CN106520987B - 单核苷酸多态性rs3888722在筛查落叶型天疱疮患者中的应用 - Google Patents

单核苷酸多态性rs3888722在筛查落叶型天疱疮患者中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了单核苷酸多态性rs3888722在筛查落叶型天疱疮患者中的应用。本发明所保护的技术方案是检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质在制备筛查落叶型天疱疮患者产品中的应用及检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质在制备检测与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。可将检测rs3888722的多态性或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查落叶型天疱疮患者的产品。

Description

单核苷酸多态性rs3888722在筛查落叶型天疱疮患者中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中单核苷酸多态性rs3888722在筛查落叶型天疱疮患者中的应用。
背景技术
天疱疮是一种少见的可威胁生命的自身免疫性大疱性皮肤病(Stanley,1989；Nousari and Anhalt,1999)，其特点为患者体内存在抗角质形成细胞黏附分子的自身抗体，缺乏角质形成细胞间的黏连功能。天疱疮发病率为每年0.76-6.7/百万人次，不同种族及地域间存在差异(Ahmed et al.,1990；Bystryn and Rudolph,2005；Meyer and Misery,2010)。尽管目前可通过长期系统性应用糖皮质激素及免疫抑制剂对该病进行治疗(Loiseau et al.,2000)，但在美国，由于天疱疮导致的死亡率接近10％(Lombardi etal.,1996)，且目前的治疗方案存在明显的副作用。因此，我们需要对天疱疮的发病机理进行进一步研究并寻找新的治疗方案。
寻常型天疱疮(PV)和落叶型天疱疮(PF)是天疱疮的两种主要亚型，二者影响皮肤的不同结构层次并且有不同的临床表现(Stanley,1989；Bystryn and Rudolph,2005)。寻常型天疱疮主要的自身抗原为桥粒核心糖蛋白3(Dsg 3)，50％-60％的患者存在桥粒核心糖蛋白1(Dsg 1)的抗体。寻常型天疱疮患者的皮肤和黏膜均受累。落叶型天疱疮患者仅存在桥粒核心糖蛋白1(Dsg 1)的抗体，并且仅有皮肤损害，不累及黏膜。寻常型天疱疮的皮损程度较深，体液流失较多，机体代谢紊乱，加大感染风险。因此，与寻常型天疱疮相比，落叶型天疱疮的预后较好。尽管二者在临床表现及自身抗原方面存在差异，二者被视为同一种疾病且治疗方案相近。
目前，天疱疮的遗传学基础还没有被很好的研究，但通过不同种群中疾病患病率的差异、自身免疫性疾病与遗传相关及HLA I和HLA II类分子在不同种群中的关联性均可证实该病存在遗传风险(Ahmed et al.,1990；Lombardi et al.,1996；Miyagawa et al.,1997；Lombardi et al.,1999；Loiseau et al.,2000；Shams et al.,2009；Saha et al.,2010；Tunca et al.,2010)。然而，大部分文章仅研究了较少的HLA等位基因并且缺乏独立的验证。目前，仅有一篇关于寻常型天疱疮的全基因组关联分析的研究，该研究对犹太人群中的100例寻常型银屑病患者及397例健康对照进行分析(Sarig et al.,2012)。然而，该研究除在HLAII类分子区域发现有较强的关联信号外，并没有发现任何遗传风险因素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何筛查落叶型天疱疮患者与检测落叶型天疱疮易感性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一用途：
A1)检测人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备筛查落叶型天疱疮患者产品中的应用；
A2)检测人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备检测落叶型天疱疮易感性产品中的应用；
A3)检测人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备检测与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；
A4)检测人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；
B1)人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型在制备筛查落叶型天疱疮患者产品中的应用；
B2)人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型在制备检测落叶型天疱疮易感性产品中的应用；
B3)检测人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型的物质在筛查落叶型天疱疮患者中的应用；
B4)检测人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型的物质在检测落叶型天疱疮易感性中的应用；
B5)检测人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型的物质在检测与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性的中的应用；
