CN114381523A - 一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA标准品、RNA标准品及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因重排标准品技术领域，本发明提供了一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA标准品、RNA标准品及其应用。本发明是将针对EGFR‑E1基因的1号内含子的sgRNA构建到载体pX330上，得到质粒E1‑2，将针对EGFR‑E7基因的7号内含子的sgRNA构建到载体pX330上，得到质粒E7‑3，将质粒E1‑2和质粒E7‑3共同转染宿主细胞，得重组细胞，再对重组细胞进行单克隆化，得到制备DNA标准品或RNA标准品的细胞，进而得到DNA和RNA标准品。本发明提供的EGFR vIII重排标准品序列和细胞，样品可以稳定长期提供，非常适用于LDT或IVD开发的性能评价和长期的质控需求。
Description
技术领域
本发明涉及基因重排标准品技术领域，尤其涉及一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA标准品、RNA标准品及其应用。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR/ErbB1/HER1)是酪氨酸激酶受体家族的成员，还包括ErbB2/HER2/Neu、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。所有这些受体都是跨膜糖蛋白，分子量范围从170kDa到185kDa。通常，它的激活涉及配体结合和随后的受体二聚化。EGF受体的激活可在Ras/Raf/MAPK、PI3K/AKT、JAK/STAT或PLC/PKC通路中诱导信号，对多种细胞过程产生影响，包括增殖、代谢、凋亡、细胞存活或分化。信号级联的终止发生在受体内化后，主要是网格蛋白依赖性内吞作用，导致其进入早期内体。此外，受体可能被转运回细胞膜或在晚期内体和溶酶体中降解。
编码EGFR的基因位于7号染色体(p11.2)的短臂上，由28个外显子组成。成熟的EGFR蛋白(1186个氨基酸)由前体蛋白(1210个氨基酸)在去除N末端部分后形成。从N到C末端，EGFR由参与配体结合和受体二聚化的胞外域(外显子1-16)、疏水跨膜域(外显子17)和具有酪氨酸激酶活性的胞内域组成，其两侧是接头区域和受体的C端部分(外显子18-28)。细胞内结构域的20个酪氨酸残基中有12个被证明经历了磷酸化，这些结合受体激活后募集的膜结合或细胞质效应蛋白。
胶质母细胞瘤(GBM)是成人中最常见的恶性脑肿瘤，也是所有癌症中最致命的，目前的治疗方法：手术、放疗和化疗，中位生存期仅为12-15个月。
在GBM中，EGFR扩增在大多数情况下伴有基因重排。此类改变涉及特定外显子或外显子部分的缺失，并被指定为EGFR vI(N末端部分缺失)、EGFR vII(外显子14和15缺失)、EGFR vIII(外显子2-7缺失)、EGFR vIV(外显子25-27缺失)和EGFR vV(外显子25–28缺失)。
在胶质母细胞瘤(GBM)中，最常检测到的变异之一是EGFR vIII。大约50％的GBM患者中EGFR发生了扩增，大约50-60％的扩增中同时伴随有EGFR vIII重排。EGFR vIII的出现是由于EGFR外显子2-7的缺失，产生了一个能够组成型EGFR激活的截短的细胞外结构域。截短的细胞外结构域产生了一个新的肽序列，从而产生了独特的、GBM细胞特异性、抗体反应性EGFR vIII抗原。其中，EGFR WT和EGFR vIII的结构示意图如图1所示。
在GBM的诊断中，NCCN指南提到了EGFR amplification和EGFR mutation，EGFRvIII的突变可以既称为EGFR mutation，又经常会导致EGFR的扩增，因此是一个重要的诊断指标。其中，NCCN-2021第二版中枢神经系统肿瘤分子标志物截图如图2所示。
近些年来，国内出现很多公司去开发检测EGFR vIII的试剂盒，在试剂盒的开发中，需要有标准品对整个检测体系做性能评价，按照第三类医疗器械肿瘤检测试剂盒开发的指导原则上描述，用于实验性能评价需要对应的标准品，标准品不能是质粒，最好是临床样本。但是在实际检测过程中，临床样本往往是可遇不可求的，需要正好碰到这样的病人，而且样本不可再生，量较少，不适合作为IVD试剂盒开发长期使用的标准品、质控品。
如何解决这个矛盾，有两个方法，第一种是把含有目的EGFR vIII重排的临床样本制备成永生化的细胞株，但是这个制备过程往往需要半年到一年的时间，而且成功率大约10％左右，一个病人对应一种重排的方式，不具有多样性，因此此方法是基本排除的，不是优选；第二种方法是在永生化的细胞系上通过基因重组、基因编辑的方式，把EGFR vIII重排导入到细胞系中，形成稳定的基因组结构，这样的话，就可以源源不断的稳定供应含有EGFR vIII重排的基因组(DNA和RNA)，同时也满足多样性的需求，解决性能评价整个过程中的标准品、质控品的需求。然而，目前关于用于分子诊断的EGFR vIII重排标准品的开发还少有研究。
发明内容
为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种用于分子诊断的EGFRvIII重排的DNA标准品、RNA标准品及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA标准品，所述DNA标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
