CN104789644A - X染色体变异对甲亢易感性影响的检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及X染色体变异对甲亢易感性影响的检测方法和试剂盒。本发明的试剂盒包括特异性扩增GPR174基因或其5’非翻译区或转录本的引物，其中，所述引物扩增出的产物含有SEQ ID NO：1的第265位和/或第282位。与正常人群相比，若所检测的GPR174基因在对应于SEQ ID NO：1的第265位和/或282位存在变异，则表明该个体患甲亢或患可能性大于正常人群。本发明也涉及SEQ ID NO：2和3所示的引物在制备用于辅助诊断甲亢或检测甲亢易感性的试剂盒中的应用。

Description

X染色体变异对甲亢易感性影响的检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及X染色体变异对甲亢易感性影响的检测方法和试剂盒。

背景技术

Graves’病（Graves’disease，GD），又称毒性弥漫性甲状腺肿伴甲亢，通常称为甲亢，是一种甲状腺激素（TH）分泌增多的、遗传与环境共同起作用导致的器官特异性自身免疫性疾病，是甲状腺功能亢进的最常见病因。甲亢临床上的典型特征包括弥漫性甲状腺肿、甲状腺功能亢进的系列表现、眼症以及胫前黏液水肿和指端粗厚。甲亢在临床上目前为免疫内分泌主要疾病之一，甲亢所引起的心衰、甲状腺危象的发生，常危及患者生命，致疾病预后不良。最近的调查显示中国人群的发病率为0.25～1.09%，估计患者约有1300万。亚洲人群的发病率较欧美和非洲人群发病率略高。

同胞对研究显示，同卵双胞胎患甲亢的一致率达36%，异卵双胞胎患病率为3%，甲亢发病的所有影响因素中遗传的比重占79%〔Brix,T.H.,Kyvik,K.O.,Christensen,K.&Hegedus,L.Evidence for a major role of heredity inGraves'disease:a population-based study of two Danish twin cohorts.J Clin Endocrinol Metab86,930-4(2001)〕。遗传因素在甲亢的发病机制中具有重要的作用。

甲亢的发病率存在着明显的男女差异。好发于生育年龄的女性，女性发病率大约是男性的5-10倍。在Turner综合征患者中甲亢的发病率很高，而Turner综合征是由于X染色体缺失或有其他异常导致的。研究也发现甲亢患者体内X染色体失活偏移发生率显著高于同年龄段的健康个体。这些现象一致提示X染色对甲亢发病有重要的影响。

近年来，单核苷酸变异(SNP)概念在多基因疾病研究中的广泛运用，同时，高通量、低成本的SNP检测手段的不断出现也为SNP大规模快速分型提供了可能。这为在分子水平上研究甲亢的发生和发展的机制开辟了全新的思路和手段。SNP的存在与否以及等位基因频率存在人种及地域的差异，这就提示多基因疾病遗传异质性的存在，即同一疾病或性状在不同的人群中可能是不同的遗传因素造成的。另外，不同人群中SNP类型和频率存在的这种差异也与不同人群对药物及环境因素的反应性不同密切相关。

甲亢作为一种遗传因素起较大作用的疾病，寻找易感基因进而阐明其遗传机制已经成为目前研究的热点。虽然已有许多关于遗传变异与甲亢的研究，但没有证实GPR174基因与甲亢相关性的报道，更没有证实本发明所述的GPR174基因SNP与甲亢相关性的报道。

综上所述，为了早期预防和诊断甲亢，本领域迫切需要寻找甲亢易感基因，并开发用于甲亢疾病预警的方法和试剂盒。

发明内容

本发明人运用Plink软件对X染色体的数据同常染色一样进行常规的Cochran Armitage趋势检验，没有发现X染色体上的易感基因。鉴于Plink软件常规Cochran Armitage趋势检验的方法对X染色体分析的缺陷，本发明人进一步用另外的两种方法（男女分层分析和Clayton的方法）对X染色体进行分析。两种关联分析的方法都显示一组存在着强LD关系的SNPs与GD相关。这些关联的SNPs位于Xq21.1区域，分布在GPR174基因及其周围区域。P值最低的SNP是距离GPR174基因约155-kb的rs5912838（P _{logistic regression}=4.60×10^-8;P_snpMatrix=1.36×10^-9;OR=1.80,95%CI1.48-2.18）。推定填补分析并没有在Xq21.1区域发现P值更低的SNPs。在这些关联的SNPs当中，rs3827440是一个导致GPR174发生非同义突变的SNP，它与P值最低的rs3827440之间存在着强的LD关系。虽然rs3827440不是这一区域P值最低的SNP，但是它是非常值得研究的功能变异。

