KR20090090263A

KR20090090263A - Ｊａｋ２ 유전자의 변이 검출용 프로브 및 그 용도

Info

Publication number: KR20090090263A
Application number: KR1020087032135A
Authority: KR
Inventors: 미츠하루 히라이; 사토시 마지마; 타이라 마에카와; 신야 키무라
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2007-07-13
Filing date: 2008-07-11
Publication date: 2009-08-25
Also published as: EP2119796A4; JPWO2009011297A1; EP2119796A1; CN101622363A; KR101147277B1; US20100068713A1; WO2009011297A1; CN101622363B; EP2119796B1

Abstract

본 발명은 1 염기만이 상이한 변이를 포함하는 검출 대상 서열과 변이를 포함하지 않는 비검출 대상 서열이 공존하는 경우라도, 상기 변이를 포함하는 검출 대상 서열을 검출 가능한 JAK2 유전자 변이의 검출용 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.

서열 번호 1의 염기 서열로 이루어지는 JAK2 유전자의 exon12에서의 84번째의 시토신 염기(C)를 1 염기째로 하여 5' 방향을 향해 17∼22 염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기(C)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 사용한다. 이들 프로브를, 예컨대 Tm 분석에 사용하는 것에 의해, 변이가 발생하고 있는 JAK2 유전자와 변이가 발생하지 않는 JAK2 유전자가 포함되는 시료라도, 전자의 변이를 검출할 수 있다. 상기 프로브는, 형광 색소로 표지화되어 있는 것이 바람직하다.

Description

ＪＡＫ２ 유전자의 변이 검출용 프로브 및 그 용도{PROBE FOR DETECTING MUTATION IN JAK2 GENE AND USE THEREOF}

본 발명은, 만성 골수증식성 질환(chronic myeloproliferative disorder; CMPD)에 관련되는 JAK2 유전자의 변이를 검출하기 위한 프로브 및 그 용도에 관한 것이다.

모든 질환의 원인이나, 개체간의 질환 이환 용이성(易罹患性)(질환이 걸리기 쉬운 정도), 개체간에서의 약효의 차이 등을 유전자 레벨로 분석하는 방법으로서, 점 돌연변이, 소위 1염기 다형(SNP)의 검출이 널리 행해지고 있다.

SNP의 일반적인 검출 방법으로서는, (1) 검출 목적의 변이가 발생하는 영역을 증폭시키고, 얻어진 증폭 산물의 염기 서열을 분석하는 Direct Sequencing법, (2) Pyrosequencing법, (3) 상기 영역을 증폭시키고, 온도 경사 칼럼중에서 HPLC를 행하고, 용출되는 시간에 의해 변이의 유무를 검출하는 Denaturing HPLC법, (4) 검출 목적의 변이를 포함하는 영역에 형광 프로브가 결합하면 형광을 발하는 것을 이용하고, 형광 강도의 측정에 의해 변이를 검출하는 Invader법, (5) 3' 말단 영역 중 어느 하나의 염기가 검출 목적의 변이에 상보적인 염기가 되도록 설계한 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, 증폭의 유무에 의해 변이를 판단하는 ASP(Allele Specific Primer)-PCR(Polymerase Chain Reaction)법 등을 들 수 있다.

그러나, 상기 (1), (2) 및 (4)의 방법은, 각각 약 20%, 약 5%, 약 5% 정도로 감도가 낮고, 조작에 많은 수고와 시간이 걸린다. 상기 (3)의 방법은 감도가 약 10%로 낮고, 또한 변이의 유무를 확인할 수 있는 것만으로, 어느 부위에 어떠한 변이가 생기고 있는 것인지를 분석할 수 없으며, 특이성이 부족하다고 하는 문제가 있다. 또한, 상기 (5)의 방법은 감도는 높지만 특이성이 낮으며, 위양성이 생기기 쉽다고 하는 문제가 있다. 또한, 감도는 수치(%)가 작을수록 고감도이다.

이러한 문제로부터, 최근 SNP의 검출 방법으로서, 이하에 나타내는 Tm(Melting temperature) 분석이 이용되고 있다. 이것은, 우선 검출 목적의 SNP를 포함하는 영역에 상보적인 프로브를 이용하여, 피검체의 핵산과 상기 프로브와의 하이브리드(2중쇄 핵산)를 형성시킨다. 그리고 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따르는 하이브리드의 단일쇄에의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널 측정에 의해 검출한다. 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정하는 것에 의해, SNP를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 예컨대 우선, 변이형의 SNP를 포함하는 핵산과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서, 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해둔다. 계속해서, 피검체의 핵산과 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정한다. 그리고 이 측정값이 상기 평가 기준값과 동일하면, 퍼펙트매치, 즉, 피검체의 핵산의 SNP를 변이형이라고 판단할 수 있다. 한편, 상기 측정값이 상기 평가 기준값보다 낮으면, 미스 매치, 즉 피검체의 핵산의 SNP를 정상형이라고 판단할 수 있다. 그러나, 이러한 Tm 분석을 이용한 검출 방법은, 일반적으로 감도가 낮다고 하는 문제가 있다.

