CN114058722A - 隐孢子虫活卵囊的双探针qRT-PCR检测试剂盒及其方法 - Google Patents

隐孢子虫活卵囊的双探针qRT-PCR检测试剂盒及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了同步检测C.parvum微小隐孢子虫、C.hominis人隐孢子虫、C.tyzzeri泰泽隐孢子虫的qRT‑PCR引物及探针，它包括：引物Crypt6_3920_1201F:5’‑AGTGATTCAG ATTAYTTAGAAGGTG‑3’；三种隐孢子虫特异性探针；及环境水中隐孢子虫检测方法，它包括：1）取水样，每1升水添加硅胶颗粒0.142克，离心、浓缩到1mL；2）提取隐孢子虫卵囊RNA；3）qRT‑PCR进行检测得到的RNA；本发明优点在于：本发明双探针与单探针相比，提高了扩增效率；检测的最低卵囊数为0.5个卵囊；所设计的探针特异性效果良好；检测环境水样方法可行。

Description

隐孢子虫活卵囊的双探针qRT-PCR检测试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及隐孢子虫活卵囊的双探针qRT-PCR检测试剂盒及其方法。
背景技术
隐孢子虫病（cryptosporidiosis）是一种全球性流行的人畜共患肠道寄生虫病，病原包括顶复门下“隐孢子虫属”（Cryptosporidium）的所有物种。目前尚无治疗该病的特效方法，对隐孢子虫病的研究已成为医学界、兽医学界研究关注的热点之一。
隐孢子虫感染人体的主要为微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）和人隐孢子虫（Cryptosporidium hominis）两物种。隐孢子虫感染通过环境中的卵囊（oocysts）传播，其中主要的传播源包括被卵囊污染的水源和食品，在1946年至2016年期间，全球共报告了936起因水生原生动物引起的疾病暴发，其中隐孢子虫占了58％。隐孢子虫卵囊呈圆形或椭圆形，显微尺寸（如微小隐孢子虫卵囊直径为5微米左右），其结构包括卵囊壁及内含的四个子孢子（sporozoites）。
目前，检测环境中隐孢子虫卵囊的方法，如检测虫体DNA 的PCR扩增、检测卵囊的免疫荧光显微镜学（IFA）等方法，不能或不宜区分不同物种和死活卵囊。但环境中只有微小隐孢子虫和人隐孢子虫的活卵囊才真正对人体具有感染风险，而卵囊失活后其卵囊形态和DNA可以存在数天至数周。而虫体的RNA在卵囊失活后只能存在数小时至一天，可作为特异性检测具有活性的微小隐孢子虫和人隐孢子虫的标记分子。
发明内容
本研究意在建立一种双探针qRT-PCR检测具有特定序列并高表达的mRNA的试剂盒及其方法，用于敏感且特异的检测环境中对人体具有感染风险的隐孢子虫卵囊（即有活性的C. parvum和C. hominis卵囊）。
检测C. parvum（微小隐孢子虫）、C. hominis（人隐孢子虫）、C. tyzzeri（泰泽隐孢子虫）的qRT-PCR引物及探针，包括：
引物：
Cryptosporidium属内多物种的通用探针：
Crypt6_3920_1201F: 5’-AGTGATTCAGATTAYTTAGAAGGTG-3’；
Crypt6_3920_1325R: 5’-TCAATTCCTTCCAAAGGTTTTAC-3’；
C. parvum 特异性探针：
Cp6_3920_1232p1b： FAM-TCAAGAAGATTCAAATGAAAG -MGB ；
Cp6_3920_1273p2b： FAM-TGCAATTAGGTCCTCTGA –MGB；
C. hominis 特异性探针：
Ch6_3920-1232p1b： JOE-CCAAGAAGATTTAAATGGAAA –MGB；
Ch6_3920_1272p2b：JOE-TTGTAATTAGATCTTCAGATT –MGB；
C. tyzzeri特异性探针：
Ct6_3920-1232p1b：TMR-TTGTAATTAGATCTTCAGATT –MGB；
Ct6_3920_1272p2b：TMR-TTGTAATTAGATCTTCAGATT –MGB。
检测隐孢子虫的双探针qRT-PCR试剂盒包括：所述的同步检测C. parvum、C. hominis、C. tyzzeri的qRT-PCR引物及探针；