B6)检测人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性的中的应用；
B7)人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型在筛查落叶型天疱疮患者中的应用；
B8)人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型在检测落叶型天疱疮易感性中的应用。
rs3888722是人染色体6p22.1上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是颠换(C/G，在其互补链上则为G/C)。所述rs3888722基因型是CC、CG或GG。所述CC是rs3888722位点为C的纯合型，所述GG是rs3888722位点为G的纯合型，所述CG是rs3888722位点为C和G的杂合型。所述检测人基因组中rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型具体可为检测rs3888722的核苷酸种类。
上述用途中，所述检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质可为扩增包括rs3888722在内的基因组DNA片段的PCR引物和/或成套探针。所述产品可包括所述PCR引物和/或所述成套探针。
上述用途中，所述GG和所述CG基因型的个体在落叶型天疱疮患者群体中的比例分别高于对应的基因型在正常人群体中的比例，所述GG和所述CG基因型的个体在落叶型天疱疮患者群体中的比例分别高于对应的基因型在寻常型天疱疮群体中的比例。
上述用途中，所述落叶型天疱疮具体可为中国人群落叶型天疱疮。
为解决上述技术问题，本发明还提供了含有检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质的产品。
本发明所提供的含有检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质的产品，为a)-d)中的任一种产品：
a)检测与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型的产品；
b)鉴定或辅助鉴定与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型的产品；
c)筛查落叶型天疱疮患者产品；
d)检测落叶型天疱疮易感性产品。
上述产品中，所述检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质可为扩增包括rs3888722在内的基因组DNA片段的PCR引物和/或成套探针。
上述产品中，所述落叶型天疱疮具体可为中国人群落叶型天疱疮。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述M1)或M2)的方法：
M1)筛查落叶型天疱疮患者的方法，包括：检测待测对象基因组中rs3888722位点的基因型，如rs3888722位点的基因型为GG基因型，所述待测对象为或候选为落叶型天疱疮患者；如rs3888722位点的基因型为CG基因型，所述待测对象为或候选为落叶型天疱疮患者；如rs3888722位点的基因型为CC基因型，所述待测对象为或候选为非落叶型天疱疮患者；
M2)检测落叶型天疱疮易感性的方法，包括：检测待测对象基因组中rs3888722位点的基因型，如rs3888722位点的基因型为GG基因型，所述待测对象易感或候选易感落叶型天疱疮；如rs3888722位点的基因型为CG基因型，所述待测对象易感或候选易感落叶型天疱疮；如rs3888722位点的基因型为CC基因型，所述待测对象不易感或候选不易感落叶型天疱疮。
上述方法中，检测待测对象基因组中rs3888722位点的基因型可采用所述检测rs3888722的多态性或基因型的物质进行。
上述方法中，所述落叶型天疱疮具体可为中国人群落叶型天疱疮。
实验证明，rs3888722的风险等位基因为G，该等位基因在落叶型天疱疮患者群体中的比例比该等位基因在正常健康人群中的比例高147.32％，比该等位基因在寻常型天疱疮患者中的基因频率增加了46.96％，比正常对照和寻常型天疱疮患者群体中的基因频率增加了132.90％。rs3888722的P值是6.73×10-9，且rs3888722的相对危险度是2.74，说明rs3888722是与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性。rs3888722的三个基因型中，GG基因型的个体和CG基因型的个体在落叶型天疱疮患者群体中的比例分别高于对应的基因型的个体在正常人群体和/或寻常型天疱疮患者群体中的比例，CC基因型的个体在落叶型天疱疮患者群体中的比例低于该基因型的个体在正常人群体和/或寻常型天疱疮患者群体中的比例。
本发明在实际应用中，可将检测rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查落叶型天疱疮患者的产品。
