CN102827834B - 甲亢疾病的易感基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甲亢疾病的易感基因及其应用。具体地，本发明公开了20个涉及人类甲亢疾病易感性的单核苷酸多态性位点(SNP)。本发明还首次证实了这20个单核苷酸多态性位点与甲亢疾病存在密切相关性。这些SNP可用于检测甲亢易感性、制备检测甲亢疾病易感性试剂及试剂盒、筛选甲亢药物等，从而为甲亢疾病的诊断、分型、预后和治疗提供新的方式。

Description

甲亢疾病的易感基因及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及人类基因组中20个单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)及其与甲亢疾病的相关性。本发明还涉及检测这些SNP和甲亢易感性的方法和试剂盒。

背景技术

甲状腺功能亢进症(Hyperthyroidism，简称甲亢)系指由多种病因导致甲状腺激素(TH)分泌过多引起的临床综合征。甲亢病人较复杂，其中以弥漫性甲状腺肿伴甲亢(Graves病，GD)为最多见。GD是一种伴甲状腺激素分泌增多的、器官特异性自身免疫性疾病，它是机体的免疫系统功能亢进，从而产生抗自身甲状腺的抗体(免疫球蛋白)而引起的，这种特异性的抗体刺激甲状腺增生、并使其分泌大量的甲状腺激素。一般Graves病多见于女性，男女患病率之比为1∶4-7，特别是青春发育期、妊娠期和更年前期。

经研究，Graves病是一种器官特异性自身免疫疾病，一种常见的多基因疾病，因此其发病具有较强的遗传基础。Graves病的发病原因一般被认为是由多种易感基因和环境因素共同造成的。已经发现人白细胞抗原(HLA)-II基因、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)基因，促甲状腺受体(TSH-R)基因和甲状腺球蛋白(Tg)基因等多个基因与Graves病存在一定的联系。此外，还有其它的免疫相关基因，如白介素-1受体拮抗基因、肿瘤坏死因子β基因和甲状腺过氧化物酶基因等，但很多结果存在争议。

群体中可能存在多于一种的称为“多态位点”的核酸序列，多态位点可以允许序列基于取代、插入或缺失而存在差异。因此取代、插入或缺失可以导致移码、产生过早终止密码子、多核苷酸所编码的一个或多个氨基酸的缺失、添加、改变剪切位点。以及影响mRNA的转运或稳定性。当多态位点长度为单独一个氨基酸时，将该位点称为单核苷酸多态性(SNP)。

SNP是造成疾病易感性和药物反应差异的最普遍的遗传变异形式。SNP可以直接促成许多表型如患者间的疾病危险或药物反应差异，或者更普遍地作为所述表型的标记。

由于甲亢疾病本身的复杂性、多个基因之间的相互作用，以及环境因素对甲亢疾病发展的影响，使甲亢易感基因的确定十分困难。因此，本领域迫切需要深入研究人类基因组，以期找到导致Graves病发生和发展的易感基因，并研发出可用于诊断和检测Graves病的试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

本发明人经过长期深入的研究，发现20个单核苷酸位点(SNP)与甲亢疾病的易感性密切相关。本发明的一个目的是证实20个单核苷酸多态性位点与甲亢疾病密切相关。本发明的另一个目的是证明所述SNP可用于检测甲亢易感性、制备检测甲亢疾病易感性试剂及试剂盒、筛选甲亢药物等。

