CN107532209A - 检测基因融合的多重pcr - Google Patents
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Abstract
本文提供的是用于检测例如与癌症相关的基因融合的方法和组合物。本发明方法和组合物可以用于以非常高的灵敏度和特异性检测基因融合。本文方法和组合物可以检测例如来自血浆样品的游离循环肿瘤RNA中的基因融合。
Description
发明背景
许多癌症与基因融合相关。可能最早报道的例子是在60年代,BCR-ABL与慢性骨髓性白血病(CML)的关联(Nowell和Hungerford(1960),J. Natl. Cancer Inst. 25:85)。从那以后,已经报道了许多不同组织中的癌症的数百个基因融合(Presner和Chinnaiyan(2009),Curr. Opin Genet. Dev. 19:82)。
另一个例子是酪氨酸受体激酶ALK.EML4-ALK(棘皮动物微管相关蛋白样4型间变性淋巴瘤激酶)融合与非小细胞肺癌(NSCLC)相关。在这种情况下,ALK的细胞外部分N末端替换为EML4(KIF5B、HIP1、KLC1、TFG也可以以类似的方式与ALK融合)。所得到的融合基因的表达由强EML4启动子驱动,导致ALK的细胞内酪氨酸激酶结构域的更高表达。另外,EML4形成卷曲螺旋,其导致配体非依赖性二聚化和ALK酪氨酸激酶结构域的组成性激活。
基因融合的检测对于指导治疗是重要的。大多数目前的检测方法需要肿瘤组织的活组织检查,这对尤其是后期的许多癌症患者是不可行的。活组织检查组织切片中的检测通常通过荧光原位杂交(FISH)或免疫组织化学(IHC)来进行。这些测试具有高假阳性率和背景,部分是因为在切片过程中的剪切。因此,要求熟练的细胞学家观察多个组织切片,这需要来自虚弱患者的相当大的活组织检查。融合的检测已使用RT-PCR进行尝试,但由于基因融合的高度可变性,这并未成功。在EML4-ALK4的情况下,至少20种不同的融合导致活化的酪氨酸激酶。关于RT-PCR的另一个可能是来自肿瘤组织的遗传材料的数量和质量,所述肿瘤组织例如是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)形式的。参见例如Liu等人(2015),PLoSOne 10: e0117032。
因为检测是时间和资源密集的,所以测试率相对较低。与ALK融合相关的癌症对ALK抑制剂例如克唑替尼和色瑞替尼非常敏感。在转录过程中重排(RET)的基因融合例如KIF5B或CCDC6对于例如用范德他尼的治疗也很敏感(参见Matsubara等人,(2007),J. Thorac. Oncol. 7:1872)。基因融合测试的低速率因此代表了治疗机会的大量损失。
发明概述
本文提供的是用于检测遗传融合例如融合基因的方法和组合物。
提供的是包含下述的组合物:(1)对于第一遗传区域和第二遗传区域之间的融合位点特异性的至少一个第一引物对,其中所述第一遗传区域和第二遗传区域在野生型基因组中不相邻,并且其中所述至少一个引物对包含在融合位点的5'侧上开始的至少一个正向引物和在融合位点的3'侧上开始的至少一个反向引物;(2)对于其为融合位点5'的第一遗传区域的一部分特异性的第二引物对;和(3)对于其为融合位点3'的第一遗传区域的一部分特异性的第三引物对。可选地,第二引物对和第三引物对可以是对于第二遗传区域特异性的。
在一些实施方案中,第一遗传区域在基因(例如基因1)中。在一些实施方案中,第二遗传区域位于基因(例如基因2)中。在一些实施方案中,第一遗传区域和第二遗传区域在基因中,其中基因之间的融合点在野生型基因组中未发现。在一些实施方案中,至少一个第一引物对(1)包含在基因2中融合位点的5'开始的至少一个正向引物,并且任选地包括融合位点。在一些实施方案中,至少一个第一引物对(1)包含在基因1中融合位点的3'开始的至少一个反向引物,并且任选地包括融合位点。在一些实施方案中,至少一个第一引物对包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个引物对。
在一些实施方案中,组合物进一步包含对于对照序列(例如内部对照)特异性的至少一个引物对。可以用于本文公开测定的对照的例子包括但不限于SDH(琥珀酸脱氢酶)、LDHA(乳酸脱氢酶A)、NONO、PGK(磷酸甘油酸激酶1)、PPIH、HPRT1、β-肌动蛋白、GADPH、ACTB和16S rRNA。
在一些实施方案中,每个引物组((1)、(2)、(3)和任选的至少一个对照引物对)与不同的标记(例如染料)结合,所述不同的标记发射不同于其他标记的信号。标记可以直接或间接地附着到每个引物对的正向引物或反向引物。在一些实施方案中,保留标记,使得每个引物组((1)、(2)、(3)和任选的至少一个对照引物对)产生的扩增产物是经标记的。在一些实施方案中,组合物包含对于每个引物组((1)、(2)、(3)和任选的至少一个对照引物对)产生的扩增产物各自具有特异性的至少一种标记的探针。
在一些实施方案中,组合物进一步包含DNA聚合酶,例如热稳定DNA聚合酶,例如Taq或Taq衍生物。在一些实施方案中,组合物进一步包含逆转录酶。在一些实施方案中,组合物进一步包含dNTP。在一些实施方案中,组合物进一步包含顺应通过DNA聚合酶和逆转录酶进行聚合作用的缓冲液。
在一些实施方案中,组合物进一步包含来自个体或个体组的生物样品。在一些实施方案中,个体已被诊断患有癌症,例如肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)、肺鳞状细胞癌、肺腺癌)、膀胱癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肾癌或乳腺癌。
在一些实施方案中,样品是分离的核酸,例如DNA或RNA。在一些实施方案中,样品是例如从血液(血清或血浆)、支气管肺泡灌洗或组织活组织检查中分离的RNA。在一些实施方案中,样品包括100 nM或更少的包含融合基因的多核苷酸,例如0.01-100 nM、0.01-25nM、0.01-5 nM、0.02-0.5 nM或0.02-0.1 nM。
在一些实施方案中,第一遗传区域(基因1)选自ALK、RET、ROS、NTRK、BRAF、ABL和FGFR。在一些实施方案中,第一遗传区域是ALK,并且第二遗传区域(基因2)选自EML4、KIF5B、HIP1、KLC1和TFG。在一些实施方案中,第一遗传区域是RET,并且第二遗传区域(基因2)选自KIF5B、CCDC6、NCOA4和TRIM33。
