CN1868468A - 毛萼乙素在制药中的应用 - Google Patents

毛萼乙素在制药中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN1868468A
CN1868468A CNA2005101100898A CN200510110089A CN1868468A CN 1868468 A CN1868468 A CN 1868468A CN A2005101100898 A CNA2005101100898 A CN A2005101100898A CN 200510110089 A CN200510110089 A CN 200510110089A CN 1868468 A CN1868468 A CN 1868468A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
erib
kasumi
apoptosis
eriocalyxin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2005101100898A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100370981C (zh
Inventor
陈赛娟
陈竺
王兰
赵维莅
孙汉董
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Affiliated Ruijin Hospital of Shanghai Second Medical University
Kunming Institute of Botany of CAS
Original Assignee
RUI JIN HOSPITAL AFFILIATED TO SHANGHAI SECOND MEDICAL UNIVERSITY
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RUI JIN HOSPITAL AFFILIATED TO SHANGHAI SECOND MEDICAL UNIVERSITY filed Critical RUI JIN HOSPITAL AFFILIATED TO SHANGHAI SECOND MEDICAL UNIVERSITY
Priority to CNB2005101100898A priority Critical patent/CN100370981C/zh
Priority to EP06791205A priority patent/EP1952811A4/en
Priority to US12/092,914 priority patent/US20080300299A1/en
Priority to JP2008539213A priority patent/JP2009514903A/ja
Priority to PCT/CN2006/002623 priority patent/WO2007051390A1/zh
Publication of CN1868468A publication Critical patent/CN1868468A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100370981C publication Critical patent/CN100370981C/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

本发明涉及毛萼乙素在制备治疗急性白血病药物中的应用；和毛萼乙素在制备治疗伯基特淋巴瘤药物中的应用。毛萼乙素毒性较小，药理作用强，预示着很好的药用前景。毛萼乙素能够提高过氧化物(ROS)的水平，影响IκBα的磷酸化和降解，以及阻止NF－κB进核，从而抑制NF－κB信号通路。毛萼乙素还能够下调ERK1/2的磷酸化水平，抑制MAPK信号通路。

