CN109988758A

CN109988758A - 一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针及其核酸扩增试剂盒

Info

Publication number: CN109988758A
Application number: CN201910302822.8A
Authority: CN
Inventors: 周中人; 许向华; 张磊; 张桂平
Original assignee: Shanghai Quiling Bioengineering Co Ltd; QUICKING BIOTECH CO Ltd
Current assignee: Shanghai Quiling Bioengineering Co Ltd; QUICKING BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2019-07-09

Abstract

本发明公开了一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，寡核苷酸链探针的最小自由能结构是茎环结构，其序列自5’端至3’端依次为如下四区段：茎结构序列MB‑J、环序列MB‑H、茎结构互补序列MB‑Jc、单链尾序列MB‑P；一组荧光淬灭基团和荧光基团分别连接在MB‑J的5’端和MB‑Jc链中间碱基，两连接位置在茎环结构中相邻近；MB‑H和MB‑P与靶序列全部或部分互补，且MB‑P的3’端与靶序列互补并能延伸聚合。本发明的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，具有引物和分子信标的功能。本发明还公开了一种恒温核酸扩增试剂盒，包括所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针。

Description

一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针及其核酸扩增试剂盒

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针及其核酸扩增试剂盒。

背景技术

DNA特异性扩增技术和检测技术，和在此基础上发展的各种应用发展迅猛。在临床检验中，即时检验(point-of-care testing，POCT)理念快速兴起，从简单的干化学技术到传感及生物芯片，其检测项目几乎覆盖了所有医学检验领域。POCT与核酸扩增的结合要求仪器便携稳定、方法操作简便、获得结果快速清楚可靠甚至具有可对比的标准。由此产生了方法、试剂、仪器等大量的改进和发明。

POCT中大量应用等温DNA扩增技术，包括链置换等温扩增(stranddisplacementamplification，SDA)、滚环等温扩增(rolling circle amplification，RCA)、核酸序列扩增技术(nucleic acid sequence based amplifica tion，NASBA)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物介导的等温扩增(Cross-Priming Amplification，CPA)等。等温DNA扩增反应技术因不需要定时周期变化反应温度，降低了对仪器的要求，促进DNA扩增为基础的检测技术的广泛应用；高速的扩增酶和扩增循环启动不受温度循环限制大大缩短的扩增所需的时间。但是，几乎所有等温扩增反应都倾向于产生非特异的DNA合成，引入探针的好处包括不产生非特异的信号和信号检测灵敏便捷。

现有的恒温扩增技术如LAMP技术多采用观测焦磷酸镁白色沉淀、HNB染料颜色、钙黄绿素荧光等方法判断阳性，但上述方法的阳性检测结果只能代表实验过程中发生了核酸聚合反应过程，而无法区分真正的由引物和对应目标DNA模版杂交而形成的阳性扩增结果和由于引物之间、引物与样本DNA之间误杂交发生误扩增所导致的假阳性结果，对临床检测造成了不便。

分子信标(molecular beacon)是1996年Tyagi等发明的一种有茎环结构的荧光探，应用于循环变温的聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增，使其检测达到定量的精密度。该技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析。分子信标的茎结构两链相邻近的位置(常见为茎的两端或环的两端，在茎结构的任一位置也是可以的)一个连接有荧光基团，另一个连接有荧光淬灭基团。当没有靶序列存在时，分子信标探针低温时自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发荧光。在有靶序列存在的情况下，分子信标低温时与互补的靶序列形成稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着温度的升高，双链杂交体逐渐解链，达到熔点时，荧光迅速下降。通过控制反应温度同时观测荧光值，即可判断是否存在靶序列的扩增。在PCR扩增的退火阶段，分子信标与生成的靶序列结合发出荧光，在延伸阶段，脱离靶序列而不干扰扩增，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与扩增的模板量成正比。从而实现了实时监控的定量的高度灵敏和特异的检测。分子信标也应用于包括PCR在内的其它DNA扩增技术的检测。常规的分子信标环序列与靶序列一致，茎序列多为高GC比例的无关序列。

中国专利申请201811067779.3公开了一种基于分子信标的荧光环介导等温扩增方法，该方法根据环介导等温扩增技术(LAMP)环引物(加速引物)设计分子信标，一个末端连接有荧光基团，另一个末端连接有荧光淬灭基团。该反应体系的检测限约为10³拷贝。这个方法能够产生特异的分子信标荧光信号，能够区别背景和阳性，但是该方法的扩增终点信号强度Rn较差(0.5vs染料法>2)，信号弱，不适合用作商品化的试剂盒。

发明内容

为了解决上述问题，本发明在传统的分子信标茎环序列外，将其3'端的茎额外延伸出来一定长度序列作为尾链，且这段尾链序列与靶序列互补，尾链能参与正常的聚合延伸；这种情况下，该分子信标不只是一个荧光信号探针，它也是参与聚合延伸提高核酸扩增反应效率的一个特殊引物。因此，本发明的第一个目的是提供一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，以解决现有核酸扩增反应中存在的基因扩增中的序列特异性荧光信号来源问题。本发明的第二个目的是提供一种核酸扩增试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，寡核苷酸链探针的最小自由能结构是茎环结构，其序列自5’端至3’端依次为如下四区段：茎结构序列MB-J、环序列MB-H、茎结构互补序列MB-Jc、单链尾序列MB-P；MB-J的碱基侧面和MB-Jc的碱基侧面的茎环结构中两个邻近位置分别连接了一组荧光淬灭基团/荧光基团中的一个；MB-H和MB-P与靶序列全部或部分互补，且MB-P的3’端与靶序列互补并能延伸聚合。当茎环结构打开，MB-J与MB-Jc分离，远离淬灭基团的荧光基团发出的信号可以被检测到。检测到荧光信号即等同于茎环结构被打开，茎环结构被打开的情况为：当茎或环的序列与靶序列互补时，即存在单链的靶序列；当仅尾序列MB-P与靶序列互补时，该寡核苷酸链探针所延伸的DNA充当下一轮延伸的模板并延伸到探针的位置。