所述的试剂盒中的单个qRT-PCR扩展反应的总体积20 μL，包括下列物质：2× OneStep Q Probe Mix 10 μL；One Step Q Probe Enzyme Mix 1 μL；50× ROX参比染料 0.4μL；10 μM 上下游引物 1.2 μL；C. parvum、C. hominis、C. tyzzeri 探针各0.4 μL；样本RNA 2 μL；RNase-Free dH2O 1.8 μL。
反应条件为：
步骤1：逆转录反应，1次，55 ℃ 15 min
步骤2：预变性反应，1次，95 ℃ 30 s
步骤3：循环反应，40次，95 ℃ 10 s 与 60℃ 60 s
环境水样中隐孢子虫检测方法：
1）取水样，每1升水添加硅胶颗粒0.142克，离心、浓缩到1 mL；
2）提取隐孢子虫卵囊RNA；
3）qRT-PCR进行检测得到的RNA；
所述的qRT-PCR反应体系为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
反应条件为：
Stage 1：逆转录 Reps：1 55℃ 15 min
Stage 2：预变性 Reps：1 95℃ 30 s
Stage 3：循环反应 Reps：40 95℃ 10 s, 60℃ 60 s
所述的硅胶颗粒直径20微米。
本发明提供了检测C. parvum、C. hominis、C. tyzzeri的qRT-PCR引物及探针，同时提供了不同样本（包括环境水、饮用水、以及清洗食品后水样等）中隐孢子虫检测方法。本发明优点在于：本发明双探针的使用与单探针相比，提高了扩增效率；获得能够检测最低0.5个卵囊数的高灵敏度；方法特异性良好，检测包括环境水等样本中的三种隐孢子虫活卵囊方法可行。
附图说明
图1 双探针与单探针扩增效率比较图；
图2 最小卵囊数检测结果图；
图3 qRT-PCR以验证RNA降解情况示意图；
图4 通过qPCR与qRT-PCR检测活卵囊所占比例方法的示意图。
具体实施方式
本发明材料与试剂：
1、 生物信息学分析相关网站及软件
隐孢子虫专业网站CryptoDB（https://www.cryptodb.org/）
美国国家生物信息技术中心NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）
DNAMAN软件、primer premier 5软件
2、 实验动物
用于虫株保种传代的新生犊牛由长春广泽乳业有限公司提供。
3、虫株和菌株
微小隐孢子虫卵囊为本实验室保存。
4、 主要试验器材
电子天平（Sartorius）、恒温水浴锅、高压蒸汽灭菌锅（ZEALWAY）、涡旋震荡仪（Qilinbeier）、荧光定量PCR仪（ABI Step one plus）、低温高速离心机（Eppendorf）、离心机（中佳仪器有限公司）、超纯水系统（Millipore）、超净工作台（AIRTECH）。
5、 主要试剂
RNeasy Mini Kit 试剂盒（QIAGEN公司）、QIAampDNA Mini Kit 试剂盒（QIAGEN公司）、二氧化硅颗粒、AceQr qPCR Probe Master Mix（Vazyme公司）、HiScriptII One StepqPCR Probe Kit（Vazyme公司）、次氯酸钠（SIGMA）、蔗糖（北京化工厂）、DEPC水。
6、主要试剂的配方及其配制
（1）蔗糖原液：在320 mL蒸馏水加入500 g蔗糖加热融化，在4 °C条件下进行保存。
（2）50% 蔗糖溶液：将蒸馏水与蔗糖原液等比例混合然后搅拌均匀，在4 °C条件下进行保存。
（3）25% 蔗糖溶液：将1/4的蔗糖原液和3/4的蒸馏水混合均匀，在4 °C条件下进行保存。
（4）DEPC水：将1 mL DEPC原液加入去离子水中，用去离子水定容至1 L，高压灭菌，在4℃保存。
（5）1×PBS：称取8 g NaCl，0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4，3.58 g Na2HPO4·12H2O，充分溶解于900 mL蒸馏水，调节pH到7.4后，定容至1 L，高压灭菌，置于4 ℃条件下进行保存，以待备用。
实施例1 微小隐孢子虫卵囊的纯化
（1）收集犊牛粪便：收集被微小隐孢子虫感染的犊牛粪便，将其与5% 重铬酸钾1:1混合，放于容器中，在4 ℃环境下保存。
（2）过滤：将粪样摇匀后取出，依次过10目，30目，100目筛子，并将粪样收集在烧杯里，接着与1×PBS按 1:1比例混合均匀后倒入50 mL离心管，放置4℃离心机中，3500 rpm，离心10 min，然后去掉上层液体。
（3）洗掉重铬酸钾：加少量1×PBS用涡旋震荡仪将沉淀充分悬起，加入1×PBS至50mL，放置4 ℃离心机中，3500 rpm，离心10 min，然后去掉上层液体。
