CN109628575A - Hla-a*24:02等位基因在检测人发生甲硝唑所致药疹风险中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HLA‑A*24:02等位基因在检测人发生甲硝唑所致药疹风险中的应用。本发明提供了检测人是否具有HLA‑A*24:02等位基因的物质在制备检测或评价人发生应答于甲硝唑的药物不良反应风险的产品中的应用。本发明的实验证明，人类白细胞抗原基因——HLA‑A*24:02等位基因，它与甲硝唑所致药疹发病相关。HLA‑A*24:02等位基因可作为预测甲硝唑所致药疹发生风险的标记基因。

Description

HLA-A*24:02等位基因在检测人发生甲硝唑所致药疹风险中 的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域中，HLA-A*24:02等位基因在检测人发生甲硝唑所致药疹风险中的应用。

背景技术

药疹，指药物通过各种途径进入人体后引起的皮肤及(或)粘膜的不良反应，它是最为常见的药物不良反应，既往报道发病率1-3％。随着药疹在我国发病率的逐年上升，不但对个人健康及经济损失造成严重危害，更成为公共卫生中阻碍临床用药安全及新药研发的障碍，已成为国内外研究热点。近期国内外研究揭示出多种药物所致药疹的发生与个体人类白细胞抗原(HLA)的编码基因有关，HLA等位基因是人体多态性最为丰富的基因系统。已陆续证实阿巴卡韦、别嘌呤醇、卡马西平、醋甲唑胺等多种药物所致药疹均与特定HLA等位基因相关。这其中除了重症疹型以外，某些药物所致的发疹型药疹也同样与HLA等位基因存在一定关联，且大多分布于I类等位基因。已有大样本临床实验提示，用药前筛查HLA等位基因对于减少重症药疹的发生具有重要意义。

甲硝唑主要用于治疗滴虫性阴道炎细菌性阴道病、阿米巴病、酒渣鼻、厌氧菌或混合型感染贾第虫病肠贾第虫等。随着甲硝唑在临床上的应用越来越广泛，由其所致的不良反应也越来越多，其引起的药疹疹型最常见为固定型药疹、荨麻疹型药疹、发疹型药疹。除了引起普通型药疹外，甲硝唑也可引起致命的重症药疹,后者发病重、死亡率和致残率高，往往给个人和社会带来巨大的负担。

目前仍无预测甲硝唑所致药疹的可靠手段。鉴于它的高发率、危害性及对于中药发展的影响，对其发病的预测无疑具有很大的临床及经济学价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何预测人发生甲硝唑所致药疹风险。

本发明提供了如下应用：

1、检测人HLA-A*24:02等位基因的物质在制备检测或评价人发生应答于甲硝唑的药物不良反应风险的产品中的应用；

2、检测人HLA-A*24:02等位基因的物质在制备检测或评价人发生甲硝唑所致药疹风险的产品中的应用；

3、检测人HLA-A*24:02等位基因的物质在制备筛查甲硝唑所致药疹产品中的应用；

4、检测人HLA-A*24:02等位基因的物质在制备检测甲硝唑所致药疹易感性产品中的应用。

本发明还提供了含有检测人HLA-A*24:02等位基因的物质的产品，所述产品为a)-d)中的任一种：

a)检测或评价人发生应答于甲硝唑的药物不良反应风险的产品；

b)检测或评价人发生甲硝唑所致药疹风险的产品；

c)筛查甲硝唑所致药疹产品；

d)检测甲硝唑所致药疹易感性产品。

上文中，所述检测人HLA-A*24:02等位基因是指检测人是否具有HLA-A*24:02等位基因。

本发明还提供了检测或评价人发生应答于甲硝唑的药物不良反应风险的方法，所述方法包括检测人是否具有HLA-A*24:02等位基因，其中，具有HLA-A*24:02等位基因的人使用甲硝唑后发生应答于甲硝唑的药物不良反应风险高于不具有HLA-A*24:02等位基因的人。