진성 다혈증(Polycythemia vera; PV), 본태성 혈소판혈증(essential thrombocythemia; ET) 등의 만성 골수증식성 질환(CMPD)에 있어서, JAK2 유전자의 변이형 SNP가 고빈도로 확인되는 것이 보고 되어 있다(비특허문헌 1∼4). 상기 변이형 SNP란, JAK 단백질의 617번째의 발린(V)을 페닐알라닌(F)으로 치환하는 변이이고, JAK2 유전자의 exon12의 73번째(성숙 mRNA(CDS)의 1849번째)의 구아닌이 티민으로 치환되어 있다(JAK2/V617F). 이러한 단백질을 발현하는 JAK2 유전자의 변이(JAK2/V617F)의 검출은, CMPD의 진단, 치료에 유용하다고 생각할 수 있다. 그러나, 한 사람의 환자의 혈액 검체라도, 그 혈액 검체에는 변이형 SNP가 발생하고 있는 변이 JAK2 유전자를 갖는 혈액 세포와, 정상형 SNP인 정상 JAK2 유전자를 갖는 혈액 세포가 포함되어 있다. 이들 유전자의 차이는 SNP의 타입, 즉, 1 염기의 차이에 지나지 않는다. 그러면 변이형 SNP를 검출하기 위한 프로브는, 변이형 SNP를 포함하는 변이 서열(검출 대상 서열)에 퍼펙트매치로 하이브리다이즈하지만, 또한 변이형 SNP이 아니라 정상형 SNP를 포함하는 정상 서열(비검출 대상 서열)에도, 1 염기는 미스매치이지만, 하이브리다이즈한다고 하는 현상이 발생해 버린다. 이러한 경우에 Tm 분석에 있어서, 시그널 강도와 온도와의 관계를 나타내는 융해 곡선을 작성하면, 퍼펙트매치인 변이 서열의 고온측 피크가, 미스매치인 정상 서열의 저온측의 피크의 존재에 의해서, 검출하기 어려워진다고 하는 문제가 있다. 즉, 변이 서열이 존재하는 경우라도, 정상 서열의 존재에 의해, 그 검출이 곤란해지고, 검출 감도의 저하가 생겨 버린다.

비특허문헌 1: Tefferi A. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2006; 240-245.

비특허문헌 2: Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al. Lancet. 2005; 365: 1054-1061.

비특허문헌 3: Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al. N Engl J Med. 2005; 352: 1779-1790.

비특허문헌 4: Levine RL, Wadleigh M, Cools J, et al. Cancer Cell. 2005; 7: 387-397.

그래서, 본 발명은 1 염기만이 상이한, 변이를 포함하는 변이 서열과 변이를 포함하지 않는 정상 서열이 공존하는 경우라도, 우수한 감도로 검출 목적의 상기 변이를 검출 가능한 JAK2 유전자 변이의 검출용 프로브 및 그 용도의 제공을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 프로브는 JAK2 유전자의 변이를 검출하기 위한 프로브로서, 하기 (X) 및 (Y)의 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

(X) 서열 번호 1의 염기 서열로 이루어지는 JAK2 유전자의 exon12에서의 84번째의 시토신 염기(c)를 1 염기째로 하여 5' 방향을 향해 17∼22 염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기(c)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드

(Y) 상기 (X)의 상보 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드

본 발명의 변이의 검출 방법은, JAK2 유전자에서의 변이의 검출 방법으로서, 하기 공정 (A)∼(C)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

(A) 상기 변이의 유무를 검출하는 피검 핵산과, 본 발명의 프로브를 포함하는 반응계를 준비하는 공정

(B) 상기 반응계의 온도를 변화시키고, 상기 피검 핵산과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정

(C) 온도 변화에 따르는 상기 시그널값의 변동으로부터, 상기 피검 핵산에서의 상기 변이의 유무를 결정하는 공정

본 발명의 프라이머 세트는, 핵산 증폭법에 의해 JAK2 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트로서, 하기 (F)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 포워드 프라이머 및 하기 (R)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 리버스 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 한다.

(F) 서열 번호 2의 염기 서열에서의 193번째의 시토신 염기(c)를 1염기째로서 5' 방향을 향해 24∼44 염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기(c)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드(R) 서열 번호 2의 염기 서열에서의 255번째의 시토신 염기(c)를 1 염기째로 하여 3' 방향을 향해 23∼47 염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 255번째의 시토신 염기(C)에 상보적인 구아닌 염기(g)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드

본 발명의 변이 검출 키트는, 본 발명의 JAK2 유전자의 변이의 검출 방법에 사용하기 위한 키트로서, 본 발명의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 프로브에 의하면, 검출 목적의 변이 JAK2/V617F가 발생하고 있는 변이 서열(변이 유전자)과, 상기 변이가 발생하지 않는 정상 서열(정상 유전자)이 공존하고 있는 경우라도, 상기 변이 서열의 유무, 즉 검출 목적의 변이의 유무를 검출할 수 있다. 전술과 같이, 상기 Tm 분석에 있어서는, 일반적으로, 1 염기만이 상이한 변이 서열과 정상 서열의 쌍방에 프로브가 하이브리다이즈한다. 이 때문에, 상기 융해 곡선에 있어서, 양자의 시그널이 중복되고, 변이 서열의 유무를 검출하는 것이 매우 곤란하게 되어 있다. 이것에 대하여, 본 발명의 프로브에 의하면, 변이 서열과 정상 서열의 쌍방에 하이브리다이즈하지만, 융해 곡선에 있어서, 양자의 시그널을 충분히 분리할 수 있다. 이 때문에, 본 발명에 의하면 우수한 감도로, JAK2 유전자의 변이(JAK2/V617F)를 검출할 수 있다.

도 1은, 본 발명의 실시예 1에서의 Tm 분석의 결과를 도시하는 그래프이다.

본 발명에 있어서, 이하 검출 목적의 변이가 발생하고 있는 JAK2 유전자를, 「변이 유전자 또는 검출 대상 유전자」, 검출 목적의 변이가 발생하고 있는 서열로서, 프로브가 하이브리다이즈 가능한 영역 또는 이 영역을 포함하는 서열을, 「변이 서열 또는 검출 대상 서열」이라고 한다. 또한 검출 목적의 변이가 발생하지 않는 JAK2 유전자를, 「정상 유전자 또는 비검출 대상 유전자」, 검출 목적의 변이가 발생하지 않는 서열로서, 프로브가 하이브리다이즈 가능한 영역 또는 이 영역을 포함하는 서열을, 「정상 서열 또는 비검출 대상 서열」이라고 한다. 또한, 변이의 검출에 제공되는 핵산을, 「피검 핵산 또는 표적 핵산」이라고도 한다.

