CN101113466A - 甲亢疾病的易感基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和医学领域，公开了一种UGRP1(子宫球蛋白相关蛋白1)的用途，用于(i)制备用于甲亢分型的试剂或试剂盒；(ii)制备检测UGRP1的变异形式的试剂或试剂盒；(iii)选择治疗甲亢药物的标志；或(iv)筛选治疗甲亢的药物。本发明首次发现并证实UGRP1基因与甲亢疾病的密切相关性，从而为甲亢疾病的诊断与治疗提供了新的途径。

Description

甲亢疾病的易感基因及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及人UGRP1基因启动子区域的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)及其与甲亢疾病的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。

背景技术

弥漫性甲状腺肿伴甲亢(Graves病)为甲亢最常见的一种类型。甲状腺功能亢进症(Hyperthyroidism，简称甲亢)系指由多种病因导致甲状腺激素(TH)分泌过多引起的临床综合征。甲亢的病人较复杂，其中以Graves病(GD)最多见。Graves病是一种伴甲状腺激素分泌增多的、器官特异性自身免疫性疾病，它是机体的免疫系统功能亢进，从而产生抗自身甲状腺的抗体(免疫球蛋白)而引起的，这种特异性的抗体刺激甲状腺增生、并使其分泌大量的甲状腺激素。一般Graves病多见于女性，男女患病率之比为1∶4～7，特别是青春发育期、妊娠期和更年前期。

经研究，Graves病是一种常见的多基因疾病，是一种器官特异性自身免疫疾病，其发病具有较强的遗传基础。Graves病的发病原因被认为是由多种易感基因和环境因素共同造成的。已经发现人白细胞抗原(HLA)-II基因、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)基因，促甲状腺受体(TSH-R)基因和甲状腺球蛋白(Tg)基因等多个基因与Graves病存在一定的联系。此外，还有其它的免疫相关基因，如白介素-1受体拮抗基因、肿瘤坏死因子β基因和甲状腺过氧化物酶基因等，但很多结果存在争议。

在以往的工作中，通过在56个汉族Graves病人中进行全基因组筛查，发现在5q31的marker D5S436附近有很强的Lod值，随后在这一区域使用排列更紧密的marker进行分析，D5S2090处的Lod值达到了4.31(参见Jin Y等，Genome-widescan of Graves′disease：evidence for linkage on chromosome 5q31 in Chinese Hanpedigrees.Clin Endocrinol Metab.2003 Apr；88(4)：1798-803)。

此外，有文献报道，一个日本的研究小组在对AITD(自身免疫性甲状腺疾病，包括Graves病和乔本氏甲状腺炎)进行遗传定位时也将易感区段定位在D5S436(参见Sakai K等，Identification of susceptibility loci for autoimmunethyroid disease to 5q31-q33 and Hashimoto′s thyroiditis to 8q23-q24 by multipointaffected sib-pair linkage analysis in Japanese.Hum Mol Genet.2001 Jun15；10(1 3)：1379-86)。因此，这一区段很可能包含一个亚洲人群中比较显著的Graves病易感基因，这也成为本发明人进行定位克隆时首先考虑的部位。

由于自身免疫性疾病本身的复杂性、多个基因之间的相互作用，以及环境因素对疾病发展的影响，使易感基因的确定十分困难。因此，本领域迫切需要进行进一步的研究，以找到导致Graves病发生和发展的易感基因，并研究和开发出可用于诊断和检测Graves病的试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

本发明人在研究中发现，UGRP1基因与甲亢(尤其是弥漫性甲状腺肿伴甲亢(Graves病))的发生和发展密切相关。因此，本发明的一个目的是提供UGRP1蛋白的用途，用于制备检测甲亢的试剂或试剂盒、用于制备检测UGRP1的变异形式的试剂或试剂盒、用于筛选治疗甲亢的药物。

本发明的另一目的是提供一种分型和/或鉴别诊断(尤其是早期监测或诊断)甲亢的方法。

本发明的另一目的是提供一种筛选甲亢药物以及评判甲亢药物的疗效的方法。

在本发明的第一方面，提供一种UGRP1基因或其蛋白的用途，用于(i)制备用于甲亢分型或检测甲亢的试剂或试剂盒；(ii)制备检测UGRP1的变异形式的试剂或试剂盒；(iii)选择治疗甲亢药物的标志；或(iv)筛选治疗甲亢的药物。

在本发明的一个优选例中，所述的甲亢是UGRP1蛋白表达改变相关的甲亢。

在本发明的另一优选例中，所述的甲亢为Graves病。

在本发明的另一优选例中，所述的试剂是引物和/或探针。

在本发明的另一优选例中，所述的变异形式选自下组：

UGRP1基因第-112位，G→A；(P1)

