KR101704143B1 - Nudt15 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 티오퓨린 유도 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물 - Google Patents

Nudt15 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 티오퓨린 유도 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NUDT15 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 티오퓨린 유도 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 NUDT15 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는, 크론병, 궤양성 대장염, 백혈병 또는 장기이식 환자에서 티오퓨린 유도된 백혈구 감소증의 위험 예측용 조성물, 위험 예측 키트 및 위험 예측방법에 대한 것이다. 본 발명에 의하면, 크론병, 궤양성 대장염, 백혈병 또는 장기이식 환자에서 티오퓨린 치료 과정 중 발생하는 백혈구 감소증에 대해 감수성이 높은 환자를 조기에 신속히 분류할 수 있어, 환자 맞춤형 치료를 효율적으로 수행할 수 있다.

Description

NUDT15 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 티오퓨린 유도 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물{Composition for predicting risk of thiopurine induced leukopenia comprising single nucleotide polymorphism marker in NUDT15 gene}
본 발명은 NUDT15 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는, 크론병, 궤양성 대장염, 백혈병 또는 장기이식 환자에서 티오퓨린 유도된 백혈구 감소증의 위험 예측용 조성물, 위험 예측 키트 및 위험 예측방법에 관한 것이다.
티오퓨린(thiopurine)계 약물인, 아자티오프린(azathioprine; AZA) 및 6-머캡토퓨린(6-mercaptopurine; 6-MP)은 암, 장기 이식 및 염증성장질환(inflammatory bowel disease; IBD)과 같은 자가면역질환이나 염증질환 환자의 치료에 널리 사용된다. IBD 치료에 요구되는 AZA 용량은 2.0-3.0 mg/kg/day이고, 6-MP 용량은 1.0-1.5 mg/kg/day이다. 하지만, AZA/6-MP 사용에 있어서 주요 문제점은 상기 약물 치료시 백인 IBD 환자의 2 내지 5%에서 발생하는 골수억제(myelosuppression)이다. 따라서 골수억제의 위험을 감소시키기 위해서, 미국 식품 의약국은 티오퓨린 치료를 시작하기 전에 티오퓨린 S-메틸트랜스퍼라제(thiopurine S-methyltransferase; TPMT) 유전자 또는 효소 활성을 시험하는 것을 권고하고 있다. 하지만, 이전의 연구에서는 아자티오프린(azathioprine) 치료 과정에서 골수억제를 경험하는 IBD 환자의 단지 1/4만이 TPMT 돌연변이를 가진 것으로 나타났는데, 이는 대다수의 환자에 있어서 골수억제가 다른 요인들에 의해 야기된다는 것을 의미한다. 그러므로, 티오퓨린 치료를 시작하기 전에 TPMT 상태에 대해 미리 시험하는 것이 유용성이 있을지는 의문이다. 더구나, TPMT 돌연변이의 빈도는 아시아인(2 내지 3%)이 백인(~10%) 보다 낮은데도 불구하고, 티오퓨린 치료 과정에서 백혈구 감소증(leukopenia)은 백인에 비해 아시아인에게서 더욱 흔하게 발생한다. 이전 연구에 의하면, 한국인 크론병(Crohn's disease;CD) 환자의 티오퓨린 치료 과정 중 31.2%에서 백혈구 감소증(백혈구 세포[white blood cell; WBC] 수가 <3000/mm3인 경우)이 관찰되었다. 백혈구 감소증을 보이는 AZA 용량은 약 1.34 mg/kg/day인 것으로 관측되었다. 한국의 다른 다기관 연구에서는 IBD 환자의 39.6%에서 백혈구 감소증(WBC<3000/mm3)을 나타냈고, 상기 환자에서 AZA의 평균 용량은 1.80 mg/kg/day으로 나타났다. 일본의 한 연구에서는, 대다수 환자에 있어서 AZA의 일일 투여량이 50 mg이었는데도, 야생형 TPMT를 가진 일본 IBD 환자의 15.8%에서 백혈구 감소증(WBC<3000/mm3)을 나타냈다. 티오퓨린 치료 과정 중 백혈구 감소증이 발생하는 아시아인 IBD 환자의 0 내지 5.6%에서만 TMPT 돌연변이가 발견되는 것을 고려해 볼때, 아시아인에서 발병하는 백혈구 감소증의 유전적 원인에 대한 이해는 여전히 부족하다.