서열 번호 1의 염기 서열은 JAK2 유전자의 exon12의 cDNA 서열이고, 73번째의 염기(k)가 검출 목적의 염기이다. 상기 73번째의 염기(k)는 SNP로서 알려져 있고, 예컨대 정상형은 g, 변이형은 t이다. 서열 번호 2의 염기 서열은, JAK2 유전자의 전장(full-length) 서열(exon 및 intron을 포함한다)에서의 부분 서열이고, exon12 및 그 주변 영역을 포함하는 서열이다. JAK2 유전자의 전장 서열(142751 bp)은, 예컨대 NCBI 억세션 No.NC_000009에 등록되어 있다. 또한 JAK2 유전자의 mRNA(5097 bp)는, 예컨대 NCBI 억세션 No. NM_004972에 등록되어 있고, 이 등록되어 있는 염기 서열에 있어서, 2343번째가, 검출 대상의 염기 부위이다. 또한 NCBI 억세션 No. NM_004972에 등록되어 있는 염기 서열에 있어서, 495번째∼3893번째의 영역이 CDS 서열이고, CDS 내의 1849번째가, 검출 목적의 염기 부위이다.

<프로브>

본 발명의 프로브는, 전술과 같이, JAK2 유전자의 변이를 검출하기 위한 프로브로서, 하기 (X) 및 (Y)의 적어도 한쪽의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브인 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 프로브는, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브여도 좋다. 본 발명에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드(X)는 3' 말단이, 하기 조건을 만족시키고 있으면 좋다.

(Y) 상기 (X)의 상보 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드

본 발명의 프로브는, 서열 번호 1에 나타내는 JAK2 유전자 exon12의 73번째(k), 즉, JAK2 유전자의 cDNA(성숙 mRNA에 대응)의 1849번째의 염기(k)의 변이(g→t)를 검출하기 위한 프로브이다. 본 발명의 프로브 중, 상기 올리고뉴클레오티드(X)로 이루어지는 프로브는, JAK2 유전자의 안티센스 쇄(역쇄)에 상보적로서, 안티센스 쇄에서의 변이를 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브 중, 상기 올리고뉴클레오티드(Y)로 이루어지는 프로브는, JAK2 유전자의 센스 쇄(순쇄)에 상보적으로서, 센스 쇄에서의 변이를 확인할 수 있다.

본 발명의 프로브는, 예컨대 JAK2 유전자의 73번째가 변이(t)한 변이 서열에 퍼펙트매치하도록 설계하여도 좋고, 73번째가 정상(g)인 정상 서열에 퍼펙트매치하도록 설계하여도 좋다.

본 발명의 프로브에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드(X)로서는, 예컨대 서열 번호 3∼8로 나타내는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 하기 서열에 있어서, k는 g 및 t 중 어느 것이라도 좋고, 변이 서열과 퍼펙트매치로 설계할 때에는 「t」, 정상 서열과 퍼펙트매치에 설계할 때에는 「g」로 하는 것이 바람직하다. 이들 서열 중에서도, 서열 번호 5로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프 로브가 바람직하고, 보다 바람직하게는 서열 번호 5에서 염기 k가 티민인 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브이다.

이들 올리고뉴클레오티드는, 각각 서열 번호 1의 염기 서열에서의 62, 63, 64, 65, 66 또는 67부터 84번째의 영역(73번째는 g 또는 t)의 상보 서열에 결합하는 서열이다.

본 발명의 프로브는, 표지 물질로 표지화된 프로브인 것이 바람직하다. 상기 표지 물질은, 제한되지 않지만, 형광 색소(형광단)를 들 수 있다. 상기 표지화 프로브의 구체예로서, 예컨대 상기 형광 색소로 표지되고, 단독으로 형광을 나타내며 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예컨대 소광)하는 프로브가 바람직하다. 이러한 현상은, 일반적으로 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)으로 불린다. 이 형광 소광 현상을 이용한 프로브로서는, 그 중에서도, 일반적으로 구아닌 소광 프로브라고 불리는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는, 소위 QProbe(등록상표)로서 알려져 있다. 구아닌 소광 프로브란, 예컨대 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단의 염기가 시토신이 되도록 설계하고, 그 말단의 염기 시토신이 상보적인 염기 구아닌에 근접하면 발광이 약해지는 형광 색소로 상기 말단을 표지화한 프로브이 다. 본 발명의 프로브에 있어서는, 예컨대 형광 소광 현상을 나타내는 형광 색소를, 상기 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 시토신에 결합시켜도 좋고, 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 시토신에 설계하며, 이것에 결합시켜도 좋다.

상기 형광 색소는, 제한되지 않지만, 예컨대 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있고, 시판되는 형광 색소로서는, 예컨대 BODIPYFL(상표명, 모레큘러프로브사제), FluorePrime(상품명, 아머샴파마르시아사제), Fluoredite(상품명, 밀리포아사제), FAM(ABI사제), Cy3 및 Cy5(아머샴파마르시아사제), TAMRA(모레큘러프로브사제) 등을 들 수 있다. 프로브의 검출 조건은, 특별히 제한되지 않고, 사용하는 형광 색소에 의해 적절하게 결정할 수 있지만, 예컨대 Pacific Blue는 검출 파장 450 ㎚∼480 ㎚, TAMRA는 검출 파장 585 ㎚∼700 ㎚, BODIPY FL은 검출 파장 515 ㎚∼555 ㎚에서 검출할 수 있다. 이러한 프로브를 사용하면 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명의 프로브는, 예컨대 3' 말단에 인산기가 부가되어도 좋다. 후술하는 바와 같이, 변이의 유무를 검출하는 피검 핵산(표적 핵산)은 PCR 등의 핵산 증폭법에 의해 조제할 수 있고, 이 때, 본 발명의 프로브를 핵산 증폭 반응의 반응계에 공존시킬 수 있다. 이러한 경우, 프로브의 3' 말단에 인산기를 부가시켜 두면, 프로브 자체가 핵산 증폭 반응에 의해 신장하는 것을 충분히 방지할 수 있다. 또한, 3' 말단에 전술과 같은 표지 물질을 부가하는 것에 의해서도, 동일한 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 프로브는, 전술과 같이, JAK2 유전자의 변이의 검출에 사용할 수 있다. 이 변이의 검출 방법은, 전혀 제한되지 않고, 피검 핵산과 상기 프로브와의 하이브리다이즈를 이용하는 방법이면 좋다. 본 발명의 프로브를 적용하는 방법의 일례로서, Tm 분석을 이용한 변이의 검출 방법에 대해서, 이하에 설명한다.

