CN111363015A - 分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用 - Google Patents

分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用，该试剂包括裂解液A、裂解液B和裂解液C，裂解液A的成分为：pH为7.8的6mM‑12mM HEPES，9mM‑11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM‑2mM MgCl2；裂解液B的成分为：pH为7.8的6mM‑12mM HEPES，pH 7.8，9mM‑11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM‑2mM MgCl2，8％‑12％NP‑40；裂解液C的成分为：pH为7.8的6mM‑12mM HEPES，9mM‑11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM‑2mM MgCl2，8％‑12％甘油，8％‑12％SDS。本发明能够实现高效、快速、完全的分离细胞浆蛋白和核蛋白，避免二者交叉污染；降低蛋白分离液的细胞毒性及对研究操作人员健康的危害；提高细胞核浆分离试剂的保存稳定性。

Description

分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及蛋白分离技术领域，特别是涉及一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用。
背景技术
细胞核浆蛋白分离试剂是用于提取细胞中蛋白的试剂。医学研究中常用的细胞蛋白为细胞浆蛋白和细胞核蛋白；由于细胞内渗透压高，通常使用渗透压低的裂解液破坏细胞膜，当细胞膜被裂解后，细胞浆蛋白会渗出；高盐可破坏细胞的核膜，在高盐环境中，细胞核膜被破坏，核蛋白就可释放出来；因此，细胞核浆蛋白分离技术的关键在于借助不同渗透压的试剂，有效分离细胞浆和细胞核蛋白，即浆蛋白提取液中不能含有核蛋白，且核蛋白提取液中不能含有浆蛋白，以便分别用于检测和研究细胞浆和细胞核中分布的相关蛋白等。
然而，现有技术中存在以下缺陷：细胞浆蛋白分离时，由于裂解液裂解的强度太大或时间太长，导致细胞核膜的破坏和核蛋白溢出；细胞浆蛋白去除不充分，导致细胞核蛋白中残留浆蛋白污染；蛋白分离液成分中含细胞毒性很强的蛋白酶抑制剂如苯甲基磺酰氟(PMSF)，毒性强，会导致细胞损伤，给操作人员的健康带来危害；蛋白裂解液含易氧化的还原剂成分如二硫苏糖醇(DTT)，导致裂解液保存的稳定性差。
发明内容
鉴于上述状况，本发明提供一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用，以解决现有试剂在分离细胞浆蛋白和核蛋白时会导致二者交叉污染、试剂毒性强、保存稳定性差的问题。
本发明的技术方案为：
一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，包括裂解液A、裂解液B和裂解液C，裂解液A的成分为：pH为7.8的6mM-12mM HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)，9mM-11mM NaCl，0.5mM EDTA(乙二胺四乙酸)，1mM-2mM MgCl2；裂解液B的成分为：pH为7.8的6mM-12mMHEPES，pH 7.8，9mM-11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM-2mM MgCl2，8％-12％NP-40(乙基苯基聚乙二醇)；裂解液C的成分为：pH为7.8的6mM-12mM HEPES，9mM-11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM-2mM MgCl2，8％-12％甘油，8％-12％SDS(十二烷基硫酸钠)。
本发明还提供了上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，包括：
步骤1：制备裂解液A；
步骤2：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液B；
步骤3：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液C。
其中，所述步骤1具体包括：
步骤1.1：配制HEPES溶液，浓度为6mM-12mM；
步骤1.2：配制NaCl和MgCl2两种盐溶液，NaCl的浓度为9mM-11mM，MgCl2的浓度为1mM-2mM；
步骤1.3：配置EDTA溶液，EDTA溶液的浓度配制成0.5mM。
其中，所述步骤2具体包括：
在裂解液A中加入浓度8％-12％的NP-40。