（4）脱脂：加少量1×PBS用涡旋震荡仪将沉淀充分悬起，加入1×PBS至35 mL，再加入乙酸乙酯至50 mL。充分摇匀后，放置于4℃冰箱中静置5 min, 待分层明显后，放置4℃离心机中，3500 rpm，离心10 min，然后去掉上层液体。
（5）二次脱脂：重复步骤（4）；
（6）杀菌：用ddH2O重悬纯化好的卵囊，加入5%次氯酸钠冰浴杀菌9 min，然后用大量的1×PBS清洗3次，每次3500 rpm，离心10 min，弃掉上清，更换新的离心管重复离心2-3次。
（7）过糖梯度：加少量1×PBS用涡旋震荡仪将沉淀充分悬起来，定容到10 mL，按比例配好蔗糖梯度（下层50% 蔗糖溶液15 mL，上层25% 蔗糖溶液20 mL，用1×PBS配置 ），将10 mL悬液缓慢加到糖梯度上层，保证分层明显，放进4℃离心机，调节升降速度为11,500g，离心30 min。
（8）洗糖：用消毒过的移液管分别吸取细菌层和卵囊层的液体，用1×PBS将其分别稀释至50 mL，放入4 ℃离心机，3500 rpm，离心10 min，然后去除上清。
（9）计数：用适量无菌1×PBS 重悬沉淀，使用显微镜进行镜检计数。
实施例2 隐孢子虫卵囊DNA、RNA的提取
1、隐孢子虫卵囊DNA的提取
鉴于隐孢子虫卵囊壁不易被裂解液裂解，在提取卵囊DNA之前我们先将卵囊进行5次冻融处理，来破碎卵囊壁，提高卵囊DNA提取效率。然后所有样本DNA的提取都按照QIAampDNA Mini Kit 试剂盒操作手册进行，具体步骤如下：
（1）样本加入180 μL裂解液 buffer ATL。
（2）加入20 μL proteinase K ，振荡30 s，56 ℃水浴3 h使卵囊裂解充分。
（3）加入200 μL buffer AL，混匀，70 ℃水浴10 min。
（4）短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
（5）加入200 μL乙醇（96%-100%），振荡15 s，短时离心，以去除离心管盖内沿液体。
（6）将上述混合液小心加入到QIAamp Mini spin column中将离心柱放入2 ml收集管中，盖紧离心管，使用4℃离心机，6000 g，离心1 min。
（7）取出离心管倒掉收集管中的液体，然后向离心柱中缓慢加入500 μL bufferAW1，盖紧离心管，使用4℃离心机，6000 g，离心1 min。
（8）将离心管取出，倒掉收集管中的液体，更换一个新的收集管，然后再向离心柱中加入500 μL buffer AW2，盖紧离心管，使用4℃离心机，20000 g，离心3 min。
（9）取出离心管，倒掉收集管中的液体，更换一个新的收集管，全速离心1 min，以去除 buffer AW2的残留。
（10）取出离心管，将离心柱放入一个新的1.5 mL收集管中，然后加入50 μLbuffer AE，在超净台中放置1 min，然后6000 g离心1 min，洗脱DNA。
（11）重复步骤（10）洗脱DNA。
（12）将获得的DNA放 -80℃ 保存。
2、 隐孢子虫卵囊RNA的提取
鉴于隐孢子虫卵囊壁不易被裂解液裂解，在提取卵囊RNA之前我们先将卵囊进行5次冻融处理（液氮30 s/冰上，30 min）来破碎卵囊壁，提高卵囊RNA提取效率。然后所有样本RNA的提取都按照RNeasy Mini Kit 试剂盒操作手册，具体步骤如下：
（1）样本加入350 μL裂解液 buffer RLT。
（2）然后加入350 μL的无水乙醇，混匀。
（3）将混合液加到试剂盒中的离心柱中，放入2 mL的收集管中，小心盖紧离心管盖，使用高速离心机离心，8000 g，离心15 s。
（4）取出离心管，倒掉收集管中的液体，将离心柱放入新的收集管中，然后加入700μL的 buffer RW1，小心盖紧离心管盖，使用高速离心机进行离心，8000 g，离心15 s。
（5）洗第二次，加入500 μL buffer RPE，小心盖紧离心管盖，使用高速离心机进行离心，8000 g，离心15 s。
（6）取出离心管，倒掉收集管中的液体，将离心柱放入新的收集管中，然后加入500μL的 buffer RPE，小心盖紧离心管盖，使用高速离心机进行离心，8000 g，离心2 min。
（7）取出离心柱，放入新的离心管中，使用高速离心机全速离心1 min，以去除上述液体的残留。
（8）取出离心柱，放入到1.5 mL的收集管中，加入50 μL的无 RNA 酶的水，8000 g，离心1 min，洗脱RNA。
（9）重复步骤（8）洗脱RNA。