根据本发明，茎序列MB-Jc的序列全部或部分与靶序列互补。

进一步的，所述参与聚合延伸的寡核苷酸链探针为RNA或DNA。

作为本发明的第二个方面，一种核酸扩增试剂盒，包括根据靶序列设计的引物，至少一种链置换DNA聚合酶或一种RNA聚合酶以及如上述所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针。

根据本发明，所述的核酸扩增试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的四条按环介导等温扩增(LAMP)方法设计的引物；这四条引物分别为F3、FIP、BIP、B3，靶序列上存在与FIP、BIP相关的F1c/B1序列，其中，上述所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上F1c的3’端上游序列相同或B1的5’端下游的序列互补，或参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列来自靶序列以外来源，共同完成LAMP反应。

根据本发明，所述核酸扩增试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少一条按滚环扩增(rolling cycle amplification,RCA)方法设计的引物，上述所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上互补或相同，共同完成双引物滚环扩增(又称，超支化滚环扩增Hyperbranched rolling cycleamplification或分支滚环扩增ramification amplification)反应。

根据本发明，所述核酸扩增试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少两条引物分别为F/R，寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上除F/R以外的其他序列互补或相同。

进一步的，所述核酸扩增试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少两条按重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)方法设计的引物分别为F/R，所述参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上除F/R以外的其他序列互补或相同。

进一步的，所述核酸扩增试剂盒包括至少两条按解链酶依赖扩增(Helicase-Dependent Amplification,HDA)方法设计的引物分别为F/R，上述参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上除F/R以外的其他序列互补或相同。

进一步，所述核酸扩增试剂盒包括至少一种RNA聚合酶及与靶序列互补的至少一条按转录介导的扩增(TMA)方法设计的带有RNA聚合酶启动子位点的引物，所述参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列互补或相同。

根据本发明，所述核酸扩增试剂盒还包括一种用于检测核酸含量的荧光染料，该荧光染料的探测波长与寡核苷酸链探针的荧光探测波长设置在不同通道。

本发明的有益效果：本发明的类似分子信标结构且能参与聚合延伸的寡核苷酸链探针将其3'端的茎额外延伸出来一定长度序列作为尾链，且至少这段尾链序列与靶序列互补，尾链能参与正常的聚合延伸；这种结构的分子信标既是一个合成技术成熟成本可控的荧光探针，它也能在扩增反应中与靶序列结合参与聚合延伸，大大提高了核酸扩增反应效率，能在多种基因扩增方法中发挥作用，尤其是在恒温基因扩增方法中发挥作用。

附图说明

图1-1为本发明的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的结构示意图。其中，△表示荧光基团，☆表示荧光淬灭基团。

图1-2为本发明的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的结构示意图。其中，△表示荧光基团，☆表示荧光淬灭基团。

图2为三个参与核酸序列聚合延伸的分子信标：LB-DMB1、LF-DMB1和LB-DMB2的最低自由能结构(LAMP)。

图3-1为实施例1的第②组合和第④组合的LAMP反应的扩增曲线图。

图3-2为实施例的第③、④、⑥组合的LAMP反应的扩增曲线图。

图3-3为实施例1的第③组合的LAMP反应的扩增曲线图。

图3-4为实施例1的第②组合的LAMP反应的扩增曲线图。

图4为实施例5TMA反应的扩增曲线图。

图5为实施例6PCR反应的参与聚合延伸的寡核苷酸链(RNA)探针RSX30的最低自由能结构。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中所述中不够详尽之处，均为常规方法和常规材料；具体实验，均设置验证和对照。

一种核酸扩增试剂盒，包括根据靶序列设计的引物，至少一种链置换DNA聚合酶以及参与聚合延伸的寡核苷酸链探针。

如图1-1和图1-2所示，为本发明的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的最小自由能结构是茎环结构，其序列自5’端至3’端依次为如下四区段：MB-J、MB-H、MB-Jc、MB-P；MB-H为寡核苷酸链探针的环序列，MB-J及MB-Jc序列互补或部分互补形成茎结构，MB-P与靶序列全部或部分互补，且3’端与靶序列互补并能延伸聚合；MB-J的5’端，MB-Jc链中邻近MB-J的5’端的碱基分别与一组荧光淬灭基团和荧光基团中的一个连接。目前的DNA链中间位置一般通过dT-Dabcyl或dT-BHQ能标记淬灭基团。当茎环结构打开，MB-J与MB-Jc分离，远离淬灭基团的荧光基团发出的信号可以被检测到。检测到荧光信号即等同于茎环结构被打开：当茎或环的序列与靶序列互补时，即存在单链的靶序列；当仅尾序列MB-P与靶序列互补时，该寡核苷酸链探针所延伸的DNA充当下一轮延伸的模板并延伸到探针的位置。