在一些实施方案中,基因1是ALK,并且基因2是EML4。在一些实施方案中,至少一个第一引物对包含含有选自SEQ ID NO:1-51的序列的至少一个正向引物,以及含有选自SEQID NO:52-62的序列的至少一个反向引物。在一些实施方案中,第二引物对包含含有选自SEQ ID NO:63-67的序列的正向引物,以及含有选自SEQ ID NO:68-72的序列的反向引物。在一些实施方案中,第三引物对包含含有选自SEQ ID NO:73-77的序列的正向引物,以及含有选自SEQ ID NO:78-82的序列的反向引物。
在一些实施方案中,基因1是RET,并且基因2是CCDC6。在一些实施方案中,第一引物对包含含有选自SEQ ID NO:83-160的序列的至少一个正向引物,以及含有选自SEQ IDNO:161-198的序列的至少一个反向引物。在一些实施方案中,第二引物对包含含有SEQ IDNO:199的序列的正向引物,以及含有SEQ ID NO:200的序列的反向引物。在一些实施方案中,第三引物对包含含有SEQ ID NO:201的序列的正向引物,以及含有SEQ ID NO:202的序列的反向引物。
进一步提供的是用于检测生物样品中的遗传融合的方法,即测定生物样品是否包括具有遗传融合或融合基因的多核苷酸(无论它是在DNA还是表达的RNA中)。在一些实施方案中,该方法包括( 1)用生物样品和本文及上文所述的组合物进行扩增反应;(2)测定来自至少一个第一引物对的扩增产物的量(例如通过检测与至少一个第一引物对相关的标记的信号);(3)检测是否存在来自第二引物对的扩增产物的量和来自第三引物对的扩增产物的量的差异(例如通过检测和比较与第二引物对和第三引物对相关的标记的信号);并且(4)如果(i)来自步骤(2)中测定的至少一个第一引物对的扩增产物的量大于来自至少一个第一引物对和不携带融合基因的对照多核苷酸的扩增产物的量;或(ii)在步骤(3)中检测到差异的存在,则检测到遗传融合。
在一些实施方案中,该方法用生物样品和组合物进行,所述组合物包含(a)对于第一遗传区域(例如基因1)和第二遗传区域(例如基因2)之间的融合位点特异性的至少一个第一引物对(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个引物对),其中所述第一遗传区域和第二遗传区域在野生型基因组中不相邻,并且其中所述至少一个引物对包含在融合位点的5'侧上开始的至少一个正向引物和在融合位点的3'侧上开始的至少一个反向引物;(b)对于其为融合位点5'的第一遗传区域的一部分特异性的第二引物对;和(c)对于其为融合位点3'的第一遗传区域的一部分特异性的第三引物对。
在该方法的一些实施方案中,至少一个第一引物对(1)包含在基因2中融合位点的5'开始的至少一个正向引物,并且任选地包括融合位点。在该方法的一些实施方案中,至少一个第一引物对(1)包含在基因1中融合位点的3'开始的至少一个反向引物,并且任选地包括融合位点。
在该方法的一些实施方案中,组合物进一步包含对于对照序列(例如内部对照)特异性的至少一个引物对。可以用于本文公开测定的对照的例子包括但不限于SDH(琥珀酸脱氢酶)、LDHA(乳酸脱氢酶A)、NONO、PGK(磷酸甘油酸酯激酶1)、PPIH、HPRT1、β-肌动蛋白、GADPH、ACTB和16S rRNA。如上文说明的,每个引物组可以与不同的标记(例如染料)结合,所述不同的标记发射不同于其他标记的信号。
在该方法的一些实施方案中,组合物进一步包含DNA聚合酶,且任选为逆转录酶。在该方法的一些实施方案中,组合物进一步包含顺应通过DNA聚合酶和逆转录酶进行聚合作用的dNTP和/或缓冲液。
在该方法的一些实施方案中,样品是分离的核酸,例如DNA或RNA。在一些实施方案中,样品是例如从血液(血清或血浆)、支气管肺泡灌洗或组织活组织检查中分离的RNA。在一些实施方案中,该方法用生物样品进行,所述生物样品具有100 nM或更少的包含融合基因的多核苷酸,例如0.01-100 nM、0.01-25 nM、0.01-5 nM、0.02-0.5 nM或0.02-0.1 nM。
在一些实施方案中,该方法对来自个体例如被诊断患有癌症的个体的生物样品进行,所述癌症例如肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)、肺鳞状细胞癌、肺腺癌)、膀胱癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、肾癌或乳腺癌。
在该方法的一些实施方案中,第一遗传区域(基因1)选自ALK、RET、ROS、NTRK、BRAF、ABL和FGFR。在一些实施方案中,第一遗传区域是ALK,并且第二遗传区域(基因2)选自EML4、KIF5B、HIP1、KLC1和TFG。在该方法的一些实施方案中,第一遗传区域是RET,并且第二遗传区域(基因2)选自KIF5B、CCDC6、NCOA4和TRIM33。
在一些实施方案中,如果发现遗传融合,则该方法进一步包括推荐治疗过程。在一些实施方案中,治疗过程包括放射疗法或化学疗法(例如顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛。在一些实施方案中,治疗过程包括特异性靶向涉及遗传融合的基因的药物的施用。例如,当涉及基因融合的基因之一是激酶时,可以推荐或施用激酶抑制剂或受体酪氨酸激酶抑制剂,由于基因融合,所述激酶具有比没有融合的情况下更高的表达或活性水平。可以推荐或施用的药物的例子包括伊马替尼、吉非替尼、托西尼布、厄洛替尼、tykerb、舒尼替尼、尼罗替尼、索拉非尼、博舒替尼、来那替尼、瓦他拉尼、阿法替尼、克唑替尼、色瑞替尼、GSK1838705A、TAE-684、CEP-14083、AP26113和NMS-E628。参见例如Grande等人(2011),Mol. Cancer Ther. 10:569,以及Rajan&Schrump(2015年4月6日),Sem. Thoracic Cardiovascular Surgery。在一些实施方案中,检测到涉及ALK的基因融合,并且治疗过程包括推荐或施用选自下述的药物:克唑替尼、色瑞替尼、GSK1838705A、TAE-684、CEP-14083、AP26113和NMS-E628。在一些实施方案中,检测到涉及RET的基因融合,并且治疗过程包括推荐或施用选自下述的药物:索拉非尼、凡德他尼、莫替沙尼、舒尼替尼和XL-184(参见例如,Mologni(2011),Curr. Med. Chem. 18:162)。
