JP2003512110A - 組織形成のための合成基材 - Google Patents

組織形成のための合成基材

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、合成軟骨をその上に成長させるための基材、基材を製造する方法、基材を含んでなる合成軟骨パッチ及び合成軟骨パッチを使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、合成軟骨をその上に成長させるための基材、基材を製造する方法、
基材を含んでなる合成軟骨パッチ及び合成軟骨パッチを使用する方法に関する。
【０００２】 発明の背景 哺乳動物の関節軟骨欠損を処置するために多数の異なる方法が開発されている
。組織工学法は、関節の限局性の損傷を受けた領域の表面を新しくすることに関
して調べられている。一つの方法は、インビトロでの軟骨形成の基材として多孔
性合成材料形態を使用する。研究により、基材材料特性は、軟骨細胞表現型及び
形成される細胞外マトリックスに影響を与え得ることが示唆されている（Ｇｒａ
ｎｄｅ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｌ Ｒｅｓ，３４：２１
１−２２０，１９９７及びＮｅｈｒｅｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒ
ｉａｌｓ，１８：７６９−７７６，１９９７）。最適な基材材料特性を特定する
ことにより、哺乳動物における関節軟骨欠損の修復における使用のための改善さ
れた基材が提供される。
【０００３】 発明の要約 本発明は、合成軟骨の成長を可能にするために７０μｍ未満、好ましくは４０
μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ましくは１５μｍ未満の平均孔
サイズを有する相互に連結されている孔を有する多孔性構造物を含んでなる合成
軟骨をその上に成長させるための基材を提供する。本発明はまた、選択した孔サ
イズを有する孔を形成することができる材料から７０μｍ未満、好ましくは４０
μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ましくは１５μｍ未満の平均孔
サイズを有する相互に連結されている孔を有する多孔性構造物を製造することを
含んでなる合成軟骨をその上に形成するかもしくは成長させるための基材を製造
する方法も提供する。一つの態様として、平均孔サイズは１０〜４０μｍの間、
好ましくは１０〜３０μｍの間、より好ましくは１０〜２０μｍの間、そして最
も好ましくは１０〜１５μｍの間である。
【０００４】 本発明はまた、（ａ）その上に合成軟骨の成長を可能にするために７０μｍ未
満、好ましくは４０μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ましくは１
５μｍ未満の平均孔サイズを有する相互に連結されている孔を有する多孔性構造
物を含んでなる合成軟骨をその上に成長させるための表面成分、及び（ｂ）基材
中への骨内方成長を可能にするように選択される孔サイズを有する多孔性構造物
を含んでなる深部成分を含んでなる基材も意図する。深部成分は、移植後の基材
中への骨内方成長を容易にするかもしくは促進する。
【０００５】 本発明はまた、本発明の基材上もしくはそれと組み合わせて形成される合成軟
骨を含んでなるインビボでの哺乳動物における軟骨欠損の修復のための合成軟骨
パッチにも関する。基材は、より大量の組織形成を可能にする。
【０００６】 本発明はまた、哺乳動物における軟骨損傷の修復のための合成軟骨パッチ、好
ましくは合成関節軟骨パッチをインビトロで製造する方法も意図する。この方法
は、（ａ）選択した孔サイズを有する孔を形成することができる材料から７０μ
ｍ未満、好ましくは４０μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ましく
は１５μｍ未満の平均孔サイズを有する相互に連結されている孔を有する多孔性
構造物を製造すること；及び（ｂ）細胞に合成軟骨の三次元多細胞層パッチを形
成させるために十分な条件下で、露出させた軟骨形成細胞を基材上で培養するこ
とを含んでなる。
【０００７】 一つの態様として、本発明は（ａ）本発明の合成軟骨パッチを前もって決定し
た部位で外科的に移植すること；及び（ｂ）パッチの合成軟骨を前もって決定し
た部位に統合させることを含んでなる哺乳動物における前もって決定した部位で
軟骨欠損の修復をもたらす方法を提供する。
【０００８】 さらに、本発明は、軟骨の形成もしくは維持に影響を及ぼすと思われる物質の
存在下で、細胞に合成軟骨の三次元多細胞層パッチを形成させる条件下で、露出
させた軟骨形成細胞を本発明の基材上で培養すること、及び培養において生じる
合成軟骨の生化学的組成及び／もしくは生理学的構成を物質の非存在下での合成
軟骨の生化学的組成及び／もしくは生理学的構成と共に決定することを含んでな
る軟骨組織に影響を及ぼす物質を試験する系を提供する。
【０００９】 本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な記述から明らかになる。し