环序列MB-H的全部或部分序列与靶序列互补。

茎序列MB-Jc的序列全部或部分与靶序列互补。

所述参与聚合延伸的寡核苷酸链探针为RNA或DNA。应当说明，在以核酸扩增为基础的生物技术领域，RNA引物不是一种成熟的技术。1995年Shibata H.等(首先)报告了RNA能够充当PCR反应的引物。在转录介导的核酸扩增(Transcriptionmediated amplification，TMA)反应的设计中，RNA信标探针可以用于检测TMA反应中的RNA产物，指导RNA合成的是由DNA引物带入系统的特定的启动子序列，没有RNA引物。参与聚合延伸的寡核苷酸核糖核酸(RNA)链探针可以用于上述PCR和TMA两种反应体系。

所述的核酸扩增试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的四条按环介导等温扩增方法设计的引物；这四条引物分别为F3、FIP、BIP、B3，靶序列上存在与FIP、BIP相关的F1c/B1序列，其中，上述所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上F1c的3’端上游序列相同或B1的5’端下游的序列互补，或参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列来自靶序列以外来源，共同完成LAMP反应。

所述核酸扩增试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少一条按滚环扩增方法设计的引物，上述所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上互补或相同，共同完成双引物滚环扩增反应。

所述核酸扩增试剂盒包括包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少两条引物分别为F/R，寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上除F/R以外的其他序列互补或相同。

所述核酸扩增试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少两条按重组酶聚合酶扩增方法设计的引物分别为F/R，上述所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上除F/R以外的其他序列互补或相同。

所述核酸扩增试剂盒包括至少两条按解链酶依赖扩增方法设计的引物分别为F/R，参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上除F/R以外的其他序列互补或相同。

所述核酸扩增试剂盒还包括一种用于检测核酸含量的荧光染料，该荧光染料的探测波长与寡核苷酸链探针的荧光探测波长设置在不同通道。

以下实施例的试验材料如下：

(1)以下实施例的所有质粒、引物、探针均由上海生工生物工程有限公司合成。

(2)荧光值由宏石slan-96P荧光定量PCR仪检测从而获得数据进行分析。

实施例1一种参与核酸序列聚合延伸的分子信标应用于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)体系

一、LAMP反应体系和反应条件的设置

1、LAMP反应体系(25μL)：

模板2μL(DNA含量分别为1000个量级、100个量级以及10量级)；

Tris-HCl(pH＝8.8)20mM，KCl 10mM，(NH4)₂SO₄ 10mM，甜菜碱0.8M，MgSO₄ 8mM，dNTP 1.4mM，Tween20 0.25μL，Bst DNA聚合酶8U，

引物F3和引物B3各5pmol，引物FIP和引物BIP各40pmol，引物LF和引物LB各20pmol，常规的和带尾的分子信标探针均为20pmol。每个分子信标引物组合设置三个重复。

2、LAMP反应条件：64℃反应45min，每分钟采集一次荧光。

二、引物的设计与合成

本实施例根据NCBI中已发表的非洲猪瘟病毒特异性保守序列设计引物和探针，所用序列的genebank号为MH910496.1(格鲁吉亚株，African swine fever virusstrainGeorgia 2008/2)，选择外膜蛋白基因B646L的3’保守序列(1492-1907)的417碱基。具体序列如下：

atgcagcccactcaccacgcagagataagctttcaggatagagatacagctcttccagacgcatgttcatctatatctgatattagccccgttacgtatccgatcacattacctattattaaaaacatttccgtaactgctcatggtatcaatcttatcgataaatttccatcaaagttctgcagctcttacatacccttccactacggaggcaatgcgattaaaacccccgatgatccgggtgcgatgatgattacctttgctttgaagccacgggaggaataccaacccagtggtcatattaacgtatccagagcaagagaattttatattagttgggacacggattacgtggggtctatcactacggctgatcttgtggtatcggcatctgctattaactttcttcttcttcag(SEQ ID NO：1)

设计的引物组合包括一对内引物FIP、BIP，一对外引物F3、B3以及一对环引物LF、LB，具体序列如下：

F3:CAGCTCTTACATACCCTTC(SEQ ID NO：2)

B3:CAAGATCAGCCGTAGTGA(SEQ ID NO：3)

FIP:GGCTTCAAAGCAAAGGTAATCAAGGCAATGCGATTAAAA(SEQ ID NO：4)

BIP:AGGAATACCAACCCAGTGGTCAGTAATCCGTGTCCCAACTA(SEQ ID NO：5)

LF:ATCGCACCCGGATCAT(SEQ ID NO：6)

LB:AACGTATCCAGAGCAAGAG(SEQ ID NO：7)

使用10¹¹拷贝/uL浓度溶液10^-10稀释，获得10拷贝/uL，取1uL加入反应体系做模板。

三、用于LAMP体系的一种参与核酸序列聚合延伸的分子信标的设计与筛选

1、针对步骤二的引物组合设计配套的常规分子信标探针。

LB-DMB0:※cgccgtaTCCAGAGCAAGAGAAtacggcg※，不带尾巴(SEQ ID NO：8)