在本发明的第一方面，提供一种分离的含单核苷酸多态性(SNP)位点的多核苷酸，所述多核苷酸中的SNP位点对应于选自下组的SNP：

1号染色体155908307位  rs10908583   C→T；

1号染色体155935902位  rs3761959    G→A；

2号染色体204416891位  rs231804     C→T；

2号染色体204429997位  rs1024161    C→T；

2号染色体204449111位  rs231726     C→T；

2号染色体204471289位  rs10197319   A→G；

4号染色体39998408位   rs6832151    T→G；

6号染色体31166157位   rs4947296    T→C；

6号染色体31458683位   rs1521       C→T；

6号染色体32536263位   rs6903608    T→C；

6号染色体32771829位   rs6457617    C→T；

6号染色体33168096位   rs2281388    C→T；

6号染色体167293698位  rs9366076    T→C；

6号染色体167303065位  rs9355610    A→G；

14号染色体80438570位  rs12050151   T→C；

14号染色体80502299位  rs179247     G→A；

14号染色体80514120位  rs2284722     G→A；

14号染色体80520982位  rs12101261    C→T；

14号染色体80538707位  rs4903964     G→A；

14号染色体80592881位  rs17111394    T→C。

在另一优选例中，所述SNP是甲亢易感相关的SNP，详细信息如表1所示：

表1

在另一优选例中，所述SNP是选自表2的与治疗后抗体持续阳性(TRab⁺)相关的SNP：

表2

在另一优选例中，所述SNP选自下组：rs9355610A→G或rs6832151T→G。

在另一优选例中，所述多核苷酸包括引物、探针、扩增产物、或质粒。

在另一优选例中，所述多核苷酸长度为8-5000bp，较佳地10-3000bp，更佳地15-1000bp，最佳地18-500bp。

在本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体包含本发明第一方面所述的多核苷酸。

在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面中所述的载体。

在本发明的第四方面，提供了一种核酸引物对，所述引物对长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出单核苷酸多态性(SNP)的扩增产物，其中所述的SNP选自表1。

在另一优选例中，所述的SNP是甲亢易感性相关的SNP或TRab⁺相关的SNP。

在另一优选例中，所述的引物对特异性扩增含以下SNP的扩增产物：rs9355610A→G或rs6832151T→G。

在本发明的第五方面，提供了一种寡核苷酸探针，所述探针的长度为15-500bp，且特异性地杂交并检测出含单核苷酸多态性(SNP)的扩增产物，其中所述的SNP选自表1。

在另一优选例中，所述的SNP是甲亢易感相关的SNP或TRab⁺相关的SNP。

在本发明的第六方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒的扩增产物含有选自表1的突变位点。

在另一优选例中，所述的试剂盒可用于检测甲亢易感性，或用于判断甲亢病人经抗甲状腺药物治疗后抗体是否会持续阳性。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有与突变位点结合的探针。

在本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的引物对、或本发明的第五方面所述寡核苷酸探针的用途，所述多核苷酸、所述引物对或所述寡核苷酸探针用于制备检测甲亢易感性的试剂盒；或用于制备判断甲亢病人经抗甲状腺药物治疗后抗体是否会持续阳性的试剂盒。

在本发明的第八方面，提供了一种检测个体甲亢易感性的方法，包括步骤：检测与甲亢相关的SNP，其中所述的SNP包括表1中所示SNP。

在另一优选例中，所述SNP是表1中所示的与甲亢易感性相关的SNP。

在另一优选例中，所述SNP是表2中所示的与治疗后抗体持续阳性相关的SNP。

在本发明的第九方面，提供了一种鉴定甲亢相关基因的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)提供一候选基因，其中所述候选基因含有SNP，所述的SNP包括表1中所示SNP；

(2)检测所述候选基因在甲亢病人群体中的表达水平，记为La，和检测所述候选基因在正常群体中的表达水平，记为Lc；并比较La与Lc，如果La显著高于Lc或La显著低于Lc，则表明所述候选基因是甲亢相关基因。

在另一优选例中，所述的甲亢病人群体包括至少500人，且所述正常群体包括至少500人。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：检测所述候选基因的编码蛋白的活性。

在另一优选例中，在步骤(2)中检测所述候选基因的mRNA表达情况。

在本发明的第十方面，提供了一种SNP或含所述SNP的多核苷酸的用途，其中所述的SNP为rs9355610A→G，所述SNP或含所述SNP的多核苷酸用于制备检测RNASET2基因表达水平的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述试剂盒用于检测T细胞中RNASET2的表达水平。

