CN114015752B - 一种适用于单细胞测序的小鼠视网膜冰冻组织细胞核悬液及其制备方法和应用 - Google Patents
一种适用于单细胞测序的小鼠视网膜冰冻组织细胞核悬液及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液的制备方法，所述方法包括：配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇‑蔗糖溶液1、碘克沙醇‑蔗糖溶液2，并置于冰上预冷；将小鼠视网膜冰冻组织取出至置于冰上的培养皿中，用预冷的PBS洗涤后，转移至离心管中；离心管埋于冰中，加入细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织并孵育；使用细胞筛进行过滤至新的离心管中，离心弃上清；使用碘克沙醇‑蔗糖溶液进行密度梯度离心；向细胞核沉淀中加入细胞核洗涤缓冲液，离心弃上清；用细胞核洗涤缓冲液重悬沉淀，吸取单细胞核进行镜检细胞核浓度、细胞核碎片比例及细胞核结团比例。本发明还公开了上述制备方法在单细胞转录组测序中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种适用于单细胞核测序的小鼠视网膜组织的细胞核悬液及其制备方法和应用。
背景技术
单细胞转录组测序以单个细胞分辨率来揭示组织的异质性，也已成为生命科学研究的基础技术手段。近几年发展起来的单细胞核测序技术，因为能够解决常规组织解离带来的细胞类型偏好等问题，也得到越来越广泛的应用，如《Systematic assessment oftissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows》一文中，对单细胞核测序进行了系统的比较和验证。
单细胞核测序中，单细胞核悬液的制备是最为关键的步骤，大致分为以下两步：1)裂解；2)纯化。现有技术已在大量常规样本中得到应用，并能取得较为理想的效果，但在一些特殊组织中作用并不好。例如小鼠视网膜组织，它是由多种类型的相互连接的神经元和神经胶质细胞形成的复杂组织，采用现有技术进行单细胞核悬液的制备，往往细胞核总量少，碎片杂质很多，出现大量结团，无法达到单细胞测序的实验要求。特别是对冻存的小鼠视网膜组织，更加难以制备得到满足单细胞核测序上机要求的悬液。因此亟需开发一种新的适用于冻存小鼠视网膜组织的单细胞核悬液的制备方法和流程。
现有技术中对胚胎、脑组织细胞核悬液的制备进行单细胞测序研究较多，市场上也有动物组织细胞核悬液制备相关的试剂盒，但缺少专门针对小鼠视网膜组织细胞核悬液的制备方法，而因为组织理化性质的差异，适用于胚胎和脑组织的细胞核悬液的制备方法不适用视网膜组织。
发明内容
现有技术中使用单一的非离子型去污剂，已在大量常规样本中得到应用，但在一些特殊组织中作用并不好。例如小鼠视网膜组织，它是由多种类型的相互连接的神经元和神经胶质细胞形成的复杂组织，采用单一的非离子型去污剂制备小鼠视网膜冰冻组织的细胞核悬液，细胞核总量较低且碎片比例较高，且很难通过进一步纯化等操作进行提升，因此无法开展单细胞核测序。为了解决现有技术存在的不足，本发明所述技术方案采用两种非离子去污剂组合使用，有效提高细胞核数量。同时为进一步提高细胞核悬液质量，采用低温离心纯化方法，确保操作过程中RNA完整性良好。因此，本发明所述技术方案采用碘克沙醇-蔗糖溶液作为小鼠视网膜组织细胞核的纯化方法。
本发明的目的是提供一种适用于小鼠视网膜组织单细胞测序的细胞核悬液的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)配置试剂：先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇-蔗糖溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于冰上预冷。
(2)样品准备：将小鼠视网膜冰冻组织取出至培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷的PBS洗涤，弃漂洗液，转移至离心管中。
(3)组织破碎及细胞膜裂解：加入细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中。冰上孵育。
(4)过筛：使用细胞筛进行过滤至新的离心管中，离心弃上清，用细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀，得细胞核悬液。
(5)纯化：使用碘克沙醇-蔗糖溶液进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液。离心弃上清，得到细胞核沉淀。
(6)洗涤：向细胞核沉淀中加入细胞核洗涤缓冲液，离心弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
进一步地，所述方法还包括步骤(7)：细胞核计数和形态观察吸取单细胞核进行镜检细胞核浓度、细胞核碎片比例及细胞核结团比例。
步骤(1)中，所述细胞核裂解液包含以下成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.1％～0.2％(v/v)TritonX-100、0.1％～0.2％(v/v)吐温20、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)。
步骤(1)中，所述裂解主要成分TritonX-100的终浓度为0.1％～0.2％(v/v)，优选地，为0.1％(v/v)。
步骤(1)中，所述裂解主要成分吐温20的终浓度为0.1％～0.2％(v/v)，优选地，为0.1％(v/v)。
步骤(1)中，所述细胞核洗涤缓冲液包含以下成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％～2％(v/v)BSA。
步骤(1)中，所述细胞核洗涤缓冲液主要成分BSA，终浓度为1％～2％(v/v)，优选地，为1％(v/v)。
步骤(1)中，所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖的混合溶液，总体积为600μL。
步骤(1)中，所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖的混合溶液，总体积为600μL。
步骤(1)中，所述成分分别购自Tris-HCl(Invitrogen；15567027)、CaCl2(Sigma-Aldrich；21115-100ML)、Mg(AC)2(Sigma-Aldrich；63052-100ML)、NaCl(Thermo FisherScientific；AM9760G)、TritonX-100(Sigma-Aldrich；93443-100ML)、吐温20(Sigma-Aldrich；P9416-100ML)、RNase Inhibitor(Enzymatics&QIAGEN；Y9240L)、碘克沙醇(Sigma-Aldrich；1343517-200MG)、蔗糖(Sigma-Aldrich；V900116)、BSA(BSA；MACS,130091376)。