本发明还提供了一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的RNA标准品，所述RNA标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示。
本发明还提供了一种制备DNA标准品或RNA标准品的细胞，所述细胞的基因组重组有DNA标准品的核苷酸序列。
优选的，所述细胞以人永生化细胞系为宿主细胞；
所述宿主细胞选自HEK293、HCT116、DLD-1、RKO和SW48中的一种。
本发明还提供了一种制备DNA标准品或RNA标准品的细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)将针对EGFR-E1基因的1号内含子的sgRNA构建到载体pX330上，得到质粒E1-2；
(2)将针对EGFR-E7基因的7号内含子的sgRNA构建到载体pX330上，得到质粒E7-3；
(3)将质粒E1-2和质粒E7-3共同转染宿主细胞，得重组细胞；
(4)对重组细胞进行单克隆化，得到制备DNA标准品或RNA标准品的细胞。
优选的，步骤(1)中所述针对EGFR-E1基因的1号内含子的sgRNA的序列如SEQ IDNO.15所示。
优选的，步骤(2)中所述针对EGFR-E7基因的7号内含子的sgRNA的序列如SEQ IDNO.26所示。
优选的，步骤(4)中所述单克隆化采用有限稀释法进行。
本发明还提供了EGFR vIII重排的DNA标准品或EGFR vIII重排的RNA标准品在制备检测EGFR vIII重排的试剂盒中的应用。
本发明还提供了EGFR vIII重排的DNA标准品或EGFR vIII重排的RNA标准品在LDT或IVD研发体系的性能评价中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供的EGFR vIII重排的DNA标准品或RNA标准品，适用于作为分子诊断的EGFR vIII重排标准品，样品可以稳定长期提供，得到的众多克隆呈现内含子断点的多样性，正确转录为RNA产物，且断点完整准确，含有人类全长的基因组，是模拟临床样本最佳的标准品，非常适合用于LDT或IVD开发的性能评价和长期的质控需求。
附图说明
图1为EGFR WT和EGFR vIII的结构示意图；
图2为NCCN-2021第二版中枢神经系统肿瘤分子标志物截图；
图3为ddPCR检测EGFR在HCT116中DNA的拷贝数；
图4为ddPCR检测EGFR在HCT116中mRNA中的拷贝数；
图5为EGFR vIII在DNA层面的重排(注：竖线左侧为EGFR的1号内含子的部分序列，竖线右侧是EGFR的7号内含子的部分序列)；
图6为ddPCR检测EGFR vIII的16号克隆的重排频率；
图7为sanger测序检测到的EGFR vIII的16号克隆的RNA序列(注：左侧箭头为EGFR的1号外显子尾部序列，右侧箭头为EGFR的8号外显子头部的序列)；
图8为ddPCR检测EGFR vIII的16号克隆在RNA层面的拷贝数。
具体实施方式
本发明提供了一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA标准品，所述DNA标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
本发明还提供了一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的RNA标准品，所述RNA标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示。
本发明还提供了一种制备DNA标准品或RNA标准品的细胞，所述细胞的基因组重组有DNA标准品的核苷酸序列。
在本发明中，所述细胞优选以人永生化细胞系为宿主细胞；
所述宿主细胞优选HEK293、HCT116、DLD-1、RKO和SW48中的一种，进一步优选为HCT116。
本发明还提供了一种制备DNA标准品或RNA标准品的细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)将针对EGFR-E1基因的1号内含子的sgRNA构建到载体pX330上，得到质粒E1-2；
(2)将针对EGFR-E7基因的7号内含子的sgRNA构建到载体pX330上，得到质粒E7-3；
(3)将质粒E1-2和质粒E7-3共同转染宿主细胞，得重组细胞；
(4)对重组细胞进行单克隆化，得到制备DNA标准品或RNA标准品的细胞。
在本发明中，步骤(1)中所述针对EGFR-E1基因的1号内含子的sgRNA的序列优选如SEQ ID NO.15所示。
在本发明中，步骤(2)中所述针对EGFR-E7基因的7号内含子的sgRNA的序列优选如SEQ ID NO.26所示。
在本发明中，步骤(4)中所述单克隆化优选采用有限稀释法进行，所述有限稀释法具体操作优选为：收集1x10e6的细胞，配置成如下密度：10cells/ml，20cells/ml，50cells/ml，将上述密度的细胞分别铺到96孔板，100μl/孔，即10cells/ml的细胞1cells/孔，20cells/ml的细胞2cells/孔，50cells/ml的细胞5cells/孔，所述1cells/孔铺96孔板的A行、B行和C行，2cells/孔铺96孔板的D行、E行、F行，5cells/孔铺96孔板的G行、H行，按照上述方式合计铺板10块96孔板，继续细胞培养；
第2天，待细胞贴壁后，在显微镜下观察每个孔，单孔中存在一个细胞的，做下记号，没有细胞或者大于1个细胞的孔，全部放弃；
在之后的5～10天内，每天在显微镜下观察96孔中标记的孔，待形成克隆岛后，胰酶消化，铺板到24孔板中；
待24孔板长到70％汇合度后，胰酶消化，铺板到6孔板中；
待6孔板中细胞长到70％汇合度以上时，胰酶消化，收集即为单克隆化的细胞。