其中，所述步骤3具体包括：
在裂解液A中分别加入8％-12％的甘油和8％-12％的SDS。
本发明还提供了上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂在贴壁细胞中的应用，包括以下步骤：
步骤一：用培养皿或培养瓶培养细胞，并于培养皿或培养瓶中加相应的细胞培养液；待细胞生长到70％以上时，开始收集细胞；弃去细胞培养液，用预冷的PBS洗涤2-3次，冰上放置1-2分钟后弃去，用细胞刮将贴壁细胞刮下并重悬于1-2ml预冷的PBS中；4℃离心，转速1500rpm，离心时间7min-10min，去除残余培养基；
步骤二：经PBS洗涤离心后的细胞，按每1×107-5×108细胞加入500μl-1000μl的裂解液A，重悬细胞，并转入干净的EP管中；
步骤三：加了裂解液A的细胞，放置于冰上裂解10-15min，中间每隔5min左右用振荡器震荡一次，每次30-60s；
步骤四：裂解后的细胞加入500μl-1000μl的裂解液B，震荡30s，裂解后经4℃离心，转速3000rpm，离心时间10-15min；
步骤五：移出上清至另一个干净的EP管中，即为粗提的浆蛋白，细胞沉淀用于提取核蛋白；
步骤六：粗提的细胞浆蛋白再次4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，将上清再次移至另一个干净的EP管中，并弃除剩下的细胞沉淀，即为纯化的细胞浆蛋白；
步骤七：将步骤五中的细胞沉淀用500μl-1000μl的裂解液A重悬，吹打混匀后经4℃离心，转速12000rpm，离心时间10min，按此方式洗涤两次后将上清去除干净，留取细胞的沉淀；
步骤八：用100-500μl的裂解液C重悬细胞沉淀；
步骤九：逐滴加入5-10μl的NaCl；
步骤十：冰上反应30min，每隔5min震荡混匀；
步骤十一：4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，移出上清至另一个EP管中，即为纯化的核蛋白。
本发明还提供了上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂在悬浮细胞中的应用，包括以下步骤：
步骤一：用移液管将细胞吹打混匀后收集于离心管中，4℃离心，转速1500rpm，离心时间7-10min，去除残余培养基后用预冷的PBS洗涤2-3次，每次加10-15ml重悬洗涤；
步骤二：经PBS洗涤离心后的细胞，按每1×107-5×108细胞加入500μl-1000μl的裂解液A，重悬细胞，并转入干净的EP管中；
步骤三：加了裂解液A的细胞，放置于冰上裂解10-15min，中间每隔5min左右用振荡器震荡一次，每次30-60s；
步骤四：裂解后的细胞加入500μl-1000μl的裂解液B，震荡30s，裂解后经4℃离心，转速3000rpm，离心时间10-15min；
步骤五：移出上清至另一个干净的EP管中，即为粗提的浆蛋白，细胞沉淀用于提取核蛋白；
步骤六：粗提的细胞浆蛋白再次4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，将上清再次移至另一个干净的EP管中，并弃除剩下的细胞沉淀，即为纯化的细胞浆蛋白；
步骤七：将步骤五中的细胞沉淀用500μl-1000μl的裂解液A重悬，吹打混匀后经4℃离心，转速12000rpm，离心时间10min，按此方式洗涤两次后将上清去除干净，留取细胞的沉淀；
步骤八：用100-500μl的裂解液C重悬细胞沉淀；
步骤九：逐滴加入5-10μl的NaCl；
步骤十：冰上反应30min，每隔5min震荡混匀；
步骤十一：4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，移出上清至另一个EP管中，即为纯化的核蛋白。
本发明的有益效果为：
本发明提供的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，经过实验测试，能够成功分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白，可以高效彻底分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白，并避免核浆蛋白之间的相互污染。此外，该试剂中不含具有毒性的蛋白酶抑制剂，能够降低蛋白分离液的细胞毒性及对研究操作人员健康的危害，且该试剂中不含易氧化的还原剂，能够提高试剂的保存稳定性。
附图说明
图1为本发明提供的分离提取细胞浆蛋白和核蛋白的试剂的试验效果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
