KR102304562B1 - 약물 유도 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 il6 유전자 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 백혈구 감소증 발병 위험 예측 방법 - Google Patents

약물 유도 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 il6 유전자 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 백혈구 감소증 발병 위험 예측 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IL6 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물 및 이를 이용한 백혈구 감소증 발병 위험 예측 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 IL6 유전자 내의 단일염기다형성 마커는 약물, 특히 치오퓨린 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증의 발병 위험과 높은 상관관계를 가지고 있는바, 이를 이용하여 백혈병, 크론병, 궤양성 대장염, 또는 장기이식 등에서 치오퓨린 계열 약물 치료 중 발생하는 백혈구 감소증에 대해 감수성이 높은 환자를 조기에 효과적으로 예측 또는 진단할 수 있고, 이를 통해 환자에게 적합한 약물을 투여하여 최적의 치료 효과를 달성할 수 있는 환자 맞춤형 치료를 효율적으로 수행할 수 있다. 나아가 본 발명에 따른 단일염기다형성 마커를 약물 유도 백혈구 감소증의 치료를 위한 약물 개발 연구에 활용할 수 있다.

Description

약물 유도 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 IL6 유전자 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 백혈구 감소증 발병 위험 예측 방법 {IL6 single nucleotide polymorphism marker in gene for predicting risk of drug induced leukopenia and method for predicting risk of drug induced leukopenia using the same}
본 발명은 IL6 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물 및 이를 이용한 백혈구 감소증 발병 위험 예측 방법에 관한 것이다.
치오퓨린(thiopurine)계열 약물인 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 아자치오퓨린(azathiopurine), 치오구아닌(thioguanine) 등은 백혈병, 크론병, 궤양성 대장염과 같은 환자의 치료에 널리 사용되는 면역 억제성(immunosuppressive) 약물이다. 치오퓨린 계열 약물 사용에 있어서 주요 문제점은 BSA에 따라 계산된 예정된 용량의 약물을 복용하기 시작하더라도 약 6%의 환자에서 백혈구 감소증이나 간독성 등의 부작용이 나타난다는 것이다. 치오퓨린 계열 약물의 활성은 S-메틸트랜스퍼라제(thiopurine S-methyltransferase; TPMT)와 연관되어 있는데, 이와 관련하여 TPMT 유전자에 돌연변이를 가지고 있는 경우 TPMT 효소 활성이 감소하고 TGN 대사물질(metabolite)이 증가하여 심각한 골수억제가 발생할 수 있다는 결과가 보고되었다. 따라서 이러한 위험을 줄이기 위해 미국 식품 의약안전청은 치오퓨린 계열 약물을 사용하기 전에 TPMT 효소 활성을 측정할 것을 권고하고 있다. 하지만 아시아인에서 TPMT 돌연변이 발생 빈도는 2 내지 3%로 백인에서(10%) 보다 현저히 낮은 빈도로 발견되는 것을 고려해 볼 때, 아시아인에서 TPMT의 효소 활성을 미리 측정하는 것이 유용성이 있을지는 의문이다. 또한 이전의 연구에 의하면, 치오퓨린에 의해 유도되는 백혈구 감소증의 유전적 원인으로 보고되었던 NUDT15 돌연변이의 경우 한국인 백혈구 감소증 환자의 42.5%에서 비교적 높은 빈도로 관찰되긴 하나, NUDT15 돌연변이로 설명되지 않는 나머지 환자를 고려해 볼 때, 아시아인에서 발병하는 백혈구 감소증의 유전적 원인에 대한 이해는 여전히 부족하다.
