BR112012018394B1

BR112012018394B1 - método para detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo e kit para detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo

Info

Publication number: BR112012018394B1
Application number: BR112012018394-0A
Authority: BR
Inventors: Jong Yoon Chun
Original assignee: Seegene, Inc
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2021-02-23
Also published as: CA2784344A1; AU2010336137B2; EP2516679B1; IL220478A0; EP2516679A1; AU2010336137A1; IL220478A; US20120264643A1; JP2013514803A; EP2516679A4; JP5822843B2; BR112012018394A2; RU2012129362A; KR20120107488A; RU2551321C2; BR112012018394B8; US9845492B2; CA2784344C; WO2011078441A1; CN102762744B

Abstract

"DETECÇÃO ALVO DE INICIADOR DE TSG". A presente invenção refere-se á detecção de uma sequência-alvo de ácido nucleico por tempo real usando um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG) tendo marcadores interativos duais. A presente invenção permite tanto a ampplificação alvo como amplificação de sinal pela introdução de marcadores interativos duais em um iniciador usado em reações de PCR, assegurando a detecção alvo em tempo real por reações de PCR sem o uso de oligonucleotídeos complicados. A presente invenção pode estar livre das matérias incômadas e falhas associadas a métodos convencionais de PCR em tempo real. A presente invenção permite detecção do alvo em tempo real bem sucedida usando somente um iniciador marcado. Igualmente, a presente invenção pode obter fortes sinais indicativos da presença das sequências alvo de ácidos nucleicos tanto em uma fase líquida como em fase sólida.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção relaciona à detecção de uma sequên cia-alvo de ácidos nucleicos usando um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG).

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[0002] Um processo alvo de amplificação de ácido nucleico está prevalentemente envolvido na maioria das tecnologias para detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos. A amplificação de ácidos nu- cleicos é um processo fundamental de uma ampla variedade de métodos na biologia molecular, tal que vários métodos de amplificação foram propostos. Por exemplo, MIller, H. I. et al. (WO 89/06700) amplificaram uma sequência de ácidos nucleicos baseada na hibridização de uma sequência de promotor/iniciador a um DNA alvo de fita simples ("ssDNA") seguido pela transcrição de muitas cópias de RNA da sequência. Outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos conhecidos incluem sistemas de amplificação baseados na transcrição (Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173 (1989); e Gingeras T.R. et al., WO 88/10315).

[0003] O processo mais predominante para amplificação de ácidos nucleicos conhecido como reação de polimerase em cadeia (a seguir referido como "PCR") é baseado em ciclos repetidos de desnaturação de DNA de fita dupla, seguido por anelamento de iniciador de oligonu- cleotídeo ao molde de DNA, e extensão de iniciador por uma DNA po- limerase (Mullis et al. Patentes U.S. Nos. 4.683.195, 4.683.202, e 4.800.159; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354).

[0004] As técnicas baseadas em PCR foram largamente usadas não somente para a amplificação de uma sequência de DNA alvo, mas também para aplicações científicas ou métodos nos campos da pesquisa biológica e médica, tais como PCR por transcriptase reversa (RT-PCR), PCR de exibição diferencial (DD-PCR), clonagem de genes conhecidos ou desconhecidos por PCR, amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE), PCR com iniciadores arbitrários (AP-PCR), PCR multiplex, tipagem de genoma de SNP, análise genômica baseada em PCR (McPherson e Moller, (2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlim Heidelberg, NY).

[0005] Ao mesmo tempo, os métodos para detecção dos ácidos nucleicos alvo baseados na amplificação de ácidos nucleicos proposta até agora são resumidos como se segue:

1. Método de Detecção Pós-PCR

[0006] O método pós-PCR que é tipicamente heterogêneo envolve a amplificação de ácidos nucleicos e a seguir, a detecção de produtos amplificados para análise da sequência-alvo de ácidos nucleicos. O método de detecção pós-PCR convencional requer que os produtos amplificados sejam separados com base em um diferencial de tamanho, que é comumente alcançado pelo uso de eletroforese em gel, ou pela imobilização do produto. Entretanto, o processo de separação causa problemas sérios tais que transferem a contaminação e o baixo rendimento.

2. Métodos de Detecção em Tempo real

[0007] Para superar problemas do método pós-PCR, foi sugerido um método de PCR em tempo real que detectasse produtos amplificados em tempo real e fosse livre de contaminantes, tornando possível analisar quantitativamente as sequências alvo de ácidos nucleicos.

2.1 Métodos baseados em iniciador marcado 2.1.1 Método de iniciador Sunrise

[0008] Este método usa iniciadores Sunrise que formam alças de grampo nas suas extremidades 5’ para juntar um par fluoróforo e inibidor de fluorescência, dessa forma, assegurando baixa fluorescência. Quando estes iniciadores foram incorporados em um produto de PCR, as caudas tornam-se fita dupla e o grampo é desemaranhado fazendo a fluorescência aumentar (Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 n. 12, e Pat. U.S. No. 6.117.635). Entretanto, o método de iniciador Sunrise é muito inconveniente em que os iniciadores são intricadamente projetados para conter uma sequência com-plementar a sequências alvo de ácidos nucleicos e uma sequência capaz de formar alças de grampo nas suas extremidades 5’. Além disso, a existência das alças de grampo em iniciadores deteriora sua eficiência de hibridização para sequências alvo.

2.1.2 Método de iniciador Scorpion

[0009] Este método usa iniciadores Scorpion contendo um sistema sinalizador integrado. O iniciador tem uma região molde de ligação e a cauda compreendendo um ligante e uma região alvo de ligação. A região alvo de ligação é hibridizada com uma sequência complementar em um produto de extensão do iniciador. Posteriormente, este evento alvo de hibridização específico é acoplado a um sistema sinalizador em que a hibridização leva a uma modificação detectável. O ligante no iniciador com cauda impede a cópia de cadeia mediada por polimerase da região de cauda do molde de iniciador (Whitcombe et al, 804-807, Nature Bio-technology v.17 AUGUST 1999 e Pat. U.S. No. 6.326.145). Como o método de iniciador Sunrise, este iniciador com cauda também tem uma dificuldade no desenho e síntese de iniciadores devido à incorporação de um ligante para gerar sinais dependentes do amplicon e uma região alvo de ligação hibridizável com um produto de extensão de iniciador em um iniciador. Além disso, a existência de alças de grampo em iniciadores reduz sua eficiência de hibridização a sequências alvo.

2.1.3 Método de iniciador único marcado (método de Lux)

[00010] O método de iniciador único marcado usa iniciadores com uma marcação de fluorescência única para detectar sequências alvo observando modificações nas características de fluorescência em iniciadores para hibridizar com sequências alvo (Pat. U.S. No. 7.537.886). É recomendável também para este método que os inicia-dores tenham uma estrutura grampo-alça para geração de sinal eficiente. Além disso, as características de fluorescência em iniciadores podem ser alteradas por vários fatores, tais como tipos de marcadores, sequências de iniciadores em torno do marcador de fluorescência, a posição do marcador de fluorescência em iniciadores e circundando outros componentes, tornando-o muito difícil de otimizar o desenho do iniciador.

2.1.4. Método Lion (usando atividade 3’ para 5’ de nuclease)

[00011] Este método usa um iniciador marcado deliberadamente incompatível em pelo menos um nucleotídeo na extremidade 3’ do iniciador. O iniciador marcado é incubado com uma amostra sob condições suficientes para permitir a hibridização e a amostra é posteriormente exposta à ácido nucleico polimerase que tem uma atividade 3’ para 5’ de revisão, por meio disso liberando o marcador ou parte do sistema de marcador (Pat. U.S. No. 6.248.526).

[00012] Entretanto, o iniciador incompatível deve ser intricadamente projetado para conter um nucleotídeo incompatível na sua extremidade 3’. Para piorar a situação, o iniciador incompatível provavelmente gerará sinais falsos-positivos pela atividade 3’ para 5’ de revisão mesmo quando a extremidade 3’ for incompatível para sequências não alvo.

2.2 Métodos baseados em sonda marcada 2.2.1 Método de farol molecular

[00013] Os faróis moleculares contêm corantes fluorescentes e inibidores, mas FRET (transferência de energia de ressonância de fluo- rescência) somente ocorre quando o corante inibidor de fluorescência é diretamente adjacente ao corante fluorescente. Os faróis moleculares são projetados para adotar uma estrutura de grampo enquanto liberados em solução, deixando ambos os corantes muito próximos. Quando um farol molecular hibridiza um alvo, os corantes fluorescentes e inibidores de fluorescência são separados. FRET não ocorre e o corante fluorescente emite luz sob irradiação (Indian J Med Res 124: 385-398 (2006) e Tyagi et al, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996).