Description

毛萼乙素在制药中的应用
技术领域
本发明涉及毛萼乙素的用途，尤其涉及在制药领域中的应用。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是一组起源于髓系祖细胞的异常增殖，分化和存活的造血系统恶性疾病。特异的染色体易位经常出现在AML中，并且在白血病的发生中扮演了重要的角色。在AML中，t(8；21)(q22；q22)代表了最常见的染色体易位，该易位生成了AML1-ETO融合蛋白。AML1-ETO阻断髓系细胞分化和凋亡，参与白血病生成。临床上，40％-50％的t(8；21)AML患者接受化疗后仍然复发，并且产生耐药性。而且，高剂量化疗药物不适合于老年患者。因此，发展一种能够直接针对该类白血病遗传学改变的可替代药物，是非常需要的。
在过去三十年里，天然产物在癌症治疗中已经显示出很有希望的结果。天然产物可以提供许多先导化合物，它们可以用作设计具有更强生物活性新药的模板。紫杉醇是一种来源于太平洋紫杉Taxus brevifolia树皮的一种天然产物。紫杉醇对耐药的乳腺癌和卵巢癌有效，并且上百种紫杉醇的类似物已经被合成出来应用于临床。在造血系统疾病中，无机砷化合物，例如最初来源于雄黄的三氧化二砷，在治疗急性早幼粒细胞白血病中非常有效。冬凌草甲素是一种从中药植物Isodon rubescens中提取出的一种二萜化合物，它有很强的抗肿瘤活性。毛萼乙素简称EriB(见图1A)是冬凌草甲素的类似物，它是一种从分布于我国西南部的常绿植物Isodon eriocalyx var.laxiflora(疏花毛萼香茶菜)中纯化出的对映贝壳杉烷类化合物。Isodon eriocalyx var.laxiflora在民间用于抗炎和抗细菌的药物。在中国申请号CN02134163.X，公开了一种预防或治疗癌症的药物，其中含有预防或治疗癌症有效量的式I化合物毛萼乙素及可药用载体和/或赋形剂，同时提供了式I化合物在制备预防或治疗癌症药物中的应用。但该药物不能治疗急性白血病以及伯基特淋巴瘤等疾病。
发明内容
本发明的目的在于：
(1)提供毛萼乙素在制备治疗急性白血病药物中的应用；
(2)提供毛萼乙素在制备治疗伯基特淋巴瘤药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：
(一)试剂：
毛萼乙素(购自中科院昆明植物所)溶解于DMSO中，储存液浓度为100mM，-20℃保存。MTT，碘化丙啶，DCFH-DA，肿瘤坏死因子-α，二硫苏糖醇，蛋白酶抑制剂和Hochest 33258购自Sigma公司。Z-DEVD-fmk购自BD公司。抗PARP，caspase-3，Bcl2，Bcl-XL，Bax，P65，Lamin B，羧基端IκBα，氨基端IκBα，ERK1/2，ERK1/2磷酸化形式，c-Jun，c-Jun磷酸化形式和抗ETO抗体，过氧化物酶偶联的羊抗鼠二抗，羊抗兔二抗和鼠抗羊二抗均购自Santa Cruz公司。抗β-actin和c-Fos抗体购自Abcam公司。抗剪切的caspase-3，IκBα和化学发光检测试剂盒购自CellSignaling公司。驴抗鼠荧光标记二抗购自Molecular Probes公司。
(二)细胞培养，细胞存活和细胞形态学：
本研究应用了以下几种人的细胞株：带有t(8；21)染色体易位的AML白血病Kasumi-1细胞株，该白血病又称为含有AML1-ETO融合基因的急性髓系白血病；急性早幼粒细胞白血病NB4，NB4/R1和NB4/R2细胞株；急性髓系白血病U937细胞株；Burkitt’s淋巴瘤Raji和Daudi细胞株，该病又称为伯基特淋巴瘤；T细胞急性淋巴母细胞白血病Jurkat细胞株。本研究收集了来自五位带有t(8；21)AML患者的原代白血病细胞。对患者的诊断建立于形态学检测，细胞遗传学检测到t(8；21)染色体易位以及RT-PCR检测到AML1-ETO融合蛋白的基础上。白血病细胞用淋巴细胞分离液分离得到，在5％CO2-95％空气，饱和湿度以及37℃的条件下，培养于RPMI-1640培养液中(Gibco/BRL)，并加入10％FBS(PAA)。在每次实验中，细胞接种密度为2×105/ml。细胞的存活率采用台盼兰染色排斥实验检测。细胞形态学观察采用瑞氏染色法。
(三)MTT实验：
在96孔板中，用0.1，0.25，0.5，1，2，4，6，8和10μM的毛萼乙素处理细胞。72小时后，向每孔中加入0.1mg MTT，在37℃下孵育4小时后，在分光光度计570nm处测量标本吸光度值。
(四)流式细胞仪检测annexin-V，细胞周期，线粒体跨膜电位和过氧化物(ROS)生成：
细胞凋亡用ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit(BD)进行分析。在分析细胞周期过程中，细胞在-20℃下用甲醇固定过夜，接着用含有1％RNase的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)处理，50μg/ml PI染色。在检测线粒体跨膜电位中，细胞用PBS洗后，在37℃下与10mg/ml Rh123孵育30分钟，然后再用50μg/ml PI染色。DCFH-DA用于检测ROS水平，细胞用PBS洗后，在37℃下与20mM DCFH-DA孵育30分钟。荧光强度用流式细胞仪进行测量。
(五)扫描电镜：
细胞在4℃用2％glutaraldehyde固定过夜，再3000×g离心15分钟，用0.1Mcacodylate缓冲液洗后，用1％osmium tetroxide在4℃固定1小时，脱水后用Epon 812包埋。用超薄切片机制备样品，染色后，在电镜下进行观察。
(六)免疫荧光：
细胞在-20℃用甲醇固定5分钟，PBS洗后，用0.5％Triton-X透化，1％BSA封闭，与抗P65抗体在室温孵育1小时，PBS洗后，再与荧光标记二抗在室温孵育30分钟。细胞再与Hochest 33258孵育5分钟后，在荧光显微镜下进行观察。
(七)免疫印迹分析：
用200μl Laemmli裂解缓冲液(0.5MTris-HCl，pH 6.8，2mM EDTA，10％glycerol，2％SDS and 5％β-mercaptoethanol)裂解5×106细胞。蛋白裂解物(20μg)用于10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜在溶于TBS/0.05％Tween 20的5％脱脂牛奶中封闭，之后与一抗在室温孵育2小时，与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时。免疫复合物用辣根过氧化物酶化学发光检测试剂盒检测。条带的信号强度用Quantity One version 4.1.1 software软件分析。
(八)核蛋白与浆蛋白分离：
1×107细胞与400μl含有0.2％Nonidet P-40和蛋白酶抑制剂的蛋白酶裂解缓冲液(10mM HEPES，10mM KCl，1.5mM MgCl2，0.5mM DTT，pH7.9)在冰上孵育1分钟。2500×g离心1分钟后，收集上清即为浆蛋白。沉淀用不含NP-40的裂解缓冲液洗后，重悬于提取缓冲液(20mM HEPES，pH7.9，420mM NaCl，0.5mM DTT，0.2mM EDTA and 25％甘油)中，冰上孵育20分钟。12000×g离心10分钟后，上清即为核蛋白。
(九)半定量RT-PCR：
总的RNA用Trizol(Invitrogen)提取，用随机引物和Superscript II(Invitrogen)逆转录为cDNA。本研究中所用到的引物为：
GAPDH，5’-TCACCAGGGCTGCTTTTA-3’和5’-AAGGTCATCCCTGAGCTGAA-3’；Bcl-2，5’-GCAGGCATGTTGACTTCACTT-3’和5’-GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3’；Bcl-XL5’-CATGGCAGCAGTAAAGCAAGC-3’和5’-TGCGATCCGACTCACCAATAC-3’；Bax，5’-TTCTGACGGCAACTTCAACTGGG-和5’TTCTTCCAGATGGTGAGCGAGG.-3’。循环参数：：94℃5分钟；94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，共28个循环；72℃5分钟。
(十)荧光素酶报告实验：