한국공개특허 제10-10-2007-0003777호(2007.01.05 공개)
본 발명의 목적은 NUDT15 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 NUDT15 유전자 내의 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 NUDT15 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 키트를 제공하는데 있다.
상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드 및 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물을 제공한다,
또한, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 키트를 제공한다.
본 발명은 NUDT15 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는, 크론병, 궤양성 대장염, 백혈병 또는 장기이식 환자에서 티오퓨린 유도된 백혈구 감소증의 위험 예측용 조성물, 위험 예측 키트 및 위험 예측방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 크론병, 궤양성 대장염, 백혈병 또는 장기이식 환자에서 티오퓨린 치료 과정 중 발생하는 백혈구 감소증에 대해 감수성이 높은 환자를 조기에 신속히 분류할 수 있어, 환자 맞춤형 치료를 효율적으로 수행할 수 있다.
도 1은 한국 서울 아산병원에서 티오퓨린을 사용한 1191명의 크론병(CD) 환자들을 실험대상으로 한 분석 모식도를 나타낸다.
도 2는 야생형 또는 돌연변이 NUDT15로 형질감염시킨 후, 7.5 uM 6-MP 처리한 Jurkat 세포의 감수성을 나타낸 결과이다. A. 야생형 또는 돌연변이 NUDT15로 형질감염시킨 Jurkat 세포에서의 NUDT15 mRNA 수준을 나타내는데, RT-PCR 분석에 의해 측정하였다. B. NUDT15-형질감염된 돌연변이 세포의 생존수는 야생형-형질감염 대조군 세포에 비해 감소한 결과이다. C. annexin V 및 propidium iodide 염색으로 세포독성을 측정한 결과로서, 야생형 NUDT15로 형질감염된 세포에 비해 돌연변이 NUDT15로 형질감염된 경우의 세포가 6-MP에 더 민감하다는 것을 나타냈다. 결과는 3번의 독립적인 실험결과를 평균±표준편차로 나타냈다.
본 발명자들은 크론병, 궤양성 대장염, 백혈병 또는 장기이식 환자에 있어서 티오퓨린 치료 과정 중 발생하는 백혈구 감소증과 관련된 감수성 유전자들을 확인하기 위해서, 면역칩(immunochip)을 이용한 대규모 연관 분석(large-scale association analysis)을 수행하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드 및 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 C/T이고, 상기 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 A/G일 수 있다.
상세하게는, 상기 백혈구 감소증은 티오퓨린(thiopurine)에 의해 유도되는 것일 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 조성물은 티오퓨린(thiopurine)을 투여한 크론병, 궤양성 대장염, 백혈병 또는 장기이식 환자의 백혈구 감소증 발병 위험을 예측하기 위해 사용되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 티오퓨린은 아자티오프린(azathioprine; AZA) 또는 6-머캡토퓨린(6-mercaptopurine; 6-MP)이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 rs116855232로 표시하여 기재할 수 있다. 상기 rs116855232는 13q14 상의 NUDT15 내에 존재하며, 대립유전자형은 C/T이다. 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, C 또는 T일 수 있으므로 "y"라고 기재하였다.
상기 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 rs147390019로 표시하여 기재할 수 있다. 상기 rs147390019는 13q14 상의 NUDT15 내에 존재하며, 대립유전자형은 A/G이다. 상기 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, A 또는 G일 수 있으므로 "r"이라고 기재하였다.