最低自由能结构(Minimum free energy of the structure)＝-9.52kcal/mol

常规分子信标探针的环序列与靶序列一致，茎序列不一致，且末端标记占据延伸位点，常规分子信标探针不能作为引物延伸。

下划线部分的序列与模板序列一致；※是标记荧光信号或淬灭基团的位置，形成茎环结构时，二者邻近不产生荧光信号，当探针与靶序列结合时，二者分离产生荧光信号。

2、针对步骤二的引物组合设计配套的一种参与核酸序列聚合延伸的分子信标。最低自由能结构见附图2。其中，(1)LB-DMB1、LF-DMB1的MB-H、MB-Jc、MB-P与靶序列互补，LB-DMB2的MB-P与靶序列互补。(2)下划线部分的序列与模板序列一致；※是标记荧光信号或淬灭基团的位置，形成茎环结构时，二者邻近不产生荧光信号，当探针与靶序列结合时，二者分离产生荧光信号。

LF-DMB1:※atccgggATCGCAcccggat※CAT(SEQ ID NO：9)

环-茎-尾(识别)：6-7-3(16)；Minimum free energy of the structure＝-11.10kcal/mol

LB-DMB1:※actcttgctAACGTATCCAGagcaagagt※TTTA(SEQ ID NO：10)

环-茎-尾(识别)：11-9-4(24)；Minimum free energy of the structure＝-10.90kcal/mol

LB-DMB2:※cgcgacATGCgtcgcg※AACGTATCCAGAGCAAGAG(SEQ ID NO：11)

环-茎-尾(识别)：4-6-19(19)；Minimum free energy of the structure＝-9.80kcal/mol

四、以SEQ ID NO：1的非洲猪瘟病毒特异性保守序列质粒为模板，采用如下引物探针组合LAMP反应。其中，F3、B3、FIP、BIP、LF、LB的引物序列分别如SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示。LB-DMB0、LF-DMB1、LB-DMB1、LB-DMB2的序列分别如SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示。

F3、B3、FIP、BIP、LF、LB

①：F3、B3、FIP、BIP、LF、LB+LB-DMB0；

②：F3、B3、FIP、BIP、LF+LB-DMB0；

③：F3、B3、FIP、BIP、LF-DMB1+LB；

④：F3、B3、FIP、BIP、LF+LB-DMB1；

⑤：F3、B3、FIP、BIP、LF+LB-DMB2；

⑥：F3、B3、FIP、BIP、LF-DMB1+LB-DMB1；

结果如图3-1、图3-2、图3-3所示。其中，图3-1为第②组合和第④组合的LAMP反应的扩增曲线图，模板量均为10³拷贝/uL。图3-2为第③、④、⑥组合的LAMP反应的扩增曲线图，模板量均为10³拷贝/uL，阈值处四条曲线左到右依次为：第③组合，第组合，第④组合，第⑥组合；图3-3的第③组合的质粒梯度a为10³拷贝/uL、b为10²拷贝/uL、c为10¹拷贝/uL。图3-4的第②组合的质粒梯度10⁴拷贝/uL、10³拷贝/uL、10²拷贝/uL、10¹拷贝/uL和空白对照。

(1)图3-1的结果显示，SEQ ID NO：8所示的常规信标探针没有促进反应的功能；SEQ ID NO：10所示的带尾的信标探针/引物具有促进反应的功能。

(2)图3-2的结果显示，第③、④组合都得到阳性结果，其中，第③组合较好；第③组合与第组合的Ct、Rn差不多，第⑥组合比第④组合的结果差，Ct较大(即第⑥组合比第④组合的促进延伸作用差)，Rn较低(即反应终止时产物形成的荧光信号较弱)。

(3)图3-3的结果显示：第③组合的Rn值约为2.2，第③组合的a、b、c都起峰。

另外，发明人对第④组合和第⑤组合进行的LAMP反应，第④组合和第⑤组合的模板量a为10³拷贝/uL、b为10²拷贝/uL、c为10¹拷贝/uL。

结果显示，第④、⑤组合的Rn和灵敏度差不多(第④、⑤组合的Rn值均约为1.0)；在模板浓度为10²拷贝/uL时，第⑤组合较第④组合的起峰略早；在模板浓度10拷贝/uL时，第⑤组合和第④组合都没有扩增(第④、⑤组合的c结果均为阴性)。

综上，第③组合和第④组合的Rn值相差两倍(第③组合的Rn值约为2.2，第④组合的Rn值约为1.0)，灵敏度差一个数量级(第③组合的a、b、c都起峰，第④组合的a、b起峰，c结果为阴性)；

第③、④组合的环、茎、尾序列都与靶序列识别，第⑤组合只有尾序列与靶序列识别。第③、④、⑤组合的茎结构打开的时间是不同的。第③、④组合在探针与靶序列结合的时候就打开茎环结构产生荧光信号，而第⑤组合的尾序列结合在靶序列上不直接打开茎结构，要等到以带尾的信标探针/引物延伸出的链充当模板且合成到茎序列，即尾序列结合靶位点之后几乎两个循环才能打开茎结构。模板量a为10³拷贝/uL时，第③、④、⑤组合的Ct分别是16，27，26。

(4)第②组合的引物和探针的LAMP反应。

将质粒进行梯度稀释，浓度为10⁴拷贝/uL、10³拷贝/uL、10²拷贝/uL、10拷贝/uL，采用第②组合的引物和探针的进行灵敏度试验，结果如表1和图3-4所示。