步骤(1)中，所述冰上预冷温度是0～4℃，优选地，为0℃，置于冰上预冷。
步骤(2)中，所述冰冻组织的取样量为30～50mg；优选地，为40mg。
步骤(2)中，进行PBS洗涤目的是将样本上残留的血液充分洗涤。
步骤(2)中，所述PBS洗涤次数为1～3次，优选地为1次。
步骤(2)中，所述小鼠视网膜冰冻组织为新鲜取材后，进行液氮速冻，-80℃保存的冰冻组织。
步骤(2)中，所述冰是指制冰机产生的碎冰，装于方形泡沫盒里，将离心管埋于碎冰中。
步骤(3)中，加入细胞核裂解液1～3mL，优选地，为2mL。
步骤(3)中，所述电动匀浆仪品牌是Omni international，编号为TH-02。
步骤(3)中，所述电动匀浆时间为3～5s，优选地，为3s。
步骤(3)中，所述冰上孵育的时间为5～7min，优选地，为5min。
步骤(3)中，所述离心管为Eppendorf ProteinTubes低吸附离心管，编号为0030122356。
步骤(4)中，所述细胞筛孔径为40μm。
步骤(4)中，所述15mL离心管为Eppendorf ProteinTubes低吸附离心管，编号为0030122216。
步骤(4)中，所述离心机的条件为800～1000×g、4～6℃离心10～15min，优选地，为1000×g，4℃离心10min。
步骤(5)中，所述纯化目的是去除碎片杂质，纯化细胞核，以得到高质量的单细胞核悬液。
步骤(5)中，所述细胞核悬液-碘克沙醇预混液是指所述步骤4中得到的400μL细胞核悬液与400μL的50％(v/v)碘克沙醇溶液进行1:1混匀。
步骤(5)中，所述离心机为低温离心机，离心机温度为4～6℃，优选地，为4℃。
步骤(5)中，所述离心机转速为2000～3000×g，优选地，为3000×g。
步骤(5)中，所述离心时间为20～30min，优选地，为30min。
步骤(6)中，所述加入细胞核洗涤缓冲液的体积为5～7mL，优选地，为5mL。
步骤(6)中，所述离心机转速为500～800×g、4～6℃离心5～7min，优选地，为600×g，4℃离心5min。
步骤(6)中，所述细胞核悬液的细胞核浓度为1200～1600个/μL、细胞核碎片比例为7％～8％、细胞核结团比例为5％～6％。
步骤(7)中，所述镜检使用质量分数0.4％的台盼蓝(Thermo Fisher Scientifc，T10282)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL解离液混匀，进行镜检。
本发明所述方法还适用于小鼠视网膜新鲜组织，需要进行预处理，针对装有组织保护液的小鼠视网膜，首先需要弃掉保护液，使用PBS清洗2次；针对装有组织冻存液的小鼠视网膜，先37℃孵育2min，弃掉冻存液，使用PBS清洗2次。小鼠视网膜新鲜组织完成预处理后，可按本发明所述技术方法进行小鼠细胞核悬液的制备。
本发明还提供了由上述方法制备得到的适用于小鼠视网膜组织单细胞测序的细胞核悬液。
其中，所述细胞核悬液的细胞核浓度为1200～1600个/μL、细胞核碎片比例为7％～8％、细胞核结团比例为5％～6％。
本发明还提供了所述细胞核悬液在小鼠视网膜组织单细胞测序中的应用。
本发明还提供了所述细胞核悬液在小鼠视网膜组织单细胞转录组测序中的应用。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇-蔗糖溶液1和碘克沙醇-蔗糖溶液2。
其中，所述细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇-蔗糖溶液1和碘克沙醇-蔗糖溶液2的体积比例为(20～30)：(50～70)：6：6；优选地，为10：25：3：3。
其中，所述细胞核裂解液包含以下成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mMCaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.1％～0.2％(v/v)TritonX-100、0.1％～0.2％(v/v)吐温20、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)。
其中，所述细胞核裂解液的主要成分TritonX-100的终浓度为0.1％～0.2％(v/v)；优选地，为0.1％(v/v)。
其中，所述细胞核裂解液的主要成分吐温20的终浓度为0.1％～0.2％(v/v)；优选地，为0.1％(v/v)。
其中，所述细胞核洗涤缓冲液包含以下成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％～2％(v/v)BSA。
其中，所述细胞核洗涤缓冲液的主要成分BSA的终浓度为1％～2％(v/v)；优选地，为1％(v/v)。
其中，所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖的混合溶液，总体积为600μL。
其中，所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖的混合溶液，总体积为600μL。
本发明还提供了所述试剂盒在小鼠视网膜组织单细胞测序中的应用。
本发明还提供了所述试剂盒在小鼠视网膜组织单细胞转录组测序中的应用。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果包括：(1)填补了目前的技术空白，目前尚缺少专门针对小鼠视网膜的细胞核悬液的制备方法，本发明提供的技术方案解决了这一问题，将有力促进单细胞测序的应用；(2)解决了现有技术制备得到的视网膜组织细胞核悬液无法上机进行单细胞测序的问题；(3)制备得到的小鼠视网膜细胞核总量提升至30万，碎片比例、结团比例均降至10％以下，可顺利完成单细胞核测序实验。因此，本发明所述的技术方案提升了制备到的细胞核悬液的各项质量指标。(4)提供一种用于小鼠视网膜细胞核制备的试剂盒，可高效、快速、稳定地获得单细胞核总量多、碎片比例少、结团比例低的单细胞核悬液，可应用于小鼠视网膜组织的单细胞核制备，获得的单细胞核悬液可进一步适用于单细胞测序研究，为视网膜样本的单细胞研究提供了良好工具。
附图说明
图1是小鼠视网膜制备细胞核悬液镜检结果。
图2是小鼠视网膜制备的细胞核RNA质检结果。
图3是小鼠视网膜单细胞聚类结果。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
本发明提出了一种简便、高效地从小鼠视网膜组织中分离细胞核的方法，所得单细胞核悬液适用于单细胞转录组测序。
实施例1