本发明还提供了EGFR vIII重排的DNA标准品或EGFR vIII重排的RNA标准品在制备检测EGFR vIII重排的试剂盒中的应用，所述应用具体是指将所述EGFR vIII重排的DNA标准品或RNA标准品作为检测EGFR vIII重排的标准品或对照品替代临床样本。
本发明还提供了EGFR vIII重排的DNA标准品或EGFR vIII重排的RNA标准品在LDT或IVD研发体系的性能评价中的应用。
下面结合实验例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验例1
选择质粒转染效率较高的母细胞作为备选感染的宿主细胞，如表1所示：
表1不同宿主细胞系的来源及培养基
| 细胞系 | 来源 | 培养基 |
| HEK293 | ATCC；CRL-1573 | DMEM+10％FBS |
| HCT116 | ATCC；CCL-247 | McCoy's5a+10％FBS |
| DLD-1 | ATCC；CRL-2577 | RPMI-1640+10％FBS |
| RKO | ATCC；CCL-221 | MEM+10％FBS |
| SW48 | ATCC；CCL-231 | DMEM+10％FBS |
按照ATCC公布的说明，培养5株细胞，调整到指数增长期，按照1x10e6cell/well的密度，将细胞铺板到6孔板中，过夜培养；
第二天显微镜下观察细胞，细胞汇合度达到75％时，将带有GFP的质粒PX458转染5种宿主细胞，1.5μg/孔，转染方法按照lipo3000的说明书，继续培养细胞，48小时用荧光显微镜观察细胞GFP的表达，72小时再次观察，根据两次观察的结果，选出感染效率最好的细胞。结果显示，HEK293中GFP表达阳性比例为70％，HCT116中GFP表达阳性比例为90％，DLD-1中GFP表达阳性比例为50％，RKO中GFP表达阳性比例为80％，SW48中GFP表达阳性比例为70％。因此，选择HCT116为宿主细胞，用于之后的实验。
继续培养HCT116细胞，收集1x10e6细胞，配置如下的密度：10cells/ml，20cells/ml，50cells/ml，将对应的细胞铺入到96孔板，100μl/孔，相当于1cells/孔，2cells/孔，5cells/孔，其中1cells/孔铺96孔板的A行、B行和C行，2cells/孔铺96孔板的D行、E行、F行，2cells/孔铺96孔板的D行、E行、F行，5cells/孔铺96孔板的G行、H行。相同的方案，合计铺板10块96孔板，继续细胞培养。
第二天，待细胞贴壁后，在显微镜下观察每个孔，单孔中存在一个细胞的，做下记号，没有细胞或者大于1个细胞的孔，全部放弃。在此后的5-10天内，每天在显微镜下观察96孔中标记的孔，待形成克隆岛后，胰酶消化，铺板到24孔板中，待24孔板长到70％汇合度后，胰酶消化，铺板到6孔板中。
待6孔板中细胞长到70％汇合度以上时，胰酶消化，收集细胞，使用Zymo的Quick-DNA Miniprep提取gDNA，使用qubit4.0检测浓度，Nano检测OD260/280(介于1.8-2.0)，凝胶电泳观察gDNA的完整度，确保gDNA的质量。
设计检测EGFR的Copy number的ddPCR体系，用于检测每个克隆中EGFR的本底的拷贝数；设计检测EGFR expression的ddPCR体系，用于检测每个克隆中EGFR是否正常被转录。设计如下：
EGFR的拷贝数设计如下：
选择目的序列如SEQ ID NO.1所示；
用Primer3设计引物、探针，序列分别为：
EFGR-CN-F如SEQ ID NO.2所示，EFGR-CN-R如SEQ ID NO.3所示，EFGR-CN-P如SEQID NO.4所示。
内参基因EIF2C1的拷贝数设计如下：
选择目的序列如SEQ ID NO.5所示；
用Primer3设计引物、探针，序列分别为：
EIF2C1-CNV-F如SEQ ID NO.6所示，EIF2C1-CNV-R如SEQ ID NO.7所示，EIF2C1-CNV-P如SEQ ID NO.8所示。
EGFR的Expression设计如下：
选择目的序列如SEQ ID NO.9所示；
用Primer3设计引物、探针，序列分别为：
EGFR-mRNA-F如SEQ ID NO.10所示，EGFR-mRNA-R如SEQ ID NO.11所示，EGFR-mRNA-P如SEQ ID NO.12所示。
使用ddPCR检测，得到33号单克隆数据，如图3、图4所示。拷贝数为2(检测值为1.93)，mRNA的拷贝数为1.93copies/ng，正常转录，表明27号单克隆在ROS1的基因组上结构完整，结构正常，适合下一步的基因编辑。
EGFR vIII的重排，是EGFR的2号外显子和7号外显子缺失，因此在DNA的重排上，断点为EGFR的第1号内含子和第7号内含子。其中，EGFR的第1号内含子序列的NCBI的登录号为NC_000007.14，EGFR的第7号内含子序列如SEQ ID NO.13所示。
使用zhanglab在线的crisprcas9的设计软件，设计sgRNA，设计结果如表2、表3所示。
表2针对EGFR的1号内含子的sgRNA设计结果
表3针对EGFR的7号内含子的sgRNA设计结果
将EGFR-E1的10条sgRNA构建到载体pX330上，同时也将EGFR-E7的10条sgRNA构建到载体pX330上，合计20个质粒，抽提100μg，在24孔板中转染27号克隆的HCT116细胞，待细胞长到75％汇合度后，消化铺板到6孔板中，待6孔板中细胞长到75％汇合度后，胰酶消化，收集细胞，使用Zymo的Quick-DNA Miniprep提取gDNA，使用qubit 4.0检测浓度，Nano检测OD260/280(介于1.8-2.0)，凝胶电泳观察gDNA的完整度(大于15000bp的单一条带)，确保gDNA的质量。