[00014] Entretanto, há algumas desvantagens no método de farolmolecular.

[00015] Primeiramente, duas repetições inversas da estrutura de grampo devem ter contrapartes complementares no ácido nucleico alvo, que por sua vez requer a presença de repetições inversas no alvo também, uma condição que não é geralmente encontrada. Em segundo lugar, a Tm da porção de alça da estrutura de grampo com uma sequência complementar de ácidos nucleicos e a Tm da porção de tronco tem que ser cuidadosamente equilibrada com respeito à temperatura do ensaio para permitir desdobramento específico da sonda de grampo na presença do alvo sem desdobramento não específico. Por fim, este método exige iniciadores adicionais para amplificar as sequências alvo de ácidos nucleicos.

2.2.2 Métodos de sonda de hibridização

[00016] Este método usa quatro oligonucleotídeos: dois iniciadores e duas sondas. As sondas de hibridização têm um marcador único, uma com um fluoróforo doador e uma com um fluoróforo aceptor. A sequência das duas sondas é selecionada para que possam hibridizar as sequências alvo em um arranjo cabeça para cauda, deixando os corantes reboque muito próximos entre si, permitindo transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). O corante aceptor em uma das sondas transfere a energia, permitindo ao outro dissipar a fluorescência em um comprimento de onda diferente. A quantidade de fluorescência é diretamente proporcional à quantidade de DNA alvo gerado durante o processo de PCR (385-398, Indian J Med Res 124, artigo de revisão October 2006 e 303-308, e Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46).

[00017] Entretanto, este método não é adotável para multiplexar a detecção e requer iniciadores adicionais de amplificar as sequências alvo de ácidos nucleicos.

2.2.3 Método de sonda TaqMan (usando atividade nuclease 5’ para 3’)

[00018] As sondas de TaqMan são projetadas para hibridizar uma região interna de um produto de PCR. Durante a PCR, quando a poli- merase replica um molde no qual uma sonda de TaqMan está ligada, a atividade 5’ da exonuclease polimerase cliva a sonda. Isto separa os corantes fluorescentes e inibidores de fluorescência e FRET não ocorre mais (385-398, Indian J Med Res 124, artigo de revisão October 2006 e 303-308, Pat. U.S. No. 5.210.015).

[00019] Entretanto, este método é limitado no sentido que emprega três oligonucleotídeos (uma sonda de marcação dual e dois iniciadores). Isto seriamente complica o desenho e a síntese da sonda, e a otimização da condição de reação.

2.2.4. Método de sonda auto-inibidora de fluorescência (usando atividade nuclease 5’ para 3’)

[00020] O método de sonda de auto-inibidora de fluorescência usa sondas marcadas duais que tem uma sequência hibridizável com uma região interna de um produto de PCR (Pat. U.S. No. 5.723.591).

[00021] Provavelmente para o método TaqMan, o método de sonda de auto-inibidora de fluorescência tem que usar três oligonucleotídeos (uma sonda marcada dual e dois iniciadores) para o ensaio homogêneo, que o faz seriamente complicado para otimizar o desenho dasonda e condições de reação.

[00022] Como descrito acima, a maioria dos métodos de detecção alvo convencionais desenvolvidos até aqui têm falhas intrínsecas que são consideradas difíceis de superar.

[00023] Consequentemente, há uma necessidade sentida por muito tempo para uma nova abordagem para detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos de maneira mais técnica e mais eficiente em tempo e custos.

[00024] Ao longo deste pedido de patente, várias patentes e publicações são referidas, e citações são fornecidas em parênteses. A revelação destas patentes e publicações nas suas entidades é por meio deste incorporada por referências neste pedido de patente a fim de descrever mais totalmente esta invenção e o estado da técnica à qual esta invenção pertence.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00025] Os presentes inventores fizeram pesquisas intensivas para superar falhas associadas com tecnologias convencionais da detecção em tempo real das sequências alvo de ácidos nucleicos. Os presentes inventores inventaram novos iniciadores de TSG (geração de sinal alvo) capazes de gerar sinais dependendo de hibridização e extensão com as sequências alvo de ácidos nucleicos, e construíram por sua vez vários protocolos usando os iniciadores para a detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos. Como resultados, verificamos que os novos protocolos ou processos exibem um desempenho plausível na detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos, inter alia, detecção em tempo real, e produzem sinais indicativos da presença das sequências alvo de ácidos nucleicos tanto em uma fase líquida como em uma fase sólida de maneira muito mais forte e mais rápida.

[00026] Consequentemente, é um objeto desta invenção fornecer um método para detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos usando um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG).

[00027] É outro objeto desta invenção fornecer um método para detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos usando um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG) em uma reação de amplificação.

[00028] É objeto adicional desta invenção fornecer um kit para detectar uma sequência de ácido nucleico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos usando um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG).

[00029] Outros objetos e vantagens da presente invenção ficarão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir tomados em conjugação com as reivindicações e desenhos acrescentados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00030] Os princípios básicos da presente invenção são delineados nas FIG. 1 a 4.

[00031] A FIG. 1 mostra as etapas esquemáticas envolvidas em um ensaio para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos usando um iniciador de TSG. A FIG. 1A mostra o uso de um iniciador de TSG tendo uma estrutura convencional para a detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos. A FIG. 1B mostra o uso de um iniciador de TSG que tem uma estrutura oligonucleotídica de iniciação dual (DPO) para a especificidade de anelamento de iniciador na detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos.

[00032] A FIG. 2 mostra uma representação esquemática de uma amplificação por PCR em tempo real para a detecção de um ácido nu- cleico alvo em tempo real usando um iniciador de TSG desta invenção e um ácido nucleico polimerase dependente de molde que não tem atividade nuclease 5’ para 3’. A FIG. 2A mostra o uso de um iniciador de TSG tendo uma estrutura convencional de uma amplificação por PCR em tempo real. A FIG. 2B mostra o uso de um iniciador de TSG tendo uma estrutura oligonucleotídica de iniciação dual (DPO) para a especificidade de anelamento de iniciador em uma amplificação por PCR em tempo real.

[00033] A FIG. 3 mostra uma representação esquemática de uma amplificação por PCR em tempo real para a detecção de um ácido nu- cleico alvo em tempo real usando um iniciador de TSG desta invenção e um ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo uma atividade nuclease 5’ para 3’. A FIG. 3A mostra o uso de um iniciador de TSG tendo uma estrutura convencional de uma amplificação por PCR em tempo real. A FIG. 3B mostra o uso de um iniciador de TSG tendo uma estrutura oligonucleotídica de iniciação dual (DPO) para a especificidade de anelamento de iniciador em uma amplificação por PCR em tempo real.

[00034] A FIG. 4 mostra as etapas esquemáticas envolvidas em um ensaio para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos usando um iniciador de TSG imobilizado no substrato sólido. A FIG. 4A mostra o uso de um iniciador de TSG tendo uma estrutura convencional para a detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos. A FIG. 4B mostra o uso de um iniciador de TSG tendo uma estrutura oli- gonucleotídica de iniciação dual (DPO) para a especificidade de ane- lamento de iniciador na detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos.

[00035] A FIG. 5 mostra os resultados de detecção de S. pneumoniae somente por hibridização e extensão de iniciadores de TSG durante a reação de síntese de ácidos nucleicos usando uma DNA poli- merase dependente de molde que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’ sem repetição de desnaturação, hibridização e extensão de iniciador.

[00036] A FIG. 6 mostra os resultados de detecção de S. aureus somente por hibridização e extensão de iniciadores de TSG durante a reação de síntese de ácidos nucleicos usando uma DNA polimerase dependente de molde que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’ sem repetição de desnaturação, hibridização e extensão de iniciador.

[00037] A FIG. 7 mostra os resultados da amplificação por PCR em tempo real para a detecção de S. pneumoniae usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’.

[00038] A FIG. 8 mostra os resultados da amplificação por PCR em tempo real para a detecção de S. aureus usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’.

[00039] A FIG. 9 mostra os resultados da amplificação por PCR em tempo real para a detecção de N. gonorrhoeae usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’.