进一步提供的是用于检测遗传融合的试剂盒,如本文更详细描述的。
附图简述
图1显示了来自qRT-PCR(定量逆转录酶PCR)的结果,所述qRT-PCR使用来自野生型细胞的RNA(对照),以及以所示比率用来自具有EML4-ALK融合的细胞的RNA掺入的野生型RNA。在图表上从左到右的列中的样品与图表下方从顶部到底部列出的相同次序。顶图显示了关于每个引物组的Ct。引物组在左下角上的三角形中描述,连同相应的染料(FAM、HEX、JA270和Cy5.5)。底图显示了基于琥珀酸脱氢酶内部对照(SDH-IC)的相对Ct值(CtR)。注意到在右侧上在融合位点扩增的5'和融合位点扩增的3'之间的差异。星形指示所检测到的具有EML4-ALK融合的样品。每个Ct值中的降低与2倍的模板量增加相关联。
图2显示了来自检测CCDC6-RET的qRT-PCR的结果。顶图显示了关于野生型RNA(CRL5908)、或掺入有来自携带CCDC6-RET(LC2AD)的细胞的指示的RNA量的野生型的Ct值。底图显示了CtR值,以及在右侧上在融合位点扩增的5'和融合位点扩增的3'之间的差异。再次,在图表上从左到右的列中的样品与图表内从顶部到底部列出的相同次序。
图3显示了关于所示引物组的Ct值(与图2中相同)。在图表上从左到右的列中的样品与图表内从顶部到底部列出的相同次序。在这种情况下,样品包括来自cfRNA的RNA,以及滴定到野生型RNA内的来自CCDC6-RET阳性细胞的RNA。
图4显示了来自图3中所示数据的CtR值。再次,在融合位点扩增的5'和融合位点扩增的3'之间的差异显示在右侧上。星形指示CCDC6-RET融合的检测。
发明详述
I. 引言
本发明人已发现了检测遗传区域之间融合的新型、定量和多重的方法。本发明的方法仅需要少量患者样品,所述患者样品可以非侵入性采集,例如来自血浆的循环游离RNA(cfRNA)。
由于源于肿瘤的有限量的循环核酸,目前的测试需要活组织检查或大量血浆。本文描述的方法允许非常敏感的单管测定以至少两种方式检测基因融合。在第一种方式中,对于各种融合特异性的多个引物被用于跨融合位点扩增。在第二种方式中,使用扩增融合位点外部的两组引物。一个引物组扩增位于融合位点上游(融合位点的5')的受累基因区域,并且另一个引物组扩增位于融合位点下游(融合位点的3')的受累基因区域。最后,可以包括对于已知序列特异性的对照引物组,以确保样品中核酸的存在和质量。因此,该方法利用了四组引物:(i)融合位点特异性的,(ii)融合位点的5' ;(iii)融合位点的3';以及任选地(iv)对照。(i)、(ii)、(iii)和(iv)各自可以与不同的标记或染料结合,并且使用4通道检测器进行检测。
融合位点特异性引物(i)包括至少一个正向(5')和至少一个反向(3')引物,但可以包括各自的多重变体,以捕获不同的融合位点变体。如本文实施例所示,七个不同的正向引物和两个不同的反向引物用于检测关于ALK的融合位点。九个不同的正向引物和两个不同的反向引物用于检测关于RET的融合位点。融合位点特异性引物(i)可以排列在融合位点的任一侧上,但不包括融合位点,或者可以这样排列,使得引物之一覆盖融合位点。正向引物或反向引物或两者可以被标记,使得来自融合位点特异性引物(i)的所有扩增产物都包括相同的标记。
取决于融合的类型,融合位点引物(ii)的5'和融合位点引物(iii)的3'可以针对任一成员融合基因进行设计。目标是比较在遗传位点的任一侧上的遗传区域量。如果它们相等,则不存在融合。即,断点5'的区域和断点3'的区域仍然是完整的。如果它们不相等,则基因的一侧以比另一侧更低的水平表达,指示融合已发生。例如,对于EML4-ALK,如果融合位点引物的5'导致比融合位点引物的3'更低的扩增信号,则将检测到融合(参见实施例1和图1)。再次,正向引物、反向引物或两者可以被标记,使得来自(ii)的所有扩增产物都包括相同的标记,并且来自(iii)的所有扩增产物都包括相同的标记。
可以扩增变体特异性引物组(i)中的引物数目,以检测给定遗传融合的几种不同变体。在特定变体融合不被变体特异性引物组(i)扩增和检测的情况下,融合位点引物(ii)的5'和融合位点引物(iii)的3'提供了备份。
对照引物组(iv)可以对于预期在血浆中出现的任何核酸例如管家基因是特异性的。再次,正向或反向或两者可以被标记,使得来自(iv )的扩增产物包括相同的标记。
II. 定义
“遗传融合”是通过先前分开的两个染色体位置的连接形成的杂交染色体序列。融合可以在相同染色体(例如中间缺失或染色体倒位)或不同染色体(例如易位)上的基因之间发生。
“融合基因”是通过先前分开的两个基因的连接形成的杂合基因。融合基因不一定包括来自两个基因的编码序列,而是可以包括来自基因之一的非编码序列,例如启动子或3'非翻译区。包含融合基因的基因命名如“基因1”、“基因2”、“基因A”、“基因B”等用于区分构成融合的基因,并且不一定是指融合中的基因位置。
术语“融合位点”、“融合点”、“断点”和类似术语指遗传融合中的点,在其中来自一个基因或遗传位置的核苷酸被发现与来自另一个基因或遗传位置的核苷酸相邻。
术语“靶区域”、“靶部分”、“靶片段”和类似术语指待扩增和/或分析的靶核酸序列的区域。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指核苷酸(例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物,并且包括天然存在的(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶)、非天然存在的和经修饰的核酸。该术语不受聚合物的长度(例如单体数目)限制。核酸可以是单链或双链的,并且一般含有5'-3'磷酸二酯键,尽管在一些情况下,核苷酸类似物可以具有其他连接。单体通常称为核苷酸。术语“非天然核苷酸”或“经修饰的核苷酸”指含有经修饰的含氮碱基、糖或磷酸基的核苷酸,或者在其结构中掺入非天然部分的核苷酸。非天然核苷酸的例子包括双脱氧核苷酸、生物素化、胺化、脱氨基、烷基化、苄基化和荧光标记的核苷酸。