合计20个gDNA送测第三方做sanger测序(根据每个断点两边的序列设计引物，测序发现任何与野生型不一致的，都可以认为发生了有效切割)，根据测序结果，发现E1-2，E1-7，E1-9是EGFR的1号内含子切割效率最高的前3条，E7-2，E7-3，E7-6是EGFR的7号内含子切割效率最高的前3条，用于下游进一步的实验中。
将E1-2，E1-7，E1-9，E7-2，E7-3，E7-6对应的pX330质粒，按照两两组合的方式(合计3×3＝9种组合)，在24孔板中共转33号克隆的HCT116细胞，待细胞长到75％汇合度后，消化铺板到6孔板中，待6孔板中细胞长到75％汇合度后，胰酶消化，收集细胞，使用Zymo的Quick-DNA Miniprep提取gDNA，使用qubit 4.0检测浓度，Nano检测OD260/280(介于1.8-2.0)，凝胶电泳观察gDNA的完整度(大于15000bp的单一条带)，确保gDNA的质量。
合计9个gDNA送测第三方做sanger测序(根据EGFR的1号和7号内含子的两个断点，F向引物设计在EGFR的1号内含子断点左侧，R向引物设计在EGFR的7号内含子断点右侧，只要有PCR产物的，都用于测序)，根据PCR产物电泳结果和测序结果，发现E1-2_E7-3出现明显的PCR产物，说明发生了EGFR vIII的重排。
对HCT116-E1-2_E7-3的细胞，做单克隆化，具体操作为：收集1x10e6的细胞，配置如下的密度：10cells/ml，20cells/ml，50cells/ml，将对应的细胞铺入到96孔板，100μl/孔，相当于1cells/孔，2cells/孔，5cells/孔，其中1cells/孔铺96孔板的A行、B行和C行，2cells/孔铺96孔板的D行、E行、F行，2cells/孔铺96孔板的D行、E行、F行，5cells/孔铺96孔板的G行、H行。相同的方案，合计铺板10块96孔板，继续细胞培养。
第二天，待细胞贴壁后，在显微镜下观察每个孔，单孔中存在一个细胞的，做下记号，没有细胞或者大于1个细胞的孔，全部放弃。在此后的5-10天内，每天在显微镜下观察96孔中标记的孔，待形成克隆岛后，胰酶消化，铺板到24孔板中，待24孔板长到70％汇合度后，胰酶消化，铺板到6孔板中。
待6孔板中细胞长到70％汇合度以上时，胰酶消化，收集细胞，使用Zymo的Quick-DNA Miniprep提取gDNA，使用qubit4.0检测浓度，Nano检测OD260/280(介于1.8-2.0)，凝胶电泳观察gDNA的完整度(大于15000bp的单一条带)，确保gDNA的质量。
所有的HCT116-E1-2_E7-3单克隆送测第三方做sanger测序(根据EGFR的1号和7号内含子的两个断点，F向引物设计在EGFR的1号内含子断点左侧，R向引物设计在EGFR的7号内含子断点右侧，只要有PCR产物的，都用于测序)，根据PCR产物电泳结果和测序结果，发现E1-2_E7-3出现阳性的重排，克隆号16。具体如图5所示。由图5可知，竖线左侧为EGFR的1号内含子的部分序列，竖线右侧是EGFR的7号内含子的部分序列，表明成功得到EGFR vIII的在DNA层面的重排。
实验例2
ddPCR检测EGFR vIII的重排标准品细胞在DNA层面的拷贝数：
选择EGFR vIII重排的16号克隆，设计ddPCR检测目的重排的频率，FAM阳性目的序列如SEQ ID NO.34所示。
针对FAM阳性目的序列设计ddPCR：
EGFR vIII-DNA-Fu-F如SEQ ID NO.35所示；
EGFR vIII-DNA-Fu-R如SEQ ID NO.36所示；
EGFR vIII-DNA-Fu-P如SEQ ID NO.37所示。
VIC野生型对应的序列如SEQ ID NO.38所示。
针对VIC野生型对应的序列设计ddPCR：
EGFR vIII-DNA-WT-F如SEQ ID NO.39所示；
EGFR vIII-DNA-WT-R如SEQ ID NO.40所示；
EGFR vIII-DNA-WT-P如SEQ ID NO.41所示。
ddPCR检测得知16号克隆EGFR vIII的重排频率为100％，即HCT116的EGFR有2个拷贝，都发生了重排。如图6所示。ddPCR检测EGFR vIII的16号克隆的重排频率，FAM探针检测EGFR vIII重排的拷贝数，VIC探针检测EGFR WT的拷贝数，由图6可知，EGFR vIII的重排频率为100％。
实验例3
ddPCR检测EGFR vIII的重排标准品细胞在RNA层面的拷贝数：
使用Biomiga的Tissue RNA Miniprep Kit试剂盒提取EGFR vIII的16号克隆的RNA，送测第三方sanger测序，检测数据显示样本正确提取的mRNA，经过反转录后，测序数据正确，为EGFR vIII重排。结果如图7所示。
针对EGFR vIII的RNA拼接序列，开发ddPCR，检测对应RNA的拷贝数，对应的拼接序列如SEQ ID NO.42所示。
针对目的序列设计ddPCR：
EGFR vIII-RNA-F如SEQ ID NO.43所示；
EGFR vIII-RNA-R如SEQ ID NO.44所示；
EGFR vIII-RNA-P如SEQ ID NO.45所示。
使用ddPCR检测EGFR vIII重排16号克隆的RNA层面拷贝数，检测结果为730copies/ng，如图8所示。
综上可知，本发明通过在HCT116细胞上做基因编辑，得到16号克隆，该克隆在DNA层面出现100％的EGFR vIII的重排(经过sanger测序和ddPCR验证)，断点在内含子；在RNA层面出现EGFR vIII的重排(经过sanger测序和ddPCR检测)，断点在外显子。
本发明提供的EGFR vIII重排的DNA标准品或RNA标准品，适用于作为分子诊断的EGFR vIII重排标准品，样品可以稳定长期提供，得到的众多克隆呈现内含子断点的多样性，正确转录为RNA产物，且断点完整准确，含有人类全长的基因组，是模拟临床样本最佳的标准品，非常适合用于LDT或IVD开发的性能评价和长期的质控需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 仁宽（上海）生物科技有限公司
