CN115820535A - 一种制备爬行纲动物单细胞的试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备爬行纲动物单细胞的试剂盒和方法，属于单细胞测序技术领域。所述试剂盒包括CollagenaseⅠ、DNaseⅠ、Dispase和DMEM培养基。本发明的试剂盒和方法填补了爬行纲动物尤其是扬子鳄组织单细胞制备技术的空白。试剂盒成分简单，易于制备，方法有很高的重复性和成功率，能够得到大量高活率、杂质低的单细胞，可用于单细胞测序及更多应用领域。

Description

一种制备爬行纲动物单细胞的试剂盒和方法

技术领域

本发明属于单细胞测序技术领域，具体地，涉及一种制备爬行纲动物单细胞的试剂盒和方法，更具体地，涉及一种制备扬子鳄单细胞的试剂盒和方法。

背景技术

单细胞转录组测序是在单细胞水平对转录组进行测序的一项新技术，可以研究单个细胞内的基因表达情况，同时解决普通转录组测序无法解决的细胞异质性难题，让解析单个细胞的行为、机制及其与机体的关系成为了现实。近年来，该技术已广泛应用于大量物种的多种组织，但以哺乳类为主(尤以人、小鼠居多)。

目前，对其他物种开展单细胞转录组测序仍存在不少挑战：多数单细胞制备方法以哺乳类动物(如人、小鼠等)为对象，对爬行类等与哺乳类亲缘性不高的动物类群的组织适用性较差，不同物种的同源组织的单细胞制备技术并不能直接使用。

扬子鳄，是我国特有的一种鳄类。目前，扬子鳄的生存状况已经十分濒危。对扬子鳄的研究与保护已相当迫切。然而，目前还没有针对扬子鳄相关组织的单细胞制备方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种针对扬子鳄胚胎性腺的单细胞制备方案。为了达到该目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种制备爬行纲动物单细胞的试剂盒，所述试剂盒包括CollagenaseⅠ、DNaseⅠ、Dispase和DMEM培养基。

在本发明的一些实施方案中，所述DMEM培养基中含有3～8％FBS。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒中，CollagenaseⅠ和DNaseⅠ预加入至DMEM培养基中，终浓度分别为0.5～2mg/mL和0.1～1mg/mL。在本发明的一些优选实施方案中，终浓度分别为1mg/mL和0.5mg/mL。

本发明第二方面提供一种利用本发明第一方面所述的试剂盒制备爬行纲动物单细胞的方法，包括以下步骤：

S1，将CollagenaseⅠ和DNaseⅠ预加入至DMEM培养基中，终浓度分别为 0.5～2mg/mL和0.1～1mg/mL，优选地，终浓度分别为1mg/mL和0.5mg/mL；

S2，获得所述爬行纲动物的组织样本，并剪切成1mm³大小的小块，转移至步骤 S1获得的含有CollagenaseⅠ和DNaseⅠ的DMEM培养基中；

S3，转移到恒温摇床中，30～35℃，60～100rpm振荡5～20min；

S4，取出混匀，加入0.5mg/mL Dispase，放回恒温摇床，消化10～30min；

S5，将培养基过30μm筛，收集清液，8～15℃、280～400g离心3～10min，弃尽上清，沉淀用缓冲液重悬，得到第一细胞悬液。

在本发明的一些实施方案中，所述方法进一步包括：

S6，用适量DMEM培养基洗下筛上的剩余组织，加入2倍体积0.25％胰酶，， 30～35℃，60～100rpm振荡5～20min，重复步骤S5，得到第二细胞悬液。

在本发明的一些实施方案中，在步骤S3和S4之间和/或在步骤S4和S5之间，进一步包括将培养基取出混匀的步骤。在本发明的一些实施方案中，利用移液器对培养基进行吹打混匀。

在本发明的一些实施方案中，步骤S5中，所述缓冲液选自包括PBS缓冲液、MOPS 缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液的组中的一种。优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液，更加优选地，所述PBS缓冲液中含有5％FBS。

在本发明的一些实施方案中，所述爬行纲动物为扬子鳄。在本发明的一些实施方案中，所述组织为胚胎性腺组织。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明取得了以下有益效果：

本发明的试剂盒和方法填补了爬行纲动物尤其是扬子鳄组织单细胞制备技术的空白。试剂盒成分简单，易于制备，方法有很高的重复性和成功率，能够得到大量高活率、杂质低的单细胞，可用于单细胞测序及更多应用领域。

附图说明

图1示出了本发明实施例2中制备的细胞悬液A的细胞计数结果。

图2示出了本发明实施例2中制备的细胞悬液B的细胞计数结果。

图3示出了本发明实施例2中制备的细胞悬液A和细胞悬液B混合后的细胞计数结果。

图4示出了本发明实施例2制备的细胞进行单细胞测序的测序结果。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01 或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1单细胞制备试剂

本实施例提供一种适用于爬行纲动物组织的单细胞制备试剂组合，包括CollagenaseⅠ、DNaseⅠ、Dispase和DMEM培养基(含5％FBS)。

使用时，先将CollagenaseⅠ和DNaseⅠ加入至DMEM培养基中，终浓度分别为 1mg/mL和0.5mg/mL，置于冰上备用。Dispase在消化过程中加入(终浓度0.5mg/mL)，为保证细胞活率和消化效率。