[00040] A FIG. 10 mostra os resultados da amplificação por PCR em tempo real para a detecção de N. meningitidis usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’.

[00041] A FIG. 11 mostra os resultados da sensibilidade PCR em tempo real para a detecção de S. aureus usando um iniciador de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’.

[00042] A FIG. 12 mostra os resultados da geração de sinal e acúmulo de iniciadores de TSG dependendo de um ácido nucleico polime- rase dependente de molde tendo uma atividade nuclease 5’ para 3’ ou que não tem atividade nuclease 5’ para 3’ durante a reação de síntese de ácidos nucleicos com repetição de desnaturação, hibridização e extensão de iniciador.

[00043] A FIG. 13 mostra os resultados da amplificação por PCR em tempo real para a detecção de S. pneumoniae usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde tendo atividade exonuclease 5’ para 3’.

[00044] A FIG. 14 mostra os resultados da amplificação por PCR em tempo real para a detecção de S. aureus usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde tendo atividade exonuclease 5’ para 3’.

[00045] A FIG. 15 mostra os resultados da amplificação por PCR em tempo real para a detecção de N. gonorrhoeae usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde tendo atividade exonuclease 5’ para 3’.

[00046] A FIG. 16 mostra os resultados da amplificação por PCR em tempo real para a detecção de N. meningitidis usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde tendo atividade exonuclease 5’ para 3’.

[00047] A FIG. 17 mostra os resultados da sensibilidade PCR em tempo real para a detecção de S. aureus utilização de um iniciador de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde tendo atividade exonuclease 5’ para 3’.

DESCRIÇÃO DETALHADA DESTA INVENÇÃO

[00048] A presente invenção é dirigida a um novo método para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos em tempo real usando um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG) com um sistema de marcador dual e um ácido nucleico polimerase dependente de molde.

[00049] Conforme a presente invenção, o iniciador marcado dual chamado de um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG) com sinais inibidores é hibridizado com uma sequência-alvo de ácidos nucleicos para induzir a não inibição de sinal e estendida para sinteti- zar uma sequência complementar da sequência-alvo de ácidos nuclei- cos, finalmente detectando o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos. Em outras palavras, o iniciador de TSG sofre tanto modificação conformacional da não inibição de sinal como a reação de extensão 3’.

[00050] Os presentes inventores encontraram primeiro que como um iniciador sem qualquer estrutura modificada, tal como uma estrutura grampo-alça, o iniciador de TSG pode gerar sinais alvo pela conversão de um estado de inibição a um estado de não inibição dependendo da extensão e hibridização do iniciador. Os iniciadores de TSG e os processos em tempo real usando-os foram primeiro propostos pelos presentes inventores.

[00051] Uma das vantagens-chave do iniciador de TSG é que a extensão na extremidade 3’ do iniciador de TSG assegura muito menos variação na intensidade de sinal na modificação de condições de reação (por exemplo, temperaturas de reação), levando-nos a raciocinar que resultados de sinal mais confiáveis e estáveis podem ser obtidos pela extensão na extremidade 3’ do iniciador de TSG com muito pouco ou nada de influência de sinal na modificação de condição de reação. Especialmente, a extensão na extremidade 3’ do iniciador de TSG permite ao iniciador de TSG amplificar a sequência-alvo de ácidos nu- cleicos.

[00052] O iniciador de TSG da presente invenção em reações de amplificação, inter alia, em métodos de detecção em tempo real baseados em PCR, está envolvido em amplificação alvo bem como geração de sinal, permitindo um ensaio homogêneo bem sucedido para sequências alvo.

[00053] De maneira interessante, o novo método de detecção por PCR em tempo real da presente invenção usando os iniciadores de TSG trabalha de uma maneira distintamente diferente de abordagens convencionais de PCR em tempo real, resultando em superação das desvantagens das tecnologias convencionais e elevação de eficiência de detecção em tempo real.

[00054] A diferença mais notável do método baseado no iniciador de TSG dos métodos baseados na sonda convencionais, tais como métodos de Farol molecular e de sonda TaqMan é que as sondas marcadas são capazes somente de gerar sinais alvo não para amplificar sequências alvo, mas os iniciadores de TSG são capazes de amplificar sequências alvo bem como gerar sinais alvo. Os métodos baseados em sonda são compelidos para uso de iniciadores adicionais para a amplificação alvo, que claramente se diferenciam da presente invenção. Seria reconhecido por um versado na técnica que métodos convencionais usando sondas marcadas passam pelo desenho de sonda e iniciador, seleção de sequência e otimização de reação porque iniciadores adicionais para amplificação são requeridos. Ao contrário, uma vez que o método de iniciador de TSG não requer sondas adicionais, tais problemas podem ser minimizados.

[00055] Além disso, uma vez que os iniciadores de TSG são incorporados em produtos expandidos ou amplificados, mas as sondas marcadas não são incorporadas em nenhum produto, o método de iniciador de TSG diretamente mede os produtos amplificados, mas não pode ser considerado que os sinais do método de sonda marcada reflitam diretamente os produtos amplificados.

[00056] Além disso, a hibridização de sondas marcadas com sequências alvo é dependente de concentrações de sondas marcadas e produtos amplificados, que a torna difícil para realizar análise quantitativa. Embora as sondas marcadas em excesso possam ser usadas para melhorar a exatidão da análise quantitativa, com muita probabilidade produzirão grandes problemas de fundo. Ao contrário, o método de iniciador de TSG pode medir diretamente a amplificação alvo usando iniciadores marcados, permitindo a análise quantitativa de sequências alvo com exatidão muito mais alta.

[00057] Ao mesmo tempo, vários métodos de detecção em tempo real baseados em iniciadores convencionais, tais como o método Sunrise e método Scorpion têm que formar uma estrutura de grampo para inibir a fluorescência deles antes da hibridização com sequências alvo.

[00058] Entretanto, a utilização da estrutura de grampo nos métodos baseados em iniciadores marcados reduz a eficiência de amplificação bem como a eficiência de hibridização. Além disso, a estrutura de grampo configurada para os iniciadores marcados requer uma sequência adicional; por isso, os iniciadores têm que ser projetados e preparados considerando tanto uma sequência-alvo complementar como uma sequência que forma o grampo. Nestes contextos, seria difícil projetar os iniciadores marcados com a estrutura de grampo. Ao contrário, o iniciador de TSG gera sinais alvo sem a ajuda de estrutu-ras de grampo, e permite superar falhas associadas com estruturas de grampo.

[00059] O método Lux usando um marcador único em iniciadores é diferente da presente invenção usando um sistema de marcador interativo dual em iniciadores em vista de um mecanismo principal que é a base da geração de sinal. O sinal da molécula de marcador único em iniciadores pode ser afetado por vários fatores, tais como tipos de marcadores, sequências de iniciadores em torno do marcador, as posições do marcador em iniciadores e circundando outros componentes, que são considerados como desvantagens do método Lux.

[00060] Como descrito acima, o método de detecção em tempo real baseado no iniciador de TSG da presente invenção tem alguns atributos técnicos (particularmente, princípio de geração de sinal, estrutura de oligonucleotídeos e função de oligonucleotídeos) diferenciando-se de métodos baseados em iniciador convencional e em sonda. Os atri- butos técnicos desta invenção permitem à superação das limitações dos métodos convencionais em tempo real e detecção de sequências alvo de ácidos nucleicos de maneira muito mais eficaz.

[00061] Surpreendentemente, os presentes inventores encontraram que os iniciadores hibridizados com as sequências alvo de ácidos nu- cleicos sofrem uma reação de clivagem 5’ na sua porção de extremidade 5’ por um ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo uma atividade nuclease 5’ para 3’ e a reação de clivagem 5’ adota para detecção de sequências alvo por geração de sinais de sequências alvo (ver PCT/KR2009/007064).

[00062] Onde o iniciador de TSG tendo uma molécula repórter ou inibidora de fluorescência na sua porção de extremidade 5’ é hibridiza- do com uma sequência-alvo (isto é, molde), sofre reação de clivagem 5’ na sua porção de extremidade 5’ por um ácido nucleico polimerase dependente de molde que tem uma atividade nuclease 5’ para 3’ e as moléculas repórter e inibidoras de fluorescência então são separadas entre si, contribuindo para transmitir a não inibição no iniciador de TSG.