かしながら、この詳細な記述及び特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示す
が、この詳細な記述から本発明の精神及び範囲内の様々な変形及び改変が当業者
に明らかになるので、例示のためにのみ示すと理解されるべきである。
【００１０】 発明の詳細な記述 本発明は、合成軟骨の成長を可能にするために７０μｍ未満、好ましくは４０
μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ましくは１５μｍ未満の平均孔
サイズを有する相互に連結されている孔を有する多孔性構造物を含んでなる合成
軟骨をその上に成長させるための基材を提供する。本発明はまた、選択した孔サ
イズを有する孔を形成することができる材料から７０μｍ未満、好ましくは４０
μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ましくは１５μｍ未満の平均孔
サイズを有する相互に連結されている孔を有する多孔性構造物を製造することを
含んでなる合成軟骨をその上に形成するかもしくは成長させるための基材を製造
する方法も提供する。本発明の一つの態様として、材料は粉末である。好ましい
態様として、粉末は、本発明の基材の特性を有する多孔性構造物を形成するよう
に粉末の粒子（すなわち、粉末粒子）を融合させるために適当な条件下で焼結す
る。
【００１１】 本発明の基材はまた、哺乳動物の骨との接続進入機序のための深部成分を含ん
でなることもできる。深部成分の孔サイズは、哺乳動物への移植後に基材中への
骨内方成長を容易にするかもしくは促進するように選択される。従って、基材は
、（ａ）その上に合成軟骨の成長を可能にするために７０μｍ未満、好ましくは
４０μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ましくは１５μｍ未満の平
均孔サイズを有する相互に連結されている孔を有する多孔性構造物を含んでなる
表面成分、及び（ｂ）基材中への骨内方成長を可能にするように選択される（ａ
）と比較してさらに大きい平均孔サイズを有する多孔性構造物を含んでなる深部
成分を含んでなることができる。一つの態様として、深部成分の孔サイズは約３
０〜２００μｍの間である。
【００１２】 本発明の基材は、結合組織、椎間円盤、線維組織、腱及び靭帯が包含されるが
これらに限定されるものではない他の軟部組織を形成するために用いることがで
きる。
【００１３】 本発明はまた、本発明の基材上もしくはそれと組み合わせて形成される合成軟
骨を含んでなるインビボでの哺乳動物における軟骨欠損の修復のための合成軟骨
パッチにも関する。基材は、より大量の組織形成を可能にする。特に、合成軟骨
は、約４０μｍ以上の平均孔サイズを有する相互に連結されている孔を有する基
材上に形成される組織と比較した場合にいっそう高い細胞充実性（約２倍高い、
特に平均して１．５倍高い）及びいっそう高いプロテオグリカン含有量（約２倍
高い、特に平均して１．５倍高い）を特徴とする。
【００１４】 本発明はまた、哺乳動物における軟骨損傷の修復のための合成軟骨パッチ、好
ましくは合成関節軟骨パッチをインビトロで製造する方法も意図する。この方法
は、（ａ）選択した孔サイズを有する孔を形成することができる材料から７０μ
ｍ未満、好ましくは４０μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ましく
は１５μｍ未満の平均孔サイズを有する相互に連結されている孔を有する多孔性
構造物を形成することを含んでなる基材を製造すること；及び（ｂ）細胞に合成
軟骨の三次元多細胞層パッチを形成させるために十分な条件下で、露出させた軟
骨形成細胞を基材上で培養することを含んでなる。得られる合成軟骨は、マトリ
ックス内に分散している軟骨形成細胞を含有する。合成軟骨はまた、より大きい
平均孔サイズ（すなわち、約４０μｍより大きい）を有する基材上に形成される
かもしくはより大きい粉末サイズ（約４５μｍより大きい）を有する粉末から形
成される合成軟骨と比較した場合にいっそう高いＤＮＡ含有量により示されるよ
うないっそう高い細胞充実性及びいっそう高いプロテオグリカン含有量を有する
とみなされる。工程（ａ）において、多孔性構造物は、本明細書に記述するよう
な深部成分と共にもしくはその上に形成することができ、またはそれは前もって
形成した深部成分上に置くことができる。
【００１５】 基材は、表面成分及び場合により深部成分を含有する前もって形成した構造で
あることができ、またはそれはこれら２つの成分の複合構造であることができる
。表面成分及び深部成分は、別個の層としてもしくは一体構造として形成するこ
とができる。
【００１６】 本発明の基材を製造するために用いる材料（例えば粉末）は、純粋なチタンも
しくはチタン合金（例えばＴｉ６Ａｌ４Ｖ）、ヒドロキシアパタイト、炭酸カル
シウム、リン酸カルシウム（ＷＯ９７／４５１４７として公開されたＰＣＴ／Ｃ
Ａ９７／００３３１、及びＵ．Ｓ．６，０７７，９８９を参照）または他の同様
の無機材料に基づくことができる。表面成分多孔性構造物を製造するために用い
