CN116034987A - 组织和细胞的保存液、细胞分离方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种神经和/或细胞的保存液和细胞分离方法。本发明提供的保存液包括山梨醇、葡萄糖、代谢调节剂、酸碱调节剂和等渗剂。本发明还提供了包括该保存液的试剂盒。本发明还提供了该保存液和细胞分离方法在神经组织细胞特别是成年神经细胞分离中的应用。本发明通过优化神经组织细胞保存液的配方，简化了神经组织的细胞分离步骤，缩短了分离时间，从而得到高活性的单细胞悬液，可用于后续的单细胞分析。

Description

组织和细胞的保存液、细胞分离方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种组织和/或细胞的保存液、细胞分离方法及其在神经组织细胞分离中的应用。

背景技术

在生物医学科学研究领域，对组织器官功能的研究逐渐深入到组织器官内单个细胞的分子水平，各种针对单细胞的分析技术如单细胞转录组测序、单细胞转座酶可及染色质(ATAC)测序，甚至是单细胞代谢组分析等逐渐取代了组织水平的平均分析。单细胞分析对于揭示肿瘤细胞异质性、发育过程中特定结构形成、神经组织内各种细胞相互作用等发挥重要作用，正成为生命科学研究的焦点技术。

但是，在成年神经组织中，由于神经元之间已经建立起较长的突起连接(轴突和树突等)，与神经元相互作用的其他类型细胞的紧密连接也已经形成，在分离神经组织的过程中，打断这些连接，会造成大部分神经细胞的死亡，因此无法获得有活性的足够数量的单细胞悬液。而在胚胎阶段和出生后阶段的神经组织，由于神经细胞轴突和树突的发育尚不成熟，突起再生能力强，连接较弱，即使打断后，细胞胞体仍然具有重新长出突起的能力，因此更容易获取高活性和足够数量的神经细胞。因此，如何解离成年阶段神经组织，获取高质量的单细胞悬液用于单细胞测序等分析，成为神经科学研究的难点。

目前已报道的一些分离成年神经细胞的方法，主要采用将成年大脑切片，采用人工脑脊液孵育脑片并消化吹打成单细胞的方法。这种步骤繁杂，耗时长，分离出的单细胞悬液碎片较多。更重要的是，用这种方法分离出的单细胞活力较差，即使孵育过程中不使用TTX等离子通道阻断剂减少神经元的死亡，也无法支持后续的细胞培养等实验。

发明内容

本发明针对神经组织特别是成年神经组织解离的难点，研制出一种可以较长时间保存组织和细胞活力的保存液。本发明还提供了一种高效、快速且低成本的细胞分离方法，可用于实验室人工分离神经组织制备单细胞悬液，进而用于细胞培养、单细胞测序分析等多种用途。

在第一方面，本发明提供了一种组织和/或细胞的保存液，其包括山梨醇、葡萄糖、代谢调节剂、酸碱调节剂和等渗剂。该液体对小块神经组织和细胞的活性均有很好的保存效果。

在一些实施方式中，所述代谢调节剂选自牛磺酸、丙酮酸钠或肌酸中的至少一种。在一些优选实施方式中，所述代谢调节剂为丙酮酸钠。

在一些实施方式中，所述酸碱调节剂选自磷酸、氢氧化钾、氢氧化钠中的至少一种。在一些优选实施方式中，所述酸碱调节剂为氢氧化钠。

在一些实施方式中，所述等渗剂选自氯化镁、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾中的至少一种。在一些优选实施方式中，所述等渗剂为氯化钾、氯化镁和磷酸二氢钠。在一些实施例中，所述磷酸二氢钠为无水磷酸二氢钠。在一些实施例中，所述氯化镁为六水氯化镁。

在一些实施方式中，所述山梨醇的浓度为100-300mM，例如为100mM、120mM、150mM、180mM、200mM、220mM、250mM、280mM、300mM或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述山梨醇的浓度为150-250mM，更优选为180-220mM。

