JP2018510673A - 機械的に機能するヒト軟骨の組織工学およびその作製方法 - Google Patents
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Abstract
成人ヒト間葉系幹細胞由来の機械的に機能する培養軟骨を有する医療機器および同機器を作製する方法。【選択図】図1
Description
連邦政府資金による研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成番号第DE016525号および第EB002520号の下で連邦政府支援によりなされた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成番号第DE016525号および第EB002520号の下で連邦政府支援によりなされた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
本開示は、組織工学分野に関し、より具体的には、機械的に機能するヒト軟骨の組織工学に関する。
世界人口が熟成するにつれて、膝関節置換および股関節置換は長年にわたって何倍も増加すると推定される。加えて、筋骨格の損傷(例えば、スポーツ傷害)は増加の傾向にあり、過去十年間で小児集団については2倍以上増えている。
患者の細胞からin vitroで機能組織を生成することで、損傷、疾患または老化により失われたあるいは損なわれた組織に生物学的代用品を提供することによって再生医療に改革をもたらす。胚発生および幹細胞生物学の理解が高まり、足場設計、細胞操作、および幹細胞分化と組織形成を調節する(生化学的および物理的)要因の取込みへの組織工学アプローチに多大な影響を与えている。
軟骨はその無血管の性質のためごくわずかな自然修復力を示すので、組織工学は軟骨再生に特に着目する。軟骨疾患の特徴的な性質としては、機械的性質の減少、コラーゲン分解、プロテオグリカン合成の減少、および細胞充実性の低下が挙げられる。局在性軟骨病変の修復へのアプローチとしては、レーザーはんだ溶接、骨膜移植を介する自家移植細胞/組織移植、自家骨軟骨移植術、および軟骨再生のための自家軟骨細胞移植方法が挙げられる。これらの選択肢は症状の一時的緩和をもたらすが、一方で長期の問題も持ち込まれる。
軟骨組織工学では、初代ウシ軟骨細胞とともに足場材料を用いて、天然の組織の性質と近似するものを有する軟骨を作ってきた。しかし、これらの方法は、臨床応用のための好ましい細胞源であるヒト間葉系幹細胞(hMSC)とともに用いた場合、亜正常の軟骨組織になる。
組織または臓器でさえその生物学的代用品の工学技術は、ますます真実味を帯びてきているが、依然として大きな障害に直面している。軟骨は、わずか1種類の細胞型を含む無血管組織であるので、組織工学者にとって主要な焦点であり、最初は、容易な標的であると思われた。例えば、患者の膝から採取され、培養で増殖させた自家軟骨細胞による軟骨修復は、細胞治療製品を提供する。しかし、患者の膝から自家軟骨細胞を採取することは、関節炎の罹患およびリスクと関連する。骨髄または脂肪hMSCなどの異なる細胞源は、膝から組織採取を回避できるので、臨床的関心が高まることになる。
さらに、臨床試験において軟骨再生を誘導するために、自家hMSCおよび同種hMSCは栄養因子源として使用されてきた。これらの方法のいずれも、機械的に機能するヒト軟骨を生成することができない。今まで、hMSCから生成された軟骨の組成物および機械的性質は、軟骨細胞によって成し遂げられたそれらより依然として劣っている。したがって、機械的に機能する軟骨組織の効果的な組織工学への必要性が依然としてある。
第1の態様において、機械的に機能する培養ヒト軟骨を含む医療機器が提供される。培養軟骨は、天然のヒト軟骨の特性を示す。例えば、培養軟骨は、これに限定されるものではないが、800kPaを超えるヤング率と、0.3未満の平衡摩擦係数を有する。別の実施形態において、培養ヒト軟骨は生理学的層状化特性、剛性またはトライボロジー的性質を有する。
一実施形態において、培養ヒト軟骨は骨基質に付着される。この点について、医療機器はインプラントである。一部の実施形態において、培養ヒト軟骨は解剖学的形状であり、およびこれを用いて骨を交換または修復することができる。この点において、医療機器および/または培養軟骨は、臨床的な大きさ、例えばセンチメートルの大きさであり得る。
骨基質は、顆の関節面であり得る。顆は、患者の解剖学的ヒト顆に対応するように、例えば患者の顆を画像化し、例えば3Dプリンティング技術を用いることによって構成されてもよい。このように、医療機器は特定の患者のために個別化された骨軟骨組織構築物であり得る。別の実施形態において、培養軟骨は、骨欠損への局所送達のための送達デバイス、例えばペン型注入器で使用されることができる。
骨基質は、顆の関節面であり得る。顆は、患者の解剖学的ヒト顆に対応するように、例えば患者の顆を画像化し、例えば3Dプリンティング技術を用いることによって構成されてもよい。このように、医療機器は特定の患者のために個別化された骨軟骨組織構築物であり得る。別の実施形態において、培養軟骨は、骨欠損への局所送達のための送達デバイス、例えばペン型注入器で使用されることができる。
別の態様において、本主題は、解剖学的な足場に関する。この足場は、脱細胞化骨マトリックスと、凝集間葉体とを含む。一実施形態において、凝集間葉体は、骨基質上に配置される高密度細胞層を形成する。凝集間葉体の高密度細胞層および骨基質は、層状構造体を形成する。
一部の実施形態において、脱細胞化骨マトリックスは多孔質であり、および凝集間葉体は細孔内に分散している。言い換えれば、凝集間葉体は、多孔質骨を浸透して構築物を形成する。
別の態様において、骨軟骨構築物を生成するための方法が提供される。この方法は、凝集間葉体を形成するためにヒト間葉系幹細胞を培養することと、次いで骨基質上に凝集間葉体を融合または付着させることとを含む。
本明細書に記載の主題の種々の態様、特徴および実施形態の詳細な説明は、以下に簡単に説明する添付の図面を参照して提示する。図面は例示であり、必ずしも縮尺で描かれてなく、一部の成分および特徴は明瞭性のために誇張されている。図面は本主題の種々の態様および特徴を示しており、本主題の1または複数の実施形態または実施例を全部もしくは一部を示し得る。
ここで本開示の主題の例示的な実施形態を詳細に参照する。本開示の主題の方法および対応するステップは、本システムの詳細な説明と共に説明される。