る粉末の粒子サイズは、７０μｍ未満、好ましくは４０μｍ未満、より好ましく
は約２０μｍ未満、最も好ましくは１５μｍ未満の孔サイズを与えるように選択
される。適当な粒子サイズは１００μｍ未満、より好ましくは５０μｍ未満、最
も好ましくは４５μｍ未満である。
【００１７】 本発明の方法では、基材を形成するために粉末（例えば、リン酸カルシウム、
チタンもしくはチタン合金（Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ）、ヒドロキシアパタイトまたは炭
酸カルシウムの粉末）を用いる。粉末は、例えば、材料の融解温度より少し低い
圧力もしくは重力焼結により、または材料の融解温度より低いが粒子間の有意な
連結部領域の形成を与えるために十分な原子もしくは分子拡散もしくは粘性流れ
を与える温度より高い温度で、焼結することができる。これにより、７０μｍ未
満、好ましくは４０μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ましくは１
５μｍ未満の平均孔サイズを有する相互に連結されている孔を有する表面成分多
孔性構造物が製造される。粉末の粒子サイズは、表面成分では典型的に１００μ
ｍ未満、より好ましくは５０μｍ未満、最も好ましくは４５μｍ未満である所望
の孔サイズを与えるように選択される。
【００１８】 選択した孔サイズを有する基材を製造するために当該技術分野において既知で
ある他の方法及び材料を使用できることが理解される（例えば、レーザー焼結、
直接凝固、繊維の焼結、結合メッシュ、及び犠牲要素の優先溶解）。例えば、Ｐ
ＣＴ／ＣＡ９７／００３３１（ＷＯ９７／４５１４７として公開された）及びＵ
．Ｓ．６，０７７，９８９を参照。
【００１９】 本発明の基材は、任意のサイズもしくは形状、好ましくは哺乳動物における移
植のための合成軟骨パッチを形成するために適当なものに成形することができる
。例えば、基材は、円筒形、先細もしくはねじ込みであることができる、棒、ピ
ン、ディスク、ねじ及び板、好ましくはディスクに成形することができる。得ら
れるパッチは、軟骨欠損に直接相互適合することができ、またはそれは欠損への
挿入の前に適切なサイズ及び形状に整えることができる。
【００２０】 本明細書において使用する「合成軟骨」という用語は、合成関節軟骨が包含さ
れるがこれに限定されるものではない、内因的に生産されそして分泌される細胞
外マトリックス内に分散している軟骨形成細胞を含有するインビトロで製造され
る任意の軟骨組織をさす。細胞外マトリックスは、膠原原繊維、硫酸化プロテオ
グリカン、例えばアグリカン、及び水からなる。
【００２１】 「合成関節軟骨」は、哺乳動物関節の関節をなす表面上に通常存在する軟骨に
生化学的及び形態学的に類似しているインビトロで製造される任意の軟骨組織を
さす。
【００２２】 「軟骨形成細胞」という用語は、適切な刺激にさらされると軟骨組織に特有の
成分、例えば、ＩＩ型コラーゲンの原繊維及び大きい硫酸化プロテオグリカンを
生産しそして分泌することができる細胞に分化することができる任意の細胞をさ
す。本発明の実施に用いる軟骨形成細胞は、軟骨形成細胞を含有する任意の組織
から単離することができる。軟骨形成細胞は、ヒアリン軟骨、弾性軟骨もしくは
線維軟骨が包含される以前から存在する軟骨組織から直接単離することができる
。特に、軟骨形成細胞は、関節軟骨（負荷もしくは非負荷関節のいずれかから）
、肋軟骨、胸肋軟骨、喉頭蓋軟骨、甲状軟骨、鼻軟骨、耳介軟骨、気管軟骨、披
裂軟骨及び輪状軟骨から単離することができる。軟骨形成細胞、特に間葉幹細胞
はまた、当該技術分野において周知である技術を用いて骨髄から単離することも
できる（例えば、Ｗａｋｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊ
ｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．７６：５７９−５９１，米国特許第５，１９７，９８５号
及び第４，６４２，１２０号を参照）。
【００２３】 好ましくは、軟骨形成細胞は関節軟骨から単離される。関節軟骨の生検サンプ
ルは、当該技術分野において周知である方法を用いて関節鏡もしくは開関節手術
中に単離することができる（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ １
９９１，ＭｃＧｉｎｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋを参照）。
【００２４】 軟骨形成細胞は、哺乳動物、好ましくはヒト、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、
最も好ましくはヒトから単離することができる。軟骨形成細胞は、成体もしくは
胎児組織から単離することができる。本発明の一つの態様として、軟骨形成細胞
は、Ｂｏｙｌｅ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ
Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，３：１１７−１２５，１９９５）に記述されているように