在一些实施方式中，所述葡萄糖的浓度为1-50mM，例如为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述葡萄糖的浓度为2-10mM，更优选为4-8mM。

在一些实施方式中，所述代谢调节剂的浓度为5-100mM，例如为5mM、20mM、40mM、60mM、80mM、100mM或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述代谢调节剂的浓度为10-50mM，更优选为15-25mM。

在一些实施方式中，所述酸碱调节剂的浓度为1-20mM，例如为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述酸碱调节剂的浓度为1-10mM，更优选为2-8mM。

在一些实施方式中，所述等渗剂的浓度为0.5-200mM，例如为0.5mM、5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM或它们之间的任意值。在一些实施方式中，所述等渗剂的浓度为0.5-100mM，更优选为0.5-50mM。

在一些实施方式中，所述保存液包括山梨醇、葡萄糖、丙酮酸钠、氢氧化钠、氯化钾、氯化镁和磷酸二氢钠。

在一些实施方式中，所述山梨醇的浓度为100-300mM，例如为100mM、120mM、150mM、180mM、200mM、220mM、250mM、280mM、300mM或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述山梨醇的浓度为150-250mM，更优选为180-220mM。

在一些实施方式中，所述葡萄糖的浓度为1-50mM，例如为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述葡萄糖的浓度为2-10mM，更优选为4-8mM。

在一些实施方式中，所述丙酮酸钠的浓度为5-100mM，例如为5mM、20mM、40mM、60mM、80mM、100mM或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述丙酮酸钠的浓度为10-50mM，更优选为15-25mM。

在一些实施方式中，所述氢氧化钠的浓度为1-20mM，例如为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述氢氧化钠的浓度为1-10mM，更优选为2-8mM。

在一些实施方式中，所述氯化钾的浓度为5-100mM，例如为5mM、20mM、40mM、60mM、80mM、100mM或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述氯化钾的浓度为10-50mM，更优选为20-40mM。

在一些实施方式中，所述磷酸二氢钠的浓度为1-20mM，例如为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述磷酸二氢钠的浓度为1-10mM，更优选为2-8mM。

在一些实施方式中，所述氯化镁的浓度为0.1-5mM，优选为0.1-2mM，更优选为0.2-1mM。例如为0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM或它们之间的任意值。在一些优选实施方式中，所述葡萄糖的浓度为0.2-1mM，更优选为0.4-0.8mM。

在一些实施方式中，所述保存液包括30mM氯化钾、5mM氢氧化钠、5mM无水磷酸二氢钠、0.5mM六水合氯化镁、20mM丙酮酸钠、5.5mM葡萄糖和200mM山梨醇。在一些实施方式中，所述保存液经氢氧化钠调节pH至7.3-7.4，经0.22μm的滤膜过滤。

在一些实施方式中，所述保存液的pH为7.0-7.5，优选为7.3-7.4。

在一些实施方式中，所述细胞包括来源于非人哺乳动物或人类的脑组织或神经系统。

在一些实施方式中，所述细胞包括神经元、星型胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞、少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞或小胶质细胞中的至少一种。

在第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的保存液。

在第三方面，本发明提供了一种细胞分离方法，其包括利用第一方面所述的保存液或第二方面所述的试剂盒对离体组织进行细胞分离，获得单细胞。

在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)将离体组织置于在所述保存液的存在下进行剪碎，获得剪碎的离体组织；

(2)将DNA酶和木瓜蛋白酶与所述剪碎的离体组织混合，对破碎的离体组织进行行消化和吹打，获得细胞混悬液；

(3)对步骤(2)获得的细胞混悬液进行离心处理，得到单细胞悬液。

在一些实施方式中，步骤(2)中，所述木瓜蛋白酶为激活的木瓜蛋白酶。在一些实施方式中，所述激活的木瓜蛋白酶通过将与基础培养基混合后的木瓜蛋白酶混悬液在35℃-40℃中孵育10-30min获得。

在一些实施方式中，步骤(2)中，所述消化的时间为10-30min，例如为10min、15min、20min、25min、30min或它们之间的任意值。优选地，所述消化中，每5-10分钟混合一次。