表1第②组合的引物和探针的LAMP反应结果

表1结果显示，第②组合的引物和探针的检测限是10¹拷贝/uL，但Rn值为0.5，Rn值较低。

结论：采用第②组合的引物和探针很难优化出商品化的试剂盒。

综上所述：本发明给出的一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针在LAMP体系中同时具有探针和引物的功能。

实施例2一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针应用于超分支滚环扩增技术(Hyperbranched rolling cycle amplification,HRCA)

锁式探针两端设计特异性序列与靶序列互补，特异性序列之间的连接序列设计为通用序列并针对该序列设计通用引物和参与聚合延伸的寡核苷酸探针。锁式探针的缺口对应核酸变异位点，只有锁式探针两端的特异性序列与靶序列完全互补的情况下，锁式探针才会在连接酶作用下成(单链)环。锁式探针的一个重要应用就是检测点突变。

一、用于HRCA反应的序列、引物和探针的设计

用于HRCA技术的锁式探针中的通用序列的序列如下：

tggagtggtgaatccgttagcgaggtgccgcctcgacgaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaccag(SEQ ID NO：12)

针对通用序列合成的一对引物，引物序列如下：

HRCA-S：5'CTG GTG CTA CGC CTG AAT AAG TGA 3'(SEQ ID NO：13)

HRCA-A：5'GGT GAA TCC GTT AGC GAG GTG 3'(SEQ ID NO：14)

根据通用序列设计的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，探针序列如下：

HRCA-PS:5'caggcgt CTG GTG CTa cgcctg AAT AAG TGA 3'(SEQ ID NO：15)

HRCA-PA：5'ctaac ggaGGT GAA TCC GTT AGC GAG GTG 3'(SEQ ID NO：16)

二、HRCA反应和结果检测

1、以成环的锁式探针为模板进行HRCA扩增反应的条件：25uL体系中10XBst缓冲液2.5uL，连接反应产物4uL，HRCA通用引物(HRCA-S和HRCA-A各2.5pmol/uL)6uL，dNTP(各10mmol/L)1uL，94℃2min；Bst DNA聚合酶1uL，终体积25uL,61℃90min。

TaqI内切酶+电泳检测：15uL HRCA反应产生中加1uL TaqI，65℃1hr，取5uL电泳检查。预期的条带长度为82+120*N，即82、202、322等梯度。

结果：10⁴模板产生的连接反应产物(环化锁式探针)模板的30min HRCA反应产物电泳已显示清楚的条带。

2、HRCA反应同时荧光检测：25uL体系中10XBst缓冲液2.5uL，连接反应产物4uL，HRCA通用引物(HRCA-S和HRCA-A各15pmol)+参与聚合延伸的寡核苷酸探针(HRCA-PS和HRCA-PA各15pmol)，dNTP(各10mmol/L)1uL，94℃2min；BstDNA聚合酶1uL，终体积25uL,61℃90min。

结果：10⁴模板的环化锁式探针+HRCA-S+HRCA-PA或10⁴模板的环化锁式探针+HRCA-PS+HRCA-A的HRCA反应+荧光检测，Ct约20min，Rn在2-3之间。

结论：HRCA-PS、HRCA-PA两个都是有效的探针和引物。

具体的，本实施例的模板序列采用NCBI上的序列，genebank号为NM_001040458(2227-2285)。具体序列如下：

GGACCTCATT GATAAGCAGA CATGGACAGA CGAGGGCTCA GTCTCAGAGC GAATGCTGCG

(SEQ ID NO：17)

本实施例的锁式探针的序列如下：

CCTCGTCTGTCCATGtggagtggtgaatccgttagcgaggtgccgcctcgacgaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaccagGCTCTGAGAC TGAGC(SEQ ID NO：18)

实施例3一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针应用于重组酶聚合扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)

一、用于RPA反应的序列和引物、探针

1、模板质粒ASFV-RPA克隆的序列为非洲猪瘟病毒(格鲁吉亚-2株，genebank号MH910496.1)B646L基因(编码VP72外膜蛋白)的部分序列(96-395)，非洲猪瘟病毒格鲁吉亚-2株B646L基因1-420序列如下：

2、RPA引物和探针

P3-F:TGAACAAAAGTTATGGGAAACCCGATCCCGAA(SEQ ID NO：20)

P3-R：ATCTGGGACGTGCCCTGAATCGGAGCATCCT(SEQ ID NO：21)

exo探针：CGTATGCGGGCGTACTTTATTGTATTCAAA-FAM-dT-C-THF-T-BHQ1-dT-CTGGAACATAAGGCTT(SEQ ID NO：22)

一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针MB：

FAM-aagtacgcCGTATGCGGGCGTACTT-Dabcyl-dT-TATTGTATTCAAA

(SEQ ID NO：23)

二、RPA反应和结果检测

1、使用Twist Amp exo试剂盒，按说明书操作：50uL反应体系中，RehydrationBuffer 29.5uL，Mg²⁺2.5uL，10uM上下游引物(P3-F和P3-R)各2.1uL，10uM exo探针0.6uL，42℃，实时荧光检测，反应时间90分钟。