本開示の一態様によれば、生理学的層状化と生体力学を有する培養ヒト軟骨が提供される。例示的な一実施形態によれば、培養ヒト軟骨を含む医療機器が提供される。医療機器は、プラグまたはインプラントとして構成されることが可能である。培養ヒト軟骨を含むプラグは、対象における欠損を塞ぐことができる。プラグは、対象の組織と統合することができる。別の実施形態において、医療機器はインプラントである。インプラントは、骨基質に固定される培養ヒト軟骨を含む。
別の態様において、機械的に機能するヒト軟骨を作る方法が説明される。この方法に関して、トランスフォーミング増殖因子−βに曝されると、間葉系幹細胞は誘導されて細胞体に凝集し、軟骨形成分化を起こし、および天然のヒト軟骨と類似する特性を示す軟骨組織を形成することが分かったのは驚くべきことであった。培養ヒト軟骨を作るための従来の方法は、天然のヒト軟骨と類似する特性を示す機械的に機能するヒト軟骨を形成することができなかった。
例示的な一実施形態において、凝集間葉細胞体(CMB)は、間葉凝集遺伝子の発現およびテネイシンの沈着によって示されるように、in vitroのセットで5日間の培養の後、外部境界を形成した。境界域の凝固前に、CMBは均質の細胞凝集体に融合され、高分化し、機械的に機能する軟骨を生じる。CMBの間葉凝集および融合を用いて、5週間にわたる培養で、センチメートルの大きさの解剖学的形状のヒト関節軟骨片を生成する。この方法から形成された軟骨の生体力学的性質は天然のヒト軟骨と同等である。一実施形態において、培養軟骨は800kPaを超えるヤング率と、0.3未満の平衡摩擦係数を有する。培養軟骨の従来の方法は、これらの特性を成し遂げられなかった。CMBがin vitro軟骨欠損モデルにおいて機械的に強力な軟骨−軟骨界面を形成する能力があることがわかった。「レゴ様」ブロックの新生軟骨としての働きをするCMBは、生理学的様構造および機械的性質を有するヒト軟骨に組み込むことができる。
本開示の種々の実施形態によれば、機械的に機能するヒト軟骨を作るために、細胞分化および初期の軟骨発達へのシグナルが細胞環境に供給される。一部の実施形態において、
骨格組織および他の間葉組織の発達において極めて重要な段階であり、細胞接着分子および細胞外マトリックス(ECM)によって媒介される間葉凝集を模倣する細胞自己組織化方法が提供される。生理学的な凝集の間、細胞は、一連の間葉凝集段階を経て高密度細胞体を形成することができる。間葉凝集は、細胞体のその後の増殖と分化を明確にすることができる境界域を凝固する。in vitroで、間葉系幹細胞はTGF−βなどの調節因子の存在下で細胞凝集および軟骨形成が行われることが示される。
骨格組織および他の間葉組織の発達において極めて重要な段階であり、細胞接着分子および細胞外マトリックス(ECM)によって媒介される間葉凝集を模倣する細胞自己組織化方法が提供される。生理学的な凝集の間、細胞は、一連の間葉凝集段階を経て高密度細胞体を形成することができる。間葉凝集は、細胞体のその後の増殖と分化を明確にすることができる境界域を凝固する。in vitroで、間葉系幹細胞はTGF−βなどの調節因子の存在下で細胞凝集および軟骨形成が行われることが示される。
種々の実施形態によれば、間葉系幹細胞凝集は、機能するヒト軟骨を作る方法として提供される。凝集間葉細胞体(CMB)は、それらの凝集境界域の凝固前に融合することによって大きな均質の細胞凝集体を形成するよう誘導されることが可能である。この方法は、生理学的層状化特性、剛性またはトライボロジー的性質を有するセンチメートルの大きさの解剖学的形状の関節軟骨構築物を生成することができる。軟骨を修復するCMBの能力は、in vitro軟骨欠損モデルで明らかにされている。このアプローチは、軟骨に関連するばかりでなく、間葉凝集由来の他の組織に関する再生医療で使用されることができる。
本明細書に記載のように、間葉凝集の一部の態様の反復発生は、機能する軟骨をhMSCから形成することをもたらした。図1〜6を参照して、hMSC凝集および境界域凝固をin vitroで調査した。例示されるように、一実施形態において、hMSCは凝集後、1日以内にCMBへの凝集が起こり、早くも7日目に境界域凝固が起きた。
間葉凝集の間の主要な境界域凝固タンパク質であるテネイシン−Cおよびシンデカン−3が上腕骨、橈骨および尺骨の外形を描いている発育中のニワトリ四肢の周辺で高度に発現することを発達研究は明らかにしている。境界域の凝固前、わずかに初期(7日目以前)のCMBが均質に融合され、軟骨形成分化と大きな機能する軟骨組織の形成とを誘導することが可能である。これらの知見は、フィブロネクチンへの細胞付着性を調節する際のテネイシン−Cの既報告の役割と整合している。
本開示の種々の実施形態によれば、生理学的圧縮弾性率と潤滑特性を有する大きな軟骨組織は、CMBを融合し、それらの軟骨形成分化を誘導しながら、図7〜10に示すように軟骨下骨との界面も確定することによってin vitroでの作製に成功している。
一実施形態において、hMSCはTGF−β3を補充した培養液に懸濁され、ウェルの底で凝集され、12時間のインキュベーションの後に単一細胞体に凝集された。3日目までに、図1に示すように不適当な凝集を表す両凹面ディスク構造体を形成した大きな凝集体(5×105〜2×106の細胞を含有する)とは対照的に、小さな凝集体(<5×105の細胞を含有する)は高密度の球状細胞体を形成した。図2は、細胞充実性の相対的増加も、大きな凝集体よりも小さな凝集体の方が高かったことを示している。CMBの形成のために2.5×105細胞が選択された。
凝集後、CMBは発達し、長期間にわたってその球状構造体を維持した。組織境界域の形成を調査するために、間葉凝集中の境界域凝固タンパク質であるテネイシンの生成と局在化が検討された。テネイシンの生成は経時的に増加し、その結果、凝集の7日目までにはCMBの外面全体にテネイシンの豊富なECMが存在し、凝集の進展段階の境界域が凝固した(図4)。フィブロネクチン(FN1)の発現は安定した状態を保っていたが、一方、性決定領域Y(SRY)−ボックス9の軟骨形成分化因子(SOX9)、細胞接着ホメオボックスA2の転写因子(HOXA2)、細胞接着カドヘリン2(CDH2)遺伝子および境界域凝固タンパク質 テネイシンC(TNC)とシンデカン3(SDC3)の発現のすべては経時的に増加し(図5)、凝集過程の成熟および間葉凝集境界域の凝固についての証拠を示した。