本实施例描述本发明所述小鼠视网膜冰冻组织细胞核制备方法在单细胞测序中应用。本发明所述细胞核裂解液主要成分0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20，细胞核洗涤缓冲液主要成分为1％(v/v)BSA，纯化方式采用碘克沙醇-蔗糖密度梯度离心。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇-蔗糖溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液主要成分：1％BSA(v/v)、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mMCaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用400μL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到400μL细胞核悬液。
5)纯化。
使用蔗糖溶液-碘克沙醇进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上600μL的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL50％碘克沙醇溶液进行1:1混匀)。3000×g、4℃离心30min弃上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：通过本发明所述的细胞核制备的技术方法分离小鼠视网膜组织以制备单细胞核悬液，经分离结束后，细胞核以台盼蓝染色，细胞核浓度、碎片杂质比例、细胞结团比例，均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求(见表1)。
实施例2
本实施例描述本发明所述小鼠视网膜冰冻组织细胞核制备方法在单细胞测序中应用。本发明所述细胞核裂解液主要成分0.2％(v/v)TritonX-100、0.2％(v/v)吐温20，细胞核洗涤缓冲液主要成分为2％(v/v)BSA，纯化方式采用碘克沙醇-蔗糖密度梯度离心。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇-蔗糖溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.2％(v/v)TritonX-100、0.2％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液主要成分：2％BSA、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mMMg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用400μL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到400μL细胞核悬液。
5)纯化。
使用蔗糖溶液-碘克沙醇进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上600μL的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL50％碘克沙醇溶液进行1:1混匀)。3000×g、4℃离心30min弃上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：通过本发明所述的细胞核制备的技术方法分离小鼠视网膜组织以制备单细胞核悬液，经分离结束后，细胞核以台盼蓝染色，细胞核浓度、碎片杂质比例、细胞核结团比例，均能达到10x Genomics公司单细胞测序要求(见表1)。
对比实施例1
组织破碎方式变换为手术眼科剪剪碎。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mMCaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用灭菌眼科剪剪碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核总量较少，碎片比例偏高，无法达到10x Genomics公司单细胞测要求。
对比实施例2
组织破碎方式改为手动研磨。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液主要成分：0.1％(v/v)TritonX-100、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mMCaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使手动研磨破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：与对比实施例1相比，细胞核量较多，但细胞核碎片比例偏高，无法达到10x Genomics公司单细胞测序实验，见表1。
对比实施例3
组织破碎方式改为电动匀浆。
1)配置试剂
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液主要成分：0.1％(v/v)TritonX-100、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mMCaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor
细胞核洗涤缓冲液主要成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将小鼠视网膜的冰冻组织40mg置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆，破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清。，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核总量较多，细胞核碎片较高，虽然达到10x Genomics公司单细胞测序实验，但具有较高的失败风险，见表1。
对比实施例4
将细胞核裂解液主要成分变换为0.1％IGEPAL CA-630(Sigma-Aldrich；I8896-50ML)，
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)IGEPAL CA-630、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mMCaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心5min弃上清。
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析
结果显示：细胞核总量较少，细胞碎片比例较高，无法达到单细胞测序实验要求。
对比实施例5
将细胞核裂解液主要成分为0.1％NP40(Thermo ScientificTM；28324)。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)NP40、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mMMg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心5min弃上清。