[00063] Acredita-se que a proporção dos iniciadores de TSG para sofrer a reação de clivagem 5’ é variada dependendo de uma atividade nuclease 5’ para 3’ de um ácido nucleico polimerase dependente de molde, condições de reação e distância entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência.

[00064] Considerando que a reação de clivagem 5’ ocorre na presente invenção quando o ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo atividade nuclease 5’ para 3’ e os iniciadores de TSG tendo uma molécula repórter ou inibidora de fluorescência na sua porção de extremidade 5’ é usada, a presente invenção pode dar o sinal indicativo da presença das sequências alvo de ácidos nucleicos de duas outras maneiras: (i) transmissão da geração pelo sinal de não inibição do sistema de marcador interativo no iniciador de TSG causado pela modificação de conformação na hibridização com a sequência-alvo de ácidos nucleicos; e (ii) geração de sinal por reação de clivagem 5’ na sua porção de extremidade 5’ do iniciador de TSG pelo ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo atividade nuclease 5’ para 3’.

[00065] Na presente invenção, usando o ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo atividade nuclease 5’ para 3’, é preferencial que a reação de clivagem 5’ ocorra somente quando a porção de extremidade 5’ (mais preferencialmente, a extremidade 5’) do iniciador de TSG for complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos.

[00066] Conforme a presente invenção, as sequências alvo de ácidos nucleicos podem ser detectadas em tempo real com eficiência e confiança dramaticamente aumentadas. Para nosso melhor conhecimento, estes achados científicos e estratégias tecnológicas são primeiro propostos pelos presentes inventores.

[00067] Em um aspecto da presente invenção, é fornecido um método para detectar uma sequência de ácido nucleico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos usando um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG), que compreende as etapas de:

[00068] (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com o iniciador de TSG; em que o iniciador de TSG compreende (i) uma sequência nucleotídica hibridizante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência; em que quando o iniciador de TSG não é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente adjacentes entre si para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter; em que quando o iniciador de TSG é hibri- dizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula repórter, pelo qual o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos é gerado e obtido;

[00069] (b) contato do resultante da etapa (a) com um ácido nuclei- co polimerase dependente de molde sob condições de extensão de iniciador tal que a reação de extensão 3’ seja induzida na extremidade 3’ do iniciador de TSG; e

[00070] (c) detecção do sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos, pelo qual o sinal indica a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos em DNA ou mistura de ácidos nuclei- cos.

[00071] Os presentes inventores fizeram pesquisas intensivas para superar as falhas associadas a tecnologias convencionais para detecção em tempo real das sequências alvo de ácidos nucleicos. Os presentes inventores inventaram novos iniciadores de TSG (geração de sinal alvo) capazes de gerar sinais dependendo de hibridização e extensão com as sequências alvo de ácidos nucleicos, e construíram por sua vez vários protocolos usando os iniciadores para a detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos. Como resultado, verificamos que os novos protocolos ou processos exibem um desempenho plausível na detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos, inter alia, detecção em tempo real, e produzem sinais indicativos da presença das sequências alvo de ácidos nucleicos tanto em uma fase líquida como em uma fase sólida de maneira muito mais forte e mais rápida.

[00072] Conforme a presente invenção, o iniciador de TSG a ser hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos tem um sistema de marcador interativo contendo uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência. Onde o iniciador de TSG não é hibridiza- do com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência no iniciador de TSG são tridimensionalmente adjacentes entre si para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter; no contrário, quando o iniciador de TSG é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nu- cleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência no iniciador de TSG são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula re-pórter, pelo qual o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos é gerado e obtido. Como tal, o iniciador de TSG tem uma função distinta dual: (i) geração de sinal para a sequência-alvo de ácidos nucleicos; e (ii) síntese de uma sequência complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos.

[00073] Por isso, o iniciador usado na presente invenção é chama do de um "Iniciador de geração de sinal alvo" (iniciador de TSG) e o presente método chamado "Ensaio de Detecção Alvo com Iniciador de TSG".

[00074] De acordo com a presente invenção, uma sequência-alvo de ácidos nucleicos é primeiro hibridizada com o iniciador de TSG.

[00075] O termo usado neste pedido "ácido nucleico alvo", "se quência-alvo de ácidos nucleicos" ou "sequência-alvo" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos de interesse para detecção, que é anelada ou hibridizada com um iniciador sob condições de hibridização, anelamento ou amplificação.

[00076] O termo "iniciador", como usado neste pedido, refere-se a um oligonucleotídeo, que é capaz de atuação como um ponto de início da síntese quando colocado sob condições em que a síntese do produto de extensão de iniciador que é complementar a uma fita de ácidos nucleicos (molde) é induzida, isto é, na presença de nucleotídeos e um agente para polimerização, tal como DNA polimerase, e em uma temperatura adequada e pH. O iniciador é preferencialmente de fita única para eficiência máxima na amplificação. Preferencialmente, o iniciador é um oligodesoxirribonucleotídeo. O iniciador desta invenção pode ser compreendido de dNMP de ocorrência natural (isto é, dAMP, dGM, dCMP e dTMP), nucleotídeo modificado ou nucleotídeo não natural. O iniciador também pode incluir ribonucleotídeos.

[00077] O iniciador deve ser suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos de extensão na presença do agente de polimeri- zação. O comprimento exato dos iniciadores dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, aplicação, e fonte de iniciador. O termo "anelamento" ou "iniciação" como usado neste pedido refere à justaposição de um oligodesoxinucleotídeo ou ácido nucleico a um ácido nucleico molde, pelo qual a justaposição permite a polimerase polime- rizar nucleotídeos em uma molécula de ácidos nucleicos que é complementar ao ácido nucleico molde ou uma porção do mesmo.

[00078] O termo usado "hibridização" usado neste pedido refere-se à formação de ácido nucleico de fita dupla a partir de ácidos nucleicos de fita única complementares. A hibridização pode ocorrer entre duas fitas de ácidos nucleicos perfeitamente combinadas ou substancialmente combinadas com algumas incompatibilidades. A complementaridade da hibridização pode depender de condições de hibridização, particularmente temperatura.

[00079] Não há distinção desejada entre os termos "anelamento" e "hibridização", e estes termos serão usados intercambiavelmente.

[00080] O termo "iniciador de TSG" usado neste pedido significa um iniciador tendo as capacidades de auto-inibição e não auto-inibição e extensão. Especialmente, o iniciador de TSG usado na presente invenção significa um iniciador marcado dual capaz tanto de sintetizar uma sequência complementar a uma sequência-alvo como de gerar sinais indicativos da presença das sequências alvo de ácidos nuclei- cos de tal maneira que onde não hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, induz a inibição do sistema de marcador interativo; onde hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, induz a não inibição do sistema de marcador interativo, gerando o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.

[00081] O termo usado neste pedido "iniciador de sentido direto" significa um iniciador (direção 5’ para 3’ ) complementar a uma fita de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos alinhada em uma direção 3’ para 5’. O iniciador de sentido reverso tem uma sequência complementar à outra fita da sequência de ácidos nucleicos.

[00082] O termo usado neste pedido "tridimensionalmente adjacente" em conjunto com a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência no iniciador de TSG significa que a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência estão conformacionalmente próximas sem a ajuda de qualquer estrutura intramolecular de iniciadores, tais como um grampo-alça.

[00083] O iniciador de TSG compreende (i) uma sequência nucleo- tídica hibridizante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) um sistema de marcador interativo dual. O termo "complementar" é usado neste pedido para significar que os iniciadores são suficientemente complementares para hibridizar seletivamente uma sequência- alvo de ácidos nucleicos sob condições de anelamento designadas ou condições estringentes, englobando os termos "substancialmente complementar" e "perfeitamente complementar", preferencialmente perfeitamente complementar.

[00084] Alternativamente, o iniciador de TSG pode compreender ainda na sua extremidade 5’ uma sequência nucleotídica não hibridi- zante não complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos. Preferencialmente, uma da molécula repórter e da molécula inibidora de fluorescência no iniciador de TSG está localizada na sequência nucleotí- dica não hibridizante e a outra está localizada na sequência nucleotídi- ca hibridizante. A sequência nucleotídica não hibridizante do iniciador de TSG preferencialmente não forma a estrutura grampo-alça e não se envolve na formação de uma estrutura intramolecular, tal como um grampo-alça. A sequência nucleotídica não hibridizante do iniciador de TSG preferencialmente não carrega nenhum sítio de restrição.