UGRP1基因第-623至-622位，AG→T；(P2)

UGRP1基因第-718位，G→A；(P3)

UGRP1基因第-1351位，G→A；(P5)

UGRP1基因第+222位，C→A；(I1-1)

UGRP1基因第+271位，T del(T缺失)；(I1-2)

UGRP1基因第+3337位，G→A；(E3-1)

UGRP1基因第-1664位，A→T；(P6)或

UGRP1基因第-1301至-1303位，AAA del(T缺失)；(P4)

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

在本发明的另一优选例中，所述的变异形式选自：

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG→T；(P2)或

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-718位G→A(P3)。

在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒用于检测UGRP1基因的表达是否改变。

在本发明的第二方面，提供一种体外检测UGRP1基因或转录本是否存在核苷酸变异的方法，所述的方法包括以下步骤：

检测该个体的UGRP1基因、和/或转录本，并与正常的UGRP1基因、和/或转录本相比较，存在以下变异形式就表明该个体的UGRP1基因、和/或转录本存在核苷酸变异：

UGRP1基因第-112位，G→A；(P1)

UGRP1基因第-623至-622位，AG→T；(P2)

UGRP1基因第-718位，G→A；(P3)

UGRP1基因第-1351位，G→A；(P5)

UGRP1基因第+222位，C→A；(I1-1)

UGRP1基因第+271位，T del(T缺失)；(I1-2)

UGRP1基因第+3337位，G→A；(E3-1)

UGRP1基因第-1664位，A→T；(P6)或

UGRP1基因第-1301至-1303位，AAA DEL(T缺失)；(P4)

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

在本发明的另一优选例中，所述的变异形式选自：

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG→T；(P2)或

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-718位G→A(P3)。

在本发明的另一优选例中，检测的是UGRP1的基因的核苷酸序列，并与正常UGRP1基因的核苷酸序列比较差异。

在本发明的第三方面，提供一种检测样品中是否存在UGRP1基因变异的方法，包括以下步骤：

(1)用UGRP1基因特异性引物扩增样品中的UGRP1基因，得到扩增产物；以及

(2)检测扩增产物中是否存在选自下组的变异形式：

UGRP1基因第-112位，G→A；(P1)

UGRP1基因第-623至-622位，AG→T；(P2)

UGRP1基因第-718位，G→A；(P3)

UGRP1基因第-1351位，G→A；(P5)

UGRP1基因第+222位，C→A；(I1-1)

UGRP1基因第+271位，T del(缺失)；(I1-2)

UGRP1基因第+3337位，G→A；(E3-1)

UGRP1基因第-1664位，A→T；(P6)或

UGRP1基因第-1301至-1303位，AAA DEL(T缺失)；(P4)

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM 054023。

在本发明的另一优选例中，所述的变异形式选自：

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG→T；(P2)或

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-718位G→A(P3)。

在本发明的第四方面，提供一种对个体的甲亢患者进行分型的方法，所述方法包括：

检测该个体的UGRP1基因、和/或转录本，并与正常的UGRP1基因、和/或转录本相比较，存在以下变异形式就表明该个体是UGRP1基因相关的甲亢患者：

UGRP1基因第-112位，G→A；(P1)

UGRP1基因第-623至-622位，AG→T；(P2)

UGRP1基因第-718位，G→A；(P3)

UGRP1基因第-1351位，G→A；(P5)

UGRP1基因第+222位，C→A；(I1-1)

UGRP1基因第+271位，T del(T缺失)；(I1-2)

UGRP1基因第+3337位，G→A；(E3-1)

UGRP1基因第-1664位，A→T；(P6)或

UGRP1基因第-1301至-1303位，AAA DEL(T缺失)；(P4)

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

在本发明的另一优选例中，所述的变异形式选自：

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG→T；(P2)或

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-718位G→A(P3)。

在本发明的第五方面，提供一种检测甲亢的试剂盒，它包括特异性扩增UGRP1基因、或转录本的引物。

在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒中还包括选自下组的试剂：

(a)与变异部位结合的探针；和

(b)识别变异位点的限制性内切酶。

在本发明的另一优选例中，所述的变异选自：

UGRP1基因第-112位，G→A；(P1)

UGRP1基因第-623--622位，AG→T；(P2)

UGRP1基因第-718位，G→A；(P3)

UGRP1基因第-1351位，G→A；(P5)

UGRP1基因第+222位，C→A；(I1-1)

UGRP1基因第+271位，T del；(I1-2)