本发明的实施方式提出一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，包括裂解液A、裂解液B和裂解液C，裂解液A的成分为：pH为7.8的6mM-12mM HEPES，9mM-11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM-2mM MgCl2；裂解液B的成分为：pH为7.8的6mM-12mM HEPES，pH 7.8，9mM-11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM-2mM MgCl2，8％-12％NP-40；裂解液C的成分为：pH为7.8的6mM-12mM HEPES，9mM-11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM-2mM MgCl2，8％-12％甘油，8％-12％SDS。按照裂解和破坏膜的能力从高到低排列，分别为裂解液C、裂解液B、裂解液A。
优选地，裂解液A的成分为：pH为7.8的10mM HEPES，10mM NaCl，0.5mM EDTA，1.5mMMgCl2；裂解液B的成分为：pH为7.8的10mM HEPES，10mM NaCl，0.5mM EDTA，1.5mM MgCl2，10％NP-40；裂解液C的成分为：pH为7.8的10mM HEPES,10mM NaCl，0.5mM EDTA，1.5mMMgCl2，10％甘油，10％SDS。
本发明的实施方式提供了上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，包括步骤1～3。
步骤1：制备裂解液A。
其中，所述步骤1具体包括：
步骤1.1：配制HEPES溶液，浓度为6mM-12mM，依据待裂解的细胞被裂解程度不同上下调整，优选地配成10mM；
步骤1.2：配制NaCl和MgCl2两种盐溶液，这两种盐溶液的浓度也可以微调，NaCl在9mM-11mM，MgCl2在1mM-2mM浓度范围内均可，NaCl浓度选择相对低浓度时，可选择相对高浓度的MgCl2；
步骤1.3：配置EDTA溶液，EDTA溶液的浓度配制成0.5mM。
需要指出的是裂解液A在临用前记得需要现配蛋白酶抑制剂，本发明中用低毒性的cocktail替代目前市售蛋白裂解液中高毒性的PMSF，10μg/ml-25μg/ml的cocktail可以很好地抑制蛋白的降解。
在可替代的实施方式中，上述步骤1.2和步骤1.3可以颠倒。即：步骤1.2：配制EDTA溶液，步骤1.3：配制NaCl和MgCl2，而且这两种盐的配制顺序也可以颠倒，可以先配NaCl，再配MgCl2，也可以先配MgCl2，再配NaCl。当然，也可以调整HEPES溶液的配制顺序或最后配制HEPES溶液。
步骤2：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液B。
其中，根据不同细胞优化了裂解液A的配方后，制备裂解液B。在该步骤中，在裂解液A中加入8％-12％的NP-40，根据所裂解获得的浆蛋白中是否有核蛋白污染而调整，如果存在核蛋白污染，则下调NP-40的浓度，反之上调其浓度。
步骤3：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液C。
其中，根据不同细胞优化了裂解液A的配方后，制备裂解液C。在该步骤中，在裂解液A中分别加入8％-12％的甘油和8％-12％的SDS，根据是否能裂解细胞核膜并获得足够高的核蛋白浓度而调整。
需要指出的是，在可替代的实施方式中，上述步骤2和步骤2可以颠倒。即：步骤2：根据不同细胞优化了裂解液A的配方后，制备裂解液C。在该步骤中，在裂解液A中分别加入8％-12％的甘油和8％-12％的SDS，根据是否能裂解细胞核膜并获得足够高的核蛋白浓度而调整。步骤3：根据不同细胞优化了裂解液A的配方后，制备裂解液B。在该步骤中，在裂解液A中加入8％-12％的NP-40，根据所裂解获得的浆蛋白中是否有核蛋白污染而调整，如果存在核蛋白污染，则下调NP-40的浓度，反之上调其浓度。
本发明的实施方式还提供了上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂在贴壁细胞中的应用，包括以下步骤：
步骤一：用一定尺寸的培养皿或培养瓶培养。优选地，采用直径10CM的培养皿培养，并于培养皿中加8ml-15ml相应的细胞培养液；待细胞生长到70％-90％以上时，开始收集细胞；首先弃去细胞培养液，用预冷的PBS洗涤2-3次，每次加10ml-15ml，冰上轻轻旋转混匀，1-2分钟后弃去，用细胞刮将贴壁细胞轻轻刮下并重悬于1ml-2ml预冷的PBS中；4℃离心，转速1500rpm，离心时间7min-10min，去除残余培养基；
步骤二：经PBS洗涤离心后的细胞，按每1×107-5×108细胞加入500μl-1000μl的裂解液A，重悬细胞，并转入干净的EP管中；
步骤三：加了裂解液A的细胞，放置于冰上裂解10-15min，中间每隔5min左右用振荡器震荡一次，每次30-60s；