（10）将获得的 RNA 放 -80℃ 保存。
实施例3 特异性引物与双探针的设计
实验室前期研究已选取cgd6_3920为方法的靶基因，通过DNAMAN软件将获取的靶基因的C. parvum和C. hominis碱基序列进行比对分析，根据C. parvum和C. hominis之间有 ≥3个碱基的差异，且C. parvum，C. hominis和其他隐孢子虫虫种之间也保持有 ≥3个碱基的差异的原则，筛选出多态性区域，设计针对C. parvum和C. hominis的探针，且它们的探针含有不同的荧光基团。并在靶基因的多态性区域的两端设计一对能同时扩增该段基因的特异性引物。本研究的创新在于使用了双探针来提高检测灵敏度。
cgd6_3920引物：
Crypt6_3920_1201F: 5’-AGTGATTCAGATTAYTTAGAAGGTG-3’
Crypt6_3920_1325R: 5’-TCAATTCCTTCCAAAGGTTTTAC-3’
C. parvum探针：
Cp6_3920_1232p1b（CpProbe 1）： FAM-TCAAGAAGATTCAAATGAAAG -MGB
Cp6_3920_1273p2b（CpProbe 2）： FAM-TGCAATTAGGTCCTCTGA –MGB
C. hominis探针：
Ch6_3920-1232p1b（ChProbe 1）： JOE-CCAAGAAGATTTAAATGGAAA –MGB
Ch6_3920_1272p2b（ChProbe 2）： JOE-TTGTAATTAGATCTTCAGATT –MGB
C. tyzzeri探针：
Ct6_3920-1232p1b（CtProbe 1）： TMR-TTGTAATTAGATCTTCAGATT -MGB
Ct6_3920_1272p2b（CtProbe 2）： TMR-TTGTAATTAGATCTTCAGATT –MGB
实施例4 实验条件优化
1、引物终浓度优化
取5×105 的卵囊，脱囊率100％，使用QIAamp RNA Mini Kit试剂盒提取RNA。所提取的RNA，最终稀释到100 μL 洗脱液中。
基于qRT-PCR试剂盒说明书中的反应中引物浓度调整范围（0.2-1μL），我们选取了5组引物浓度进行筛选：0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μL，使用CpProbe 1探针例进行qRT-PCR，以此来确定体系中最优引物浓度。
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
扩增程序：
Stage 1：逆转录 Reps：1 55℃ 15 min
Stage 2：预变性 Reps：1 95℃ 30 s
Stage 3：循环反应 Reps：50 95℃ 10 s
60℃ 30 s
结果如表所示，引物浓度为0.6 μL时，CT值最低，即在此引物浓度时 qRT-PCR 扩增效率最高，所以我们的方法确定选取引物终浓度为0.6 μL。
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
2、探针终浓度优化
取5×105 的卵囊，脱囊率100％，使用QIAamp RNA Mini Kit试剂盒提取RNA，所提取的RNA，最终稀释到100 μL 洗脱液中。
基于qRT-PCR试剂说明书中的反应中探针浓度调整范围（50~250 nM），我们选取了5 组探针浓度进行筛选：50 nM、100 nM、150 nM、200 nM、250 nM，分别使用C. parvum探针中的两个单一探针及双探针进行qRT-PCR，使用上节筛选出的最优引物浓度，以此来确定qRT-PCR反应中最优探针使用浓度。
Figure DEST_PATH_IMAGE008A
扩增程序：
Stage 1：逆转录 Reps：1 55℃ 15 min
Stage 2：预变性 Reps：1 95℃ 30 s
Stage 3：循环反应 Reps：50 95℃ 10 s, 60℃ 30 s
结果如下：
当使用CpProbe 1探针时，结果为：
Figure DEST_PATH_IMAGE010A
当使用CpProbe 1探针时，探针浓度为250 nM时，qRT-PCR的CT值最低，说明扩增效率最好。
当使用CpProbe 2探针时，结果为：
Figure DEST_PATH_IMAGE012A
当使用CpProbe 2探针时，探针浓度为250 nM时，qRT-PCR的CT值最低，说明扩增效率最好。
当使用CpProbe 1与CpProbe 2双探针时，结果为：