한국 등록특허공보 제10-1704143호
이에 본 발명자들은 치오퓨린 계열 약물에 의해 발생하는 부작용 중 하나인 백혈구 감소증의 발병 위험성을 예측할 수 있는 마커를 개발하고자 연구를 수행한 결과, IL6 유전자 내의 특정 단일염기다형성 부위와 백혈구 감소증 발병과의 유의성 있는 상관관계를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 IL6 유전자 내의 단일염기다형성 마커를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 단일염기다형성 마커 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 백혈구 감소증 발병 위험 예측에 대한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 부위를 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성 부위를 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 백혈구 감소증 발병 위험 예측 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시료 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 백혈구 감소증 발병 위험 예측에 대한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 따른 IL6 유전자 내의 단일염기다형성 마커는 약물, 특히 치오퓨린 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증의 발병 위험과 높은 상관관계를 가지고 있는바, 이를 이용하여 백혈병, 크론병, 궤양성 대장염, 또는 장기이식 등에서 치오퓨린 계열 약물 치료 중 발생하는 백혈구 감소증에 대해 감수성이 높은 환자를 조기에 효과적으로 예측 또는 진단할 수 있고, 이를 통해 환자에게 적합한 약물을 투여하여 최적의 치료 효과를 달성할 수 있는 환자 맞춤형 치료를 효율적으로 수행할 수 있다. 나아가 본 발명에 따른 단일염기다형성 마커를 약물 유도 백혈구 감소증의 치료를 위한 약물 개발 연구에 활용할 수 있다.
도 1은 6-머캅토퓨린을 사용한 백혈병 환자들 중 본 발명의 일 실시예에서 분석 대상으로 이용할 환자군을 선정하기 위한 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 IL6 유전자상의 단일염기다형성 부위(rs13306435)와 복용량 비율(dose percentage) 감소와의 상관관계(Trend test)를 확인한 구체적인 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 IL6 유전자상의 단일염기다형성 부위(rs13306435)와 G4N(Grade 4 Neutropenia)와의 상관관계(Trend test)를 확인한 구체적인 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
일 양태로, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 부위를 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, '다형성(polymorphism)'은 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미하며, '다형성 부위(polymorphic site)'란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 '단일염기다형성', 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.
본 발명에 있어서, '대립유전자(allele)'는 상동염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에 있어서, 상기 "서열번호 1"은 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다.
구체적으로, 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드는 7p15.3 상의 IL 유전자 좌에 존재하는 것으로, rs13306435로 표시할 수 있다. 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드, 즉 rs13306435 의 대립유전자형은 T이다. 변이가 일어났을 시의 대립유전자형은 A이다. 따라서 서열번호 1의 101 번째 뉴클레오티드는 A 또는 T(U)일 수 있으므로 다중염기 기재 방식에 따라 “w”로 기재하였다.
본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 20 내지 80개, 보다 더 바람직하게는 40 내지 60개의 연속 염기로 구성될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 백혈구 감소증은 치오퓨린(thiopurine) 계열 약물에 의해 유도되는 것을 포함하며, 예를 들어, 백혈병, 크론병, 궤양성 대장염, 또는 장기이식 환자에서 치오퓨린(thiopurine) 계열 약물 치료시 유도되는 것일 수 있다.
상기 치오퓨린 계열 약물에는 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine), 아자치오프린(azathioprine) 또는 치오구아닌(thioguanine) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 단일염기다형성 마커가 백혈구 감소증 발병 위험 예측에 이용될 수 있다는 것은, 치오퓨린계 약물 투여에 따라 발생하는 부작용인 백혈구 감소증이 발병된 군의 유전자 분석 결과 단일염기다형성 부위에서 특정 염기가 존재할 확률이 높다는 것에 근거한 것이다.
본 발명에 따른 IL6 유전자 내의 단일염기다형성 마커는 약물, 특히 치오퓨린 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증 및 이로 인한 복용량 감소와 높은 상관관계를 가지고 있는바, 이를 이용하여 백혈병, 크론병, 궤양성 대장염, 또는 장기이식 등 치오퓨린 계열 약물 치료 중 발생하는 백혈구 감소증에 대해 감수성이 높은 환자를 조기에 효과적으로 예측 또는 진단할 수 있고, 이를 통해 환자에게 적합한 약물을 투여하여 최적의 치료 효과를 달성할 수 있는 환자 맞춤형 치료를 효율적으로 수행할 수 있다. 나아가 본 발명에 따른 단일염기다형성 마커를 약물 유도 백혈구 감소증의 치료를 위한 약물 개발 연구에 활용할 수 있다.
다른 양태로, 본 발명은 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 부위를 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 백혈구 감소증 발병 위험 예측 키트를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드이다. 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브 또는 프라이머일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
상기 키트는 상기 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법에 따라 다양한 형태의 키트일 수 있으며, 예를 들어, PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양태로, 본 발명은 시료 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 백혈구 감소증 발병 위험 예측에 대한 정보제공방법을 제공한다.