상기 NUDT15 단백질(NCBI accession no. NP_060753.1)은 164개의 아미노산으로 이루어졌으며, 아미노산 서열은 서열번호 2에 기재하였다.
상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드가 C인 경우에 NUDT15 단백질(서열번호 2)의 139번째 아미노산은 아르기닌(R)이고, T인 경우에는 시스테인(C)이다.
상기 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드가 G인 경우에 NUDT15 단백질(서열번호 2)의 139번째 아미노산은 아르기닌(R)이고, A인 경우에는 히스티딘(H)이다.
본 발명의 다형성(polymorphism)은 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미하며, '다형성부위(polymorphic site)'란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 ‘단일염기다형성’, 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.
본 발명의 연관불평형 (Linkage Disequilibrium)이란 집단유전학에서 반드시 동일 염색체상에 존재하는 두 개 이상의 유전자좌 (loci)에서의 대립유전자의 비-무작위적 연관 (non-random association)을 의미한다.
본 발명은 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 상기 확인된 유전자형으로 백혈구 감소증 발병 위험을 예측하는 단계를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 백혈구 감소증 발병 위험을 예측하는 단계는 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T 또는 상기 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드의 유전자형이 A인 경우, 백혈구 감소증 발병 위험이 높은 것으로 예측할 수 있다.
상세하게는, 상기 백혈구 감소증은 티오퓨린(thiopurine)에 의해 유도되는 것일 수 있으며, 보다 상세하게는, 상기 티오퓨린은 아자티오프린(azathioprine; AZA) 또는 6-머캡토퓨린(6-mercaptopurine; 6-MP)이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시료로부터 DNA를 추출하는 단계에서, DNA는 대상의 혈액, 피부세포, 점막 세포 및 모발 등 모든 세포로부터 분리될 수 있다. 해당 세포로부터 DNA를 추출하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 기술 또는 시판되고 있는 DNA 추출용 키트를 사용할 수 있다.
상기 유전자형을 확인하는 단계에서는 유전자 서열 분석이 수행될 수 있다. 서열분석은 당업계에 공지된 방법을 모두 이용할 수 있으며, 구체적으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 자동염기서열분석기를 사용하거나, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCRSSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법 및 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법 중 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 키트를 제공한다. 상기 키트는 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트가 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 실험 대상
한국 서울 아산병원에서 티오퓨린을 사용한 1191명의 크론병(CD) 환자들 중에서, 978명의 환자들을 본 발명에 포함시켰다(도 1, 표 1). 213명의 환자들은 충분하지 않은 티오퓨린 치료를 받은 것으로 판단되어 본 발명에서 제외하였다. 백혈구 감소증 발병은 없었으나 여러 이유로 AZA를 8주 이상, 1 mg/kg/day 이상으로 투여받지 못한 환자들은 불충분한 치료를 받은 것으로 판단하였다. 978명의 환자들 중에서, 66명에게서 티오퓨린 치료 후 처음 8주 내에 백혈구 감소증이 발병하였고[초기 백혈구 감소증(early leukopenia) 환자 케이스], 280명에게서 처음 8주 후에 백혈구 감소증이 발병하였으며[후기 백혈구 감소증(late leukopenia) 환자 케이스], 632명에게서는 AZA를 8주 이상, 1 mg/kg/day 이상으로 투여하였으나 백혈구 감소증이 발병하지 않았다[대조군]. 본 발명에 참가한 모든 참가자는 한국인이었다. 크론병 진단은 기존의 임상적 판단, 방사선 검사, 내시경 검사 및 병리조직학적 검사 기준에 기초하였다. 본 연구는 아산병원 임상시험심사위원회의 승인을 받았고, 모든 참가자로부터 사전 동의를 얻었다.
