CN109055301B - 一种脑微细血管分离提纯方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脑微细血管分离提纯方法，包括以下步骤：(1)取小鼠新鲜全脑组织，经Dounce匀浆器上下研磨12‑15次制备组织匀浆液；(2)将组织匀浆液经无菌玻璃磁珠和70μm尼龙细胞过滤器双重过滤，得到脑血管和微细血管组织。通过本发明的方法不仅可以有效提高分离出脑微细血管的完整度、数量和纯度，而且不破坏脑微细血管内各靶标蛋白的含量。

Description

一种脑微细血管分离提纯方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种脑微细血管分离提纯方法。

背景技术

阿尔兹海默病(AD)，即老年性痴呆，是严重影响公众生活质量的一种进行性发展的神经退行性病变。阿尔兹海默病其特征性病理改变为脑组织退行性变及老化造成小动脉、软脑膜和大脑皮层的毛细血管通透性改变,促使血清中淀粉样蛋白-β蛋白沉积在脑组织中与血管壁上，引发脑淀粉样血管病(CAA)。近年来血管因素在阿尔兹海默病的发生、发展中受到广泛关注。目前，阿尔茨海默病其病因及发病机制尚未阐明，导致至今没有获批的治疗方法，其主要原因是无法获取完整的足量脑微细血管且不破坏血管内淀粉样蛋白-β蛋白的含量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种脑微细血管分离提纯方法。该方法采用物理手段，可以有效提高分离出脑微细血管的完整度、数量和纯度，而且不破坏脑微细血管内各靶标蛋白的含量。

基于上述目的，本发明提供了一种脑微细血管分离提纯方法，其特征在于，包括：利用杜恩斯匀浆器研磨小鼠脑组织，制备小鼠脑组织匀浆液；小鼠脑组织匀浆液经无菌磁珠和细胞滤器过滤，得到纯化的脑血管和微血管组织。所述小鼠脑组织为小鼠的新鲜全脑组织。所述利用杜恩斯匀浆器研磨小鼠脑组织，制备小鼠脑组织匀浆液中还包括：所述小鼠脑组织经杜恩斯匀浆器缓慢研磨12-15次获取小鼠脑组织匀浆液，且避免产生气泡。所述利用杜恩斯匀浆器研磨小鼠脑组织，制备小鼠脑组织匀浆液中还包括：所述小鼠脑组织匀浆液离心后，用4℃的含17％葡聚糖的20毫摩尔HEPES-DMEM重悬组织沉淀，4℃条件下10000g离心30分钟，去除上清液和脂肪层，不要触碰到含有脑血管和微血管的沉淀物。所述含有脑血管和微血管的沉淀物用4℃的含10％胎牛血清的20毫摩尔HEPES-DMEM重悬，获得组织悬液。所述小鼠脑组织匀浆液经无菌磁珠和细胞过滤器过滤，得到纯化的脑血管和微血管组织中还包括：将高压灭菌的无菌磁珠置于细胞过滤器中，无菌磁珠填充满细胞过滤器，使所述组织悬液与无菌磁珠接触。所述小鼠脑组织匀浆液经无菌磁珠和细胞过滤器过滤，得到纯化的脑血管和微血管组织中还包括：将所述无菌磁珠全部倒入组织培养皿中，向组织培养皿中加入所述含10％胎牛血清的20毫摩尔HEPES-DMEM，轻摇所述细胞过滤器和所述组织培养皿。所述小鼠脑组织匀浆液经无菌磁珠和细胞过滤器过滤，得到纯化的脑血管和微血管组织中还包括：重复所述向组织培养皿中加入含10％胎牛血清的20毫摩尔HEPES-DMEM，轻摇所述细胞过滤器和所述培养皿至少三次。

本发明实施例的结果显示：本发明提供的脑微细血管分离提纯方法，不会损伤脑血管和微细血管完整性，保证脑血管和微细血管获取的量，同时确保脑微细血管具有较高的分离纯度。

附图说明

图1为匀浆12-15次和15次以上显微镜下观察的分离小鼠脑微细血管(10×)；a.匀浆12-15次；b.匀浆15次以上

图2为无菌玻璃磁珠粒过滤4次之后磁珠上残留成分(20×)；

图3为收集的脑组织悬液和分离提纯的脑微细血管内皮标记CD31的Westernblot结果；a.CD31 Western blot图像；b.CD31分析结果。

图4为收集不同脑组织获取脑微细血管沉淀物的量；a.新鲜大脑皮层+海马组织的脑血管和微血管组织提取物；b.新鲜半脑脑血管和微血管组织提取物；c.新鲜全脑脑血管和微血管组织提取物；d.冰冻全脑脑血管和微血管组织提取物。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