<변이 검출 방법>

본 발명의 변이 검출 방법은, 전술과 같이, JAK2 유전자에서의 변이의 검출 방법으로서, 하기 공정(A)∼(C)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 변이 검출 방법에 의하면, 서열 번호 1로 나타내는 JAK2 유전자의 exon12에서의 73번째의 염기(k)의 변이(g→t)를 검출할 수 있다. 본 발명의 변이 검출 방법에 의하면, 예컨대 종래의 Direct Sequencing법이나 Pyrosequencing법보다도, 우수한 감도로 검출을 행할 수 있다.

본 발명에서의 피검 핵산은, 예컨대 단일쇄라도 좋고, 2중쇄라도 좋다. 2중쇄의 경우는, 예컨대 피검 핵산과 프로브를 하이브리다이즈시켜 하이브리드체를 형성하기 위해, 가열에 의해 상기 2중쇄를 단일쇄로 해리시키는 공정을 포함하는 것 이 바람직하다.

상기 피검 핵산의 종류로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 DNA나, 토탈 RNA, mRNA 등의 RNA 등을 들 수 있다. 또한 상기 피검 핵산은, 예컨대 생체 시료 등의 시료에 포함되는 핵산을 들 수 있다. 상기 시료중의 핵산은, 예컨대 생체 시료중에 원래 포함되어 있는 핵산이어도 좋지만, 예컨대 변이 검출의 정밀도를 향상시킬 수 있기 때문에, 상기 생체 시료중의 핵산을 주형으로서 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물 등을 들 수 있다. 구체예로서는, 예컨대 상기 생체 시료에 원래 포함되어 있는 DNA를 주형으로 하여, 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물이나, 상기 생체 시료에 원래 포함되어 있는 RNA로부터 리버스사 반응(RT-PCR: Reverse Transcription PCR)에 의해 생성시킨 cDNA를 주형으로서, 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물을 들 수 있다. 이들 증폭 산물을, 본 발명에서의 피검 핵산으로 하여도 좋다. 상기 증폭 산물의 길이는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 50∼1000 염기이며, 바람직하게는 80∼200 염기이다.

상기 생체 시료로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 백혈구 세포 등의 혈구 시료, 전혈(全血) 시료 등을 들 수 있다. 또한 본 발명에 있어서, 시료의 채취 방법, DNA나 RNA 등의 핵산의 조제 방법 등은, 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다.

전술과 같이, 피검 핵산이, 주형 핵산으로부터 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭 산물인 경우, 상기 (A) 공정은 또한, 프라이머를 이용하여 주형 핵산으로부터 피검 핵산을 증폭하는 공정을 포함하여도 좋다.

상기 프라이머로서는, JAK2 유전자에 있어서 본 발명의 프로브가 하이브리다이즈 가능한 영역이 증폭되면 좋고, 특별히 제한되지 않는다. 상기 증폭 영역은, 예컨대 상기 프로브가 하이브리다이즈하는 영역이어도 좋고, 상기 하이브리다이즈 영역을 포함하는 영역뿐이어도 좋다. 프라이머로서는, 예컨대 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 중 어느 한쪽이라도 좋지만, 양자를 한 쌍으로 하여 병용하는 것이 바람직하다. 프라이머로서는, 후술하는 것을 사용할 수 있지만, 이것에는 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 프로브의 첨가 비율은, 제한되지 않지만, 검출 시그널을 충분히 확보할 수 있기 때문에, 본 발명의 프로브의 피검 핵산에 대한 몰비는, 1배 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 O.1배 이하이다. 이 때, 피검 핵산이란, 예컨대 검출 목적의 변이가 발생하고 있는 변이 서열(검출 대상 서열)과 상기 변이가 발생하지 않는 정상 서열(비검출 대상 서열)과의 합계라도 좋고, 상기 변이 서열을 포함하는 증폭 산물과 상기 정상 서열을 포함하는 증폭 산물과의 합계라도 좋다. 또한, 피검 핵산을 포함하는 시료중에서의 변이 서열의 비율은, 통상 불명하지만, 결과적으로, 상기 프로브의 첨가 비율(몰비)은 변이 서열 또는 그것을 포함하는 증폭 산물에 대하여 10배 이하가 되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5배 이하, 또한 바람직하게는 3배 이하이다. 또한, 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 O.001배 이상이고, 바람직하게는 O.01배 이상이며, 보다 바람직하게는 O.1배 이상이다.

상기 피검 핵산에 대한 본 발명의 프로브의 첨가 비율은, 예컨대 2중쇄 핵산 에 대한 몰비여도 좋고, 단일쇄 핵산에 대한 몰비여도 좋다.

Tm값에 대해서 설명한다. 예컨대 2중쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260 ㎚에서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 2중쇄 DNA에서의 양쇄간의 수소 결합이 가열에 의해서 풀어지고, 단일쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고 모든 2중쇄 DNA가 해리되어 단일쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 시작시의 흡광도(2중쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이것에 의해 융해가 완료한다고 판단할 수 있다. 이 현상에 기초하여, 융해 온도 Tm이란, 일반적으로 흡광도가, 흡광도 전체 상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다.

본 발명에 있어서, Tm값을 결정하기 위한 온도 변화에 따르는 시그널 변동의 측정은, 전술과 같은 원리로부터, 260 ㎚의 흡광도 측정에 의해 행할 수도 있지만, 본 발명의 프로브에 부가한 표지의 시그널을 측정하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 본 발명의 프로브로서, 전술의 표지화 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 표지화 프로브로서는, 예컨대 단독으로 시그널을 나타내고 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브, 또는 단독으로 시그널을 나타내지 않으며 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브를 들 수 있다. 전자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2중쇄)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널을 나타낸다. 또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2중쇄)를 형성하는 것에 의해 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 표지에 의한 시그널을 시그널 특유의 조건(흡광도 등)으로 검출하는 것에 의해, 상기 260 ㎚의 흡광도 측정과 마찬가지로, 융해의 진행 및 Tm값의 결정을 행할 수 있다. 표지화 프로브에서의 표지화 물질은, 예컨대 전술한 대로이다.

