的懸浮液；以及(2)作用細胞數(少量oNK細胞懸浮液，中量oNK細胞懸浮液，大量oNK細胞懸浮液，NK-92懸浮液，小量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液，中量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液，或大量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液中的總細胞數)與SK-OV-3細胞(目標細胞)數的比例為2：1(ET2)。

茲描述製備小量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液，中量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液，和大量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液的方法於下。

小量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液：將「小量oNK細胞懸浮液」中的所有細胞，利用互補的一細胞鏈接器和一賀癌平(Trastuzumab)鏈接器與賀癌平(Trastuzumab)連接，進而取得小量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液，其中ACE-oNK-HER2細胞的比例大約為8.91%。

中量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液：將「中量oNK細胞懸浮液」中的所有細胞，利用互補的一細胞鏈接器和一賀癌平(Trastuzumab)鏈接器與賀癌平(Trastuzumab)連接，進而取得中量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液，其中ACE-oNK-HER2細胞的比例大約為64.15%。

大量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液：將「大量oNK細胞懸浮液」中的所有細胞，利用互補的一細胞鏈接器和一賀癌平(Trastuzumab)鏈接器與賀癌平(Trastuzumab)連接，進而取得大量ACE-oNK-HER2細胞懸浮液，其中ACE-oNK-HER2細胞的比例大約為91.74%。

將賀癌平(Trastuzumab)與細胞(少量oNK細胞懸浮液，中量oNK細胞懸浮液，或大量oNK細胞懸浮液中的細胞)結合的方法如同實施例四的方法。

請參照圖6A和6B。圖6A為比較不同數量的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系，對癌細胞的細胞毒殺活性之柱狀圖。。圖6B為比較不同數量的HER2抗體複合的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(anti-HER2 antibody-conjugated non-transgenic human CD16⁺ natural killer cell line)，透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用對癌細胞的細胞毒殺活性之柱狀圖。

圖6A顯示NK-92細胞系(一CD16陰性自然殺手細胞系，因此無法透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用摧毀癌細胞)只毒殺2.40±5.52%的癌細胞；小量oNK細胞(非基因轉殖人類CD16陽性自然殺手細胞，該細胞沒有與靶向腫瘤相關抗原的IgG抗體連接或共培養，因此，未經活化而無法誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應)毒殺25.00±3.60%的癌細胞；中量oNK細胞(非基因轉殖人類CD16陽性自然殺手細胞，該細胞沒有與靶向腫瘤相關抗原的IgG抗體連接或共培養，因此，未經活化而無法誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應)毒殺47.60±6.80%的癌細胞；大量oNK細胞(非基因轉殖人類CD16陽性自然殺手細胞，該細胞沒有與靶向腫瘤相關抗原的IgG抗體連接或共培養，因此，未經活化而無法誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應)毒殺49.68±1.19%的癌細胞。

因此，此結果顯示：和NK-92細胞(NK-92為一CD16陰性自然殺手細胞系，因此不能藉由抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用摧毀癌細胞)相比，小量oNK細胞懸浮液(其中人類CD16陽性自然殺手細胞系的比例為8.91%)足以使細胞毒殺效果提升10倍(25.00÷2.4=10)。這是一無法預期的結果。因此，該結果代表當以懸浮液中的總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞系的數量等於或超過5%即足以殺死癌細胞。根據此結果，申請人相信在臨床實驗中能觀察到相似的無法預期的結果。

該結果也顯示了中量或大量oNK細胞懸浮液(其中人類CD16陽性自然殺手細胞系的比例為64.15%或91.74%)可以使細胞毒殺效果提升大約20~21倍(47.60÷2.4=20；49.68÷2.4=21)。因此，該結果代表越多人類CD16陽性自然殺手細胞系即能殺死越多癌細胞，且於人類CD16陽性細胞系的量大約為60%~65%時達到一高原(platenu)，此係以懸浮液中的總細胞數作為100%。根據此結果，申請人相信在臨床實驗中能觀察到相似的結果。

圖6B顯示小量oNK細胞毒殺25.00±3.60%的癌細胞；中量oNK細胞毒殺47.60±6.80%的癌細胞；大量oNK細胞毒殺49.68±1.19%的癌細胞；小量ACE-oNK-HER2細胞毒殺63.70±5.00%的癌細胞；中量ACE-oNK-HER2細胞毒殺62.00±4.00%的癌細胞；大量ACE-oNK-HER2細胞毒殺73.9±11.80%的癌細胞。

因此，此結果顯示：當本發明培養所得的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系，透過互補的一細胞鏈接器和一抗體鏈接器(例如賀癌平(Trastuzumab)鏈接器)與靶向腫瘤相關抗原(例如賀癌平(Trastuzumab))的抗體連結，因此能被活化而誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應時，細胞毒殺效果顯著增加14.4%~38.7%(62.00%-47.60%=14.4%；63.70%-25.00%=38.7%)。

該結果同時顯示，外因性靶向單元複合的oNK細胞(exogeneous targeting unit complexed-oNK cell；例如與抗HER2抗體共軛的oNK細胞)的量等於或超過5%時即足以透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用殺死癌細胞；該結果也指出，越多外因性靶向單元複合的oNK細胞，即能透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用殺死越多癌細胞，且當外因性靶向單元複合的oNK細胞量為大約5%~10%時，會達到一第一高原(first plateau)，此係以懸浮液中的總細胞數作為100%。根據此結果，申請人相信能在臨床測試中觀察到相似的結果。

實施例七：與HER2抗體共軛的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系和與HER2抗體共培養的非基因轉殖人類CD16陽性自然殺手細胞系間細胞毒殺活性之比較

本實施例的實驗方法和實施例3.5的方法大致相同，除了(1)本實施例中所使用的作用細胞為①用公開在實施例2.1中的培養方法培養55天後所取得的細胞懸浮液(稱為經55天培養的oNK懸浮液)，或②含有ACE-oNK-HER2細胞的細胞懸浮液(如實施例四中所描述，將「經55天培養的oNK懸浮液」中的所有細胞，利用互補的一細胞鏈接器和一賀癌平(Trastuzumab)鏈接器與賀癌平(Trastuzumab)連接)；(2)作用細胞數(經55天培養的oNK懸浮液中的所有細胞或含有ACE-oNK-HER2細胞的細胞懸浮液中的所有細胞)與SK-OV-3細胞(目標細胞)數的比例為1：1(ET1)、2：1(ET2)、5：1(ET5)；和(3)在用於測試經55天培養的oNK懸浮液的實驗孔中，加入與「含有ACE-oNK-HER2細胞的細胞懸浮液中，連接在細胞上的賀癌平(Trastuzumab)」總量相等的賀癌平(Trastuzumab)(在E：T比例為1時(0.55ng)，E：T比例為2時(1.10ng)，及E：T比例為5時(2.75ng))。詳細步驟描述於下。

將xCELLigence E-盤中的孔分成對照孔、ACE-oNK-HER2 ET1實驗孔、ACE-oNK-HER2 ET2實驗孔、ACE-oNK-HER2 ET5實驗孔、oNK和賀癌平(Herceptin)ET1實驗孔、oNK和賀癌平(Herceptin)ET2實驗孔、oNK和賀癌平(Herceptin)ET5實驗孔、以及最大化裂解目標細胞對照孔。將SK-OV-3細胞種於對照孔、ACE-oNK-HER2 ET1實驗孔、ACE-oNK-HER2 ET2實驗孔、ACE-oNK-HER2 ET5實驗孔、oNK和賀癌平(Herceptin)ET1實驗孔、oNK和賀癌平(Herceptin)ET2實驗孔、oNK和賀癌平(Herceptin)ET5實驗孔、以及最大化裂解目標細胞對照孔中，每孔含有20000個SK-OV-3細胞，然後使其靜置30分鐘。

將含有ACE-oNK-HER2細胞的細胞懸浮液中的20000、40000、100000個細胞分別加入ACE-oNK-HER2 ET1實驗孔、ACE-oNK-HER2 ET2實驗孔、及ACE-oNK-HER2 ET5實驗孔；因此，作用細胞數(含有ACE-oNK-HER2細胞的細胞懸浮液中的細胞總數)與SK-OV-3細胞(目標細胞)數的比例為1、2和5。

將經55天培養的oNK懸浮液中的20000、40000、或100000個細胞和0.55、1.10、或2.75ng的賀癌平(Trastuzumab)(一種HER2蛋白的抗體，商品名稱為Herceptin，購自Roche，瑞士)分別加入「oNK和賀癌平(Herceptin)ET1實驗孔」、「oNK和賀癌平(Herceptin)ET2實驗孔」、及「oNK和賀癌平(Herceptin)ET5實驗孔」中。因此，作用細胞數(經55天培養的oNK懸浮液中的細胞總數)與SK-OV-3細胞(目標細胞)數的比例為1、2和5；在「oNK和賀癌平(Herceptin)ET1實驗孔」、「oNK和賀癌平(Herceptin)ET2實驗孔」、或「oNK和賀癌平(Herceptin)ET5實驗孔」中的賀癌平(Trastuzumab)量分別與在Ace-oNK-HER2 ET1實驗孔、Ace-oNK-HER2 ET2實驗孔、及Ace-oNK-HER2 ET5實驗孔中，連接在細胞上的賀癌平(Trastuzumab)總量相同。