在另一优选例中，所述的T细胞是CD4+和CD8+细胞。

本发明还提供一种SNP或含所述SNP的多核苷酸的用途，其中所述的SNP为rs6832151T→G，它用于制备检测GDCG4p14和CHRNA9基因的表达水平的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述试剂盒用于检测T细胞中所述基因的表达水平。

在另一优选例中，所述的T细胞是CD4+和CD8+细胞。

在本发明的第十一方面，提供了一种检测对象中RNASET2表达水平的方法，其特征在于，检测所述对象的基因或基因组是否存在以下SNP：rs9355610A→G，如果存在所述SNP，则提示该对象中RNASET2表达水平低于正常人群。

在另一优选例中，所述的对象在该SNP基因型是GG。

在本发明的第十二方面，提供了一种检测对象中GDCG4p14和CHRNA9基因表达水平的方法，其特征在于，检测所述对象的基因或基因组是否存在以下SNP：rs6832151T→G，如果存在所述SNP，则提示该对象中所述基因的表达水平低于正常人群。

在另一优选例中，所述的对象在该SNP基因型是GG。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了全基因组扫描疾病相关性分析结果。

图1a显示了对1468个GD样本全基因组初步扫描后的GD疾病相关性结果。

图1b显示了对997个pTRAb+GD样本全基因组初步扫描后的GD疾病相关性结果。

图1c显示了对410个pTRAb-GD样本全基因组初步扫描后的GD疾病相关性结果。其中图a-c中从左至右分别为染色体1-22。

图1d显示了1468个GD样本的分位数-分位数图。

图1e显示了997个pTRAb+GD样本分位数-分位数图。

图1f显示了410个pTRAb-GD样本分位数-分位数图。

图2显示了染色体6p21-22的MHC区域的SNP疾病相关性扫描分析结果。图中，1468个GD样本vs.1490个对照样本和997个pTRAb+GD样本vs.1490个对照样本的数据点分布在上部和中部，而1468个pTRAb-GD样本vs.1490个对照样本分布在下部。

图3显示了待选基因的疾病相关性和表达分析结果。

图3a显示了染色体6q27疾病相关性和表达分析结果。

图3b显示了染色体4p14疾病相关性和表达分析结果。

图3c-图3d分别显示了，为与rs9355610的不同基因型相比，染色体6q27上的待选基因的相对表达水平的PBMCs(AA，n＝21；AG，n＝23；GG，n＝19)，以及亚类PBMCs(AA，n＝7；AG，n＝6；GG，n＝6)。

图3e-图3f分别显示了，为与rs6832151的不同基因型相比，染色体4p14上的待选基因的相对表达水平的PBMCs(TT，n＝29；TG，n＝24；GG，n＝10)，以及亚类PBMCs(TT，n＝10；TG，n＝6；GG，n＝5)。

图3g显示了人类GDCG4p14基因的图谱结构。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次发现20个单核苷酸多态性位点(SNP)与甲亢(特别是Graves病，GD)密切相关。因此可以通过检测甲亢易感基因以及SNP来辅助性诊断甲亢或对甲亢进行分型。

因此，基于本发明人的新发现，可用于(i)制备用于检测甲亢疾病易感性的试剂或试剂盒；(ii)制备用于检测甲亢疾病分型的试剂或试剂盒；(iii)评估甲亢疾病的转归、预后的分子标志；(iv)选择治疗甲亢药物的标志；或(iv)筛选治疗甲亢的药物。

单核苷酸多态性(SNP)

单核苷酸多态性是人类基因组中最常见的DNA序列变异，在各种生物学和生物医学的应用中获得了越来越多的重要性。SNPs可以用来探索人类种群进化历史、分析法医样品，因此在遗传学中发挥重要作用。药物遗传学利用这些DNA变异来阐明构成不同药物功效或不利事件的基础遗传因素。

本发明涉及鉴定特定疾病的单核苷酸多态性(SNPs)，其明确鉴定为与甲亢表型相关，因此，在疾病症状存在之前，可以对这些个体进行干预，例如饮食改变，锻炼和/或药物治疗。鉴定涉及甲亢疾病的SNPs有助于更好的理解疾病过程，改善诊断试剂和治疗试剂。