在验证阶段的4,564例患者和3,968例性别匹配的对照中，对rs3827440进行分型。统计结果验证了最初的关联，并且合并分析的P值达到了全基因组关联研究的显著性水平（combined P _{logistic regression}=5.53×10^-21;combined P_snpMatrix=4.26×10^-22;OR=1.69,95%CI1.53-1.86;表3-6）。rs3827440的OR值为1.69（95%CI1.53-1.86），在本发明的研究样本中仅低于HLA区域的rs4947296。提示在中国人群中GPR174是一个重要的易感基因。

本发明的重测序结果显示5’非翻译区（5’UTR）区域的两个SNPs（rs3810711与rs3810712）与rs3827440是完全连锁不平衡关系,也就是说对rs3810711或rs3810712进行基因分型等同于检测rs3827440。5’UTR区域对基因的转录和翻译有重要的作用，往往影响基因的表达量。Rs3827440是GPR174基因编码区的第519位C→T变异，造成第162位氨基酸由脯氨酸转变为丝氨酸（P162S）。RT-PCR结果显示rs3827440（rs3810711或rs3810712）的基因型与外周血GPR174的表达量相关。无论男性群体还是女性群体，rs3827440TT或T基因型都与GPR174的高表达相关（分别为P=0.009和P=0.029）。在男女混合人群中，携带rs3827440TT或T的群体GPR174的表达量显著高于携带CC或C的群体（P=0.002）。这些结果提示，rs3827440、rs3810711或rs3810712单独或者共同影响了GPR174基因的表达量，从而影响了GD的遗传易感性。

因此，本发明的目的就是提供一种辅助诊断(尤其是早期诊断)甲亢的方法及检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种新的治疗甲亢的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种对个体的甲亢易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

检测该个体的GPR174基因、转录本和/或蛋白，并与正常的GPR174基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患甲亢的可能性高于正常人群。

在另一优选例中，所述的方法中检测的是GPR174的基因或转录本，并与正常GPR174核苷酸序列比较差异。

在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性：

265位T→C和282位C→T;

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

在一优选例中，所述的差异还包括以下的多核苷酸多态性：

367位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在G蛋白偶联受体174（GPR174）的单核苷酸多态变异的方法，包括步骤：

(a)用GPR174基因特异性引物扩增样品的GPR174基因，得到扩增产物；

和

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

265位T→C和282位C→T;

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

在一优选例中，所述步骤（b）还包括检测扩增产物中是否存在以下多核苷酸多态性：

367位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO:2和3的序列。

在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-2000bp、优选为150-1500bp、更佳地为200-1000bp，且含有SEQ ID NO:1中第265位或第282位。

在另一优选例中，所述的扩增产物还含有SEQ ID NO:1第367位。

在本发明的第三方面，提供了一种用于辅助诊断甲亢或检测甲亢易感性甲亢的试剂盒，它包括特异性扩增GPR174基因或其5’UTR区域或转录本的引物，更佳地，所述的引物扩增出长度为100-2000bp，且含有SEQ ID NO:1中第265位的扩增产物。

在一个优选例中，扩增出的产物还含有SEQ ID NO:1第282位。

在另一优选例中，扩增出的产物还含有SEQ ID NO:1第367位。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：

(a)与SEQ ID NO:1中第265位或第282位的突变结合的探针；和

(b)识别SEQ ID NO:1中第265位或第282位的突变的限制性内切酶。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有：

（c）与SEQ ID NO:1中第367位的突变结合的探针；

（d）识别SEQ ID NO:1中第367位的突变的限制性内切酶。

在另一优选例中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

265位T→C和282位C→T;

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

在一优选例中，所述的突变还包括以下的多核苷酸多态性：

367位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

本发明还涉及能特异性扩增GPR174基因及其5’UTR区域或转录本、且所扩增的产物含有SEQ ID NO：1的第265位或第282位的引物在制备用于辅助诊断甲亢或检测甲亢易感性的试剂盒中的应用。