Figure 112014127712863-pat00001
2. 티오퓨린의 사용
티오퓨린의 처방은 AZA 또는 6-MP 중 하나를 저용량에서 시작하였고, 몸무게에 기초한 목적 용량까지 여러 달에 걸쳐 천천히 투약을 증가시켰다. 본 발명자들은 티오퓨린 치료를 시작하기 전에 TPMT 유전자형이나 효소 활성은 확인하지 않았다. 이상반응(adverse events)에 따른 티오퓨린 약물의 용량 수정 또는 중단에 대해서는 책임있는 의사가 케이스 별로 결정하였다.
3. 백혈구 감소증 판단
각 환자에 대한 과거의 의료 기록은 검토되었고, 용량, 치료기간 및 백혈구 감소증의 발병시기 및 정도를 포함하는 티오퓨린 치료에 대한 정보는 유전자형 분석 결과를 알지 못하는 3명의 의사 중 2명에 의해 독립적으로 평가되었다.
아산병원에서 측정된 WBC의 정상 범위는 4,000-10,000/mm3였다. 본 발명에서 백혈구 감소증이란 WBC 수가 3000/mm3 보다 낮은 경우를 의미하는데, 미국 국립암연구소의 이상반응 평가기준(National Cancer Institute's Common Terminology Criteria for Adverse Events; NCI-CTCAE) version 4.0에 의하면, grade 2는 2,000-3,000/mm3, grade 3은 1,000-2,000/mm3 및 grade 4는 1,000/mm3 이하이다. 3,000-4,000/mm3의 WBC 수(NCI-CTCAE grade 1)는 백혈구 감소증으로 판단하지 않았으나, 백혈구 감소증의 경계라고 판단하였다. 백혈구 감소증이 여러 차례 발병한 환자는 첫 번째 발병시의 가장 낮은 WBC 수에 따라 백혈구 감소증의 단계를 결정하였다. 6-MP의 용량은 6-MP 용량에 2.08을 곱하여 AZA 당량으로 조정하였다.
4. 단일염기다형성 유전자형 및 연관 분석
티오퓨린 치료에 따라 백혈구 감소증이 발병한 197명의 환자(초기 33명 및 후기 164명) 및 백혈구 감소증이 발병하지 않은 307명의 대조군 환자에 대한 발굴 분석(discovery analysis)을 우선 수행하였는데, P<10-5의 어떤 시그널도 발견하지 못했다. 초기 백혈구 감소증을 가진 환자들이 후기 백혈구 감소증을 가진 환자들보다 유전적 변이에 있어서 더 큰 효과가 있을 것이라는 예측에 기초하여, 초기 백혈구 감소증에 초점을 맞추어 분석하였다. 발굴 코호트(discovery cohort)로서 초기 백혈구 감소증을 가진 33명의 환자 및 307명의 대조군에서 면역칩(Immunochip)을 사용하여 발굴 분석을 수행하였다. 발굴 분석으로부터 선택된 SNPs에 대한 1단계 재현 분석은 재현 코호트(replication cohort)로서 추가적인 초기 백혈구 감소증을 가진 33명의 환자 및 325명의 대조군에서 TaqMan SNP genotyping assays를 이용하여 수행하였다. 다음으로, 발굴 및 1단계 재현 분석으로부터 확인된 SNPs에 대해, 발굴 및 재현 코호트로서 후기 백혈구 감소증을 가진 280명의 환자 및 632명의 대조군을 이용하여 2단계 재현 분석으로 검증하였다(도 1). 또한, 본 발명자들은 모든 참가자에 대하여 TPMT 유전자형(rs1142345)을 결정하였다.
5. 대치법( Imputation )
유전적 변이의 적용범위를 개선하기 위해서, 발굴 샘플에서 결정되지 않은 유전형은 1,000 Genomes Project databases (Feb 2012 release) 및 IMPUTE (v2.0)를 통해 Asian reference panel (Japanese in Tokyo and Han Chinese in Beijing)을 사용하여 대치시켰다.