如本文所用，术语“SNP”是指在个体群体之间不同的人类基因组中特定位置上的单核苷酸多态性。在本发明中，SNP可以通过它的名称或通过位于特定序列的位置来确定。如SNP“[G/A]”表示在该序列的该位置的核苷酸碱基(或等位基因)可以是鸟嘌呤或腺嘌呤。

如本文所用，本发明公开的核苷酸序列包括所述核苷酸序列的互补序列。另外，术语“SNP”包括在一组等位基因中的任何等位基因。

如本文所用，术语“等位基因”是指在定义SNP的核苷酸选择中特定的核苷酸。

如本文所用，术语“次要等位基因”是指在个体群体内比主要等位基因出现频率低的SNP的等位基因。

如本文所用，术语“主要等位基因”是指在个体群体内比次要等位基因出现频率高的SNP的等位基因。

如本文所用，术语“风险等位基因”是指与甲亢疾病关联的等位基因。

如本文所用，术语“单倍型”是指来自于两个或多个SNPs的具体等位基因的组合。

如本文所用，术语“风险状态单倍型”是指与甲亢疾病相关联的单倍型。

RNASET2及相关SNP

本发明鉴定了一种新的基因座：位于6q27的RNASET2-FGFR1OP-CCR6(P_combined＝6.85×10^-10)，SNP为rs9355610A→G。

SNP：rs9355610A→G与甲亢易感以及治疗后抗体是否会持续阳性的相关，假如样本中存在所述SNP，则提示该样本中RNASET2表达水平低于正常人群。因此，SNP：rs9355610A→G是一种RNASET2表达水平的指示物。

在另一优选例中，所述样本为T细胞。

在另一优选例中，所述的T细胞是CD4+和CD8+细胞。

GDCG4p14及相关SNP

本发明鉴定了一种新的基因座：位于4p14的GDCG4p14(P_combined＝1.08×10^-13)，SNP为rs6832151T→G。

SNP：rs6832151T→G与甲亢易感以及治疗后抗体是否会持续阳性的相关，假如样本中存在所述SNP，则提示该样本中GDCG4p14和CHRNA9基因表达水平低于正常人群。因此，SNP：rs9355610A→G是一种GDCG4p14和CHRNA9基因表达水平的指示物。

在另一优选例中，所述样本为T细胞。

在另一优选例中，所述的T细胞是CD4+和CD8+细胞。

含SNP的多核苷酸

本发明还提供了含本发明所述SNP的多核苷酸。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多态式。多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、和/或它们的类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，包括单链、双链和三螺旋分子结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。如以下非限制性实施例：基因或基因片段，外显子，内含子，mRNA，tRNA，rRNA，siRNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，质粒，载体，分离的任何序列的DNA，分离的任何序列的RNA，核酸探针，引物。多核苷酸也可以包括经修饰的核算分子，如甲基化核酸分子和核酸分子类似物。

在另一优选例中，所述的多核苷酸包括引物、探针、扩增产物、或质粒。

如本文所用，术语“基本分离的”或“分离的”多核苷酸是指基本没有天然的相关序列的多核苷酸。基本上没有是指至少50％、较优地至少70％、更优地至少80％或最优地至少90％不含其它天然相关物质。“分离的多核苷酸”还包括重组的多核苷酸。

如本文所用，术语“在严格条件下杂交”意在描述杂交条件，在该条件下，彼此至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％相同的核苷酸序列典型地彼此保持杂交。这些严格的条件是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y(1989)中找到。严格杂交的一个非限制性实例是在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在0.2xSSC，0.1％SDS中在50-65℃下一次或多次洗涤。