将Kasumi-1细胞重悬于培养液中，再加入报告基因质粒〔10μg，NF-κB介导的荧光素酶报告质粒或者pAP1-luc(Clontech)〕以及2μg用于校正细胞转染效率的CMV介导的β-半乳糖苷酶表达质粒。细胞转染条件为：1000V，25μF，电转仪为Biorad公司。转染后36小时，用毛萼乙素和/或TNFα处理细胞，再将细胞裂解。荧光素酶活性用lumat LB 9507tube luminometer(EG&G Berthold)测量。细胞裂解液与2×β-半乳糖苷酶反应试剂混合，在37℃孵育1小时后，加入1M Na2CO3终止反应。β-半乳糖苷酶用分光光度计测量420nm吸光度值。
(十一)胶电泳转移检测实验：
Kasumi-1细胞核蛋白提取物用考马斯亮蓝试剂(Pierce)定量。核蛋白(10μg)与32P标记的双链NF-κB(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)共有序列孵育，然后用4％非变性PAGE凝胶分离，用放射自显影检测被标记的条带。
(十二)统计分析：
实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。P值小于0.05则认为具有统计学差异。所有的统计采用SAS8.2软件。
二萜类化合物对固体肿瘤细胞和造血系统恶性肿瘤有显著的细胞毒效应。在本实验中，我们显示一种从Isodon eriocalyx var.laxiflora中提取出的二萜化合物EriB，对白血病和淋巴瘤细胞有一种抗增殖作用，特别是对t(8；21)白血病。EriB不仅对Kasumi-1细胞株有效，而且对来自患者的新鲜白血病细胞也非常有效，这提示EriB对t(8；21)白血病是有效的。EriB能够直接针对AML1-ETO融合蛋白，主要通过诱导细胞凋亡减少细胞存活率。这些都已经被形态学特征，sub-G1期细胞和annexinV+/PI-细胞增长的结果所证明。而且，超显微结构研究结果，线粒体跨膜电位以及EriB诱导的细胞凋亡都与线粒体通路紧密相关。Bcl-2和Bcl-XL，作为Bcl-2家族主要的抗凋亡蛋白，能够通过阻止线粒体孔的形成或者通道的开放抑制线粒体去极化，它们通过破坏线粒体来阻断促凋亡蛋白。已有研究报道，冬凌草甲素，一种从Rabdosia rubescens中分离得到的二萜类化合物，能够通过下调Bcl-2导致线粒体跨膜电位的崩溃，诱导NB4细胞和K562细胞凋亡。在成年人的T-细胞白血病细胞中，冬凌草甲素能够通过下调Bcl-XL诱导细胞凋亡。在本研究中，EriB能够显著的减少Bcl-2和Bcl-XL的mRNA和蛋白水平，这进一步提示内源性的凋亡通路参与了EriB诱导的细胞凋亡。
在AML细胞中NF-κB是组成型活化的，NF-κB在AML细胞中能够调控许多对凋亡和存活很重要的基因的表达，其中包括Bcl-2和Bcl-XL。NF-κB转录因子能够形成同二聚体和异二聚体，能够结合许多因子包括TNF-α，并有DNA结合位点特异性，。IκBα降解能够使NF-κB从无活性的细胞浆定位转移至细胞核内，起始靶基因的转录活化。最近研究显示冬凌草甲素的作用机制与阻断NF-κB信号通路相关。冬凌草甲素能够通过直接干扰NF-κB与DNA的结合能力，另外还通过影响IκBα磷酸化和降解来阻断NF-κB进核。在本研究中，我们证明有两个不同的信号通路参与了EriB介导的NF-κB活性的抑制。EriB通过直接破坏NF-κB与DNA的结合能力而不是影响其核浆定位来抑制内源性的NF-κB活性。当TNF-α存在时，EriB通过阻断IκBα磷酸化和降解来抑制TNF-α介导的NF-κB活性。因此，EriB能够负性调控两个NF-κB活化过程中的重要环节。由于NF-κB在白血病细胞中表达而在正常的原始细胞中，因此抑制NF-κB会诱导白血病特异的凋亡。
NF-κB是一个氧化还原敏感的转录因子，在细胞核中它与靶基因的结合需要一个还原的环境。在NF-κB与DNA的结合区域中氧化还原敏感的半胱氨酸可能会被氧化，导致NF-κB无法与靶基因结合。在本研究中，我们发现在Kasumi-1细胞中EriB在早期能够诱导细胞内ROS水平的上升，接着就观察到EriB诱导的NF-κB活性抑制以及细胞凋亡。抗氧化剂DTT能够完全抑制EriB所诱导的一系列改变，这一结果表明在EriB诱导NF-κB活性抑制过程中，氧化还原的平衡是非常重要的。另一方面，EriB被认为能够与蛋白的巯基相结合。EriB诱导的NF-κB活性抑制也可能由于EriB与NF-κB的DNA结合区域的半胱氨酸上的巯基相结合。当半胱氨酸上这些巯基形成二硫键，半胱氨酸即被氧化，这就会使得NF-κB不能与其靶基因结合。DTT能够减少二硫键的形成，使得半胱氨酸残基转变为还原状态，恢复NF-κB的活性。
Caspase-3的活化对白血病细胞的凋亡是非常重要的。Caspase-3除了能够在凋亡级联反应中起到作用外，它还可以切割IκBα氨基末端的ser32，导致IκBα泛素化位点的丢失，生成IκBα的非降解形式(ΔIκBα)。后者在与NF-κB二聚体相结合的过程中作为一个超级抑制物，它通过将NF-κB聚集在细胞浆中下调NF-κB的活性。EriB能够激活caspase-3，接着PARP被切割。在本研究中，我们检测到一个34kDa大小的IκBα剪切产物(ΔIκBα)，这一现象对应着caspase-3活性的增高以及细胞核内NF-κB蛋白水平的减少。Caspase-3的活化似乎也与EriB诱导的AML1-ETO降解相关。用Z-DEVD-fmk抑制caspase-3的活性能够完全阻断AML1-ETO降解，但仅能部分减少EriB诱导的凋亡，这提示在EriB诱导细胞凋亡过程中还存在着caspase-3非依赖的机制。
Raf/MEK/ERK级联反应的激活一般能够促进细胞存活，特别是在恶性血液细胞中。干扰ERK1/2可能会降低EriB诱导凋亡的门槛。AP-1活化能够促进细胞死亡，在哺乳动物细胞中主要的AP-1复合物成员是c-Jun和c-Fos。有研究表明，当细胞面对DNA遭受破坏时；c-Jun能够通过诱导CD95-L作为一个促凋亡调节子，而c-Fos既有促凋亡功能也有抗凋亡功能，这与细胞类型以及细胞外刺激因素相关。冬凌草甲素是从Isodonrubescen中分离出的二萜类化合物，它能够通过激活ERK1/2依赖的MAPK通路增加L929细胞的死亡率。在本研究中，我们证明在Kasumi-1细胞中，EriB快速的抑制ERK1/2磷酸化，导致转录因子AP-1的活化。这表明EriB能够抑制促存活信号调节子(例如：ERK1/2)，然而激活凋亡的阳性调节子(例如：AP-1)。在EriB诱导的凋亡过程中，这可能是caspase-3非依赖的机制。
综上所述，目前的研究证明EriB能够通过抑制NF-κB和MAPK信号通路诱导t(8；21)白血病细胞凋亡。EriB是一个潜在的治疗t(8；21)白血病的凋亡诱导者和治疗药物。
本发明所公开毛萼乙素在制药中的应用，其优点表现在：
(1)本发明对毛萼乙素发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
(2)本发明的毛萼乙素安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。
(3)毛萼乙素能够提高过氧化物(ROS)的水平，影响IκBα的磷酸化和降解，以及阻止NF-κB进核，从而抑制NF-κB信号通路。毛萼乙素还能够下调ERK1/2的磷酸化水平，抑制MAPKA信号通路。
附图说明
图1A显示EriB的化学结构。
图1B显示MTT实验中EriB处理各种白血病和淋巴瘤细胞株IC50结果，在Kasumi-1，NB4，NB4/R1和NB4/R2细胞中，IC50值低于1μM。
图1C显示用各种浓度EriB处理Kasumi-1细胞24和48小时后，细胞生长抑制和存活结果。柱形图代表在三次非依赖性实验中的平均值±标准差，在0.25μM EriB处理过的Kasumi-1细胞中观察到显著的细胞抑制效应和细胞生存率的下降。
图1D显示0.5或1μM EriB处理Kasumi-1，NB4和NB4/R2细胞48小时后的细胞形态，该图显示了典型的凋亡细胞。
图1E显示EriB处理Kasumi-1，NB4和NB4/R2细胞24和48小时后Annexin V的分析结果，EriB能够增高Annexin-V+/PI(右下方)和annexin-V+/PI+(右上方)细胞的百分比。
图2A显示0.25μM EriB处理过的Kasumi-1细胞中核内DNA含量的分布，显示了EriB处理后Kasumi-1细胞中sub-G1期细胞显著增多。
图2B显示Kasumi-1细胞的超微结构，与未处理对照细胞相比较(上方，7400×)，EriB处理过的Kasumi-1细胞(下方，7400×)显示线粒体损伤以及溶酶体数量的增多(箭头所指处)。