本发明还提供了检测或评价人发生甲硝唑药疹风险的方法，所述方法包括检测人是否具有HLA-A*24:02等位基因，其中，具有HLA-A*24:02等位基因的人使用甲硝唑后发生甲硝唑药疹风险高于不具有HLA-A*24:02等位基因的人。

本发明还提供了一种开发治疗应答于甲硝唑的药物不良反应药物的方法，所述方法包括使用HLA-A*24:02等位基因作为靶点的测定法来鉴别和/或筛选治疗应答于甲硝唑的药物不良反应药物。

本发明还提供了一种开发治疗甲硝唑所致药疹药物的方法，所述方法包括使用HLA-A*24:02等位基因作为靶点的测定法来鉴别和/或筛选治疗甲硝唑所致药疹药物。

本发明中，检测人是否具有HLA-A*24:02等位基因的物质可为本领域已知的任一种检测等位基因存在的方法所用的试剂、试剂盒和/或仪器，如通过下述至少一种方法确定HLA-A*24:02等位基因存在所用的试剂、试剂盒和/或仪器：DNA特异性杂交法、以PCR为基础的HLA测序分型法以及HLA血清学分型法。

上述检测人是否具有HLA-A*24:02等位基因的物质还可为检测人是否具有HLA-A*24:02等位基因的等价遗传标记物的方法中所采用的试剂、试剂盒和/或仪器，所述HLA-A*24:02等位基因的等价遗传标记物的存在指示HLA-A*24:02等位基因的存在。

上述中的产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂盒和仪器的组合产品。

在本发明的一个实施例中，所述试剂盒为SSO Typing Tests(人类白细胞抗原-DNA分型试剂盒(序列特异性寡核苷酸探针法))，One Lambda,Inc。

上文中，可以通过使用待测人的外周血制备的DNA、RNA、蛋白质、细胞或血清来检测人是否具有HLA-A*24:02等位基因。

上文中，所述检测人是否具有HLA-A*24:02等位基因中，两条染色体均含有HLA-A*24:02等位基因的纯合个体以及仅一条染色体含有HLA-A*24:02等位基因的杂合个体均为含有HLA-A*24:02等位基因。

HLA-A*24:02等位基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示。

可以利用HLA-A*24:02等位基因作为预测甲硝唑所致药疹发生风险的标记基因。进一步，可利用检测HLA-A*24:02等位基因的物质制备用于是否可利用甲硝唑进行治疗的试剂盒，用于筛查甲硝唑所致药疹的高危者，可指导临床用药，从而减少甲硝唑所致药疹的发生。还可以将HLA-A*24:02等位基因作为靶点来筛选治疗甲硝唑所致药疹药物，以靶向作用于HLA-A*24:02分子，从而阻断其在发病中与甲硝唑或其代谢产物之间的相互作用。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、HLA-A*24:02等位基因是甲硝唑所致药疹的风险遗传标记

一、样本

样本为人的外周血，包括甲硝唑所致药疹样本、甲硝唑耐药者样本和健康对照样本。

1、甲硝唑所致药疹组

15例甲硝唑所致药疹患者(药疹组)；患者平均年龄43.80±14.84岁，男女比例为2：13；甲硝唑药物潜伏期7.21±5.07天(1-15天)。患者使用甲硝唑的主要途径为口服(10例)，其次为外用(3例)，再次为静脉注射(2例)。

患者的临床表现普通型药疹，其中10例为荨麻疹型药疹，表现为泛发的风团样皮疹，24小时内难以消退；3例为发疹型，表现为泛发红斑/斑疹，可为猩红热样或麻疹样；1例为固定型药疹，表现为局部靶形红斑；1例为多形红斑型药疹，表现为泛发靶形红斑。具体患者临床信息见下表1。

