CN116162594A - 一种基于组织研磨的活细胞提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于组织研磨的活细胞提取方法，包括如下步骤：1)将待处理组织与添加剂混合得到混合物；2)将步骤1)得到的混合物加入细胞研磨装置的研磨皿中研磨，得到组织悬液；3)将步骤2)得到的组织悬液通过细胞研磨装置的滤膜过滤，得到细胞悬液。本发明针对现有原代细胞提取方法细胞提取数量低、过度消耗人工、细胞存活率低等问题，对原有的刀片剪切的方式进行改进采取研磨的方式对其进行替换，可以显著提高人或动物健康或疾病实体组织活细胞提取成功率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的说，涉及一种基于组织研磨式的活细胞提取方法。
背景技术
目前常用的活细胞提取大多采取基于刀或剪刀切取并利用生物酶消化的方法，利用人工剪切或用机械设备进行剪切。上述方法具有如下缺点：
1)人工剪切：目前用人工剪或切处理组织样本提取细胞的方法耗时长，不仅耗用人工，还对细胞存活率产生了一定的负向影响，且得到的组织碎块不均匀，使消化时长很难控制，进而影响活细胞的提取效率与细胞存活率。
2)机械方法剪切：这一方法相比于人工剪切节省人工，但由于电极附近较热、刀头要高速长时间旋转等因素导致细胞存活率很低，影响后续实验。
3)酶消化表层细胞：这一方法的应用场景不多，仅用于表层细胞的消化，且需要多次消化处理，细胞提取效率不高。
发明内容
发明用于活细胞提取，针对现有的针对组织提取细胞的消耗人工、结果难重复、细胞提取效率不高以及细胞存活率低的问题，提出了新的组织研磨方法。
本发明提供一种基于组织研磨的活细胞提取方法，包括如下步骤：
1)将待处理组织与添加剂混合得到混合物；
2)将步骤1)得到的混合物加入细胞研磨装置的研磨皿中研磨，得到组织悬液；
3)将步骤2)得到的组织悬液通过细胞研磨装置的滤膜过滤，得到细胞悬液；
所述细胞研磨装置包括研磨器、研磨皿、过滤器和收集器，所述研磨器的下端面为粗糙表面；所述研磨皿底壁的内表面为与研磨器匹配的粗糙表面，所述研磨皿的底壁上设有排液口；所述过滤器通过排液口与研磨皿相连通，所述过滤器的出口端设有滤膜；所述收集器与过滤器相连通。
其中，所述步骤1)中的添加剂为等渗溶液和/或生物酶。
其中，所述等渗溶液为PBS培养基、DMEM培养基、DMEM F12培养基或红细胞裂解液。
其中，所述生物酶为胶原酶、胰酶或DNAse。
其中，所述生物酶的用量为1μM-10μM。
其中，所述步骤2)中的研磨时间为5-20min。
其中，所述粗糙表面的粗糙度为0.05-1000μm。
其中，所述研磨器的上端连接有手柄；所述手柄与驱动装置可拆卸连接。
其中，所述滤膜为10-100μm滤膜。
其中，还包括将步骤3)得到的细胞悬液使用生物酶、生长因子、抑制剂或化学制剂进一步消化组织获取细胞的步骤。
所述待处理组织可以为人细胞组织也可以为动物细胞组织，包括但不限于，肿瘤细胞组织和非肿瘤细胞组织。
相比于目前存在的几种细胞提取方法，本发明具有以下几个优点：本发明可用于自动化提取细胞悬液，但同时也可进行手动操作；本发明提取出的细胞由于操作时间短、条件温和等优势使得提取细胞的存活率较目前几种方法更高；本发明处理生物样本相比于剪切法更均匀，细胞提取效率更高；本发明可以节约人工成本，无论是手动或是机械控制都可以明显提高细胞提取效率；本发明可以针对不同种类组织灵活地添加或更改生物酶含量；本发明可添加保证组织细胞存活率的生长因子、抑制剂或化学制剂等试剂；本发明使用各类不同天然组织、人造组织、各类动物组织(不同硬度、多细胞种类组织)的活细胞提取，应用场景较广；本发明可设计成高通量自动化的细胞提取设备，流程可标准化，进而进一步提高多种类细胞提取效率。
附图说明
图1为传统做法(A)与本发明方法(B)提取细胞死亡率(红色荧光)对比图；