在一些实施方式中，步骤(2)中，所述吹打包括先使用直径为200-500μm的玻璃管吹打，再使用直径为100-200μm的玻璃管吹打。优选地，所述玻璃管选自硅化巴斯德玻璃管。

在一些实施方式中，步骤(3)中，所述离心包括在1000-2000g离心5-10min，优选在1200-1500g离心5-6min。在一些实施方式中，所述离心的次数为1-5次。在一些实施方式中，所述离心为密度梯度离心。在一些实施方式中，若需流式细胞仪进行细胞分选，可重复密度梯度离心步骤来提高流式分选效率。

在一些实施方式中，所述细胞包括来源于非人哺乳动物或人类的脑组织或神经系统。

在一些实施方式中，所述细胞包括神经元、星型胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞、少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞或小胶质细胞中的至少一种。

本发明通过优化保存液的配方，简化了神经组织的细胞分离步骤，缩短了分离时间，从而得到高活性的单细胞悬液，可用于后续的单细胞分析。

与现有的成年神经细胞分离方法不同的是，本申请运用具有冬眠作用的神经组织细胞保存液，使离体神经组织和细胞可以在较长时间仍保持活力，对组织碎片和分离出的神经细胞有很好的保存效果，对于神经组织碎片可保存超过24小时仍能分离出较多活细胞，而保存分离出的单细胞悬液可达7天仍然有50％的细胞存活率。同时，在分离步骤上，优化了对组织块的消化时间和吹打方式，将消化时间缩短到15-20分钟，使从组织块到单细胞悬液的操作时间缩减到35-40分钟左右，从而实现了快速而高效的组织细胞分离。使消化后的单细胞悬液中活细胞比例占总细胞数量的90％以上。此外，该方法也适用于微量脑组织(0.5-10mg)的单细胞分离，从而克服了现有分离技术只能用于大量神经组织(大于10mg)的情况。

在第三方面，本发明提供了第一方面所述的保存液、第二方面所述的试剂盒或第三方面所述的细胞分离方法在神经组织细胞分离中的应用。

在一些实施方式中，所述神经组织细胞为成年个体的神经组织细胞。

相比于现有技术，本发明具有如下的有益效果：

(1)与现有技术例如国际上美天旎gentleMACS全自动组织处理器和国内瑞沃德单细胞悬液制备仪相比较，本方法采用全手工操作，熟练者可同时操作4-6管样品，分离成本与同类机器和配套消化液等产品相比，成本大大下降。与人工脑脊液作为孵育液的同类方法相比，本方法分离过程中不需要使用钠离子通道阻断剂，不需要NMDA和AMPA受体阻断剂的使用，因而使成本也低于同类人工分离方法。

(2)上述全自动组织处理器或单细胞制备仪可以处理的组织样品均在10mg以上，对于小量和微量样品分离效果较差。而本方法可以利用1.5ml的组织消化体系来操作极其微量的样品。

(3)在整个分离时间上，本申请的方法通过压缩消化酶作用时间和离心时间，将整个消化分离过程降低到35-40分钟，而全自动组织处理器和单细胞悬液制备仪单单消化酶消化时间都需要40-60分钟，加上离心和去碎片过程的耗时，整个分离过程需要1.5-2小时。

(4)本申请的方法操作步骤简单，分为组织剪碎，消化，吹打，离心和去碎片等6步操作共2次离心过程，即可获得单细胞悬液。而同类人工分离方法步骤繁杂，耗时较长。在最终获取的单细胞悬液中，活细胞数量占总细胞数的比例上相比，本方法平均可达到90％以上的活细胞比例，经流式细胞仪分选后完全符合10×单细胞测序的细胞输入要求。而与同类全自动仪器和同类人工分离方法相比，其活细胞比例多在90％以下。