6. NUDT15 의 형질감염 및 세포사멸 분석
티오퓨린-유도 세포독성 효과에 대한 NUDT15 코딩 변이(R139C)의 기능적 역할을 알아보기 위해서, 본 발명자들은 NUDT1 야생형 또는 돌연변이의 형질감염 후, 6-MP에 대한 Jurkat 세포 감수성을 측정하였다.
리포펙타민 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여, NUDT15 야생형(139R) 또는 NUDT15 돌연변이(139C) 중 하나로 Jurkat 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후, 7.5 uM 6-MP (Sigma Aldrich, St.Louis, MS)를 처리하기 전에 세포들은 24시간 동안, 5% CO2, 37℃에서 회복되었다. 7.5 uM 6-MP에 대한 세포 감수성은 새포 생존 및 세포사멸 분석을 통해 측정하였다. 세포 생존을 평가하기 위해서, 세포는 배지에 4x 희석하였고, 트립판 블루 생존 염색액에 2x 희석하였다. 생존 세포는 100x 배율 현미경을 이용하여 혈구계산기(hemocytometer)로 계수하였다. FITC Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 세포사멸 분석을 위해 사용되었다. 세포는 PBS로 씻어냈고, 100 ul 1x annexin-binding buffer(10mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5mM CaCl2, pH 7.4)에 재현탁하였다(~1x106 cells/mL). 그 후, 1 ul의 프로피디움 아이오디드(propidium iodide)(100 ug/mL, diluted in 1x annexin-binding buffer) 및 5 ul의 FITC annexin V로 상온에서 15분 동안 반응시킨 다음, 400 ul의 1x annexin-binding buffer를 첨가하였다. 약물 처리에 따른 세포사멸은 annexin V 및 프로피디움 아이오디드(propidium iodide) 염색을 이용하여 BD FACS Canto II (BD Biosciences, San Jose, CA)에 의해 측정하였다. 데이타는 Student's t test로 분석하였고, P <0.05가 통계학적 유의성 있게 판단되었다.
< 실시예 1> 초기 백혈구 감소증에 있어서 발굴 연관 분석
본 발명자들은 초기 백혈구 감소증을 가진 33명의 환자 및 307명의 대조군에서 96,048 유전자형 SNPs의 발굴 연관 분석을 수행하였고, 과도한 P 수치가 분위-분위 분포(quantile-quantile distribution)의 꼬리 부분에서 관측되었지만, 전체적인 분포에서는 인구집단 층화(population stratification)로 인한 어떤 팽창(inflation)의 징후도 나타나지 않았다(λGC=1.041). 발굴 분석에서는 P<10- 5 에서 4개의 연관성이 나타났는데, 이들은 3p25.1 상 rs9843344(FBLN2), 6p22.3 상 rs1986731(CMAHP-pseudogene), 8q24.22 상 rs2945770(ST3GAL1) 및 14q31.1 상 rs17109616(NRXN3)였다. 또한, TPMT 유전좌위(locus) 내의 rs1142345 (TPMT*3C) (odds ratio, 7.11; P=1.61x10-4) SNP에서 시사적 연관성을 발견하였다(표 2). 또한, 발굴 분석에 있어서 유전적 변이의 적용범위를 개선하기 위해서, 본 발명자들은 453,532개의 대치된 SNPs에 대한 연관성 분석을 수행하였고, P<10-5인 1q32, 8q22, 13q14 및 14q31의 추가적인 4개 유전좌위를 발견하였다. 오직 13q14 상의 SUCLA2 / NUDT15 / MED4 부위만이 P<10-19의 다중 시그널을 나타냈는데(rs79076357, rs1168552132, rs142829497, rs73481212), rs142829497 (odds ratio, 24.2; P=2.36x10-23)이 가장 상위였다. 또한 rs142829497에 추가적으로, NUDT15의 139번 위치에서 아미노산 치환(염기성 아르기닌이 극성 시스테인으로 변경)을 야기하는 rs116855232가 검증을 위해 선택되었다.