其中，检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质可为通过下述至少一种方法确定rs3888722的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、TaqMan探针技术和SequenomMassArray技术。其中，利用Sequenom MassArray技术确定rs3888722的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对、基于单碱基延伸反应的延伸引物、磷酸酶、树脂、芯片、MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)和/或Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器；利用TaqMan探针技术确定rs3888722的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪、进行基因分型的模块和/或TaqMan探针技术所需要的其他试剂；SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片和/或基于荧光分子DNA结合反应的芯片。在本发明的一个实施例中，，利用的是TaqMan探针技术。
所述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒和仪器组成的系统，如由引物和DNA测序仪组成的系统，由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的系统，由TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的模块以及TaqMan探针技术所需要的其他试剂组成的系统，由探针、PCR引物对以及连接酶检测反应(LDR)所需要的其他试剂和仪器组成的系统，由PCR引物对、单碱基延伸引物、芯片、PCR仪、进行基因分型的模块和/或Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器组成的系统。
采用TaqMan探针技术确定rs3888722的多态性(即等位基因)和基因型时，所述PCR引物对在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs3888722在内的基因组DNA片段即可。所述TaqMan探针的序列覆盖rs3888722。所述定量PCR仪为ABI 7900实时荧光定量PCR仪。所述进行基因分型的模块具体可为7900System SDS software。
本发明中，所述PCR引物可由rs3888722-F和rs3888722-R组成；
所述rs3888722-F是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：
a1)序列表中序列4所示的单链DNA；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述rs3888722-R是如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：
b1)序列表中序列5所示的单链DNA；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
所述成套探针由探针1和探针2组成；所述探针1的序列为如下c1)至c4)中的任一种：
c1)序列表中序列6所示的序列；
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
c3)与c1)或c2)限定的序列具有85％以上的同一性的序列；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的序列杂交的序列；
所述探针2的序列为如下d1)至d4)中的任一种：
d1)序列表中序列7所示的序列；
d2)在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
d3)与d1)或d2)限定的序列具有85％以上的同一性的序列；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的序列杂交的序列。
a2)所述在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA为在序列4所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。b2)所述在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA为在序列5所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列为在序列6所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的序列。d2)所述在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列为在序列7所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列4、序列5、序列6或序列7所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
所述探针1和所述探针2均可由荧光物质标记。所述探针1可为在序列表中序列6所示的单链DNA的5’端标记报告荧光染料FAM、在3’端标记淬灭荧光染料NFQ得到的TaqMan探针。所述探针2可为在序列7所示的单链DNA的5’端标记报告荧光染料VIC、在3’端标记淬灭荧光染料NFQ得到的TaqMan探针。
本发明在一个来自中国人群的样本(落叶型天疱疮患者群体、寻常型天疱疮患者群体和健康群体)中发现rs3888722是与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性，并且rs3888722的单核苷酸多态性与寻常型天疱疮无关。可将检测rs3888722的多态性(即等位基因)或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型的物质)联合在一起制备筛查落叶型天疱疮患者的产品。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、rs2178077和rs3888722是与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性