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核碎片比例较高，无法进行单细胞测序实验。
对比实施例6
将细胞核裂解液主要成分为吐温20(Sigma-Aldrich；P9416-100ML)。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心5min弃上清。
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清。，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核各项指标无法进行单细胞测序实验。
对比实施例7
根据Sigma细胞核分离试剂盒，编号为NUC201-1KT，分离小鼠视网膜冰冻组织。具体实施步骤依据Sigma细胞核分离试剂盒说明书进行。
结果及分析
结果显示：制备得到的细胞核悬液无法开展单细胞测序实验。
对比实施例8
将细胞核裂解液主要成分变换为0.1％(v/v)吐温20、0.1％(v/v)IGEPALCA-630。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)吐温20、0.1％(v/v)IGEPAL CA-630、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心5min弃上清。
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：碎片比例较高，无法进行单细胞测序实验。
对比实施例9
将细胞核裂解液主要成分变换为0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)IGEPALCA-630。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)IGEPAL CA-630、10mMTris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心5min弃上清。
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：碎片比例高，无法进行单细胞测序实验要求。
对比实施例10
将细胞核裂解液主要成分为0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心5min弃上清
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：碎片比例较高，开展10x Genomics公司单细胞测序实验有较高失败风险。
对比实施例11
将细胞核裂解液主要成分变换为0.05％TritonX-100、0.05％吐温20。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.05％(v/v)TritonX-100、0.05％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心5min弃上清。
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核碎片比例较高，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例12
将细胞核裂解液主要成分变换为0.2％(v/v)TritonX-100、0.2％(v/v)吐温20。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.2％(v/v)TritonX-100、0.2％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心5min弃上清。
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核总量较多，但碎片比例较高，仍无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例13
将细胞核裂解液主要成分变换为0.3％(v/v)TritonX-100、0.3％(v/v)吐温20。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.3％(v/v)TritonX-100、0.3％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心5min弃上清。
5)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
6)细胞核计数及形态观察。
用细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀，吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核总量较低且碎片比例较高，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例14
将碘克沙醇-蔗糖溶液密度梯度离心纯化细胞核变换为美天妮去碎片试剂盒(Debris Removal Solution；编号为130-109-398)。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。
5)纯化。
使用美天妮去碎片试剂盒(Debris Removal Solution；编号为130-109-398)，操作步骤按照试剂盒说明书进行，以此达到去除碎片杂质，纯化细胞核。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核碎片比例较高，无法达到10x Genomics公司单细胞测序实验，见表1。
对比实施例15
纯化细胞核方式使用流式细胞仪(Becton Dickinson FACSCalibu；编号为FACSCalibur)。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。
5)纯化。
使用流式细胞分选单细胞核，操作步骤按照说明书进行，以此达到去除碎片杂质，纯化细胞核。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核各项指标达到10x Genomics公司单细胞测序实验。
对比实施例16
将纯化方式采用细胞核悬液与250mM蔗糖溶液混匀后进行密度梯度离心，
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使手动研磨，破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用1mL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到1mL细胞核悬液。