Figure DEST_PATH_IMAGE014A
当使用CpProbe 1与CpProbe 2双探针时，探针搭配浓度为200 nM时，qRT-PCR的CT值最低，说明扩增效率最好。
综上所述，当我们使用单探针进行qRT-PCR时，我们选取探针浓度为250 nM，qRT-PCR的CT值最低，说明扩增效率最好。当我们使用双探针进行qRT-PCR时，我们选取探针搭配浓度为200 nM，qRT-PCR的CT值最低，说明扩增效率最好。
3、qRT-PCR 程序优化
取5×105 卵囊，脱囊率100％，使用QIAamp RNA Mini Kit试剂盒，按照1.2.2节标准步骤提取RNA。所获RNA，最终稀释到100 μL 洗脱液中。
使用上述确定的最优引物浓度及最优探针浓度，基于qRT-PCR试剂说明书中的退火时间调整范围，设定了两组退火时间分别为30s、60s，使用CpProbe 1探针进行qRT-PCR。
Figure DEST_PATH_IMAGE016A
扩增程序：
Stage 1：逆转录 Reps：1 55℃ 15 min
Stage 2：预变性 Reps：1 95℃ 30 s
Stage 3：循环反应 Reps：50 95℃ 10 s
60℃ 30 s或60 s
结果如表8显示：退火时间60s时，CT更低，扩增效率提高，所以退火时间确定为60s。
Figure DEST_PATH_IMAGE018A
实施例5 双反转录引物提高方法灵敏度实验
根据RTase 在 RNA 模板上合成单链 DNA 时，如果遇到模板上前方已有 DNA 单链，会通过新合成 DNA 将其置换下来，而非将其降解的原理。利用这一特征，我们做出假设，在反应中再加入1条反转录引物，即进行反转录时，存在两条引物，1 次反转录获得2条cDNA，由此增加 RT-PCR 中的单链 DNA 模板，从而提高RT-PCR的灵敏度。
Crypt6_3920_1492R（R2引物）：5’-TATCATTTGAAAGTTCGATAC-3’
我们首先取5×105 卵囊提取的RNA，每个体系中分别加入1/2、1/4、1/8三种量的R2引物，分别使用C. parvum探针中的两个单探针及双探针进行qRT-PCR，确定在高浓度的卵囊RNA模板的情况下，不同量的R2引物是否对某个探针或者双探针搭配组有提高灵敏度的作用。
我们再次取3×105卵囊提取的RNA，每个体系中分别加入1/2、1/4、1/8三种量的R2引物，分别使用C. parvum探针中的两个单探针及双探针进行qRT-PCR，确定在低浓度的卵囊RNA模板的情况下，不同量的R2引物是否对某个探针或者双探针搭配组有提高灵敏度的作用。
Figure DEST_PATH_IMAGE020A
Figure DEST_PATH_IMAGE022
扩增程序：
Stage 1：逆转录 Reps：1 55℃ 15 min
Stage 2：预变性 Reps：1 95℃ 30 s
Stage 3：循环反应 Reps：50 95℃ 10 s
60℃ 60 s
当使用CpProbe 1单探针时，结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE024
当使用CpProbe 2单探针时，结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE026
当使用CpProbe 1与 CpProbe 2双探针时，结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE028
在高模板量条件下，与不加入R2相比，加入不同量的R2后，qRT-PCR结果显示 CT 值无明显变化。
我们再次取5×103卵囊提取的RNA，每个体系中分别加入1/2、1/4、1/8三种量的反转录R2引物。
当使用CpProbe 1单探针时，结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE030
当使用CpProbe 2单探针时，结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE032
当使用CpProbe 1与 CpProbe 2双探针时，结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE034
在低模板量条件下，与不加入R2相比，加入不同量的R2后，qRT-PCR结果显示CT 值无明显变化。