[00085] Preferencialmente, o iniciador de TSG não forma a estrutura grampo-alça.

[00086] De acordo com uma modalidade preferencial, o sistema de marcador dual é posicionado na sequência complementar alvo do iniciador de TSG.

[00087] De acordo com uma modalidade preferencial, a extremidade 5’ ou uma porção de extremidade 5’ do iniciador de TSG tem uma sequência perfeitamente complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos.

[00088] O iniciador de TSG tem o sistema de marcador interativo contendo a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência.

[00089] O sistema de marcador interativo é um sistema de geração de sinal no qual a energia é passada não radioativamente entre uma molécula doadora e uma molécula aceptora. Como um representante do sistema de marcador interativo, o sistema de marcador FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência) inclui uma molécula repórter fluorescente (molécula doadora) e uma molécula inibidora de fluorescência (molécula aceptora). Na FRET, o doador de energia é fluorescente, mas o aceptor de energia pode ser fluorescente ou não fluorescente.

[00090] Em outra forma de sistemas de marcador interativo, o doador de energia é não fluorescente, por exemplo, um cromóforo, e o aceptor de energia é fluorescente. Ainda em outra forma de sistemas de marcador interativo, o doador de energia é luminescente, por exemplo, bioluminescente, quimioluminescente, eletroquimiolumines-cente, e o aceptor é fluorescente.

[00091] Preferencialmente, o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos é gerado por sistemas de marcador interativo duais, ainda mais preferencialmente o sistema de marcador de FRET.

[00092] Onde o marcador de FRET é usado no iniciador de TSG, os dois marcadores (a molécula repórter fluorescente e a molécula inibi- dora de fluorescência) são separados entre si para induzir a não inibição de sinal quando o iniciador de TSG hibridizado com a sequência- alvo de ácidos nucleicos está em uma conformação estirada. Quando o iniciador de TSG não hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos está em uma conformação torcida, os dois marcadores são adjacentes entre si para induzir a inibição de sinal.

[00093] Os termos usados neste pedido "inibição" e "não inibição" têm que ser interpretados de uma maneira relativa. Por exemplo, o termo "não inibição" pode ser considerado reduzir a eficiência ou nível de inibição do que o termo "inibição". Em outras palavras, a inibição do sinal da molécula repórter engloba a inibição do sinal bem como redução em níveis de sinal em comparação com nenhuma ocorrência da inibição. Além disso, a não inibição do sinal da molécula repórter en-globa a recuperação completa do sinal bem como aumento em níveis de sinal em comparação com a ocorrência da inibição.

[00094] O sinal que indica a sequência-alvo de ácidos nucleicos pode ser obtido pelas diferenças em níveis de inibição de sinal como descrito acima. Por exemplo, onde as intensidades de fluorescência relativa da molécula repórter fluorescente são medidas para detectar o ácido nucleico alvo, o iniciador de TSG não hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos mostra uma intensidade de fluorescência baixa relativa (um estado de inibição) porque a molécula repórter fluorescente e a molécula inibidora de fluorescência são, conforme o es- paço (ou tridimensionalmente), adjacentes entre si. Onde o iniciador de TSG é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a intensidade de fluorescência relativamente alta é detectada (um estado de não inibição) porque a molécula repórter fluorescente e a molécula ini- bidora de fluorescência são, conforme o espaço, separadas entre si.

[00095] A molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência podem ser posicionadas em qualquer sítio do iniciador de TSG contanto que a troca inibição-não inibição ocorra.

[00096] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são posicionadas de 4 a 50 nucleotídeos afastadas entre si.

[00097] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são posicionadas em não mais do que 50 nucleotídeos, mais preferencialmente não mais do que 40 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente não mais do que 30 nucleotídeos, ainda muito mais preferencialmente não mais do que 25 nucleotídeos afastadas entre si.

[00098] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são separadas por pelo menos 4 nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 6 nu- cleotídeos, ainda mais preferencialmente pelo menos 10 nucleotídeos, ainda muito mais preferencialmente pelo menos 15 nucleotídeos.

[00099] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter ou a molécula inibidora de fluorescência no iniciador de TSG está localizada na sua extremidade 5’ ou 1 a 5 nucleotídeos afastada da sua extremidade 5’. Por exemplo, a molécula repórter no iniciador de TSG está localizada na sua extremidade 5’ ou 1 a 5 nucleotídeos afastada da sua extremidade 5’ e a molécula inibidora está localizada 4 a 50 nucleotídeos afastada da molécula repórter.

[000100] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter no iniciador de TSG está localizada na sua extremidade 5’ ou 1 a 10 nucleotídeos afastada da sua extremidade 5’, mais preferencialmente na sua extremidade 5’.

[000101] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula inibidora de fluorescência no iniciador de TSG está localizada na sua extremidade 5’ ou 1 a 10 nucleotídeos afastada da sua extremidade 5’, mais preferencialmente na sua extremidade 5’.

[000102] A molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência útil na presente invenção podem incluir qualquer molécula conhecida na técnica. Exemplos daquelas são: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calceína (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BO- DIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 5464 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Ficoeritrina R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-Ficocianina (642), C-Ficocianina (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Tiadicarbocianina (671) e Cy5.5 (694). O numérico nos parênteses é um comprimento de onda de emissão máximo em nanômetros.

[000103] Os pares adequados de repórter/inibidor são descritos em uma variedade de publicações como se segue: Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; Patentes U.S. Nos. 3.996.345 e 4.351.760.

[000104] É notável que uma molécula inibidora preta não fluorescente capaz de inibir uma fluorescência de uma ampla faixa de comprimentos de onda ou um comprimento de onda específico possa ser usada na presente invenção.

[000105] No marcador de FRET adotado para o iniciador de TSG, o repórter engloba um doador de FRET e o inibidor engloba o outro parceiro (aceptor) de FRET. Por exemplo, um corante fluoresceína é usado como repórter e um corante rodamina, como inibidor.

[000106] Após hibridização com a sequência-alvo de ácidos nuclei- cos, o resultante da etapa (a) é contatado à ácido nucleico polimerase dependente de molde sob condições de extensão de iniciador para estender o iniciador de TSG hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos.

[000107] A frase "sob condições de extensão de iniciador" significa condições suficientes para induzir a reação de extensão na extremidade 3’ do iniciador de TSG por um ácido nucleico polimerase dependente de molde. Tais condições podem ser condições da extensão de iniciador por ácido nucleico polimerases convencionais. Por exemplo, as condições serão encontradas em Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001). Como exemplo ilustrativo, as condições incluem incubação de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos, o iniciador de TSG, uma DNA polimerase termoestável (por exemplo, Taq DNA polimerase), dNTPs e MgCl2 em temperatura relativamente alta (por exemplo, 50 a 75oC) por um período de tempo adequado.

[000108] A extensão do iniciador de TSG é uma etapa crucial da presente invenção. Onde o produto expandido é produzido pela reação de extensão do iniciador de TSG, leva à hibridização mais estável da sequência de iniciador de TSG incorporada no produto expandido com a sequência-alvo de ácidos nucleicos. Além disso, a reação de extensão do iniciador de TSG permite incorporar marcadores no iniciador de TSG no produto expandido, por meio disso aumentando a intensidade de sinal em paralelo com a quantidade do produto amplificado. Tal fenômeno de acoplamento induzido na presente invenção assegura análise quantitativa mais exata da sequência-alvo de ácidos nucleicos. Conforme a presente invenção, as sondas improvavelmente marcadas, onde o iniciador de TSG per si, são não especificamente hibridi- zadas com sequências não alvo, qualquer sinal falso-positivo não pode ser gerado pela realização de detecção de sinal sob condições altas estringentes, tais como altas temperaturas (por exemplo, 50 a 85oC). Também, a extensão do iniciador de TSG resulta na amplificação da sequência-alvo de ácidos nucleicos, permitindo amplificação de sinal simultaneamente com amplificação alvo.

[000109] De acordo com a presente invenção, um ácido nucleico po- limerase dependente de molde inclui qualquer ácido nucleico polime- rase conhecida na técnica.

[000110] Uma das vantagens proeminentes da presente invenção é gerar sinais alvo até usando um ácido nucleico polimerase dependente de molde sem atividades de nuclease.

[000111] De acordo com uma modalidade preferencial, o ácido nu- cleico polimerase dependente de molde usada na presente invenção não tem nenhuma atividade de nuclease.