(5)本申请的方法可高效快速从大小鼠和人类脑组织(从胚胎到成年阶段均适用)中分离出中枢神经系统多种类型的单细胞，如神经元、星型胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞、少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞、小胶质细胞等。分离出的活细胞在总细胞中的存活率可高达99％。分离出的单细胞悬液可用于后续细胞培养，单细胞测序和其他多种单细胞分析等。本方法克服了目前实验室或专业分离仪器对成年神经组织分离的效率低，耗时长，分离后的细胞存活率低，无法培养的缺陷。另外，使用本方法大大降低了神经组织的分离成本。

附图说明

图1显示了采用不同保存液分离获得的单细胞贴壁3小时的细胞状态，其中A为单细胞悬液光镜和荧光图像，B为获得的单细胞数统计结果，C为标记细胞数占总单细胞数的统计结果。

图2显示了根据实施例2获得的成年小鼠脑组织的单细胞流式细胞分选图，其中A和B显示了ThyYFP标记的神经元细胞的分布和统计结果，C和D显示了Aldh1l1GFP标记的星形胶质细胞的分布和统计结果。

图3显示了对转基因成年小鼠的大脑海马组织进行单细胞分离的结果，其中A显示了采用本发明方法进行单细胞分离的结果，B显示了采用现有技术方法进行单细胞分离的结果。

具体实施方式

以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

称取配方量的组分溶解于水中，用氢氧化钠调节pH至7.3-7.4，并用0.22μm滤膜进行无菌过滤。按照如下表1所示的配方制备保存液：

表1

采用上述各配方制备的保存液进行细胞分离，具体操作如下：先用10ml冰的PBS溶液，经心脏灌注Aldh1l1GFP转基因小鼠(小鼠来自Jackson Lab,STOCK Tg(Aldh1l1-EGFP,-DTA)D8Rth/J)Strain#:026033，该品系小鼠为绿色荧光蛋白GFP的特异性标记大脑星形胶质细胞类型)。解剖出小鼠大脑，将大脑放置在盛有预冷的各保存液的锥形管中。在解剖镜下从完整大脑中将感兴趣的核团或区域解剖出来，剪碎成约1mm左右组织碎片，将相同质量组织碎片转移到包含各保存液的1.5ml EP管中，4℃保存24小时。24小时后，对各保存液中的组织碎片进行单细胞分离。将木瓜蛋白酶消化液置于37℃水浴锅中进行激活(约20分钟)，木瓜蛋白酶消化液是将100μl木瓜蛋白酶混悬液(LS003126，Worthington)加入到5ml基础培养基中。基础培养基主要成分为DMEM，添加4.5g/L葡萄糖，4.5mM的L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠。将Dnase(D806930，Macklin)加入激活的木瓜蛋白酶消化液中(4μg/ml终浓度)。移除组织碎片中的保存液，将0.22μm过滤器过滤后的木瓜蛋白酶消化液加入到组织碎片中。将混合组织碎片的消化液置于37℃水浴锅中消化组织20min，每10分钟上下混合一次。消化完毕后，使用硅化巴斯德玻璃管(火抛光)(直径300μm)，吹打至大组织块消失。然后使用另一支较小直径的巴斯德玻璃管(直径150μm)吹打至组织块完全消失，溶液成为均匀混悬液。将包含10％总体积的OptiprepTM(1114542，Axis-Shield/Alere Technologies)密度梯度离心液DMEM加入到上述细胞混悬液中，1400g离心6min，以去除细胞碎片和未消化的组织块，即可得到单细胞悬液。

上述采用不同配方的保存液保存24小时后，分离获得的单细胞悬液贴壁3小时的细胞状态如图1所示。其中GFP为转基因鼠自带荧光标记，DAPI染色为贴壁前5分钟加入DNA染料，用于标记死亡细胞。图1A-C的结果显示，与其他保存液相比2-4，保存液1获得的细胞形态良好，单细胞数量较多，细胞碎片较少未能解离的组织块较少，有良好细胞形态的细胞(小箭头所示)，Aldh1L1GFP+标记的星形胶质细胞数量较多，而DAPI标记阳性的死亡细胞数量(小箭头所示)和死亡后未能解离的组织块(大箭头所示)较少。而保存液5获得的细胞碎片较多，难以找到用于统计的荧光活细胞。结果提示保存液1保存的组织块活性较高，分离效果更好。