<120> 一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA标准品、RNA标准品及其应用
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcagatgtgg tctttggaaa cagaggtcga aggaaagtaa ggagctgaga gctcacattc 60
ataggtgccg ccagccttcg tgcatcttct tgcatcatct ctaaggagct cctctaatta 120
cac 123
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acagaggtcg aaggaaagta agga 24
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggctggcg gcaccta 17
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgagagctc acattc 16
<210> 5
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggcgcgagg tctggttcgg ctttcaccag tctgtgcgcc ctgccatgtg gaagatgatg 60
ctcaacattg atggtgagtg gggagagcta tggagccagg ggcaccccaa gtccagtgac 120
cac 123
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgcgccctg ccatgt 16
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catagctctc cccactcacc at 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagatgatgc tcaacatt 18
<210> 9
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggaggaaaa gaaagtttgc caaggcacga gtaacaagct cacgcagttg ggcacttttg 60
aagatcattt tctcagcctc cagaggatgt tcaataactg tgaggtggtc cttgggaatt 120
tg 122
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccaaggcacg agtaacaagc t 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggaggctgag aaaatgatct tca 23
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgcagttgg gcact 15
<210> 13
<211> 1677
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtgagtcctc ctctgtgggc cctctaactg gtcaggcatc cttgtcccgc tctgtctcct 60
gctgagccct ggagtatccc atcttggaga gtctttgggt ggatgtgttt gccttgcttg 120
gaggaggcga ccctgtgccc gtccaggcac acaggcgagg ggaggggctg gcttgctacc 180
gaggagcggg caggtggtgg ccatctccac ccatgggggc tgctcagtgc acagggcaga 240
tctgggtggc caggccacct cacaggagaa acacctgctg ctcagccctc accactcatc 300
cagcagccac agccgtgggt attcagttgt ctgctgggca caaagccgtg ggcatgccac 360
tgtttagtgc ttgtgccaag caggtattta atacaccgaa atcagagagt ctatcagaag 420
acctgccttc ttgagtggtt aaaattctag tgaaagttat gcctcttagg agtattgcag 480
aggttttgtt tttgttttta ttttgttttg ttttaatggt ttgggtttga gttttgcttg 540
tttgtactta catttgtact ggtggctcca gggtttaggg aaattgtgac ataaaataat 600
tcctgacaga gaaagcaaaa ctttgtctaa tgaaagagtt ttagaagcca ctcttgatct 660
ctagaagggg agattaactg agaaaaaaaa ttgaaagaac aattatgagg gggagatttt 720
accctgccag atttgtgtac atgaaaaatt ttacattccg tatggaaaaa aaaaacacaa 780
aataataagc cattataagg taaatgacaa acaaagctaa agaaaaatgt gccacagtga 840