이때 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형이 A 인 경우, 백혈구 감소증 발병 위험 확률이 높은 것으로 예측할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 대립유전자형이 TA 또는 AA인 경우, 대립유전자형이 TT인 경우에 비해 백혈구 감소증 발병할 확률이 높은 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에 있어서, 백혈구 감소증은 치오퓨린(thiopurine) 계열 약물에 의해 유도되는 것을 포함하며, 예를 들어, 백혈병, 크론병, 궤양성 대장염, 또는 장기이식 환자에서 치오퓨린(thiopurine) 계열 약물 치료시 유도되는 것일 수 있다.
상기 치오퓨린 계열 약물에는 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine), 아자치오프린(azathioprine) 또는 치오구아닌(thioguanine) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 정보제공방법은 시료 DNA를 수득하기 위하여, 생물학적 시료로부터 DNA를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 분리는 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl AmmoniumBromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 등을 이용하거나, 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 생물학적 시료에는 대상의 혈액, 타액, 뇨, 피부세포, 점막 세포 및 모발 등 모든 조직이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자형을 확인하는 단계를 수행하기 위하여 유전자 서열 분석이 수행될 수 있다. 서열 분석은 당업계에 공지된 방법을 모두 이용할 수 있으며, 예를 들어, 자동염기서열분석기를 사용하거나, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화 법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법 (rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화 법 및 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법을 이용할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 대상의 선정
한국 서울대병원과 서울아산병원에서 6-머캅토퓨린을 사용하여 유지요법을 진행한 298명의 소아 ALL 환자들을 1차 선별하였다. 이 중 재발, 버킷림프종, 임상 데이터 부재 등의 이유로 총 54명을 본 실험에서 제외하였다. 또한 244명 중에서도, star allele 개념에 근거하여 NUDT15, TPMT 유전자가 정상적인 활성(normal activity)인 188명을 분석대상으로 설정하였다. 본 실험에 참가한 모든 참가자는 한국인이었으며, 구체적인 실험 대상의 선정 과정을 하기 도 1 및 표 1에 나타내었다.
NUDT15
Normal Metabolizer
(*1/*1) 		NUDT15
Intermediate Metabolizer
(*1/*2, *1/*3, *1/*4, *1/*5, *1/*6, *1/*9) 		NUDT15
Poor Metabolizer
(*3/*3)
total
TPMT
Normal Metabolizer
(*1/*1, *1/*1S, *1S/*1S)
188 48 1 237
TPMT
Intermediate Metabolizer
(*1/*3C, *1S/*3C, *1/*6)
6 1 7
TPMT
Poor Metabolizer
total
194 49 1 244
소아 암 그룹(Children's Cancer Group; CCG)의 치료요법(treatment protocols)에 의하면, 6-머캅토퓨린의 초기 권장 용량은 75mg/m2이다. 하지만 서울아산병원에서 해당 용량으로 치료를 진행한 상당수의 환자에서 심각한 약물 독성을 보여 화학요법을 중단하는 결과를 보이는 바, 초기 투여 용량을 75mg/m2에서 50mg/m2으로 조정하였다. 치료를 위한 프로토콜은 이상반응(adverse events)에 따른 약물 용량 수정 또는 중단에 대해서는 책임 있는 의사가 케이스 별로 결정하였다. 각 환자에 대한 과거의 의료기록은 검토되었고, 용량, 치료기간 및 백혈구 감소증의 발병 시기 및 정도를 포함하는 6-머캅토퓨린에 대한 정보는 유전자형 분석 결과를 알지 못하는 의사에 의해 독립적으로 평가되었다.
6-머캅토퓨린은 총 12주 동안 지속되는 한 싸이클(cycle)의 동일 항암 치료를 6-10회 반복하는 스케줄로 처방되었다. 첫 싸이클에서는 체표면적(Body Surface Area; BSA)에 기초한 예정된 용량의 약물 복용을 시작하였고, 백혈구 감소증이나 간독성 등의 이상반응(adverse events)에 따라 6-머캅토퓨린 용량을 계속적으로 감량하면서 싸이클을 지속하였다.