研究对象
全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)发现阶段的研究对象包括166例天疱疮患者(寻常型天疱疮(PV)101例，落叶型天疱疮(PF)65例)和885例正常对照(CK)。在SNP验证阶段中的研究对象为156例天疱疮患者(PV 86例，PF 70例)和996例正常对照(CK)。联合分析研究对象为369例天疱疮患者(PV 210例，PF 159例)和2493例正常对照(CK)。所有研究对象均来自于中国人群。
所有天疱疮患者的诊断符合以下4条：1)临床特点：红斑基础上的水疱、大疱，尼式征阴性；2)具有典型的寻常型天疱疮或落叶型天疱疮病史；3)免疫学检查包括皮肤活检组织的直接免疫荧光与血浆样本的间接免疫荧光证实其为寻常型天疱疮或落叶型天疱疮患者；4)ELISA分析证实其为寻常型天疱疮或落叶型天疱疮患者。
所有正常对照都被临床证实无天疱疮(包括寻常型天疱疮和落叶型天疱疮)病史且无天疱疮的家族史，并均没有自身免疫性疾病。
所有患者和对照的特点见表1。年龄分布及性别比例在PV群体、PF群体及对照群体中均无显著差异。
表1、发现阶段与验证阶段的样本
本研究经山东省皮肤病性病防治研究所伦理审查委员会批准。所有研究对象都已签署知情同意书。
样本为每位患者的大约2ml全血，提取基因组DNA用于基因型分析。
发现阶段(第一阶段)
对发现阶段的101例PV、65例PF和885例正常对照应用涵盖900015个SNPs的Illumina Omni Zhonghua芯片进行基因分型。在进一步分析时排除了总体基因分型率<96％或杂合体率超过平均值±3S.D.的样本(18例对象)；通过继承等同分析(IBD)(PI_HAT>0.25)确定的9例可能的重复样本或亲戚样本也被排除。满足下列条件的SNPs也被排除：(i)没有映射到常染色体；(ii)call rate<90％；(iii)MAF<0.01；(iv)对照中SNP的基因型分布与Hardy-Weinberg平衡的预测值(P<10-5)相偏离。在对样本和SNP进行质量过滤后，得到了包含101例PV，65例PF病例及844例对照中的43826个常见独立的SNPs(r2<0.1)的数据集，将这些数据以及来自YRI(来自尼日利亚，伊巴丹的约鲁巴人；n＝90)，CEU(来自北欧和西欧的犹太人；n＝90)，CHB(n＝45)和JPT(n＝44)的HapMap样本一起进行PCA分析，排除了14个异常的样本。我们对剩余的病例和对照样本进行了另一轮PCA，结果显示病例和对照都匹配很好(附件图S1)。经过质量控制阶段，一共有101例PV，65例PF和844例对照的806342个SNPs被纳入到全基因组SNP推算。对于那些基于千人组计划的基准(2012年3月发布)而未分型的SNPs，我们应用Shapeit(Delaneau et al.,2013)和IMPUTE_v2(Howie et al.,2009)来定相和推算。低推算置信度(INFO score<0.8)，显著的Hardy-Weinberg连锁不平衡(P<10-5)或MAF<5％的SNPs被排除于进一步的分析之外。最终，在GWAS发现阶段一共有101例PV病例，65例PF病例和844例对照中的5546030个SNPs被分型和推算。
SNP验证阶段(第二阶段)
发明人选取了82个SNPs按以下1)或2)的标准：1)在PV关联分析中P<10-4；或2)在PF关联分析中P<10-4，在另一独立样本中选择56例PV患者，49例PF患者和996例正常对照的独立样本中进行验证。在82个SNPs中，一共有71个SNPs被成功分型，call rate>90％且无显著HWE偏离(P>0.0003)。
其中rs2178077SNP分型的引物序列如下：
rs2178077_W1_F(正向引物)：ACGTTGGATGTAACAACCGAGGATTACTGC(序列1)
rs2178077_W1_R(反向引物)：ACGTTGGATGATCTCAGCAGTGATGTTGCC(序列2)
rs2178077_W1_E(延伸引物)：TGCCTCCGATGAGCAC(序列3)
rs2178077SNP分型的具体操作步骤如下：
采用Sequenom MassArray(San Diego，USA)平台验证，每个样本约用到15ngDNA。首先提取外周血的基因组DNA，标准化后，样本DNA经多重PCR反应扩增包括SNP位点在内的基因组DNA片段，扩增产物进行SNP位点特异性单一链的延伸，延伸产物脱盐并转移到384孔的芯片上。质谱仪(MALDI-TOF MS)进行等位基因的检测，采用Sequenom Mass ARRAY分型软件对检测结果进行分析。
1、全血标本采集
在患者知情同意，并签署书面同意书的情况下采集研究对象外周静脉血5ml，放置于EDTANa2抗凝管中，置-80℃冰柜储存备用。
2、DNA浓度标准化包括如下步骤：
1)利用NanoDrop-1000浓度测试仪准确测定每一份需要标准化的样本DNA浓度和OD比值(A260/A280、A260/A230)。
2)建立电子表格，排定每个样本孔需要加入的DNA编号。
进行Sequenom MassArray分型的样本，在每96孔板上留有空白对照和重复样本对照。
3)按照电子表格的顺序，加入已测定浓度的DNA。
对于进行Sequenom MassArray分型的样本要求实验浓度为12-30ng/μl，一般以18ng/μl为佳。并且A260/A280比值介于1.5-2.0之间、A260/230介于1.5-2.3，如DNA浓度高于18ng/μl则加入适量FG3，将浓度标化至18ng/μl；如DNA浓度低于12ng/μl，则重新从血液提取合格的DNA。浓度在12—18ng/μl间直接加入。