UGRP1基因第+3337位，G→A(E3-1)。

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

在另一优选例中，所述的变异形式选自：

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG→T；(P2)或

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-718位G→A(P3)。

在本发明的第六方面，提供一种筛选调节UGRP1蛋白表达的药物的方法，包括以下步骤：

(a)在测试组中，向表达UGRP1蛋白的体系中添加待筛选的候选物，并检测UGRP1蛋白的表达情况；

(b)将步骤(a)测试组中UGRP1蛋白的表达情况与未添加候选物的对照组中UGRP1蛋白的表达情况进行比较；

如果测试组中UGRP1蛋白的表达在统计学上高于对照组，就表明该候选物是促进UGRP1蛋白表达的药物；如果测试组中UGRP1蛋白的表达在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制UGRP1蛋白表达的药物。

在本发明的另一优选例中，所述的表达UGRP1蛋白的体系为由野生型UGRP1基因表达UGRP1蛋白的体系；或为由带有变异形式的UGRP1基因表达UGRP1蛋白的体系，所述的变异形式选自：

UGRP1基因第-112位，G→A；(P1)

UGRP1基因第-623--622位，AG→T；(P2)

UGRP1基因第-718位，G→A；(P3)

UGRP1基因第-1351位，G→A；(P5)

UGRP1基因第+222位，C→A；(I1-1)

UGRP1基因第+271位，T del；(I1-2)

UGRP1基因第+3337位，G→A(E3-1)。

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

在另一优选例中，所述的变异形式选自：

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-623至-622位AG→T；(P2)或

UGRP1基因第-112位G→A(P1)和UGRP1基因第-718位G→A(P3)。

在本发明的另一优选例中，所述的促进UGRP1蛋白表达的药物为治疗甲亢的药物。

较佳地，所述的表达UGRP1蛋白的体系包括但不限于：原核细胞，真核细胞，或动物模型。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了UGRP1的受体在各种组织中的表达状况。

其中，图1A显示了小鼠的表达谱；图1B显示了人的表达谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次发现UGRP1基因表达水平的改变与甲亢(特别是Graves病)密切相关。具体地，UGRP1基因的下调与与甲亢(特别是Graves病)密切相关。因此可以通过检测UGRP1的表达情况来辅助性诊断甲亢或对甲亢进行分型。

进一步地，本发明人还提供了一些UGRP1基因的变异形式，这些变异形式与甲亢存在显著的相关性。

因此，基于本发明人的新发现，可以利用UGRP1基因或其蛋白：(i)进行甲亢的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的甲亢治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群甲亢患病风险，早期监测早期预防；(iv)筛选改变UGRP1表达水平的药物，结合UGRP1基因的多态性来特异性治疗相关类型的甲亢。

UGRP1基因(子宫球蛋白相关蛋白1，UteroGlobin-Related Protein 1)是一种新近发现的基因，人的UGRP1基因定位于5q31-5q34，主要表达在肺脏。UGRP1基因的功能目前还很不明确，由于多种自身免疫性疾病的候选区域定位于5q31-34附近，其与哮喘关联已有许多报道。但是目前尚没有人发现UGRP1基因与甲亢的相关性。

UGRP1基因的总长度为3480bp，其基本序列在GenBank上的登录号为NM_054023，UGRP1基因的CDS全长282bp，编码一条含有93个氨基酸的蛋白。可通过GenBank登录号NM_054023引申地找到UGRP1基因的内含子、启动子等序列，具体可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

本发明人通过对于来自不同地区的数百个甲亢病例(Graves病)进行了深入的研究，并与正常对照进行比较，证实甲亢样本与正常样本的差异位点最多且差异最显著的位点都位于UGRP1基因上，从而有力地证实了UGRP1基因与甲亢的(特别是Graves病)相关性。所述的差异包括以下变异形式的一种或多种：

UGRP1基因第-112位，G→A；(P1)

UGRP1基因第-623至-622位，AG→T；(P2)

UGRP1基因第-718位，G→A；(P3)

UGRP1基因第-1351位，G→A；(P5)

UGRP1基因第+222位，C→A；(I1-1)

UGRP1基因第+271位，T del(T缺失)；(I1-2)

UGRP1基因第+3337位，G→A；(E3-1)

UGRP1基因第-1664位，A→T；(P6)或

UGRP1基因第-1301至-1303位，AAA DEL(T缺失)；(P4)

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

进一步的，本发明人的研究结果显示，统计学差异最明显的单倍型都包含UGRP1基因上的P1+P2两个SNP或P1+P3两个SNP，证实这两种单倍型与Graves病的发生密切相关。

本发明人通过荧光素酶(Luceferase)试验观查启动子区域的改变对UGRP1基因表达的影响，证实含有这两种单倍型变化的质粒其发光值明显下降，有统计学差异。这说明，相对于正常的启动子序列，含有P1+P2、P1+P3单倍型的启动子对下游的基因转录有抑制作用。