术语“引物”指在合适的条件下充当通过核酸聚合酶的多核苷酸链合成起始点的短核酸(寡核苷酸)。多核苷酸合成和扩增反应通常包括适当的缓冲液、dNTP和/或rNTP、以及一种或多种任选的辅因子,并且在合适的温度下进行。引物通常包括与靶序列至少基本上互补的至少一个至少靶-杂交区域。该区域通常为长度约15至约40个核苷酸。“引物对”指正向引物和反向引物(有时称为5'和3'引物),其与靶序列的相对链互补,并且设计为扩增靶序列。正向引物和反向引物排列在靶序列上彼此的可扩增距离内,例如约10-5000个核苷酸或约25-500个核苷酸。“引物组”指一个或多个引物对,或至少一个正向引物和至少一个反向引物的组合。例如,引物组可以包括3个正向引物和1个反向引物,使得可以潜在地产生3种不同的扩增产物。
对于其为融合位点(或断点)5'(或3')的序列(或基因的一部分)特异性的引物组或引物对指用于扩增不包括融合位点或断点的序列的引物。
如本文使用的,“探针”意指能够选择性地结合特异性预期的靶生物分子的任何分子,例如被探针结合、捕获或杂交的目的核酸序列。
单词“互补”或“互补性”指多核苷酸中的核酸与第二多核苷酸中的另一个核酸形成碱基对的能力。例如,序列A-G-T(关于RNA的A-G-U)与序列T-C-A(关于RNA的U-C-A)互补。互补性可以是部分的,其中仅一些核酸根据碱基配对匹配,或可以是完全的,其中所有核酸都根据碱基配对匹配。如果探针或引物与靶序列至少部分互补,则它被视为对于靶序列“特异性的”。取决于条件,与靶序列的互补性程度通常对于较短的核酸如引物高于(例如大于80%、90%、95%或更高)较长的序列。
在两个或更多个核酸或者两个或更多个多肽的背景下,术语“等同的”或“同一性百分比”指两个或更多个序列或子序列是相同的,或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸(当在比较窗口或指定区域上就最大对应性比较且比对时,例如在指定区域上的约60%同一性,例如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性中任意),如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法与默认参数测量的,或通过手动比对和目视检查。参见例如,在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST处的NCBI网站。这些序列然后被说成是“基本上等同的”。通常在最佳比对序列上测定同一性百分比,使得定义适于具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。在本领域中通常使用的算法会处理缺口等。通常,同一性存在于包含长度至少约8-25个氨基酸或核苷酸的序列的区域上,或者长度50-100个氨基酸的区域或核苷酸的区域上,或者参考序列的整个长度上。
术语“等位基因”指基因的序列变体。一个或多个遗传差异可构成等位基因。
术语“试剂盒”指制造品(例如包装或容器),其包括至少一种试剂例如核酸探针或探针库等等,其用于如本文描述的特异性扩增、捕获、加标签/转换或检测RNA或DNA。
术语“扩增条件”指允许引物的杂交和模板依赖性延伸的核酸扩增反应(例如PCR扩增)中的条件。术语“扩增子”指核酸分子,其含有靶核酸序列的全部或片段,并且通过任何合适的扩增方法作为体外扩增产物形成。各种PCR条件在PCR Strategies(Innis 等人,1995, Academic Press, San Diego, CA)在第14章处;PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications(Innis等人,Academic Press, NY, 1990)中描述。
术语“热稳定核酸聚合酶”或“热稳定聚合酶”指这样的聚合酶,当与例如来自大肠杆菌(E. coli)的聚合酶相比较时,所述聚合酶在升高的温度下是相对稳定的。热稳定聚合酶适合于在聚合酶链反应(“PCR”)典型的温度循环条件下使用。示例性热稳定聚合酶包括来自下述的那些:嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermus caldophilus、栖热菌属物种(Thermus sp.)Z05(参见例如美国专利号5,674,738)和栖热菌属物种Z05聚合酶的突变体、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、黄栖热菌(Thermus flavus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、栖热菌属物种sps17、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、热温泉家族(Hot Spring family)B /克隆7、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、Bacillus caldotenax、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)和非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、及其修饰形式。
术语“样品”或“生物样品”指含有或推测含有来自个体的核酸的任何组合。该术语包括细胞、组织或血液的纯化或分开的组分,例如DNA、RNA、蛋白质、无细胞部分或细胞裂解产物。在一些实施方案中,对从血液分离的血浆样品进行分析;术语“在患者的血液中检测到”和“在患者的血浆中检测到”可互换使用,以意指从患者获得血液,并由其衍生的血浆用于分析。样品也可以指其他类型的生物样品,例如皮肤、血浆、血清、全血和血液组分(血沉棕黄层)、唾液、尿、眼泪、精液、阴道液、组织活组织检查及其他流体和组织,包括石蜡包埋组织。样品还可以包括从个体获得的细胞的体外培养物包括细胞系的组成成分和组分。
“对照”样品或值指充当用于与测试样品或测试条件比较的参考(通常为已知的参考)。例如,测试样品可以从测试条件(例如怀疑患有癌症的个体)获取,并且与来自已知条件(例如无癌个体(阴性对照)或已知患有癌症的个体(阳性对照))的样品进行比较。在本公开的背景下,阴性对照的生物样品将是来自已知健康(非癌症)个体的生物样品,并且阳性对照的例子将是来自已知具有特定基因融合的患者或细胞系的生物样品。对照也可以表示从多个测试或结果收集的平均值或范围。对照也可以对于反应条件进行制备。例如,关于核酸存在的阳性对照可以包括检测已知存在于样品中的序列的引物或探针,而阴性对照将不含核酸。本领域技术人员将认识到对照可以设计用于评价何数目的参数。例如,对照可以设计为基于药理学数据(例如半衰期)或治疗措施比较治疗益处(例如益处和/或副作用的比较)。对照可以设计用于体外应用。本领域技术人员将理解哪些对照在给定情况下是有价值的,并且能够基于与控制值的比较来分析数据。对照对于测定数据的显著性也是有价值的。例如,如果关于给定参数的值是对照中的广泛变体,则测试样品中的变化不被视为显著的。