仔ウシの中手骨−手根骨関節から単離される。
【００２５】 軟骨形成細胞は、遺伝子欠損を直すかもしくは補う生物学的に活性のタンパク
質をコードする外来遺伝子を含有する組換えベクターで形質転換することができ
る。
【００２６】 「露出させた細胞」は、そのような細胞を含有する離解した組織から単離され
ている任意の細胞をさす。露出させた細胞を遊離させるために組織を酵素的及び
／もしくは機械的に離解することができる。組織から軟骨形成細胞を単離するた
めに常法を用いることができる。例えば、軟骨細胞は、コンドロイチナーゼＡＢ
Ｃ、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ、コラーゲナーゼもしくはトリプシンが包含
されるタンパク質分解酵素を用いて順次酵素消化技術により単離することができ
る。一つの態様として、本発明は、Ｋａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０３５：１３０，１９９０もしくはＢｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ 上記に記述されている方法を用いる。
【００２７】 軟骨形成細胞を基材上に接種し（例えば１ｘ１０5〜８ｘ１０8細胞／ｃｍ2、
より好ましくは１ｘ１０6〜８ｘ１０8細胞／ｃｍ2、最も好ましくは１．５ｘ１
０7細胞／ｃｍ2）、そして通常の培養条件下で増やす。例えば、培養物は、５％
ウシ胎仔血清を含有するＨａｍｓ Ｆ１２倍地において増やし、そして約７日後
にアスコルビン酸（例えば１００μｇ／ｍｌ）を培地に加える。次いで細胞外マ
トリックスの生産及び蓄積、従って合成軟骨の形成を誘導するために培養物を維
持する（例えば１〜１００日、好ましくは１〜６０日）。
【００２８】 本発明の一つの態様として、軟骨細胞は、Ｕ．Ｓ．５，３２６，３５７及びＰ
ＣＴ ＣＡ９６／００７２９（ＷＯ９７／１７４３０として公開された）に記述
されている方法を用いて基材上に形成される。
【００２９】 本発明の合成軟骨パッチは、軟骨欠損を置換もしくは修復するために移植片と
して用いることができる。欠損は、関節の関節鏡検査中もしくは開手術中に容易
に同定することができる。それらはまた、コンピューター断層撮影（ＣＴスキャ
ン）、Ｘ線検査、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、滑液もしくは血清マーカーの分析
、または当該技術分野において既知である他の方法を用いて同定することもでき
る。欠損の処置は、関節鏡もしくは開関節処置中に実施することができる。いっ
たん欠損が同定されると本発明の方法を用いてそれを処置することができる。
【００３０】 本発明は、（ａ）本明細書に記述する本発明の合成軟骨パッチを前もって決定
した部位で外科的に移植すること；及び（ｂ）合成軟骨を前もって決定した部位
に（例えば軟骨）統合させることを含んでなる哺乳動物（好ましくはヒト）にお
ける前もって決定した部位で軟骨欠損、好ましくは関節軟骨欠損の修復をもたら
す方法を意図する。合成軟骨パッチの基材部分は、例えば、圧入、もしくは絡み
合い形態（例えばねじ込み基材）を用いて、骨に適所で固定することができる。
基材が表面成分及び深部成分を含んでなる場合、深部成分は好ましくは骨と実質
的に並置して移植される。ある方法では、欠損のある軟骨は移植前に取り除かれ
る。パッチは、軟骨欠損に適合するようにサイジング及び成形することができ、
もしくは複数のパッチを欠損に移植することができる。
【００３１】 合成軟骨パッチは、移植の前に当業者に周知である常法を用いて生化学的もし
くは形態学的にアッセイすることができる。例えば、合成軟骨パッチの組成を確
かめるために、細胞増殖アッセイ（Ｐｏｌｌａｃｋ，１９７５，「Ｒｅａｄｉｎ
ｇｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」中，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、増殖した細胞の軟骨形成能力を測定するアッセ
イ（例えばＢｅｎｙａ ｅｔ ａｌ，１９８２，Ｃｅｌｌ ３０：２１５−２２
４に記述されているようなアガロース培養）並びに生化学的アッセイ及び免疫組
織化学染色を用いることができる。
【００３２】 本発明の合成軟骨パッチは、同種異系、異種もしくは好ましくは自己細胞から
得ることができる。合成同種異系軟骨は、レシピエントと同じ種に属する哺乳動
物からの生検組織、骨髄吸引液もしくは血清サンプルから単離される細胞より製
造することができる。自己パッチは、意図するレシピエントからの生検部位から
得られる細胞より製造することができる。
【００３３】 本明細書に記述する方法は、関節軟骨の部分的厚み及び全厚みの欠損の両方の
処置において用いることができる。全厚みの欠損には、関節軟骨、その下にある
肋軟骨下骨組織、及び関節軟骨と肋軟骨下骨の間に位置する軟骨の石灰化層にお
ける変化が包含される。これらの欠損は、関節の外傷の間もしくは変性性関節疾
患（例えば変形性関節症）の後期の間に起こり得る。部分的厚みの欠損は、軟骨
組織自体に限定され、そして裂、裂溝もしくは侵食が包含される。これらの欠損