Figure 112014127712863-pat00002
< 실시예 2> 재현 분석( Replication analysis )
발굴 분석에서 선택된 SNPs를 검증하기 위해서, 본 발명자들은 추가적인 초기 백혈구 감소증을 가진 33명의 환자 및 325명의 대조군에서 발굴된 10개 SNPs에 대해 우선적으로 유전자형을 분석하였다. Rs73481212는 분석 실패로 인해 추후 분석에서 배재된 rs142829497를 대신하였다. 13q14 상 SUCLA2 / NUDT15 / MED4 부위 내의 2개 SNPs가 유전체 전반에 걸친 유의성이 있는 것으로 확인되었다(표 2). nonsynonymous SNP인, rs116855232 (R139C)가 면역칩 및 검증 분석을 종합한 결과, 가장 유의성이 높고 강력한 연관성을 나타냈다(odds ratio, 35.6; combined P=4.88x10-94)(표 3). 다른 SNP인, rs73481212는 1.92x10-70의 조합 P value를 보였다(표 2). Rs 73481212는 rs116855232와 연관불균형(linkage disequilibrium; LD)이었고, 연관성은 rs116855232 (R139C)와 독립적이지 않았다. 또한, 잘 알려진 TPMT*3C 대립유전자(allele)(rs1142345)는 검증 샘플에서는 일관된 연관성을 보였으나(P<0.05), 조합 샘플로부터의 결과는 유전체 전반에 걸친 유의성을 보이지 않았다(P value of 2.95x10-5)(표 2).
Figure 112014127712863-pat00003
rs116855232는 SUCLA2, NUDT15 및 MED4를 포함하는 ~185 kb LD 부위 내에 위치하므로, 본 발명자들은 한국인의 SUCLA2 / NUDT15 / MED4 부위에서 nonsynonymous SNPs를 탐색하였다. 추가적인 2개의 nonsynonymous SNPs인, SUCLA2 내의 rs7320366 및 NUDT15 내의 rs186364861가 확인되었는데, 이는 rs116855232와 낮은 LD를 보였다(각각 r 2 = 0.33, 0). 하지만 rs7320366만이 유의성을 보였으나, 백혈구 감소증과의 연관성은 강하지 않았다(odds ratio, 5.03; combined P=3.55x10-20). 그 후, 조건부 로지스틱 회귀분석(conditional logistic regression analysis)에서는 SUCLA2 내 rs7320366의 연관성이 선두 SNP인 NUDT15 내 rs116855232의 연관성과 독립적이지 않았다.
rs116855232의 T 대립유전자(allele)가 초기 백혈구 감소증의 발생에 주된 역할을 하는 것이 명확해짐에 따라, 본 발명자들은 후기 백혈구 감소증의 경우에도 rs116855232의 연관성 분석을 수행하였다. 표 4에서 나타낸 바와 같이, 후기 백혈구 감소증과의 연관성은 초기 백혈구 감소증보다 훨씬 더 완화되었다.
Figure 112014127712863-pat00004
< 실시예 3> 백혈구 감소증에 대한 위험 예측자로서 NUDT15 R139C
발굴 및 재현 분석 결과에 기초하여, 본 발명자들은 NUDT15 139C 대립유전자(allele)가 전체 백혈구 감소증 환자의 42.5% (147/346) 및 대조군의 6.8% (43/632)에서 존재한다는 것을 밝혀냈는데(표 5), 이는 NUDT15 139C의 존재가 곡선하 면적(area under the curve; AUC) 수치 0.68로서, 모든 백혈구 감소증에 대한 위험 예측자로서 42.5% (147/346)의 감수성 및 93.2% (589/632)의 특이성을 갖는다는 것을 의미한다. 예상되는 티오퓨린-유도 백혈구 감소증에 대한 NUDT15 139C 대립유전자(allele)의 양성 및 음성 예측 수치는 각각 77.4 % (147/190) 및 74.7% (589/788)였다.