tgacacagat atatctttga gatagggctt aacagagctt taaaatccat aggaaaacac 900
ttcgagcctg agataccaag agcagatggt tcacagaaga atcatcaatg tcctataaat 960
atttttgagg atcttcttgg ggaacttaaa acaggaacag gccaggcaca gtggctcatt 1020
ggctcatgcc tttaatccca gcactttggg agactgaagg ggctggattg tctgaggtca 1080
ggagtttggg accagcctgg ccaacagggt gaaacctcgt ctctactaaa aatacaaaaa 1140
ttagccgggc gtggtggcgc acgcctgtaa tcacagccgc tcaggaggct gaggcaggag 1200
aattgcttta acccaggagg cggaggttgc agtgagctga gatcacacca ctgcactcca 1260
gcctgggtga cagagcaaga ctccatctca gacaaacaaa aaaggaagac atagagctcc 1320
taaaaataac gcagaagtct gctattaata caaatgaatt actttaaagg tgagagcagg 1380
tggaggagag ggctgaggtg cctgctggga cgcaaaacag ctggcccctc aagggaccca 1440
gtgtttcctg ccatgatgaa acacctgtat tgtccacatt gcggcctaga atgttattaa 1500
actcttgaac gggattcctt ctctatttgc aacctttcat tctttgtcct taaagtaaat 1560
aaagccaaag gaggatggag cctttccatc acccctcaag aggacctgga ccgcctgtgt 1620
gaggcccgag cacctggtgc caccgtcatc accttccttt catgctctct tccccag 1677
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcctaccct acaaaaccag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggctgacat cccctaacgt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcttgctcaa gaggacagtg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
catagattga cacagcatga 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttttgtagg gtaggccctg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tccctgcccc catacaccag 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aagagagcat gcatgtgagg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gatatcacta tacttcacat 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgcatctgga cccacgttag 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
accaatgcaa cagtgttgag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttggcacaag cactaaacag 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atatatctgt gtcatcactg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
taacattcta ggccgcaatg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
accagttaga gggcccacag 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgaaaggaag gtgatgacgg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agcagacaac tgaataccca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gagaattgct ttaacccagg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cagcaggtgt ttctcctgtg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cacctgtatt gtccacattg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caggaacagg ccaggcacag 20
<210> 34
<211> 817
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttagtgcttt gaagtcctaa gtcatagggc ctgctgctct tgatgcagta gaatttgtct 60