步骤四：裂解后的细胞加入500μl-1000μl的裂解液B，震荡30s，裂解后经4℃离心，转速3000rpm，离心时间10-15min；
步骤五：移出上清至另一个干净的EP管中，即为粗提的浆蛋白，细胞沉淀用于提取核蛋白；
步骤六：粗提的细胞浆蛋白再次4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，将上清再次移至另一个干净的EP管中，并弃除剩下的细胞沉淀，即为纯化的细胞浆蛋白；
步骤七：将步骤五中的细胞沉淀用500μl-1000μl的裂解液A重悬，吹打混匀后经4℃离心，转速12000rpm，离心时间10min，按此方式洗涤两次后将上清去除干净，留取细胞的沉淀；
步骤八：用100-500μl的裂解液C重悬细胞沉淀；
步骤九：逐滴加入5-10μl的NaCl；
步骤十：冰上反应30min，每隔5min震荡混匀；
步骤十一：4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，移出上清至另一个EP管中，即为纯化的核蛋白。
本发明的实施方式还提供了上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂在悬浮细胞中的应用，包括以下步骤：
步骤一：用移液管将细胞吹打混匀后收集于离心管中，4℃离心，转速1500rpm，离心时间7-10min，去除残余培养基后用预冷的PBS洗涤2-3次，每次加10-15ml重悬洗涤；
步骤二：经PBS洗涤离心后的细胞，按每1×107-5×108细胞加入500μl-1000μl的裂解液A，重悬细胞，并转入干净的EP管中；
步骤三：加了裂解液A的细胞，放置于冰上裂解10-15min，中间每隔5min左右用振荡器震荡一次，每次30-60s；
步骤四：裂解后的细胞加入500μl-1000μl的裂解液B，震荡30s，裂解后经4℃离心，转速3000rpm，离心时间10-15min；
步骤五：移出上清至另一个干净的EP管中，即为粗提的浆蛋白，细胞沉淀用于提取核蛋白；
步骤六：粗提的细胞浆蛋白再次4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，将上清再次移至另一个干净的EP管中，并弃除剩下的细胞沉淀，即为纯化的细胞浆蛋白；
步骤七：将步骤五中的细胞沉淀用500μl-1000μl的裂解液A重悬，吹打混匀后经4℃离心，转速12000rpm，离心时间10min，按此方式洗涤两次后将上清去除干净，留取细胞的沉淀；
步骤八：用100-500μl的裂解液C重悬细胞沉淀；
步骤九：逐滴加入5-10μl的NaCl；
步骤十：冰上反应30min，每隔5min震荡混匀；
步骤十一：4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，移出上清至另一个EP管中，即为纯化的核蛋白。
本发明提供的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，经过实验测试，能够成功分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白，可以高效彻底分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白，并避免核浆蛋白之间的相互污染。此外，该试剂中不含具有毒性的蛋白酶抑制剂，能够降低蛋白分离液的细胞毒性及对研究操作人员健康的危害，且该试剂中不含易氧化的还原剂，能够提高试剂的保存稳定性。
下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。本发明实施例不限定于以下的具体实施例。在不变主权利的范围内，可以适当的进行变更实施。
实施例1：
一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，包括裂解液A、裂解液B和裂解液C，裂解液A的成分为：pH为7.8的10mM HEPES，10mM NaCl，0.5mM EDTA，1.5mM MgCl2；裂解液B的成分为：pH为7.8的10mM HEPES，10mM NaCl，0.5mM EDTA，1.5mM MgCl2，10％NP-40；裂解液C的成分为：pH为7.8的10mM HEPES,10mM NaCl，0.5mM EDTA，1.5mM MgCl2，10％甘油，10％SDS。
上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，包括：
步骤1：制备裂解液A；
步骤2：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液B；
步骤3：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液C。
其中，所述步骤1具体包括：
步骤1.1：配制HEPES溶液，浓度为10mM；