다음에, 본 발명의 변이 검출 방법에 대해서, 본 발명의 프로브로서, 형광 색소로 표지화된 표지화 프로브를 사용하는 예를 들어 설명한다. 또한 본 발명의 변이 검출 방법은, 본 발명의 프로브를 사용하는 것 자체가 특징이며, 그 외의 공정이나 조건에 대해서는 전혀 제한되지 않는다.

우선, 전혈로부터 게놈 DNA를 단리한다. 전혈로부터의 게놈 DNA의 단리는, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있고, 예컨대 시판되는 게놈 DNA 단리 키트(상품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE 헬스케어바이오사이언스사제) 등을 사용할 수 있다.

다음에, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 시료에 표지화 프로브를 첨가한다. 상기 표지화 프로브로서는, 예컨대 QProbe가 바람직하다. 이 QProbe란, 일반적으로, 프로브 말단의 시토신 염기를 형광 색소로 표지화한 프로브이고, 이것이 검출 대상 서열에 하이브리다이즈함으로써, 상기 형광 색소와 검출 대상 서열의 구아닌 염기가 상호 작용하고, 그 결과, 형광이 감소(또는 소광)하는 것이다.

상기 프로브의 첨가 타이밍은, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 후술하는 증폭 반응 전, 증폭 반응 도중 및 증폭 반응 후 중 언제라도, 증폭 반응의 반응계에 첨가하여도 좋다. 그 중에서도, 증폭 반응과, 상기 (B) 공정을 연속적으로 행할 수 있기 때문에, 증폭 반응 전에 첨가하는 것이 바람직하다. 이와 같이 핵산 증폭 반응 전에 상기 프로브를 첨가하는 경우는, 예컨대 전술과 같이, 그 3' 말단에, 형광 색소를 부가하거나, 인산기를 부가하는 것이 바람직하다.

상기 프로브는, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 액체 시료에 첨가하여도 좋고, 용매중에서 게놈 DNA와 혼합하여도 좋다. 상기 용매로서는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대 Tris-HCl 등의 완충액, KCl, MgCl₂, MgSO₄, 글리세롤 등을 포함하는 용매, PCR 반응액 등, 종래 공지의 것을 들 수 있다.

계속해서, 단리한 게놈 DNA를 주형으로 하고, PCR 등의 핵산 증폭법에 의해서, 검출 목적의 염기 부위를 포함하는 서열을 증폭시킨다. 상기 핵산 증폭법은 제한되지 않고, 예컨대 PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있지만, PCR법이 바람직하다. 또한 이하, PCR법을 예로 들어 본 발명을 설명하지만, 이것에는 제한되지 않는다. 또한 PCR의 조건은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

PCR의 프라이머의 서열은, 검출 목적의 염기 부위를 포함하는 서열을 증폭할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, 전술과 같이, 목적의 서열에 따라서, 종래 공지의 방법에 의해 적절하게 설계할 수 있다. 프라이머의 길이는, 특별히 제한되지 않고, 일반적인 길이(예컨대 10 mer∼30 mer)로 설정할 수 있다.

본 발명의 검출 방법에 사용하는 프라이머 세트로서는, 예컨대 후술하는 본 발명의 프라이머 세트를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트의 용도는, 본 발명의 검출 방법에는 제한되지 않고, 또한 본 발명의 검출 방법에 사용하는 프라이머 세트도, 본 발명의 프라이머 세트로는 한정되지 않는다.

다음에, 얻어진 PCR 증폭 산물의 해리, 및 해리에 의해 얻어진 단일쇄 DNA와 상기 표지화 프로브와의 하이브리다이즈를 행한다. 이것은, 예컨대 상기 반응액의 온도 변화에 의해 행할 수 있다.

상기 해리 공정에서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물을 해리할 수 있는 온도이면 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 85℃∼95℃이다. 가열 시간도 특별히 제한되지 않지만, 통상 1초∼10분이고, 바람직하게는 1초∼5분이다.

또한, 해리한 단일쇄 DNA와 상기 표지화 프로브와의 하이브리다이즈는, 예컨대, 상기 해리 공정 후, 상기 해리 공정에서의 가열 온도를 강하시키는 것에 의해 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예컨대 40℃∼50℃이다.

하이브리다이즈 공정의 반응계(반응계)에서의 각 조성의 체적이나 농도는, 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서는, 상기 반응계에서, DNA의 농도는, 예컨대 0.01 μmol/L∼1 μmol/L이고, 바람직하게는 O.1 μmol/L∼O.5 μmol/L, 상기 표지화 프로브의 농도는, 예컨대 상기 DNA에 대한 첨가 비율을 만족시키는 범위가 바람직하며, 예컨대 0.001 μmol/L∼10 μmol/L이고, 바람직하게는 0.001 μmol/L∼1 μmol/L이다.

그리고, 상기 반응액의 온도를 변화시키고, 상기 증폭 산물과 상기 표지화 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정한다. 구체적으로는, 예컨대 상기 반응액(상기 단일쇄 DNA와 상기 표지화 프로브와의 하이브 리드 형성체)을 가열하고, 온도 상승에 따르는 시그널값의 변동을 측정한다. 전술과 같이, 말단의 C 염기가 표지화된 프로브(구아닌 소광 프로브)를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와 하이브리다이즈한 상태에서는, 형광이 감소(또는 소광)하고, 해리한 상태에서는 형광을 발한다. 따라서, 예컨대 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드 형성체를 서서히 가열하고, 온도 상승에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 좋다.

형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 시작 온도가 실온∼85℃이고, 바람직하게는 25℃∼70℃이며, 종료 온도는, 예컨대 40℃∼105℃이다. 또한 온도의 상승 속도는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 0.1∼20℃/초이고, 바람직하게는 0.3∼5℃/초이다.

다음에, 상기 시그널의 변동을 분석하여 Tm값으로서 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터, 예컨대 각 온도에서의 단위 시간당의 형광 강도 변화량을 산출한다. 변화량을 (-d 형광 강도 증가량/dt)로 하는 경우는, 예컨대 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또한 변화량을 (d 형광 강도 증가량/t)로 하는 경우는, 예컨대 가장 높은 점을 Tm값으로서 결정할 수도 있다. 또한 표지화 프로브로서, 소광 프로브가 아니라, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 프로브를 사용한 경우에는, 반대로 형광 강도의 감소량을 측정하면 좋다.