实施例2扬子鳄理胚胎性腺组织单细胞制备

利用实施例的试剂组合对扬子鳄胚胎性腺组织进行单细胞制备，具体步骤如下：

a)利用PBS清洗扬子鳄胚胎性腺组织；

b)用针头将组织剪切成大小均一1mm³左右的小块；

c)转移组织至实施例1制备的预冷的含有CollagenaseⅠ和DNaseⅠ的 DMEM培养基中，冰上孵育10min，使消化液充分浸润组织，提高解离效率，减少解离时间，保证细胞活率；

d)转移到恒温摇床中，设置温度为35℃(鳄鱼的细胞在该温度下生长更好，鳄鱼生存的温度条件也都低于35℃，且酶活在该条件下几乎无损失，因而是更好的选择)、80rpm，10min；

e)取出吹打，放回恒温摇床继续消化15min；

f)取出吹打，加入0.5mg/mL Dispase，放回恒温摇床，消化15min；

g)取出吹打，观察消化情况，继续消化5-10min；

h)过30μm筛，收集清液，12℃、300g离心6min，弃尽上清，沉淀用1.5mL PBS缓冲液(含5％FBS)重悬，记为细胞悬液A(重悬体积取决于沉淀的量，且应相对较小，较高的悬液浓度可以根据计数浓度稀释，可避免不必要的操作)；

i)同时，用1mL DMEM洗下筛上的剩余组织，加入2mL 0.25％胰酶，在35℃、 80rpm恒温摇床中继续消化10min；

j)取出吹打，过30μm筛，收集清液，12℃、300g离心6min，弃尽上清，沉淀用1.5mLPBS缓冲液(含5％FBS)重悬，记为细胞悬液B。

利用上述方法制备的细胞悬液因为对细胞的损伤较小，只有极少杂质，细胞活率也较高。

细胞悬液A为混合酶消化液解离产物。活率在75％～90％的范围内，有少量杂质，如图1所示，使用时需要进行进一步清洗、过20μm筛。

细胞悬液B为混合酶消化液解离后剩余组织继续胰酶消化的产物，悬液质量高，活率往往在90％以上，碎片较少，如图2所示，不需做过多处理。

接着，发明人利用细胞计数仪计算细胞数量。出于获得完整细胞类型的考虑，每次上机都会混合细胞悬液A和B，再上机计数，计数结果如图3所示，从图3可以看出细胞浓度和细胞活率。多次计数结果如表1所示：

表1单细胞计数

实施例3单细胞测序

利用实施例2制备的单细胞进行单细胞测序，单细胞转录组测序(Single cellRNA sequencing)是在单细胞水平对转录组进行测序的一项新技术，可以研究单个细胞内的基因表达情况，同时解决用组织样本测序无法解决的细胞异质性难题，让解析单个细胞的行为、机制及其与机体的关系成为了现实。

结果如图4所示，从图4中可以看出，细胞表达丰度较高，重复性好，线粒体占比低，数据结果较好。

实施例4单细胞制备试剂性能验证

为了验证实施例1中的单细胞制备试剂的性能，发明人对其中一种组分进行替换，或对其中一种组分的含量进行调整，利用实施例2描述的方法制备扬子鳄胚胎性腺组织的单细胞，结果如表2所示：

表2不同单细胞制备试剂试剂的细胞悬液的计数结果

如表2可知，实施例1中的单细胞制备试剂中的任意物质均不能随意替换，浓度也不可随意调整，否则均为显著影响制备得到的单细胞的浓度和活率。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备爬行纲动物单细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括CollagenaseⅠ、DNaseⅠ、Dispase和DMEM培养基。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DMEM培养基中含有3～8％FBS。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，CollagenaseⅠ和DNaseⅠ预加入至DMEM培养基中，终浓度分别为0.5～2mg/mL和0.1～1mg/mL。

4.一种利用权利要求1所述的试剂盒制备爬行纲动物单细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将CollagenaseⅠ和DNaseⅠ预加入至DMEM培养基中，终浓度分别为0.5～2mg/mL和0.1～1mg/mL；

S2，获得所述爬行纲动物的组织样本，并剪切成1mm³大小的小块，转移至步骤S1获得的含有CollagenaseⅠ和DNaseⅠ的DMEM培养基中；

S3，转移到恒温摇床中，30～35℃，60～100rpm振荡5～20min；

S4，取出混匀，加入终浓度为0.5mg/mL Dispase，放回恒温摇床，消化10～30min；

S5，将培养基过30μm筛，收集清液，8～15℃、280～400g离心3～10min，弃尽上清，沉淀用缓冲液重悬，得到第一细胞悬液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进一步包括：

S6，用适量DMEM培养基洗下筛上的剩余组织，加入2倍体积0.25％胰酶，30～35℃，60～100rpm振荡5～20min，重复步骤S5，得到第二细胞悬液。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，在步骤S3和S4之间和/或在步骤S4和S5之间，进一步包括将培养基取出混匀的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用移液器对培养基进行吹打混匀。

8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤S5中，所述缓冲液选自包括PBS缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液的组中的一种。

9.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述爬行纲动物为扬子鳄。

10.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述组织为胚胎性腺组织。

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