JP2017503523A - Ｎｕｄｔ１５遺伝子内の単一塩基多型マーカーを含むチオプリン誘導白血球減少症の発病危険予測用組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＮＵＤＴ１５遺伝子内の単一塩基多型マーカーを含むチオプリン誘導白血球減少症の発病危険予測用組成物に関するものであって、詳細には、ＮＵＤＴ１５遺伝子内の単一塩基多型マーカーを含むクローン病、潰瘍性大腸炎、白血病または臓器移植患者でチオプリン誘導された白血球減少症の危険予測用組成物、危険予測キット及び危険予測方法に対するものである。本発明によれば、クローン病、潰瘍性大腸炎、白血病または臓器移植患者において、チオプリン治療過程中に発生する白血球減少症に対して、感受性が高い患者を早期に迅速に分類することができて、患者カスタマイズド治療を効率的に行うことができる。

Description

本発明は、ＮＵＤＴ１５遺伝子内の単一塩基多型マーカーを含むクローン病、潰瘍性大腸炎、白血病または臓器移植患者でチオプリン誘導された白血球減少症の危険予測用組成物、危険予測キット及び危険予測方法に関する。

チオプリン（ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ）系薬物であるアザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ；ＡＺＡ）及び６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ；６−ＭＰ）は、癌、臓器移植及び炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ；ＩＢＤ）のような自己免疫疾患や炎症疾患の患者の治療に広く使われる。ＩＢＤ治療に要求されるＡＺＡ容量は、２．０〜３．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであり、６−ＭＰ容量は、１．０〜１．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである。しかし、ＡＺＡ／６−ＭＰ使用において、主要問題点は、前記薬物治療時に、白人ＩＢＤ患者の２〜５％で発生する骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）である。したがって、骨髄抑制の危険を減少させるために、米国食品医薬品局は、チオプリン治療を始める前に、チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ Ｓ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＴＰＭＴ）遺伝子または酵素活性を試験することを勧告している。しかし、以前の研究では、アザチオプリン治療過程で骨髄抑制を経験するＩＢＤ患者の単に１／４のみがＴＰＭＴ突然変異を有したと表われたが、これは、ほとんどの患者において、骨髄抑制が他の要因によって引き起こされるということを意味する。したがって、チオプリン治療を始める前に、ＴＰＭＴ状態に対してあらかじめ試験することの有用性については疑問である。その上に、ＴＰＭＴ突然変異の頻度は、アジア人（２〜３％）が、白人（〜１０％）に対比して低いにも拘らず、チオプリン治療過程で白血球減少症（ｌｅｕｋｏｐｅｎｉａ）は、白人に比べてアジア人でさらに頻繁に発生する。以前研究によれば、韓国人のクローン病（Ｃｒｏｈｎ´ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＤ）患者のチオプリン治療過程において、３１．２％で白血球減少症（白血球細胞［Ｗｈｉｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ；ＷＢＣ］数が＜３０００／ｍｍ^３である場合）が観察された。白血球減少症を示すＡＺＡ容量は、約１．３４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであると観測された。韓国の他の多機関研究では、ＩＢＤ患者の３９．６％で白血球減少症（ＷＢＣ＜３０００／ｍｍ^３）を表わし、前記患者でＡＺＡの平均容量は、１．８０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙに表われた。日本の一研究では、ほとんどの患者において、ＡＺＡの一日投与量が５０ｍｇであったにも、野生型ＴＰＭＴを有した日本のＩＢＤ患者の１５．８％で白血球減少症（ＷＢＣ＜３０００／ｍｍ^３）を表わした。チオプリン治療過程において、白血球減少症が発生するアジア人のＩＢＤ患者の０〜５．６％のみでＴＭＰＴ突然変異が見つけられることを考慮すれば、アジア人で発病する白血球減少症の遺伝的原因に対する理解は依然として不足である。

本発明の目的は、ＮＵＤＴ１５遺伝子内の単一塩基多型マーカーを含む白血球減少症の発病危険予測用組成物を提供するところにある。

また、本発明の他の目的は、前記ＮＵＤＴ１５遺伝子内の単一塩基多型マーカーの遺伝子型を確認する段階を含む白血球減少症の発病危険予測方法を提供するところにある。

また、本発明のさらに他の目的は、前記ＮＵＤＴ１５遺伝子内の単一塩基多型マーカーを含むポリヌクレオチドに特異的に結合するプローブ、または前記ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーを含む白血球減少症の発病危険予測キットを提供するところにある。