本发明人通过实时PCR(Real-time PCR)分析发现，当样本的启动子区域含有P1+P2或P1+P3单倍型时，其UGRP1基因的表达量相对于启动子区P1-P3位点均正常的样本有明显的下降。

另外，本发明人通过Northern印迹和RT-PCR试验发现，UGRP1的受体在很多免疫相关的组织都有表达，这进一步提示UGRP1基因与Graves病这种自身免疫疾病有很强的相关性。

通过上述研究，本发明人证实了UGRP1基因与甲亢的相关性，并且甲亢的发生和/或发展与UGRP1基因的单核苷酸多态性相关。因此，基于这种相关性可进行甲亢患者的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析。比如，可分离出由UGRP1基因表达异常而导致甲亢的人群，从而可进行更有针对性地治疗；更进一步地，可从UGRP1基因表达异常的甲亢人群中分离出具有不同UGRP1基因SNP位点的患者，从而可实现更精确的治疗。

基于上述的相关性以及甲亢的分型，可针对性地评估相关人群的甲亢治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法，从而避免盲目给药或盲目治疗。

基于上述的相关性以及UGRP1基因的单核苷酸多态性位点，可早期评估相关人群甲亢患病风险，从而可实现早期监测、早期预防。

基于上述的相关性，还可筛选改变UGRP1表达水平的药物，结合UGRP1基因的多态性来特异性治疗相关类型的甲亢。

基于本发明的新发现，UGRP1基因或蛋白有着多方面的潜在新用途。这些潜在用途包括(但不限于)：直接作为药物治疗UGRP1蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如Graves病)，和用于筛选调节(特别是促进)UGRP1蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人UGRP1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人UGRP1蛋白功能的多肽分子。

正常的UGRP1蛋白可直接用于疾病治疗因UGRP1不表达或表达下降所导致的疾病，例如，可用于甲亢治疗。在使用本发明UGRP1蛋白时，还可同时使用其他治疗甲亢的药剂。

利用本发明UGRP1蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与UGRP1蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明UGRP1蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。

人UGRP1蛋白的多聚核苷酸可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于UGRP1蛋白的无表达或异常/无活性的UGRP1蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带UGRP1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献。另外重组人UGRP1基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明UGRP1蛋白或调节UGRP1蛋白表达的调节剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的蛋白还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的UGRP1蛋白或调节UGRP1蛋白表达的调节剂(如激动剂)施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约1 00微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明还涉及定量和定位检测人UGRP1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，如包括FISH测定和/或放射免疫测定。

一种检测检测样品中是否存在UGRP1蛋白的方法是利用UGRP1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与UGRP1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在UGRP1蛋白。通过所述的方法还可定量检测UGRP1蛋白。

抗人UGRP1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人UGRP1蛋白。一种优选的抗UGRP1抗体是不识别正常UGRP1但识别变异UGRP1(如在UGRP1基因的-112位上所发生的G→A的突变)的抗体，或者识别正常UGRP1但不识别突变UGRP1的抗体。利用该抗体对正常和异常UGRP1蛋白的特异性差异，可以方便地进行蛋白质水平的甲亢易感性检测或甲亢分型。

UGRP1蛋白的多聚核苷酸可用于UGRP1蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，UGRP1蛋白的多聚核苷酸可用于检测UGRP1蛋白的表达与否或在疾病状态下UGRP1蛋白的异常表达。如UGRP1 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断UGRP1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法、Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用UGRP1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测UGRP1蛋白的转录产物。

检测UGRP1基因的变异也可用于诊断甲亢。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。UGRP1蛋白突变的形式包括与正常野生型UGRP1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。一类优选的突变是表1所示的SNP。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明还包括可用于检测甲亢疾病的试剂盒，所述的试剂盒中可包括特异性扩增UGRP基因或转录本的引物。更优选的，它还含有选自下组的试剂：(a)与UGRP1基因的突变部位结合的探针；(b)识别UGRP1基因的突变位点的限制性内切酶。

在本发明的另一种优选方式中，所述的试剂盒中可包括：特异性与UGRP1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。更优选的，所述试剂盒中还包括常规的可用于检测抗原抗体结合状况的试剂。

本发明的主要优点在于：

(1)首次发现并证实UGRP1基因与甲亢疾病(特别是Graves病)的密切相关性，从而为甲亢疾病的诊断与治疗提供了新的途径。

(2)首次发现了UGRP1基因的新功能，即UGRP1基因表达的下降将导致甲亢的发生，从而为甲亢药物的进一步开发提供了一种良好的靶点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.通用材料和方法