图2C显示经EriB处理24和48小时的Kasumi-1细胞线粒体跨膜电位下降，散点图下方的数字代表Rh123弱信号的细胞比例。
图2D显示Caspase-3，active(Δ)caspase-3和PARP蛋白的western blot分析，其中β-actin作为上样量的参照，在用EriB处理过的Kasumi-1，NB4和NB4/R2细胞中，caspase-3被激活，PARP被降解。
图3A显示用western blot检测Bcl-2，Bcl-XL和Bax蛋白的表达水平，用0.25和0.5μM EriB处理Kasumi-1细胞24和48小时后，Bcl-2和Bcl-XL的蛋白水平都在下降，而Bax则没有变化。
图3B显示用RT-PCR检测Bcl-2，Bcl-XL和Bax mRNA水平，用0.25和0.5μM EriB处理Kasumi-1细胞24和48小时后，Bcl-2和Bcl-XL的mRNA水平都在下降，而Bax则没有变化。
图3C显示EriB能够诱导下调Bcl-2/Bax的比率，条带的强度用密度仪定量。
图3D显示EriB能够诱导下调Bcl-XL/Bax的比率，条带的强度用密度仪定量。
图4A显示在荧光素酶报告实验中EriB下调NF-κB依赖的转录。用NF-κB介导的荧光素酶报告质粒和β-gal质粒瞬时转染Kasumi-1细胞。在用0.25和0.5μM EriB处理细胞1小时后，再加入TNF-α孵育4小时。柱形图代表在三次非依赖性实验中的平均值±标准差(上方)。Westernblot检测NF-κB(P65)(下方)。
图4B显示EriB抑制NF-κB的DNA结合能力。Kasumi-1细胞的处理方法：用NF-κB介导的荧光素酶报告质粒和β-gal质粒瞬时转柒Kasumi-1细胞(左方)，用0.2mM DTT，0.25和0.5μM EriB以及EriB联合0.2mMDTT分别处理4小时(右方)。核蛋白提取物被制备出来，应用EMSA实验检测NF-κB的DNA结合能力。
图4C显示在Kasumi-1细胞中用免疫荧光方法检测细胞内的P65转移。在未处理的Kasumi-1细胞中，NF-κB(P65)主要定位在细胞浆中，100ng/ml TNF-α处理细胞4小时后，在细胞核中检测到显著的NF-κB(P65)染色。用EriB预处理1小时则能抑制TNF-α诱导的NF-κB(P65)的转移。
图4D显示当TNF-α存在时，EriB能够诱导IκBα磷酸化和降解。在用100ng/ml TNF-α处理Kasumi-1细胞前，有EriB预先处理1小时。细胞核和细胞浆内的蛋白被制备出来用于western blot检测P65蛋白。LaminB用作核内蛋白的对照。从全细胞裂解液中提取出的等量蛋白用于western blot检测IκBα的磷酸化形式和总的IκBα。
图4E显示DTT抑制Kasumi-1细胞中EriB诱导的细胞凋亡和ROS产生。细胞与0.2mM DTT和0.5μM EriB孵育12小时。线粒体跨膜电位用流式细胞仪检测。上方：Rh123弱表达细胞比例。细胞用0.2mM DTT和0.5μM EriB处理2小时。下方：细胞荧光强度的增加。柱形图代表在三次非依赖性实验中的平均值±标准差。
图4F显示EriR诱导IκBα的切割。用0.25和0.5μM EriB处理Kasumi-1细胞24和48小时。提取核蛋白用于western blot检测P65。全细胞裂解液中IκBα蛋白用抗羧基端IκBα抗体(C-IκBα)和抗-氨基端抗体(N-IκBα)。IκBα和ΔIκBα条带的位置用箭头指示。
图5A显示EriB诱导Kasumi-1细胞中AML1-ETO降解。用0.25和0.5μM EriB处理细胞24和48小时。全细胞裂解液中AML1-ETO的蛋白水平用抗ETO抗体检测。
图5B显示western blot检测caspase-3，caspase-3活性形式(Δcaspase-3)，PARP和AML1-ETO蛋白的表达。Kasumi-1细胞在用0.5μMEriB处理48小时前，与40μM Z-DEVD-fmk预先孵育1小时。Z-DEVD-fmk能够完全抑制caspase-3活化，PARP切割和AML-ETO降解。
图5C显示Z-DEVD-fmk仅能部分减少EriB诱导的凋亡。Kasumi-1细胞的处理方式：用0.5μM EriB处理48小时前，与40μM Z-DEVD-fmk预先孵育1小时。柱形图代表在三次非依赖性实验中的annexin V+细胞比例的平均值±标准差。
图6A显示EriB抑制ERK的磷酸化。用0.25和0.5μM EriB处理Kasumi-1细胞24和48小时后，用western blot分析方法检测p42/44ERK蛋白的磷酸化形式(上方)。用0.5μM EriB处理Kasumi-1细胞0，0.5，1，2，4，6和12小时后，同样方法检测ERK1/2的磷酸化(下方)。
图6B显示EriB诱导c-Jun和c-Fos的表达。Kasumi-1细胞处理方式：用0.25和0.5μM EriB处理Kasumi-1细胞24和48小时(下方)，对c-Jun的磷酸化形式(p-c-Jun)，c-Jun和c-Fos的表达进行了westernblot检测。
图6C显示EriB诱导AP-1依赖性转录的增加。Kasumi-1细胞瞬时转染AP-1介导的荧光素酶报告质粒以及用作转染效率对照的β-gal质粒，接着用0.5μM EriB处理4小时。柱形图代表在三次非依赖性实验中的annexin V+细胞比例的平均值±标准差。
图7A显示EriB抑制来自t(8；21)AML患者的原代白血病细胞生长以及诱导其凋亡。台盼蓝排斥实验用于检测该效应。
图7B显示EriB抑制来自t(8；21)AML患者的原代白血病细胞生长以及诱导其凋亡。形态学研究用于检测该效应。
图7C显示用0.1和0.25μM EriB处理来自一位t(8；21)AML患者的原代白血病细胞12和24小时后Bcl-XL和Bcl-2的表达减少。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
EriB能够抑制人的白血病细胞生长并诱导细胞凋亡
用MTT法检测EriB对人类恶性血液肿瘤细胞生长的影响。EriB对这些细胞的半数生长抑制量在0.2-2μM之间。不同浓度的EriB对所有被检测细胞均有生长抑制作用。EriB对Kasumi-1细胞的半数生长抑制量为0.2μM，对NB4和NB4/R2细胞为0.5μM，对NB4R1，HL60和U937细胞为1μM。恶性淋巴细胞增殖疾病对毛萼乙素敏感性比髓系白血病细胞低，Raji，Daudi和Jurkat细胞的IC50值高于1.5μM(见图1B)。
Kasumi-1细胞对EriB最敏感，EriB对细胞的生长抑制作用有时间和剂量的依赖性(见图1C左)，细胞的存活率也对应下降(见图1C右)。在低于0.25μM的浓度下，也能观察到抑制效应。用0.25μM和0.75μMEriB处理Kasumi-1细胞48小时后，分别有42.7±6.5％和90.5±4.3％细胞死亡(见图1C右)。
为了检测EriB是否通过诱导细胞凋亡导致细胞生长抑制，对Kasumi-1细胞的形态和annexin V-FITC/PI进行了检测。经0.5μMeriB处理过的Kasumi-1细胞表现出特征性的凋亡形态学改变，例如：收缩的细胞浆，固缩的染色质，细胞核碎裂和完整的细胞膜，1μM EriB处理后的NB4和NB4/R2细胞也表现出类似的特征(见图1D)。Kasumi-1细胞经0.5μM EriB处理48小时后，annexin V-阳性细胞的比例增长至88.6％，这个比例高于1μM EriB处理48小时后的NB4和NB4/R2细胞(见图1E)。用0.25μM EriB处理Kasumi-1细胞6，12，24和48小时，在细胞周期分析中显示亚G1期比例升高提示毛萼乙素诱导细胞凋亡，但没有细胞周期的改变(见图2A)。
0.1和0.25μM EriB处理Kasumi-1细胞7天，没有改变其髓系细胞和单核细胞分化相关抗原的表达，例如：CD11b，CD13，CD14，CD33，CD34和CD64，也没有诱导其分化。
实施例2
毛萼乙素在凋亡诱导浓度下破坏线粒体，激活caspase-3
为了研究Kasumi-1细胞在凋亡早期超微结构的改变以及寻找参与凋亡机制的提示，我们进行了透射显微镜分析。正常的肿瘤细胞细胞核形状不规则，含有大量的粗糙内质网和线粒体(见图2B)，用EriB处理6小时后的Kasumi-1细胞显示出膨胀的细胞，溶酶体数量的增加，肿胀和衰弱的线粒体(见图2B)，这提示细胞早期凋亡和线粒体损伤(见图2B)。