前記課題の解決のために、本発明は、配列番号１の１０１番目のヌクレオチド及び配列番号１の１０２番目のヌクレオチドのうち何れか１つ以上の単一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーを含む１０〜１００個の連続したＤＮＡ配列で構成されるポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを含む白血球減少症の発病危険予測用組成物を提供する。

また、本発明は、配列番号１の１０１番目のヌクレオチドまたは配列番号１の１０２番目のヌクレオチドの遺伝子型を確認する段階を含む白血球減少症の発病危険予測方法を提供する。

また、本発明は、前記ポリヌクレオチドに特異的に結合するプローブ、または前記ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーを含む白血球減少症の発病危険予測キットを提供する。

本発明は、ＮＵＤＴ１５遺伝子内の単一塩基多型マーカーを含むクローン病、潰瘍性大腸炎、白血病または臓器移植患者でチオプリン誘導された白血球減少症の危険予測用組成物、危険予測キット及び危険予測方法に関するものである。本発明によれば、クローン病、潰瘍性大腸炎、白血病または臓器移植患者において、チオプリン治療過程中に発生する白血球減少症に対して、感受性が高い患者を早期に迅速に分類することができて、患者カスタマイズド治療を効率的に行うことができる。

韓国のソウル峨山病院でチオプリンを使った１１９１人のクローン病（ＣＤ）患者を実験対象とした分析模式図を示す。 野生型または突然変異ＮＵＤＴ１５で形質感染させた後、７．５ｕＭ ６−ＭＰ処理したＪｕｒｋａｔ細胞の感受性を表わした結果である。図２Ａは、野生型または突然変異ＮＵＤＴ１５で形質感染させたＪｕｒｋａｔ細胞でのＮＵＤＴ１５ ｍＲＮＡレベルを表わすが、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定した。図２Ｂは、ＮＵＤＴ１５−形質感染された突然変異細胞の生存数は、野生型−形質感染対照群細胞に比べて減少した結果である。図２Ｃは、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ染色で細胞毒性を測定した結果であって、野生型ＮＵＤＴ１５で形質感染された細胞に比べて、突然変異ＮＵＤＴ１５で形質感染された場合の細胞が６−ＭＰにさらに敏感であるということを表わした。結果は、３回の独立した実験結果を平均±標準偏差で表わした。

本発明者らは、クローン病、潰瘍性大腸炎、白血病または臓器移植患者において、チオプリン治療過程中に発生する白血球減少症と関連した感受性遺伝子を確認するために、免疫チップ（ｉｍｍｕｎｏｃｈｉｐ）を用いた大規模関連分析（ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行い、本発明を完成した。

本発明は、配列番号１の１０１番目のヌクレオチド及び配列番号１の１０２番目のヌクレオチドのうち何れか１つ以上の単一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーを含む１０〜１００個の連続したＤＮＡ配列で構成されるポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを含む白血球減少症の発病危険予測用組成物を提供する。

詳細には、前記配列番号１の１０１番目のヌクレオチドの対立遺伝子型は、Ｃ／Ｔであり、前記配列番号１の１０２番目のヌクレオチドの対立遺伝子型は、Ａ／Ｇであり得る。

詳細には、前記白血球減少症は、チオプリンによって誘導されるものであり得る。より詳細には、前記組成物は、チオプリンを投与したクローン病、潰瘍性大腸炎、白血病または臓器移植患者の白血球減少症の発病危険を予測するために使われることが望ましいが、これに制限されるものではない。

詳細には、前記チオプリンは、アザチオプリン（ＡＺＡ）または６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）が望ましいが、これに制限されるものではない。

前記配列番号１の１０１番目のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドで多型ＳＮＰ変異は、ｒｓ１１６８５５２３２に表示して記載することができる。前記ｒｓ１１６８５５２３２は、１３ｑ１４上のＮＵＤＴ１５内に存在し、対立遺伝子型はＣ／Ｔである。前記配列番号１の１０１番目のヌクレオチドは、多重塩基記載方式によって作成したが、ＣまたはＴであり得るので、“ｙ”であると記載した。