상기 Tm값은, 예컨대 종래 공지의 MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/) 등에 의해 산출할 수 있고, 또한 최근린법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수도 있다.

그리고, 이들 Tm값으로부터, 목적의 염기 부위에서의 유전자형(변이형, 정상형 등)을 결정한다. Tm 분석에 있어서, 완전히 상보적인 하이브리드(퍼펙트매치)는, 1 염기가 상이한 하이브리드(미스매치)보다, 해리를 나타내는 Tm값이 높아진다고 하는 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 미리 상기 프로브에 대해서, 완전히 상보인 하이브리드의 Tm값과, 1 염기가 상이한 하이브리드의 Tm값을 결정해 두는 것에 의해, 목적의 염기 부위에서의 유전자형을 결정할 수 있다. 예컨대 목적의 염기 부위의 염기를 변이형으로 가정하고, 그 변이형 염기를 포함하는 검출 목적 서열에 상보적인 프로브를 사용한 경우, 형성한 하이브리드의 Tm값이, 완전히 상보인 하이브리드의 Tm값과 동일하면, 목적 염기는, 변이형으로 판단할 수 있다. 또한 형성한 하이브리드의 Tm값이, 1 염기 상이한 하이브리드의 Tm값과 동일(완전히 상보인 하이브리드의 Tm값보다 낮은 값)하면, 목적 염기는 정상형으로 판단할 수 있다.

또한, 본 발명에서는, 전술과 같이, 상기 프로브를 포함하는 반응액의 온도를 상승시켜(하이브리드 형성체를 가열하여), 온도 상승에 따르는 시그널 변동을 측정하는 방법 대신에, 예컨대 하이브리드 형성시에서의 시그널 변동의 측정을 행하여도 좋다. 즉, 상기 프로브를 포함하는 반응액의 온도를 강하시켜 하이브리드 형성체를 형성할 때에, 상기 온도 강하에 따르는 시그널 변동을 측정하여도 좋다.

구체예로서, 단독으로 시그널을 나타내고 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브(예컨대 구아닌 소광 프로브)를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와 프로브가 해리하고 있는 상태에서는 형광을 발하고 있지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예컨대 상기 반응액의 온도를 서서히 강하시켜, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 감소를 측정하면 좋다. 한편 단독으로 시그널을 나타내지 않고 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브를 사용한 경우, 단일쇄 DNA와 프로브가 해리되어 있는 상태에서는 형광을 발하지 않지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광을 발하게 된다. 따라서, 예컨대 상기 반응액의 온도를 서서히 강하시켜, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 좋다.

<프라이머 세트>

(F) 서열 번호 2의 염기 서열에서의 193번째의 시토신 염기(c)를 1 염기째로 하고 5' 방향을 향해 24∼44 염기째까지의 영역과 동일 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기(c)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드(R) 서열 번호 2의 염기 서열에서의 255번째의 시토신 염기(c)를 1 염기째로 하여 3' 방향을 향해 23∼47 염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 255번째의 시토신 염기(c)에 상보적인 구아닌 염기(g)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드

본 발명에 있어서, 각 프라이머는 DNA 폴리메라제에 의한 증폭의 개시점을 결정하는 역할을 다하는 3' 말단의 염기가, 전술의 조건을 만족시키고 있으면 좋다.

이와 같이, 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머는 그 3' 말단의 염기가 고정되어 있으면 좋기 때문에, 각 프라이머의 길이 자체는 특별히 제한되지 않고, 일반적인 길이로 적절하게 조정할 수 있다. 프라이머의 길이의 일례로서는, 예컨대 13 mer∼50 mer의 범위이고, 바람직하게는 14 mer∼45 mer이며, 보다 바람직하게는 15∼40 mer이다. 구체예로서, 상기 포워드 프라이머는, 서열 번호 2의 염기 서열에서의 193번째의 시토신 염기(c)를 1 염기째로 하여 5' 방향을 향해 24∼47 염기째(바람직하게는 25∼35 염기째, 보다 바람직하게는 27∼32 염기째)까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한, 상기 리버스 프라이머는 서열 번호 2의 염기 서열에서의 255번째의 시토신 염기(c)를 1 염기째로 하여 3' 방향을 향해 23∼47염기째(바람직하게는 25∼38염기째, 보다 바람직하게는 26∼31염기째)까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한, 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 3' 말단이 고정되어 있기 때문에, 프라이머로부터 신장하는 영역은, 예컨대 서열 번호 2에서의 194번째∼254번째의 영역이지만, 얻어지는 증폭 산물의 전체의 길이는 사용하는 프라이머의 길이에 따라서 변화한다.

또한, 리버스 프라이머는, 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열에 대하여, 포워드 프라이머는, 상기 염기 서열의 상보쇄의 염기 서열에 대하여, 각각 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드가 아니어도 좋다. 즉, 각 프라이머에서의 3' 말단의 염 기를 제외하는 부분에 있어서, 예컨대 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드와 1개∼5개의 염기가 상이하여도 좋다.

이하에, 본 발명에서의 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머의 구체예를 나타내지만, 본 발명은 이것에는 제한되지 않는다. 그 중에서도 포워드 프라이머로서는, 서열 번호 25, 리버스 프라이머로서는 서열 번호 51이 바람직하다.

[표 1]

[표 2]

본 발명의 프라이머 세트에서의 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머의 몰비는, 특별히 제한되지 않는다. 또한, 핵산 증폭 반응시에서의 상기 양자의 몰비도, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 포워드 프라이머와(F)와 리버스 프라이머(R)와의 몰비(F:R)는 1:0.01∼100인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1:0.1∼10이며, 특별히 바람직하게는 1:0.5∼2이다.

<변이 검출 키트>

본 발명의 변이 검출 키트는, 본 발명의 JAK2 유전자에서의 변이의 검출 방법에 사용하기 위한 변이 검출 키트로서, 본 발명의 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은, 전술의 본 발명의 프로브를 사용하는 것이 특징으로서, 그 외의 구성 등은 전혀 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 사용 방법은, 본 발명의 변이 검출 방법에 따라서 행할 수 있다.