图2为传统做法(A)与本发明方法(B)处理后所得到的人肺组织碎屑对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等如PBS培养基、DMEM培养基、DMEM F12培养、胶原酶、胰酶或DNAse，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的人肝癌组织样本和人肺组织样本均来自郑州大学第一附属医院，公众可以从清华大学深圳国际研究生院获得。
本发明提供一种基于组织研磨的活细胞提取方法，包括如下步骤：
1)将待处理组织与添加剂混合得到混合物；
2)将步骤1)得到的混合物加入细胞研磨装置的研磨皿中研磨，得到组织悬液；
3)将步骤2)得到的组织悬液通过细胞研磨装置的滤膜过滤，得到细胞悬液。
所述步骤1)中的添加剂为等渗溶液和/或生物酶。
还包括将细胞悬液使用生物酶、生长因子、抑制剂或化学制剂进一步消化组织获取细胞的步骤。
所述等渗溶液为PBS培养基、DMEM培养基、DMEM F12培养基或红细胞裂解液。
所述生物酶为胶原酶、胰酶或DNAse。
所述步骤2)中的研磨时间为5-20min。
所述生物酶的用量为1μM-10μM。
本发明使用的细胞研磨装置包括如下结构：
所述细胞研磨装置，包括：研磨器，所述研磨器的下端面为粗糙表面；研磨皿，所述研磨皿底壁的内表面为与研磨器匹配的粗糙表面，所述研磨皿的底壁上设有排液口；过滤器，所述过滤器通过排液口与研磨皿相连通，所述过滤器的出口端设有滤膜；收集器，所述收集器与过滤器相连通。
作为进一步方案，所述研磨器的下端面与所述研磨皿底壁的内表面均为平面。
作为进一步方案，所述研磨器的下端面与所述研磨皿底壁的内表面均为弧形表面。
作为进一步方案，所述研磨器的下端面与所述研磨皿底壁的内表面均为不规则表面。
作为进一步方案，所述粗糙表面的粗糙度为0.05-1000μm。
作为进一步方案，所述粗糙表面为具有凸起和或凹陷的表面。
作为进一步方案，所述凸起和或凹陷的截面形状为圆形、椭圆形、多边形或不规则图形。
作为进一步方案，所述研磨器的上端连接有手柄。
作为进一步方案，所述手柄与驱动装置可拆卸连接。所述驱动装置可以为电力或者人力驱动装置，如电机，丝杠等。
作为进一步方案，所述滤膜为10-100μm滤膜。
作为进一步方案，所述研磨器和研磨皿由石材、硬质塑料、玻璃或金属材料制成。
作为本实施例的进一步方案，所述研磨皿的排液口22处设有可开合的挡板。当挡板闭合时，排液口关闭，保证带研磨组织能够在研磨皿中充分研磨，当挡板打开时，排液口开启，研磨后的组织碎和细胞悬液能够流通至过滤器中。
本发明的方法可用人工也可用机械自动化进行，省时省力，得到的组织碎块较均匀，细胞提出率和细胞存活率显著提高，且可根据不同组织提供不同的消化研磨方案，保证细胞的提取效率及细胞存活率。
本发明利用两个粗糙表面(例如但不限于平面、弧形表面、不规则表面等；例如但不限于石材、硬质塑料、玻璃、金属材料等)对天然动物组织或人造组织、半人造组织及细胞团等进行研磨从而获取包括人在内的哺乳动物组织原代活细胞。本发明可利用手动或机械自动化研磨(单独研磨或高通量研磨)方法用两个粗糙表面对组织进行研磨。本发明提出的研磨方法可以(但不限于)利用细胞等渗溶液(比如但不限于PBS、DMEM、DMEM F12、红细胞裂解液等含血清或无血清的溶液)进行辅助研磨获取细胞。本发明可仅用研磨不添加生物酶(比如但不限于胶原酶、胰酶、DNAse等)的方法获取细胞。本发明可研磨后继续用不同浓度(比如但不限于1μM、10μM等)生物酶(比如但不限于胶原酶、胰酶、DNAse等)、生长因子、抑制剂、化学制剂等，消化组织进一步获取细胞。引入自动回收细胞悬液模块，进一步自动化提取细胞并回收细胞悬液。
针对现有原代细胞提取方法细胞提取数量低、过度消耗人工、细胞存活率低等问题，对原有的刀片剪切的方式进行改进采取研磨的方式对其进行替换。
本发明可以显著提高人或动物健康或疾病实体组织活细胞提取成功率。本发明技术技术良好的生物和细胞相容性，制造过程对细胞损伤较小，细胞可用于后续培养或其他用途。