经EriB处理后的Kasumi-1细胞与Rh123孵育后用于流式细胞仪的检测，结果显示线粒体跨膜电位明显下降，并且有时间和剂量的依赖性(见图2C)。在Kasumi-1，NB4和NB4/R2细胞中，与线粒体跨膜电位改变同步发生的还有caspase-3的剪切(见图2D)。PARP是一种参与DNA修复的核酶，当DNA收到损伤的时候，它会被特异的剪切成85-kDa的片段(ΔPARP)，在毛萼乙素处理的过程中PARP也被降解了(见图2D)。这些结果提示毛萼乙素通过依赖于caspase活化的内源性线粒体通路诱导细胞凋亡。
实施例3
毛萼乙素通过下调Bcl-2和Bcl-XL作用于内源性凋亡通路
Bcl-2家族蛋白直接控制线粒体膜的通透性，它们是caspase活化的中心调节者。该家族抗凋亡和促凋亡的相对成员决定了细胞的生死命运。为了检测EriB是否通过作用于Bcl-2家族成员破坏线粒体，我们用western blot和RT-PCR的方法检测了经EriB处理24和48小时后，Kasumi-1细胞中抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-XL以及促凋亡因子Bax的表达情况。Bcl-2和Bcl-XL在蛋白和mRNA水平上均有减少，然而Bax的表达没有显著变化(见图3A和图3B)。最终，EriB诱导Bcl-2/Bax和Bcl-XL/Bax比率的负性调节(见图3C和图3D)，这与Kasumi-1细胞凋亡过程中线粒体稳定性被破坏的结果相吻合。
实施例4
EriB抑制Kasumi-1细胞内源性和TNF-α诱导的NF-κB活化
EriB能够减少Bcl-2和Bcl-XL的mRNA水平，它们的转录都是直接受NF-κB调控的。为了研究EriB是否嫩能够阻断内在的和TNF-α介导的NF-κB活化，我们进行了荧光素酶报告实验。在Kasumi-1细胞中NF-κB显示出基础的转录活性，这提示NF-κB是组成型活化的，在加入TNF-α4小时后，荧光素酶活性大约增加4倍(见图4A)。用EriB预处理细胞1小时后，基础的荧光素酶活性和TNF-α诱导的NF-κB活性均被阻断(见图4A)。然而，EriB和TNF-α单独或联合均对P65的蛋白水平没有影响(见图4A)。EMSA实验显示经TNF-α处理后的Kasumi-1细胞显示出明显的NF-κB活性上调，然而在加入TNF-α前用EriB处理1小时能够阻断NF-κB活化(见图4B)。但是，一种能够阻止二硫键形成的化合物DTT，能够减少EriB的这种抑制效应(见图4B)。这提示EriB的抑制效应是氧化还原敏感的。我们还分析了Kasumi-1细胞中特异的NF-κB复合物，迁移较慢的蛋白-DNA复合物对应着P65-P50二聚体。这些结果提示NF-κB在Kasumi-1细胞中是组成型活化的，在EMSA实验中，EriB能够抑制内源性的和TNF-α诱导的NF-κB活性。
实施例5
毛萼乙素在Kasumi-1细胞中阻止NF-κB的核转移以及IκB-α的降解
为了进一步理解EriB介导的NF-κB失活的机制，我们进行了免疫荧光检测和western blot分析。尽管在Kasumi-1细胞中EriB本身对P65核转移没有明显的影响，但它能够显著的阻止TNF-α诱导的P65快速进核(见图4C)。EriB处理Kasumi-1细胞后，细胞核中的NF-κB减少，而细胞浆中的则增加(见图4D)。为了检测EriB对细胞核内NF-κB的作用，我们制备了Kasumi-1细胞的核蛋白提取物。EriB处理24和48小时后，Kasumi-1细胞中的核蛋白减少(见图4F)。
IκBα通过将NF-κB隔离在细胞浆中来调节NF-κB的活性。IκBα经泛素化后就会被蛋白酶体降解，这就会导致NF-κB的核转运。在本研究中，TNF-α在4小时内诱导IκBα磷酸化，然而EriB预处理后该蛋白的磷酸化反而受到抑制(见图4D)。为了检测在细胞核内NF-κB水平减少的过程中IκBα所扮演的角色，我们对经EriB处理的Kasumi-1细胞总蛋白进行了western blot分析。我们用抗IκBα羧基端的抗体能够检测到37和34kDa二种蛋白形式，然而用抗IκBα氨基端的抗体则不能检测到34kDa大小的蛋白形式(见图4F)。这些结果提示EriB诱导IκBα被切割成一个34kDa大小的产物(ΔIκBα)。ΔIκBα缺少泛素化位点，通过将NF-κB稳定的隔离在细胞浆中产生对其的超级抑制物的作用。
综上所述，EriB能够通过直接抑制NF-κB与DNA的结合能力抑制内源性的NF-κB活性，以及主要通过抑制IκBα的磷酸化和降解来阻断TNF-α诱导的NF-κB活性。
实施例6
DTT抑制EriB诱导的Kasumi-1细胞凋亡和过氧化物(ROS)水平升高
有研究表明EriB通过与活性SH基相互作用来发挥它的毒性作用。为了证明这个作用机制是否参与了EriB诱导的细胞凋亡，我们用0.5μMEriB和0.2mM DTT持续处理Kasumi-1细胞。DTT单独处理细胞对Rh123细胞的比例没有产生影响(见图4E)。然而，0.2mM DTT能够完全抑制EriB诱导的凋亡(见图4E)。为了研究ROS是否与EriB诱导的凋亡相关，我们用一种细胞通透性染料H2DCFDA进行流式细胞仪分析。在ROS存在的情况下，H2DCFDA会被特异的切割并发出一定波长的荧光。用0.5μM EriB单独处理Kasumi-1细胞2小时，细胞内ROS水平与未处理细胞相比大约升高2倍，然而当0.2mM DTT与EriB共同孵育时，ROS水平却没有发生改变(见图4E)。
实施例7
EriB诱导AML-ETO融合蛋白发生降解，这一变化能够被caspase-3抑制剂拮抗
AML-ETO融合蛋白是由t(8；21)染色体易位产生的，AML-ETO被认为在带有这种融合蛋白的AML治疗中是一个重要的治疗靶点。我们用用抗ETO的抗体检测发现用EriB处理24和48小时后的Kasumi-1细胞中AML1-ETO被降解(见图5A)，这提示EriB直接这对该融合蛋白。AML1-ETO的降解与caspase-3活化的发生时间是一致的，因此我们进一步研究了在EriB诱导凋亡的过程中，caspase-3活化与AML1-ETO降解之间的关系。在EriB处理Kasumi-1细胞的过程中预先加入了caspase-3的抑制剂Z-DEVD-fmk(40μM)。Z-DEVD-fmk能够完全阻断EriB诱导的caspase-3活化，PARP降解以及AML-ETO降解(见图5B)。然而，在0.5μM EriB处理Kasumi-1细胞的时候预先加入Z-DEVD-fmk孵育1小时，细胞凋亡率(annexin V阳性的细胞比例)仅部分减少(见图5C)。这些结果提示，EriB诱导的AML1-ETO降解是一个伴随caspase-3发生的事件。然而，在EriB诱导的凋亡过程中除了caspase-3活化之外还存在不依赖于caspase-3的机制。
实施例8
EriB在Kasumi-1细胞中抑制ERK通路以及激活AP-1通路
Ras/Raf/MEK/ERK通路是一个参与控制造血细胞增殖的重要信号级联反应，破坏这条通路在AML中会使促凋亡信号占优势。为了检测EriB对ERK活化的作用，我们用抗ERK1/2磷酸化形式(p-ERK1/2)的抗体进行了western blot分析。在Kasumi-1细胞中，EriB处理12和24小时后，ERK1/2的磷酸化水平快速降低(见图6A)。事实上，从EriB处理Kasumi-1细胞30分钟起，p-ERK1/2就已经开始降低(见图6A)。
早期的体外实验表明，AP-1活性的提高能够导致特异的人肿瘤细胞凋亡。AP-1蛋白复合体在哺乳动物中的主要组分为c-Jun和c-Fos。在Kasumi-1细胞中，EriB能够快速的诱导c-Jun，c-Fos和磷酸化的c-Jun表达(见图6B)。C-Jun磷酸化形式的增加即c-Jun的活化提示这个转录因子在EriB诱导的凋亡中扮演了潜在的角色。为了进一步评估EriB对AP-1的活性的作用，我们进行了荧光素酶报告实验。在Kasumi-1细胞中瞬时转染pAP-1-Luc报告质粒，加入EriB 4小时后荧光素酶活性升高约3倍(见图6C)，这提示EriB在Kasumi-1细胞中通过诱导c-Jun，c-Fos和c-Jun磷酸化形式的表达来增强转录因子AP-1的活性。
实施例9
毛萼乙素诱导来自t(8；21)患者的白血病细胞凋亡
0.1和0.25μM EriB处理来自t(8；21)患者的白血病原代细胞，能够显著抑制细胞生长，在全部5例病人中达到超过60％的细胞抑制(见图7A)。在用0.1μM EriB处理24小时后，我们观察到典型的带有凋亡特征的形态学改变(见图7B)。EriB还能在处理12和24小时后降低Bcl-2和Bcl-XL的水平(见图7C)。这些结果提示白血病原代细胞对EriB非常敏感。