5)纯化。
使用250mM蔗糖溶液，与1mL细胞核悬液混匀，3000×g离心30分钟，收集沉淀。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核碎片较高，无法达到10x Genomics公司单细胞测序实验要求，见表1。
对比实施例17
将纯化方式采用细胞核悬液与650mM蔗糖溶液混匀形成密度梯度离心。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使手动研磨，破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用1mL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到1mL细胞核悬液。
5)纯化。
使用650mM蔗糖溶液，与细胞核悬液混匀，3000×g离心30分钟，收集上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核碎片稍高，无法达到10x Genomics公司单细胞测序实验要求，见表1。
对比实施例18
将碘克沙醇-蔗糖溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2中蔗糖浓度变为500mM。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇-蔗糖溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于0℃冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、500mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、500mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用400μL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到400μL细胞核悬液。
5)纯化。
使用蔗糖溶液-碘克沙醇进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上600μL的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL50％碘克沙醇溶液进行1:1混匀)。3000×g、4℃离心30min弃上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核总量较多，但开展单细胞测序实验存在较高的失败风险。
对比实施例19
将碘克沙醇-蔗糖溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2中蔗糖浓度变为100mM。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、100mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、100mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用400μL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到400μL细胞核悬液。
5)纯化。
使用蔗糖溶液-碘克沙醇进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上600μL的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL50％碘克沙醇溶液进行1:1混匀)。3000×g、4℃离心30min弃上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核碎片比例较高，无法进行单细胞测序实验。
对比实施例20
将碘克沙醇-蔗糖溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2中蔗糖浓度变为300mM。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用400μL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到400μL细胞核悬液。
5)纯化。
使用蔗糖溶液-碘克沙醇进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上600μL的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL50％碘克沙醇溶液进行1:1混匀)。3000×g、4℃离心30min弃上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果分析
结果显示，细胞核各项指标满足单细胞测序实验要求，达到开展单细胞测序实验要求。
对比实施例21
将碘克沙醇-蔗糖溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2中蔗糖浓度变为700mM
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、700mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、700mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用400μL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到400μL细胞核悬液。
5)纯化。
使用蔗糖溶液-碘克沙醇进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上600μL的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL50％碘克沙醇溶液进行1:1混匀)。3000×g、4℃离心30min弃上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：分离得到的细胞核悬液碎片比例稍高，无法满足10x Genomics公司单细胞测序各项指标。
对比实施例22
将细胞核洗涤缓冲液中BSA浓度变换为0.5％，其余成分、操作步骤与实施例1完全一致。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：0.5％BSA、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用400μL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到400μL细胞核悬液。