本发明提供了一种脑微细血管分离提纯方法，具体步骤为：

1.使用酒精浸泡的医用纸尽可能去除大脑的脑膜，并切掉小脑和嗅球。

2.无菌条件下解剖小鼠大脑，处理为1-2mm³的组织块，直接滴加100-300ul 4℃的试剂[1]到组织块上，并用大孔吸管将组织转移到Dounce匀浆器，再滴加4℃的100-300ul试剂[1]清洗载玻片的遗留组织块同时转移至Dounce匀浆器，重复清洗1-2次。将组织块于杜恩斯(Dounce)匀浆器中研磨为组织匀浆。

3.将所述步骤2得到的组织匀浆转移至15ml锥形管中，每次添加400-600ul 4℃的试剂[1]清洗Dounce匀浆器至少三次，以收集尽可能多的组织匀浆。

4.将所述步骤3得到的组织匀浆离心获得脑血管和微血管的沉淀物。所述离心条件为：4℃条件下1000g离心10分钟。

5.将所述步骤4得到的沉淀物用2-4mL 4℃的试剂[2]重悬。组织悬液转移至离心管中，继续添加3-5ml 4℃的试剂[2]冲洗锥形管。

6.将所述步骤5得到的组织悬液于4℃条件下10000g离心30分钟。去除上清液和脂肪层(注意不要触碰到含有脑血管和微血管的沉淀物)获取脑血管和微血管的沉淀物。

7.采用0.5-1.5mL 4℃的试剂[3]重悬所述步骤6得到的沉淀物。同时用1-3mL试剂[3]冲洗离心管以尽可能多的收集脑血管和微血管组织悬液。

8.将所述步骤7得到的组织悬液经孔径70μm的细胞滤器过滤获取脑微细血管。

实施例1

参见图1，其为本发明实施例不同匀浆次数对分离提取脑微细血管的影响。

小鼠大脑组织碎块转移至Dounce匀浆器后，上、下推动研磨棒12-15次以获得组织匀浆。研磨过程要求非常平缓。最初的几次推动匀浆器会很困难，但随着组织的分解和碎块的不断研磨，匀浆器推动更加容易。匀浆过程中确保无气泡产生。使用足够量的高压灭菌后的无菌玻璃磁珠粒(～2g)置于70μm尼龙细胞过滤器中，填充满尼龙细胞过滤器，并将尼龙细胞过滤器安装在50ml锥形管管口。用1ml试剂[4]清洗无菌玻璃磁珠粒两次。将所述步骤7得到的脑血管和微血管组织悬液滴在清洗后的无菌玻璃磁珠粒上，使脑微血管粘附在无菌玻璃磁珠表面，其余直径小于70μm的组织碎片或血管碎片等通过细胞滤器滤除。将尼龙细胞过滤器上的全部玻璃磁珠粒倒入直径60mm的组织培养皿中，重复洗涤五次以收集玻璃磁珠粒上的大部分微血管(小心玻璃磁珠粒进入清洗液中)。收集洗涤五次后玻璃磁珠上的残留组织，显微镜下观察残留物(结果见图2)。轻轻晃动培养皿，使脑血管和微血管组织与玻璃磁珠粒分开。用无菌吸管收集含有脑血管和微血管组织的溶液，并转移到15ml锥形管中。在培养皿中加入3ml试剂[3]，摇动培养皿，使脑血管和微血管组织从玻璃磁珠粒上脱落，此步骤重复三至五次，便于收集尽可能多的脑血管和微血管组织。将组织悬液于4℃条件下1000g离心10分钟后，弃上清，用1ml试剂[5]重悬沉淀物，显微镜下观察分离的小鼠脑微细血管的形态特征(结果见图1a)；另一部分组织碎块置于Dounce匀浆器上、下推动研磨棒15次以上，其余操作步骤和注意事项一致，显微镜下观察分离的小鼠脑微细血管的形态特征(结果见图1b)。

本实施例中，图1a表明匀浆12-15次在显微镜10倍放大下可见大量的脑血管和微血管组织；图1b表明匀浆15次以上显微镜10倍放大下同样可以见到脑血管和微血管组织，但其微血管组织片段均较小，容易在过滤中流失，且微血管组织研磨过碎，导致所获取的脑微血管量较少且结构不完整。从结果中可以看出，匀浆12-15次较匀浆15次以上的效果要好。图2显示匀浆12-15次的脑血管和微血管组织悬液经过所述实施例1中的无菌玻璃磁珠清洗清洗三至五次后，获取玻璃醋煮表面残余组织于显微镜下20倍观察。结果可见，玻璃磁珠经三至五次清洗后，大部分脑血管和微血管组织已被冲洗入培养皿中，组织上仅残存少量微血管组织，表明所述清洗步骤达到了清洗目的。