在一个具体实施方式中，所述引物扩增出的产物长度为100-2000bp，优选为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。

在一个具体实施方式中，所述试剂盒还含有：

（a）与SEQ ID NO:1中第265位或第282位的突变结合的探针；和

（b）识别SEQ ID NO:1中第265位或第282位的突变的限制性内切酶。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有：

（c）与SEQ ID NO:1中第367位的突变结合的探针；

（d）识别SEQ ID NO:1中第367位的突变的限制性内切酶。

在一个具体实施方式中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

265位T→C和282位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

在一优选例中，所述的突变还包括以下的多核苷酸多态性：

367位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，对遍布X染色体上大量SNPs进行了测定和分析。首次发现和证明了GPR174的基因组序列与甲亢密切相关，其中关联研究结果显示，RS3827440在对照组和病例组中的分布存在显著性差异(P<0.05)，而rs3810711（在GPR174的SEQ ID NO:1中第265位的SNP(T→C))和rs3810712（在GPR174的SEQ ID NO:1中第282位的SNP(C→T))与rs3827440存在完全连锁不平衡，三者的检测效力相同。因此三者皆可作为辅助性检测甲亢(或其易感性)的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。

G蛋白偶联受体174（G protein-coupled receptor174,GPR174）基因位于染色体Xq21.1区域，由一个编码333个氨基酸的外显子组成，这个基因属于GPCR超家族，被归为GPCR1类基因家族。GPCR超家族是跨膜蛋白，共同特点是有7个α-螺旋的跨膜区，在细胞信号传导中起重要作用。至今已发现超过50%的药物的作用靶点都是GPCRs。最近，有研究发现LysoPS是GPR174的配体。在体内，LysoPS是由免疫系统分泌，作为一个脂类介质调控体内免疫进程。LysoPS与GPR174结合后可以刺激细胞外cAMP浓度的增加，并且这种刺激作用是剂量依赖的。研究也发现，引起cAMP水平增高或者cAMP的类似物都会阻止体内Th1类细胞因子的产生，但是Th2因子的产生不受影响，甚至提高。通常认为GD是一种以Th2类反应为主导的疾病。因此，cAMP水平增高导致的Th2类反应占主导有可能参与了GD的病理过程。

我们的研究显示易感等位基因导致GPR174基因表达水平的提高，而GPR174基因表达水平的提高有可能导致胞外cAMP浓度的增高。我们的表达谱结果分析显示GPR174基因广泛的表达于免疫相关的组织，并且在甲状腺中也有一定量的表达。这种表达模式提示GPR174基因可能参与免疫过程，并且与甲状腺的结构或者功能有一定的联系，有可能在GD的发病过程中起重要作用。

本发明人通过对分布于整条X染色体的SNPs在中国人群中进行了关联分析，发现GPR174基因上的rs3827440与甲亢的易感性相关。rs3827440是GPR174基因编码区的第519位C→T变异，造成第162位氨基酸由脯氨酸转变为丝氨酸（P162S）。本发明的重测序结果显示5’非翻译区（5’UTR）区域的两个SNPs（rs3810711与rs3810712）与rs3827440是完全连锁不平衡关系。另外对GPR174基因中的整个外显子区域进行了测序，发现了许多频率较低的SNP也与甲亢易感性相关。以rs3827440、rs3810711或rs3810712对甲亢的遗传贡献率最大。

具体而言，本发明揭示了GPR174基因的单核苷酸多态性(SNP)以及该多态性与甲亢的相关性。本发明的SNP是SEQ ID NO:1所示序列的265位的T/C和282位C/T多态，265位等位基因型C和282位等位基因T在甲亢人群中的频率要高于在正常对照人群中的频率。

基于本发明的新发现，GPR174蛋白或多肽及其配体有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：用于辅助性诊断甲亢。