5)纯化。
使用蔗糖溶液-碘克沙醇进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上600μL的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL50％碘克沙醇溶液进行1:1混匀)。3000×g、4℃离心30min弃上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示:分离得到的细胞核，细胞核结团比例较高，无法进行单细胞测序实验。
对比实施例23
细胞核洗涤缓冲液中BSA浓度变换为1％，其余成分、操作步骤与实施例完全一致。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：1％BSA、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用400μL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到400μL细胞核悬液。
5)纯化。
使用蔗糖溶液-碘克沙醇进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上600μL的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL50％碘克沙醇溶液进行1:1混匀)。3000×g、4℃离心30min弃上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核各项指标达到10x Genomics公司单细胞测序实验要求。
对比实施例24
细胞核洗涤缓冲液中BSA浓度变换为3％，其余成分、操作步骤与实施例完全一致。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液成分：3％BSA、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
2)样品准备。
将40mg的小鼠视网膜的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛。
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用400μL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到400μL细胞核悬液。
5)纯化。
使用蔗糖溶液-碘克沙醇进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上600μL的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL50％碘克沙醇溶液进行1:1混匀)。3000×g、4℃离心30min弃上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：细胞核各项指标达到10x Genomics公司单细胞测序实验要求。
对比实施例25
采用本发明所述技术方案对小鼠脑组织进行细胞核悬液制备。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于0℃即冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液主要成分：1％BSA、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mMMg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
2)样品准备。
将40mg的小鼠脑的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用400μL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到400μL细胞核悬液。
5)纯化。
使用蔗糖溶液-碘克沙醇进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上600μL的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL50％碘克沙醇溶液进行1:1混匀)。3000×g、4℃离心30min弃上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析：
结果显示：使用本发明所述技术方案制备小鼠脑单细胞核悬液，其细胞核数量、碎片比例均无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求(见表1)。
对比实施例26
采用本发明所述技术方案对小鼠胚胎组织进行细胞核悬液制备。
1)配置试剂。
开始准备样本前，先分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于0℃冰上预冷。
细胞核裂解液成分：0.1％(v/v)TritonX-100、0.1％(v/v)吐温20、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
细胞核洗涤缓冲液主要成分：1％BSA、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mMMg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液，总体积为600μL。
2)样品准备。
将40mg的小鼠脑胚胎的冰冻组织置于培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷PBS冲洗一遍，弃漂洗液，将组织转移至5mL的离心管。
3)组织破碎及细胞膜裂解。
加入2mL细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育5min。
4)过筛
使用40μm的细胞筛网进行过滤，1000×g、4℃离心10min弃上清。使用400μL细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀。得到400μL细胞核悬液。
5)纯化。
使用蔗糖溶液-碘克沙醇进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上600μL的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL50％碘克沙醇溶液进行1:1混匀)。3000×g、4℃离心30min弃上清。
6)洗涤。
加入5mL预冷的细胞核洗涤缓冲液混匀，600×g、4℃离心5min弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
7)细胞核计数及形态观察。
吸取单细胞核悬液进行检测细胞核数量、碎片杂质比例及细胞核结团比例。