[000112] De acordo com uma modalidade preferencial, o ácido nu- cleico polimerase dependente de molde usada na presente invenção não tem atividade nuclease 5’ para 3’

[000113] O ácido nucleico polimerase dependente de molde capaz de ser usada na presente invenção pode incluir qualquer ácido nuclei- co polimerase, por exemplo, o fragmento de Klenow de DNA polimera- se I de E. coli, uma DNA polimerase termoestável e DNA polimerase de bacteriófago T7. Preferencialmente, a polimerase é uma DNA poli- merase termoestável que pode ser obtida de uma variedade de espécies bacterianas.

[000114] De acordo com uma modalidade preferencial, onde o ácido nucleico polimerase dependente de molde usada na presente invenção tem uma atividade nuclease 5’ para 3’, o iniciador de TSG é estendido na sua extremidade 3’ pela atividade de polimerase do ácido nu- cleico polimerase dependente de molde e clivado na sua extremidade 5’ pela atividade nuclease 5’ para 3’ do ácido nucleico polimerase dependente de molde, para que a molécula repórter ou a molécula inibi- dora de fluorescência sejam liberadas para gerar o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.

[000115] Preferencialmente, o ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo atividade nuclease 5’ para 3’ é uma DNA polimerase termoestável que pode ser obtida de uma variedade de espécies bac- terianas, incluindo Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lac- teus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus espécies Z05 e Thermus es-pécies sps 17. Ainda mais preferencialmente, o ácido nucleico polime- rase dependente de molde tendo atividade nuclease 5’ para 3’ é Taq DNA polimerase.

[000116] De maneira interessante, os presentes inventores encontraram que o iniciador de TSG hibridizado com as sequências alvo de ácidos nucleicos é estendido na sua extremidade 3’ e também clivado na sua porção de extremidade 5’ (por exemplo, extremidade 5’) somente pelo contato das ácido nucleico polimerases dependentes de molde tendo atividade nuclease 5’ para 3’. A reação de clivagem na porção de extremidade 5’ do iniciador de TSG é também responsável pela geração de sinal na presente invenção.

[000117] Em resumo, onde a presente invenção é realizada para envolver a reação de clivagem 5’ do iniciador de TSG, a presente invenção pode dar o sinal indicativo da presença das sequências alvo de ácidos nucleicos de duas outras maneiras: (i) geração de sinal pela não inibição de sinal do sistema de marcador interativo no iniciador de TSG causado pela modificação de conformação na hibridização com a sequência-alvo de ácidos nucleicos; e (ii) geração de sinal por reação de clivagem 5’ na sua porção de extremidade 5’ do iniciador de TSG pelo ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo atividade nuclease 5’ para 3’.

[000118] De acordo com uma modalidade preferencial, o iniciador de TSG compreende uma sequência compatível à sequência-alvo de ácidos nucleicos na sua extremidade 5’ ou na sua porção de extremidade 5’.

[000119] O termo usado neste pedido "porção de extremidade 5’" em conjunto com o iniciador de TSG refere-se a uma porção ou região compreendendo qualquer sequência longa consecutiva da extremidade 5’ do iniciador de TSG. Preferencialmente, a porção de extremidade 5’ do iniciador de TSG tem a extremidade 5’ e uma sequência compreendendo 1 a 10 nucleotídeos (mais preferencialmente 1 a 7 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 1 a 5 nucleotídeos, ainda muito mais pre-ferencialmente 1 a 3 nucleotídeos) afastada da extremidade 5’.

[000120] Alternativamente, o ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo uma atividade exonuclease 3’ para 5’ pode ser usada na presente invenção.

[000121] De acordo com uma modalidade preferencial, onde o ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo atividade exonuclease 3’ para 5’ é usada, o iniciador de TSG compreende pelo menos uma sequência nucleotídica incompatível na sua porção de extremidade 3’ ou extremidade 3’.

[000122] De acordo com uma modalidade preferencial, onde o iniciador de TSG compreende pelo menos uma sequência nucleotídica incompatível na sua porção de extremidade 3’ ou extremidade 3’, a sequência nucleotídica incompatível não tem nenhum marcador.

[000123] O número dos nucleotídeos incompatíveis pode ser 1 a 5, preferencialmente 1 a 4, mais preferencialmente 1 a 3, ainda mais pre-ferencialmente 1 a 2 e ainda mais preferencialmente 1. Onde os iniciadores carregam pelo menos 2 nucleotídeos incompatíveis, os nucleotí- deos incompatíveis podem ser localizados continuamente ou intermitentemente.

[000124] De acordo com uma modalidade preferencial, onde o ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo atividade exonuclease 3’ para 5’ é usada, o iniciador de TSG tem pelo menos um nu- cleotídeo incompatível tendo uma estrutura resistente à atividade 3’ para 5’ de nuclease de ácido nucleico polimerases dependentes de molde na sua porção de extremidade 3’.

[000125] De acordo com uma modalidade preferencial, onde o ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo atividade exonuclease 3’ para 5’ é usada, o iniciador TGS compreende na sua extremidade 3’ um nucleotídeo de determinante da combinação única tendo uma estrutura resistente à atividade 3’ para 5’ de nuclease de ácidonucleico polimerases dependentes de molde.

[000126] O nucleotídeo determinante compatível único na extremidade 3’ do iniciador de TSG forma um par de bases somente quando é hibridizado com um nucleotídeo compatível presente na fita oposta. Entretanto, o nucleotídeo determinante compatível único do iniciador de TSG não pode formar o par de bases quando um nucleotídeo presente na fita oposta não é complementar ao nucleotídeo determinante compatível único.

[000127] Na presente invenção, porque o nucleotídeo determinante compatível único na extremidade 3’ do iniciador de TSG contém uma estrutura resistente à atividade 3’ para 5’ de nuclease, uma reação de clivagem não é induzida mesmo quando a extremidade 3’ do iniciador de TSG não é pareada por base, por meio disso não induzindo nenhuma reação de extensão.

[000128] A extensão do iniciador de TSG dá origem à hibridização estável mais alta com sequências alvo comparadas sem iniciador de TSG expandido. Por isso, com o ajuste de temperaturas, a presença do produto expandido (isto é, sequência-alvo) pode ser detectada por análise de modificações em sinais.

[000129] Preferencialmente, a presente invenção é usada para a detecção de variações de nucleotídeo. Mais preferencialmente, a variação de nucleotídeo detectada nesta invenção é uma substituição de bases, ainda mais preferencialmente, SNP (polimorfismo de nucleotí- deo único) e mutação pontual.

[000130] De acordo com uma modalidade preferencial, as variações de nucleotídeo podem ser posicionadas em frente do nucleotídeo determinante compatível único na extremidade 3’ do iniciador de TSG.

[000131] O esqueleto resistente à atividade 3’ para 5’ de nuclease inclui qualquer uma das conhecidas por um versado na técnica. Por exemplo, inclui várias ligações fosforotioato, ligações fosfonato, liga- ções fosforoamidato e modificações 2’-carboidratos. De acordo com uma modalidade mais preferencial, os nucleotídeos tendo uma estrutura resistente à nuclease 3’ para 5’ incluem ligação fosforotioato, ligação alquilfosfotriéster, ligação arilfosfotriéster, ligação alquilfosfonato, ligação arilfosfonato, ligação hidrogeno-fosfonato, ligação alquilfosforoa- midato, ligação arilfosforoamidato, ligação fosforosselenato, modificação 2’-O-aminopropila, modificação 2’-O-alquila, modificação 2’-O-alila, modificação 2’-O-butila, modificação oligodesoxinucleotídeo α-anomérico e 1-(4’-tio-β-D-ribofuranosila).

[000132] De acordo com uma modalidade preferencial, o ácido nu- cleico polimerase dependente de molde com atividade exonuclease 3’ para 5’ é uma DNA polimerase termoestável que pode ser obtida de uma variedade de espécies bacterianas, incluindo Thermococcus lito- ralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Pyrococcus furiosus (Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus e Aquifex aeolieus. Ainda mais preferencialmente, o ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo atividade 3’ para 5’ de nuclease é a DNA polimerase Pfu.