請參照圖7。圖7為比較HER2抗體複合的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(anti-HER2 antibody-conjugated non-transgenic human CD16⁺ natural killer cell line)和與HER2抗體共培養的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(anti-HER2 antibody co-cultured non-transgenic human CD16⁺ natural killer eell line)，透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用對癌細胞的細胞毒殺活性能力之柱狀圖。圖7顯示與靶向腫瘤相關抗原的 IgG抗體共培養的oNK細胞(因此，被活化誘導了抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應)，在E：T的比例為1、2或5時，分別只毒殺0.00±2.10%、7.30±1.40%、或71.8±2.10%的癌細胞，然而，連接(共軛)了靶向腫瘤相關抗原的IgG抗體的ACE-oNK-HER2細胞(因此，被活化誘導了抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應)，在E：T的比例為1、2、或5時，分別毒殺31.40±1.10%、65.60±1.00%、或99.10±1.30%的癌細胞。

因此，此結果顯示：對比於與靶向腫瘤相關抗原的IgG抗體共培養的oNK細胞，連接(共軛)靶向腫瘤相關抗原的IgG抗體的ACE-oNK-HER2細胞在低劑量時，能造成9~∞倍的細胞毒性增加量(ET1含有0.55ng賀癌平(Trastuzumab)或ET2含有1.10ng賀癌平(Trastuzumab)；65.60÷7.30=9；31.40÷0.00=∞；∞是一代表一無限大數值的符號)。亦即，「將CD16陽性自然殺手細胞與腫瘤抗原之抗體連結」(例如連結經培養的oNK細胞和賀癌平(Trastuzumab))會造成一無法預期的結果，而且「將CD16陽性自然殺手細胞與腫瘤抗原之抗體連結」創造出有效且更安全的治療方法，使得低劑量的治療方法得以實現。

除此之外，根據此結果，申請人相信將人類CD16陽性自然殺手細胞系從經55天培養的oNK懸浮液(培養的oNK)分離出來後、以及將與賀癌平(Trastuzumab)連接的CD16陽性自然殺手細胞(ACE-oNK-HER2細胞)從含有ACE-oNK-HER2細胞的細胞懸浮液中分離出來後，可觀察到相似的無法預期的結果。

實施例八：檢測非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系的基因組DNA

實施例8.1 使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)檢測編碼CD16受體的DNA序列。

本實施例中使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)來檢測本發明經培養的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(oNK)或轉殖CD16的NK-92細胞系(yNK)中，編碼CD16受體的DNA序列。

本實施例使用揭露於實施例2.1中的培養方法培養M天後取得的細胞懸浮液(稱為經M天培養的oNK懸浮液)和轉殖CD16的NK-92細胞系(購自ATCC，具有寄存編號ATCC PTA-6967；稱為yNK)。用Blood & Cell Culture DNA Mini Kit試劑盒(購自Qiagen)分離yNK和經M天培養的oNK懸浮液中的細胞的基因組DNA(Genomic DNA)。

yNK樣品或oNK樣品：將從yNK或經M天培養的oNK懸浮液中分離出的50ng基因組DNA與10μL的ddPCR Supermix for Probes(2倍濃度溶液(2X))(商品貨號：1863026；購自Bio-Rad)、1μLBstXI限制酶(商品名BstXI；商品貨號R0013S；購自BioLabs)、及1μL的CD16 F176F水解探針和CD16 F176V水解探針混合物(試驗ID：C_C_25815666_10；購自ThermoFisher；內容序列[VIC/FAM]：TCTGAAGACACATTTTTACTCCCAA[C/A]AAGCCCCCTGCAGAAGTAGGAGCCG；https://www.thermofisher.com/order/genome-database/details/genotyping/C＿25815666_10?CID=&ICID=&subtype=)混合，使總體積達20μL。

無模板的對照樣品：將水、10μL的ddPCR Supermix for Probes(2倍濃度溶液(2X))、1μLBstXI限制酶、及1μL的CD16 F176F水解探針和CD16 F176V水解探針混合物混合，使總體積達20μL。

用QX100/QX200微滴式數位PCR(ddPCR)系統(購自Bio-Rad)進行ddPCR實驗。首先，將樣品放入一QX100或QX200微滴產生器(QX100/QX200微滴式數位PCR系統中的一台機器)中，將每個樣品分隔成(partition)15000~20000顆微滴(奈升大小的微滴，nanoliter-sized droplet)。

第二，將96孔盤(商品名：DG8 cartidge；購自Bio-Rad)中的孔分成無模板對照孔、yNK孔、及oNK孔，這些孔分別用於測試無模板對照組(NTC組)、yNK組、及oNK組。將奈米化的無模板對照樣品、yNK樣品、及oNK樣品各自轉移到無模板對照孔、yNK孔、及oNK孔中。

第三，PCR擴增的方法中，熱循環的條件為95℃作用10分鐘、45個循環的95℃作用15秒、及60℃作用1分鐘，接著98℃作用10分鐘，然後保持在4℃。每個步驟中的升降溫速率(ramp rate for each step)設定為2℃/s。

CD16 F176F水解探針(CD16 F176F hydrolysis probe)是一標記有FAM受體螢光團(FAM receptor fluorophore)的探針，而CD16 F176V水解探針(CD16 F176V hydrolysis probe)是一標記有VIC受體螢光團的探針。PCR擴增方法中的主要步驟為變性(denaturation)、接合(annealing)、及延伸(extension)。在接合時，水解探針(例如CD16 F176F水解探針或CD16 F176V水解探針)與目標序列結合；然後在延伸時，標記在探針5’端的受體被切除然後獲釋的受體發射螢光。CD16 F176F水解探針的序列為SEQ ID NO：11，因此預期可以檢測位於一號染色體q臂第1q23.3位點的編碼CD16受體的DNA序列；CD16 F176V水解探針的序列為SEQ ID NO：12，預期能檢測yNK 中的合成的DNA序列。

請注意，oNK中位於一號染色體q臂第1q23.3位點的編碼CD16受體的DNA序列會被轉錄成CD16 F176F信息RNA(CD16 F176F mRNA)，然後轉譯成CD16 F176F蛋白(CD16 F176F protein)，其中oNK內位於一號染色體q臂第1q23.3位點的編碼CD16受體的DNA序列包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：19；CD16 F176F信息RNA的序列包含SEQ ID NO：13；CD16 F176F蛋白的序列包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：20。yNK中編碼CD16受體的合成的DNA序列會被轉錄成CD16 F176V訊息RNA(CD16 F176V mRNA)，然後轉譯成CD16 F176V蛋白(CD16 F176V protein)，CD16 F176V訊息RNA的序列為SEQ ID NO：15；CD16 F176V蛋白的序列為SEQ ID NO：16。

第四，微滴讀取的過程(droplet reading process)中，用一QX100/QX200微滴讀取儀(QX100/QX200微滴數位PCR分析系統中的一台機器)讀取微滴，其中每個微滴被各自隔開以讀取螢光，因此每個微滴都被一雙色檢測系統個別地(individually)分析(設定為檢測FAM和VIC)。對比於陰性微滴(negative droplets)，具有至少一個目標DNA分子拷貝(one copy of the target DNA molecule)(例如CD16 F176F水解探針檢測的DNA分子或CD16 F176V水解探針檢測的分子)的陽性微滴(positive droplet)展現增強的螢光量。

請參照圖8。圖8為比較非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系和轉殖CD16的NK-92細胞系，其基因型(genotype)柱狀圖。

NTC組中，在14568個總收集微滴(事件)中，只有一個含有能被CD16 F176F水解探針檢測到的DNA分子的陽性微滴和四個含有能被CD16 F176V水解探針檢測到的DNA分子的陽性微滴。yNK組中，在14230個總收集微滴(事件)中，有6737個含有能被CD16 F176F水解探針檢測到的DNA分子的陽性微滴和8152個含有能被CD16 F176V水解探針檢測到的DNA分子的陽性微滴。oNK組中，在14230個總收集微滴(事件)中，有7637個含有能被CD16 F176F水解探針檢測到的DNA分子的陽性微滴和5333個含有能被CD16 F176V水解探針檢測到的DNA分子的陽性微滴。

因此，此結果顯示使用微滴數位PCR分析系統分析yNK細胞的基因組DNA時，能被CD16 F176F水解探針檢測到的DNA分子和能被CD16 F176V水解探針檢測到的DNA分子的比例為0.83(6737÷8152=0.83)，而用微滴數位PCR分析系統分析oNK細胞的基因組DNA時，能被CD16 F176F水解探針檢測到的DNA分子和能被CD16 F176V水解探針檢測到的DNA分子的比例為1.43(7637÷5333=1.43)。

亦即，透過使用微滴數位PCR分析系統分析本發明的人類CD16陽性自然殺手細胞系(oNK)的基因組DNA時，能被CD16 F176F水解探針檢測到的DNA分子和能被CD16 F176V水解探針檢測到的DNA分子的比例等於或大於一(能被CD16 F176F水解探針檢測到的DNA分子數÷能被CD16 F176V水解探針檢測到的DNA分子數≧1)。

此外，基於此結果，申請人相信將人類CD16陽性自然殺手細胞系從經M天培養的oNK懸浮物(經培養的oNK)中分離出來後，可觀察到相似的結果。

根據申請人的經驗，具有序列SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的另一水解探針可以檢測在其他轉殖CD16的NK細胞(other CD16-transgenic NK cells)中的編碼CD16受體的DNA序列。

實施例8.2 利用螢光原位雜交實驗(FISH)檢測編碼CD16受體的DNA序列。

本實施例中，使用雙色(two-color)螢光原位雜交實驗(Fluorescence in situ hybridizaton，FISH)來檢測人類自然殺手細胞中，基因轉殖的、合成的、基因改造的、或特意遞送的編碼CD16a受體的DNA序列。