tcagatttgc aaagggtaag gcaaaccact agcattttgt atggaacttg atgcaaatac 120
ttttaattgt ctggttttca aatgtataga cttaaagtaa tatcaactct ttctttgaat 180
caactactga aatacctagt cttaaataaa tatttttatg taatccttaa agtactatgt 240
attcattttt ctttcttctt tcttttctgg tttgataaat attctataaa gtaactgtgt 300
ttaatggcca acatttgagt aagtccatat gcagatccaa acatctcagt ttagacaata 360
acttaagaca atatagagtg gctgacatcc cctaatgcgg cctagaatgt tattaaactc 420
ttgaacggga ttccttctct atttgcaacc tttcattctt tgtccttaaa gtaaataaag 480
ccaaaggagg atggagcctt tccatcaccc ctcaagagga cctggaccgc ctgtgtgagg 540
cccgagcacc tggtgccacc gtcatcacct tcctttcatg ctctcttccc caggtaatta 600
tgtggtgaca gatcacggct cgtgcgtccg agcctgtggg gccgacagct atgagatgga 660
ggaagacggc gtccgcaagt gtaagaagtg cgaagggcct tgccgcaaag gtaggaagcc 720
cgccggtgtg cggacgaggc ttgttctcgg ctgctgaggc tgggctctca tgccacctcc 780
aaaggaacac atcttcctct tctcattaaa aaacaac 817
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atatgcagat ccaaacatct cagttt 26
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agtttaataa cattctaggc cgcatt 26
<210> 37
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tggctgacat ccc 13
<210> 38
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gacacatgca gtcactcaag actggacaca gcaaggaagt agtgggtcca tgccaaaggc 60
tcagccagac gagacactct agctgtggca ggagatgcca gggaatgctc caagcctaag 120
cagattgtaa acaaggaacc tcaaattcat gaaaaattct tgcttatgtg gcccatgtca 180
gtaattactc tctgcctcag tttccgcagc tgacatgtaa ataaaagcag ttcatggttc 240
atcttctttt cttatcgggg tctcaagtga ttctacaaac cagccagcca aacaatcaga 300
gaataagttg aaaagattgt cttcatttat tgaatgtgct taactcaggc ccgggaaagg 360
gcgtcatcag tttctcatca tttcactgag atatgcatct attactttta catttcaggc 420
caaaagtgtg atccaagctg tcccaatggg agctgctggg gtgcaggaga ggagaactgc 480
cag 483
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aagtagtggg tccatgccaa a 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gcatctcctg ccacagctag a 21
<210> 41
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ctcagccaga cgagac 16
<210> 42
<211> 263
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gacccgccag agacgggaga gccggagcga gcccggggag cagcgagcga cccccgggac 60
ggccggggca gcgcccggcg cgcggcgcgc cgcccggcga gcgggccgga ggaaaagaaa 120
ggaaagggga cagacacggc cggcgccgag ccgggggccg acagcagaga ggaggaagac 180
ggcgccgcaa ggaagaaggc gaagggccgc cgcaaaggga acggaaagga gggaaaaaga 240
ccaccccaaa agcacgaaaa aac 263
<210> 43
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gcggcgcgcc gc 12
<210> 44