在本实施例中，应用Dounce匀浆器匀浆12-15次制备组织匀浆，同时用无菌玻璃磁珠和70μm尼龙细胞过滤器双重过滤的方式，获得足够量的，结构完整的脑血管和微细血管组织。

实施例2

参见图3和图4，其为本发明实施例应用免疫印迹试验(Western blot)测定不同分离提纯方法得到的脑血管和微血管靶标蛋白CD31的含量。

将所述实施例1得到的脑血管和微血管组织经4℃1000g离心10分钟后，用200-300ul试剂[5]重悬脑血管和微血管沉淀。分样并添加2×SDS缓冲液以制备100μl1x SDS w/1x蛋白酶和1x磷酸酶抑制剂。具体操作步骤如下：

1.使用动物细胞(组织)总蛋白抽提试剂，按照1:99比例加入蛋白酶抑制剂混合物；按1:10(g/ml)的比例加入组织蛋白抽提试剂并作匀浆和超声处理。取保存于－80℃中的小鼠脑血管和微血管组织提纯物质至于2ml离心管中，按照0.8ml/100mg的比例加预冷的组织蛋白抽提液。冰上采用超声，每次工作10秒，间歇10秒，循环6次，随后冰水浴。组织悬液4℃，14000g离心15min，吸取上清分装于-80℃保存备用。

2.蛋白质含量测定

采用考马斯蓝染色法(Bradford法)测定蛋白含量，通过测定考马斯亮蓝G–250染料与待测蛋白的结合量，并与结合这种染料的不同量的标准蛋白质(牛血清白蛋白)比较来定量未知蛋白。具体操作按照试剂说明书进行(所述的蛋白质含量测定试剂盒为市场常规可购买到的试剂盒种类)。

3.免疫印迹试验

(1)配制溶液

1.5MpH8.8 Tris-SDS(十二烷基硫酸钠)：18.17g Tris-base，0.4gSDS，充分溶解后，用超纯水定溶至100ml，室温保存。

1MpH6.8 Tris-SDS：12.11g Tris-base，0.4gSDS，充分溶解后，用超纯水定溶至100ml，室温保存。

30％丙烯酰胺(Acr)：30gAcr，0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bic)，用超纯水定溶至100ml，溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

上样Buffer(6×)：1ml 1MpH6.8 Tris-SDS，1.2gSDS，0.02g溴酚蓝，加3ml甘油，用水定溶至10ml。

SDS电泳缓冲液(5×)PH8.3：15.1g tris-base，72.0g甘氨酸(glycin)，5gSDS，用双蒸水定溶至1000ml。

10％SDS：10gSDS，超纯水100ml，50℃水浴下溶解后，室温保存。

10％过硫酸胺(AP)：过硫酸胺0.1g，超纯水l.0ml，溶解后4℃保存，保存时间1周。

转移缓冲液：1.82g tris-base，8.65g甘氨酸，90ml甲醇，定容至600ml。

TBS缓冲液：12.11g tris-base，9g Nacl，溶解于800ml水中，以7.5ml的浓盐酸调PH至7-8之间，定容至1000ml。

TBST缓冲液：12.11g tris-base，9g Nacl，溶解于800ml水中，加7.5ml浓盐酸，1mlTween20，定容至1000ml。

封闭液：0.1g牛血清(BSA)，TBS 10ml，或者0.5g脱脂奶粉，TBS 10ml，制成5％的脱脂奶粉。

考马斯亮蓝G250染色液：40ml乙酸，0.1g考马斯亮蓝G250，用水定溶至400ml。

(2)配胶与灌胶

分别按下表配制电泳分离胶(12％)和积层胶(5％)

表1分离胶和积层胶的配制

清洗玻璃板：准备清洁玻璃板1套，用棉球醮乙醇溶液擦玻璃板，再用蒸馏水冲洗后晾干或吹干备用。

灌胶：将两块玻璃板和边条(选择和玻璃厚度配套1.0mm的边条)组装在一起，玻璃板下端对齐，较长的一块位于内侧，将玻璃板放入电泳槽的主体架子上，外侧用斜楔板卡紧，将配套的1.0mm的样品梳准备好，准备灌胶。将混匀后的分离胶溶液，沿玻璃板的边缘(可以防止产生气泡)，用1ml移液器加至距梳齿下缘约1cm。再用1ml移液器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加满超纯水，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60min后凝胶完全聚合，则可看到超纯水与凝固的胶面有折射率不同的界线。此时将超纯水倒去，然后用滤纸吸干。