본 발명의 변이 검출 키트는, 또한 본 발명의 프라이머 세트를 구성하는 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 중 어느 하나를 포함하여도 좋고, 양쪽 모두를 포함하여도 좋다. 또한, 본 발명의 변이 검출 키트는, 예컨대 또한, 핵산 증폭에 필요한 시약, 사용설명서 등을 포함하여도 좋다.

이어서, 본 발명의 실시예에 대해서 설명한다. 단, 본 발명은 하기의 실시예에 의해 제한되지 않는다.

실시예 1

JAK2 유전자 exon12의 73번째의 염기의 점 돌연변이(g→t)의 검출

본 발명의 프로브를 사용하여, 서열 번호 1로 나타내는 JAK2 유전자의 exon12에서의 79번째의 염기의 점 돌연변이(g→t)에 대한 Tm 분석을 행하였다.

(검체)

JAK2/V617F 양성 백혈병 세포주인 HEL과, JAK2 야생형 백혈병주인 MYL을 사용하였다. 각 세포의 배양액을, 세포수가 이하의 비율이 되도록 혼합하고, 이 배양혼 합액 10 μl를 95℃에서 5분간 처리한 시료를, PCR용 시료로 하였다.

[표 3]

(프로브 및 프라이머 세트)

검출용 프로브(서열 번호 3)

5'-agtatgtTtctgtggagac-(TAMRA)-3'

포워드 프라이머(서열 번호 25)

5'-gcagcaagtatgatgagcaagctttctc-3'

리버스 프라이머(서열 번호 51)

5'-gctctgagaaaggcattagaaagcctg-3'

(Tm 분석)

상기 PCR용 시료 5 μl에, 하기 P-mix 20 μl와 하기 E-mix 25 μl와의 혼합 액을 첨가하고, PCR 반응을 행하였다. 상기 PCR 반응은 서멀 사이클러를 이용하여, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃ 5초 및 58℃ 30초를 1 사이클로 하여 35-50 사이클 반복하고, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 더 처리하였다. 그리고, 계속하여 온도의 상승 속도를 1℃/3초로 하고, 상기 PCR 반응액을 40℃부터 70℃로 가열해 가며, 시간 경과에 따른 형광 강도의 변화를 측정하였다(파장 585 ㎚∼700 ㎚).

[표 4]

이들 결과를 도 1에 도시한다. 도 1은 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 도시하는 Tm 분석의 그래프이다. 동 도면에 있어서, (W)는 wild(정상형) DNA(100%), (M)은 mt(변이형) DNA(100%), (M1)은 mtDNA:wildDNA가 1:99인 혼합물, (M10)은 mtDNA:wildDNA가 10:90인 혼합물의 결과를 각각 나타낸다. 동 도면(W)에 도시하는 바와 같이, wildDNA(100%)의 피크는 52℃이고, (M)에 도시하는 바와 같이, mtDNA(100%)의 피크는 58℃였다. 이들 피크 온도(Tm값)를 평가 기준으로 하고, wildDNA와 mtDNA와의 혼합물에서의 피크를 평가하였다. 그 결과, 동 도면에서의 (M1) 및 (M10)에 도시하는 바와 같이, 상기 검출용 프로브를 사용한 결과, 각각 상 기 평가 기준과 동등한 온도로, wildDNA의 피크 및 mtDNA의 피크가 검출되었다. 이 결과로부터, 본 발명의 프로브에 의하면, mtDNA와 wildDNA가 공존하는 경우라도, mtDNA의 검출 감도를 충분히 확보할 수 있는 것을 알았다. 또한, 일반적인 Direct Sequencing법이나 Pyrosequencing법의 경우, 검출 감도는 약 5%∼20%, 즉 mtDNA가 5%∼20% 존재하지 않으면 검출하는 것이 곤란하지만, 상기 검출용 프로브를 이용한 Tm 분석에 의하면, mtDNA가 약 1%여도 충분히 검출 가능하고, 매우 고감도인 것을 알았다.

또한, 만성 골수증식성 질환(CMPD)의 환자로부터 채혈하고, 게놈 DNA의 추출을 행하며, 마찬가지로 하여, JAK2 유전자의 변이에 대해서 Tm 분석을 행하였다. 그 결과, 복수의 환자 중, 모든 진정 다혈증예(PV증 예: 10예) 및 본태성 혈소판혈증 예(ET증 예. 4예)에서 JAK2-V617F가 검출되었다. 또한 ET증 예에 대해서는, Direct Sequencing법으로는, 검출 한계 이하였기 때문에, 본 실시예에서의 방법이, 매우 우수한 검출 감도이며, 매우 유용한 것을 알았다.

이상과 같이, 본 발명의 프로브에 의하면, 검출 목적의 변이가 발생하고 있는 JAK2 유전자(변이 유전자)와 변이가 발생하지 않는 JAK2 유전자(정상 유전자)가 공존하고 있는 경우라도, 검출 목적의 변이를 갖는 변이 유전자를 검출할 수 있다. 예컨대 상기 Tm 분석에 있어서는, 종래의 프로브이면, 전술과 같이, 프로브가 1염기만 상이한 변이 유전자와 정상 유전자의 쌍방에 하이브리다이즈하기 때문에, 상기 융해 곡선에 있어서, 양자의 시그널이 중복되고, 변이 유전자의 존재를 검출하 는 것이 매우 곤란했다. 이것에 대하여, 본 발명의 프로브에 의하면, 변이 유전자와 정상 유전자의 쌍방에 하이브리다이즈하지만, 융해 곡선에 있어서, 양자의 시그널을 분리할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브를 이용한 방법에 의하면, 기지의 방법인 Direct Sequencing법이나 Pyrosequencing법보다 검출 감도에도 우수하다. 이 때문에, 본 발명에 의하면, 예컨대 Tm 분석에 의해서도, 변이 유전자의 검출이 우수한 감도로 실현 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY Inc. <120> TF08020-01 <130> Probe to detect JAK2 gene mutation and use the same <150> JP 07/184842 <151> 2007-07-13 <160> 55 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 88 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> k stands for g or t <400> 1 tctttctttg aagcagcaag tatgatgagc aagctttctc acaagcattt ggttttaaat 60 tatggagtat gtktctgtgg agacgaga 88 <210> 2 <211> 500 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> exon <222> (154)..(241) <223> <220> <221> misc_feature <222> (226)..(226) <223> k stands for g or t <400> 2 gtccatataa agggaccaaa gcacattgta tcctcatcta tagtcatgct gaaagtagga 60 gaaagtgcat ctttattatg gcagagagaa ttttctgaac tatttatgga caacagtcaa 120 acaacaattc tttgtacttt tttttttcct tag tct ttc ttt gaa gca gca agt 174 Ser Phe Phe Glu Ala Ala Ser 1 5 atg atg agc aag ctt tct cac aag cat ttg gtt tta aat tat gga gta 222 Met Met Ser Lys Leu Ser His Lys His Leu Val Leu Asn Tyr Gly Val 10 15 20 tgt ktc tgt gga gac gag a gtaagtaaaa 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Claims