前記配列番号１の１０２番目のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドで多型ＳＮＰ変異は、ｒｓ１４７３９００１９に表示して記載することができる。前記ｒｓ１４７３９００１９は、１３ｑ１４上のＮＵＤＴ１５内に存在し、対立遺伝子型はＡ／Ｇである。前記配列番号１の１０２番目のヌクレオチドは、多重塩基記載方式によって作成したが、ＡまたはＧであり得るので、“ｒ”であると記載した。

前記ＮＵＤＴ１５タンパク質（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿０６０７５３．１）は、１６４個のアミノ酸からなり、アミノ酸配列は、配列番号２に記載した。
前記配列番号１の１０１番目のヌクレオチドがＣである場合に、ＮＵＤＴ１５タンパク質（配列番号２）の１３９番目のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）であり、Ｔである場合には、システイン（Ｃ）である。

前記配列番号１の１０２番目のヌクレオチドがＧである場合に、ＮＵＤＴ１５タンパク質（配列番号２）の１３９番目のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）であり、Ａである場合には、ヒスチジン（Ｈ）である。

本発明の多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）は、単一遺伝子座位に２種以上の対立遺伝子が存在する場合を意味し、‘多型部位（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｉｔｅ）’とは、前記対立遺伝子が存在する遺伝子座位を意味する。多型部位のうち、ヒトによって単一塩基のみが異なることを‘単一塩基多型’、すなわち、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）と言う。

本発明の連鎖不平衡（Ｌｉｎｋａｇｅ Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）とは、集団遺伝学で必ず同一染色体上に存在する２つ以上の遺伝子座（ｌｏｃｉ）での対立遺伝子の非無作為的関連（ｎｏｎ−ｒａｎｄｏｍ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を意味する。

本発明は、試料からＤＮＡを抽出する段階と、前記抽出したＤＮＡから配列番号１の１０１番目のヌクレオチドまたは配列番号１の１０２番目のヌクレオチドの遺伝子型を確認する段階と、前記確認された遺伝子型で白血球減少症の発病危険を予測する段階と、を含む白血球減少症の発病危険予測方法を提供する。

詳細には、前記白血球減少症の発病危険を予測する段階は、前記配列番号１の１０１番目のヌクレオチドの遺伝子型がＴ、または前記配列番号１の１０２番目のヌクレオチドの遺伝子型がＡである場合、白血球減少症の発病危険が高いものとして予測することができる。

詳細には、前記白血球減少症は、チオプリンによって誘導されるものであり、より詳細には、前記チオプリンは、アザチオプリン（ＡＺＡ）または６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）が望ましいが、これに制限されるものではない。

前記試料からＤＮＡを抽出する段階で、ＤＮＡは、対象の血液、皮膚細胞、粘膜細胞及び毛髪などあらゆる細胞から分離される。当該細胞からＤＮＡを抽出する方法は、特に限定されず、当業者に公知の技術または販売されているＤＮＡ抽出用キットを使うことができる。

前記遺伝子型を確認する段階では、遺伝子配列分析が行われる。配列分析は、当業者に公知の方法をいずれも利用でき、具体的には、これに制限されるものではないが、自動塩基配列分析器を使うか、パイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＰＣＲＳＳＣＰ法（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＰＣＲ−ＳＳＯ法（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＣＲ−ＳＳＯ法とドットハイブリッド化法とを組み合わせたＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリッド化法、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＲＣＡ法（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＲＭ（Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ）法、プライマー伸張法、サザンブロットハイブリッド化法及びドットハイブリッド化法などの公知の方法のうち、選択された何れか１つ以上を使うことができる。

本発明は、配列番号１の１０１番目のヌクレオチドまたは配列番号１の１０２番目のヌクレオチドの単一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーを含む１０〜１００個の連続したＤＮＡ配列で構成されるポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドに特異的に結合するプローブ、または前記ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーを含む白血球減少症の発病危険予測キットを提供する。前記キットは、ＰＣＲキットまたはＤＮＡチップキットが望ましいが、これに制限されるものではない。