将混合均匀后的浓缩胶溶液灌入分离胶上方，直至将剩余的空间灌满，然后轻轻将梳子插入。灌浓缩胶同样也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。约30min后，上层胶聚合，取出玻璃板，拆掉边条，迅速更换内外方向后放回架子上，卡紧后放入电泳槽。

加入电泳缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm。此时注意排除玻璃板下端分离胶底部的气泡，气泡多时会影响电泳的速度，并可能使得泳道歪斜，然后小心拔出梳子。

(3)样品的处理及加样

按照每10ul样品+2μl 6×上样Buffer，100℃恒温金属浴12min，取出冷却后混匀即可加样。

加入上样Buffer后按照蛋白提取后测定的原始浓度，重新计算蛋白的终浓度，并计算每个样品的加样体积(每个样品80ug)。

用10ul移液器小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部，其中一个孔加入8u1预染的蛋白质Marker，其他不用的空孔中加入等体积的1×上样缓冲液。

(4)电泳

将电泳仪与电源接通，打开电泳仪稳压在80mV，电泳20min，至溴酚蓝前沿达分离胶，将电压调至120mV，电泳80min左右，当溴酚蓝染料距底框0.5cm时，停止电泳。

(5)剥胶与转膜

取下玻璃板，从一个下角将玻璃翘松，翘开后小心将分离胶切除，将凝胶小心剥入盛有转移缓冲液的盘中，凝胶即滑入转移缓冲液中，平衡10min。戴无粉尘手套，根据样品的多少剪一张合适大小的PVDF膜，再剪6张同样大小的滤纸。在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上做好标记，放入盛有少量甲醇玻璃皿，PVDF膜在甲醇内浸湿数秒，转入转移缓冲液中平衡10min。

本实验采用湿转。将转印夹子打开，使一面保持水平，放入加有转移缓冲液的方盘内，按顺序组装转印夹层：一张海绵，三层滤纸，凝胶，一张PVDF膜，三层滤纸，一张海绵。每加一层就用玻璃试管排去气泡。安装时注意胶靠近转印夹黑色的一侧，膜则靠近转印夹白色的一侧，以保证转膜时凝胶在负极。

将安装好的转印夹放入转膜仪槽内，接好电泳仪电源，打开电源开关，设置转膜条件为稳流300mA，冰浴下75min左右。

(6)封闭

转膜结束后，将膜放入TBST洗1次，采用5％的脱脂奶粉室温摇床封闭2h，去封闭液，TBST10min×3次。

(7)一抗孵育

用封闭液稀释一抗，每张PVDF膜添加3ml CD31(PECAM-1)(～130kDa,mAb#77699，1：500，购自美国Cell Signaling Technology)一抗，内参αTubulin Antibody(～55kDa,sc-53646，1：4000，购自美国Santa Cruz Biotechnology)一抗，置4℃冰箱过夜；一抗可以回收再次利用，可加入0.02％的叠氮钠防止变质。TBST振摇洗涤，15min×3次。

所述内参即是内部参照(internal control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(housekeeping proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。GAPDH、beta-actin和Tublin等在各组织和细胞中的表达相对恒定，以校正蛋白质定量、上样误差，保证实验结果的准确性。

(8)二抗孵育

将膜放入新的杂交袋中，每张PVDF膜添加3ml anti-Rabbit or Mouse IgG(H&L)-HRP二抗(1:4000,购自美国Santa Cruz Biotechnology)，室温振摇2h。将膜取出后，用TBST振摇洗涤，10min×4次。

本发明中，所述TBST中含有Tris-Hcl，NaCl，Tween20三种物质，是做Western blot常用的一种缓冲溶液

(9)化学发光与扫描

原理：在HRP催化作用下，过氧化物与鲁米诺(Luminol)增强剂反应发强光，可见光信号可以用压片法检测。Western实验中，HRP标记在二抗上，与一抗－靶蛋白复合物结合，再用SuperSignal底物进行发光检测。采用凝胶电泳(Non-denaturing gradient gelelectrophoresis，NDGGE)和显色盒(GEHealthcare；Buckinghamshire,UK)曝光影片，采用柯尼卡影片处理器(Konica，型号SRX-101A)冲洗曝光影片。