這裏將用本發明經培養的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(oNK)作為一例來展示沒有基因轉殖的、合成的、基因改造的、或特意遞送的編碼CD16受體的DNA序列的人類細胞的結果，而用轉殖CD16的NK-92細胞系(yNK)為一例來展示有基因轉殖的、合成的、基因改造的、或特意遞送的編碼CD16受體的DNA序列的人類細胞的結果。

詳言之，本實施例使用從揭露於實施例2.1的培養方法培養N天後取得的細胞懸浮液中分離出的CD16陽性NK細胞(oNK細胞)(稱為經N天培養的oNK懸浮液)、以及轉殖CD16的NK-92細胞系(購自ATCC，具有寄存編號ATCC PTA-6967；稱為yNK)。

Kallioniemi在1996年公開了雙色螢光原位雜交實驗(FISH)方法的細節，茲呈現一簡短摘錄如下。

第一，依DNA流式細胞技術(DNA flow cytometry)的使用指南，從1×10⁷個yNK細胞或從經N天培養的oNK懸浮液中分離出的oNK細胞(CD16陽性NK細胞)中製備細胞核(nuclei)(Kallioniemi et al.,1996；Vindelov et al.,1983)。詳言之，將細胞團塊(cell pellet)培養(incubated)於一低張的界面活性劑溶液(hypotonic detergent solution)中並稍微用胰蛋白酶分解。

第二，將細胞核(nuclei)滴在顯微鏡玻片(microscope slides)上，風乾並固定於甲醇乙酸液(methanol acetic acid)中。

第三，在雜交反應(hybridization)前，用蛋白酶K(proteinase K)或其他蛋白水解酵素處理目標細胞以提升探針的穿透力(probe penetration)。

第四，通常透過將玻片浸沒在一變性溶液(70%甲醯胺(formamide)，兩倍濃度的SSC緩衝液)中，於70℃條件下作用2~4分鐘，然後用乙醇固定(fixation)和脫水(dehydration)，來達成目標細胞的變性(denaturation)。變性反應的時間和溫度需要根據目標細胞的特性做最佳化。

第五，在雜交反應前，將20~60ng的第一螢光染劑標記的FCGR3A FISH探針(一可以檢測所有編碼CD16a受體的人類DNA序列的實驗探針；購自Empire Genomics)、20~60ng的第二螢光染劑標記的一號染色體對照探針(一參考探針；購自Empire Genomics)、以及遮蔽DNA(blocking DNA；沒有標記的Cot-1或胎盤DNA)加入一以甲醯胺為基底的雜交反應緩衝液(formamide-based hybridization buffer)。當探針含有會與基因組上多個位置雜交(hybridize)的重複序列(repetitive sequences)時，必須使用遮蔽DNA。將雜交反應混合物加熱達70℃，反應5分鐘使探針片段(probe fragments)變性，然後放置到目標玻片(target slide)上；蓋上一蓋玻片，封上橡膠膠合劑(rubber cement)。雜交反應是在37℃條件下的一潮濕反應槽(moist chamber)中執行過夜(overnight)。

第六，將未結合的探針洗掉。

第七，用一DNA染料複染(counterstained)目標細胞核(target nuclei)，該染料通常為碘化丙啶(propidium iodide)或4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。

使用一一般的高解析度落射螢光顯微鏡(high-quality epifluorescence microscope)來評估雜交反應。幾乎任何主要的製造商(Zeiss,Leitz,Olympus,and Nikon)近期的顯微鏡型號都適合用來作基因專一性的FISH分析；60X Plan Apos或其他經過仔細色差校正過的物鏡較佳。評估至少100個從整個玻片上任意挑選的細胞核的實驗和參考探針的訊號數。只計算形態完整且沒有重疊的細胞核。因為細胞核是三維立體的，所以必須在細胞核的深度區間上下移動焦距以取得正確的訊號計數。

一般可用幾種格式來報告基因專一性FISH實驗的結果，例如：(1)每個細胞的實驗探針訊號數；(2)每個細胞的測試探針訊號數除以參考探針的訊號數；或(3)測試探針的訊號數比參考探針的拷貝數(copy number)高或低的細胞的百分比。

請參照圖9A-9E。圖9A-9E說明應用一標記一顏色的CD16a受體基因專一性測試探針和一標記另一顏色的參考探針的雙色FISH分析來檢測測人類自然殺手細胞中，基因轉殖的、合成的、基因改造的、或特意遞送的編碼CD16a受體的DNA序列的原理。

根據申請人的經驗，每個oNK細胞的FCGR3A FISH探針(一種可以檢測所有編碼CD16a的人類DNA序列的實驗探針)訊號值為2(每個細胞的實際基因拷貝數；the actual gene copy number per cell)，oNK的雙色FISH形態看起來將會像圖9A(代表一不具有基因轉殖的、合成的、基因改造的、或特意遞送的編碼CD16a受體的DNA序列的人類細胞的結果的常態圖樣(normal pattern))。每個yNK細胞的一號染色體對照探針(一參考探針；購自Empire Genomics)的訊號數可能大於2，yNK的雙色FISH形態看起來將會像圖9B~9E(代表一具有基因轉殖的、合成的、基因改造的、或特意遞送的編碼CD16a受體的DNA序列的人類細胞的結果的CD16轉基因圖樣(CD16-transgenic pattern))。

實施例九：冷凍解凍對非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系存活率的影響。

利用實施例1.1的方法分選出純化的CD16陽性細胞群(表達CD16受體的細胞比例高達99%)，然後利用實施例2.1的培養方法培養該純化的CD16陽性細胞群21天(純化的CD16陽性細胞群被繼代培養了八次)。將細胞液樣品與一等體積的台盼藍混合，進行細胞計數後得知細胞存活率為95%。取一足夠量的細胞液，使其含有2×10⁷個活細胞，然後實施以下的冷凍和解凍方法。

冷凍方法：將含有2×10⁷個活細胞的細胞液離心，去除上清液，然後用1mL的冷凍緩衝液(CryoStor® CS10 Freeze Media，含有10vol%的DMSO，BioLife Solutions，美國)重新懸浮細胞。將該細胞懸浮液放入一冷凍管後，將該冷凍管置入CoolCell細胞冷凍盒(Corning，USA)，然後將該CoolCell細胞冷凍盒存放入一-80℃冰箱過夜(每分鐘溫度下降1℃)。將該冷凍管移出並存放在液氮中17天。

解凍方法：將冷凍管放入一37℃水浴以快速地解凍細胞懸浮液，將1mL的細胞懸浮液與9mL實施例2.1中所述的細胞培養基混合。在將一細胞混合液樣品與一等體積的台盼藍混合後，觀察細胞數與細胞存活率。

實驗結果顯示，解凍後有1.95×10⁷個細胞存活，回收率(Recovery Rate)高達97.5%[(1.95×10⁷)÷(2×10⁷)×100%=97.5%]，細胞存活率為96%，與冷凍前的存活率(95%)沒有顯著的差異。

實施例十：非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系的細胞毒殺活性

本實施例的實驗方法和實施例3.5的方法大致相同，除了(1)本實施例中所使用的作用細胞為Ctrl oNK細胞、Ctrl yNK細胞、ACE-oNK細胞或ACE-yNK細胞；以及(2)作用細胞數與SK-OV-3細胞(目標細胞)數的比例為2：1(ET2)或5：1(ET5)。

Ctrl oNK細胞：Ctrl oNK細胞為將純化的CD16陽性細胞群(其中非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系的比例高達99%)用實施例2.1的培養方法培養26天後所得的經培養的細胞群。

Ctrl yNK細胞：Ctrl yNK細胞為轉殖CD16的NK-92細胞系(購自ATCC；寄存編號為ATCC PTA-6967)；

ACE-oNK細胞：ACE-oNK細胞為使用互補的一細胞鏈接器和一賀癌平(Trastuzumab)鏈接器，使賀癌平(Trastuzumab)與Ctrl oNK細胞結合後，所取得的細胞。

ACE-yNK細胞：ACE-oNK細胞為使用互補的一細胞鏈接器和一賀癌平(Trastuzumab)鏈接器，使賀癌平(Trastuzumab)(一種HER2蛋白抗體，商品名為Herceptin，購自Roche，瑞士)與Ctrl yNK細胞結合後，所取得的細胞。

使賀癌平(Trastuzumab)與自然殺手細胞(例如Ctrl oNK細胞或Ctrl yNK細胞)結合的方法如下：

(A)製備細胞鏈接器(Cell linker)並使細胞鏈接器與自然殺手細胞結合，以製備一單鏈DNA共軛的NK細胞(NK-ssDNA conjugate)的步驟；

(B)製備賀癌平鏈接器(Trastuzumab linker)並使賀癌平(Trastuzumab)鏈接器與賀癌平(Trastuzumab)結合，以製備單鏈DNA共軛的賀癌平(Trastuzumab-ssDNA conjugate)的步驟；

(C)混合單鏈DNA共軛的NK細胞和單鏈DNA共軛的賀癌平(Trastuzumab)，使單鏈DNA共軛的NK細胞和單鏈DNA共軛的賀癌平(Trastuzumab)透過細胞鏈接器與其位於賀癌平(Trastuzumab)鏈接器上的互補序列相結合，以製備賀癌平共軛的自然殺手細胞(Trastuzumab-conjugated natural killer cells)(例如：ACE-oNK細胞或ACE-yNK細胞)。

其中步驟(A)的製備細胞鏈接器並使細胞鏈接器與自然殺手細胞結合，包含下列步驟(a1)~(a4)：

步驟(a3)將10~500μL的細胞鏈接器貯備物和0.1~10μL的N-羥基琥珀醯亞胺-順丁烯二醯亞胺(NHS-Maleimide)(可從Fisher Scientific商業上取得)混合並反應1~60分鐘。