另一方面，本发明还包括对人GPR174基因DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人GPR174基因产物或片段。较佳地，指那些能与人GPR174基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并激活人GPR174蛋白的分子，也包括那些并不影响人GPR174蛋白功能的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人GPR174基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人GPR174蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人GPR174蛋白功能的抗体以及不影响人GPR174蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人GPR174基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人GPR174基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如大肠杆菌)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人GPR174蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人GPR174蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗GPR174抗体是不识别正常GPR174但识别突变GPR174的抗体，或者识别正常GPR174但不识别突变GPR174的抗体。利用这些抗体，可以方便地进行蛋白质水平的甲亢易感性预测。

利用本发明GPR174蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与GPR174蛋白的配体和其他与之发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明还涉及定量和定位检测人GPR174蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括ELISA等。

一种检测检测样品中是否存在GPR174蛋白的方法是利用GPR174蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与GPR174蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在GPR174蛋白。

GPR174蛋白的多聚核苷酸可用于GPR174蛋白相关疾病的辅助诊断。在诊断方面，GPR174蛋白的多聚核苷酸可用于检测GPR174蛋白的表达与否或在疾病状态下GPR174蛋白的异常表达。如GPR174DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断GPR174蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法,Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用GPR174蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测GPR174蛋白的转录产物。

检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。GPR174蛋白突变的形式包括与正常野生型GPR174DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用GPR174基因特异性引物扩增样品的GPR174基因及其5’UTR区域，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：265位T→C或282位C→T，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

应理解，在本发明首次揭示了GPR174基因的SNP与甲亢的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在265位G→T或282位C→T。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5'端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID NO:2和3的序列。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-2000bp，较佳地为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO:1中第265位。

由于本发明的SNP与甲亢具有非常高的关联性，因此不仅可用于早期辅助性诊断甲亢，而且可以未雨绸缪地使一些携带者在未发病前就采取合理的预防措施，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。当然，最终还应当用常规检测方法进行确诊。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

研究简介

本研究采用病例对照关联研究。患者的诊断由富有临床经验的内分泌科医师根据甲亢的诊断标准作出。甲亢的诊断标准是依据临床记录和生化检查：甲状腺功能亢进、甲状腺肿大和以下指标中的任意一项：TSHR抗体阳性，131I摄入量增加及突眼。对照样本选自南方中心样本库中年龄、性别匹配，无关节炎病史的个体。

对1,536例甲亢患者和1,516健康对照的rs3827440进行基因分型。其中1456例患者与1485例对照的试验数据通过质控，对通过实验质控的基因分型的结果进行统计分析。在1456例患者中：女性TT444例，TC508例，CC163例；男性TT232例，CC109例。在1485例对照中：女性TT265例，TC541例，CC219例；男性TT186例，CC172例。logistic回归分析P值为9.52×10^-8。T等位基因增加疾病的易感性。

这一结果进一步在在包含4,265例甲亢患者和3,807健康对照的独立样本中进行验证。在4,265例患者中：女性TT1,298例，TC1,606例，CC471例；男性TT606例，CC284例。在3,807例对照中：女性TT957例，TC1344例，CC584例；男性TT526例，CC396例。logistic回归分析P值为7.76×10^-15。T等位基因增加疾病的易感性。

根据我们的研究结果认为C→T改变，增加了甲亢的易感性，等位基因型T与甲亢的发生显著相关。rs3810712及rs3810711都与rs3827440完全连锁，因此三者有同等检测效力，rs3810712的C等位基因和rs3810711的T等位基因皆与甲亢的发生显著相关。

实施例1

1.1研究对象

患者的诊断由富有临床经验的内分泌科医师根据甲亢的诊断标准作出。甲亢的诊断标准是依据临床记录和生化检查：甲状腺功能亢进、甲状腺肿大和以下指标中的任意一项：TSHR抗体阳性，131I摄入量增加及突眼。对照样本选自南方中心样本库中年龄、性别匹配，无关节炎病史的个体。

在知情同意的基础上随机收集了1,536例甲亢患者和1,516健康对照的外周血样本。

1.2实验方法和结果

1.2.1DNA提取

用常规酚氯仿法从人的外周血样本中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。

1.2.2PCR及测序引物的设计

根据GenBank中GPR174的基因组序列，设计和合成以下引物。具体引物如下表1所示。

表1引物序列表

引物名称	序列(5'-3')	SEQ ID NO:
			有义引物	gtcccagagggccttaaaat	2
反义引物	tacacaggcaaggcagatga	3