步骤1.2：配制NaCl和MgCl2两种盐溶液，NaCl的浓度为10mM，MgCl2的浓度为1.5mM；
步骤1.3：配置EDTA溶液，EDTA溶液的浓度配制成0.5mM。
其中，所述步骤2具体包括：
在裂解液A中加入浓度10％的NP-40。
其中，所述步骤3具体包括：
在裂解液A中分别加入10％的甘油和10％的SDS。
实施例2：
一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，包括裂解液A、裂解液B和裂解液C，裂解液A的成分为：pH为7.8的6mM HEPES，10mM NaCl，0.5mM EDTA，2mM MgCl2；裂解液B的成分为：pH为7.8的6mM HEPES，pH 7.8，10mM NaCl，0.5mM EDTA，2mM MgCl2，12％NP-40；裂解液C的成分为：pH为7.8的6mM HEPES，10mM NaCl，0.5mM EDTA，2mM MgCl2，10％甘油，9％SDS。
上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，包括：
步骤1：制备裂解液A；
步骤2：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液B；
步骤3：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液C。
其中，所述步骤1具体包括：
步骤1.1：配制HEPES溶液，浓度为6mM；
步骤1.2：配制NaCl和MgCl2两种盐溶液，NaCl的浓度为10mM，MgCl2的浓度为2mM；
步骤1.3：配置EDTA溶液，EDTA溶液的浓度配制成0.5mM。
其中，所述步骤2具体包括：
在裂解液A中加入浓度12％的NP-40。
其中，所述步骤3具体包括：
在裂解液A中分别加入10％的甘油和9％的SDS。
实施例3：
一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，包括裂解液A、裂解液B和裂解液C，裂解液A的成分为：pH为7.8的9mM HEPES，11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM MgCl2；裂解液B的成分为：pH为7.8的9mM HEPES，pH 7.8，11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM MgCl2，11％NP-40；裂解液C的成分为：pH为7.8的9mM HEPES，11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM MgCl2，12％甘油，9％SDS。
上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，包括：
步骤1：制备裂解液A；
步骤2：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液B；
步骤3：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液C。
其中，所述步骤1具体包括：
步骤1.1：配制HEPES溶液，浓度为9mM；
步骤1.2：配制NaCl和MgCl2两种盐溶液，NaCl的浓度为11mM，MgCl2的浓度为1mM；
步骤1.3：配置EDTA溶液，EDTA溶液的浓度配制成0.5mM。
其中，所述步骤2具体包括：
在裂解液A中加入浓度11％的NP-40。
其中，所述步骤3具体包括：
在裂解液A中分别加入12％的甘油和9％的SDS。
实施例4：
一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，包括裂解液A、裂解液B和裂解液C，裂解液A的成分为：pH为7.8的12mM HEPES，9mM NaCl，0.5mM EDTA，1.5mM MgCl2；裂解液B的成分为：pH为7.8的12mM HEPES，pH 7.8，9mM NaCl，0.5mM EDTA，1.5mM MgCl2，8％NP-40；裂解液C的成分为：pH为7.8的12mM HEPES，9mM NaCl，0.5mM EDTA，1.5mM MgCl2，8％甘油，8％SDS。
上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，包括：
步骤1：制备裂解液A；
步骤2：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液B；
步骤3：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液C。
其中，所述步骤1具体包括：
步骤1.1：配制HEPES溶液，浓度为12mM；
步骤1.2：配制NaCl和MgCl2两种盐溶液，NaCl的浓度为9mM，MgCl2的浓度为1.5mM；