前記“プローブ”は、ｍＲＮＡ外特異的に結合を成しうる短くは数塩基ないし長くは数百塩基に該当するＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸断片を意味し、レーベリングされており、特定のｍＲＮＡの存否、発現量を確認することができる。プローブは、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）プローブ、一本鎖ＤＮＡ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ）プローブ、二本鎖ＤＮＡ（Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態で製作することができる。適切なプローブの選択及び混成化条件は、当該技術分野において公知の技術によって適切に選択することができる。

前記“プライマー”は、短い自由３−末端水酸化基（ｆｒｅｅ ３´ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列で相補的なテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対を形成し、テンプレート鎖コピーのための開始地点として作用する短い核酸配列を言う。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度で重合反応のための試薬（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）及び異なる４種のヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。ＰＣＲ条件、センス及びアンチセンスプライマーの長さは、当業者に公知の技術によって適切に選択されうる。

以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。

＜実験例＞
下記の実験例は、本発明によるそれぞれの実施例に共通して適用される実験例を提供するためのものである。

１．実験対象
韓国のソウル峨山病院でチオプリンを使った１１９１人のクローン病（ＣＤ）患者のうち、９７８人の患者を本発明に含ませた（図１、表１）。２１３人の患者は、十分ではないチオプリン治療を受けたと判断されて、本発明から除外した。白血球減少症の発病はなかったが、多様な理由でＡＺＡを８週以上、１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上に投与されることができなかった患者は、不十分な治療を受けたと判断した。９７８人の患者のうち、６６人からチオプリン治療後、初めの８週内に白血球減少症が発病し［初期白血球減少症（ｅａｒｌｙ ｌｅｕｋｏｐｅｎｉａ）患者ケース］、２８０人から初めの８週後に白血球減少症が発病し［後期白血球減少症（ｌａｔｅ ｌｅｕｋｏｐｅｎｉａ）患者ケース］、６３２人からは、ＡＺＡを８週以上、１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上に投与したが、白血球減少症が発病していない［対照群］。本発明に参加したあらゆる参加者は、韓国人であった。クローン病の診断は、既存の臨床的判断、放射線検査、内視鏡検査及び病理組織学的検査の基準に基づいた。本研究は、峨山病院臨床試験審査委員会の承認を受け、あらゆる参加者から事前同意を得た。

２．チオプリンの使用
チオプリンの処方は、ＡＺＡまたは６−ＭＰのうち１つを低容量で始め、体重に基づいた目的容量まで数ヶ月にわたって徐々に投薬を増加させた。本発明者らは、チオプリン治療を始める前にＴＰＭＴ遺伝子型や酵素活性は確認していない。異常反応（ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ）によるチオプリン薬物の容量修正または中断に対しては、責任のある医者がケース別に決定した。

３．白血球減少症の判断
各患者に対する過去の医療記録は検討され、容量、治療期間及び白血球減少症の発病時期及び程度を含むチオプリン治療についての情報は、遺伝子型分析結果が分からない３人の医者のうち、２人によって独立して評価された。

峨山病院から測定されたＷＢＣの正常範囲は、４，０００〜１０，０００／ｍｍ^３であった。本発明で、白血球減少症とは、ＷＢＣ数が３０００／ｍｍ^３よりも低い場合を意味するが、米国国立癌研究所の異常反応評価基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ´ｓ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ；ＮＣＩ−ＣＴＣＡＥ）ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０によれば、ｇｒａｄｅ ２は、２，０００〜３，０００／ｍｍ^３、ｇｒａｄｅ ３は、１，０００〜２，０００／ｍｍ^３、及びｇｒａｄｅ ４は、１，０００／ｍｍ^３以下である。３，０００〜４，０００／ｍｍ^３のＷＢＣ数（ＮＣＩ−ＣＴＣＡＥ ｇｒａｄｅ １）は、白血球減少症と判断しなかったが、白血球減少症の境界であると判断した。白血球減少症が数回発病した患者は、最初の発病時の最も低いＷＢＣ数によって白血球減少症の段階を決定した。６−ＭＰの容量は、６−ＭＰ容量に２．０８を乗算してＡＺＡ当量で調整した。