본 발명에서는 복용량 비율(dose percentage)이라는 개념을 도입하여 환자가 부작용 없이 복용할 수 있는 치오퓨린의 최대 복용량을 정의하였다. 복용량 비율(dose percentage)은 유지요법 마지막 사이클의 BSA에 기반한 복용량과 실제 복용량의 비율이며, 다음과 같이 정의된다.
Figure 112019135698006-pat00001
또한, G4N(Grade 4 Neutropenia incidence)라는 개념을 도입하여, ANC(Absolute Neutrophil Count)<500로 정의되는 4단계 호중구 감소증의 상대적인 발생빈도를 표현하였다.
Figure 112019135698006-pat00002
본 분석에서는 표 1에서 정의된 전체 244명의 환자 중, NUDT15와 TPMT가 모두 정상적인 대사자(normal metabolizer)인 188명의 환자를 대상으로 복용량 비율(dose percentage)에 대한 분석을 진행하였다. 또한 상기 188명 중 G4N 임상정보가 있는 185명을 대상으로 G4N에 대한 분석을 진행하였다.
실시예 2. 전체 엑솜 시퀀싱(Whole Exome Sequencing)을 통한 유전자, 변이 분석
실시예 1에서 선별한 188명의 환자들을 대상으로 골수, 혈액에서 DNA를 추출한 후 전체 엑솜 시퀀싱을 진행하였다. 도1에 나온 바와 같이, GVB를 이용하여 복용량 비율(dose percentage), G4N을 종속변수로 하는 다중 공변량 선형 회귀 분석(multiple covariate linear regression analysis)을 실행하여 후보 유전자들을 선정하였다. GVB(Genetic Variant Burden)라 함은 변이의 독성(deleteriousness)을 나타내는 지표인 SIFT 점수 중 0.7 미만인 SIFT 점수들의 geometric mean을 의미한다. 다음으로 후보 유전자들의 모든 변이에 대하여 dose percentage, G4N을 종속변수로 하는 다중 공변량 선형 회귀 분석을 실행하였고, 표 2에 표시된 후보 변이 3개를 선정하였다. 이 중 nonsynonymous variant에 해당하는 IL6 유전자의 rs13306435 변이를 최종 변이로 선정하였다.
CHR BP REF ALT Gene Name 1KG AF 1KG AFR AF 1KG AMR AF 1KG EAS AF 1KG EUR AF 1KG SAS AF Consequence SIFT CADD dbSNP
7 22771039 T A IL6 0.0204 0.0015 0.0778 0.0258 0.0169 0.0031 missense_variant 0.41 3.534 rs13306435
12 57883741 C T MARS 0.0064 0 0 0.0308 0 0.001 synonymous_variant 0.01 14.08 rs117101415
12 57906592 G A MARS 0.0064 0 0 0.0308 0 0.001 synonymous_variant 1 17.87 rs117633211
실시예 3. 회귀분석(Regression analysis)을 통한 유전자, 변이 분석
실시예 2에서 최종 후보로 선정된 변이의 복용량 비율(dose percentage), G4N에 대한 영향력을 추가적으로 검증하기 위하여, 실시예 1에서 선별된 188명 중 회귀분석(Regression analysis)을 수행하여 단일염기다형성 부위(rs13306435)가 복용량 비율(dose percentage)에 미치는 영향력을 통계적으로 확인하였다. 회귀분석 시 보정요소로는 성별, 마지막 사이클 시작 시 나이, BSA, 그리고 변이의 유전형(야생형(wild type)이면 0, 이형접합 돌연변이체(heterozygous mutant)면 1, 동형접합 돌연변이체(homozygous mutant)면 2)을 포함하였다. 또한 로지스틱 회귀분석 시에는 복용량 비율(dose percentage) 기준을 10%, 15%, 25%, 35%, 45%, 60%, 80%, 100%로, G4N 기준을 0%, 4%, 6%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%로 하여 분석하였다.
회귀분석 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 통계적으로 유의한(p-value<0.05) 결과에 대해서는 밑줄로 표시하였다.