7〜9日間の培養の間、CMBは境界域を発達させ、種々の発達段階で互いに均質に融合するCMBの能力が調査された(図3)。融合から7日目、テネイシンがCMBの外面および隣接するCMB間に存在し、統合が不十分であることを示唆した(図6)。成熟するCMB(7〜9日間)の周りの凝固境界域は、組織体の周辺で定着した境界になり、5週間の軟骨形成分化にわたり維持された(図6)。対照的に、初期のCMB(1〜5日間の凝集)が互いに融合されるとき、均質の統合が達成された(図6)。
図7および図8を参照して、融合CMBから生成された機能する軟骨を含む医療機器が調製された。この例示的な実施形態において、CMBの層は、多孔質の脱細胞化骨マトリックスに付着された。高密度細胞領域が生成され(関節軟骨の前駆体)、およびCMBの骨マトリックスへの浸透が促進された(軟骨下領域の前駆体)。高密度細胞層は軟骨に発達し、5週間にわたる培養で骨マトリックスと統合された(図8および9)。軟骨下領域の細胞内含量によって測定されるように、初期CMB(1〜5日間)内の細胞は後期CMB(7日間)内の細胞よりも浸透力があり、遊走性が高いことが観察された(図4)。グリコサミノグリカンおよびヒドロキシプロリンの量によって示されるように、成熟の異なる段階の融合CMBの軟骨形成分化能は類似していた(図4)。表1を参照して、関節軟骨組織の得られた機械的性質は、かなり異なっていた。軟骨のヤング率は、後期CMBよりも初期CMBに対してかなり高かった。対応する摩擦係数と有意差がなかった。特にin vitroで初期CMBから5週間にわたり培養した軟骨のヤング率(平均800kPa超、表1)および平衡摩擦係数(約0.28、表1および図1〜2)は、成人ヒト関節軟骨の生理学的範囲内であった。
別の実施形態において、解剖学的形状軟骨は、in vitroで生成された。この実施形態において、顆軟骨は、CMBを解剖学的形状の多孔質骨足場上にプレス成形によって作られた(図1)。CMBは足場に浸透する高密度細胞層を形成し、5週間の培養後、足場の顆表面を覆う厚い軟骨層(>1mm)に発達した(図12)。組織学的分析により、生理学的様関節軟骨の組織構造が明らかになった(図13〜18)。軟骨性のECMは、大量のグリコサミノグリカンとII型コラーゲンを含有した(図14〜15)。深いゾーン(1303、1403、1503、1603、1703、1803)において、細胞は、グリコサミノグリカン(1403)とII型コラーゲン(1503)が豊富なECMによって囲まれているラクナで見いだされた。表面的ゾーン(1302、1402、1502、1602、1702、1802)は、関節面(1602)に対して接線方向に配置されている扁平細胞とラブリシンの豊富なECMから構成されていた。軟骨下領域において、ECMはグリコサミノグリカン、I型コラーゲンとX型コラーゲン(1304、1404、1504、1604、1704、1804)から構成されていた。
一態様において、in vitroモデル内でCMBによる軟骨修復が提供される。前に使用されたモデルに類似する軟骨欠損のin vitroモデルを用いて、軟骨再生に関するCMBの能力を評価した。軟骨形成条件下での5週間の培養後、融合CMBは完全に軟骨欠損を満たし、周囲の軟骨と統合していた。統合強度は、融合CMBと周囲の軟骨の間の統合界面を壊すのに必要な力と応力で決定した。力と応力は双方とも、未処理の対照欠損においてよりもCMB群において2桁高かった(それぞれ、2.5±0.48N vs.0.03±0.02N;399±56kPa vs.4.4±1.9kPa)(図20)。高い統合強度は、融合CMBによる軟骨性のECM形成と相関した(図21〜22)。
これまでに提案された軟骨組織工学の足場に基づく技術または自己凝集技術とは異なり、本開示の方法は、下層の骨と適合した十分な層状軟骨に最終的に発達する、密集細胞凝集体内で間葉凝集を模倣する。5週間の培養後、培養軟骨について測定した圧縮弾性率と摩擦係数は、天然の関節軟骨の測定値の範囲内である。コラーゲン総含量は天然の軟骨よりも低いが、得られた圧縮弾性率は高密度のGAGに関連し(図7〜10)、軟骨細胞由来の培養軟骨との結果値に似ていた。凝集境界域の凝固前のCMB融合は、機能する軟骨構築物の形成および下層の骨とのシームレス統合に不可欠であった。これまで、そのような生物学的忠実度は、hMSCからの軟骨形成のいかなる方法によっても達成されなかった。
初期CMBの自由形成特性を用いて、天然の関節軟骨に似ている組成物、構造および機械的性質と表面性質を有し、解剖学的な脱細胞化骨足場の顆表面を覆う連続する厚さ1mmの軟骨層が作られる(図11〜18)。そのラブリシンの豊富な層を有する表在面の層状形成(図16)は、軟骨面の生理学的に低い摩擦係数(表1)と関連していた。さらに、軟骨層と軟骨下領域の間の界面で存在するX型コラーゲン(図18)は、石灰化軟骨の発達を示唆した。大きな構築物内の骨界面近くのGAG密度は、X型コラーゲンとGAGの両方が豊富な天然の軟骨−骨の界面においてよりも低く、さらなる肥大軟骨細胞系列または長期間の培養に向かって分化の必要性を示唆している。in vitroで肥大する治療方法およびそれに続く関節への移植によって検証される場合、CMB系軟骨の特許を存続させることを確認するために、さらなる研究も必要であろう。
融合するCMBの有用性は、in vitro軟骨欠損モデルを用いてさらに検討された(図19〜22)。軟骨形成の誘導の後、融合CMBは欠損を満たし、周囲の天然の軟骨と機械的、構造的に統合していた。この統合能により、CMBを臨床的に応用して、軟骨球システムと同様に簡単な注入送達によって欠損を修復し得ることが期待できる。
本開示の種々の実施形態によれば、軟骨下骨基質と適合した機械的に機能するヒト軟骨は、間葉凝集の重要な発達過程の一部の態様を模倣することによってin vitroで生成することができる。この技術は、生理学的層状化、ヤング率(>800kPa)および摩擦係数(<0.3)を有する臨床的な大きさで、解剖学的形状のヒト軟骨をつくる。400kPaの統合強度を有する軟骨−軟骨界面の形成によって証明されるように、この技術は天然関節軟骨の欠損を修復するために用いることができる。この技術は、腱または半月板などの他の組織の生物工学での作製、および胚性幹細胞や人工多能性幹細胞などの他の細胞源の使用まで拡張することができる。
実施例
骨髄由来のヒト間葉系幹細胞。