[000133] De acordo com uma modalidade preferencial, a presente invenção compreende ainda a repetição das etapas (a) - (b) ou (a) - (c) com desnaturação entre ciclos de repetição pelo menos duas vezes para amplificar o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos. O número de repetição de ciclos não é particularmente limitado, tipicamente pelo menos dois, preferencialmente pelo menos cinco, mais preferencialmente pelo menos dez. A desnaturação deve fornecer dúplexes de fita dupla formados na etapa (a) em ácidos nucleicos de fita única. Os métodos da desnaturação incluem, mas não limitados a, aquecimento, álcali, formamida, ureia e tratamento com glicoxal, métodos enzimáticos (por exemplo, ação de helicase) e proteínas de ligação. Por exemplo, a desnaturação pode ser alcançada pelo aquecimento na temperatura variando de 80°C a 105°C. Métodos gerais para realizar este tratamento são fornecidos por Joseph Sambro- ok, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).

[000134] Finalmente, o sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos é detectado. A detecção de sinal pode ser realizada para cada ciclo de repetição (isto é, maneira em tempo real), no fim da repetição (isto é, maneira de ponto da extremidade) ou em cada um dos intervalos de tempo predeterminados durante a repetição. Preferencialmente, a detecção de sinal pode ser realizada para cada ciclo de repetição para melhorar a exatidão da detecção.

[000135] O sinal pode ser detectado ou medido por métodos convencionais de cada marcador. Por exemplo, o sinal de fluorescência pode ser detectado ou medido por métodos convencionais, por exemplo, fluorômetros.

[000136] As vantagens da presente invenção ficam evidentes na etapa de detecção de sinal. Onde a detecção de sinal é realizada sob condições altas estringentes, tais como altas temperaturas (por exemplo, 50-85oC), sinais falsos-positivos devido à hibridização do iniciador de TSG com sequências não alvo de ácidos nucleicos podem ser completamente eliminados.

[000137] De acordo com uma modalidade preferencial, a detecção de sinal é realizada por medida ou análise da modificação de sinal da molécula repórter do sistema de marcador composto de moléculas repórter e inibidoras.

[000138] De acordo com uma modalidade preferencial, onde a molécula inibidora é fluorescente, a detecção de sinal é realizada pela medida da modificação de sinal da molécula inibidora ou modificações desinal tanto da molécula inibidora como da molécula repórter.

[000139] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula inibidora é fluorescente e o sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos a ser detectada é um sinal da molécula inibi- dora de fluorescência fluorescente.

[000140] Um dos atributos proeminentes da presente invenção é obter com sucesso sinais tanto em uma fase líquida como em uma fase sólida. A presente invenção pode ser realizada em duas fases, isto é, uma fase líquida e uma fase sólida.

I. Detecção alvo em uma Fase Líquida 1. Detecção alvo usando iniciador de TSG e ácido nucleico poli- merase

[000141] Conforme o primeiro protocolo, a sequência-alvo de ácidos nucleicos é detectada usando o iniciador de TSG e o ácido nucleico polimerase dependente de molde (ver as Figs 1A e 1B).

[000142] O primeiro protocolo compreende as etapas de:

[000143] (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com o iniciador de TSG; em que o iniciador de TSG compreende (i) uma sequência nucleotídica hibridizante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência; em que quando o iniciador de TSG não é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente adjacentes entre si para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter; em que quando o iniciador de TSG é hibri- dizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula repórter, pelo qual o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos é gerado e obtido;

[000144] (b) contato do resultante da etapa (a) com um ácido nuclei- co polimerase dependente de molde sob condições de extensão de iniciador tal que a reação de extensão 3’ seja induzida na extremidade 3’ do iniciador de TSG; e

[000145] (c) detecção do sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos, pelo qual o sinal indica a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos em DNA ou mistura de ácidos nuclei- cos.

[000146] De acordo com uma modalidade preferencial, a detecção da etapa (c) é realizada em tempo real, uma maneira de ponto da extremidade, ou uma maneira de intervalo de tempo predeterminada.

2. Detecção alvo usando iniciador de TSG e ácido nucleico poli- merase tendo atividade nuclease 5’ para 3’

[000147] Conforme o segundo protocolo, a sequência-alvo de ácidos nucleicos é detectada usando o iniciador de TSG e o ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo atividade nuclease 5’ para 3’.

[000148] Preferencialmente, o segundo protocolo compreende as etapas de:

[000149] (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com o iniciador de TSG; em que o iniciador de TSG compreende (i) uma sequência nucleotídica hibridizante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência; em que quando o iniciador de TSG não é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente adjacentes entre si para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter; em que quando o iniciador de TSG é hibri- dizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula repórter, pelo qual o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos é gerado e obtido;

[000150] (b) contato do resultante da etapa (a) com um ácido nuclei- co polimerase dependente de molde que tem uma atividade nuclease 5’ para 3’ em extensão de iniciador e condições de clivagem tal que a reação de extensão 3’ na extremidade 3’ do iniciador de TSG e a reação de clivagem 5’ na porção de extremidade 5’ do iniciador de TSG sejam induzidas, pelo qual a molécula repórter ou a molécula inibidora de fluorescência são liberadas do iniciador de TSG para gerar o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos; e

[000151] (c) detecção do sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos, pelo qual o sinal indica a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos em DNA ou mistura de ácidos nuclei- cos.

[000152] De acordo com uma modalidade preferencial, a presente invenção compreende ainda a repetição das etapas (a) - (b) ou (a) - (c) com desnaturação entre ciclos de repetição pelo menos duas vezes para amplificar o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.

[000153] De acordo com uma modalidade preferencial, a detecção da etapa (c) é realizada em tempo real, uma maneira de ponto da extremidade, ou uma maneira de intervalo de tempo predeterminada.

3. Detecção alvo usando iniciador de TSG, iniciador contraparte e ácido nucleico polimerase

[000154] O terceiro protocolo da presente invenção detecta a sequência-alvo de ácidos nucleicos pelo uso de (i) um ácido nucleico po- limerase dependente de molde e (ii) um par de iniciadores composto do iniciador de TSG e seu iniciador contraparte capaz de amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos, tal que o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos seja amplificado simulta- neamente com a amplificação alvo (ver as Figs 2A e 2B).

[000155] O iniciador contraparte pode ser usado como um iniciador de TSG ou não.

[000156] Preferencialmente, o terceiro protocolo detecta a sequência-alvo de ácidos nucleicos em DNA ou mistura de ácidos nucleicos por reações de amplificação usando o iniciador de TSG, compreendendo as etapas de:

[000157] (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com um par de iniciadores composto de dois iniciadores como um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso capaz de amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que pelo menos um dos dois iniciadores é o iniciador de TSG; em que o iniciador de TSG compreende (i) uma sequência nucleotídica hibridizante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência; em que quando o iniciador de TSG não é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente adjacentes entre si para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter; em que quando o iniciador de TSG é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nuclei- cos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula repórter, pelo qual o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos é gerado e obtido;

[000158] (b) contato do resultante da etapa (a) com um ácido nuclei- co polimerase dependente de molde sob condições de extensão de iniciador tal que a reação de extensão 3’ nas extremidades 3’ dos dois iniciadores seja induzida;

[000159] (c) desnaturação do resultante da etapa (b);

[000160] (d) repetição das etapas (a) - (c) pelo menos duas vezes para amplificar tanto a sequência-alvo de ácidos nucleicos como o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos; e

[000161] (e) detecção do sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos, em que a detecção é realizada para cada ciclo de repetição da etapa (d), no fim da repetição da etapa (d) ou em cada um dos intervalos de tempo predeterminados durante a repetição, tal que o sinal indique a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.

4. Detecção alvo usando iniciador de TSG, iniciador contraparte e ácido nucleico polimerase tendo atividade nuclease 5’ para 3’

[000162] O quarto protocolo da presente invenção detecta a sequência-alvo de ácidos nucleicos pelo uso de (i) um ácido nucleico polime- rase dependente de molde tendo atividade nuclease 5’ para 3’ e (ii) um par de iniciadores composto do iniciador de TSG e seu iniciador con- traparte capaz de amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos, tal que o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nuclei- cos seja amplificado simultaneamente com a amplificação alvo (ver as Figs 3A e 3B).