2、临床对照组

45例接受甲硝唑治疗三个月及以上未出现任何不良反应者作为临床对照组(耐受组)。耐受组基本资料与药疹组相比较未见统计学意义。

3、健康对照组

283例健康中国汉族人群,均来自human MHC database(dbMHC)的健康人群，均未进行甲硝唑治疗。

二、HLA-A*24:02等位基因检测

1、等位基因HLA-A*24:02的发现

取甲硝唑所致药疹组、临床对照组和健康对照组各对象血液300μl，提取基因组DNA。采用PCR-SSO法(SSO Typing Tests(人类白细胞抗原-DNA分型试剂盒(序列特异性寡核苷酸探针法))，One Lambda,Inc.,望岚达公司)对甲硝唑所致药疹组、临床对照组和健康对照组各对象进行HLA基因的分型，操作步骤按照试剂盒说明书进行。其原理是先对HLA的多态区域进行扩增,在扩增过程中对PCR产物进行同位素或非同位素标记,然后针对PCR扩增产物根据碱基配对原则设计系列寡核苷酸探针固定在膜上,最后将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影根据信号判断结果，根据试剂盒标准步骤进行HLA基因分型(即将DNA样本、底物、Taq酶、引物混合后混匀，加入扩增板中，按试剂盒说明书中条件扩增，扩增产物进行杂交、染色和读板)。结果分析通过HLA Fusion软件(One lambda,CA,USA,HLAFusion 3.0)进行。

药疹组的HLA分型结果如表1所示，可以看出，药疹组的HLA分型主要为HLA-A*24:02；因此等位基因HLA-A*24:02可能可以作为判断甲硝唑药疹患者的标记物，HLA-A*24:02等位基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示。

表1、甲硝唑药疹组的基本资料和HLA分型结果

表1中，U表示使用剂量不详；静脉表示静脉注射；F表示女性，M表示男性。

2、等位基因HLA-A*24:02与甲硝唑所致药疹的关系分析

计算各组的HLA-A*24:02的携带频率(携带频率＝各组人群中携带该等位基因的人数/该组总人数×100％)；将甲硝唑所致药疹组患者HLA-A*24:02的携带频率与临床对照组及健康对照组中的相关HLA等位基因携带频率进行比较。利用SPSS16.0计算比值比(OddsRatio，OR)及其95％的可信区间，必要时使用Haldane’s校正，选用卡方检验进行统计学分析，统计学的显著性水平设定为P小于0.05。

结果如表2所示，可以看出，甲硝唑所致药疹组中HLA-A*24:02的携带频率与两对照组相比均显著增高。HLA-A*24:02等位基因在药疹组与两对照组的OR值均不同程度地大于1，表示该两个等位基因为甲硝唑所致药疹的危险因素。

表2为HLA I类等位基因在甲硝唑药疹组和两个对照组中的比较

注：表2中，n为各组样本人数。第2-4列中，括号外的数字是携带该等位基因的样本人数，括号内的数字是该等位基因的携带频率(百分比)。第5-8列中，P值代表甲硝唑所致药疹组中HLA-A*24:02的携带频率与临床对照组及健康对照组的统计学差异结果，^*P<0.05，具有统计学差异。OR值代表HLA-A*24:02的携带频率在甲硝唑所致药疹组与两对照组中的比值比(odds ratio)，括号内为比值比95％可信区间。

上述结果可以看出，以进行甲硝唑治疗的人为研究对象，携带HLA-A*24:02等位基因的人出现药疹的风险增加，相对危险度为7.56，置信水平0.95上的置信区间是(2.02-28.35)。具有HLA-A*24:02等位基因的人，其使用甲硝唑后出现药疹的风险，是普通健康人的5.80倍，置信水平0.95上的置信区间是(1.80-18.72)。