本发明具体实施方式中使用到以下的材料和方法，以下方法和实施例中使用的各种材料试剂等都是作为进一步例证和解释本发明的工具和手段，而并非用于对本发明的限制。

并且，常规的DNA抽提、序列测定、PCR、细胞培养、转染等操作是本领域现有技术人员所熟知的，在本发明中不作详细描述。

1.样本采集

为了提高单核苷酸多态性(SNP)检测的代表性和效力，DNA样本取自数百名对象，他们分别来自我国两个不同的地区：山东、上海。

所有的山东和上海的样本均由当地医院采集，甲亢患者均按一般临床诊断标准确定，对照为体检的正常人。每个样本收集5ml的血样，采用常规的酚-氯仿法抽提DNA。

2.SNP鉴别

3.0 MB区段内的29个SNP和1.0MB区段内的39个SNP位点均选择NCBI的dbSNP数据库，1.0MB区段内的位于基因外显子和启动子区的51个SNP采用ABI公司的3700测序仪测序得到。

对所有山东和上海样本的测序是通过MassArray公司的Sequenom仪器完成。

3.关联分析

病例-对照研究通过Spss V11.0软件(购自SPSS公司)进行卡方检验，以P＜0.05认为是具有统计学差异。

单倍型分析采用PHASE软件，版本2.1；具体出处可参见http://www.stat.washington.edu/stephens/instruct2.1.pdf。

4.细胞培养、转染、荧光素酶试验

采用常规的方法，通过采用含有相应的多态位点的基因组DNA为模板进行PCR扩增，并结合重叠延伸产生特定位点诱变的方法来构建含有P1+P2、P1+P3单倍型的启动子。

将上述含有P1+P2、P1+P3单倍型的启动子构建入pGL3-Basic质粒(购自Promega公司)的多克隆位点中，并以pRL-SV40质粒(购自Promega公司)为阴性对照。

采用Invitrogen公司的Lipofectamine2000试剂瞬时转染，36小时后使用Promega公司的Dual Luciferase Reporter Assay System进行检测。

5.实时PCR分析

收集93例人甲状腺组织，测序，按启动子区是否含有P1+P2、P1+P3单倍型或P1～P3位点均为正常进行分型(共有11例样本含有P1+P2单倍型，5例含有P1+P3单倍型，16例P1～P3位点均为正常)。

采用常规的方法，设计Taqman探针，进行实时PCR检测，结果显示含有这两种单倍型的样本UGRP1的表达量比正常对照有明显的下降。

II.具体实施例

实施例1 UGRP1基因多态性的初步确定

本发明人选择了包括最高Lod值D5S2090处Lod值下降1.5所包含的3.0MB区域D5s436-D5s413(Lod值下降1.5，其所涵盖的区段含有易感位点的可能性大于99％)。这一区段包括25个基因，本发明人按照每100Kb选择一个SNP的方法，使用192个Graves病人对192个正常对照的病例-对照研究，寻找易感区段。结果，在总共的29个SNP中，有两个有统计学差异，其中Rs1368408处的P值达到8.74×10^-9。

接下来，本发明人将研究对象集中在Rs1368408附近的1.0MB(SHGC-111280-RH72492)。这一区段一共包括11个基因，本发明人使用了48个Graves病人的样本对所有这些基因的外显子和启动子区进行测序，共发现了52个SNP位点，同时对于内含子和基因间的区域，按照每5KB一个SNP位点的原则从NCBI的dbSNP数据库(NCBI Human Genome Build 34 Ver.3)共选择了39个位点。将这1.0MB区域内选择的全部9 1个SNP位点，采用MassArray Sequenom的测序方法，对从山东地区采集的所有541例病人和478例正常对照进行测序分析。

通过病例对照分析，发现一共有22个SNP位点有统计学差异，在这其中，差异位点最多且差异最显著的位点都位于UGRP1基因上：4个在启动子区(P5(-1351，G/A)，P3(-718，G/A)，P2(-623～-622，AG/T)，P1(-112，G/A))，2个在内含子(I1-1(+222，C/A)，I1-2(+271，T del))，1个在外显子区域(E3-1(+3337，G/A))，共7个位点，具体见表1。其中位于启动子区的P2位点有最明显的统计学差异(P值＝1.37×10^-8)。