步骤1.3：配置EDTA溶液，EDTA溶液的浓度配制成0.5mM。
其中，所述步骤2具体包括：
在裂解液A中加入浓度8％的NP-40。
其中，所述步骤3具体包括：
在裂解液A中分别加入8％的甘油和8％的SDS。
实施例5：
一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，包括裂解液A、裂解液B和裂解液C，裂解液A的成分为：pH为7.8的8mM HEPES，10mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM MgCl2；裂解液B的成分为：pH为7.8的8mM HEPES，pH 7.8，10mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM MgCl2，9％NP-40；裂解液C的成分为：pH为7.8的8mM HEPES，10mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM MgCl2，8％甘油，12％SDS。
上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，包括：
步骤1：制备裂解液A；
步骤2：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液B；
步骤3：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液C。
其中，所述步骤1具体包括：
步骤1.1：配制HEPES溶液，浓度为8mM；
步骤1.2：配制NaCl和MgCl2两种盐溶液，NaCl的浓度为10mM，MgCl2的浓度为1mM；
步骤1.3：配置EDTA溶液，EDTA溶液的浓度配制成0.5mM。
其中，所述步骤2具体包括：
在裂解液A中加入浓度9％的NP-40。
其中，所述步骤3具体包括：
在裂解液A中分别加入8％的甘油和12％的SDS。
实施例6：
将实施例1中的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂应用于贴壁细胞的核浆蛋白分离，包括以下步骤：
步骤一：用一定尺寸的培养皿或培养瓶培养。优选地，采用直径10CM的培养皿培养，并于培养皿中加8ml-15ml相应的细胞培养液；待细胞生长到70％-90％以上时，开始收集细胞；首先弃去细胞培养液，用预冷的PBS洗涤2-3次，每次加10ml-15ml，冰上轻轻旋转混匀，1-2分钟后弃去，用细胞刮将贴壁细胞轻轻刮下并重悬于1ml-2ml预冷的PBS中；4℃离心，1500rpm×7min-10min，去除残余培养基。
步骤二：经PBS洗涤离心后的细胞，按每1×107-5×108细胞加入500μl-1000μl裂解液A，重悬细胞，并转入干净的EP管中。
步骤三：加了裂解液A的细胞，放置于冰上裂解10min-15min，如果能放置在冰箱中旋转混匀裂解效果更好，中间每隔5min左右用振荡器震荡一次，每次30sec-60sec。
步骤四：裂解后的细胞加入500μl-1000μl裂解液B，均匀的震荡30sec，裂解后经4℃离心，3000rpm×10min-15min。
步骤五：轻柔移出上清至另一个新的干净的EP管中，即为粗提的浆蛋白，细胞沉淀用于提取核蛋白。
步骤六：粗提的细胞浆蛋白再次4℃离心，12000rpm×10-15min，将上清再次移至另一个新的干净的EP管中，并弃除剩下的细胞沉淀，即为纯化的细胞浆蛋白。
步骤七：将步骤五中的细胞沉淀用500μl-1000μl裂解液A重悬(优化步骤：比市售的试剂盒说明书增加了裂解液A对残余浆蛋白的充分裂解和洗涤作用时间)，吹打混匀后经4℃离心，12000rpm×10min，按此方式洗涤两次后将上清去除干净，留取细胞的沉淀。
步骤八：用100μl-500μl裂解液C重悬细胞沉淀。
步骤九：逐滴加入5μl-10μl的NaCl(4.1M)，根据核蛋白裂解浓度调整，同时轻轻摇匀混合液。
步骤十：冰上反应30min，每隔5min，轻拍或震荡混匀，以促进细胞核膜的裂解。
步骤十一：4℃离心，12000rpm×10min-15min，移出上清至一个新的干净的EP管中，即为纯化的核蛋白。
实施例7：
将实施例1中的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂应用于悬浮细胞的核浆蛋白分离，包括以下步骤：
步骤一：直接用移液管将细胞轻轻吹打混匀后收集于15ml离心管中，4℃离心，1500rpm×7min-10min，去除残余培养基后用4℃预冷的PBS洗涤2-3次，每次加10ml-15ml重悬洗涤。
步骤二：经PBS洗涤离心后的细胞，按每1×107-5×108细胞加入500μl-1000μl裂解液A，重悬细胞，并转入干净的EP管中。