步驟(a4)將從步驟(a3)取得的混合物與1×10⁶~1×10⁸個自然殺手細胞混合並反應1~60分鐘，以取得單鏈DNA共軛的NK細胞。

步驟(b2)第二單鏈DNA的5’端被改造成5’端為硫醇基的第二單鏈DNA(5’ end thiol-modified second single strand DNA)，以獲得賀癌平鏈接器貯備物(Trastuzumab linker stock)。該賀癌平(Trastuzumab)鏈接器貯備物也可從Integrated DNA Technologies商業上取得。對本領域技術人員而言，實際的備置方法是已知或顯而易見的(Zimmermann,J,2010)。

步驟(b3)將10~500μL的賀癌平(Trastuzumab)鏈接器貯備物和0.1~10mL的N-羥基琥珀醯亞胺-順丁烯二醯亞胺(NHS-Maleimide)(可從Fisher Scientific商業上取得)混合並反應1~60分鐘。

步驟(b4)將從步驟(b3)取得的混合物與10~100μL的賀癌平貯備物(Trastuzumab stock)(可從Roche商業上取得)混合並反應10分鐘到3小時，以取得單鏈DNA共軛的賀癌平(Trastuzumab)。

請參閱圖10。圖10為表達非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用殺死癌細胞的細胞毒殺功能之柱狀圖。圖10顯示不論作用細胞數與SK-OV-3細胞(目標細胞)數的比例為2：1(ET2)或5：1(ET5)，未經賀癌平(Trastuzumab)活化的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(Ctrl oNK細胞)毒殺60%~65%的癌細胞，而經賀癌平(Trastuzumab)活化的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(ACE-oNK細胞)毒殺95%~100%的癌細胞。因此，本發明培養所取得的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系確實有毒殺癌細胞的細胞毒殺功能，且當本發明培養所取得的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系經活化誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應後，細胞毒殺作用顯著地提高了至少30%(95%-65%=30%；p<0.05)。

請參閱圖11A和圖11B。圖11A為比較非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系和轉殖CD16的NK-92細胞系，在不同作用細胞(E)和目標細胞(T)比例時，殺死癌細胞的細胞毒殺功能之柱狀圖；圖11B為比較非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系和轉殖CD16的NK-92細胞系，在不同作用細胞(E)和目標細胞(T)比例時，透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用殺死癌細胞的細胞毒殺功能之柱狀圖。

圖11A的結果顯示，當作用細胞數與SK-OV-3細胞(目標細胞)數的比例為5：1(ET5)且未經賀癌平(Trastuzumab)活化時，非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(Ctrl oNK細胞)毒殺70%的癌細胞，而轉殖 CD16的NK-92細胞系(Ctrl yNK)毒殺72%的癌細胞，兩組間並沒有顯著差別(p>0.05)。因此，當作用細胞數與SK-OV-3細胞(目標細胞)數的比例為5：1(ET5)時，本發明培養取得的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系的細胞毒殺功能沒有比轉殖CD16的NK-92細胞系差。換句話說，與轉殖CD16的NK-92細胞系相比，利用本發明的方法所取得的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系不只安全，同時具有相同的細胞毒殺效果。

圖11B的結果顯示，不論作用細胞數與SK-OV-3細胞(目標細胞)數的比例為2：1(ET2)或5：1(ET5)，經賀癌平(Trastuzumab)活化的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系(ACE-oNK細胞)毒殺95%的癌細胞，而經賀癌平(Trastuzumab)活化的轉殖CD16的NK-92細胞系(ACE-yNK)毒殺95%的癌細胞，兩組間沒有顯著差異(p>0.05)。因此，利用本發明的培養方法所取得的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用的細胞毒殺功能沒有比轉殖CD16的NK-92細胞系差。換句話說，與轉殖CD16的NK-92細胞系相比，利用本發明的方法所取得的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系不只安全，且在透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用殺死癌細胞方面上有相同的細胞毒殺效果。

實施例十一：用不同濃度的人類血小板裂解物培養非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系。

本實施例的實驗方法和實施例2.1的方法大致相同，除了(1)在步驟S22’中，本實施例係培養「利用公開在實施例2.1的培養方法培養9天後取得的細胞懸浮液(稱為9天培養的oNK懸浮液)中的所有細胞」，且步驟 S22’中的第一容器內的細胞數為5×10⁶；以及(2)細胞培養基包含500IU/mL的介白素-2(IL-2)和① 2.5%的人類血小板裂解物，② 5.0%的人類血小板裂解物，③ 10.0%的人類血小板裂解物，或④ 5.0%的人類血清(不包含人類血小板裂解物)。

本實施例中，檢測經培養的細胞的細胞數、細胞存活率、和CD16表面標誌的實驗方法都與實施例2.2和3.4的方法相同。

請參閱圖12A~12C。圖12A~12C為人類血小板裂解物對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同培養天數後的總細胞數、細胞存活率或維持CD16表達量各自的影響之折線圖。

圖12A顯示，經培養14天後，培養在不含人類血小板裂解物(但包含5.0%的人類血清)、包含2.5%人類血小板裂解物、包含5.0%人類血小板裂解物、和包含10.0%人類血小板裂解物的細胞培養基中的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞數分別為4.7×10⁸、6.49×10⁸、1.01×10⁹、和1.74×10⁹。因此，此結果顯示：當跟不包含人類血小板裂解物(但包含5.0%的人類血清)的細胞培養基相比，人類血小板裂解物可以造成3.7倍的增加量(17.4÷4.7=3.7)。亦即，人類血小板裂解物造成了一無法預期的結果，人類血小板裂解物使非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞大量地擴增。另外，這些結果暗示對於人類CD16陽性自然殺手細胞的擴增而言，配方3(包含10.0%人類血小板裂解物)比其餘的配方好。

圖12B顯示，經培養7天後，培養在不含人類血小板裂解物(但包含5.0%的人類血清)、包含2.5%人類血小板裂解物、包含5.0%人類血小板裂解物、和包含10.0%人類血小板裂解物的細胞培養基中的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手的細胞的存活率分別維持在92%、88%、92%、和92%。經培養14天後，培養在不含人類血小板裂解物(但包含5.0%的人類血清)、包含2.5%人類血小板裂解物、包含5.0%人類血小板裂解物、和包含10.0%人類血小板裂解物的細胞培養基中的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞的細胞存活率分別維持在94%、90%、92%、和93%。因此，此結果顯示：未經人類血小板裂解物作用的人類CD16陽性自然殺手細胞和以2.5%~10.0%人類血小板裂解物作用的人類CD16陽性自然殺手細胞有相似的細胞存活率。

圖12C顯示，在不包含人類血小板裂解物(但包含5.0%的人類血清)、包含2.5%人類血小板裂解物、包含5.0%人類血小板裂解物、和包含10.0%人類血小板裂解物的細胞培養基中培養7天後，CD16陽性細胞的百分比分別維持在83.55%、84.15%、82.81%、和83.95%。在不包含人類血小板裂解物(但包含5.0%的人類血清)、包含2.5%人類血小板裂解物、包含5.0%人類血小板裂解物、和包含10.0%人類血小板裂解物的細胞培養基中培養14天後，CD16陽性細胞的百分比分別維持在80.72%、80.74%、78.07%、和80.76%。因此，此結果顯示：2.5%~10.0%的人類血小板裂解物跟沒有人類血小板裂解物(包含5.0%的人類血清)維持相似的CD16陽性細胞群。

此外，根據此結果，申請人相信將人類CD16陽性自然殺手細胞系從經9天培養的oNK懸浮液(經培養的oNK)中分離出來後，可觀察到相似的結果。

實施例十二：用不同濃度的介白素-2(IL-2)培養非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系。

本實施例的實驗方法和實施例2.1的方法大致相同，除了(1)在步驟S22’中，本實施例係培養「利用公開在實施例2.1中的培養方法培養9天後所取得的細胞懸浮液(稱為9天培養的oNK懸浮液)中的所有細胞」，且在步驟S22’中第一容器內的細胞數為5×10⁶；以及(2)細胞培養基包含5.0%的人類血小板裂解物和①100IU/mL的介白素-2(IL-2)、②200IU/mL的介白素-2(IL-2)、③500IU/mL的介白素-2(IL-2)、④750IU/mL的介白素-2(IL-2)、或⑤1000IU/mL的介白素-2(IL-2)。

請注意擴增人類CD16陽性自然殺手細胞同時需要介白素-2(IL-2)和人類血小板裂解物。本實施例中，1.8×10⁷IU/mL的介白素(IL-2)等同於1.1mg/mL的介白素(IL-2)。因此，

100IU/mL的介白素(IL-2)等同於0.0612μg/mL的介白素(IL-2)；

200IU/mL的介白素(IL-2)等同於0.1224μg/mL的介白素(IL-2)；

500IU/mL的介白素(IL-2)等同於0.306μg/mL的介白素(IL-2)；

750IU/mL的介白素(IL-2)等同於0.459μg/mL的介白素(IL-2)；以及

1000IU/mL的介白素(IL-2)等同於0.612μg/mL的介白素(IL-2)。

請參照圖13A~13F。圖13A~13F為介白素-2(IL-2)對人類CD16陽性自然殺手細胞系經過不同培養天數後的總細胞數、細胞存活率、或維持CD16表達量各自的影響之折線圖。

圖13A~13B顯示介白素-2(IL-2)的量不影響非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞的擴增。請注意在第7天時細胞係被重新接種然後繼續擴增到第11天；該擴增流程每11天重複一次。

圖13C~13D顯示介白素-2(IL-2)的量不影響非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞的細胞存活率。