４．単一塩基多型の遺伝子型及び関連分析
チオプリン治療によって白血球減少症が発病した１９７人の患者（初期３３人及び後期１６４人）及び白血球減少症が発病していない３０７人の対照群患者に対する発掘分析（ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）を先に行ったが、Ｐ＜１０−^５の如何なるシグナルも見つけることができなかった。初期白血球減少症を有した患者が、後期白血球減少症を有した患者よりも遺伝的変異において、さらに大きな効果があるという予測に基づいて、初期白血球減少症に焦点を合わせて分析した。発掘コホート（ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｏｈｏｒｔ）として、初期白血球減少症を有した３３人の患者及び３０７人の対照群で免疫チップを使って発掘分析を行った。発掘分析から選択されたＳＮＰｓに対する１段階再現分析は、再現コホート（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｈｏｒｔ）として、追加的な初期白血球減少症を有した３３人の患者及び３２５人の対照群でＴａｑＭａｎ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｓｓａｙｓを用いて行った。次いで、発掘及び１段階再現分析から確認されたＳＮＰｓに対して、発掘及び再現コホートとして、後期白血球減少症を有した２８０人の患者及び６３２人の対照群を用いて２段階再現分析で検証した（図１）。また、本発明者らは、あらゆる参加者に対してＴＰＭＴ遺伝子型（ｒｓ１１４２３４５）を決定した。

５．置換法（Ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ）
遺伝的変異の適用範囲を改善するために、発掘サンプルから決定されていない遺伝型は、１，０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｄａｔａｂａｓｅｓ（Ｆｅｂ ２０１２ ｒｅｌｅａｓｅ）及びＩＭＰＵＴＥ（ｖ２．０）を通じてＡｓｉａｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｎｅｌ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｉｎ Ｔｏｋｙｏ ａｎｄ Ｈａｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇ）を使って置き換えた。

６．ＮＵＤＴ１５の形質感染及び細胞死滅の分析
チオプリン−誘導細胞毒性効果に対するＮＵＤＴ１５コーディング変異（Ｒ１３９Ｃ）の機能的役割を調べるために、本発明者らは、ＮＵＤＴ１野生型または突然変異の形質感染後、６−ＭＰに対するＪｕｒｋａｔ細胞感受性を測定した。

リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使って、ＮＵＤＴ１５野生型（１３９Ｒ）またはＮＵＤＴ１５突然変異（１３９Ｃ）の１つでＪｕｒｋａｔ細胞を形質感染させた。形質感染後、７．５ｕＭ ６−ＭＰ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＳ）を処理する前に、細胞は２４時間、５％ ＣＯ_２、３７℃で回復された。７．５ｕＭ ６−ＭＰに対する細胞感受性は、細胞生存及び細胞死滅の分析を通じて測定した。細胞生存を評価するために、細胞は、培地に４ｘ希釈し、トリパンブルー生存染色液に２ｘ希釈した。生存細胞は、１００ｘ倍率顕微鏡を用いて血球計算器（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で計数した。ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が細胞死滅の分析のために使われた。細胞は、ＰＢＳで洗い落とし、１００ｕｌ １ｘ ａｎｎｅｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）に再懸濁した（〜１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。次いで、１ｕｌのヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）（１００ｕｇ／ｍＬ、ｄｉｌｕｔｅｄ ｉｎ １ｘ ａｎｎｅｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）及び５ｕｌのＦＩＴＣ ａｎｎｅｘｉｎ Ｖで常温で１５分間反応させた後、４００ｕｌの１ｘ ａｎｎｅｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加した。薬物処理による細胞死滅は、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びヨウ化プロピジウム染色を用いてＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって測定した。データは、Ｓｔｕｄｅｎｔ´ｓ ｔ ｔｅｓｔで分析し、Ｐ＜０．０５が統計学的有意性があるように判断された。