结果：使用10⁴拷贝模板，exo探针的反应Ct:20min；Rn 2.7。

2、使用Twist Amp exo试剂盒，按说明书操作：50uL反应体系中，RehydrationBuffer 29.5uL，Mg²⁺2.5uL，10uM上下游引物(P3-F和P3-R)各2.1uL，10uM参与聚合延伸的寡核苷酸链探针MB 0.6uL，42℃，实时荧光检测，反应时间90分钟。

结果：参与聚合延伸的寡核苷酸链探针MB的反应Ct 20min；Rn 2.6。且参与聚合延伸的寡核苷酸链探针MB的体系中有两种产物：(1)P3-F、P3-R之间的片段(276bp，引物之间延伸216bp)；(2)P3-F、本发明设计的寡核苷酸链探针MB之间的片段(142bp，引物之间延伸77bp)。两种产物都可以使寡核苷酸链探针MB产生荧光。

结论：实施例3中的MB具有探针的功能，可以应用于RPA反应。

实施例4一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针应用于依赖解螺旋酶的扩增技术(Helicase-Dependent Amplification,HDA)

一、用于HDA反应的序列和引物、探针

金黄色葡萄球菌基因组的FemA基因(全长：1263bp)，本实施例采用的FemA基因序列的genebank号为CP030136，用于设计HDA反应的引物和探针的具体序列如下：

FemA-F:TGGTGCCTTTACAGATAG(SEQ ID NO：25)

FemA-R*:FAM-ggtcattgAAGCTGcaatgacc-DabcylTCGT(SEQ ID NO：26)

FemA-R:AAGCTGCAATGACCTCGT(SEQ ID NO：27)

二、HDA反应和结果检测

25uL反应体系，6mmol/l MgSO₄，50mmol/l KCl 30mmol/l Tris-HCl(pH 8.8)，0.1％Triton X-100(v/v)，0.8mmol/l dNTPs，10μmol/l FemA-F引物和10μmol/l FemA-R引物，1.5mmol/l ATP，100ng Taq UvrD解旋酶，5U Bst DNA聚合酶大片段，1μl质粒DNA模板，65℃，实时荧光检测，反应时间90分钟。

25uL反应体系，6mmol/l MgSO₄，50mmol/l KCl 30mmol/l Tris-HCl(pH 8.8)，0.1％Triton X-100(v/v)，0.8mmol/l dNTPs，10μmol/l FemA-F引物、10μmol/l FemA-R*引物，1.5mmol/l ATP，100ng Taq UvrD解旋酶，5U Bst DNA聚合酶大片段，1μl质粒DNA模板，65℃，实时荧光检测，反应时间90分钟。

使用10⁴拷贝模板，FemA-F+FemA-R*反应的Ct＝20，Rn＝2.2；FemA-F+FemA-R加荧光染料或(90minHDA反应)纯化后电泳检测，荧光检测显示Ct＝19.5，Rn＝2.2、电泳结果为强阳性。

结论：实施例4中FemA-R*具有探针和引物的功能，可以应用于HDA反应。

实施例5一种参与聚合延伸的寡核苷酸链(RNA)探针应用于转录介导的扩增(Transcription mediated amplification，TMA)体系

一、应用于TMA反应的序列、引物和探针

TMA反应检测犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)的RNA。举例的序列genebank KM926612.1是毒株CDV-L的全基因组。具体被检测的是c基因的RNA，如下(1-525，计ATG的A为1，c基因的序列位于KM926612.1序列的1823-2347)：

(常规)RNA信标及TMA引物如下

CDV-CRMB：ccggaGAGGATTCTGGCGtccgg(SEQ ID NO：29)

CDV-CnT7：GGAGAAGGAAGCCYTGAT(SEQ ID NO：30)

CDV-CT7-2：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATTAAGGCCGAAAGAATATCC

(SEQ ID NO：31)

注：CDV-CnT7的C端第五个碱基Y，Y是C或者T，因为设计引物时考虑到这个位置的各种毒株可能是C或者T，前述KM926612.1的C基因序列中，这个位置是C。本实施例也以3'端第五个碱基是C为例。

CDV-CT7-2中AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGA是T7启动子序列；TTAAGGCCGAAAGAATATCC在C基因互补链的501-483。

CDV-CnT7在C基因正义链的408-425。

CDV-CRMB是RNA，实际序列中T应为U。其环序列GAGGATTCTGGCG在C基因正义链的435-446。被CDV-CRMB的环序列识别的序列为CDV-CT7-2的T7启动子延伸的RNA单链。

参与聚合延伸的RNA探针(T实际是U)

CDV-RMBP：CCAGAGGATTCTGGCGAAGAT(SEQ ID NO：32)

二、TMA反应和结果检测

本实施例以RNA为模板。

RNA是单链的，在逆转录酶作用下从引物开始合成cDNA，该引物可以在5’端引入序列，TMA反应中这里引入的是启动子序列；RNA聚合酶以双链为模板，不需要引物，但需要启动子序列合成RNA。

最初的体系中被检基因(附近)没有特定RNA聚合酶所需要启动子，所以，在只存在RNA聚合酶和反转录酶(二者反应温度相近可以在同一体系中)的情况下，TMA只能从RNA模板开始，是不能扩增DNA的；某些反转录酶同时具有引物起始的从DNA模板扩增DNA的能力，理论上，如果加一步热变性，引物与DNA模板结合，则可以因反转录酶的DNA聚合酶的作用在体系中引入RNA聚合酶启动子序列。