术语“诊断”指受试者患有病症例如癌症或某些类型的癌症(例如起因于基因融合)的相对概率。类似地,术语“预后”指某一未来结果可能在受试者中发生的相对概率。例如,在本发明的背景下,诊断可以指癌症的分类或个体将响应特定疗法的可能性。该术语不预期是绝对的,如医学诊断领域中的任何技术人员应了解的。
术语“疗法”、“治疗”和“改善”指症状严重性的任何降低。在治疗癌症的情况下,治疗可以指例如减少肿瘤大小、癌细胞数目、生长速率、转移活性、减少非癌细胞的细胞死亡、减少恶心及其他化学疗法或放射疗法副作用等。术语“治疗”和“预防”不预期是绝对术语。治疗和预防可以指发作、症状改善、患者存活中的改善、存活时间或速率中的增加等中的任何延迟。治疗和预防可以是完全的(不可检测水平的赘生性细胞)或部分的,使得在患者中发现比没有治疗将发生的更少的肿瘤细胞。治疗效应可以与未接受治疗的个体或个体库(例如具有相同遗传融合的个体)进行比较,或者与在治疗前或在治疗期间的不同时间的相同患者进行比较。在一些方面,例如与施用前的个体或未经历治疗的对照个体相比较,疾病的严重性降低至少10%。在一些方面,疾病的严重性降低至少25%、50%、75%、80%或90%,或在一些情况下,使用标准诊断技术不再可检测。
术语“阈值循环”或“Ct”是相对浓度的度量,并且通常用于实时PCR(也称为qPCR)中。Ct指扩增曲线与阈值线的交点。阈值线通常设置在可以检测到高于背景的信号时,或者当扩增反应进入指数期时的点处。Ct可以受靶的浓度和扩增条件的影响,例如条件对可检测标记和扩增效率的作用。更高的Ct对应于达到阈值的更长时间,无论它是由于低靶浓度还是无效扩增。
术语“个体”、“受试者”、“患者”和类似术语可互换使用,并且除非另有说明,否则指哺乳动物例如人和非人灵长类动物、以及兔、大鼠、小鼠、狗、猫和其他哺乳动物物种。该术语不一定指示受试者已被诊断患有特定疾病,但通常指处于医疗监督下的个体。患者可以寻求治疗、监测、调整或修改现有治疗方案等。患者可以包括未接受治疗、目前接受治疗、已具有手术的个体以及已中断治疗的个体。
术语“标记”、“标签”、“可检测部分”和类似术语指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物。例如,有用的标记包括荧光染料、发光剂、放射性同位素(例如32P、3H)、电子致密试剂或基于亲和性的部分,例如用于纯化的“His标签”或与生物素相互作用的“链霉抗生物素蛋白标签”。
除非另有定义,否则本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。参见例如Pfaffl, Methods: The ongoing evolution of qPCR,第50卷(2010);van Pelt-Verkuil等人,Principles and Technical Aspects of PCRAmplification, Springer(2010);Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULARBIOLOGY, Elsevier(第4版2007);Sambrook等人,MOLECULAR CLONING, A LABORATORYMANUAL, Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)。术语“一个/一种”预期意指“一个或多个/一种或多种”。 当在步骤或元素描述之前时,术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”,预期意指进一步的步骤或元素的添加是任选的并且不被排除。
III. 融合基因
许多癌症相关的融合基因是已知的,并且在各种各样的癌症中出现。这些癌症相关的融合基因通常发生在其中融合的一个成员是涉及促生长信号传导途径的激酶,而另一个成员有助于升高或组成性表达或信号传导的情况下。本文描述的组合物和方法可以用于检测任何遗传融合,因为引物可以设计为扩增和检测融合位点,并且扩增和检测融合位点上游和下游的区域。此外,因为公开的方法可以用有限量的cfRNA进行,所以不需要肿瘤的定位和活组织检查。
可以根据本发明检测的融合基因的例子包括涉及酪氨酸激酶的那些,例如ALK、RET、ROS、NTRK(神经营养性酪氨酸受体激酶)、BRAF、ABL和FGFR(成纤维细胞生长因子受体)。特定例子包括但不限于EML4-ALK、KIF5B-ALK、HIP1-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK、KIF5B-RET、CCDC6-RET、NCOA4-RET、TRIM33-RET、ERC1-RET、BCR-ABL、FGFR3-TACC3、C11orf95-RELA、DNAJB1-PRKACA、TMPRSS2-ERG、PML-RARA、EGFR-SEPT14、RPS6KB1-VMP1、ETV6-NTRK3、SND1-BRAF、MLL-MLLT10、MLL-ELL、EHMT1-GRIN1、NSD1-ZFN346、PPP1CB-PLB1、KDM2A-RHOD、NSD1-NUP98和MLL-MLLT4(参见例如Yoshihara等(2014年12月15日),Oncogene)。
IV. 样品的制备
用于测试遗传融合的样品可以从任何来源获得,但有利地以非侵入性方式例如从血液或血液级分中获得。用于本文方法的样品也可以取自支气管肺泡灌洗或组织活组织检查。用于从生物样品中分离核酸的方法是已知的,例如如Sambrook中所述,并且几种试剂盒是商购可得的(例如来自Roche的High Pure RNA Isolation Kit、High Pure Viral NucleicAcid Kit和MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit)。
在一些实施方案中,制备DNA,并且用作本文公开的扩增和检测方法的模板。在一些实施方案中,制备RNA。当RNA用作通过PCR扩增的模板时,需要逆转录步骤以制备cDNA。DNA聚合酶例如Taq或另一种热稳定聚合酶然后可以用于实现扩增。