离心后贴上粘性锡箔纸，并用标记笔标上样本板标号、样本类型、来源地等信息。
4)在平板离心机上，3000g离心3分钟，存放于-20℃备用。
3、利用正向引物和反向引物进行多重PCR。
4、SNP位点特异性单一链的延伸反应
其中，延伸引物根据人基因组中SNP位点上游(不包括该SNP位点)设计，所述延伸引物的最后1位核苷酸对应于人基因组中该SNP位点的前1位核苷酸。
5、数据质量控制
1)对分型的SNP进行call rate计算，去除call rate<95％的SNP或等位基因频率<0.01的SNPs；
2)对SNP进行遗传平衡检验，去除偏离遗传平衡定律的SNP(对照样本中Hardy-Weinberg平衡检验的P≦0.001)。
3)在Sequenom MassArray系统中查看SNP的分型聚类图，去除聚类图分堆不清的SNP。
4)样本质控：直接去除分型失败的样本。
将通过质控的样本和SNP进行统计分析。
6、数据统计分析
利用Plink 1.07软件对分型成功并通过质控的SNP在病例组和对照组做基因表型相关性分析，用Cochran-Armitage trend检验每个样本的基因型和表型的关联性，然后用Cochran-Mantel-Haenszel综合分析所有样本的基因型和表型的相关性。用Q检验来评价个体间的异质性，本次实验中，以p<0.05作为检验水准。多重logistic回归分析用于检测区域内的信号的独立性。检验水准α以0.05除以通过质量控制的SNP数目为检验水准。Q检验用于评估遗传异质性的显著性，对SNP校正检测后P值小于0.05者视为有显著遗传异质性。
经过对MHC突变的分析，发明人选取了1个MHC区域内的独立的SNP(rs3888722)应用Taqman Allelic Discrimination Assay(Applied Biosystems)在新招募的一批样本与部分验证阶段的研究对象(共148例病例(80例PV，68例PF)和759例正常对照，年龄分布及性别比例在PV群体、PF群体及对照群体中均无显著差异)中进行验证，新招募的研究对象也均符合上文中的标准。这个SNP被成功分型，call rate>90％且无显著HWE偏离(P>0.025)。
利用7900HT/Taqman基因分型系统Taqman Allelic Discrimination Assay(Applied Biosystems)对rs3888722进行分型：
引物及探针序列为：
正向引物rs3888722-F：TGTGGTTAAGCATTCTATCGAATCA(序列4)
反向引物rs3888722-R：TGTCATCCACAGCAGAGACATG(序列5)
探针1rs3888722-P1：AGGAACACTAAAAGTT(序列6)，5′端由报告荧光染料FAM标记，3′端由淬灭荧光染料NFQ标记
探针2rs3888722-P2：AACACTAAAACTTGCTTCT(序列7)，5′端由报告荧光染料VIC标记，3′端由淬灭荧光染料NFQ标记
操作步骤如下：
分别抽取每个对象的外周静脉血5ml，提取基因组DNA，分别基因组DNA(DNA浓度均在50-100ng/微升之间)。
实时荧光定量PCR反应的反应体系为：基因组DNA 1μL、2×TaqMan GT master mix(Life technology公司)2.5μL、20×TaqMan探针混合物0.65μL、去离子水0.85μL。将上述反应体系加入96孔PCR板中，采用ABI 7900实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)进行反应。反应条件为：95℃变性30秒，60℃退火1分钟，40个循环。
上述反应体系中，20×TaqMan探针混合物包括扩增包括rs3888722在内的基因组DNA片段的PCR引物对和成套探针，其中PCR引物对由上述正向引物和反向引物组成，成套探针由探针1和探针2组成。
反应结束后，采用7900System SDS software进行基因型分型，确定研究位点的基因型。
在排除分型失败样本外，在共计157例寻常型天疱疮(PV)患者、114例落叶型天疱疮(PF)患者和1840例正常对照中联合分析rs2178077与天疱疮的相关性(表2)，结果发现，rs2178077是与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性，rs2178077的P值是1.57×10-9，rs2178077的相对危险度是3.03。该SNP天疱疮(PV和PF)患者和正常对照中的基因型频率如表3所示。结果表明：rs2178077的三个基因型中，AG基因型的个体在PF患者群体中的比例分别高于该基因型的个体在正常人群体和PV患者群体中的比例，AA基因型的个体在PF患者群体中的比例分别高于该基因型的个体在正常人群体和PV患者群体中的比例，GG基因型的个体在PF患者群体中的比例分别低于该基因型的个体在正常人群体和PV患者群体中的比例。
在排除分型失败样本外，在共计167例寻常型天疱疮(PV)患者、125例落叶型天疱疮(PF)患者和1675例正常对照中联合分析rs3888722与天疱疮的相关性(表2)，结果发现，位于MHC区域内的rs3888722是与落叶型天疱疮相关的风险位点；rs3888722的P值是6.73×10-9，OR值为2.74。该SNP天疱疮(PV和PF)患者和正常对照中的基因型频率如表3所示。结果表明：rs3888722的三个基因型中，GC基因型的个体在PF患者群体中的比例分别高于该基因型的个体在正常人群体和PV患者群体中的比例，GG基因型的个体在PF患者群体中的比例分别高于该基因型的个体在正常人群体和PV患者群体中的比例，CC基因型的个体在PF患者群体中的比例分别低于该基因型的个体在正常人群体和PV患者群体中的比例。
表2、PV患者、PF患者和正常对照群体中各基因型的个体数及基因型频率
注：rs2178077的基因型中，A1*A1表示AA，A1*A2表示AG，A2*A2表示GG；