圖13E~13F顯示在包含100~200IU/mL介白素-2(IL-2)的細胞培養基中培養40天後，CD16陽性細胞的百分比下降至小於20%。反之，在包含500~1000IU/mL介白素-2(IL-2)的細胞培養基中培養40天後，CD16陽性細胞的百分比增加到80%。亦即，500~1000IU/mL的介白素-2(IL-2)造成一無法預期的結果，且500~1000IU/mL的介白素-2(IL-2)使CD16陽性細胞群大量地維持。

實施例十三：在不同的容器中培養非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞系。

本實施例的實驗方法和實施例2.1的方法大致相同，除了(1)在步驟S22’中，本實施例係培養「利用公開在實施例2.1中的培養方法培養9天後所取得的細胞懸浮液(稱為9天培養的oNK懸浮液)中的所有細胞」，且在步驟S22’中第一容器內的細胞數為5×10⁶；(2)細胞培養基包含500IU/mL的介白素-2(IL-2)和5.0%的人類血小板裂解物；以及(3)本實施例中使用的容器為①透氣容器例如高速細胞培養擴增系統(G-Rex)六孔培養盤或②不透氣容器例如T25細胞培養瓶。

請參照圖14A~14C。圖14A~14C為透氣容器對人類CD16陽性自然殺手細胞經過不同培養天數後對，總細胞數、細胞存活率、或維持CD16表達量各自的影響之折線圖。

圖14A顯示在培養14天後，培養在不透氣容器和透氣容器中的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞數分別為3.1×10⁸和1.01×10⁹。因此，此結果顯示：當與培養在不透氣的容器中的細胞相比，透氣容器可以造成3.26倍的增加量(10.1÷3.1=3.26)。亦即，透氣容器造成了一無法預期的結果，透氣容器使非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞大量地擴增。

圖14B顯示經培養7天後，培養在不透氣容器和透氣容器中的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞的細胞存活率分別維持在87%和92%。經培養14天後，培養在不透氣容器和透氣容器中的非基因轉殖的人類CD16陽性自然殺手細胞的細胞存活率分別維持在88%和92%。因此，此結果顯示：對比於培養在不透氣容器中的人類CD16陽性自然殺手細胞，培養在透氣容器中的人類CD16陽性自然殺手細胞的細胞存活率較佳。

圖14C顯示在不透氣容器和透氣容器中培養7天後，CD16陽性細胞的百分比分別維持在82.63%和82.81%。在不透氣容器和透氣容器中培養14天後，CD16陽性細胞的百分比分別維持在83.79%和88.07%。因此，此結果顯示：透氣容器跟不透氣容器維持相似量的CD16陽性細胞群。

實施例十四：製備外因性靶向單元複合的oNK細胞(exogenous targeting unit complexed-oNK cells)

本實施例中，申請人製備了一種至少複合(complexed)了一外因性靶向單元(exogenous targeting unit)的外因性靶向單元複合的oNK細胞。所述外因性靶向單元包含與一目標細胞上的一生物標記呈現專一性結合的一靶向部分(targeting moiety)，該靶向部分能與一生物標記(biological marker)結合，且該生物標記選自癌症抗原、醣脂、醣蛋白、呈現於一造血群系細胞上的分化抗原叢、γ-麩胺醯基轉胜肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白、荷爾蒙、生長因子、細胞激素、配體的受體、離子通道、膜結合形式的一免疫球蛋白μ鏈、甲型胎兒蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反應蛋白、嗜鉻血液細胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人類上皮細胞特異抗原、路易士(a)(Lewis(a))抗原、多重抗藥性相關蛋白、Neu致癌基因蛋白、神經元特異性烯醇酶(enolase)、P型醣蛋白、多重抗藥性相關抗原、p170、多重抗藥性相關抗原、前列腺特異性抗原、神經细胞黏附分子(NCAM)、神經節苷脂分子、MART-1、熱休克蛋白、唾液酸多醣(sialylTn)、酪胺酸酶、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成長因子受體(EGF-R)、血管內皮生長因子(VEGF)、或黑色素瘤相關抗原(MAGE)。該靶向部分不是一氨基酸，也不是由該外因性靶向單元複合的oNK細胞產生。

使一靶向部分(例如HER2蛋白的抗體賀癌平(Trastuzumab))與oNK細胞結合(bind)的方法如下：

(B)製備靶向部分鏈接器(targeting moiety linker)(例如賀癌平(Trastuzumab)鏈接器)並使靶向部分鏈接器與靶向部分結合，以製備單鏈DNA共軛的靶向部分(moiety-ssDNA conjugate)的步驟；

(C)混合單鏈DNA共軛的NK細胞和單鏈DNA共軛的靶向部分，使單鏈DNA共軛的NK細胞和單鏈DNA共軛的靶向部分透過細胞鏈接器與其位於靶向部分鏈接器上的互補序列相結合，以製備外因性靶向單元共軛的自然殺手細胞(exogenous targeting unit complexed-conjugated natural killer cells)(例如ACE-oNK細胞或ACE-yNK細胞)。

其中步驟(A)的製備細胞鏈接器並使細胞鏈接器與自然殺手細胞結合，包含以下步驟(a1)~(a4)：

步驟(a2)第一單鏈DNA的5’端被改造成5’端為硫醇基的第一單鏈DNA(5’ end thiol-modified first single strand DNA)，以獲得細胞鏈接器貯備物(cell linker stock)，該細胞鏈接器貯備物也可從Integrated DNA Technologies商業上取得。對本領域技術人員而言，實際的改造方法是已知或顯而易見的(Zimmermann,J,2010)。

步驟(B)的製備靶向部分鏈接器並使靶向部分鏈接器與靶向部分結合，包含以下步驟(b1)~(b4)：

步驟(b2)第二單鏈DNA的5’端被改造成5’端為硫醇基的第二單鏈DNA(5’ end thiol-modified second single strand DNA)，以獲得靶向部分鏈接器貯備物(targeting moiety linker stock)。該靶向部分鏈接器貯備物也可從Integrated DNA Technologies商業上取得。對本領域技術人員而言，實際的改造方法是已知或顯而易見的(Zimmermann,J,2010)。

步驟(b3)將10~500μL的靶向部分鏈接器貯備物和0.1~10μL的N-羥基琥珀醯亞胺-順丁烯二醯亞胺(NHS-Maleimide)(可從Fisher Scientific商業上取得)混合並反應1~60分鐘。

步驟(b4)將從步驟(b3)取得的混合物與10~100μL的靶向部分貯備物(targeting moiety stock)(可從Roche商業上取得)混合並反應10分鐘到3小時，以取得單鏈DNA共軛的靶向部分。

該靶向部分可以為一胜肽、蛋白質、或核酸適體(aptamer)，其中所述蛋白質可為一種抗一癌症抗原的抗體，且該癌症抗原選自HER2/neu(ERBB2)、人類表皮生長因子受體3(HER3)(ERBB3)、上皮成長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、GD2、細胞毒性T細胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮細胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白16(MUC16))、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(計畫性死亡-配體1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(間皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、CD3、巨噬細胞移行抑制因子(MIF)、葉酸受體α(Folate receptor alpha，FOLR1)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、運鐵蛋白受體(TfR)、黏蛋白1(MUC1)、CD25(介白素-2受體(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受體(CSF1R))、介白素1B(IL1B)、CD105(內皮糖蛋白(Endoglin))、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、介白素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生長素2(angiopoietin2)、神經纖毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴細胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(腫瘤壞死因子受體超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密連蛋白1(Claudin1)(CLDN1)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相關細胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纖維母細胞生長因子受體3(FGFR3)、一種殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIRs)、一種腫瘤壞死因子(TNF)受體蛋白、一種免疫球蛋白、一種細胞激素受體、一種整合素 (integrin)、激活自然殺手細胞的受體(activating NK cell receptors)、及其組合。