新鮮なヒト骨髄穿刺液をCambrexから入手した。骨髄由来のヒト間葉系幹細胞(hMSC)をプラスチック表面に付着させることによって分離した。細胞は、10%FBS、1%pen−strepおよび0.1ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子を補充したDMEM中で増殖させた。hMSCを第3継代まで培養し、多系列分化能を示すことを明らかにした。
骨髄由来のヒト間葉系幹細胞。
新鮮なヒト骨髄穿刺液をCambrexから入手した。骨髄由来のヒト間葉系幹細胞(hMSC)をプラスチック表面に付着させることによって分離した。細胞は、10%FBS、1%pen−strepおよび0.1ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子を補充したDMEM中で増殖させた。hMSCを第3継代まで培養し、多系列分化能を示すことを明らかにした。
凝集間葉体(CMB)の生成。
hMSCを培養液(100nMデキサメタゾン、50μg/mlのアスコビル酸−2−リン酸、100μg/mlのピルビン酸ナトリウム、40μg/mlのプロリン、1%インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム[ITS+]混合物、1%抗生物質、および10ng/mlのトランスフォーミング増殖因子−β3[TGF−β3]を補充した高グルコースDMEM)に懸濁させた。CMBの最適規模を決定するために、hMSCを105、2.5×105、5×105、106、1.5×106および2×106細胞/mlの濃度で懸濁させた。1mlの細胞懸濁液を深い丸底の96ウェルプレート(NUNC(登録商標)、Sigma−Aldrich,MO)に加え、250gで5分間遠心させた。細胞を制御された加湿チャンバー(37℃、5%CO2)内でインキュベートした。培地は3日間、一日1回交換した。DNA含量を分析するために、試料(n=4)を画像化して収集した。2.5×105細胞を用いて作製したCMBは凝集能が最も高い(図1〜2)ためすべての実験で使用した。
hMSCを培養液(100nMデキサメタゾン、50μg/mlのアスコビル酸−2−リン酸、100μg/mlのピルビン酸ナトリウム、40μg/mlのプロリン、1%インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム[ITS+]混合物、1%抗生物質、および10ng/mlのトランスフォーミング増殖因子−β3[TGF−β3]を補充した高グルコースDMEM)に懸濁させた。CMBの最適規模を決定するために、hMSCを105、2.5×105、5×105、106、1.5×106および2×106細胞/mlの濃度で懸濁させた。1mlの細胞懸濁液を深い丸底の96ウェルプレート(NUNC(登録商標)、Sigma−Aldrich,MO)に加え、250gで5分間遠心させた。細胞を制御された加湿チャンバー(37℃、5%CO2)内でインキュベートした。培地は3日間、一日1回交換した。DNA含量を分析するために、試料(n=4)を画像化して収集した。2.5×105細胞を用いて作製したCMBは凝集能が最も高い(図1〜2)ためすべての実験で使用した。
CMBの成熟度を調べるために、CMBを培地中でインキュベートし、遠心分離後1日目に開始して9日間まで、一日おきに収集した。CMBを10%ホルマリンで固定した、またはトリゾール中に保管した(n=4)。CMBの融合能を検査するために、遠心分離後1日目、3日目、5日目、7日目および9日目に、3個のCMBをポリジメチルシロキサン(PDMS)ウェル(直径3mm、深さ2mm)の内側に押しつけた。融合CMBをさらに7日間培養した。CMBの融合をパラフィン切片で組織学的に調べた。
関節軟骨の製作。
円柱状の関節軟骨を製作するために、(3日目、5日目または7日目)のCMBを8個、内径4mm×厚さ4.5mmのPDMS環内に置いた。脱細胞化骨梁マトリックス足場(内径4mm×厚さ4mm)を2個、CMBの上部の環の内部に押しつけた。CMBは互いに融合し、多孔質足場の内側に浸透して、足場上に(軟骨領域)厚さ500μmの細胞層を有する構築物を作り、軟骨下領域に浸透した(図22〜23)。この構築物を5週間培養し、機械的分析(n=4)、生化学的分析(n=4)および組織学的分析を行った。
円柱状の関節軟骨を製作するために、(3日目、5日目または7日目)のCMBを8個、内径4mm×厚さ4.5mmのPDMS環内に置いた。脱細胞化骨梁マトリックス足場(内径4mm×厚さ4mm)を2個、CMBの上部の環の内部に押しつけた。CMBは互いに融合し、多孔質足場の内側に浸透して、足場上に(軟骨領域)厚さ500μmの細胞層を有する構築物を作り、軟骨下領域に浸透した(図22〜23)。この構築物を5週間培養し、機械的分析(n=4)、生化学的分析(n=4)および組織学的分析を行った。
解剖学的な関節軟骨を製作するために、ヒト顆の3D画像を患者(現行のIRBに従って、画像を完全に匿名化した)から撮ったCTスキャンから取得した。厚さ1mmの軟骨領域を顆の関節面の上に作製した。PDMSモールドを、3Dプリンティングした、軟骨層を有する顆から製作し、足場を保持するための1片と、CMBのプレス成形のために関節軟骨側を保持するための別の1片との2片に切断した。3日目のCMB(n=120)を関節軟骨側でモールドの内側に置いた。CMBを融合させ、細胞浸透を足場に誘導するために、前述の通り、脱細胞化骨梁から作製した解剖学的なヒト顆足場をPDMSモールドの内側にフィットさせ、PDMSモールドの関節軟骨側の上まで下げた。構築物を10mlの培地で5週間培養し、培養中1週間に2回培地を変えた。
トリゾール法を用いて、メーカーの説明書に従ってRT−PCR RNAを精製した。
TaqMan(登録商標)プライマー(Life Technologies(商標)、CA)とともにリアルタイムPCR機械を使用して、間葉凝集転写因子(SOX9とHOXA2)、細胞接着遺伝子(CDH2)および凝集細胞外マトリックス遺伝子(FN1、TNCとSDC3)を定量化した。
TaqMan(登録商標)プライマー(Life Technologies(商標)、CA)とともにリアルタイムPCR機械を使用して、間葉凝集転写因子(SOX9とHOXA2)、細胞接着遺伝子(CDH2)および凝集細胞外マトリックス遺伝子(FN1、TNCとSDC3)を定量化した。