Claims (6)

1、毛萼乙素在制备治疗急性白血病药物中的应用。
2、根据权利要求1所述的应用，毛萼乙素在制备治疗含有AML1-ETO融合基因的急性髓系白血病药物中的应用。
3、根据权利要求1所述的应用，毛萼乙素在制备治疗急性早幼粒细胞白血病药物中的应用。
4、根据权利要求1所述的应用，毛萼乙素在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
5、根据权利要求1所述的应用，毛萼乙素在制备治疗T细胞急性淋巴母细胞白血病药物中的应用。
6、毛萼乙素在制备治疗伯基特淋巴瘤药物中的应用。
CNB2005101100898A 2005-11-07 2005-11-07 毛萼乙素在制药中的应用 Expired - Fee Related CN100370981C (zh)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2005101100898A CN100370981C (zh) 2005-11-07 2005-11-07 毛萼乙素在制药中的应用
EP06791205A EP1952811A4 (en) 2005-11-07 2006-10-08 USE OF ERIOCALYXIN B FOR THE MANUFACTURE OF MEDICAMENTS FOR THE TREATMENT OF LEUKEMIA
US12/092,914 US20080300299A1 (en) 2005-11-07 2006-10-08 Application of Eriocalyxin B in the Manufacture of Medicaments For Treating Leukemia
JP2008539213A JP2009514903A (ja) 2005-11-07 2006-10-08 製薬におけるエリオカリキシンｂの応用
PCT/CN2006/002623 WO2007051390A1 (fr) 2005-11-07 2006-10-08 Utilisation de l'eriocalyxine b pour la fabrication de medicaments destines au traitement de la leucemie