已检测：探针CDV-CRMB，引物CDV-CnT7和CDV-CT7-2的TMA体系对犬瘟热样品(阳性、疑似、阴性)的Ct分别是小于25分钟，25-35分钟，大于35分钟或完全不起峰。

CDV-RMBP及引物CDV-CnT7和CDV-CT7-2对犬瘟热阳性样品检测的结果如图4所示，Ct在11-12之间，Rn超过2.5。

结论：实施例5中的CDV-RMBP具有探针的功能，可以应用于TMA反应。

实施例6一种参与聚合延伸的寡核苷酸链(RNA)探针应用于聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)的扩增体系

一、应用于PCR反应的序列、引物和探针

RSX30：※GGGCGAAUUGGGUACCGGGCCCCCCC※UCGA(SEQ ID NO：33)

RSX30的最小自由能二级结构见图5。

BS430：ACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAG(SEQ ID NO：34)pBluescript SK(+)vector(GenBank:X52325.1)序列第641-1050的410碱基：

RSX30全部序列与靶序列(643-672)一致。

二、PCR反应和结果检测

PCR反应条件：10mM Tris-HC1,90mM KC1,1mM MnCl₂,200uM四种dNTPs,0.25U/uLrTth DNA聚合酶(rTth DNA polymerase)，10⁴拷贝pBluescript SK(+)质粒线性化模板，0.6uM引物(RNA引物RSX30和DNA引物BS430)。94℃ 10secand 70℃ 1min循环，70℃时采集荧光。产物430bp。Ct＝25，Rn＝3。

注：PCR循环中94℃时DNA或RNA双链是完全解开的(全部RNA探针/引物RSX30都有荧光信号)，RSX30与模板结合(结合的RSX30有荧光信号)时游离的RSX30的二级结构同时形成(游离的RSX30没有荧光信号)；因为RSX30的二级结构只存在于70℃时，在70℃时采集荧光以检测与模板结合的RSX30的量。

结论：实施例6中RNA引物RSX30具有探针和引物的功能，可以应用于PCR反应。

综上所述，本发明的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针同时具有信标探针的特异识别扩增产物并产生定量信号的功能和引物的3’端特异识别靶序列形成双链结构并提供延伸位点的功能；因茎环序列是否与靶序列互补，有两种打开茎结构，产生供检测的荧光信号的情况，①茎环序列和尾序列与靶序列互补结合，打开茎结构；②只有尾序列与靶序列结合互补，不会打开茎环结构，当茎环结构成为新一轮延伸的模板时，即下一轮延伸到尽头时，茎环结构打开。本发明的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针可以提高核酸扩增技术的特异性、灵敏性以及获得便捷和清楚的检测信号。同时，本发明的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针可采用本领域中已知的方法，进一步制成检测试剂盒，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。例如，本发明的实施例的序列，仅是用于解释说明本发明，本领域技术人员可以根据本发明的原理再设计引物和探针来用于检测其他靶基因序列。

序列表

<110> 上海快灵生物科技有限公司

上海快灵生物工程有限公司

<120> 一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针及其核酸扩增试剂盒

<130> 191017

<141> 2019-04-16

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcagccca ctcaccacgc agagataagc tttcaggata gagatacagc tcttccagac 60

gcatgttcat ctatatctga tattagcccc gttacgtatc cgatcacatt acctattatt 120

aaaaacattt ccgtaactgc tcatggtatc aatcttatcg ataaatttcc atcaaagttc 180

tgcagctctt acataccctt ccactacgga ggcaatgcga ttaaaacccc cgatgatccg 240

ggtgcgatga tgattacctt tgctttgaag ccacgggagg aataccaacc cagtggtcat 300

attaacgtat ccagagcaag agaattttat attagttggg acacggatta cgtggggtct 360

atcactacgg ctgatcttgt ggtatcggca tctgctatta actttcttct tcttcag 417

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagctcttac atacccttc 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagatcagc cgtagtga 18

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcttcaaag caaaggtaat caaggcaatg cgattaaaa 39

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggaatacca acccagtggt cagtaatccg tgtcccaact a 41

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcgcacccg gatcat 16

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aacgtatcca gagcaagag 19

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgccgtatcc agagcaagag aatacggcg 29

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atccgggatc gcacccggat cat 23

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actcttgcta acgtatccag agcaagagtt tta 33

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgcgacatgc gtcgcgaacg tatccagagc aagag 35

<210> 12

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggagtggtg aatccgttag cgaggtgccg cctcgacgaa tttctgccat tcatccgctt 60

attatcactt attcaggcgt agcaccag 88

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctggtgctac gcctgaataa gtga 24

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggtgaatccg ttagcgaggt g 21

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caggcgtctg gtgctacgcc tgaataagtg a 31

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctaacggagg tgaatccgtt agcgaggtg 29

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggacctcatt gataagcaga catggacaga cgagggctca gtctcagagc gaatgctgcg 60