實施例十五：製備表達嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CAR)的oNK細胞

本實施例公開了製備包含一合成的、基因改造的且/或特意遞送的編碼一嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor；CAR)的多核苷酸之oNK細胞的方法，該嵌合抗原受體包含一抗靶向抗原的靶向結合單鏈可變片段(scFv)(target-binding single-chain variable fragment against target antigen)，其中所述嵌合抗原受體選自CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8a、CD8、CD11a(整合素αL(ITGAL))、CD11b(整合素αM(ITGAM))、CD11c(整合素αX(ITGAX))、CD11d(整合素αD(ITGAD))、CD18(整合素β2(ITGB2))、CD19(B4)、CD27(腫瘤壞死因子受體超家族7(TNFRSF7))、CD28、CD29(整合素β1(ITGB1))、CD30(腫瘤壞死因子受體超家族8(TNFRSF8))、CD40(腫瘤壞死因子受體超家族5(TNFRSF5))、CD48(信號淋巴細胞激活分子家族成員2(SLAMF2))、CD49a(整合素α1(ITGA1))、CD49d(整合素α4(ITGA4))、CD49f(整合素α6(ITGA6))、CD66a(癌胚抗原相關細胞黏附分子1(CEACAM1))、CD66b(癌胚抗原相關細胞黏附分子8(CEACAM8))、CD66c(癌胚抗原相關細胞黏附分子6(CEACAM6))、CD66d(癌胚抗原相關細胞黏附分子3(CEACAM3))、CD66e(癌胚抗原相關細胞黏附分子5(CEACAM5))、CD69(C型凝集素結構域家族2(CLEC2))、CD79A(B細胞抗原受體複合物相關α鏈(B-cell antigen receptor complex-associated alpha chain))、CD79B(B細胞抗原受體複合物相關β鏈 (B-cell antigen receptor complex-associated beta chain))、CD84(信號淋巴細胞激活分子家族成員5(SLAMF5))、CD96(Tactile)、CD100(腦信號蛋白4D(SEMA4D))、CD103(整合素αE(ITGAE))、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(信號淋巴細胞激活分子家族成員1(SLAMF1))、CD158A(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL1(KIR2DL1))、CD158B1(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL2(KIR2DL2))、CD158B2(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL3(KIR2DL3))、CD158C(殺手細胞免疫球蛋白樣受體3DP1(KIR3DP1))、CD158D(殺手細胞免疫球蛋白樣受體DL4(KIRDL4))、CD158F1(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL5A(KIR2DL5A))、CD158F2(殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DL5B(KIR2DL5B))、CD158K(殺手細胞免疫球蛋白樣受體3DL2(KIR3DL2))、CD160(BY55)、CD162(P選擇素醣蛋白配體(SELPLG))、CD226(DNAX輔助分子1(DNAM1))、CD229(信號淋巴細胞激活分子家族成員3(SLAMF3))、CD244(信號淋巴細胞激活分子家族成員4(SLAMF4))、CD247(CD3-ξ)、CD258(LIGHT)、CD268(B細胞活化因子受體(BAFFR))、CD270(腫瘤壞死因子受體超家族14(TNFSF14))、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(計畫性死亡-1(PD-1))、CD314(NKG2D)、CD319(信號淋巴細胞激活分子家族成員7(SLAMF7))、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(信號淋巴細胞激活分子家族成員6(SLAMF6))、CD353(信號淋巴細胞激活分子家族成員8(SLAMF8))、CD355(細胞毒性及調節T細胞分子(CRTAM))、CD357(腫瘤壞死因子受體超家族18(TNFRSF18))、可誘導T細胞共刺激分子(ICOS)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、 NKp80(殺手細胞凝集素樣受體基因家族成員1(KLRF1))、介白素-2R β(IL-2R beta)、介白素-2R γ(IL-2R gamma)、介白素-7R α(IL-7R alpha)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、信號淋巴細胞激活分子家族成員9(SLAMF9)、T細胞活化銜接因子(LAT)、GADS(GrpL)、SLP-76(淋巴細胞胞漿蛋白2(LCP2))、PAG1/CBP、一CD83配體、Fcγ受體、MHC1類分子(MHC class 1 molecule)、MHC2類分子(MHC class 2 molecule)、一種腫瘤壞死因子(TNF)受體蛋白、一種免疫球蛋白、一種細胞激素受體、一種整合素、活化自然殺手細胞受體(activating NK cell receptors)、一種類鐸受體(Toll-like receptor)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、B細胞成熟抗原(BCMA)、計畫性死亡-配體1(PD-L1)、及其組合。

下面以CD19為例來解釋製備包含一合成的、基因改造的、且/或特意遞送的編碼一嵌合抗原受體(CAR)的多核苷酸之oNK的方法，該嵌合抗原受體包含一抗CD19的靶向結合單鏈可變片段(scFv)。收集oNK細胞，用6μM的5Z-7-Oxozeaenol(TAK1抑制劑)處理30分鐘。將5Z-7-Oxozeaenol處理過的細胞用Trasdux(轉導促進劑)處理後，用慢病毒顆粒(lentivirus particle)感染細胞，病毒感染劑量為9(at m.o.i.of 9)，其中該慢病毒顆粒是帶有CD19單鏈可變片段(scFv)嵌合抗原受體(CAR)的建構物的CD810A-1載體(CD810A-1 vector)所製成的。用1000 xg的轉速將細胞離心70分鐘後，在37℃條件下反應4小時。將細胞以200 xg轉速再次離心5分鐘，移除上清液。將感染過的細胞用新鮮的生長培養基(fresh growth media)重新懸浮後，在37℃條件下於高速細胞培養擴增系統(G-Rex)細胞盤中培養。

將細胞以400 xg轉速離心5分鐘，並用MACS緩衝液清洗以濃縮表達嵌合抗原受體(CAR)的細胞群。接著將細胞用Myc-Ab-APC抗體和碘化丙啶或4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。用Dulbecco氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(DPBS)清洗後，以細胞分選儀分選出APC陽性碘化丙啶或4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)陰性(APC⁺DAPI^-)的細胞，然後在新鮮的生長培養基和高速細胞培養擴增系統(G-Rex)中擴增細胞。

本發明的實施例顯示，利用本發明的方法所取得的非基因轉殖的CD16陽性人類自然殺手細胞系、本發明的外因性靶向單元複合自然殺手細胞、和本發明的嵌合抗原受體(CAR)表達oNK細胞都確實可以透過類似抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用殺死目標細胞(例如癌細胞)。因此，利用本發明的培養方法所取得的非基因轉殖的CD16陽性人類自然殺手細胞系的應用範圍包含但不僅限於癌症治療、自體免疫疾病治療、神經疾病治療、消滅人類免疫不全病毒(HIV)、造血細胞相關疾病治療、代謝症候群治療、病原性疾病治療、病毒感染治療、和細菌感染治療。

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以上所述僅為本發明之較佳實施例，並非用以限定本發明之申請專利範圍，因此凡其它未脫離本發明所揭示之精神下所完成之各種更動或潤飾等，均應包含於本案之申請專利範圍內。

【生物材料寄存】

日本、獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(NPMD)、2019年09月02日、NITE BP-03017。

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<210> 38

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 38

<210> 39

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 39

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<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> synthetic

<400> 40

Claims

一種人類自然殺手細胞，其為

(A)寄存在NPMD且具有寄存編號NITE BP-03017；或

(B)具有以下特徵：

i)表達一CD16受體；

ii)在經過至少三個月的繼代培養後仍保持其增殖的能力；以及

iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意遞送(deliberately delivered)的編碼CD16受體的多核苷酸，或

y)通過使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)分析細胞的基因組去氧核醣核酸(genomic DNA)，能被CD16 F176F探針檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)與能被CD16 F176V探針檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)的比例等於或大於1，其中CD16 F176F探針的序列為SEQ ID NO：11，且CD16 F176V探針的序列為SEQ ID NO：12。
如申請專利範圍第1項所述之細胞，其中所述CD16受體是一CD16a受體或一CD16b受體。
如申請專利範圍第1項所述之細胞，其中一被表達的編碼CD16受體的多核苷酸位於一號染色體q臂的第1q23.3位點。
如申請專利範圍第1項所述之細胞，該細胞對一免疫力不全的小鼠不具致癌性(non-tumorigenic)。
如申請專利範圍第1項所述之細胞，在經過γ射線照射過後，該細胞對一同種異體的個體不具致癌性(non-tumorigenic)。
如申請專利範圍第1項所述之細胞，其中一編碼CD16受體的多核苷酸包含一SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：19核苷酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之細胞，其中CD16受體包含一SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：20胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之細胞，該細胞更包含一失活的腫瘤抑制基因(inactive tumor suppressor gene)或一經突變且高度表達的致癌基因(highly expressed oncogene)。
如申請專利範圍第1項所述之細胞，其中該細胞能媒介一抗體依賴性細胞介導的細胞毒性反應，且該細胞為一雄性細胞。
如申請專利範圍第1項所述之細胞，其中該細胞更包含至少一複合於該細胞上的外因性靶向單元(exogenous targeting unit)，其中外因性靶向單元包含一靶向部分(targeting moiety)，該靶向部分的特徵在於：