如本文所用，术语“引物”是指在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

如本文所用，术语“载体”是指可以携带插入的DNA并且可以为维持在宿主细胞中的DNA分子。载体也可以为克隆载体，克隆媒介物等。术语“载体”包括主要功能为将核酸分子插入到细胞中的载体，主要功能在于复制核酸的复制载体，和用于转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体，还包括提供多余一种上述功能的载体。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是载体或核酸分子和/或蛋白质整合的接受体。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且由于天然的、随机的或有意突变，所述子代可能未必与亲代完全相同(在形态上或在总DNA互补序列上)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸转染的细胞。“分离的宿主细胞”是指已经与它来源的生物在物理上分离的宿主细胞。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

试剂盒及其用途

本发明还包括可用于检测甲亢疾病的试剂盒，所述的试剂盒中可包括特异性扩增含SNP位点的扩增产物的引物。更优选的，它还含有选自下组的试剂：(a)与SNP部位结合的探针；(b)识别SNP位点的限制性内切酶。

应理解，在本发明首次揭示了表1所示SNP与甲亢的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含所述SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在这些SNP。

通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-3000bp，较佳地为150-2000bp，更佳地为200-1000bp。

本发明的主要优点在于：

(1)首次发现20个SNP与甲亢疾病易感性存在相关性，从而为甲亢疾病的诊断与治疗提供了新的途径。

(2)基于本发明人的新发现，可用于择治疗甲亢药物的标志、筛选治疗甲亢的药物、评估甲亢疾病的转归、预后的分子标志，为甲亢药物的进一步开发提供了一种良好的靶点。

(3)本发明不仅可用于早期较准确地诊断甲亢，而且可以未雨绸缪地使携带者在未发病前就采取合理的预防措施，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1样本获得及准备

1.在SNP筛选阶段，发明人选择了1536例甲亢病人和1516例正常对照。

1536例甲亢病人来源于江苏徐州和山东临沂，1516例正常对照来自于与甲亢病人相同的地区，且性别匹配。

1536例病人中病程超过一年的病人均用ELISA的方法检测促甲状腺激素受体的自身抗体(TRab)的水平。TRab水平≥1.5U/L的样本被认为是持续性TRab阳性(pTRab+)，TRab水平＜1.5U/L的样本被认为是持续性TRab阴性(pTRab-)，

1516的正常对照样本都检测过促甲状腺激素(TSH)和抗甲状腺微粒体抗体(TPOab)的水平，其中任一项指标都在正常参考值范围内，目的为排除自身免疫性甲状腺疾病。

2.在验证阶段，发明人选择了3994例甲亢病人和3510例正常对照。3994例甲亢病人除来自徐州和临沂地区外又扩大到山东青岛、安徽蚌埠及江苏镇江地区，3510例正常对照来自于相同地区且性别匹配。

3994例病人中病程超过一年的病人均检测过促甲状腺激素受体的自身抗体(TRab)的水平。

表3

实施例2基因分型

1.在SNP筛选阶段，全基因组关联研究选了Illumina公司的人660K的芯片进行基因分型，数据分析运用的也是Illumina公司BeadStudio 3.3软件。

2.在验证阶段，在一阶段筛选出的与甲亢疾病最相关的100个SNPs位点中，96个SNPs选用了Fludigm公司EP1的平台进行基因分型，4个SNPs运用了美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)的7900HT系统进行基因分型。

实施例3统计分析

1.在SNP筛选阶段，首先运用SmartPCA和PLINK软件对样本的人群结构进行评估，采用的分析方法分别为主成分分析(PCA)和多位尺度分析(MDS)。且运用PLINK软件和R统计包对所有的SNPs点的P值进行了理论值和观测值的分布分析。经过一系列的质量控制，最后1468个病人和1490个正常对照及476121个SNPs纳入统计分析，运用PLINK软件对这些数据进行了病例-对照的趋势检验分析。

2.在验证阶段，验证数据应用的是趋势检验的方法分析了100个SNPs和疾病的关系。两个阶段的数据荟萃应用的是Cochran-Mantel-Hanezel的分析方法。