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gcaccacaaa acccc 15
<210> 45
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
agcgggccgg a 11
Claims (10)
1.一种用于分子诊断的EGFRvIII重排的DNA标准品，其特征在于，所述DNA标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
2.一种用于分子诊断的EGFRvIII重排的RNA标准品，其特征在于，所述RNA标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示。
3.一种制备权利要求1所述DNA标准品或权利要求2所述RNA标准品的细胞，其特征在于，所述细胞的基因组重组有权利要求1所述的DNA标准品的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述细胞以人永生化细胞系为宿主细胞；
所述宿主细胞选自HEK293、HCT116、DLD-1、RKO和SW48中的一种。
5.权利要求3或4所述的制备DNA标准品或RNA标准品的细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将针对EGFR-E1基因的1号内含子的sgRNA构建到载体pX330上，得到质粒E1-2；
(2)将针对EGFR-E7基因的7号内含子的sgRNA构建到载体pX330上，得到质粒E7-3；
(3)将质粒E1-2和质粒E7-3共同转染宿主细胞，得重组细胞；
(4)对重组细胞进行单克隆化，得到制备DNA标准品或RNA标准品的细胞。
6.根据权利要求5所述的制备DNA标准品或RNA标准品的细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述针对EGFR-E1基因的1号内含子的sgRNA的序列如SEQ ID NO.15所示。
7.根据权利要求6所述的制备DNA标准品或RNA标准品的细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述针对EGFR-E7基因的7号内含子的sgRNA的序列如SEQ ID NO.26所示。
8.根据权利要求7所述的制备DNA标准品或RNA标准品的细胞的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述单克隆化采用有限稀释法进行。
9.权利要求1所述的EGFRvIII重排的DNA标准品或权利要求2所述的EGFRvIII重排的RNA标准品在制备检测EGFRvIII重排的试剂盒中的应用。
10.权利要求1所述的EGFRvIII重排的DNA标准品或权利要求2所述的EGFRvIII重排的RNA标准品在LDT或IVD研发体系的性能评价中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210026401.9A CN114381523A (zh) | 2022-01-11 | 2022-01-11 | 一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA标准品、RNA标准品及其应用 |
Publications (1)
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ID=81202496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN202210026401.9A Pending CN114381523A (zh) | 2022-01-11 | 2022-01-11 | 一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA标准品、RNA标准品及其应用 |
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|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101130818A (zh) * | 2007-07-03 | 2008-02-27 | 浙江大学 | 实时荧光定量pcr检测表皮生长因子受体ⅲ型突变体的试剂盒 |
| CN109837275A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-06-04 | 大连医科大学附属第二医院 | 一种融合基因阳性对照标准品的制备方法 |
| CN113897438A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-01-07 | 南京科佰生物科技有限公司 | 一种用于分子诊断的cd74-ros1重排的dna标准品、rna标准品及其应用 |
-
2022
- 2022-01-11 CN CN202210026401.9A patent/CN114381523A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HYUN-MUN KIM等: "The epidermal growth factor receptor variant type III mutation frequently found in gliomas induces astrogenesis in human cerebral organoids", 《CELL PROLIFERATION》 * |
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