＜実施例１＞初期白血球減少症において発掘関連分析
本発明者らは、初期白血球減少症を有した３３人の患者及び３０７人の対照群で９６，０４８遺伝子型ＳＮＰｓの発掘関連分析を行い、過度なＰ数値が分位−分位分布（ｑｕａｎｔｉｌｅ−ｑｕａｎｔｉｌｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）のしっぽ部分から観測されたが、全体的な分布では、集団の階層化（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）による如何なる膨張（ｉｎｆｌａｔｉｏｎ）の徴候も表われなかった（λ_ＧＣ＝１．０４１）。発掘分析では、Ｐ＜１０^−５で４個の関連性が表われたが、これらは、３ｐ２５．１上ｒｓ９８４３３４４（ＦＢＬＮ２）、６ｐ２２．３上ｒｓ１９８６７３１（ＣＭＡＨＰ−ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）、８ｑ２４．２２上ｒｓ２９４５７７０（ＳＴ３ＧＡＬ１）及び１４ｑ３１．１上ｒｓ１７１０９６１６（ＮＲＸＮ３）であった。また、ＴＰＭＴ遺伝座位（ｌｏｃｕｓ）内のｒｓ１１４２３４５（ＴＰＭＴ^＊３Ｃ）（ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ、７．１１；Ｐ＝１．６１ｘ１０^−４）ＳＮＰで示唆的関連性を見つけた（表２）。また、発掘分析において、遺伝的変異の適用範囲を改善するために、本発明者らは、４５３，５３２個の置き換えられたＳＮＰｓに対する関連性分析を行い、Ｐ＜１０^−５である１ｑ３２、８ｑ２２、１３ｑ１４及び１４ｑ３１の追加的な４個の遺伝座位を見つけた。ただ１３ｑ１４上のＳＵＣＬＡ２／ＮＵＤＴ１５／ＭＥＤ４部位のみが、Ｐ＜１０^−１９の多重シグナルを表わしたが（ｒｓ７９０７６３５７、ｒｓ１１６８５５２１３２、ｒｓ１４２８２９４９７、ｒｓ７３４８１２１２）、ｒｓ１４２８２９４９７（ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ、２４．２；Ｐ＝２．３６ｘ１０^−２３）が最も上位であった。また、ｒｓ１４２８２９４９７に追加的に、ＮＵＤＴ１５の１３９番の位置でアミノ酸置換（塩基性アルギニンが極性システインに変更）を引き起こすｒｓ１１６８５５２３２が、検証のために選択された。

＜実施例２＞再現分析（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）
発掘分析から選択されたＳＮＰｓを検証するために、本発明者らは、追加的な初期白血球減少症を有した３３人の患者及び３２５人の対照群から発掘された１０個のＳＮＰｓに対して優先的に遺伝子型を分析した。Ｒｓ７３４８１２１２は、分析失敗によって今後の分析から排除されたｒｓ１４２８２９４９７の代わりをした。１３ｑ１４上ＳＵＣＬＡ２／ＮＵＤＴ１５／ＭＥＤ４部位内の２個のＳＮＰｓが誘電体全般にわたった有意性があると確認された（表２）。ｎｏｎｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ＳＮＰであるｒｓ１１６８５５２３２（Ｒ１３９Ｃ）が免疫チップ及び検証分析を総合した結果、最も有意性が高く、強力な関連性を表わした（ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ、３５．６；ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｐ＝４．８８ｘ１０^−９４）（表３）。他のＳＮＰであるｒｓ７３４８１２１２は、１．９２ｘ１０^−７０の組合わせＰ ｖａｌｕｅを示した（表２）。Ｒｓ ７３４８１２１２は、ｒｓ１１６８５５２３２と連鎖不平衡（ＬＤ）であり、関連性は、ｒｓ１１６８５５２３２（Ｒ１３９Ｃ）と独立していない。また、よく知られたＴＰＭＴ^＊３Ｃ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）（ｒｓ１１４２３４５）は、検証サンプルでは一貫した関連性を示したが（Ｐ＜０．０５）、組合わせサンプルからの結果は、誘電体全般にわたった有意性を示していない（Ｐ ｖａｌｕｅ ｏｆ ２．９５ｘ１０^−５）（表２）。

ｒｓ１１６８５５２３２は、ＳＵＣＬＡ２、ＮＵＤＴ１５及びＭＥＤ４を含む〜１８５ ｋｂ ＬＤ部位内に位置するので、本発明者らは、韓国人のＳＵＣＬＡ２／ＮＵＤＴ１５／ＭＥＤ４部位でｎｏｎｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ＳＮＰｓを探索した。追加的な２個のｎｏｎｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ＳＮＰｓであるＳＵＣＬＡ２内のｒｓ７３２０３６６及びＮＵＤＴ１５内のｒｓ１８６３６４８６１が確認されたが、これは、ｒｓ１１６８５５２３２と低いＬＤを示した（それぞれｒ^２＝０．３３、０）。しかし、ｒｓ７３２０３６６のみが有意性を示したが、白血球減少症との関連性は強くなかった（ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ、５．０３；ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｐ＝３．５５ｘ１０^−２０）。次いで、条件付きロジスティック回帰分析（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）では、ＳＵＣＬＡ２内のｒｓ７３２０３６６の関連性が先頭ＳＮＰであるＮＵＤＴ１５内のｒｓ１１６８５５２３２の関連性と独立していない。