Gene (variant) Index Type Criteria Case Control P Coefficient(linear regression)
/ OR(logistic regression)
IL6 (rs13306435) DIP(%) Linear regression 0.0015 (-)0.2323
Logistic regression <10 3 185 0.0257 38 (2.04-2382.37)
<15 4 184 0.0264 11.84 (1.18-121.28)
<25 9 179 0.0007 12.61 (2.76-56.05)
<35 25 163 0.0005 7.7 (2.41-24.61)
<45 33 155 0.0044 5.01 (1.62-15.34)
<60 74 114 0.0308 3.46 (1.16-11.61)
<80 129 59 0.3538 1.86 (0.56-8.44)
<100 162 26 0.4102 2.39 (0.45-44.49)
G4N(%) Linear regression 0.0020 0.0053
Logistic regression >0 95 93 0.1935 2.11 (0.71-7.1)
>4 63 125 0.5995 1.34 (0.43-3.91)
>6 48 140 0.4737 1.51 (0.45-4.54)
>8 30 158 0.6332 1.39 (0.3-4.79)
>10 22 166 0.2903 2.09 (0.44-7.45)
>15 11 177 0.0348 4.83 (0.96-19.54)
>20 5 183 0.0026 20.57 (2.9-183.55)
>25 3 185 0.02 25.23 (1.82-699.41)
표 3에 나타낸 바와 같이, 복용량 비율(dose percentage) 기준에서는 10%, 15%, 25%, 35%, 45%, 60%에서 로지스틱 회귀(logistic regression)의 p-값이 유의하였다. 또한 G4N 기준에서는 15%, 20%, 25%에서 로지스틱 회귀(logistic regression)의 p-값이 유의하였다. 두 기준 모두에서 선형 회귀(linear regression)의 p-값이 유의하였다.
실시예 4. T-test(Trend test)를 통한 유전자, 변이 분석
실시예 2에서 최종 후보로 선정된 IL6 유전자의 rs13306435 변이에 대해 Fisher's Exact Test(variant 측면)와 Cochran Armitage Trend Test를 이용한 분석을 수행하였다. Fisher's exact test에 있어서, 특정 단일염기다형성 부위와 백혈구 감소증 발병 상태 및 위험률(odds ratio, OR)은 95% 신뢰구간(confidence intervals, CI)으로 산출하였으며, 통계학적 유의성은 p<0.05로 판정하였다.
그 결과, IL6 유전자상의 단일염기다형성 부위(rs13306435, 서열번호 1의 101번째 염기에 해당)가 백혈구 감소증과 유의한 연관성을 보임을 확인하였다. rs13306435와 복용량 비율(dose percentage) 감소와의 상관관계(Trend test)를 확인한 구체적인 결과를 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다. 통계적으로 유의성 있는 p값을 밑줄로 표시하였다.
Gene (variant) Index Criteria REF HET HOM FET(Dominant) FET(Recessive) CATT
P OR P OR P
(95% CI) (95% CI)
IL6 (rs13306435) DIP(%) <10 1 2 0 0.0171 25.26(1.24-1549.88) 1 0 (0-Inf) 0.0002
≥10 172 13 0
<15 2 2 0 0.0326 12.73(0.86-188.75) 1 0 (0-Inf) 0.0017
≥15 171 13 0
<25 5 4 0 0.0027 11.85(2.06-64.49) 1 0 (0-Inf) 0.0000
≥25 168 11 0
<35 18 7 0 0.001 7.4(2.03-26.62) 1 0 (0-Inf) 0.0001
≥35 155 8 0
<45 26 7 0 0.0063 4.89(1.38-16.96) 1 0 (0-Inf) 0.002
≥45 147 8 0
<60 64 10 0 0.0295 3.38(1-13.19) 1 0 (0-Inf) 0.024
≥60 109 5 0
<80 117 12 0 0.3972 1.91(0.49-10.96) 1 0 (0-Inf) 0.322
≥80 56 3 0
<100 148 14 0 0.6982 2.36(0.33-103.9) 1 0 (0-Inf) 0.4022
≥100 25 1 0
Index Criteria REF HET HOM FET(Dominant) FET(Recessive) CATT
P OR P OR P
(95% CI) (95% CI)
IL6 (rs13306435) G4N(%) >0 85 10 0 0.284 1.99(0.59-7.75) 1 0 (0-Inf) 0.2157
≤0 85 5 0
>4 57 6 0 0.5846 1.32(0.37-4.39) 1 0 (0-Inf) 0.6122
≤4 113 9 0
>6 43 5 0 0.5415 1.47(0.37-5.06) 1 0 (0-Inf) 0.4959
≤6 127 10 0
>8 27 3 0 0.7143 1.32(0.22-5.37) 1 0 (0-Inf) 0.6783
≤8 143 12 0
>10 19 3 0 0.3947 1.98(0.33-8.3) 1 0 (0-Inf) 0.1335
≤10 151 12 0
>15 8 3 0 0.0481 4.99(0.76-24.59) 1 0 (0-Inf) 0.0163
≤15 162 13 0
>20 2 3 0 0.004 20.12(2.1-261.65) 1 0 (0-Inf) 0
≤20 168 12 0
>25 1 2 0 0.0176 24.82(1.22-1523.35) 1 0 (0-Inf) 0.0002
≤25 169 13 0