固定化後の免疫蛍光および免疫組織化学染色、試料は、Immunocal溶液(脱細胞化骨足場を含んでいる場合)で脱灰し、パラフィン包埋して、厚さ5μmの切片に切断した。この切片をGAGおよびトリクロームについてヘマトキシリンとエオジン(H&E)、アルシアンブルーで染色した。試料をI型コラーゲン、II型コラーゲン、X型コラーゲンおよびラブリシン(Abcam,MA)についても免疫組織化学的に染色した。N−カドヘリンとテネイシン抗体(Millipore,MA)を免疫蛍光染色のために使用した。
前述の通り、生化学的分析DNA、GAGおよびヒドロキシプロリンの含量を測定した。手短に述べると、軟骨領域と軟骨下領域を多孔質の脱細胞化骨足場の平面に沿って分離し、湿重量を決定した。試料(群当たりn=4)を50℃で、0.5mlのプロテイナーゼK溶液中で消化した。Picogreenアッセイ(Molecular Probes,OR)を用いてDNA含量を決定した。抽出物の硫酸化GAG(s−GAG)含量は、基準としてコンドロイチン−6−硫酸とともに1,9−ジメチルメチレンブルー(DMMB)染料比色アッセイを用いて決定した。ヒドロキシプロリン含量を酸加水分解で測定した。関節軟骨の機械的試験、軟骨の圧縮ヤング率を前述の通り、PBS中で一軸圧縮を用いて測定した。円柱状構築物を最高3,000秒間まで、0.01%ひずみ/秒で圧縮し、次いで圧縮荷重を測定した。ヤング率を応力−ひずみ曲線の線形勾配から算出した。
軟骨とガラスの間の摩擦係数を前述の通り、一軸圧縮で、PBS浴中で測定した。連続する往復摺動を1mm/秒の速度および平行移動範囲±10mmで使用した。軟骨の法線力、摩擦力および軸変形を試験の間、モニターした。すべての検査は、1,800秒後に終えた。時間依存摩擦係数(μeff)を摩擦力対法線力の比率で算出した。最小摩擦係数(μmin)および平衡摩擦係数(μeq)は、それぞれμeffの最小値と、実験終了時に達した値を表した。
統計的分析の結果のペアワイズ比較を、多元分散分析(ANOVA)を用いて行い、続いてPrismソフトウェアを使用し、0.05のaで、テューキーの多重比較検定を行った。
CMBの生成と融合。
CMBを生成するために、hMSCを軟骨形成培養液(10ng/mLのTGF−β3、100nMデキサメタゾン、50μg/mLのアスコビル酸−2−リン酸、100μg/mLのピルビン酸ナトリウム、40μg/mLのプロリン、1%インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム(ITS)+混合物、および1%ペニシリン−ストレプトマイシンを補充した高グルコースDMEM)に懸濁させた。CMBの最適規模を決定するために、hMSCを105、2.5×105、5×105、106、1.5×106および2×106細胞/mLの濃度で懸濁させた。1ミリリットルの細胞懸濁液を深い丸底の96ウェルプレート(NUNC;Sigma−Aldrich)に等分し、次いで250×gで5分間遠心させた(図3)。細胞を制御された加湿チャンバー[37℃、5体積% CO2]内でインキュベートした。培地は3日間まで、一日1回交換した。DNA含量を分析するために、試料を画像化して収集した(n=4)。2.5×105細胞を用いて作製したCMBは、その凝集能およびコンパクトな球状CMBの形成のためにすべての実験で使用した。CMBの発達と成熟度を調べるために、CMBを培地中でインキュベートし、遠心分離後1日目に開始して9日間まで、一日おきに収集した。CMBを組織学的および免疫組織化学分析のために10体積%ホルマリンで固定した、または遺伝子発現分析のためにトリゾール中に保管した(n=4)。CMBの融合能を検査するために、遠心分離後、1日目、3日目、5日目、7日目および9日目に、3個のCMBをポリジメチルシロキサン(PDMS)ウェル(直径3mm、深さ2mm)の内側にステンレス鋼ブロックで押しつけ(図3)、5週間まで培養して、組織学的評価を行った。
CMBを生成するために、hMSCを軟骨形成培養液(10ng/mLのTGF−β3、100nMデキサメタゾン、50μg/mLのアスコビル酸−2−リン酸、100μg/mLのピルビン酸ナトリウム、40μg/mLのプロリン、1%インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム(ITS)+混合物、および1%ペニシリン−ストレプトマイシンを補充した高グルコースDMEM)に懸濁させた。CMBの最適規模を決定するために、hMSCを105、2.5×105、5×105、106、1.5×106および2×106細胞/mLの濃度で懸濁させた。1ミリリットルの細胞懸濁液を深い丸底の96ウェルプレート(NUNC;Sigma−Aldrich)に等分し、次いで250×gで5分間遠心させた(図3)。細胞を制御された加湿チャンバー[37℃、5体積% CO2]内でインキュベートした。培地は3日間まで、一日1回交換した。DNA含量を分析するために、試料を画像化して収集した(n=4)。2.5×105細胞を用いて作製したCMBは、その凝集能およびコンパクトな球状CMBの形成のためにすべての実験で使用した。CMBの発達と成熟度を調べるために、CMBを培地中でインキュベートし、遠心分離後1日目に開始して9日間まで、一日おきに収集した。CMBを組織学的および免疫組織化学分析のために10体積%ホルマリンで固定した、または遺伝子発現分析のためにトリゾール中に保管した(n=4)。CMBの融合能を検査するために、遠心分離後、1日目、3日目、5日目、7日目および9日目に、3個のCMBをポリジメチルシロキサン(PDMS)ウェル(直径3mm、深さ2mm)の内側にステンレス鋼ブロックで押しつけ(図3)、5週間まで培養して、組織学的評価を行った。
円柱状軟骨プラグの生成。
(3日目、5日目または7日目)のCMBを8個、PDMS環(内径4mm×高さ4.5mm)の内側に置いた。脱細胞化円柱状の骨梁マトリックス足場(直径4mm×高さ4mm)を前述の通り処理し、CMBの上部の環の内部に押しつけた。骨軟骨構築物を、その骨部分をCMB層内に押しつけることによって形成した。モールドの内部形態は軟骨層の形成のための0.5mmの空き空間があり、一つの試料から別の試料への加圧が一貫して維持された。CMB層をステンレス鋼ブロック上に押しつけることによって軟骨層を再現性よく形成することができたが、CMBの自然融合によって加圧せずに軟骨層を再現性よく形成することはできなかった。構築物を5週間培養し、機械的分析(n=4)、生化学的分析(n=4)および組織学的分析(n=4)を行った。