Figure 112014127712863-pat00005
초기 백혈구 감소증으로 범위를 좁히면, NUDT15 139C 대립유전자(allele)는 초기 백혈구 감소증 환자의 89.4% (59/66)에서 존재했으나, 대조군 및 후기 백혈구 감소증 환자 조합에서는 14.4% (131/912)만이 존재하는 것으로 나타났다(표 5). 이는 NUDT15 139C의 존재가 곡선하 면적(area under the curve; AUC) 수치 0.89로서, 초기 백혈구 감소증에 대한 위험 예측자로서 89.4% (59/66)의 감수성 및 85.6% (781/912)의 특이성을 갖는다는 것을 의미한다. 예상되는 티오퓨린-유도 백혈구 감소증에 대한 NUDT15 139C 대립유전자(allele)의 양성 및 음성 예측 수치는 각각 31.1% (59/190) 및 99.1% (781/788)였다.
상기 결과에 따르면, NUDT15 139C 대립유전자(allele)를 가지고 있지 않은 대상과 비교했을 때, 1 카피(copy)를 가진 대상은 티오퓨린-유도 초기 백혈구 감소증이 발병할 위험이 88배 높은 것으로 나타났다(heterozygous odds ratio)(표 5). 대조군은 모두 139C 대립유전자(allele)에 대해 동형접합성(homozygous)이 아닌 것으로 나타났다. 또한, NUDT15 139C 대립유전자(allele)의 카피 수가 증가하면, 백혈구 감소증을 유발하는 티오퓨린의 용량이 낮아졌고, 티오퓨린 치료 시작으로부터 백혈구 감소증이 유발되는 간격이 짧아졌으며, 백혈구 감소증의 단계가 더 높아졌다(표 6).
Figure 112014127712863-pat00006
반면, TPMT*3C 대립유전자는 초기 백혈구 감소증 환자의 12.1% (8/66)에서 나타났으나, 대조군 및 후기 백혈구 감소증 환자 조합에서는 단지 2.2% (20/912)만이 나타났는데, 이는 TPMT*3C 대립유전자의 존재가 초기 백혈구 감소증에 대한 위험 예측자로서 12.1% (8/66)의 감수성 및 97.8% (892/912)의 특이성을 갖는다는 것을 의미한다. 초기 및 후기 백혈구 감소증의 조합 분석에서, TPMT*3C 대립유전자는 모든 백혈구 감소증 환자의 3.8% (13/346) 및 대조군의 2.4% (15/632)에서 나타났는데, 이는 TPMT*3C 대립유전자의 존재가 모든 백혈구 감소증에 대한 위험 예측자로서 3.8% (13/346)의 감수성 및 97.6% (617/632)의 특이성을 갖는다는 것을 의미한다.
< 실시예 4> rs116855232 의 생물기능적 결과
24시간 동안 6-MP를 처리한 후, 돌연변이 NUDT15로 형질감염된 생존 세포의 수는 야생형-형질감염된 대조군 세포에 비해 감소하였다(p<0.001)(도 2). 또한, 세포사멸 마커인 표면 Annexin 4는 야생형-형질감염된 대조군 세포에 비해 돌연변이-형질감염된 세포에서 유의성 있게 증가하였는데(P=0.02), 이는 티오퓨린-유도 세포독성에 대한 돌연변이 NUDT15의 역할을 뒷받침한다.
< 실시예 5> 백혈구 감소증에 대한 위험 예측자로서 NUDT15 R139H
본 발명자들은 NUDT15 139C 대립유전자(allele)를 가지고 있지 않은 초기백혈구 감소증 환자 7명에서 추가 분석으로 2명이 139번째 아미노산이 시스테인이 아닌 히스티딘을 가지고 있는 것을 확인하고, 후기백혈구 감소증 환자 및 대조군을 모두 분석한 결과 후기 백혈구 감소증 환자에서도 4명이 139번째 아미노산 히스티딘을 가지고 있는 것으로 확인하였다(표 7 내지 표 9).