如实施例中所示,本文公开的方法是异常灵敏的,并且可以用于检测来自野生型RNA中1:4000稀释的样品中的少至20个拷贝的融合突变。这允许在其中靶序列是非常罕见的样品,例如循环游离RNA(cfRNA)中的检测。
在一些实施方案中,样品是从血浆中分离的RNA。取决于患者的状况,可以获得约1-10 mL的血浆用于测试(通常为约2 mL)。用于分离循环游离RNA的试剂盒是例如从NorgenBiotek Corp或Qiagen商购可得的。
V. 扩增和检测
核酸扩增可以使用任何引物依赖性方法进行。在一些实施方案中,扩增是定量的,使得给定扩增靶的相对丰度或实际丰度可以通过扩增产物的量来测定。
基于DNA的方法可以用于本文公开的扩增和检测方法,例如PCR。在一些实施方案中,使用实时或定量PCR(RTPCR或qPCR)。qPCR允许在PCR过程的每个循环期间生成的产物的可靠检测和测量。这些技术是本领域众所周知的,并且试剂盒和试剂例如从RocheMolecular Systems、Life Technologies、Bio-Rad等商购可得。参见例如Pfaffl(2010),Methods: The ongoing evolution of qPCR第50卷。在一些实施方案中,扩增和检测在用猝灭剂和荧光团标记的双重标记的探针(例如TaqMan、CPT,LNA或MGB探针)的存在下进行(参见例如Gasparic等人(2010),Anal. Bioanal. Chem. 396:2023)。
在一些实施方案中,进行初步逆转录步骤(也称为RT-PCR,不与实时PCR混淆)。参见例如Hierro等人(2006),72:7148。如本文使用的,术语“qRT-PCR”指逆转录,随后为定量PCR。两种反应均可以在单个管中进行而不中断,例如以添加试剂。
还可以使用基于RNA的扩增方法,例如转录介导的扩增(TMA)或基于核酸序列的扩增(NASBA)。参见例如Fakruddin等人(2013),J Pharm Bioallied Sci. 5:245;vanDeursen等人(1999),Nucl. Acids Res. 27:e15;Kamisango等人(1999),J Clin. Microbiol. 37:310。
探针或者引物对中的一个或两个引物可以用直接或间接发射或生成可检测信号的任何物质或组分进行标记。在一些实施方案中,标记是荧光团(染料),其中许多在文献中报道并且是本领域技术人员已知的,并且其中许多是商购可得的。荧光团在例如Cardullo等人(1988),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790;Hochstrasser等人(1992),Biophysical Chemistry 45: 133;Selvin(1995),Methods in Enzymology 246: 300;Steinberg, Ann. Rev. Biochem., 40: 83- 114(1971);和Wang等人,Anal. Chem. 67:1197-1203(1995)中描述。
下述是可以用作标记的荧光团的例子:4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸;吖啶;异硫氰酸吖啶;5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS);4-氨基-N-[3-乙烯砜基]苯基]萘酰亚胺-3,5-二磺酸酯;N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺;邻氨基苯甲酰胺;BODIPY;亮黄;香豆素;7-氨基-4-甲基香豆素(AMC,香豆素120)/7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆满151);花青染料;焰红染料4',6-二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚(DAPI);5',5''-二溴焦棓酚-磺酸萘(溴焦酚红);7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素;二亚乙基三胺五乙酸酯;4,4'-二异硫氰酸二氢芪-2,2'-二磺酸;4,4'-二异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸;5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS,丹磺酰氯);4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL);4-二甲基氨基苯偶氮基苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC);曙红;曙红异硫氰酸酯;赤藓红B;赤藓红异硫氰酸酯;乙锭;5-羧基荧光素(FAM);5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF);2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE);荧光素;异硫氰酸荧光素;荧光胺;IR144;IR1446;孔雀石绿异硫氰酸酯;4-甲基伞形酮;邻甲酚酞;硝基酪氨酸;副品红;酚红;藻红蛋白(包括但不限于B和R型);邻苯二甲醛;芘;芘丁酸酯;琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯;量子点;活性红4(Cibacron亮红3B-A);6-羧基-X-罗丹明(ROX);6-羧基罗丹明(R6G);丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明;罗丹明B;罗丹明123;罗丹明X异硫氰酸酯;磺酰罗丹明B;磺酰罗丹明101;磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红);N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA);四甲基罗丹明;四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC);核黄素;玫红酸;和镧系元素螯合衍生物。