表1

	位置	变异位置及其前后25个核苷酸		显著性差异或出现频率
					变异前	变异后
		P1	UGRP1基因第-112位G→A				AAGTGGAAAACCCTCCAAATTGTTTGGTGAGAAAACATAACATTTATCCCT(SEQ ID NO：7)	AAGTGGAAAACCCTCCAAATTGTTTAGTGAGAAAACATAACATTTATCCCT(SEQ ID NO：8)	4.11×10-8
P2	UGRP1基因第-623至-622位，AG→T			AAAATTGAATCCCAGGTTTTTCAAAA GACACTCTGATTTTAGATCTTAAGCC(SEQ ID NO：9)	AAAATTGAATCCCAGGTTTTTCAAATACACTCTGATTTTAGATCTTAAGCC(SEQ ID NO：10)	1.37×10-8
		P3	UGRP1基因第-718位，G→A				CCTTATGGTTGGTTGTGTTATTTATGTTCCCATTTTAGATGAGAGGACCAA(SEQ ID NO：11)	CCTTATGGTTGGTTGTGTTATTTATATTCCCATTTTAGATGAGAGGACCAA(SEQ ID NO：12)	0.00007
P5	UGRP1基因第-1351位，G→A			TTGAGGTGCATGGCAGGCATTCATGGTGTCTTTCATGTAGTTTATAAAGTA(SEQ ID NO：13)	TTGAGGTGCATGGCAGGCATTCATGATGTCTTTCATGTAGTTTATAAAGTA(SEQ ID NO：14)	0.00039

I1-1	UGRP1基因第+222位，C→A	TGTTAATAAGAGCACAACTAGTAAGCCTTGCCTCACTGACAGTGGAATATG(SEQ ID NO：15)	TGTTAATAAGAGCACAACTAGTAAGACTTGCCTCACTGACAGTGGAATATG(SEQ ID NO：16)	0.04426
					I1-2	UGRP1基因第+271位，T del(T缺失)	TGGTGGTAGGAATTGTATTTTTTTTTATTTTACTTTTAACTGACACATAAT(SEQ ID NO：17)	TGGTGGTAGGAATTGTATTTTTTTTATTTTACTTTTAACTGACACATAAT(SEQ ID NO：18)	0.00163
E3-1	UGRP1基因第+3337位，G→A	TTCAGGAGGCGCTATCACACTTGGTGTGACATCAAGATAAAGAGCGGAGGT(SEQ ID NO：19)	TTCAGGAGGCGCTATCACACTTGGTATGACATCAAGATAAAGAGCGGAGGT(SEQ ID NO：20)	0.00027

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

除此之外，在周围的其它几个基因也有一些统计学有差异的位点，但数量较少且P值较小。

以上的试验结果都通过Genomic Control进行了校正(共选择了20个中性位点作校正，卡方值的中位数等于0.5351)。

实施例2上海样本中UGRP1基因多态性的研究

进一步地，本发明人还收集了一批来自上海的样本，有120例Graves病人和380人的正常对照。

通过对同样这91个位点的病例-对照分析，发现了6个SNP位点(它们是UGRP1(P2，-623～-622)，STK32A(+108222)，SPINK5(+37390)，基因间区域(rs4705047，rs1363525，rs6895278))有统计学差异，且统计学差异最明显的位点仍然是UGRP1的P2位点。

实施例3山东样本中UGRP1基因多态性的研究

为了进行进一步地确证，本发明人对山东人群中UGRP1基因的9个SNP位点(它们是：P6(-1664)，P5(-1351)，P4(-1301～-1303)，P3(-718)，P2(-623～-622)，P1(-112)，I1-1(+222)，I1-2(+271)，E3-1(+3337))组成的单倍型进行了分析。其中，P4和P2的变异情况见表2。

表2

	位置	变异位置及其前后24-25个核苷酸
						变异前	变异后
P6	UGRP1基因第-1664位，A→T	GGCATAGAGCTTGAAATTCATTTATATATACTAAAGGAAAAACTCATAACT(SEQ ID NO：21)	GGCATAGAGCTTGAAATTCATTTATTTATACTAAAGGAAAAACTCATAACT(SEQ ID NO：22)
				P4	UGRP1基因第-1301--1303位，AAA DEL	TAGTTTATAAAGTAGCAGAAAGATAAAGAAATGACAGTTACAACATGGTAA(SEQ ID NO：23)	TAGTTTATAAAGTAGCAGAAAGATGAAATGACAGTTACAACATGGTAA(SEQ ID NO：24)

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

结果显示，统计学差异最明显的单倍型都包含P1和P2两个SNP或P1和P3两个SNP。

当把山东和上海两个人群的样本放在一起作分析时也有类似的结果。这进一步提示这两种单倍型与Graves病的发生密切相关。

实施例4 P1+P2、P1+P3单倍型的致病相关性研究

由于UGRP1基因的启动子区P1-P3位点是所有位点中统计学差异最明显的，且单倍型的分析提示P1+P2、P1+P3这两种组合与致病密切相关。

1.荧光素酶(Luceferase)试验

首先本发明人用Luceferase试验观察启动子区域的改变是否对基因的表达有影响。

本发明人构建了包含P1+P2、P1+P3单倍型以及不含SNP位点变化的正常启动子序列的报告基因系统质粒。

通过荧光素酶试验证实：含有这两种单倍型变化的质粒其发光值明显下降，有统计学差异。这说明，相对于正常的启动子序列，含有P1+P2、P1+P3单倍型的启动子对下游的基因转录有抑制作用。