采用逻辑回归分析方法来确定疾病易感位点的独立性，在MHC区段有大量独立的易感位点，本发明人是采用逐步回归的方法分析的。在第一阶段的GWAS数据采用的是前向逐步逻辑回归的方法建模型以深度挖掘易感位点。

3.疾病的分型分析

发明人收集的病人样本大多数是经过治疗的，而其中病程大于一年的病人血浆都是检测过TRAb水平。将病人分成两组即抗体持续阳性组和抗体非持续阳性组，对这两类亚型进行逻辑回归分析。

4.结果

如图1，全基因组扫描分析疾病相关性。

图1a-c中不同的颜色代表不同的染色体，红色水平线代表P＝1×10^-4。

图1a为与1490个对照样本相比，1468个GD样本疾病相关性的P值。

图1b为与1490个对照样本相比，pTRAb+GD样本疾病相关性的P值。

图1c为与1490个对照样本相比，pTRAb-GD样本疾病相关性的P值。

图1d-f为全基因组相关性分析(GWAS)结果的分位数-分位数图，所有SNP用红色表示，MHC位点排除SNP用蓝色表示。

图1d为与1490个对照样本相比，1468个GD样本的分位数-分位数图。

图1e为与1490个对照样本相比，对997个pTRAb+GD样本分位数-分位数图。

图1f为与1490个对照样本相比，对410个pTRAb-GD样本分位数-分位数图。

图2为染色体6p21-22(第六条染色体，25-35Mb)MHC区域的SNPs图。绿色、红色和蓝色的点分别代表与1490个对照样本相比，1468个GD样本、pTRAb+GD样本、pTRAb-GD样本的P值。箭头代表典型的MHC基因、基因大小及其转录方向。

图3为待选基因的疾病相关性和表达分析结果。

图3a-图3b为在GWAS样本6q27(3a)和4p14中(3b)，观测值(菱形)和理论值(圆形)SNP的相关性结果。每一个基因分型的SNP位点的颜色都代表了相关基因位点与顶部SNP(红色大菱形)的r²。蓝色菱形代表顶部SNPs的合并P值。基因重组率用蓝绿色表示。

图3c-图3d为与rs9355610的不同基因型相比，染色体6q27上的待选基因的相对表达水平的PBMCs(图3c)(AA，n＝21；AG，n＝23；GG，n＝19)，以及亚类PBMCs(图3d)(AA，n＝7；AG，n＝6；GG，n＝6)。

图3e-图3f为与rs6832151的不同基因型相比，染色体4p14上的待选基因的相对表达水平的PBMCs(图3e)(TT，n＝29；TG，n＝24；GG，n＝10)，以及亚类PBMCs(图3f)(TT，n＝10；TG，n＝6；GG，n＝5)。

图3g为人类GDCG4p14基因的图谱结构。4p14中CHRNA9和RHOH中间的110kb序列中有5个假定基因和若干表达序列标签。GDCG4p14.1和GDCG4p14.2是GDCG4p14的两个多态形式，以绿色表示，可能的开放阅读框以红色表示。

本发明人确定了6个基因区段(MHC、TSHR、CTLA-4、FCRL3、RNASET2-FGFR1OP-CCR6、CHRNA9)的20个SNPs是甲亢疾病的易感位点(见表4)：