综上，当加入反转录引物时，在高浓度RNA模板的条件下，无论使用单探针还是双探针，qRT-PCR灵敏度没有明显提高；在低浓度RNA模板的条件下，无论使用单探针还是双探针，qRT-PCR灵敏度也没有明显提高。
实施例6 单探针与双探针扩增效率对比实验
分别取5×105、5×104、5×103、5×102、250个微小隐孢子虫卵囊，分别提取RNA，每个样本提取的RNA最终都洗脱到100 μL，每个梯度的样本取2 μL RNA为模板，分别用C. parvum探针中的单个探针和双探针进行qRT-PCR，建立标准曲线。
Figure DEST_PATH_IMAGE036
Figure DEST_PATH_IMAGE038
扩增程序：
Stage 1：逆转录 Reps：1 55℃ 15 min
Stage 2：预变性 Reps：1 95℃ 30 s
Stage 3：循环反应 Reps：50 95℃ 10 s
60℃ 60s
结果如图1所示，双探针与单探针相比，提高了扩增效率。
实施例7方法的灵敏度鉴定
分别取5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、25个微小隐孢子虫卵囊，提取RNA，每个样本提取的RNA最终都洗脱到100 μL,每个梯度的样本取2 μL RNA为模板做qRT-PCR，建立标准曲线来确定检测的最低卵囊数。qRT-PCR反应体系扩增程序如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE040
扩增程序：
Stage 1：逆转录 Reps：1 55℃ 15 min
Stage 2：预变性 Reps：1 95℃ 30 s
Stage 3：循环反应 Reps：50 95℃ 10 s
60℃ 60 s
结果如图2所示，以不同梯度卵囊log数为横坐标，以其RNA为模板通过qRT-PCR产生的CT值为纵坐标，可以看出所选卵囊梯度的结果均位于一个线性范围内，当卵囊数为25时到达检测最低线，此时每个反应折合成卵囊为0.5个，即该方法检测的最低卵囊数为0.5个卵囊。
实施例8 方法的特异性鉴定
我们首先需要从微小孢子虫、人隐孢子虫、泰泽孢子虫、艾美尔球虫、贾第虫和大肠杆菌中获得RNA，然后采用多重荧光PCR方法进行此方法的特异性验证，体系中同时加入C.parvum探针、C. hominis探针、C. tyzzeri探针，模板分别加入单个物种的RNA（C.parvum、C. hominis、C. tyzzeri、Eimeria、Giardia、E. coli）及混合物种RNA进行扩增，验证三种探针的特异性。
Figure DEST_PATH_IMAGE042
从上述结果中可以看出，C. parvum 探针、C. hominis 探针只能扩增出其对应的物种，且与其他隐孢子虫和其他物种（如艾美耳球虫、贾第虫、大肠杆菌）无交叉反应，证明该方法中所设计的探针特异性效果良好。
实施例9 通过qPCR和qRT-PCR检测样品中活卵囊比例
1、冻融法灭活隐孢子虫后，DNA和RNA降解情况
冻融法灭活后隐孢子虫DNA降解情况:
（1）取 8×106卵囊，悬浮于400 μL PBS中。分成 8 个等量卵囊（50 μL/each）。
（2）共8组。第1组加DNA提取裂解液buffer ATL后立刻放入液氮冰冻，然后置于 -80℃ 冰箱保存（等于活卵囊对照）。
（3）第2-8样本组不加裂解液，-20℃冰箱放置30min，冰上化开后，冻融3次（液氮2min，冰上化开30min）。在室温环境（水浴25℃）放置8个不同时间后放入液氮冰冻，然后置于 -80℃ 冰箱保存。
（4）最终获得以下不同时间样本：live、0、6、12、24、36、48、72 h。所有样本一起提取DNA，获得的DNA最终都洗脱到100 μL。
（5）使用C. parvum双探针进行qPCR验证DNA降解情况。
冻融法灭活后隐孢子虫RNA降解情况:
（1）取 8×106卵囊，悬浮于400 μL PBS中。分成 8 个等量卵囊（50 μL/each）。
（2）共8组。第1组加RNA提取裂解液buffer RLT后立刻放入液氮冰冻，然后置于 -80℃ 冰箱保存（等于活卵囊对照）。
（3）第2-8样本组不加裂解液，-20度冰箱放置30 min，冰上化开后，冻融3次（液氮2min，冰上化开30min）。在室温环境（水浴25℃）放置8个不同时间后再次放入液氮冰冻，然后置于 -80℃ 冰箱保存。
（4）最终获得以下不同时间点样本：live（活卵囊）和冻融灭活后室温放置0、6、12、24、36、48、72 h后样本。所有样本一起提取RNA，获得的RNA最终都洗脱到100 μL保存液。
（5）使用C. parvum双探针进行qRT-PCR验证RNA降解情况。,