2.实时PCR(Real-time PCR)分析

进一步地，本发明人还收集了93例人甲状腺组织，并采用实时PCR进行分析。

通过实时PCR分析发现，当样本的启动子区域含有P1+P2或P1+P3单倍型时，其UGRP1基因的表达量相对于启动子区P1～P3位点均正常的样本有明显的下降。

实施例5 UGRP1受体的表达状况

作为一种分泌蛋白，UGRP1的受体的定位及其作用对研究UGRP1与Graves病的关系有很强的提示作用。本实施例中，验证UGRP1的受体在各种组织中的表达状况。

本发明人通过Northern印迹和RT-PCR试验发现，UGRP1的受体在很多免疫相关的组织都有表达，所述组织包括肝脏，脾脏，胸腺等。具体见图1，其中，图1A显示了小鼠的表达谱，图1B显示了人的表达谱。

Graves病是一种自身免疫疾病，它是机体的免疫系统功能亢进造成的。由图1(图中，MACRO表示UGRP1的受体)的结果显示UGRP1的受体在很多免疫相关的组织都有特异性高表达，而在非免疫相关的组织中表达量较低。因此可见，UGRP1与Graves病这种自身免疫疾病的发生和发展有很强的相关性。

实施例6 Graves病的检测试剂盒

制备一种检测Graves病的试剂盒，其中包括如表3中所列的PCR引物：

表3

P1	正向引物	5’ATCTTACCATAGTAGATGTGTGAGTGGG 3’(SEQ ID NO：1)
			反向引物	5’ACAGTTATCTGGGATATTTTTCAGGAG 3’(SEQ ID NO：2)
	P2	正向引物			5’AGCCTTGGAAACAAATTACTACTCCTG 3’(SEQ ID NO：3)
反向引物			5’TGGAGAATCACATTAGCTGATGAAC 3’(SEQ ID NO：4)
		P3		正向引物	5’GGAATATGTGGGAGAAATGGAAG 3’(SEQ ID NO：5)
	反向引物		5’CCAACCATAAGGTGTGTAGCTTG 3’(SEQ ID NO：6)

抽取待检测对象的血液5ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将所获得DNA进行PCR扩增。PCR反应液为含Taq酶、dNTP等的常规PCR反应缓冲液。

检测扩增产物中UGRP1的多核苷酸多态性，从而确定检测对象是否患有Graves病或者其是否有患Graves病的风险。

实施例7筛选促进UGRP1蛋白表达的药物的方法

建立测试组：表达UGRP1蛋白的细胞，其中加入候选物；

建立对照组：表达UGRP1蛋白的细胞(与测试组同)，其中不加入候选物。

测试组中UGRP1蛋白的表达情况与未添加候选物的对照组中UGRP1蛋白的表达情况进行比较；如果测试组中UGRP1蛋白的表达在统计学上高于对照组(如高50％)，就表明该候选物是促进UGRP1蛋白表达的药物，从而可作为潜在的治疗甲亢的药物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属瑞金医院

<120>甲亢疾病的易感基因及其应用

<130>062425

<160>24

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

atcttaccat agtagatgtg tgagtggg    28

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

acagttatct gggatatttt tcaggag    27

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

agccttggaa acaaattact actcctg    27

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

tggagaatca cattagctga tgaac                               25

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

ggaatatgtg ggagaaatgg aag                                 23

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

ccaaccataa ggtgtgtagc ttg                                   23

<210>7

<211>51

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>7

aagtggaaaa ccctccaaat tgtttggtga gaaaacataa catttatccc t    51

<210>8

<211>51

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>8

aagtggaaaa ccctccaaat tgtttagtga gaaaacataa catttatccc t    51

<210>9

<211>52

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>9

aaaattgaat cccaggtttt tcaaaagaca ctctgatttt agatcttaag cc    52

<210>10

<211>51

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>10

aaaattgaat cccaggtttt tcaaatacac tctgatttta gatcttaagc c    51

<210>11

<211>51

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>11

ccttatggtt ggttgtgtta tttatgttcc cattttagat gagaggacca a    51

<210>12

<211>51

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>12

ccttatggtt ggttgtgtta tttatattcc cattttagat gagaggacca a    51

<210>13

<211>51

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>13

ttgaggtgca tggcaggcat tcatggtgtc tttcatgtag tttataaagt a    51

<210>14

<211>51

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>14

ttgaggtgca tggcaggcat tcatgatgtc tttcatgtag tttataaagt a    51

<210>15

<211>51

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>15

tgttaataag agcacaacta gtaagccttg cctcactgac agtggaatat g    51

<210>16

<211>51

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>16

tgttaataag agcacaacta gtaagacttg cctcactgac agtggaatat g    51

<210>17

<211>51

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>17

tggtggtagg aattgtattt ttttttattt tacttttaac tgacacataa t    51

<210>18

<211>50

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>18

tggtggtagg aattgtattt tttttatttt acttttaact gacacataat      50

<210>19

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ttcaggaggc gctatcacac ttggtgtgac atcaagataa agagcggagg t    51