(a)它對一目標細胞上的一生物標記展現專一性連結(binding)；

(b)它不是一種核酸(nucleic acid)；以及

(c)它不是由該細胞產生。
如申請專利範圍第10項所述之細胞，其中外因性靶向單元是透過共軛(conjugated)於該靶向部分的一第一鏈接器(first linker)和共軛於該細胞的一第二鏈接器(second linker)之間的一種作用力(interaction)，複合於該細胞。
如申請專利範圍第11項所述之細胞，其中第一鏈接器是一第一多核苷酸，或第二鏈接器是一第二多核苷酸。
如申請專利範圍第10項所述之細胞，其中靶向部分包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)。
如申請專利範圍第12項所述之細胞，其中第一多核苷酸包含一段單股區域(single-stranded region)。
如申請專利範圍第11項所述之細胞，其中該第一鏈接器是一第一多核苷酸，且該第二鏈接器是一第二多核苷酸。
如申請專利範圍第11項所述之細胞，其中該第一鏈接器和該第二鏈接器選自下列組群：一DNA結合結構域(DNA binding domain)和一目標DNA、一白胺酸拉鍊型構型(leucine zipper)和一目標DNA、生物素(biotin)和抗生物素蛋白(avidin)、生物素和鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)、攜鈣素結合蛋白(calmodulin binding protein)和攜鈣素(calmodulin)、一荷爾蒙和一荷爾蒙受體、凝集素(lectin)和一種碳水化合物(carbohydrate)、一細胞膜受體和一受體配體(receptor ligand)、一酵素和一受質(substrate)、一抗原和一抗體、一促效劑(agonist)和一拮抗劑(antagonist)、複數個能雜交的多核苷酸序列分子(polynucleotide hybridizing sequences)、一核酸適體(aptamer)和一目標分子、一鋅指蛋白(zinc finger)和一目標DNA。
如申請專利範圍第11項所述之細胞，其中第一鏈接器包含一第一反應基團(first reactive group)，且第二鏈接器包含一第二反應基團(second reactive group)，且其中該細胞藉由第二反應基團和第一反應基團間的一種反應(reaction)所形成的一共價鍵(covalent bond)複合於(complexed to)該靶向部分(targeting moiety)。
如申請專利範圍第15項所述之細胞，其中該靶向部分包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)。
如申請專利範圍第11項所述之細胞，其中該第二鏈接器包含一聚乙二醇區域(PEG region)。
如申請專利範圍第10項所述之細胞，其中該靶向部分和該細胞間的間隔長度為1nm到400nm。
如申請專利範圍第10項所述之細胞，其中該外因性靶向單元(exogenous targeting unit)包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)，該抗原結合單元能與癌症抗原(cancer antigen)、醣脂(glycolipid)、醣蛋白(glycoprotein)、呈現於一造血群系細胞上的分化抗原叢(cluster of differentiation antigen present on cells of a hematopoietic lineage)、γ-麩胺醯基轉胜肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白(adhesion protein)、荷爾蒙、生長因子(growth factor)、細胞激素、配體受體(ligand receptor)、離子通道、膜結合形式的一免疫球蛋白μ鏈(membrane-bound form of an immunoglobulin μ.chain)、甲型胎兒蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反應蛋白(C-reactive protein)、嗜鉻血液細胞分泌素A(chromogranin A)、上皮黏蛋白抗原(epithelial mucin antigen)、人類上皮細胞特異抗原(human epithelium specific antigen)、路易士(a)(Lewis(a))抗原、多重抗藥性相關蛋白(multidrug resistance related protein)、Neu致癌基因蛋白(Neu oncogene protein)、神經元特異性烯醇酶(neuron specific enolase)、P型醣蛋白、多重抗藥性相關抗原、p170、多重抗藥性相關抗原、前列腺特異性抗原(prostate specific antigen)、神經细胞黏附分子(NCAM)、神經節苷脂分子(ganglioside molecule)、MART-1、熱休克蛋白(heat shock protein)、唾液酸多醣(sialylTn)、酪胺酸酶(tyrosinase)、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成長因子受體(EGF-R)、血管內皮生長因子(VEGF)、或黑色素瘤相關抗原(MAGE)結合。
如申請專利範圍第21項所述之細胞，其中抗原結合單元(antigen-binding unit)是一種抗癌症抗原的抗體，且該癌症抗原選自HER2/neu(ERBB2)、人類表皮生長因子受體3(HER3)(ERBB3)、上皮成長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、GD2、細胞毒性T細胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮細胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白 16(MUC16))、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(計畫性死亡-配體1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(間皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)、CD3、巨噬細胞移行抑制因子(MIF)、葉酸受體α(folate receptor alpha；FOLR1)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、運鐵蛋白受體(TfR)、黏蛋白1(MUC1)、CD25(介白素-2受體(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受體(CSF1R))、介白素1B(IL1B)、CD105(內皮糖蛋白(Endoglin))、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、介白素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生長素2(angiopoietin 2)、神經纖毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴細胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(腫瘤壞死因子受體超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密連蛋白1(Claudin1)(CLDN1)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相關細胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纖維母細胞生長因子受體3(FGFR3)、一種殺手細胞免疫球蛋白樣受體(a killer-cell immunoglobulin-like receptors；KIRs)、一種腫瘤壞死因子(TNF)受體蛋白(a TNF receptor protein)、一種免疫球蛋白、一種細胞激素受體(cytokine receptor)、一種整合素(integrin)、激活自然殺手細胞的受體(activating NK cell receptors)及其組合。
如申請專利範圍第12項所述之細胞，其中靶向部分是藉由一耦合基團(coupling group)共軛於(conjugated to)該第一多核苷酸，其中所述耦合基團為一NHS酯(NHS ester)、其他活化後的酯(ester)、一烷基或醯基鹵(alkyl or acyl halide)、一雙功能化的交聯劑(bifunctional crosslinker)或順丁烯二醯亞胺基團(maleimide group)。
如申請專利範圍第12項所述之細胞，其中第一多核苷酸或第二多核苷酸包含一從下列所選出的序列：20個核苷酸單元的多聚CA(20-mer poly-CA)、20個核苷酸的多聚GGTT(20-mer poly-GGTT)、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、23個核苷酸單元的序列SEQ ID NO：7(23-mer SEQ ID NO：7)、和SEQ ID NO：10。
如申請專利範圍第10項所述之細胞，該靶向部分對該生物標記(biological marker)的結合親和力(binding affinity)小於250nM。
如申請專利範圍第12項所述之細胞，該第一多核苷酸的長度或該第二多核苷酸的長度為4nt到500nt。
如申請專利範圍第11項所述之細胞，第一鏈接器和第二鏈接器的結合親和力小於250nM。
如申請專利範圍第11項所述之細胞，該第一鏈接器或該第二鏈接器共軛(conjugated)在該靶向單元的一原生功能基團(native functional group)或該細胞的一表面上，其中該原生功能基團為一胺基酸、一糖基(sugar)、或一胺基(amine)。
如申請專利範圍第10項所述之細胞，靶向部分為一胜肽、蛋白質、或核酸適體(aptamer)。
一種實質上富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物，其中，該組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞的數量至少為5×10⁵個，且基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於5%；該人類CD16陽性自然殺手細胞是

(A)寄存在NPMD且具有寄存編號NITE BP-03017；或

(B)具有以下特徵：

i)表達一CD16受體，

ii)在經過至少三個月的繼代培養後仍保持其增殖的能力；以及

iii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意遞送(deliberately delivered)的編碼CD16受體的多核苷酸，或

y)通過使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)分析細胞的基因組去氧核醣核酸(genomic DNA)，能被CD16 F176F探針檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)與能被CD16 F176V探針檢測到的去氧核醣核酸分子的比例等於或大於1，其中CD16 F176F探針的序列為SEQ ID NO：11，且CD16 F176V探針的序列為SEQ ID NO：12。
如申請專利範圍第30項所述之組成物，其中該CD16受體是一CD16a受體或一CD16b受體。
如申請專利範圍第30項所述之組成物，其中一編碼CD16受體的多核苷酸位於一號染色體q臂的第1q23.3位點。
如申請專利範圍第30項所述之組成物，其中所述人類CD16陽性自然殺手細胞對一免疫力不全的小鼠不具致癌性。
如申請專利範圍第30項所述之組成物，其中在經過γ射線照射過後，所述人類CD16陽性自然殺手細胞對一同種異體的個體沒有致癌性。
如申請專利範圍第30項所述之組成物，其中一編碼CD16受體的多核苷酸包含一SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：19核苷酸序列。
如申請專利範圍第30項所述之組成物，其中CD16受體包含一SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：20胺基酸序列。
如申請專利範圍第30項所述之組成物，其中該人類CD16陽性自然殺手細胞更包含一失活的腫瘤抑制基因(inactive tumor suppressor gene)或一經突變且高度表達的致癌基因(oncogene)。
如申請專利範圍第30項所述之組成物，其中人類CD16陽性自然殺手細胞能媒介一抗體依賴性細胞介導的細胞毒性反應(ADCC)，且該細胞為一雄性細胞(male cell)。
如申請專利範圍第30項所述之組成物，其中人類CD16陽性自然殺手細胞更包含至少一複合於(complexed to)該人類CD16陽性自然殺手細胞的外因性靶向單元(exogenous targeting unit)，其中該外因性靶向單元包含一靶向部分(targeting moiety)，該靶向部分的特徵在於：