は、通常、関節の外傷もしくは機械的な障害により引き起こされ、それらは今度
は関節内の軟骨組織の磨耗を引き起こす。
【００３４】 本発明はなおさらに、軟骨の形成もしくは維持に影響を及ぼすと思われる物質
の存在下で、細胞に合成軟骨の三次元多細胞層パッチを形成させる条件下で、露
出させた軟骨形成細胞を本発明の基材上で培養すること、及び培養において生じ
る合成軟骨の生化学的組成及び／もしくは生理学的構成を物質の非存在下での合
成軟骨の生化学的組成及び／もしくは生理学的構成と共に決定することを含んで
なる軟骨組織、好ましくは関節軟骨組織に影響を及ぼす物質を試験する系に関す
る。物質は培養物に加えることができ、または物質を発現するように軟骨形成細
胞もしくは合成軟骨を遺伝子的に工学設計することができ、すなわち、軟骨形成
細胞は物質の内因性供給源として働くことができる。
【００３５】 本発明はなおさらに、関節の疾患の処置における効能について薬剤を試験する
ために本発明の合成軟骨パッチを使用する方法に関する。
【００３６】 本発明はまた、遺伝子治療において本発明の合成軟骨を使用することも意図す
る。感染させる細胞の遺伝子型及び表現型を改変するように選択される生物学的
に活性のタンパク質をコードする外来遺伝子を含有する組換えベクターを軟骨形
成細胞に、従って、本発明の合成軟骨パッチに導入することができる。遺伝子欠
損を直すかもしくは補う生物学的に活性のタンパク質をコードする外来遺伝子は
、細胞及びパッチに導入することができる。例えば、ＴＩＭＰ（金属プロテアー
ゼの組織インヒビター）は、細胞がこのタンパク質を分泌しそして変形性関節症
及び慢性関節リウマチのような疾患において局所的に軟骨細胞により合成される
金属プロテアーゼを阻害するように細胞に導入することができる。遺伝子はまた
、サラセミアの処置において有用であると思われる鉄を代謝するために挿入する
こともでき得る。外来遺伝子の発現は、組換えベクターに含まれる選択遺伝子に
よりコードされる選択可能なマーカーの発現レベルを測定することにより定量す
ることができる。
【００３７】 製薬学的因子及び増殖因子を本発明の基材の孔内に導入することができる。従
って、本発明は、製薬学的因子及び増殖因子を送達するための本発明の合成軟骨
パッチの使用を意図する。
【００３８】 以下の限定しない実施例は本発明を例示する： 実施例 本発明者等は、１００μｍ未満、好ましくは４５μｍ未満の粒子サイズを有す
るチタン合金粉末から製造される基材上に形成される軟骨性組織が、中間の粉末
サイズ（４５−１５０μｍ）からもしくはさらに大きい粉末サイズ（＞２００μ
ｍ）から製造されるディスク上に形成される組織と比較した場合にいっそう大き
い細胞充実性及びプロテオグリカン含有量を有することを見出した。従って、孔
サイズにより特定されるような基材構造は、蓄積されるプロテオグリカンの量に
より決定した場合に形成される組織の量に影響を及ぼす。
【００３９】 材料及び方法材料 ：３つの異なるサイズ範囲；＜４５μｍ（平均孔サイズ〜１３μｍ）、４５
−１５０μｍ（平均孔サイズ〜４３μｍ）及び＞２００μｍ（平均孔サイズ〜６
８μｍ）のＴｉ６Ａｌ４Ｖ粉末を焼結することにより３つの異なる孔サイズの多
孔性Ｔｉ６Ａｌ４Ｖディスクを成形した。表１は、チタンディスクの平均孔サイ
ズ及び孔サイズ分布を示す。各ディスクは、４．３ｍｍの表面直径及び４ｍｍの
高さであった。軟骨細胞培養 ：軟骨細胞は、以前に記述されているように順次酵素消化によりウ
シ中手骨−手根骨関節から得られる全厚み関節軟骨から単離した。軟骨細胞（２
ｘ１０6細胞）は、５％ウシ胎仔血清を補足したＨａｍのＦ１２培地においてデ
ィスク上で平板培養した。５日目にウシ胎仔血清濃度を２０％に増やし、そして
７日目にアスコルビン酸（１００μｇ／ｍｌ、最終濃度）を加えた。培養物は、
２−３日ごとに培地交換しそして新しいアスコルビン酸を毎度加えて４週間維持
した。軟骨細胞培養物の組織学的評価 ：平板培養後４週で培養物を採取し、１０％緩衝
ホルマリン中で固定し、そしてＯｓｔｅｏｂｅｄRに包埋した。切片を切断し、
そしてトルイジンブルーで染色した。プロテオグリカン含有量 ：軟骨細胞培養物を４週で採取し、そしてパパイン［２
０ｍＭ酢酸アンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ ＤＴＴ中１００μｇ／ｍ
ｌ］で６５℃で少なくとも４８時間消化した。プロテオグリカン含有量は、ジメ
チルメチレンブルー色素結合アッセイ及び分光測光法を用いてこれらの消化物に
おけるグリコサミノグリカンの量を測定することにより決定した（Ｂｏｙｌｅ，
Ｊ．ｅｔ ａｌ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ
，３：１１７−１２５，１９９５）。ＤＮＡ含有量 ：軟骨細胞培養物を４週で採取し、そして上記のようにパパインで
消化した。ＤＮＡ含有量は、ヘキスト色素３３２５８及び蛍光比色法を用いて測
定した（Ｂｏｙｌｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ
Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，３：１１７−１２５，１９９５）。新たに合成されるプロテオグリカンの分析 ：軟骨細胞培養物を採取する前に［35 Ｓ］ＳＯ4（８μＣｉ／ディスク）と２４時間インキュベーションした。マトリ
ックスプロテオグリカンは、０．１Ｍ ６−アミノ−ヘキサン酸、５０ｍＭベン
ズアミジンＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び５ｍＭ Ｎ−エチルマレイミドを含有
する５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．８中４ＭのグアニジンＨＣｌで４℃で２
４時間抽出した。プロテオグリカンモノマーサイズ（Ｋａｖ）は、解離条件下で
セファロースＣＬ−２Ｂクロマトグラフィーを用いて決定した。Ｋａｖは、Ｋａ
ｖ＝（Ｖe−Ｖ0）／（Ｖt−Ｖ0）（ここで、Ｖt＝全容量、Ｖ0＝ボイド容量、そ
してＶe＝溶出容量）により決定した。Ｖtは［35Ｓ］ＳＯ4で決定し、そしてボ
イド容量はデキストラン硫酸で決定した。統計学的評価 ：結果は、平均及び標準偏差（ＳＤ）として示す。選択した群間の
有意性を決定するために対（ｐａｉｒｅｄ）スチューデントｔ検定を用い、そし
て有意性はｐ＜０．０５で特定された。 結果 光学顕微鏡検査による組織学的切片の検査により、軟骨性組織が４週以内に全
ての孔サイズのディスクの表面上に形成することが示された。粉末サイズ＜４５
μｍから製造されるＴｉ６Ａｌ４Ｖディスク上に形成される組織は、４５−１５
０μｍの間もしくは＞２００μｍの範囲の粉末サイズから製造されるディスク上
に形成される組織より厚いようであった（図１）。ディスクの表面上の組織の外
形計測測定により、１３μｍの平均孔サイズのＴｉ６Ａｌ４Ｖディスク上に形成
される組織は、さらに大きい平均孔サイズのディスク上に形成される組織より有
意に厚いことが示された（平均の厚み（μｍ）±ＳＤ：１３μｍの平均孔サイズ
＝５３３±９１；４３μｍの平均孔サイズ＝１８８±４６；６８μｍの平均孔サ
イズ＝１９７±４２）。孔サイズは、軟骨細胞により合成されるプロテオグリカ
ンのサイズに影響を与えなかった（Ｋａｖ±ＳＤ：粉末サイズ＜４５μｍ＝０．
２８±０．０３；粉末サイズ４５−１５０μｍ＝０．２９±０．０３；粉末サイ
ズ＞２００μｍ＝０．２７±０．０４）。これらのプロテオグリカンのＫａｖは
、エクスビボ軟骨培養において軟骨細胞により合成されるもの（Ｋａｖ＝０．２
７）と同様のサイズであった。
【００４０】 生化学的分析により、最小の粉末サイズ（＜４５μｍ）から製造されるＴｉ６
Ａｌ４Ｖディスク上に形成される軟骨性組織は、より細胞性であり、そして１２
．５±０．６μｇ／ディスクのＤＮＡ含有量を有することが示された（図２）。
これは、同様の量のＤＮＡを示す中間の粉末サイズ（４５−１５０μｍ）もしく
は最大の粉末サイズ（＞２００μｍ）から製造されるディスク上に形成される軟
骨性組織のＤＮＡ含有量より有意に大きかった。さらに、最小の粉末サイズ（＜
４５μｍ）から製造されるＴｉ６Ａｌ４Ｖディスク上に形成される軟骨性組織は
２４６．９±８μｇ／ディスクのプロテオグリカン含有量を有し、これは、同様
の量のプロテオグリカンを有する中間の粉末サイズ（４５−１５０μｍ）（１９
０．４±１０μｇ／ディスク）もしくは最大の粉末サイズ（＞２００μｍ）（１
５６．６±２６μｇ／ディスク）のディスク上に形成される軟骨性組織のプロテ
オグリカン含有量より有意に大きかった（図３）。しかしながら、細胞当たり蓄
積されるプロテオグリカンの量は、異なる粉末サイズから製造されるディスク上
に形成される組織において同様であった（ＧＡＧ／ＤＮＡ：４５μｍ＝１８．７
±０．４）；４５−１５０μｍ＝１９．８±４．２；＞２００μｍ＝２０．５±
４．８。
【００４１】 孔サイズは、調べた範囲内で、合成されるプロテオグリカンのサイズにもまた
細胞当たり蓄積されるプロテオグリカンの量にも影響がなかった。しかしながら
、１３μｍの平均孔サイズを有するディスク上に形成される軟骨性組織は、さら
に大きい平均孔サイズのディスク上に形成される組織と比較していっそう大きい
細胞充実性及びプロテオグリカン含有量を有した。これらの結果は、孔サイズに
より特定されるような基材構造が、蓄積するマトリックスの量及び組成に影響を
及ぼし得ることを示す。
【００４２】 本明細書に記述する特定の態様は、本発明の一つの態様の単に一つの例示とし
て示すものであり、そしてあらゆる機能的に同等の態様は本発明の範囲内である
ので、本発明はそのような態様により範囲が限定されるものではない。実際、本
明細書に示しそして記述するものに加えて本発明の様々な改変が、先の記述及び
添付の図面から当業者に明らかになる。そのような改変は、添付の請求項の範囲
内に入るものとする。
【００４３】 本明細書に引用する全ての公開、特許及び特許出願は、各個々の公開、特許も
しくは特許出願が引用することによりその全部が組み込まれると特にそして個々
に示された場合と同じ程度にその全てが引用することにより組み込まれる。本明
細書に記述する全ての公開、特許及び特許出願は、本発明と関連して用いられる
かもしれないその中に報告される方法論等を記述しそして開示するという目的の