(3日目、5日目または7日目)のCMBを8個、PDMS環(内径4mm×高さ4.5mm)の内側に置いた。脱細胞化円柱状の骨梁マトリックス足場(直径4mm×高さ4mm)を前述の通り処理し、CMBの上部の環の内部に押しつけた。骨軟骨構築物を、その骨部分をCMB層内に押しつけることによって形成した。モールドの内部形態は軟骨層の形成のための0.5mmの空き空間があり、一つの試料から別の試料への加圧が一貫して維持された。CMB層をステンレス鋼ブロック上に押しつけることによって軟骨層を再現性よく形成することができたが、CMBの自然融合によって加圧せずに軟骨層を再現性よく形成することはできなかった。構築物を5週間培養し、機械的分析(n=4)、生化学的分析(n=4)および組織学的分析(n=4)を行った。
解剖学的形状軟骨の生成。
解剖学的ヒト顆の3D画像を、前述の調査のように患者のCTスキャンから取得した。顆の関節面を覆うために、厚さ1mmの軟骨領域を、再構築した3D画像から設計した。上述の骨軟骨プラグに関しては、軟骨層の形成のための1mmの空き空間を備えたモールドを用いることによって、解剖学的形状の構築物を、その骨部分をCMB層内に押しつけることによって形成した。PDMSモールドを作製し、足場を保持するための1片と、CMBのプレス成形のために関節軟骨側を含有するための別の1片との2片に切断した(図11)。計120個のCMB(3日目)を関節軟骨側でモールドの内側に置いた。CMBを融合させ、足場内への細胞浸透により解剖学的形状にCMBを成形するために、前述の通り、脱細胞化骨梁から解剖学的ヒト顆足場を作製し、PDMSモールドの内側にフィットさせ、PDMSモールドの関節軟骨側の上まで下げた。構築物を5週間培養し、1週間に2回培地を変えた。
解剖学的ヒト顆の3D画像を、前述の調査のように患者のCTスキャンから取得した。顆の関節面を覆うために、厚さ1mmの軟骨領域を、再構築した3D画像から設計した。上述の骨軟骨プラグに関しては、軟骨層の形成のための1mmの空き空間を備えたモールドを用いることによって、解剖学的形状の構築物を、その骨部分をCMB層内に押しつけることによって形成した。PDMSモールドを作製し、足場を保持するための1片と、CMBのプレス成形のために関節軟骨側を含有するための別の1片との2片に切断した(図11)。計120個のCMB(3日目)を関節軟骨側でモールドの内側に置いた。CMBを融合させ、足場内への細胞浸透により解剖学的形状にCMBを成形するために、前述の通り、脱細胞化骨梁から解剖学的ヒト顆足場を作製し、PDMSモールドの内側にフィットさせ、PDMSモールドの関節軟骨側の上まで下げた。構築物を5週間培養し、1週間に2回培地を変えた。
軟骨欠損モデル。
骨軟骨外植片を2月齢〜4月齢のウシの手根中手関節の中心から切り離し、円柱(直径4mm×厚さ4〜6mm)に切断した。外植片の中心で軟骨片を取り除くことによって軟骨欠損モデルを形成し、1.5mmの生検パンチによって軟骨環を生成しながら、軟骨下骨をそのまま残した。4個のCMBを軟骨の空隙内に置き、平らなステンレス鋼ブロックで押しつけることによって詰めた(図19)。構築物を軟骨形成培養液中または増殖培地(陰性対照)中で5週間培養し、機械的分析(n=4)および組織学的分析(n=4)を行った。
骨軟骨外植片を2月齢〜4月齢のウシの手根中手関節の中心から切り離し、円柱(直径4mm×厚さ4〜6mm)に切断した。外植片の中心で軟骨片を取り除くことによって軟骨欠損モデルを形成し、1.5mmの生検パンチによって軟骨環を生成しながら、軟骨下骨をそのまま残した。4個のCMBを軟骨の空隙内に置き、平らなステンレス鋼ブロックで押しつけることによって詰めた(図19)。構築物を軟骨形成培養液中または増殖培地(陰性対照)中で5週間培養し、機械的分析(n=4)および組織学的分析(n=4)を行った。
解剖学的足場およびバイオリアクターチャンバーの製作。
移植片は、修復される欠損の磁気共鳴画像またはコンピュータ断層撮影画像に基づいて設計する。個々のスライスをMimics(登録商標)Innovation Suite(Materialise,Belgium)などのコンピュータ支援ソフトウェアを用いて、3次元(3D)ファイルに変換する。再構築される移植片のために正確な解剖学的適合を定義した後に、移植片の3Dコンピュータモデルを.STLファイルとしてエクスポートし、足場およびバイオリアクターのマッチングインナーチャンバーの製作で使用する。
移植片は、修復される欠損の磁気共鳴画像またはコンピュータ断層撮影画像に基づいて設計する。個々のスライスをMimics(登録商標)Innovation Suite(Materialise,Belgium)などのコンピュータ支援ソフトウェアを用いて、3次元(3D)ファイルに変換する。再構築される移植片のために正確な解剖学的適合を定義した後に、移植片の3Dコンピュータモデルを.STLファイルとしてエクスポートし、足場およびバイオリアクターのマッチングインナーチャンバーの製作で使用する。
解剖学的足場を製作するためには、3DモデルSTLファイルをSolidWorks(Dassault Systems SolidWorks,MA,USA)にインポートし、材料のブロックから解剖学的足場をミリングするためのGコードをSolidWorksのアドインのMasterCAM(CNC Software Inc.,CT,USA)を使用して作成する。本検討で使用した足場材料は、子牛の膝から筋肉、膝蓋骨、線維性結合組織、靭帯および半月板を取り除いた後採取し、露出した大腿骨頭だけを残したウシ骨梁であった。卓上バンドソーを使用して、関節軟骨と皮質骨を取り除いて、海綿状骨梁を分離した。旋盤(LittleMachineShop,CA,USA)を使用して、機械加工の間、ブロックを保持するのに十分な構造であるように、直径が3D移植片モデルの幅よりも少し大きく、長さが3D移植片モデルよりもおよそ3cm長い円柱状ブロックに海綿骨を成形した。4枚刃1/4”ボールエンドミル(McMaster−Carr,NJ,USA)を使用して、4軸CNCフライス盤(LittleMachineShop,CA,USA)で円柱状骨ブロックから解剖学的骨足場を成形した。解剖学的形状の骨ブロックは、以前に確立した方法を用いて低張液、界面活性剤(複数回洗浄)およびDNAse/RNAse溶液を使用して完全に脱細胞化した。