ｒｓ１１６８５５２３２のＴ対立遺伝子が、初期白血球減少症の発生に主な役割を行うことが明確になることによって、本発明者らは、後期白血球減少症の場合にも、ｒｓ１１６８５５２３２の関連性分析を行った。表４で示すように、後期白血球減少症との関連性は、初期白血球減少症よりも遥かに緩和された。

＜実施例３＞白血球減少症に対する危険予測子としてＮＵＤＴ１５ Ｒ１３９Ｃ
発掘及び再現の分析結果に基づいて、本発明者らは、ＮＵＤＴ１５ １３９Ｃ対立遺伝子が全体白血球減少症患者の４２．５％（１４７／３４６）及び対照群の６．８％（４３／６３２）で存在するということを明らかにしたが（表５）、これは、ＮＵＤＴ１５ １３９Ｃの存在が曲線下面積（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ；ＡＵＣ）数値０．６８であって、あらゆる白血球減少症に対する危険予測子として４２．５％（１４７／３４６）の感受性及び９３．２％（５８９／６３２）の特異性を有するということを意味する。予想されるチオプリン−誘導白血球減少症に対するＮＵＤＴ１５ １３９Ｃ対立遺伝子の陽性及び陰性の予測数値は、それぞれ７７．４％（１４７／１９０）及び７４．７％（５８９／７８８）であった。

初期白血球減少症に範囲を狭めれば、ＮＵＤＴ１５ １３９Ｃ対立遺伝子は、初期白血球減少症患者の８９．４％（５９／６６）で存在したが、対照群及び後期白血球減少症患者の組合わせでは、１４．４％（１３１／９１２）のみが存在すると表われた（表５）。これは、ＮＵＤＴ１５ １３９Ｃの存在が曲線下面積（ＡＵＣ）数値０．８９であって、初期白血球減少症に対する危険予測子として８９．４％（５９／６６）の感受性及び８５．６％（７８１／９１２）の特異性を有するということを意味する。予想されるチオプリン−誘導白血球減少症に対するＮＵＤＴ１５ １３９Ｃ対立遺伝子の陽性及び陰性の予測数値は、それぞれ３１．１％（５９／１９０）及び９９．１％（７８１／７８８）であった。

前記結果によれば、ＮＵＤＴ１５ １３９Ｃ対立遺伝子を有していない対象と比較した時、１コピー（ｃｏｐｙ）を有した対象は、チオプリン−誘導初期白血球減少症が発病する危険が８８倍高いものと表われた（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ）（表５）。対照群は、いずれも１３９Ｃ対立遺伝子に対してホモ接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）ではないと表われた。また、ＮＵＤＴ１５ １３９Ｃ対立遺伝子のコピー数が増加すれば、白血球減少症を誘発するチオプリンの容量が低くなり、チオプリン治療開始から白血球減少症が誘発される間隔が短くなり、白血球減少症の段階がさらに高くなった（表６）。

一方、ＴＰＭＴ^＊３Ｃ対立遺伝子は、初期白血球減少症患者の１２．１％（８／６６）で表われたが、対照群及び後期白血球減少症患者の組合わせでは、単に２．２％（２０／９１２）のみが表われたが、これは、ＴＰＭＴ^＊３Ｃ対立遺伝子の存在が初期白血球減少症に対する危険予測子であって、１２．１％（８／６６）の感受性及び９７．８％（８９２／９１２）の特異性を有するということを意味する。初期及び後期白血球減少症の組合わせ分析で、ＴＰＭＴ^＊３Ｃ対立遺伝子は、あらゆる白血球減少症患者の３．８％（１３／３４６）及び対照群の２．４％（１５／６３２）で表われたが、これは、ＴＰＭＴ^＊３Ｃ対立遺伝子の存在があらゆる白血球減少症に対する危険予測子であって、３．８％（１３／３４６）の感受性及び９７．６％（６１７／６３２）の特異性を有するということを意味する。