结果及分析
结果显示：采用本发明所述的细胞核制备的技术方法分离小鼠胚胎组织，制备单细胞核悬液的细胞核数量、碎片杂质比例，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求(见表1)。
进一步地，根据本发明表1提供的关于本发明实施例1和2的实验结果，说明本发明所提供的技术方案制备得到的小鼠视网膜细胞核悬液能够满足10x Genomics单细胞测序实验各项质量指标的要求，顺利完成小鼠视网膜组织的单细胞测序实验(图3)。
为了开发适用于单细胞核测序的小鼠视网膜组织特异性的细胞核悬液的制备方法，本发明进行了一系列对比实验，如表1所示。依照整个流程的操作顺序，先验证组织破碎方式，如对比实施例1～3所示；其次比较和验证细胞核裂解液的主要成分和相应浓度范围，如对比实施例3～13所述；接下来通过对比实施例14～21，对细胞核纯化方式进行了验证；最后通过对比实施例22～24，对细胞核洗涤缓冲液主要成分进行对比。
对比实施例1～3首先对组织破碎方式进行验证，选择手动剪碎、手动研磨、电动匀浆三种方式，以细胞核总量及碎片比例为核心质控指标。结果的相互比较显示电动匀浆方式较好。对比实施例1为现有技术，采用眼科剪剪碎的方式，组织破碎不完全，裂解不充分，细胞核总量较少，耗时长且碎片比例较高，无法获得高质量的单细胞核悬液。手动研磨方式尽管组织充分破碎，但可能因为细胞主要是被冰冻破碎，碎片直径相对较小，因此大量碎片无法有效去除，同样无法顺利进行单细胞测序上机。而对比实施例3使用电动匀浆进行组织破碎，细胞核总量较多，碎片比例相比手动剪碎基本相同，而明显低于手动研磨方式，在细胞核总量及碎片比例两个指标中相比前述两种方式较为均衡。综上，选定电动匀浆方式作为小鼠视网膜冰冻组织细胞核制备的破碎方法。
在基本确定组织破碎方式的基础上，根据操作流程的顺序，接下来对裂解液的成分进行验证。裂解液中主要有效成分为非离子型去污剂，主要作用是对细胞膜进行溶解以释放细胞核。因此，对比实施例3～6中，通过多种非离子型去污剂进行比较，依据现有技术中的纯化步骤制备细胞核悬液，以细胞核总量及碎片比例为核心质控指标，分别采用0.1％TritonX-100、0.1％IGEPAL CA-630、0.1％NP40、0.1％吐温20作为主要的裂解去污剂，结果显示细胞碎片比例均较高，细胞核总量较少。对比实施例7采用Sigma的细胞核分离试剂盒(去污剂主要为TritonX-100，编号为NUC201-1KT)，结果显示得到的细胞核悬液无法开展10x Genomics公司单细胞测序实验。以上验证说明采用单一的非离子型去污剂制备小鼠视网膜冰冻组织的细胞核悬液，细胞核总量较低且碎片比例较高，且很难通过进一步纯化等操作进行提升，因此无法开展单细胞核测序。
在对比实施例3～7的基础上，接下来验证去污剂的“组合”是否能够更好的提升细胞核悬液质量。NP40与TritonX-100同为线性PEG，理化性质近似，由于TritonX-100更为常用，因此以TritonX-100、吐温20和IGEPAL CA-630进行两两组合。对比实施例8为0.1％(v/v)吐温20和0.1％(v/v)IGEPAL CA-630的组合，对比实施例9是0.1％(v/v)TritonX-100和0.1％(v/v)IGEPAL CA-630的组合，对比实施例10是0.1％(v/v)TritonX-100和0.1％(v/v)吐温20。结果显示，0.1％(v/v)TritonX-100和0.1％(v/v)吐温20获得的细胞核总量较其它两种组合较多，显示这种组合更适用于视网膜组织。但碎片比例仍然偏高，进行单细胞测序具有较大的油包水失败风险。
对比实施例11～13是对TritonX-100和吐温20组合的浓度范围的验证。分别采用0.05％(v/v)TritonX-100和0.05％(v/v)吐温20，0.2％(v/v)TritonX-100和0.2％(v/v)吐温20，0.3％(v/v)TritonX-100和0.3％(v/v)吐温20，结果显示对比实施例12的效果较好。综上所述，本发明所述细胞核裂解采用0.1％～0.2％TritonX-100和0.1％～0.2％吐温20的组合去污剂。结合对比实施例8～10的结果，TritonX-100和吐温20二者之间存在配伍关系，当同时、依次序使用，才能有效的保证小鼠视网膜冰冻组织达到最佳的裂解效果。
对比实施例1～13确定了组织破碎方式和裂解试剂配比及浓度后，细胞核碎片比例仍然偏高，因此接下来对纯化方式进行改进。结果如对比实施例14～18所示。对比实施例14是直接采用美天妮的去碎片试剂盒(MACS:Debris Removal Solution；编号为130-109-398)，按照试剂盒说明书进行纯化。对比实施例15采用的流式细胞仪进行分选。对比实施例16采用250mM蔗糖溶液，通过离心后收集沉淀进行纯化。对比实施例17采用650mM蔗糖溶液，通过离心后收集上清进行纯化。对比实施例18采用碘克沙醇-蔗糖溶液进行纯化。几种纯化方式相互比较结果显示，流式细胞术及碘克沙醇-蔗糖溶液能够取得较好的纯化效果。但流式细胞仪价格昂贵，操作耗时较长。特别是，因为经过细胞破碎，大量RNase被释放，室温进行分选，细胞核内RNA有较高的降解风险。应尽可能采用低温离心等纯化方法，确保操作过程中RNA完整性良好。因此，综合考虑后，最终采用碘克沙醇-蔗糖溶液作为小鼠视网膜组织细胞核的纯化方法。
碘克沙醇-蔗糖溶液进行纯化时，蔗糖的浓度对最终的分离效果具有较大影响，因此接下来对蔗糖的浓度进行验证。对比实施例18的基础上，19～21分别采用100mM蔗糖、300mM蔗糖及700mM蔗糖进行对比。结果显示300mM纯化效果较好，细胞核总量及纯度较高，满足单细胞测序上机要求。因此，确定纯化所用的碘克沙醇-蔗糖溶液中蔗糖的浓度为300mM。
最后，本发明通过在洗涤缓冲液中加入不同浓度的BSA，对细胞核结团的比例进行优化，结果如对比实施例22～24所示，1％～3％的BSA对细胞核结团均具有较好的效果，能够明显降低结团比例。但考虑到2％以上BSA对后续建库等操作可能造成一定影响，因此，最终确定BSA的浓度为1％～2％。
在确定小鼠视网膜冰冻组织单细胞核裂解配方、纯化方式基础上，对比实施例25、26采用本发明所述技术方案对小鼠脑组织、小鼠胚胎组织进行细胞核悬液制备，结果显示细胞核量较少且碎片比例较高，无法开展单细胞测序实验。因此，本发明所述技术方案不适用于其他组织类型。说明本发明所述技术方案针对小鼠视网膜冰冻组织，能够有效制备高质量的细胞核悬液。
综上所述，根据表1中实施例和对比实施例的实验结果，对比实施例1～13比较验证组织破碎方式及细胞核裂解液主要成分及浓度，即组织破碎方式采用电动匀浆最佳；细胞核裂解液成分：0.1％～0.2％(v/v)TritonX-100、0.1％～0.2％(v/v)吐温20、10mMTris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。对比实施例14～21比较验证细胞核纯化方式采用碘克沙醇-蔗糖密度梯度离心：即组成包括细胞核悬液-碘克沙醇预混液(400μL细胞核悬液与400μL 50％碘克沙醇1:1混匀)、600μL碘克沙醇-蔗糖溶液1(35％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液)、600μL碘克沙醇-蔗糖溶液2(29％(v/v)碘克沙醇、300mM蔗糖溶液)；进一步的，通过对比实施例22～24比较验证细胞核洗涤缓冲液中BSA浓度，即细胞核洗涤缓冲液主要成分：1％～2％BSA(v/v)、10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor。