步骤三：加了裂解液A的细胞，放置于冰上裂解10min-15min，如果能放置在冰箱中旋转混匀裂解效果更好，中间每隔5min左右用振荡器震荡一次，每次30sec-60sec。
步骤四：裂解后的细胞加入500μl-1000μl裂解液B，均匀的震荡30sec，裂解后经4℃离心，3000rpm×10min-15min。
步骤五：轻柔移出上清至另一个新的干净的EP管中，即为粗提的浆蛋白，细胞沉淀用于提取核蛋白。
步骤六：粗提的细胞浆蛋白再次4℃离心，12000rpm×10-15min，将上清再次移至另一个新的干净的EP管中，并弃除剩下的细胞沉淀，即为纯化的细胞浆蛋白。
步骤七：将步骤五中的细胞沉淀用500μl-1000μl裂解液A重悬(优化步骤：比市售的试剂盒说明书增加了裂解液A对残余浆蛋白的充分裂解和洗涤作用时间)，吹打混匀后经4℃离心，12000rpm×10min，按此方式洗涤两次后将上清去除干净，留取细胞的沉淀。
步骤八：用100μl-500μl裂解液C重悬细胞沉淀。
步骤九：逐滴加入5μl-10μl的NaCl(4.1M)，根据核蛋白裂解浓度调整，同时轻轻摇匀混合液。
步骤十：冰上反应30min，每隔5min，轻拍或震荡混匀，以促进细胞核膜的裂解。
步骤十一：4℃离心，12000rpm×10min-15min，移出上清至一个新的干净的EP管中，即为纯化的核蛋白。
为了对本发明提供的试剂的效果进行验证，将实施例1的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂进行实际的核浆蛋白分离试验，结果表明，通过该试剂成功分离了细胞浆蛋白和细胞核蛋白；通过分别用α-Tubulin 1和Histone 3.1作为细胞浆蛋白和细胞核蛋白的管家基因对照，如图1所示：1为裂解获得的浆蛋白，其中只有浆蛋白标志基因α-Tubulin1的表达，无核蛋白标志基因Histone 3.1的表达；2为裂解获得的核蛋白，其中只有核蛋白标志基因Histone 3.1的表达，无浆蛋白标志基因α-Tubulin 1的表达；说明本发明提供的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂可以高效彻底分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白并避免核浆蛋白的相互污染。
综上，根据本发明提供的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，经过实验测试，能够成功分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白，可以高效彻底分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白，并避免核浆蛋白之间的相互污染。此外，该试剂中不含具有毒性的蛋白酶抑制剂，能够降低蛋白分离液的细胞毒性及对研究操作人员健康的危害，且该试剂中不含易氧化的还原剂，能够提高试剂的保存稳定性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，其特征在于，包括裂解液A、裂解液B和裂解液C，裂解液A的成分为：pH为7.8的6mM-12mM HEPES，9mM-11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM-2mM MgCl2；裂解液B的成分为：pH为7.8的6mM-12mM HEPES，pH 7.8，9mM-11mM NaCl，0.5mMEDTA，1mM-2mM MgCl2，8％-12％NP-40；裂解液C的成分为：pH为7.8的6mM-12mM HEPES，9mM-11mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM-2mM MgCl2，8％-12％甘油，8％-12％SDS。
2.根据权利要求1所述的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，其特征在于，包括裂解液A、裂解液B和裂解液C，裂解液A的成分为：pH为7.8的10mM HEPES，10mM NaCl，0.5mMEDTA，1.5mM MgCl2；裂解液B的成分为：pH为7.8的10mM HEPES，10mM NaCl，0.5mM EDTA，1.5mM MgCl2，10％NP-40；裂解液C的成分为：pH为7.8的10mM HEPES,10mM NaCl，0.5mMEDTA，1.5mM MgCl2，10％甘油，10％SDS。
3.权利要求1所述的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：制备裂解液A；
步骤2：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液B；
步骤3：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液C。