次いで、各解剖学的移植片と同じ3D画像を使用して、骨軟骨構築物を培養するための内側バイオリアクターチャンバーを製作するためのモールドを設計した。SolidWorksで関節面の形状を設定するための表面選択ツールを使用することで、望ましい軟骨の厚さを関節面にわたって確立した。望ましい厚さはほとんどの場合、1mm以上であった。次いで、Gコードを作成して、構築物を保持するTeflonロッド(McMaster−Carr,NJ,USA)をミリングした。次いで、ミリングした部分を使用して、SylGard(登録商標)184 Silicone Elastomer(Dow Corning,MI,USA)をミリングした構造に注いでネガ型モールドを作製した。硬化してすぐ、シリコーン樹脂を、脱細胞化骨足場を保持するための1片と、モールド内部で関節面に押しつけられることになる凝集間葉体(CMB)を保持するための別の1片との2片に切断した。ツーピースモールドを高圧蒸気滅菌法で滅菌した。この処理の主要なステップを図27に模式的に示す。
骨髄由来の間葉系幹細胞の調製。
新鮮なヒト骨髄穿刺液を整形外科(完全に非特定化された外科材料については非ヒトIRBを通して)から、または市販供給元、例えばCambrex(NJ,USA)からのいずれかで入手した。間葉系幹細胞(BMSC)は、細胞培養プラスチック製品に付着させることによって分離し、10%FBS、1%pen−strepおよび0.1ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を補充したDMEM中で増殖させた。細胞を第3継代まで培養し、多系列分化能を検査した。
新鮮なヒト骨髄穿刺液を整形外科(完全に非特定化された外科材料については非ヒトIRBを通して)から、または市販供給元、例えばCambrex(NJ,USA)からのいずれかで入手した。間葉系幹細胞(BMSC)は、細胞培養プラスチック製品に付着させることによって分離し、10%FBS、1%pen−strepおよび0.1ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を補充したDMEM中で増殖させた。細胞を第3継代まで培養し、多系列分化能を検査した。
凝集間葉体の生成。
トリプシン処理後、100nMデキサメタゾン、50μg/mlのアスコビル酸−2−リン酸、100μg/mlのピルビン酸ナトリウム、40μg/mlのプロリン、1%インスリンと、トランスフェリンと、亜セレン酸ナトリウム(ITS+)との混合物、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および10ng/mlのトランスフォーミング増殖因子−β3(TGF−β3)を補充した高グルコースDMEMからなる軟骨形成培養液に5×105細胞/mlの濃度でBMSCを懸濁させた。1mlの細胞懸濁液を深い丸底の96ウェルプレート(NUNC(登録商標)、Sigma−Aldrich,MO)のウェルに加え、25gで5分間遠心させた。細胞を37℃/5% CO2で一晩インキュベートして、球状CMBを形成し、これを骨軟骨組織構築物の軟骨層を生成するために用いた。
トリプシン処理後、100nMデキサメタゾン、50μg/mlのアスコビル酸−2−リン酸、100μg/mlのピルビン酸ナトリウム、40μg/mlのプロリン、1%インスリンと、トランスフェリンと、亜セレン酸ナトリウム(ITS+)との混合物、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および10ng/mlのトランスフォーミング増殖因子−β3(TGF−β3)を補充した高グルコースDMEMからなる軟骨形成培養液に5×105細胞/mlの濃度でBMSCを懸濁させた。1mlの細胞懸濁液を深い丸底の96ウェルプレート(NUNC(登録商標)、Sigma−Aldrich,MO)のウェルに加え、25gで5分間遠心させた。細胞を37℃/5% CO2で一晩インキュベートして、球状CMBを形成し、これを骨軟骨組織構築物の軟骨層を生成するために用いた。
組織構築物の製作。
3日の培養の後、球状CMBは直径がちょうど1mmを超えるまで成長する。各構築物で使用したCMBの数は、式Iを用いて設計することが必要な軟骨層の体積から算出することができる。
3日の培養の後、球状CMBは直径がちょうど1mmを超えるまで成長する。各構築物で使用したCMBの数は、式Iを用いて設計することが必要な軟骨層の体積から算出することができる。
例えば、表面積が1cm2で、厚みが1mmの関節軟骨の層の場合、モールドの関節側に移される190個のCMBが必要になるだろう。次いで、解剖学的足場をモールドの他方側に挿入して、関節側にゆっくり押しつける(図28)。圧縮力をかけることによってCMBを互いに融合させて、関節面上に均一の深さで成形させる。十分な量の融合CMBが骨相に浸透して、形成軟骨と骨の間を統合させることが重要である。骨軟骨組織構築物を軟骨形成培地で5週間培養した。培地は、CMB当たり100μlの量を使用し、1週間に2回交換した。
プレス形成の後、融合CMBは、モールド内部の骨基質の表面に高密度細胞層を形成した。最初の構築物は、(i)培養に続いて軟骨面を形成する高密度細胞層と、(ii)骨基質との明らかに区別される2つの層からなっていた。骨基質に融合CMBが浸透すると界面が生成され、層状構造が形成されることによってこれらの2つの層が徐々に組み合う。
軟骨形成培地での5週間の培養後、軟骨組織の高密度層、その下の骨組織、その間の界面を有する骨軟骨組織構築物が形成される(図29)。これらの構築物は、軟骨から骨領域まで構造特性と組成特性の天然様勾配を有する非常に発達した層状構造を示した。軟骨領域は、グリコサミノグリカンと、天然の関節軟骨の主成分であるII型コラーゲンとが豊富にあったが、I型コラーゲンは主に骨領域に存在していた(図29)。特に、関節軟骨面の潤滑に不可欠なタンパク質であるラブリシンは、軟骨層の表在面に存在していた。
界面は、最小限の量のグリコサミノグリカンとII型コラーゲンだけを沈着させ、代わりにI型コラーゲンとX型コラーゲに囲まれていた足場孔に存在する細胞からなっており、石灰化軟骨の形成を示していた。
本方法は、初めて、ヒトMSCから作られた軟骨をもたらし、生理学的範囲で機械的性質を達成した。圧縮で測定されたヤング率および培養軟骨のトライボロジー検討で測定された摩擦係数の双方とも若い天然軟骨で測定されたそれらと同等であった(表3)。
本明細書に記載の方法は、四肢発生の間、軟骨形成に先立つ、間葉凝集の自然過程の基礎をなす機序に特に関してBMSCの自己組織化の機序を利用している。本技術は、BMSC凝集による外部境界域の凝固の理解を必要とする。球状細胞体を形成した後に、BMSCは、細胞外マトリックスを分化させて、沈着し始める。このマトリックスの主要な成分の一つはテネイシンであり、これは組織境界域を凝固する間葉凝集の間、沈着される境界域凝固タンパク質である。