(a)它對一目標細胞上的一生物標記(biological marker)展現專一性連結(binding)；

(b)它不是一種核酸(nucleic acid)；以及

(c)它不是由該人類CD16陽性自然殺手細胞產生。
如申請專利範圍第39項所述之組成物，其中外因性靶向單元是透過共軛(conjugated)於靶向部分的一第一鏈接器(first linker)和共軛於該人類CD16陽性自然殺手細胞的一第二鏈接器(second linker)之間的一種作用力(interaction)，複合於該人類CD16陽性自然殺手細胞。
如申請專利範圍第40項所述之組成物，其中第一鏈接器是一第一多核苷酸，或第二鏈接器是一第二多核苷酸。
如申請專利範圍第39項所述之組成物，其中該靶向部分包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)。
如申請專利範圍第41項所述之組成物，其中第一多核苷酸包含一段單股區域(single-stranded region)。
如申請專利範圍第40項所述之組成物，其中該第一鏈接器是一第一多核苷酸，且該第二鏈接器是一第二多核苷酸。
如申請專利範圍第40項所述之組成物，其中該第一鏈接器和該第二鏈接器係選自下列群組：一DNA結合結構域(DNA binding domain)和一目標DNA、一白胺酸拉鍊型構型(leucine zipper)和一目標DNA、生物素(biotin)和抗生物素蛋白(avidin)、生物素和鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)、攜鈣素結合蛋白(calmodulin binding protein)和攜鈣素(calmodulin)、一荷爾蒙和一荷爾蒙受體、凝集素(lectin)和一種碳水化合物(carbohydrate)、一細胞膜受體和一受體配體(receptor ligand)、一酵素和一受質(substrate)、一抗原和一抗體、一促效劑(agonist)和一拮抗劑(antagonist)、複數個能雜交的多核苷酸序列分子(polynucleotide hybridizing sequences)、一核酸適體(aptamer)及一目標分子、一鋅指蛋白(zinc finger)和一目標DNA。
如申請專利範圍第40項所述之組成物，其中第一鏈接器包含一第一反應基團(first reactive group)，而第二鏈接器包含一第二反應基團(second reactive group)，且其中人類CD16陽性自然殺手細胞，藉由第二反應基團和第一反應基團間的一種反應(reaction)所形成的一共價鍵(covalent bond)複合於(complexed to)該靶向部分(targeting moiety)。
如申請專利範圍第44項所述之組成物，其中靶向部分包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)。
如申請專利範圍第40項所述之組成物，其中該第二鏈接器包含一聚乙二醇(PEG)區域。
如申請專利範圍第39項所述之組成物，其中該靶向部分和該人類CD16陽性自然殺手細胞間的間隔長度為1nm到400nm。
如申請專利範圍第39項所述之組成物，其中外因性靶向單元包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)，該抗原結合單元能與癌症抗原、醣脂、醣蛋白、呈現於一造血群系細胞上的分化抗原叢、γ-麩胺醯基轉胜肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白、荷爾蒙、生長因子、細胞激素、配體受體、離子通道、膜結合形式的一免疫球蛋白μ鏈、甲型胎兒蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反應蛋白、嗜鉻血液細胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人類上皮細胞特異抗原、路易士(a)(Lewis(a))抗原、多重抗藥性相關蛋白、Neu致癌基因蛋白、神經元特異性烯醇酶(enolase)、P型醣蛋白、多重抗藥性相關抗原、p170、前列腺特異性抗原、神經細胞黏附分子(NCAM)、神經節苷脂分子、MART-1、熱休克蛋白、唾液酸多醣(sialylTn)、酪胺酸酶、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成長因子受體(EGF-R)、血管內皮生長因子(VEGF)、或黑色素瘤相關抗原(MAGE)結合。
如申請專利範圍第50項所述之組成物，其中該抗原結合單元是一種抗癌症抗原的抗體，且該癌症抗原選自HER2/neu(ERBB2)、人類表皮生長因子受體3(HER3)(ERBB3)、上皮成長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、GD2、細胞毒性T細胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮細胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白16(MUC16))、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(計畫性死亡-配體1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(間皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、CD3、巨噬細胞移行抑制因子(MIF)、葉酸受體α(folate receptor alpha；FOLR1)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、運鐵蛋白受體(TfR)、黏蛋白 1(MUC1)、CD25(介白素-2受體(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受體(CSF1R))、介白素1B(IL1B)、CD105(內皮糖蛋白(Endoglin))、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、介白素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生長素2(angiopoietin 2)、神經纖毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴細胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(腫瘤壞死因子受體超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密連蛋白1(Claudin1)(CLDN1)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相關細胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纖維母細胞生長因子受體3(FGFR3)、一種殺手細胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptors；KIRs)、一種腫瘤壞死因子(TNF)受體蛋白(TNF receptor protein)、一種免疫球蛋白、一種細胞激素受體、一種整合素(integrin)、激活自然殺手細胞的受體(activating NK cell receptors)及其組合。
如申請專利範圍第41項所述之組成物，其中該靶向部分是藉由一耦合基團(coupling group)共軛於(conjugated to)該第一多核苷酸，所述耦合基團為一NHS酯(NHS ester)、其他活化後的酯(ester)、一烷基或醯基鹵(alkyl or acyl halide)、一雙功能化的交聯劑(bifunctional crosslinker)或順丁烯二醯亞胺基團(maleimide group)。
如申請專利範圍第41項所述之組成物，其中第一多核苷酸或第二多核苷酸的序列包含一由下列選出的序列：20個核苷酸單元的多聚CA(20-mer poly-CA)、20個核苷酸的多聚GGTT(20-mer poly-GGTT)、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO： 25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、23個核苷酸單元的序列SEQ ID NO：7、和SEQ ID NO：10。
如申請專利範圍第39項所述之組成物，該靶向部分對該生物標記(biological marker)的結合親和力(binding affinity)小於250nM。
如申請專利範圍第41項所述之組成物，該第一多核苷酸的長度或該第二多核苷酸的長度為4nt~500nt。
如申請專利範圍第40項所述之組成物，該第一鏈接器(first linker)和該第二鏈接器(second linker)的結合親和力(binding affinity)小於250nM。
如申請專利範圍第40項所述之組成物，該第一鏈接器或該第二鏈接器共軛(conjugated)在靶向單元的一原生功能基團(native functional group)或人類CD16陽性自然殺手細胞的一表面上，其中該原生功能基團為一胺基酸、一糖基(sugar)或一胺基(amine)。
如申請專利範圍第39項所述之組成物，靶向部分為一胜肽、蛋白質、或核酸適體(aptamer)。
一種取得一實質富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物的方法；該方法包含：

(a)取得一群寄存編號為ATCC CRL-2047的人類周邊血液自然殺手細胞；

(b)將該群人類周邊血液自然殺手細胞與一種對一CD16受體具專一性的抗體接觸；以及

(c)將被抗體專一性地結合的細胞分離，從而取得該實質富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物；

其中所述人類CD16陽性自然殺手細胞為：

(A)寄存在NPMD且具有寄存編號NITE BP-03017；或

(B)具有以下特徵：

i)表達一CD16受體；以及

ii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意遞送(deliberately delivered)的編碼CD16受體的多核苷酸，或

y)通過使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)分析細胞的基因組去氧核醣核酸(genomic DNA)，能被CD16 F176F探針檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)與能被CD16 F176V探針檢測到的去氧核醣核酸分子(DNAmolecule)的比例等於或大於1，其中CD16 F176F探針的序列為SEQ ID NO：11，且CD16 F176V探針的序列為SEQ ID NO：12。
如申請專利範圍第59項所述之方法，其中步驟(c)包含下列子步驟：

(c1)將被抗體專一性地結合的細胞分離出來；

(c2)在一容器中，讓被抗體專一性地結合的細胞與一含有人類血小板裂解物(human platelet lysate)和介白素-2(IL-2)的培養基接觸；

(c3)培養細胞複數日，從而取得該實質富含人類CD16陽性自然殺手細胞的組成物。
如申請專利範圍第60項所述之方法，其中該容器包含一可透氣(air-permeable)且不透水(water-impermeable)的用於接種細胞的底面(bottom)。
如申請專利範圍第60項所述之方法，其中溶於培養基中的葡萄糖的濃度為1500~5000mg/L。
如申請專利範圍第60項所述之方法，該組成物中的人類CD16陽性自然殺手細胞的數量至少為5×10⁵個，且基於組成物中總細胞數為100%時，人類CD16陽性自然殺手細胞的數量為等於或大於5%。
一種培養和擴增人類CD16陽性自然殺手細胞的方法；該方法包含：

(x)在一容器中，讓人類CD16陽性自然殺手細胞和一包含0.5~10vol%的人類血小板裂解物(human platelet lysate)和100~3000IU/mL的介白素-2(IL-2)的培養基接觸；

(y)培養細胞複數日。
如申請專利範圍第64項所述之方法，其中該容器包含一可透氣(air-permeable)且不透水(water-impermeable)的用於接種細胞的底面(bottom)。
如申請專利範圍第64項所述之方法，其中步驟(y)包含下列子步驟：

(y1)培養細胞至少一天；以及

(y2)繼代培養細胞至少一個月。
如申請專利範圍第64項所述之方法，其中人類CD16陽性自然殺手細胞在經過至少三個月的繼代培養後仍能保持其增殖的能力。
如申請專利範圍第64項所述之方法，其中人類CD16陽性自然殺手細胞為：

(A)寄存在NPMD且具有寄存編號NITE BP-03017；或

(B)具有以下特徵：

i)表達一CD16受體；以及

ii)x)不包含合成的、基因改造的且/或被特意遞送(deliberately delivered)的編碼CD16受體的多核苷酸，或

y)通過使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)分析細胞的基因組去氧核醣核酸，能被CD16 F176F探針檢測到的去氧核醣核酸分子與能被CD16 F176V探針檢測到的去氧核醣核酸分子的比例等於或大於1，其中CD16 F176F探針的序列為SEQ ID NO：11，且CD16 F176V探針的序列為SEQ ID NO：12。
一種治療癌症、自體免疫疾病、神經疾病、人類免疫不全病毒(HIV)感染、造血細胞相關疾病、代謝症候群、病原性疾病、病毒感染、或細菌感染的方法，包含將含有一有效劑量的如申請專利範圍第1項或申請專利範圍第10項所述之人類自然殺手細胞的一組成物施用於一有需要的個體。
如申請專利範圍第69項所述之方法，其中外因性靶向單元是透過共軛於靶向部分的一第一鏈接器，和共軛於人類自然殺手細胞的一第二鏈接器之間的一種作用力，複合於人類自然殺手細胞。
如申請專利範圍第69項所述之方法，其中該靶向部分包含一抗原結合單元(antigen-binding unit)。
如申請專利範圍第71項所述之方法，其中抗原結合單元是一種抗癌症抗原的抗體。
如申請專利範圍第69項所述之方法，其中靶向部分為一胜肽、蛋白質、或核酸適體。
如申請專利範圍第69項所述之方法，其中人類自然殺手細胞能媒介一抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應，且該人類自然殺手細胞為一雄性細胞。
如申請專利範圍第69項所述之方法，其中該方法用來治療癌症。
如申請專利範圍第1項所述之細胞，其中該細胞還具有一合成的、基因改造的、且/或被特意遞送的多核苷酸，其編碼一種抗抗原的靶向結合單鏈可變片段(scFv)。
如申請專利範圍第76項所述之細胞，其中該細胞能媒介一抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺反應。
一種治療癌症、自體免疫疾病、神經疾病、人類免疫不全病毒(HIV)感染、造血細胞相關疾病、代謝症候群、病原性疾病、病毒感染、或細菌感染的方法，包含將一種含有有一效劑量的如申請專利範圍第76項所述之人類自然殺手細胞施用於一有需要的個體。
如申請專利範圍第78項所述之方法，其中組成物中的人類自然殺手細胞數至少為5×10⁵個，且基於組成物中的總細胞數為100%時，細胞的數量為等於或大於5%。
如申請專利範圍第78項所述之方法，其中該方法是用於治療癌症。