(10)结果分析

采用美国Image J对Western blot条带进行灰度分析

本实施例中，将未经分离提纯的脑组织匀浆液作为对照，测定分离提纯后的脑血管和微细血管内皮标记CD31的含量(结果见图3a和3b)。另外，分别选取全脑、半脑、半脑皮层和海马体的新鲜和冰冻组织制备组织悬液，观察得到的脑微血管和微细血管的量(结果见图4)，同时测定分离提纯后的脑血管和微细血管内皮标记CD31的含量(结果见图3a和3b)。

从结果可以看出，前四个样本为对照组样本，即未经分离提纯的脑组织匀浆液(input)，后十个样本为最终分离提纯的脑血管和微血管组织抽提蛋白。从内皮标记CD31的相对定量来看，由全脑提取的脑血管和微血管组织CD31表达的量最多，CD31与内参Tublin的比值达4.5；由半脑提取的脑血管和微血管组织仅符合要求，但CD31表达量低于全脑提取，CD31与内参Tublin的比值为1.5；半脑皮层+海马提取脑血管和微血管组织效果较差；新鲜组织略好于冰冻组织，二者相差不大。从图4可以看出，由新鲜全脑组织分离提纯的脑血管和微细血管的量最多。

在本实施例中，选取小鼠新鲜全脑组织分离提纯脑微血管和微细血管，从而获得纯度更高，量更大的脑血管和微细血管组织。

在本发明中，所述试剂[1]至试剂[5]的配置方法如下：

1.试剂[1]：20mM HEPES-DMEM：将357.5mg HEPES加入到75ml DMEM中(每1ml DMEM中溶解4.766mg HEPES)；

2.试剂[2]：17％葡聚糖-20mM HEPES-DMEM试剂：将50ml HEPES-DMEM试剂[1]分装到新的试管和标签[2]。加入8.5g葡聚糖至20mM HEPES-DMEM。此试剂需提前准备，并在室温下混匀直至溶解。

3.试剂[3]：将10％FBS溶入到所述试剂[1]中，例如5mlFBS加入45mL试剂[1]；

本发明中，所述FBS为胎牛血清，用于加入到培养基中为细胞提供营养成分。

4.试剂[4]：无菌PBS。

本发明中，所述PBS为磷酸盐缓冲液。

5.试剂[5]：无菌1xPBS w/1x磷酸酶和1x蛋白酶抑制剂。

本发明中，所述DMEM是一种含多种氨基酸和葡萄糖的培养基；HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，是一种氢离子缓冲剂，它可以长时间维持体系中PH恒定；HEPES-DMEM为加入HEPES的DMEM培养基。

以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

Claims (3)

1.一种脑微细血管分离提纯方法，其特征在于，包括：

利用杜恩斯匀浆器研磨小鼠脑组织，制备小鼠脑组织匀浆液；

小鼠脑组织匀浆液经无菌磁珠和细胞滤器过滤，得到纯化的脑血管和微血管组织；

所述利用杜恩斯匀浆器研磨小鼠脑组织，制备小鼠脑组织匀浆液中还包括：

所述小鼠脑组织匀浆液离心后，用4℃的含17％葡聚糖的20毫摩尔HEPES-DMEM重悬组织沉淀，4℃条件下10000g离心30分钟，去除上清液和脂肪层，不要触碰到含有脑血管和微血管的沉淀物；

所述含有脑血管和微血管的沉淀物用4℃的含10％胎牛血清的20毫摩尔HEPES-DMEM重悬，获得组织悬液；

所述小鼠脑组织匀浆液经无菌磁珠和细胞过滤器过滤，得到纯化的脑血管和微血管组织中还包括：

将高压灭菌的无菌磁珠置于细胞过滤器中，无菌磁珠填充满细胞过滤器，使所述组织悬液与无菌磁珠接触；

将所述无菌磁珠全部倒入组织培养皿中，向组织培养皿中加入所述含10％胎牛血清的20毫摩尔HEPES-DMEM，轻摇所述细胞过滤器和所述组织培养皿；

重复所述向组织培养皿中加入含10％胎牛血清的20毫摩尔HEPES-DMEM，轻摇所述细胞过滤器和所述培养皿的步骤至少三次。

2.根据权利要求1所述的一种脑微细血管分离提纯方法，其特征在于，所述小鼠脑组织为小鼠的新鲜全脑组织。

3.根据权利要求1所述的一种脑微细血管分离提纯方法，其特征在于，所述利用杜恩斯匀浆器研磨小鼠脑组织，制备小鼠脑组织匀浆液中还包括：

所述小鼠脑组织经杜恩斯匀浆器缓慢研磨12-15次获取小鼠脑组织匀浆液，且避免产生气泡。

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