in vitroでのBMSC凝集の間、テネイシンは、凝集後5日目までに、球状体の外面で周辺を蓄積し始める。これは境界域凝固の表示であった。間葉体が互いに押しつけられるときでも、間葉体上の外部境界域の凝固によって間葉体の融合が阻止された。次に、これが示唆するのは、球状形成から5日以内に融合が誘導される場合のみ、大量の軟骨が単独で、または骨軟骨構築物の内部で生成されることがあり得ることである。
実際、BMSCの凝集によって形成される間葉体のプレス成形(図28)により、高密度で空間的に均一な細胞層になる。この高密度細胞層は、自然の間葉凝集の間、in vivoで形成され、および軟骨形成のプラットフォームとして役立つ層に似ている。in vitroで、極めて高い細胞密度のこれらの緻密層は、細胞外マトリックスの急速な沈着を誘導する。その結果、培養組織は機械的強度が強くなり、ヤング率と摩擦係数の両方が生理学的レベルに達した(表3)。同時に、緻密細胞層は、表面にラブリシン、バルク相にプロテオグリカンとII型コラーゲン、骨基質との界面でX型コラーゲン、および骨相内にI型コラーゲンを含有している生理的層状軟骨に発達した(図29)。
このように、骨基質との界面でBMSCから形成された間葉体の融合は、生理学的組成物、組織形態および機械的性質とともにヒト骨軟骨組織構築物を生成する効果的な方法であり得る。このアプローチにより、BMSCから生成されたヒト軟骨が生理学的な剛性および摩擦係数に達することを可能にする。また、本方法は、画像誘導製造によって作製された足場を使用して、生成される解剖学的形状骨軟骨構築物の工学技術を可能にする。
厚さが2mmの軟骨層の軟骨面1cm2の再構築には、ほぼ1億のBMSCが必要である。顆全体を再構築するには、何億もの細胞が必要である。この数を減らすために、間葉凝集を、足場の使用および脂肪組織などの容易に利用でき豊富な間葉系細胞源の利用と組み合わせてもよい。
本開示の主題は、いくつかの例示的な実施形態の観点から本明細書に記載されているが、当業者は、その範囲から逸脱することなく、本開示の主題に対して種々の修正および改善がなされ得ることを認識するであろう。さらに、本開示の主題の一実施形態の個々の特徴は、本明細書に述べられているか、または該一実施形態の図面に示されていて、別の実施形態には述べられていない場合があるが、一実施形態の個々の特徴が別の実施形態の1または複数の特徴、または複数の実施形態からの特徴と組み合わせ得ることが明らかであろう。
以下に主張する具体的な実施形態に加えて、本開示の主題は、以下に主張する従属特徴と上に開示の特徴との任意の他の可能な組み合わせを有する他の実施形態にも関する。ということで、従属クレームに提示し、および上に開示の特定の特徴は、本開示の主題の範囲内で、他の方法で互いに組み合わせることが可能であり、したがって本開示の主題は他の可能な組み合わせを有する別の実施形態にも本質的に関すると認識されるべきである。したがって、本開示の主題の具体的な実施形態についての上述の記載は、例示と説明を目的として提示されている。本開示の主題は開示した実施形態を網羅している、またはそれに限定されることを意図するものではない。
種々の修正および変更が本開示の主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、本開示の主題の方法およびシステムになされ得ることは当業者には明らかであろう。したがって、本開示の主題は添付の特許請求の範囲および均等物の範囲内にある修正および変更を含むことを意図している。
Claims (25)
- 約800kPaを超えるヤング率と、約0.3未満の平衡摩擦係数とを有する培養ヒト軟骨を含む医療機器。
- 前記培養ヒト軟骨が骨基質に付着される、請求項1に記載の医療機器。
- 前記培養ヒト軟骨が解剖学的形状である、請求項1に記載の医療機器。
- 前記培養ヒト軟骨がセンチメートルの大きさである、請求項1に記載の医療機器。
- 前記培養ヒト軟骨が生理学的層状化特性を含む、請求項1に記載の医療機器。
- 前記培養ヒト軟骨が剛性およびトライボロジー的性質を有する、請求項1に記載の医療機器。
- 前記培養ヒト軟骨が送達デバイスに配置される、請求項1に記載の医療機器。
- 前記送達デバイスがペン型注入器である、請求項7に記載の医療機器。
- 前記骨基質が顆の関節面である、請求項2に記載の医療機器。
- 前記顆が患者の解剖学的ヒト顆に相当し、および前記医療機器が前記患者用に個別化された骨軟骨組織構築物である、請求項9に記載の医療機器。
- 骨様マトリックスと、
凝集間葉体と
を含む、解剖学的足場。 - 前記凝集間葉体が前記骨様マトリックス上に配置される高密度細胞層を形成する、請求項11に記載の足場。
- 前記凝集間葉体の高密度細胞層および前記骨様マトリックスが層状構造体を形成する、請求項12に記載の足場。
- 前記骨様マトリックスが脱細胞化骨である、請求項11に記載の足場。
- 前記脱細胞化骨が多孔質であり、および前記凝集間葉体が細孔内に分散している、請求項14に記載の足場。
- 前記骨様マトリックスがリン酸カルシウムまたはヒドロキシアパタイトを含む多孔質材料である、請求項11に記載の足場。
- 凝集間葉体を形成するためにヒト間葉系幹細胞を培養することと、
前記凝集間葉体を骨基質上に付着させることと
を含む骨軟骨構築物を生成する方法。 - 前記凝集間葉体が前記骨基質に浸透する、請求項15に記載の方法。
- 前記凝集間葉体が前記骨基質上に高密度層を形成する、請求項15に記載の方法。
- 前記骨軟骨構築物が約800kPaを超えるヤング率を有する、請求項15に記載の方法。
- 前記骨軟骨構築物が約0.3未満の平衡摩擦係数を有する、請求項15に記載の方法。
- 凝集間葉体を形成するためにヒト間葉系幹細胞を培養することと、
前記凝集間葉体を骨基質上に付着させることと
を含む移植片を生成するための方法であって、
前記移植片が約800kPaを超えるヤング率と、約0.3未満の平衡摩擦係数とを有する方法。 - 軟骨欠損または半月板欠損または腱欠損を治療する方法であって、凝集間葉体を前記欠損に適用することを含む、方法。
- 前記適用するステップが前記凝集間葉体を前記欠損に注入することを含む、請求項23に記載の方法。
- 前記凝集間葉体がペン型注入器を用いて注入される、請求項24に記載の方法。
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