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2005101100898A CN100370981C (zh) 2005-11-07 2005-11-07 毛萼乙素在制药中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1868468A true CN1868468A (zh) 2006-11-29
CN100370981C CN100370981C (zh) 2008-02-27

Family

ID=37442335

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2005101100898A Expired - Fee Related CN100370981C (zh) 2005-11-07 2005-11-07 毛萼乙素在制药中的应用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20080300299A1 (zh)
EP (1) EP1952811A4 (zh)
JP (1) JP2009514903A (zh)
CN (1) CN100370981C (zh)
WO (1) WO2007051390A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101318965B (zh) * 2008-07-18 2010-11-24 中国科学院昆明植物研究所 毛萼乙素结晶、其制备方法及含有其的药物组合物
CN102247350A (zh) * 2011-05-23 2011-11-23 上海交通大学医学院附属瑞金医院 毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用
CN110063949A (zh) * 2019-05-14 2019-07-30 大连理工大学 王枣子乙素在制备用于治疗肺癌的药物中的用途
CN111363015A (zh) * 2020-03-17 2020-07-03 江西省人民医院 分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2473161T3 (en) * 2009-08-31 2017-09-11 Dr Reddys Laboratories Ltd TOPICAL FORMULATIONS INCLUDING A STEROID
CN102372724A (zh) * 2010-08-26 2012-03-14 苏州宝泽堂医药科技有限公司 一种提取毛萼乙素的方法
EP3007686A4 (en) * 2013-06-10 2017-03-15 Yeda Research and Development Co., Ltd. Compositions and methods for treating a hematological malignancy associated with an altered runx1 activity or expression