所列出的荧光团(染料)中的任何都可以用于本文所述的测定中,以如本文所述的标记核酸。荧光团可以通过常规共价键合,使用在荧光团和/核酸上的适当官能团进行附着。
如上文注意到的,双重标记的探针可以用于检测。双重标记的探针可以包含荧光团,例如上文列出的荧光团中的任何和淬灭剂。合适的猝灭剂包括但不限于DDQ-I、Dabcyl、Eclipse、Iowa Black FQ、BHQ-1、QSY-7、BHQ-2、DDQ-II、Iowa Black RQ、QSY-21和BHQ-3。对于具有在500和550 nm之间的发射最大值的荧光团(例如FAM、TET和HEX),可以选择具有在450和500 nm之间的吸收最大值的猝灭剂(例如dabcyl或BHQ-1)。对于具有高于550 nm的发射最大值的荧光团(例如罗丹明和Cy染料),可以选择具有高于550 nm的吸收最大值的淬灭剂(例如BHQ-2)。关于选择染料-猝灭剂对中的考虑,参见例如Johansson(2003),Meth. Mol. Biol. 335:17。
检测装置是本领域已知的,并且可以如对于所选择的标记适当选择的。适合于定量PCR的检测装置包括Cobas®和Light Cycler®系统(Roche)、PRISM 7000和7300实时PCR系统(Applied Biosystems)等。
VI. 试剂盒
在一些实施方案中,用于进行本文公开的方法的试剂和材料包括在试剂盒中。在一些实施方案中,试剂盒包括用于获得、贮存和/或制备样品的组分。这些组分包括例如无菌针和注射器、EDTA内衬管、缓冲液(例如用于结合核酸与基质和从基质中洗脱)、RNA酶抑制剂和/或DNA酶等。
在一些实施方案中,试剂盒包括用于检测遗传融合例如基因融合的引物。在一些实施方案中,试剂盒包含(i)对于遗传融合中的融合位点特异性的至少一个第一引物对;(ii)对于融合位点(5'至)上游的序列的一部分特异性的第二引物对;以及(iii)对于融合位点(3'至)下游的序列的一部分特异性的第三引物对。在一些实施方案中,试剂盒进一步包含阳性对照引物对(例如来自看家基因的序列或预期在样品中的另一种序列)和/或阴性对照引物组(例如设计为扩增待测试的样品中不预期的序列,例如来自不同生物体的序列)。至少一个第一引物对(i)可以包括多于一个的引物对,其可以检测遗传融合的变体。在一些实施方案中,多个引物对包括利用相同反向引物的多个正向引物或利用相同正向引物的多个反向引物。
在一些实施方案中,引物组各自包装在分开的管中,例如以待由使用者决定的比率加入。在一些实施方案中,将一个或多个或全部引物组以预定比率包装在单个管中。
该试剂盒还可以包括酶,例如逆转录酶和/或DNA聚合酶。在一些实施方案中,DNA聚合酶是能够在热循环条件下扩增的热稳定DNA聚合酶,例如Taq或Taq衍生物。在一些实施方案中,试剂盒包括dNTP。在一些实施方案中,试剂盒包括有助于通过所选择的聚合酶的聚合/扩增的缓冲液。
在一些实施方案中,试剂盒包括对照,例如在待检测的遗传融合处是野生型(即,无遗传融合)的多核苷酸,或包括待检测的遗传融合的多核苷酸。
试剂盒还可以包括消耗品,例如样品管或小瓶;反应容器(例如管、多孔板、微流体芯片或室等),以及使用说明书或参考网站。
VII. 实施例
A. 实施例1:在血浆和滴定的细胞RNA中的EML4-ALK融合的检测
在该实施例中,我们测试了多重定量RT-PCR方法来检测EML4-ALK融合。在单管测定中使用4个不同的引物组,以减少实现可测量的可靠结果所需的样品量。
可以使用表1中所示的引物,加上用Cy5.5标记的对于SDH特异性的引物对。第一组正向引物和反向引物(SEQ ID NO:1-62)跨各种EML4-ALK融合扩增。如本领域技术人员应了解的,正向引物和反向引物可以在单一对或任何组合中使用,以扩增不同的融合产物。对于ALK(在融合中替换为EML4)上的断点5'的区域特异性的引物显示为SEQ ID NO:63-72(5个正向引物和反向引物选项各自)。对于断点(存在于融合和非融合基因两者中)3'的区域特异性的引物显示为SEQ ID NO:73-82(5个正向引物和反向引物选项各自)。所有反应中的反向引物都充当用于逆转录酶反应的引物。
反应条件如下。对于每个反应,将25 uL的输入RNA加入RT-PCR反应混合物中至50uL的终体积,所述RT-PCR反应混合物包含正向引物和反向引物、标记的探针、缓冲液、dUTP、dTTP、dATP、dGTP、UNG、RT和Z05酶。
表2中的引物组合用于生成图1中所示的代表性结果。
反应在cobas® LC480中运行,其中四种过滤器用于多重反应:FAM、HEX、JA270和CY5.5(内部对照)。
我们使用来自Horizon Discovery的EML4-ALK阳性细胞系NCI-H460(HTB-177)、NCI-H2228和EML4-ALK融合变体1细胞系,以及来自NSCLC福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)和血浆标本的RNA测试了该方法。
在血浆的情况下,我们使用Qiagen ExoRNA Easy Kit提取cfRNA。由于cfRNA的产量太低而不能准确地测量,我们将固定体积(全部的1/4)的提取血浆cfRNA输入到qRT-PCR内。
在多重qRT-PCR中,一个通道(在这种情况下为FAM)检测变体特异性ALK融合的扩增,而第二通道(HEX)检测断点5'的区域的扩增,并且第三通道(JA270)检测断点3'的区域的扩增。第四通道(Cy5.5)用于标准化对照,这确保了cfRNA输入在数量和质量中是足够的。
代表性结果显示于图1中。野生型RNA从NCI-1975(CRL-5908)细胞系获得,并且EML4-ALK RNA从EML4-ALK融合变体1细胞系获得。如所示的将EML-ALK RNA滴定到野生型RNA内,以测定检测极限。
融合变体特异性引物组(例如SEQ ID NO:1-62)以及设计为差异测量融合点5'和3'的区域的引物两者均导致融合基因扩增产物的检测。融合变体特异性引物检测到用野生型RNA以1:4000稀释度共混的25 pg EML4-ALK融合阳性RNA。5'和3'差异测量能够检测到用野生型RNA以1:100稀释度共混的1ng EML4-ALK RNA。
这些结果是令人印象深刻的,因为多重测定足够灵敏,以检测在变体特异性反应中的融合RNA种类的20个拷贝。用于差异测量融合点5'和3'的区域的反应可以生成来自共混样品的阳性信号,所述共混样品具有仅1%含有融合的RNA。多重测定也是极具特异性的,因为对于高达200 ng野生型RNA没有观察到阳性信号。鉴于与野生型cfRNA相比,来自肿瘤的cfRNA一般是罕见的,所以即使对于早期诊断这些结果也是令人鼓舞的。