实施例2

采用与实施例1细胞分离过程相同的方法，利用上述的保存液1对4周龄Thy1YFP转基因小鼠(来自Jackson Lab，B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J，Strain#:003709。其神经元特异性表达YFP荧光蛋白转基因小鼠)和Aldh1l1GFP转基因小鼠(来自Jackson Lab,STOCK Tg(Aldh1l1-EGFP,-DTA)D8Rth/J)Strain#:026033，该品系小鼠为绿色荧光蛋白GFP的特异性标记大脑星形胶质细胞类型)的大脑皮层组织进行单细胞分离，在获取单细胞悬液后进行流式分析。

流式细胞分选步骤如下：其中，上述获取的单细胞悬液较为浑浊，提示溶液中细胞碎片较多，将影响流式分选的效率，因此，上机前再进行一次去碎片操作。将10％总体积的OptiprepTM(1114542，Axis-Shield/Alere Technologies)DMEM密度梯度离心液加入到上述单细胞悬液中，1400g离心6min。移除上清，加入500μL保存液1重悬细胞，将获得的细胞悬液用7100μm细胞筛子过滤，以防堵塞喷嘴。加入DAPI(1:5000)染料将死亡细胞标记上蓝色荧光。将上述细胞悬液加入流式管，避光置冰上转运至分选室进行上机实验。通过DAPI对死细胞进行染色后得到活细胞比例在总细胞中达到97.7％。

由于获得的单细胞悬液为多种大脑皮层细胞的混合液，进一步对其中神经系统主要细胞类型神经元和星形胶质细胞的存活率进行鉴定。结果如图2所示，其中，A显示了特异性标记神经元的Thy1YFP转基因小鼠的脑切片图，绿色荧光细胞显示ThyYFP标记的神经元细胞在小鼠大脑皮层和海马区域的分布情况；B显示了从Thy1YFP转基因小鼠大脑皮层获取的单细胞悬液流式分析图，Thy1YFP-在活细胞中占比90.5％，Thy1YFP+的神经元在活细胞中占比7.89％；C显示了特异性标记星形胶质细胞的Aldh1l1GFP转基因小鼠的脑切片图，绿色荧光细胞为Aldh1l1GFP标记的星形胶质细胞在大脑皮层和海马区的分布；D显示从Aldh1l1GFP转基因小鼠大脑皮层获取的单细胞悬液流式分析图，Aldh1l1GFP-在活细胞中占比87.5％，Aldhl1GFP+的神经元在活细胞中占比11.5％。

实施例3

对20周龄Thy1YFP转基因小鼠的大脑海马组织进行单细胞分离，其中，一侧海马在商业化单细胞悬液制备仪中进行标准程序分离单细胞，另一侧海马采用细胞保存液1和实施例1中的单细胞分离方法进行单细胞分离，在获取单细胞悬液后分别进行流式分析。流式细胞分选步骤同实施例2。获得结果如图3所示，A为采用实施例1的方法进行的快速单细胞分离方法，获得的单细胞悬液活细胞比例为97.3％，死亡细胞比例为0.54％；B为商业化单细胞悬液制备仪所获得单细胞悬液中活细胞的比例为58％，死亡细胞比例为33％。结果表明，本发明的细胞保存液结合本发明的单细胞分离方法获取的单细胞悬液具有更高的细胞活性。

虽然已经说明和描述了本申请的一些示例性实施方式，然而本申请不限于所公开的实施方式。相反，本领域普通技术人员将认识到，在不脱离如所附权利要求中描述的本申请的精神和范围的情况下，可对所描述的实施方式进行一些修饰和改变。

Claims (10)

1.一种组织和/或细胞的保存液，包括山梨醇、葡萄糖、代谢调节剂、酸碱调节剂和等渗剂。

2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述代谢调节剂选自牛磺酸、丙酮酸钠或肌酸中的至少一种，优选为丙酮酸钠；和/或