图3，通过结果我们可以看出卵囊DNA在灭活后72 h内基本没有发生了降解，而卵囊RNA在灭活后48 h内降解了90% 以上，与正常情况中卵囊死亡后DNA降解缓慢，而RNA很快降解相符合，所以使用冻融法来灭活隐孢子虫卵囊可行，我们可以根据这一结论建立死卵囊和活卵囊比例曲线。
2、可以通过qPCR和qRT-PCR检测样品中活卵囊比例的方法
分别制备两组含不同卵囊死活比例的样本，每组五份，活与死卵囊比例分别为100%和0%，75%和25%，50%和50%，25%和75%，0%和100%。每份卵囊数为1×106 个/50 μL。卵囊灭活方式为：将卵囊在-20℃冻30 min，在冰上化开（30 min），然后再冻融3次（液氮2 min，冰上化开30 min），每次化开后在涡旋仪振荡15 s，灭活卵囊后室温放置72 h。
这两组样本中，其中一组使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取其DNA，所获DNA最终稀释到100 μL洗脱液中，用于后续qPCR检测。
另一组样本使用QIAamp RNA Mini Kit试剂盒提取其RNA，所获RNA最终稀释到100μL洗脱液中，后续使用C. parvum双探针法进行qRT-PCR检测。
图4，上述qPCR与qRT-PCR结果显示，不同比例活卵囊组的DNA是保持不变的，而RNA与含有的活卵囊比例成相关性。所以我们通过qPCR与qRT-PCR可以检测出样本中活卵囊所占的比例。
实施例10 样品检测
1、样本的采集与前处理
（1）环境水样的采集：2020年6月至2021年7月，从长春市各个地区的污水处理厂中采集 259 份环境水样，于国家城市供水水质监测网长春监测站取回，每份1 L。
（2）环境水样的前处理：每份环境水样取回1 L，然后经离心机进行浓缩，离心时，添加直径20微米的硅胶颗粒（每1升水0.142克），最终每个环境水样离心浓缩到1 mL，标号并且进行记录。
2、检测
浓缩后的样本吸出200 μL，提取RNA，使用cgd6_3920引物，C. parvum 双探针、C. hominis 双探针、C. tyzzeri 双探针使用多重PCR的方法进行同步检测。结果显示检测出15份活的C. parvum。
Figure DEST_PATH_IMAGE044
扩增程序：
Stage 1：逆转录 Reps：1 55℃ 15 min
Stage 2：预变性 Reps：1 95℃ 30 s
Stage 3：循环反应 Reps：50 95℃ 10 s
60℃ 60 s。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 隐孢子虫活卵囊的双探针qRT-PCR检测试剂盒及其方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 125
<212> DNA
<213> Cryptosporidium parvum
<400> 1
tcaattcctt ccaaaggttt tacagctttt tcttttgcaa ttaggtcctc tgattcttga 60
ctaaatctat atctttcatt tgaatcttct tgatattcat caccttctaa ataatctgaa 120
tcact 125
<210> 2
<211> 125
<212> DNA
<213> Cryptosporidium hominis
<400> 2
tcaattcctt ccaaaggttt tacggctttt tcttttgtaa ttagatcttc agattcttga 60
ctaaatctat attttccatt taaatcttct tggtattcat caccttctaa gtaatctgaa 120
tcact 125
<210> 3
<211> 125
<212> DNA
<213> Cryptosporidium tyzzeri
<400> 3
tcaattcctt ccaaaggttt tacagctttt tcttttgcaa ttaaatcctc agattcttga 60
ctaaatctat atctttcatt taaatcttcc tggtattcat caccttctaa ataatctgaa 120
tcact 125
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> Cryptosporidium parvum
<400> 4