<210> 18

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cctcgtctgt ccatgtggag tggtgaatcc gttagcgagg tgccgcctcg acgaatttct 60

gccattcatc cgcttattat cacttattca ggcgtagcac caggctctga gactgagc 118

<210> 19

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atggcatcag gaggagcttt ttgtcttatt gctaacgatg ggaaggccga caagattata 60

ttggcccaag acttgctgaa tagcaggatc tctaacatta aaaatgtgaa caaaagttat 120

gggaaacccg atcccgaacc cactttgagt caaatcgaag aaacacattt ggtgcatttt 180

aatgcgcatt ttaagcctta tgttccagta gggtttgaat acaataaagt acgcccgcat 240

acgggtaccc ccaccttggg aaacaagctt acctttggta ttccccagta cggagacttt 300

ttccatgata tggtgggcca tcatatattg ggtgcatgtc attcatcctg gcaggatgct 360

ccgattcagg gcacgtccca gatgggggcc catgggcagc ttcaaacgtt tcctcgcaac 420

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgaacaaaag ttatgggaaa cccgatcccg aa 32

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atctgggacg tgccctgaat cggagcatcc t 31

<210> 22

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgtatgcggg cgtactttat tgtattcaaa ctggaacata aggctt 46

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aagtacgccg tatgcgggcg tactttattg tattcaaa 38

<210> 24

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atgaagttta caaatttaac agctaaagag tttggtgcct ttacagatag catgccatac 60

agtcatttca cgcaaactgt tggccactat gagttaaagc ttgctgaagg ttatgaaaca 120

catttagtgg gaataaaaaa caataataac gaggtcattg cagcttgctt acttactgct 180

gtacctgtta tgaaagtgtt caagtatttt tattcaaatc gcggtccagt gatcgattat 240

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tggtgccttt acagatag 18

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggtcattgaa gctgcaatga cctcgt 26

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aagctgcaat gacctcgt 18

<210> 28

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atgtcagcaa agggctggaa tgcctcaaag ccctcagaga gaatcctcct gacattgagg 60

agattcaaga ggtcagcagc atcagatacc aaacctgcaa cccaggccaa gagaatggaa 120

ccacaggcat gcaggaagag gaggactctc agaatctcga tgaatcacac gagccaacaa 180

aaggatcaaa ctatgtcggc catgtactcc aaaataatcc gggatgtgga gaaagcaact 240

ctgcgcttgt ggaagcagag cagctcccta aagaggacat ccaaccagga cctggaatac 300

gatgttatca tgtttatgat cacagcggtg aagaggttaa gggaatcgaa gatgctgaca 360

gtctcgtggt acctgcaggc actgtcggta atcgaggatt cgagagcgga gaaggaagcc 420

ctgatgatag cactgaggat tctggcgaag attattccga aggaaatgct tcatctaact 480

ggggatattc tttcggcctt aaaccagaca gggcagctga tgtga 525

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ccggagagga ttctggcgtc cgg 23

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ggagaaggaa gccytgat 18

<210> 31

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aattctaata cgactcacta tagggagatt aaggccgaaa gaatatcc 48

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccagaggatt ctggcgaaga t 21

<210> 33

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gggcgaauug gguaccgggc ccccccucga 30

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 30

<210> 35

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tagggcgaat tgggtaccgg gccccccctc gaggtcgacg gtatcgataa gcttgatatc 60

gaattcctgc agcccggggg atccactagt tctagagcgg ccgccaccgc ggtggagctc 120

cagcttttgt tccctttagt gagggttaat ttcgagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 180

gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 240

aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 300

actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 360

cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 410

Claims

1.一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，其特征在于，寡核苷酸链探针的最小自由能结构是茎环结构，其序列自5’端至3’端依次为如下四区段：茎结构序列MB-J、环序列MB-H、茎结构互补序列MB-Jc、单链尾序列MB-P；一组荧光淬灭基团和荧光基团分别连接在MB-J的5’端和MB-Jc链中间碱基，两连接位置在茎环结构中相邻近；MB-H和MB-P与靶序列全部或部分互补，且MB-P的3’端与靶序列互补并能延伸聚合。

2.如权利要求1所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，其特征在于，MB-Jc的序列全部或部分与靶序列互补。

3.如权利要求1所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，其特征在于，参与聚合延伸的寡核苷酸链探针为RNA或DNA。

4.一种核酸扩增试剂盒，包括根据靶序列设计的引物，其特征在于，还包括至少一种链置换DNA聚合酶以及如权利要求1或2所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针。

5.如权利要求4所述的核酸扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的四条按环介导等温扩增方法设计的引物；这四条引物分别为F3、FIP、BIP、B3，靶序列上存在与FIP、BIP相关的F1c/B1序列，其中寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上F1c的3’端上游序列相同或与靶序列上B1的5’端下游的序列互补，或寡核苷酸链探针的序列来自靶序列以外来源。

6.如权利要求4所述的核酸扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少一条按滚环扩增方法设计的引物，寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上互补或相同。

7.如权利要求4所述的核酸扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少两条引物分别为F/R，寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上除F/R以外的其他序列互补或相同。

8.如权利要求7所述的核酸扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少两条按重组酶聚合酶扩增方法设计的引物分别为F/R，寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上除F/R以外的其他序列互补或相同。

9.如权利要求7所述的核酸扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少两条按解链酶依赖扩增方法设计的引物分别为F/R，寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上除F/R以外的其他序列互补或相同。

10.如权利要求4所述的核酸扩增试剂盒，其特征在于，还包括一种用于检测核酸含量的荧光染料，该荧光染料的探测波长与寡核苷酸链探针的荧光探测波长设置在不同通道。