<210>20

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<213>Homo sapiens

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ttcaggaggc gctatcacac ttggtatgac atcaagataa agagcggagg t    51

<210>21

<211>51

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>21

ggcatagagc ttgaaattca tttatatata ctaaaggaaa aactcataac t    51

<210>22

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>22

ggcatagagc ttgaaattca tttatttata ctaaaggaaa aactcataac t    51

<210>23

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>23

tagtttataa agtagcagaa agataaagaa atgacagtta caacatggta a    51

<210>24

<211>48

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>24

tagtttataa agtagcagaa agatgaaatg acagttacaa catggtaa        48

Claims (10)

1.一种UGRP1基因或其蛋白的用途，其特征在于，用于(i)制备用于甲亢分型或检测甲亢的试剂或试剂盒；(ii)制备检测UGRP1的变异形式的试剂或试剂盒；(iii)选择治疗甲亢药物的标志；或(iv)筛选治疗甲亢的药物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的甲亢是UGRP1表达改变相关的甲亢。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的变异形式选自下组：

UGRP1基因第-112位，G→A；

UGRP1基因第-623至-622位，AG→T；

UGRP1基因第-718位，G→A；

UGRP1基因第-1351位，G→A；

UGRP1基因第+222位，C→A；

UGRP1基因第+271位，T del；

UGRP1基因第+3337位，G→A；

UGRP1基因第-1664位，A→T；或

UGRP1基因第-1301至-1303位，AAA DEL；

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

4.一种体外检测UGRP1基因或转录本是否存在核苷酸变异的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

检测该个体的UGRP1基因、和/或转录本，并与正常的UGRP1基因、和/或转录本相比较，存在以下变异形式就表明该个体的UGRP1基因、和/或转录本存在核苷酸变异：

UGRP1基因第-112位，G→A；

UGRP1基因第-623至-622位，AG→T；

UGRP1基因第-718位，G→A；

UGRP1基因第-1351位，G→A；

UGRP1基因第+222位，C→A；

UGRP1基因第+271位，T del；

UGRP1基因第+3337位，G→A；

UGRP1基因第-1664位，A→T；或

UGRP1基因第-1301至-1303位，AAA DEL；

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，检测的是UGRP1的基因的核苷酸序列，并与正常UGRP1基因的核苷酸序列比较差异。

6.一种检测样品中是否存在UGRP1基因变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用UGRP1基因特异性引物扩增样品中的UGRP1基因，得到扩增产物；以及

(2)检测扩增产物中是否存在选自下组的变异形式：

UGRP1基因第-112位，G→A；

UGRP1基因第-623至-622位，AG→T；

UGRP1基因第-718位，G→A；

UGRP1基因第-1351位，G→A；

UGRP1基因第+222位，C→A；

UGRP1基因第+271位，T del；

UGRP1基因第+3337位，G→A；

UGRP1基因第-1664位，A→T；或

UGRP1基因第-1301至-1303位，AAA DEL；

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

7.一种对个体的甲亢患者进行分型的方法，其特征在于，所述方法包括：

检测该个体的UGRP1基因、和/或转录本，并与正常的UGRP1基因、和/或转录本相比较，存在以下变异形式就表明该个体是UGRP1基因相关的甲亢患者：

UGRP1基因第-112位，G→A和UGRP1基因第-623至-622位，AG→T；或

UGRP1基因第-112位，G→A和UGRP1基因第-718位，G→A；

其中，核苷酸位置编号基于GenBank登录号：NM_054023。

8.一种检测甲亢的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增UGRP1基因、或转录本的引物。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括选自下组的试剂：

(a)与变异部位结合的探针；和

(b)识别变异位点的限制性内切酶。

10.一种筛选调节UGRP1蛋白表达的药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)在测试组中，向表达UGRP1蛋白的体系中添加待筛选的候选物，并检测UGRP1蛋白的表达情况；

(b)将步骤(a)测试组中UGRP1蛋白的表达情况与未添加候选物的对照组中UGRP1蛋白的表达情况进行比较；

如果测试组中UGRP1蛋白的表达在统计学上高于对照组，就表明该候选物是促进UGRP1蛋白表达的药物；如果测试组中UGRP1蛋白的表达在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制UGRP1蛋白表达的药物。

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