实施例1
将人肝癌组织样本置于本发明的细胞研磨装置中，加入约5mL DMEM-F12培养基与1％胶原酶、1％DNAse并用研磨器充分研磨约10分钟后将悬液经100μm滤膜过滤之后即可得到肝癌原代肿瘤细胞悬液1。
将肝癌原代肿瘤细胞悬液1进行荧光染色法检测(染色剂为：碘化丙锭)，结果如图1B所示。
将人肝癌组织样本采用文章(Patient-derived organoids model treatmentresponse of metastatic gastrointestinal cancers[J].Science,2018,359(6378):920-926)中的方法进行细胞处理，得到肝癌原代肿瘤细胞悬液2。
将上述得到肝癌原代肿瘤细胞悬液2进行荧光染色法检测(染色剂为：碘化丙锭)，结果如图1A所示，红色荧光点表示死亡的细胞。
从图1中可以明显看出，采用本发明的方法进行细胞提取与采用传统做法进行细胞提取相比，与本发明提取细胞的死亡率更低。
实施例2
将人肺组织样本，使用1mLDMEM，加入1mg/mL IV型胶原酶进行研磨处理，得到人肺细胞悬液1。将人肺细胞悬液1进行显微镜下拍摄，如图2B所示。
将人肺组织样本采用文章(Patient-derived organoids model treatmentresponse of metastatic gastrointestinal cancers[J].Science,2018,359(6378):920-926)中的方法进行细胞处理，得到人肺细胞悬液2。将人肺细胞悬液2进行显微镜下拍摄，如图2A所示。
结合图2可以看出，与传统的处理方法相比，本发明的处理方法处理后所得到的组织碎屑大小明显更为均匀，解离组织组织更充分。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种基于组织研磨的活细胞提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将待处理组织与添加剂混合得到混合物；
2)将步骤1)得到的混合物加入细胞研磨装置的研磨皿中研磨，得到组织悬液；
3)将步骤2)得到的组织悬液通过细胞研磨装置的滤膜过滤，得到细胞悬液；
所述细胞研磨装置包括研磨器、研磨皿、过滤器和收集器，所述研磨器的下端面为粗糙表面；所述研磨皿底壁的内表面为与研磨器匹配的粗糙表面，所述研磨皿的底壁上设有排液口；所述过滤器通过排液口与研磨皿相连通，所述过滤器的出口端设有滤膜；所述收集器与过滤器相连通。
2.根据权利要求1所述的基于组织研磨的活细胞提取方法，其特征在于，所述步骤1)中的添加剂为等渗溶液和/或生物酶。
3.根据权利要求2所述的基于组织研磨的活细胞提取方法，其特征在于，所述等渗溶液为PBS培养基、DMEM培养基、DMEM F12培养基或红细胞裂解液。
4.根据权利要求2所述的基于组织研磨的活细胞提取方法，其特征在于，所述生物酶为胶原酶、胰酶或DNAse。
5.根据权利要求4所述的基于组织研磨的活细胞提取方法，其特征在于，所述生物酶的用量为1μM-10μM。
6.根据权利要求1所述的基于组织研磨的活细胞提取方法，其特征在于，所述步骤2)中的研磨时间为5-20min。
7.根据权利要求1-6任一所述的基于组织研磨的活细胞提取方法，其特征在于，所述粗糙表面的粗糙度为0.05-1000μm。
8.根据权利要求7所述的基于组织研磨的活细胞提取方法，其特征在于，所述研磨器的上端连接有手柄；所述手柄与驱动装置可拆卸连接。
9.根据权利要求7所述的基于组织研磨的活细胞提取方法，其特征在于，所述滤膜为10-100μm滤膜。
10.根据权利要求-19任一所述的基于组织研磨的活细胞提取方法，其特征在于，还包括将步骤3)得到的细胞悬液使用生物酶、生长因子、抑制剂或化学制剂进一步消化组织获取细胞的步骤。
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