ために引用することにより本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいずれも
、先行する発明という理由で本発明がそのような開示に先行する権利がないとい
う承認として解釈されるべきではない。
【００４４】 本明細書及び添付の請求項において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び
「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに他に指示しない限り複数形が包含されることが
留意されなければならない。従って、例えば、「一つの遺伝子（ａ ｇｅｎｅ）
」への言及には、複数のそのような遺伝子が包含される。
【００４５】 表１ 水銀ポロシメーター測定により決定した場合の チタンディスクの平均孔サイズ及び孔サイズ分布 材料及び粉末サイズ(μm) 水銀ポロシメーター測定 孔サイズ分布 平均孔サイズ （μｍ） （μｍ） ＴｉＡｌ＜４５ｕｍ ８−２９ １３ ＴｉＡｌ４５−１５０ｕｍ ８−１１１ ４３ ＴｉＡｌ＞２００ｕｍ １５−１０５ ６８ 水銀ポロシメーター測定の方法により決定した場合の平均孔サイズ及び孔サイ
ズ分布（ＴｉＡｌ＝チタン合金、Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ）
【図面の簡単な説明】
本発明は、図面を参照していっそうよく理解される：
【図１】 平均孔サイズＡ）１３μｍ、Ｂ）４３μｍ、Ｃ）６８μｍのＴｉ６Ａｌ４Ｖデ
ィスク上に形成される軟骨性組織の顕微鏡写真を示す（トルイジンブルー、倍率
ｘ１００）。
【図２】 代表的実験からの異なる平均孔サイズのチタン合金（Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ）上に形
成される軟骨性組織のＤＮＡ含有量を示す棒グラフである。
【図３】 代表的実験からの異なる平均孔サイズのチタン合金（Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ）上に形
成される軟骨性組織のプロテオグリカン含有量を示す棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 フイリア・ロバート カナダ・オンタリオ エム４エヌ １エヌ ８・トロント ロチエスターアベニユー 56 Ｆターム(参考） 4B029 AA01 BB11 CC10 4B065 AA90X BC42 BC44 CA44 4C076 AA82 BB31 BB32 CC09 FF02 4C081 AA12 AA14 AB04 AB05 AC03 BA12 BA13 BB07 BB08 CF011 CF031 CF111 CG02 CG03 DA01 DB06 DB07 4C097 AA02 AA03 BB01 BB09 CC01 CC03 DD07 DD10 SC07

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ４０μｍより大きい平均孔サイズを有する基材上に形成され
    る合成軟骨と比較した場合にいっそう高い細胞充実性及びいっそう高いプロテオ
    グリカン含有量を有することを特徴とする合成軟骨の成長を可能にするために７
    ０μｍ未満、好ましくは４０μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未満、最も好ま
    しくは１５μｍ未満の平均孔サイズを有する相互に連結されている孔を有する多
    孔性構造物を含んでなる合成軟骨を形成するための基材。
  2. 【請求項２】 合成軟骨の成長を可能にするために４０μｍ未満の平均孔サ
    イズを有する相互に連結されている孔を有する多孔性構造物を含んでなる合成軟
    骨を形成するための基材。
  3. 【請求項３】 平均孔サイズが１０〜４０μｍの間、好ましくは１０〜３０
    μｍの間、より好ましくは１０〜２０μｍの間、そして最も好ましくは１０〜１
    ５μｍの間である請求項１において請求したとおりの基材。
  4. 【請求項４】 多孔性構造物がリン酸カルシウム、チタンもしくはチタン合
    金（Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ）、ヒドロキシアパタイトまたは炭酸カルシウムの粉末から
    形成される請求項１、２もしくは３において請求したとおりの基材。
  5. 【請求項５】 （ａ）７０μｍ未満、好ましくは４０μｍ未満、より好まし
    くは２０μｍ未満、最も好ましくは１５μｍ未満の平均孔サイズを有する相互に
    連結されている孔を有する多孔性構造物を含んでなる合成軟骨をその上に成長さ
    せるための表面成分；及び（ｂ）基材における骨内方成長を可能にするように選
    択される孔サイズを有する多孔性構造物を含んでなる深部成分（ｄｅｅｐｅｒ
    ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を含んでなる合成軟骨を形成するための基材。
  6. 【請求項６】 多孔性構造物がリン酸カルシウム、チタンもしくはチタン合