rs10908583(P_combined＝1.02×10^-08)，rs3761959(P_combined＝1.50×10^-13)，

rs231804(P_combined＝2.12×10^-11)，rs1024161(P_combined＝2.34×10^-17)，

rs231726(P_combined＝1.16×10^-13)，rs10197319(P_combined＝2.87×10^-8)，

rs6832151(P_combined＝1.08×10^-13)，rs4947296(P_combined＝3.51×10^-51)，

rs1521(P_combined＝1.64×10^-65)，rs6903608(P_combined＝5.12×10^-24)，

rs6457617(P_combined＝7.38×10^-33)，rs2281388(P_combined＝1.50×10^-65)，

rs9366076(P_combined＝3.99×10^-09)，rs9355610(P_combined＝6.85×10^-10)，

rs12050151(P_combined＝3.88×10^-10)，rs179247(P_combined＝5.83×10^-22)，

rs2284722(P_combined＝5.15×10^-15)，rs12101261(P_combined＝6.64×10^-24)，

rs4903964(P_combined＝1.28×10^-18)，rs17111394(P_combined＝1.64×10^-09)。

表4

在疾病分型中与治疗后抗体持续阳性相关的SNP有13个(见表5)：

rs3761959(P_combined＝1.02×10^-9)，rs1024161(P_combined＝1.36×10^-11)，

rs6832151(P_combined＝2.78×10^-10)，rs4947296(P_combined＝2.40×10^-35)，

rs1521(P_combined＝4.86×10^-45)，rs2281388(P_combined＝4.40×10^-55)，

rs9355610(P_combined＝3.22×10^-11)，rs12101261(P_combined＝5.56×10^-27)。

表5

这些SNP的变异形式见表6：

表6

实施例4从甲亢易感位点克隆GDCG4p14

rs5832151位点附近有一段保守序列，通过UCSC网站预测可能有5个转录体，其中有一个序列(ENST00000510551)由多个EST支持，包含三个外显子，在此基础上针对第一、第三个外显子设计引物见表7。

表7

结果：

本发明人在Jurkat细胞中通过RT-PCR证实了该转录体的存在，并根据预测的序列往5’，3’延伸，最终扩出一段大约900碱基，包含一个编码114个氨基酸的开放读码框。

实施例5Real-time RT-PCR

取研究对象和正常人群10ml血样，分离T细胞，以GAPDH基因作为内参，同时设计一对内参引物，根据RNASET2基因序列横跨内含子设计引物(见表8)。运用SYBGreen染料法，实时荧光定量基因的表达。

表8

结果表明，该样本中RNASET2表达水平低于正常人群，为甲亢易感基因携带者。

实施例6甲亢易感rs6832151位点检测试剂盒

如实施例3所述，rs6832151与甲亢易感性密切相关，因此，可基于此突变设计引物，以制备一种检测甲亢易感性的试剂盒，以受试者DNA为模板进行扩增。

表9

制备一检测rs6832151的突变试剂盒(100人次)，它含有以下组份：

表10

抽取待检测对象的血液10ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将所获得DNA进行PCR扩增，PCR反应液为含Taq酶、dNTP等的常规PCR反应缓冲液。

检测扩增产物中单核苷酸多态性，从而确定检测对象含有甲亢易感rs6832151位点的风险。

实施例7甲亢易感rs9355610位点检测试剂盒

如实施例3所述，rs9355610与甲亢易感性密切相关，因此，可基于次突变设计引物，以制备一种检测甲亢易感性的试剂盒，以受试者DNA为模板进行扩增。

表11

制备一检测rs9355610突变试剂盒(100人次)，它含有以下组份：

表12

抽取待检测对象的血液10ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将所获得DNA进行PCR扩增，PCR反应液为含Taq酶、dNTP等的常规PCR反应缓冲液。

检测扩增产物中单核苷酸多态性，从而确定检测对象含有甲亢易感rs9355610位点的风险。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种分离的含单核苷酸多态性即SNP位点的多核苷酸的用途，所述多核苷酸中的SNP位点对应于以下的SNP：

14号染色体80520982位  rs12101261  C→T；

其特征在于，用于制备检测甲亢易感性的试剂盒。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的含14号染色体80520982位C→T的SNP的多核苷酸还与另一多核苷酸进行组合，其中所述的另一多核苷酸中的SNP包括选自下组的SNP：

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的含14号染色体80520982位C→T的SNP的多核苷酸还与另一多核苷酸进行组合，其中所述的另一多核苷酸中的SNP包括选自下组的SNP：

6号染色体167303065位  rs9355610A→G；或

14号染色体80438570位  rs6832151T→G。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸包括引物、探针、扩增产物、或质粒。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸的长度为8-5000bp。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸的长度为10-3000bp。

7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸的长度为15-1000bp。

8.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的多核苷酸的长度为18-500bp。