JAK2 유전자의 변이를 검출하기 위한 프로브로서,

하기 (X) 및 (Y)의 적어도 한 쪽 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프로브.

(X) 서열 번호 1의 염기 서열로 이루어지는 JAK2 유전자의 exon12에서의 84번째의 시토신 염기(c)를 1 염기째로 하여 5' 방향을 향해 17∼22 염기째까지의 영역과 동일 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기(c)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드

(Y) 상기 (X)의 상보 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
제1항에 있어서, 상기 (X)가 서열 번호 3∼8로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열 번호의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드인 프로브.
제1항에 있어서, 상기 염기 서열에서의 염기 (k)가 티민(t)인 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브가 서열 번호 1의 염기 서열에서의 73번째의 염기의 변이(g→t)를 검출하기 위한 프로브인 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브가 표지 물질로 표지화된 표지화 프로브인 프로 브.
제5항에 있어서, 상기 표지화 프로브가 단독으로 시그널을 나타내고 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브 또는, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브인 프로브.
제5항에 있어서, 상기 표지화 프로브가 형광 색소로 표지화된 프로브이고, 단독으로 형광을 나타내며 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소하는 프로브인 프로브.
제5항에 있어서, 상기 표지화 프로브가 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 시토신 염기가 표지화된 프로브인 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브가 Tm 분석용 프로브인 프로브.
JAK2 유전자에서의 변이의 검출 방법으로서,

하기 공정 (A)∼(C)를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이의 검출 방법.

(A) 상기 변이의 유무를 검출하는 피검 핵산과, 제1항에 기재한 프로브를 포함하는 반응계를 준비하는 공정

(B) 상기 반응계의 온도를 변화시키고, 상기 피검 핵산과 상기 프로브와의 하이브리드 형성체의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 측정하는 공정

(C) 온도 변화에 따르는 상기 시그널값의 변동으로부터, 상기 피검 핵산에서의 상기 변이의 유무를 결정하는 공정
제10항에 있어서, JAK2 유전자에서의 변이가, 서열 번호 1로 나타내는 JAK2 유전자의 exon12에서의 73번째의 염기의 변이(g→t)인 검출 방법.
제10항에 있어서, 상기 (A) 공정에서의 상기 피검 핵산이, 주형 핵산으로부터 핵산 증폭법에 의해 증폭시킨 증폭물인 검출 방법.
제12항에 있어서, 상기 (A) 공정이, 또한 프라이머 세트를 이용하여, 주형 핵산으로부터 피검 핵산을 증폭하는 공정을 포함하는 검출 방법.
제13항에 있어서, 상기 프라이머 세트가, 하기 (F)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 포워드 프라이머 및 하기 (R)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 리버스 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머인 검출 방법.

(F) 서열 번호 2의 염기 서열에서의 193번째의 시토신 염기(c)를 1 염기째로 하여 5' 방향을 향해 24∼44 염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기(c)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티 드

(R) 서열 번호 2의 염기 서열에서의 255번째의 시토신 염기(c)를 1염기째로 하여 3' 방향을 향해 23∼47 염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 255번째의 시토신 염기(c)에 상보적인 구아닌 염기(g)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
제14항에 있어서, 상기 (F)의 올리고뉴클레오티드가 하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드이고, 상기 (R)의 올리고뉴클레오티드가 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드인 검출 방법.

(F1) 서열 번호 25의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드

(R1) 서열 번호 51의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
제10항에 있어서, 상기 프로브가 형광 표지로 표지화된 프로브이고, 상기 (B) 공정에서 상기 형광 표지의 형광 강도를 측정하는 검출 방법.
제10항에 있어서, 피검 핵산이 생체 시료 유래의 핵산인 검출 방법.
제17항에 있어서, 상기 생체 시료가 혈액인 검출 방법.
핵산 증폭법에 의해 JAK2 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트로서,

하기 (F)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 포워드 프라이머 및 하기 (R)의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 리버스 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.

(F) 서열 번호 2의 염기 서열에서의 193번째의 시토신 염기(c)를 1 염기째로 하고 5' 방향을 향해 24∼44 염기째까지의 영역과 동일한 서열인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 시토신 염기(c)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드

(R) 서열 번호 2의 염기 서열에서의 255번째의 시토신 염기(c)를 1염기째로 하고 3' 방향을 향해 23∼47 염기째까지의 영역에 상보적인 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드로서, 상기 255번째의 시토신 염기(c)에 상보적인 구아닌 염기(g)를 3' 말단으로 하는 올리고뉴클레오티드
제19항에 있어서, 상기 (F)의 올리고뉴클레오티드가 하기 (F1)의 올리고뉴클레오티드이며, 상기 (R)의 올리고뉴클레오티드가 하기 (R1)의 올리고뉴클레오티드인 프라이머 세트.

(F1) 서열 번호 25의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드

(R1) 서열 번호 51의 염기 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드
제19항에 있어서, 상기 프라이머 세트가, 생체 시료 유래의 JAK2 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 세트인 프라이머 세트.
제10항에 기재한 JAK2 유전자에서의 변이의 검출 방법에 사용하기 위한 변이 검출 키트로서,

제1항에 기재한 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 검출 키트.
제22항에 있어서, 제19항에 기재한 프라이머 세트를 더욱 포함하는 변이 검출 키트.