rs3888722的基因型中，A1*A1表示GG，A1*A2表示GC，A2*A2表示CC。
表3、rs2178077在PV患者、PF患者和正常对照群体中的等位基因频率
表4、rs3888722在PV患者、PF患者和正常对照群体中的等位基因频率
利用二分类的logistic回归模型(log-additive模型)计算PV患者群体、PF患者群体和正常人群体中基因频率差异性P值，确定SNP有无显著性意义，其中基因型采用可加模型进行统计。结果发现，rs2178077和rs3888722的各等位基因的基因频率在正常人群体和PF患者群体中均有显著性差异，而在正常人群体和PV患者群体中均无显著性差异。
由表3可知，rs2178077的风险等位基因为A，与正常对照相比该等位基因在PF患者中的基因频率增加了103.25％，与PV患者群体相比该等位基因在PF患者中的基因频率增加了99.25％，与正常对照和PV患者群体相比该等位基因在PF患者中的基因频率增加了102.93％。
由表4可知，rs3888722的风险等位基因为G，与正常对照相比该等位基因的基因频率在PF患者中增加了147.32％，与PV患者群体相比该等位基因在PF患者中的基因频率增加了46.96％，与正常对照和PV患者群体相比该等位基因在PF患者中的基因频率增加了132.90％。
实验结果表明，rs2178077和rs3888722的多态性或基因型或等位基因频率可用于PF患者的筛查。
<110> 山东省皮肤病性病防治研究所
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 1
acgttggatg taacaaccga ggattactgc 30
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg atctcagcag tgatgttgcc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgcctccgat gagcac 16
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<213> 人工序列
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tgtggttaag cattctatcg aatca 25
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<213> 人工序列
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tgtcatccac agcagagaca tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aggaacacta aaagtt 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 7
aacactaaaa cttgcttct 19

Claims (4)

1.检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质在制备筛查落叶型天疱疮患者产品中的应用；
所述检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质包括扩增包括rs3888722在内的基因组DNA片段的PCR引物和成套探针；
所述rs3888722基因型是CC、CG或GG；
所述GG和所述CG基因型的个体在落叶型天疱疮患者群体中的比例分别高于对应的基因型在正常人群体中的比例，所述GG和所述CG基因型的个体在落叶型天疱疮患者群体中的比例分别高于对应的基因型在寻常型天疱疮群体中的比例。
2.检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质在制备检测落叶型天疱疮易感性产品中的应用；
所述检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质包括扩增包括rs3888722在内的基因组DNA片段的PCR引物和成套探针；
所述rs3888722基因型是CC、CG或GG；
所述GG和所述CG基因型的个体在落叶型天疱疮患者群体中的比例分别高于对应的基因型在正常人群体中的比例，所述GG和所述CG基因型的个体在落叶型天疱疮患者群体中的比例分别高于对应的基因型在寻常型天疱疮群体中的比例。
3.检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质在制备检测与落叶型天疱疮相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；
所述检测人基因组中rs3888722的多态性或基因型的物质包括扩增包括rs3888722在内的基因组DNA片段的PCR引物和成套探针；
所述rs3888722基因型是CC、CG或GG；
所述GG和所述CG基因型的个体在落叶型天疱疮患者群体中的比例分别高于对应的基因型在正常人群体中的比例，所述GG和所述CG基因型的个体在落叶型天疱疮患者群体中的比例分别高于对应的基因型在寻常型天疱疮群体中的比例。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述PCR引物由rs3888722-F和rs3888722-R组成；
所述rs3888722-F为序列表中序列4所示的单链DNA；
所述rs3888722-R为序列表中序列5所示的单链DNA；
所述成套探针由探针1和探针2组成；
所述探针1的序列如序列表中序列6所示；
所述探针2的序列如序列表中序列7所示。
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