＜実施例４＞ｒｓ１１６８５５２３２の生物機能的結果
２４時間６−ＭＰを処理した後、突然変異ＮＵＤＴ１５で形質感染された生存細胞の数は、野生型−形質感染された対照群細胞に比べて減少した（ｐ＜０．００１）（図２）。また、細胞死滅マーカーである表面Ａｎｎｅｘｉｎ４は、野生型−形質感染された対照群細胞に比べて、突然変異−形質感染された細胞で有意性があるように増加したが（Ｐ＝０．０２）、これは、チオプリン−誘導細胞毒性に対する突然変異ＮＵＤＴ１５の役割を裏付ける。

＜実施例５＞白血球減少症に対する危険予測子としてＮＵＤＴ１５ Ｒ１３９Ｈ
本発明者らは、ＮＵＤＴ１５ １３９Ｃ対立遺伝子を有していない初期白血球減少症患者７人のうち、追加分析で２人が、１３９番目のアミノ酸がシステインではないヒスチジンを有していることを確認し、後期白血球減少症患者及び対照群をいずれも分析した結果、後期白血球減少症患者でも、４人が１３９番目のアミノ酸ヒスチジンを有していることを確認した（表７ないし表９）

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的技術は、単に望ましい実施例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないということは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲と、それらの等価物とによって定義される。

本発明は、ＮＵＤＴ１５遺伝子内の単一塩基多型マーカーを含むチオプリン誘導白血球減少症の発病危険予測用組成物関連の分野に適用可能である。

Claims (12)

1. 配列番号１の１０１番目のヌクレオチド及び配列番号１の１０２番目のヌクレオチドのうち何れか１つ以上の単一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーを含む１０〜１００個の連続したＤＮＡ配列で構成されるポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを含む白血球減少症の発病危険予測用組成物。
2. 前記配列番号１の１０１番目のヌクレオチドの対立遺伝子型は、Ｃ／Ｔであり、前記配列番号１の１０２番目のヌクレオチドの対立遺伝子型は、Ａ／Ｇであることを特徴とする請求項１に記載の白血球減少症の発病危険予測用組成物。
3. 前記白血球減少症は、チオプリンによって誘導されることを特徴とする請求項１に記載の白血球減少症の発病危険予測用組成物。
4. 前記組成物は、チオプリンを投与したクローン病、潰瘍性大腸炎、白血病または臓器移植患者の白血球減少症の発病危険を予測するために使われることを特徴とする請求項３に記載の白血球減少症の発病危険予測用組成物。
5. 前記チオプリンは、アザチオプリン（ＡＺＡ）または６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）であることを特徴とする請求項３または４に記載のチオプリン誘導白血球減少症の発病危険予測用組成物。
6. 試料からＤＮＡを抽出する段階と、
   前記抽出したＤＮＡから配列番号１の１０１番目のヌクレオチドまたは配列番号１の１０２番目のヌクレオチドの遺伝子型を確認する段階と、
   前記確認された遺伝子型で白血球減少症の発病危険を予測する段階と、
   を含む白血球減少症の発病危険予測方法。
7. 前記白血球減少症の発病危険を予測する段階は、前記配列番号１の１０１番目のヌクレオチドの遺伝子型がＴ、または前記配列番号１の１０２番目のヌクレオチドの遺伝子型がＡである場合、白血球減少症の発病危険が高いものとして予測することを特徴とする請求項６に記載の白血球減少症の発病危険予測方法。
8. 前記白血球減少症は、チオプリンによって誘導されることを特徴とする請求項６に記載の白血球減少症の発病危険予測方法。
9. 前記チオプリンは、アザチオプリン（ＡＺＡ）または６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）であることを特徴とする請求項８に記載の白血球減少症の発病危険予測方法。
10. 配列番号１の１０１番目のヌクレオチドまたは配列番号１の１０２番目のヌクレオチドの単一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーを含む１０〜１００個の連続したＤＮＡ配列で構成されるポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドに特異的に結合するプローブ、または前記ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーを含む白血球減少症の発病危険予測キット。
11. 前記白血球減少症は、チオプリンによって誘導されることを特徴とする請求項１０に記載の白血球減少症の発病危険予測キット。
12. 前記チオプリンは、アザチオプリン（ＡＺＡ）または６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）であることを特徴とする請求項１１に記載の白血球減少症の発病危険予測キット。