1.2.3GPR174基因及5’UTR区域的PCR扩增

以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp9700PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；以后94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。结果，获得GPR174的扩增产物。

1.2.4SNP的发现和检测

PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-3730DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI))进行测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http://droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读、基因分型和SNP确认。

结果，发现存在数个SNP，其中包括以下SNPs:SEQ ID NO:1中265位T→C(RS3810712)和282位C→T（RS3810711）。

1.2.5SNP基因分型和关联分析

用直接单向测序法进行SNP基因分型。即在甲亢病人和正常对照组中进行分型和关联分析。

对基因分型结果进行描述性统计分析，列联表进行卡方检验。观察基因型在病人和对照之间是否具有差异。

分析结果如下：在SEQ ID NO:1的第265位上，在1456例患者中：女性CC444例，TC508例，TT163例；男性CC232例，TT109例。在1485例患者中：女性CC265例，TC541例，TT219例；男性CC186例，TT172例。logistic回归分析P值为9.52×10^-8。

在SEQ ID NO:1的第282位上，在1456例患者中：女性TT444例，TC508例，CC163例；男性TT232例，CC109例。在1485例患者中：女性TT265例，TC541例，CC219例；男性TT186例，CC172例。logistic回归分析P值为9.52×10^-8。

上述结果综合表明：rs3810712T→C和/或rs3810711C→T改变，增加了甲亢的易感性，rs3810712等位基因型C和/或rs3810711等位基因T与甲亢的发生显著相关。换言之，SEQ ID NO:1中265位和/或282位的SNP与甲亢的发生存在着相关性。

实施例2

甲亢检测试剂盒

如实施例1所述，SEQ ID NO:1中265位T→C和/或282位C→T的突变与甲亢疾病密切相关。因此，可基于这个变异设计GPR174基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有：

随机挑选100个人构成的测试组，其中包括未知是否患甲亢的对象、已知甲亢病人和经检测无甲亢的正常人。

抽取测试组中待检测对象的外周血1ml,使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将甲亢检测试剂盒中的PCR引物稀释到1ìmol/ìl,以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI3730DNA测序仪进行测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，也可检测出265位T→C和282位C→T。

检测结果：

对于GPR174存在265位T→C和282位C→T的对象，进一步通过常规方法检测以确认是否患有甲亢情况。检测结果表明，含265位T→C和282位C→T的检测对象的甲亢易感性比例明显高于正常人群(P<0.05)。

因此，这表明通过检测GPR174的265位T→C和282位C→T，可进行甲亢的辅助性检测。

实施例3

甲亢易感性辅助性检测

重复实施例2的检测，不同点在于随机选取了180个人(检测前不知道是否有甲亢)进行检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有：

抽取待检测对象的外周血1ml,使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将甲亢检测试剂盒中的PCR引物稀释到1ìmol/ìl,以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI3730DNA测序仪进行测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

结果同样证实了，含265位T→C和282位C→T的检测对象的甲亢比例明显高于该位点为C的检测对象(P<0.05)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于辅助诊断甲亢或检测甲亢易感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增GPR174基因或其5’非翻译区或转录本的引物，其中，所述引物扩增出的产物含有SEQ ID NO：1的第265位和/或第282位。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物扩增出的产物长度为100-2000bp。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物扩增出长度为200-1000bp的扩增产物。

4.如权利要求1－3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：

（a）与SEQ ID NO:1中第265位和/或第282位的突变结合的探针；

（b）识别SEQ ID NO:1中第265位和/或第282位的突变的限制性内切酶。

5.如权利要求4中所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

265位T→C或者282位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。

6.如权利要求1－5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO：2和3所示。

7.SEQ ID NO：2和3所示的引物在制备用于辅助诊断甲亢或检测甲亢易感性的试剂盒中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于特异性扩增GPR174基因或其5’UTR区域或转录本，其中，所述引物扩增出的产物长度为100-2000bp，并含有SEQ ID NO:1中第265位和第282位。

9.如权利要求7－8中任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还含有：

（a）与SEQ ID NO:1中第265位和/或第282位的突变结合的探针；

（b）识别SEQ ID NO:1中第265位和/或第282位的突变的限制性内切酶。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

265位T→C或282位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO:1。