atcaagaaga ttcaaatgaa agatatagat ttagtcaaga atcagaggac ctaattgcaa 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> Cryptosporidium hominis
<400> 5
accaagaaga tttaaatgga aaatatagat ttagtcaaga atctgaagat ctaattacaa 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> Cryptosporidium tyzzeri
<400> 6
accaggaaga tttaaatgaa agatatagat ttagtcaaga atctgaggat ttaattgcaa 60

Claims (6)

1. 检测C. parvum微小隐孢子虫、C. hominis人隐孢子虫）、C. tyzzeri泰泽隐孢子虫的qRT-PCR引物及探针，包括：
引物：
Cryptosporidium属内多物种的通用探针：
Crypt6_3920_1201F: 5’-AGTGATTCAGATTAYTTAGAAGGTG-3’；
Crypt6_3920_1325R: 5’-TCAATTCCTTCCAAAGGTTTTAC-3’；
C. parvum 特异性探针：
Cp6_3920_1232p1b： FAM-TCAAGAAGATTCAAATGAAAG -MGB ；
Cp6_3920_1273p2b： FAM-TGCAATTAGGTCCTCTGA –MGB；
C. hominis 特异性探针：
Ch6_3920-1232p1b： JOE-CCAAGAAGATTTAAATGGAAA –MGB；
Ch6_3920_1272p2b：JOE-TTGTAATTAGATCTTCAGATT –MGB；
C. tyzzeri特异性探针：
Ct6_3920-1232p1b：TMR-TTGTAATTAGATCTTCAGATT –MGB；
Ct6_3920_1272p2b：TMR-TTGTAATTAGATCTTCAGATT –MGB。
2. 检测隐孢子虫的双探针qRT-PCR试剂盒，它包括：所述的同步检测C. parvum、C. hominis、C. tyzzeri的qRT-PCR引物及探针。
3. 根据权利要求2所述的检测隐孢子虫的双探针qRT-PCR试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中的单个qRT-PCR扩展反应的总体积20 μL，包括下列物质：2× One Step Q ProbeMix 10 μL；One Step Q Probe Enzyme Mix 1 μL；50× ROX参比染料 0.4 μL；10 μM 上下游引物 1.2 μL；C. parvum、C. hominis、C. tyzzeri 探针各0.4 μL；样本RNA 2 μL；RNase-Free dH2O 1.8 μL。
4.根据权利要求3所述的检测隐孢子虫的双探针qRT-PCR试剂盒，其特征在于，反应条件为：
1）逆转录反应，1次，55 ℃ 15 min；
2）预变性反应，1次，95 ℃ 30 s；
3）循环反应，40次，95 ℃ 10 s 与 60℃ 60 s。
5.环境水样中隐孢子虫检测方法：
1）取水样，每1升水添加硅胶颗粒0.142克，离心、浓缩到1 mL；
2）提取隐孢子虫卵囊RNA；
3）qRT-PCR进行检测得到的RNA；
所述的qRT-PCR反应体系为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
反应条件为：
Stage 1：逆转录 Reps：1 55℃ 15 min
Stage 2：预变性 Reps：1 95℃ 30 s
Stage 3：循环反应 Reps：40 95℃ 10 s, 60℃ 60 s。
6.根据权利要求5所述的环境水中隐孢子虫检测方法，其特征在于：所述的硅胶颗粒直径20微米。
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CN117568501A (zh) * 2024-01-15 2024-02-20 深圳市刚竹医疗科技有限公司 基于实时荧光定量pcr技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合、试剂盒及方法

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