B. 实施例2:在血浆和滴定的细胞RNA中的CCDC6-RET融合的检测
在该实施例中,我们测试了多重qRT-PCR检测来自细胞系以及血浆的RNA中的CCDC6-RET融合的能力。
除用Cy5.5标记的对于SDH特异性的引物对之外,表3中所示的引物可以用于检测CCDC6-RET融合。
代表性正向引物(SEQ ID NO:83-160)和反向引物(SEQ ID NO:161-198)跨各种CCDC6-RET融合扩增。对于RET(在融合中替换为CCDC6)上的断点5'的区域特异性的代表性引物显示为SEQ ID NO:199和200。对于断点(存在于融合和非融合基因两者中)3'的区域特异性的代表性引物显示为SEQ ID NO:201和202。再次,如本领域技术人员应了解的,正向引物和反向引物可以在单一对或任何组合中使用,以扩增不同的融合产物。所有反应中的反向引物都充当用于逆转录酶反应的引物。
反应条件与实施例1中所述的那些相同,并且表4中的引物组合用于生成图2-4中所示的代表性结果。
我们使用来自CCDC6-RET阳性细胞系LC-2AD、野生型细胞系CRL-5908的RNA和“通用人类RNA”(UHR)(来自不同组织的RNA的混合物)来测试这种方法。我们还测试了来自NSCLC FFPET样本、以及正常和NSCLC血浆的RNA。
结果显示于图2-4中。图2显示,与关于EML4-ALK的结果相似,CCDC6-RET融合可以用极高的灵敏度检测到。变异特异性扩增可以检测与100 ng野生型RNA混合的少至25 pg融合阳性RNA,而5'和3'差异测量能够用少至10 ng RNA检测到融合。
图3显示了关于使用血浆的反应的Ct值。测试了RMS NSCLC血浆样品,并且显示对于CCDC6-RET融合是阴性的。正常血浆还与来自融合阳性(LC2AD)或野生型(CRL-5908)细胞的RNA混合。对照校正的数据显示于图4中。仅具有来自融合阳性细胞系的RNA的那些样品才显示阳性结果。
再次,由于出乎意料的灵敏度和特异性,结果是令人鼓舞的。即使在来自NSCLC患者的血浆样品中也没有检测到融合。
虽然本发明已关于具体实施例进行详细描述,但对于本领域技术人员显而易见的是,可以在本发明的范围内作出各种修改。因此,本发明的范围不应受本文描述的实施例限制。
Claims (23)
1.一种组合物,其包含:
- 对于基因1和基因2之间的融合位点特异性的至少一个第一引物对,其中所述至少一个引物对包含在所述融合位点的5'侧上开始的至少一个正向引物和在所述融合位点的3'侧上开始的至少一个反向引物;
- 对于其为所述融合位点5'的基因1的一部分特异性的第二引物对;和
- 对于其为所述融合位点3'的基因1的一部分特异性的第三引物对。
2.权利要求1的组合物,其进一步包含对于对照序列特异性的第四引物组。
3.权利要求1或2的组合物,其中所述至少一个第一引物对包含至少三个引物对。
4.前述权利要求中任一项的组合物,其进一步包含热稳定DNA聚合酶。
5.前述权利要求中任一项的组合物,其进一步包含逆转录酶。
6.前述权利要求中任一项的组合物,其进一步包含来自个体的生物样品。
7.权利要求6的组合物,其中所述生物样品是来自血浆的RNA。
8.前述权利要求中任一项的组合物,其中基因1选自ALK、RET、ROS、NTRK、BRAF、ABL和FGFR。
9.权利要求8的组合物,其中基因1是ALK,并且基因2选自EML4、KIF5B、HIP1、KLC1和TFG。
10.权利要求8的组合物,其中基因1是RET,并且基因2选自KIF5B、CCDC6、NCOA4和TRIM33。
11.一种用于检测来自个体的生物样品是否携带融合基因的方法,所述方法包括:
- 用来自所述个体的生物样品和权利要求1-5中任一项的组合物进行扩增反应;
- 测定来自所述至少一个第一引物对的扩增产物的量;
-检测是否存在来自所述第二引物对的扩增产物量和来自所述第三引物对的扩增产物量的差异;
-如果:
(i)来自步骤(B)中测定的所述至少一个第一引物对的扩增产物的量大于来自所述至少一个第一引物对和不携带融合基因的对照多核苷酸的扩增产物的量;或
(ii)在步骤(C)中检测到差异的存在,
则检测到融合基因。
12.权利要求11的方法,其中所述生物样品是分开的DNA或RNA。
13.权利要求12的方法,其中所述生物样品是来自所述个体的血浆的RNA。
14.权利要求11-13中任一项的方法,其中基因1选自ALK、RET、ROS、NTRK、BRAF、ABL和FGFR。
15.权利要求14的方法,其中基因1是ALK,并且基因2选自EML4、KIF5B、HIP1、KLC1和TFG。
16.权利要求14的方法,其中基因1是RET,并且基因2选自KIF5B、CCDC6、NCOA4和TRIM33。
17.权利要求11-16中任一项的方法,其中所述扩增反应使用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)进行。
18.一种用于检测来自个体生物样品中的融合基因的试剂盒,所述试剂盒包含:
- 对于基因1和基因2之间的融合位点特异性的至少一个第一引物对,其中所述至少一个引物对包含在所述融合位点的5'侧上开始的至少一个正向引物和在所述融合位点的3'侧上开始的至少一个反向引物;
- 对于其为所述融合位点5'的基因1的一部分特异性的第二引物对;
- 对于其为所述融合位点3'的基因1的一部分特异性的第三引物对;
其中A、B和C的引物对各自在分开的容器中,或者所述引物对的两个或更多个合并在单个容器中。
19.权利要求18的试剂盒,其进一步包含对于对照序列特异性的第四引物组,其中所述第四引物组与A、B和C的引物对在分开的容器中,或者合并在相同容器中。
20.权利要求18或19的试剂盒,其进一步包含热稳定DNA聚合酶。
21.权利要求18-20中任一项的试剂盒,其进一步包含逆转录酶。
22.权利要求18-21中任一项的试剂盒,其进一步包含至少一种对照样品。
23.权利要求22的试剂盒,其中所述至少一种对照样品包含不携带所述融合基因的DNA或RNA,和/或的确携带所述融合基因的DNA或RNA。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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