可通过检测需用甲硝唑治疗的待测患者的HLA基因是否具有等位基因HLA-A*24:02来预测该待测患者是否出现药疹，具有HLA-A*24:02等位基因的待测患者比不具有HLA-A*24:02等位基因的待测患者在接受甲硝唑治疗后出现药疹的风险大。

基于检测结果可以有助于风险预测，具有HLA-A*24:02的个体，如用甲硝唑治疗可能出现药疹，对于该类个体建议使用其他药物替代治疗。不具有HLA-A*24:02个体，甲硝唑治疗后发生药疹的可能性较低，可以酌情选择使用。

<110> 复旦大学附属华山医院、复旦大学

<120> HLA-A*24:02等位基因在检测人发生甲硝唑所致药疹风险中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggccct ggccctgacc 60

cagacctggg caggctccca ctccatgagg tatttctcca catccgtgtc ccggcccggc 120

cgcggggagc cccgcttcat cgccgtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180

gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240

ccggagtatt gggacgagga gacagggaaa gtgaaggccc actcacagac tgaccgagag 300

aacctgcgga tcgcgctccg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccctccag 360

atgatgtttg gctgcgacgt ggggtcggac gggcgcttcc tccgcgggta ccaccagtac 420

gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480

gacatggcgg ctcagatcac caagcgcaag tgggaggcgg cccatgtggc ggagcagcag 540

agagcctacc tggagggcac gtgcgtggac gggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600

gagacgctgc agcgcacgga cccccccaag acacatatga cccaccaccc catctctgac 660

catgaggcca ctctgagatg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc 720

tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc ttgtggagac caggcctgca 780

ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtac cttctggaga ggagcagaga 840

tacacctgcc atgtgcagca tgagggtctg cccaagcccc tcaccctgag atgggagcca 900

tcttcccagc ccaccgtccc catcgtgggc atcattgctg gcctggttct ccttggagct 960

gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg atgtggagga ggaacagctc agatagaaaa 1020

ggagggagct actctcaggc tgcaagcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc 1080

acagcttgta aagtgtga 1098

Claims (9)

1.检测人HLA-A*24:02等位基因的物质在制备检测或评价人发生应答于甲硝唑的药物不良反应风险的产品中的应用。

2.检测人HLA-A*24:02等位基因的物质在制备检测或评价人发生甲硝唑所致药疹风险的产品中的应用。

3.检测人HLA-A*24:02等位基因的物质在制备筛查甲硝唑所致药疹产品中的应用。

4.检测人HLA-A*24:02等位基因的物质在制备检测甲硝唑所致药疹易感性产品中的应用。

5.含有检测人HLA-A*24:02等位基因的物质的产品，为a)-d)中的任一种产品：

a)检测或评价人发生应答于甲硝唑的药物不良反应风险的产品；

b)检测或评价人发生甲硝唑所致药疹风险的产品；

c)筛查甲硝唑所致药疹产品；

d)检测甲硝唑所致药疹易感性产品。

6.检测或评价人发生应答于甲硝唑的药物不良反应风险的方法，包括检测人是否具有HLA-A*24:02等位基因，其中，具有HLA-A*24:02等位基因的人使用甲硝唑后发生应答于甲硝唑的药物不良反应风险高于不具有HLA-A*24:02等位基因的人。

7.检测或评价人发生甲硝唑药疹风险的方法，包括检测人是否具有HLA-A*24:02等位基因，其中，具有HLA-A*24:02等位基因的人使用甲硝唑后发生甲硝唑药疹风险高于不具有HLA-A*24:02等位基因的人。

8.一种开发治疗应答于甲硝唑的药物不良反应药物的方法，包括使用HLA-A*24:02等位基因作为靶点的测定法来鉴别和/或筛选治疗应答于甲硝唑的药物不良反应药物。

9.一种开发治疗甲硝唑所致药疹药物的方法，包括使用HLA-A*24:02等位基因作为靶点的测定法来鉴别和/或筛选治疗甲硝唑所致药疹药物。