4.根据权利要求3所述的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体包括：
步骤1.1：配制HEPES溶液，浓度为6mM-12mM；
步骤1.2：配制NaCl和MgCl2两种盐溶液，NaCl的浓度为9mM-11mM，MgCl2的浓度为1mM-2mM；
步骤1.3：配置EDTA溶液，EDTA溶液的浓度配制成0.5mM。
5.根据权利要求4所述的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体包括：
在裂解液A中加入浓度8％-12％的NP-40。
6.根据权利要求4所述的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤3具体包括：
在裂解液A中分别加入8％-12％的甘油和8％-12％的SDS。
7.权利要求1所述的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂在贴壁细胞中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：用培养皿或培养瓶培养细胞，并于培养皿或培养瓶中加相应的细胞培养液；待细胞生长到70％以上时，开始收集细胞；弃去细胞培养液，用预冷的PBS洗涤2-3次，冰上放置1-2分钟后弃去，用细胞刮将贴壁细胞刮下并重悬于1-2ml预冷的PBS中；4℃离心，转速1500rpm，离心时间7min-10min，去除残余培养基；
步骤二：经PBS洗涤离心后的细胞，按每1×107-5×108细胞加入500μl-1000μl的裂解液A，重悬细胞，并转入干净的EP管中；
步骤三：加了裂解液A的细胞，放置于冰上裂解10-15min，中间每隔5min左右用振荡器震荡一次，每次30-60s；
步骤四：裂解后的细胞加入500μl-1000μl的裂解液B，震荡30s，裂解后经4℃离心，转速3000rpm，离心时间10-15min；
步骤五：移出上清至另一个干净的EP管中，即为粗提的浆蛋白，细胞沉淀用于提取核蛋白；
步骤六：粗提的细胞浆蛋白再次4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，将上清再次移至另一个干净的EP管中，并弃除剩下的细胞沉淀，即为纯化的细胞浆蛋白；
步骤七：将步骤五中的细胞沉淀用500μl-1000μl的裂解液A重悬，吹打混匀后经4℃离心，转速12000rpm，离心时间10min，按此方式洗涤两次后将上清去除干净，留取细胞的沉淀；
步骤八：用100-500μl的裂解液C重悬细胞沉淀；
步骤九：逐滴加入5-10μl的NaCl；
步骤十：冰上反应30min，每隔5min震荡混匀；
步骤十一：4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，移出上清至另一个EP管中，即为纯化的核蛋白。
8.权利要求1所述的分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂在悬浮细胞中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：用移液管将细胞吹打混匀后收集于离心管中，4℃离心，转速1500rpm，离心时间7-10min，去除残余培养基后用预冷的PBS洗涤2-3次，每次加10-15ml重悬洗涤；
步骤二：经PBS洗涤离心后的细胞，按每1×107-5×108细胞加入500μl-1000μl的裂解液A，重悬细胞，并转入干净的EP管中；
步骤三：加了裂解液A的细胞，放置于冰上裂解10-15min，中间每隔5min左右用振荡器震荡一次，每次30-60s；
步骤四：裂解后的细胞加入500μl-1000μl的裂解液B，震荡30s，裂解后经4℃离心，转速3000rpm，离心时间10-15min；
步骤五：移出上清至另一个干净的EP管中，即为粗提的浆蛋白，细胞沉淀用于提取核蛋白；
步骤六：粗提的细胞浆蛋白再次4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，将上清再次移至另一个干净的EP管中，并弃除剩下的细胞沉淀，即为纯化的细胞浆蛋白；
步骤七：将步骤五中的细胞沉淀用500μl-1000μl的裂解液A重悬，吹打混匀后经4℃离心，转速12000rpm，离心时间10min，按此方式洗涤两次后将上清去除干净，留取细胞的沉淀；
步骤八：用100-500μl的裂解液C重悬细胞沉淀；
步骤九：逐滴加入5-10μl的NaCl；
步骤十：冰上反应30min，每隔5min震荡混匀；
步骤十一：4℃离心，转速12000rpm，离心时间10-15min，移出上清至另一个EP管中，即为纯化的核蛋白。
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