说明针对小鼠视网膜组织，本发明所述的细胞核制备方法能够快速、高效分离得到高质量的单细胞核悬液，从而顺利完成该组织的单细胞核测序。且本发明所述方法的操作步骤具有配伍关系，必须同时、依次使用才能取得本发明所述的技术效果。另外，本发明所述的试剂配方及相应试剂浓度同样具有配伍关系，必须严格依照本发明所述的配方及浓度，才能够完成小鼠视网膜组织的单细胞核测序。
表1小鼠视网膜组织不同细胞核制备方法的效果比较
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本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (9)
1.一种小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一、配置试剂：分别配置细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇-蔗糖溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2，并将配置好的溶液置于冰上预冷；
所述细胞核裂解液包含以下成分：10mM pH=7.5 Tris-HCl、1mM CaCl2、3 mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.1%~0.2%（v/v）TritonX-100、0.1%~0.2%（v/v）吐温20、0.4U/μL RNA酶抑制剂RNase Inhibitor；
所述细胞核洗涤缓冲液包含以下成分：10mM pH=7.5 Tris-HCl、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNA酶抑制剂RNase Inhibitor、1%~2%（v/v）BSA；
所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35%（v/v）碘克沙醇、300mM蔗糖的混合溶液；
所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29%（v/v）碘克沙醇、300mM蔗糖的混合溶液；
步骤二、样品准备：将小鼠视网膜冰冻组织取出至培养皿中，培养皿置于冰上，用预冷的PBS洗涤，弃漂洗液，转移至离心管中；
步骤三、组织破碎及细胞膜裂解：加入所述步骤一配置好并置于冰上预冷的细胞核裂解液，使用电动匀浆破碎组织，持续全过程中注意离心管始终保持埋于冰中，冰上孵育；
步骤四、过筛：使用细胞筛对所述步骤三孵育的组织液进行过滤至新的离心管中，离心弃上清，用所述步骤一配置好并置于冰上预冷的细胞核洗涤缓冲液重悬细胞核沉淀，得细胞核悬液；
步骤五、纯化：使用所述步骤一配置好并置于冰上预冷的碘克沙醇-蔗糖溶液对所述步骤四得到的细胞核悬液进行密度梯度离心，具体实施步骤为：先将所述碘克沙醇-蔗糖溶液1平铺在离心管最底层；其次，中间层铺上所述步骤一配置好并置于冰上预冷的碘克沙醇-蔗糖溶液2；最后，最上层加入细胞核悬液-碘克沙醇预混液，离心弃上清后得细胞核沉淀；
步骤六、洗涤：向所述步骤五得到的细胞核沉淀中加入所述步骤一配置好并置于冰上预冷的细胞核洗涤缓冲液，离心弃上清，使用含1%BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到所述小鼠视网膜组织单细胞测序细胞核悬液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述冰上预冷的温度为0~4℃。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述冰冻组织的取样量为30-50mg；和/或，所述PBS洗涤次数为1~3次；和/或，所述小鼠视网膜冰冻组织为新鲜取材后，进行液氮速冻，-80℃保存的冰冻组织。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述加入细胞核裂解液的量为1~3mL；和/或，所述电动匀浆时间为3~5s；和/或，所述冰上孵育的时间为5~7min。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述细胞筛的孔径为40μm；和/或，所述离心的条件为800-1000×g、4~6℃离心10~15min。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述纯化目的是去除碎片杂质，纯化细胞核，以得到高质量的单细胞核悬液；和/或，所述细胞核悬液-碘克沙醇预混液是指400μL细胞核悬液与400μL的50%（v/v）碘克沙醇溶液进行1:1混匀；和/或，所述离心为低温离心，离心温度为4~6℃，所述离心转速为2000~3000×g，所述离心时间为20~30min。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤六中，所述加入细胞核洗涤缓冲液的体积为5~7mL；和/或，所述离心的条件为500~800×g、4~6℃离心5~7min；和/或，所述细胞核悬液的细胞核浓度为1200~1600个/μL、细胞核碎片比例为7%~8%、细胞核结团比例为5%~6%。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液、碘克沙醇-蔗糖溶液1、碘克沙醇-蔗糖溶液2；
所述细胞核裂解液包含以下成分：10mM pH=7.5 Tris-HCl、1mM CaCl2、3 mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.1%~0.2%（v/v）TritonX-100、0.1%~0.2%（v/v）吐温20、0.4U/μL RNaseInhibitor；
所述细胞核洗涤缓冲液包含以下成分：10mM pH=7.5 Tris-HCl、1mM CaCl2、3mM Mg(AC)2、5mM NaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor、1%~2%（v/v）BSA；
所述碘克沙醇-蔗糖溶液1是指配置终浓度为35%（v/v）碘克沙醇、300mM蔗糖的混合溶液；
所述碘克沙醇-蔗糖溶液2是指配置终浓度为29%（v/v）碘克沙醇、300mM蔗糖的混合溶液。
9.如权利要求8所述的试剂盒在视网膜组织单细胞测序中的应用。
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