상기 표 4, 표 5에 나타낸 바와 같이, 복용량 비율(dose percentage) 10%, 15%, 25%, 35%, 45%, 60% 기준과 G4N 15%, 20%, 25%에서 IL6 유전자상의 단일염기다형성 부위(rs13306435)에 대한 대립 유전자 빈도(Allelic Frequency)는 복용량 비율(dose percentage)의 감소와 높은 상관을 보였다.
또한, 유전형(Genotype)과, 복용량 비율(dose percentage) 또는 ANC 빈도의 관계를 Wilcoxon rank sum test를 통해 브록스 플롯(blox plot)으로 나타내었다(도 2 및 3).
도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, Wilcoxon rank sum test를 실시한 결과, 복용량 비율(dose percentage) 기준에서 p-값은 0.0013으로 유의함을 확인하였다. 반면, G4N(Grade 4 Neutropenia incidence) 기준에서 p-값은 0.2803이었다.
이상의 실험 결과를 통해, IL6 유전자상의 단일염기다형성 부위(rs13306435, 서열번호 1의 101번째 염기에 해당)가 백혈구 감소증에 대한 민감도에 영향을 주는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> IL6 single nucleotide polymorphism marker in gene for predicting risk of drug induced leukopenia and method for predicting risk of drug induced leukopenia using the same <130> 1-155P-1 <150> KR 10-2019-0010143 <151> 2019-01-25 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL6 polymorphic sequence <220> <221> misc_feature <222> (101) <223> w being T(U) or A <400> 1 catcatccca tagcccagag catccctcca ctgcaaagga tttattcaac atttaaacaa 60 tcctttttac tttcattttc cttcaggcaa agaatctaga wgcaataacc acccctgacc 120 caaccacaaa tgccagcctg ctgacgaagc tgcaggcaca gaaccagtgg ctgcaggaca 180 tgacaactca tctcattctg c 201

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 부위를 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 치오퓨린(thiopurine) 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드는 IL6 유전자 좌에 위치하는 것을 특징으로 하는, 치오퓨린 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 치오퓨린 계열 약물은 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine), 아자치오프린(azathioprine) 및 치오구아닌(thioguanine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 치오퓨린 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증 발병 위험 예측용 조성물.
  5. 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 부위를 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 치오퓨린(thiopurine) 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 프로브 또는 프라이머인 것을 특징으로 하는, 치오퓨린 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증 발병 위험 예측 키트.
  7. 시료 DNA로부터 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는, 치오퓨린(thiopurine) 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증 발병 위험 예측에 대한 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 방법은 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 유전자형이 A인 경우, 백혈구 감소증 발병 위험이 높은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 치오퓨린 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증 발병 위험 예측에 대한 정보제공방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 방법은 상기 서열번호 1의 101번째 뉴클레오티드의 대립유전자형이 TA 또는 AA인 경우, 백혈구 감소증 발병 위험이 높은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 치오퓨린 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증 발병 위험 예측에 대한 정보제공방법.
  10. 삭제
  11. 제7항에 있어서, 상기 치오퓨린 계열 약물은 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine), 아자치오프린(azathioprine) 및 치오구아닌(thioguanine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 치오퓨린 계열 약물에 의해 유도되는 백혈구 감소증 발병 위험 예측에 대한 정보제공방법.
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