Figure 112014127712863-pat00007
Figure 112014127712863-pat00008
Figure 112014127712863-pat00009
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Composition for predicting risk of thiopurine induced leukopenia comprising single nucleotide polymorphism marker in NUDT15 gene <130> ADP-2014-0562 <150> KR 10-2014-0007821 <151> 2014-01-22 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctgttatcta aataaattga tttagcatct ttcttttcta ggttgggagt gggttccttg 60 ggaagaacta cctcccctgg accagctttt ctggggactg yrttgtttaa aagaacaagg 120 ctatgatcca tttaaagaag atctgaacca tctggtggga tacaaaggaa atcatctcta 180 ggtggccgag aagatttgat t 201 <210> 2 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Ala Ser Ala Gln Pro Arg Gly Arg Arg Pro Gly Val Gly Val 1 5 10 15 Gly Val Val Val Thr Ser Cys Lys His Pro Arg Cys Val Leu Leu Gly 20 25 30 Lys Arg Lys Gly Ser Val Gly Ala Gly Ser Phe Gln Leu Pro Gly Gly 35 40 45 His Leu Glu Phe Gly Glu Thr Trp Glu Glu Cys Ala Gln Arg Glu Thr 50 55 60 Trp Glu Glu Ala Ala Leu His Leu Lys Asn Val His Phe Ala Ser Val 65 70 75 80 Val Asn Ser Phe Ile Glu Lys Glu Asn Tyr His Tyr Val Thr Ile Leu 85 90 95 Met Lys Gly Glu Val Asp Val Thr His Asp Ser Glu Pro Lys Asn Val 100 105 110 Glu Pro Glu Lys Asn Glu Ser Trp Glu Trp Val Pro Trp Glu Glu Leu 115 120 125 Pro Pro Leu Asp Gln Leu Phe Trp Gly Leu Arg Cys Leu Lys Glu Gln 130 135 140 Gly Tyr Asp Pro Phe Lys Glu Asp Leu Asn His Leu Val Gly Tyr Lys 145 150 155 160 Gly Asn His Leu

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드 및 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드 중 어느 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 C/T이고, 상기 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 A/G인 것을 특징으로 하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 백혈구 감소증은 티오퓨린(thiopurine)에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 티오퓨린(thiopurine)을 투여한 크론병, 궤양성 대장염, 백혈병 또는 장기이식 환자의 백혈구 감소증 발병 위험을 예측하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 티오퓨린은 아자티오프린(azathioprine; AZA) 또는 6-머캡토퓨린(6-mercaptopurine; 6-MP)인 것을 특징으로 하는 티오퓨린(thiopurine) 유도 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물.
  6. 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    상기 추출한 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및
    상기 확인된 유전자형으로 백혈구 감소증 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 단계를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 백혈구 감소증 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 단계는 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T 또는 상기 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드의 유전자형이 A인 경우, 백혈구 감소증 발병 위험이 높은 것으로 예측하기 위한 정보를 제공하는 것을 특징으로 하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 정보를 제공하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 백혈구 감소증은 티오퓨린(thiopurine)에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 티오퓨린은 아자티오프린(azathioprine; AZA) 또는 6-머캡토퓨린(6-mercaptopurine; 6-MP)인 것을 특징으로 하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 정보를 제공하는 방법.
  10. 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 102번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 백혈구 감소증은 티오퓨린(thiopurine)에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 티오퓨린은 아자티오프린(azathioprine; AZA) 또는 6-머캡토퓨린(6-mercaptopurine; 6-MP)인 것을 특징으로 하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 키트.
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