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1424028A (zh) * 2002-11-21 2003-06-18 中国科学院昆明植物研究所 一种治疗癌症的药物及其用途
CN1486712A (zh) * 2003-08-09 2004-04-07 北海国发海洋生物产业股份有限公司 中药冬凌草有效部位抗肿瘤药物提取物及其制备方法
CN1329083C (zh) * 2004-03-11 2007-08-01 上海第二医科大学附属瑞金医院 一种降解aml1－eto融合蛋白的方法及所用试剂
CN100479815C (zh) * 2004-03-11 2009-04-22 上海第二医科大学附属瑞金医院 一种治疗m2型急性髓性白血病的药物及其注射液的制备

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101318965B (zh) * 2008-07-18 2010-11-24 中国科学院昆明植物研究所 毛萼乙素结晶、其制备方法及含有其的药物组合物
CN102247350A (zh) * 2011-05-23 2011-11-23 上海交通大学医学院附属瑞金医院 毛萼乙素在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用
CN110063949A (zh) * 2019-05-14 2019-07-30 大连理工大学 王枣子乙素在制备用于治疗肺癌的药物中的用途
CN111363015A (zh) * 2020-03-17 2020-07-03 江西省人民医院 分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN100370981C (zh) 2008-02-27
WO2007051390A1 (fr) 2007-05-10
JP2009514903A (ja) 2009-04-09
EP1952811A1 (en) 2008-08-06
US20080300299A1 (en) 2008-12-04
EP1952811A4 (en) 2010-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wu et al. Biologically synthesized green gold nanoparticles from Siberian ginseng induce growth-inhibitory effect on melanoma cells (B16)
Liu et al. Shikonin induces apoptosis and prosurvival autophagy in human melanoma A375 cells via ROS-mediated ER stress and p38 pathways
Jiang et al. Oridonin‐induced mitochondria‐dependent apoptosis in esophageal cancer cells by inhibiting PI3K/AKT/mTOR and Ras/Raf pathways
Shen et al. Evaluation of the anti-inflammatory activity of zhankuic acids isolated from the fruiting bodies of Antrodia camphorata
Yang et al. Autophagy is associated with apoptosis in cisplatin injury to renal tubular epithelial cells
CN1868468A (zh) 毛萼乙素在制药中的应用
Kuo et al. Cantharidin induces apoptosis in human bladder cancer TSGH 8301 cells through mitochondria-dependent signal pathways
Feng et al. Novel function of scutellarin in inhibiting cell proliferation and inducing cell apoptosis of human Burkitt lymphoma Namalwa cells
Wang et al. Comparison of hepatotoxicity and mechanisms induced by triclosan (TCS) and methyl-triclosan (MTCS) in human liver hepatocellular HepG2 cells
Wang et al. Brevilin A promotes oxidative stress and induces mitochondrial apoptosis in U87 glioblastoma cells
Lyu et al. Cell-penetrating peptide conjugates of gambogic acid enhance the antitumor effect on human bladder cancer EJ cells through ROS-mediated apoptosis
Lee et al. Phellinus linteus extract induces autophagy and synergizes with 5-fluorouracil to inhibit breast cancer cell growth
Scherbakov et al. Antiestrogenic and antiproliferative potency of secoisolariciresinol diglucoside derivatives on MCF-7 breast cancer cells
Hadisaputri et al. Caspase cascade activation during apoptotic cell death of human lung carcinoma cells A549 induced by marine sponge Callyspongia aerizusa
Li et al. The effect of resveratrol, curcumin and quercetin combination on immuno-suppression of tumor microenvironment for breast tumor-bearing mice
Amini et al. The p53 modulated cytotoxicity of ophiocoma scolopendrina polysaccharide against resistance ovarian cancer cells
Wang et al. Preclinical evaluation on the tumor suppression efficiency and combination drug effects of fermented wheat germ extract in human ovarian carcinoma cells
Mahmoud et al. Effects of silymarin and mesenchymal stem cells on hematological and some biochemical changes induced by gamma radiation in albino rats
CN1215070C (zh) 前胡丙素在制备治疗肿瘤药物中的应用
Hussein et al. Evaluation of the anticancer effect of violacein, phycocyanin and phycocyanobilin on apoptotic genes expression and glycan profiles in breast cancer cells
CN1165301C (zh) 组合物在制备治疗癌症的药物中的用途
Rajan et al. Saccharomyces cerevisiae-induced apoptosis of monolayer cervical cancer cells
Chou et al. Involvement of p38 MAPK in the Anticancer Activity of Cultivated Cordyceps militaris
Muthiyan et al. Antiproliferative and proapoptotic activities of marine sponge Hyrtios erectus extract on breast carcinoma cell line (MCF-7)
CN100346830C (zh) 一种治疗b细胞淋巴瘤的药物组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20061027

Address after: No. two, No. 197, Ruijin, Shanghai

Applicant after: Affiliated Ruijin Hospital of Shanghai Second Medical University

Co-applicant after: Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences

Address before: No. two, No. 197, Ruijin, Shanghai

Applicant before: Affiliated Ruijin Hospital of Shanghai Second Medical University

C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080227

Termination date: 20111107