    金（Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ）、ヒドロキシアパタイトまたは炭酸カルシウムの粉末から
    形成される請求項５において請求したとおりの基材。
  7. 【請求項７】 （ｂ）において孔サイズが３０〜２００μｍの間である請求
    項５もしくは６において請求したとおりの基材。
  8. 【請求項８】 先の請求項のいずれかにおいて請求したとおりの基材上に形
    成される合成軟骨を含んでなるインビボでの哺乳動物における軟骨欠損の修復の
    ための合成軟骨パッチ。
  9. 【請求項９】 軟骨が、４０μｍより大きい平均孔サイズを有する相互に連
    結されている孔を有する基材上に形成される軟骨組織と比較した場合に約１．５
    倍高い細胞充実性及び約１．５倍高いプロテオグリカン含有量を特徴とする請求
    項８において請求したとおりの合成軟骨パッチ。
  10. 【請求項１０】 合成軟骨が合成関節軟骨である先の請求項のいずれかにお
    いて請求したとおりの合成軟骨パッチ。
  11. 【請求項１１】 （ａ）選択した孔サイズを有する孔を形成することができ
    る材料から７０μｍ未満、好ましくは４０μｍ未満、より好ましくは２０μｍ未
    満、最も好ましくは１５μｍ未満の平均孔サイズを有する相互に連結されている
    孔を有する多孔性構造物を形成することを含んでなる基材を製造すること；及び
    （ｂ）細胞に合成軟骨の三次元多細胞層パッチを形成させるために十分な条件下
    で、露出させた軟骨形成細胞（ｄｅｎｕｄｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｃ
    ｅｌｌ）を基材上で培養することを含んでなる哺乳動物における軟骨欠損の修復
    のための合成軟骨パッチをインビトロで製造する方法。
  12. 【請求項１２】 （ａ）において材料が粉末である請求項１１において請求
    したとおりの方法。
  13. 【請求項１３】 粉末がリン酸カルシウム、チタンもしくはチタン合金（Ｔ
    ｉ６Ａｌ４Ｖ）、ヒドロキシアパタイトまたは炭酸カルシウムの粉末である請求
    項１２において請求したとおりの方法。
  14. 【請求項１４】 粉末が１００μｍ未満の粒子サイズを有する請求項１２も
    しくは１３において請求したとおりの方法。
  15. 【請求項１５】 粉末が４５μｍ未満の粒子サイズを有する請求項１２もし
    くは１３において請求したとおりの方法。
  16. 【請求項１６】 軟骨形成細胞が哺乳動物の関節軟骨から単離され、そして
    合成軟骨が合成関節軟骨である先の請求項のいずれかにおいて請求したとおりの
    方法。
  17. 【請求項１７】 （ａ）における多孔性構造物が、基材における骨内方成長
    を可能にするように選択される孔サイズを有する多孔性構造物を含んでなる深部
    成分上もしくはそれと共に形成されるか、またはその上に置かれる先の請求項の
    いずれかにおいて請求したとおりの方法。
  18. 【請求項１８】 深部成分の孔サイズが３０〜２００μｍの間である請求項
    １７において請求したとおりの方法。
  19. 【請求項１９】 合成軟骨が、約４０μｍより大きい平均孔サイズを有する
    相互に連結されている孔を有する基材上に形成される合成軟骨と比較した場合に
    約１．５倍高い細胞充実性及び約１．５倍高いプロテオグリカン含有量を特徴と
    する先の請求項のいずれかにおいて請求したとおりの方法により製造される合成
    軟骨パッチ。
  20. 【請求項２０】 （ａ）先の請求項のいずれかにおいて請求したとおりの合
    成軟骨パッチを前もって決定した部位で外科的に移植すること；及び（ｂ）パッ
    チの合成軟骨を前もって決定した部位に統合させることを含んでなる哺乳動物に
    おける前もって決定した部位で軟骨欠損の修復をもたらす方法。
  21. 【請求項２１】 欠損が関節軟骨の部分的厚み（ｐａｒｔｉａｌ−ｔｈｉｃ
    ｋｎｅｓｓ）もしくは全厚み（ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）の欠損である請
    求項２０において請求したとおりの方法。
  22. 【請求項２２】 （ａ）軟骨の形成もしくは維持に影響を及ぼすと思われる
    物質の存在下で、細胞に合成軟骨の三次元多細胞層パッチを形成させる条件下で
    、露出させた軟骨形成細胞を先の請求項のいずれかにおいて請求したとおりの基
    材上で培養すること、及び （ｂ）培養において生じる合成軟骨の生化学的組成及び／もしくは生理学的構成
    を物質の非存在下での合成軟骨の生化学的組成及び／もしくは生理学的構成と共
    に決定すること、 を含んでなる軟骨組織に影響を及ぼす物質を試験する系。
  23. 【請求項２３】 関節の疾患の処置における効能について薬剤を試験するた
    めに先の請求項のいずれかにおいて請求したとおりの合成軟骨パッチを使用する
    方法。
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