所述酸碱调节剂选自磷酸、氢氧化钾、氢氧化钠中的至少一种，优选为氢氧化钠；和/或

所述等渗剂选自氯化镁、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾中的至少一种，优选为氯化钾、氯化镁和磷酸二氢钠。

3.根据权利要求1或2所述的保存液，其特征在于，所述山梨醇的浓度为100-300mM，优选为150-250mM，更优选为180-220mM；和/或

所述葡萄糖的浓度为1-50mM，优选为2-10mM，更优选为4-8mM；和/或

所述代谢调节剂的浓度为5-10mM，优选为10-50mM，更优选为15-25mM；和/或

所述酸碱调节剂的浓度为1-20mM，优选为1-10mM，更优选为2-8mM；和/或

所述等渗剂的浓度为0.5-200mM，优选为0.5-100mM，更优选为0.5-50mM。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的保存液，其特征在于，所述保存液包括山梨醇、葡萄糖、丙酮酸钠、氢氧化钠、氯化钾、氯化镁和磷酸二氢钠。

5.根据权利要求4所述的保存液，其特征在于，所述保存液中，所述山梨醇的浓度为100-300mM，优选为150-250mM，更优选为180-220mM；和/或

所述葡萄糖的浓度为1-50mM，优选为2-10mM，更优选为4-8mM；和/或

所述丙酮酸钠的浓度为5-10mM，优选为10-50mM，更优选为15-25mM；和/或

所述氢氧化钠的浓度为1-20mM，优选为1-10mM，更优选为2-8mM；和/或

所述氯化钾的浓度为5-100mM，优选为10-50mM，更优选为20-40mM；和/或

所述氯化镁的浓度为0.1-5mM，优选为0.1-2mM，更优选为0.2-1mM；和/或

所述磷酸二氢钠的浓度为1-20mM，优选为1-10mM，更优选为2-8mM；

优选地，所述保存液的pH为7.0-7.5，优选为7.3-7.4。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的保存液，其特征在于，所述细胞包括来源于非人哺乳动物或人类的脑组织或神经系统；和/或

所述细胞包括神经元、星型胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞、少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞或小胶质细胞中的至少一种。

7.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-6中任一项所述的保存液。

8.一种细胞分离方法，包括利用权利要求1-6中任一项所述的保存液或权利要求7所述的试剂盒对离体组织进行细胞分离，获得单细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将离体组织在所述保存液中的存在下进行剪碎，获得剪碎的离体组织；

(2)将DNA酶和木瓜蛋白酶与所述剪碎的离体组织混合，对破碎的离体组织进行行消化和吹打，获得细胞混悬液；

(3)对步骤(2)获得的细胞混悬液进行离心处理，得到单细胞悬液；

优选地，步骤(2)中，所述木瓜蛋白酶为激活的木瓜蛋白酶，更优选地，所述激活的木瓜蛋白酶通过将与基础培养基混合后的木瓜蛋白酶混悬液在35℃-40℃中孵育10-30min获得；

优选地，步骤(2)中，所述消化的时间为10-30min；优选地，每5-10分钟混合一次；

优选地，步骤(2)中，所述吹打包括先使用直径为200-500μm的玻璃管吹打，再使用直径为100-200μm的玻璃管吹打，更优选地，所述玻璃管选自硅化巴斯德玻璃管；

优选地，步骤(3)中，所述离心包括在1000-2000g离心5-10min，优选在1200-1500g离心5-6min，更优选地，所述离心的次数为1-5次；

优选地，所述细胞包括来源于非人哺乳动物或人类的脑组织或神经系统；

优选地，所述细胞包括神经元、星型胶质细胞、血管内皮细胞、周细胞、少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞或小胶质细胞中的至少一种。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的保存液、权利要求7所述的试剂盒或权利要求8-9中任一项所述的细胞分离方法在神经组织细胞特别是在成年个体的神经组织细胞分离中的应用。

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