[000163] Preferencialmente, o quarto protocolo compreende as etapas de:

[000164] (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com um par de iniciadores composto de dois iniciadores como um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso capaz de amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que pelo menos um dos dois iniciadores é o iniciador de TSG; em que o iniciador de TSG compreende (i) uma sequência nucleotídica hibridizante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência; em que quando o iniciador de TSG não é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente adjacentes entre si para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter; em que quando o iniciador de TSG é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nuclei- cos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula repórter, pelo qual o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos é gerado e obtido;

[000165] (b) contato do resultante da etapa (a) com um ácido nuclei- co polimerase dependente de molde em extensão de iniciador e condições de clivagem tal que a reação de extensão 3’ na extremidade 3’ do iniciador de TSG e a reação de clivagem 5’ na porção de extremidade 5’ do iniciador de TSG sejam induzidas, pelo qual a molécula repórter ou a molécula inibidora do iniciador de TSG são liberadas do iniciador de TSG para gerar o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos; e

[000166] (c) desnaturação do resultante da etapa (b);

[000167] (d) repetição das etapas (a) - (c) pelo menos duas vezes para amplificar tanto a sequência-alvo de ácidos nucleicos como o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos; e

[000168] (e) detecção do sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos, em que a detecção é realizada para cada ciclo de repetição da etapa (d), no fim da repetição da etapa (d) ou em cada um dos intervalos de tempo predeterminados durante a repetição, tal que o sinal indique a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.

II. Detecção alvo em uma Fase Sólida

[000169] A vantagem proeminente da presente invenção é ser eficaz na detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos até em uma fase sólida, tais como microarranjo.

[000170] De acordo com uma modalidade preferencial, a presente invenção é realizada em fase sólida e o iniciador de TSG é imobilizado na superfície de um substrato sólido pela sua extremidade 5’.

1. Detecção alvo On-Chip usando iniciador de TSG e ácido nuclei- co polimerase

[000171] Conforme o primeiro protocolo sólido, a sequência-alvo de ácidos nucleicos é detectada usando o iniciador de TSG e um ácido nucleico polimerase dependente de molde em fase sólida (ver as Figs 4A e 4B).

[000172] Preferencialmente, o primeiro protocolo sólido compreende as etapas de:

[000173] (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com o iniciador de TSG; em que o iniciador de TSG compreende (i) uma sequência nucleotídica hibridizante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência; em que o iniciador de TSG é imobilizado na superfície de um substrato sólido pela sua extremidade 5’; em que quando o iniciador de TSG não é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente adjacentes entre si para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter; em que quando o iniciador de TSG é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula repórter, pelo qual o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nu- cleicos é gerado e obtido;

[000174] (b) contato do resultante da etapa (a) com um ácido nuclei- co polimerase dependente de molde sob condições de extensão de iniciador tal que a reação de extensão 3’ na extremidade 3’ do iniciador de TSG seja induzida; e

[000175] (c) detecção do sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos no substrato sólido, pelo qual o sinal indica a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos em DNA ou mistura de ácidos nucleicos.

2. Detecção alvo On-Chip usando iniciador de TSG, iniciador con- traparte e ácido nucleico polimerase

[000176] O segundo protocolo sólido da presente invenção detecta a sequência-alvo de ácidos nucleicos pelo uso de (i) um ácido nucleico polimerase dependente de molde e (ii) um par de iniciadores composto do iniciador de TSG e seu iniciador contraparte capaz de amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos, tal que o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos seja amplificado simultaneamente com a amplificação alvo.

[000177] Em outras palavras, o segundo protocolo sólido executa a tecnologia de PCR on-chip em tempo real.

[000178] Preferencialmente, o segundo protocolo sólido compreende as etapas de:

[000179] (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com um par de iniciadores composto de dois iniciadores como um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso capaz de amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que pelo menos um dos dois iniciadores é o iniciador de TSG; em que o iniciador de TSG compreende (i) uma sequência nucleotídica hibridizante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência; em que pelo menos um dos dois iniciadores é imobilizado na superfície de um substrato sólido pela sua extremidade 5’ e outro iniciador não é imobilizado; o iniciador imobilizado é o iniciador de TSG; em que quando o iniciador de TSG não é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente adjacentes entre si para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter; em que quando o iniciador de TSG é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula repórter, pelo qual o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos é gerado e obtido;

[000180] (b) contato do resultante da etapa (a) com um ácido nuclei- co polimerase dependente de molde sob condições de extensão de iniciador tal que a reação de extensão 3’ nas extremidades 3’ dos dois iniciadores seja induzida;

[000181] (c) desnaturação do resultante da etapa (b);

[000182] (d) repetição das etapas (a) - (c) pelo menos duas vezes para amplificar tanto a sequência-alvo de ácidos nucleicos como o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos; e

[000183] (e) detecção do sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos, em que a detecção é realizada para cada ciclo de repetição da etapa (d), no fim da repetição da etapa (d) ou em cada um dos intervalos de tempo predeterminados durante a repetição, tal que o sinal indique a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.

[000184] De acordo com uma modalidade preferencial, o iniciador de TSG é imobilizado na superfície de um substrato sólido pela sua extremidade 5’, e outro iniciador não é imobilizado e não um iniciador de TSG.

[000185] De acordo com uma modalidade preferencial, o iniciador de TSG e o iniciador contraparte têm uma estrutura oligonucleotídica de iniciação dual (DPO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5’-Xp-Yq-Zr-3’ (I) em que Xp representa uma primeira porção de iniciação 5’ que tem uma sequência nucleotídica hibridizante complementar ao ácido nucleico alvo; Yq representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Zr representa uma segunda porção de iniciação 3’ que tem uma sequência nucleotídica hibridi- zante complementar ao ácido nucleico alvo; p, q e r representam o número de nucleotídeos, e X, Y, e Z são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da primeira porção de iniciação 5’ é mais alta do que aquela da segunda porção de iniciação 3’ e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação separa a primeira porção de iniciação 5’ da segunda porção de iniciação 3’ em termos de anelamento de eventos ao ácido nucleico alvo, pelo qual a especificidade de anelamento do oligonucleotídeo é determinada duplamente pela primeira porção de iniciação 5’ e a segunda porção de iniciação 3’ tal que a especificidade de anelamento total do iniciador seja aumentada.

[000186] A estrutura de DPO como uma versão de iniciador de DSO (oligonucleotídeo de especificidade dual) foi primeiro proposta pelo presente inventor (ver WO 2006/095981; Chun et al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40 (2007)).

[000187] A DPO incorpora um conceito novo no qual sua hibridiza- ção ou anelamento são duplamente determinados pela porção 5’ de alta especificidade de Tm (ou a primeira porção de iniciação 5’ ) e porção 3’ de baixa especificidade de Tm (ou a segunda porção de iniciação 3’ ) separadas pela porção de separação, exibindo especificidade de hibridização dramaticamente aumentada (ver WO 2006/095981; Kim et al., Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mu tants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of Virological Methods, 149:76-84 (2008); Kim, et. al., Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay, Journal of Virological Methods, doi:10.1016/j.jviromet.2008.11.007 (2008); Horii et. al., Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplex sexually transmitted pathogens in clinical specimens, Letters in Applied Microbiology, doi:10.111/j.1472-765X2009.02618x (2009)). Como tal, DPO tem consequentemente dois segmentos de iniciadores com propriedades de hibridização distintas: a primeira porção de iniciação 5’ que inicia a hibridização estável, e a segunda porção de iniciação 3’ que principalmente determina a especificidade alvo.

[000188] A amplificação (particularmente, amplificação multiplex) usando iniciadores tendo a estrutura de DPO na presente invenção assegura para obter amplicons sem dados falsos-positivos e negativos.

[000189] De acordo com uma modalidade preferencial, a base universal na porção de separação é selecionada a partir do grupo consistindo de desóxi-inosina, inosina, 7-deaza-2’-desóxi-inosina, 2-aza-2’- desóxi-inosina, 2’-OMe inosina, 2’-F inosina, desóxi 3-nitropirrol, 3- nitropirrol, 2’-OMe 3-nitropirrol, 2’-F 3-nitropirrol, 1-(2’-desóxi-beta-D- ribofuranosyl)-3-nitropirrol, desóxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2’-OMe 5- nitroindol, 2’-F 5-nitroindol, desóxi 4-nitrobenzimidazol, 4- nitrobenzimidazol, desóxi 4-aminobenzimidazol, 4-aminobenzimidazol, desóxi nebularina, 2’-F nebularina, 2’-F 4-nitrobenzimidazol, PNA-5- introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobenzimidazol, PNA-3-nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolino-nebularina, morfoli- no-inosina, morfolino-4-nitrobenzimidazol, morfolino-3-nitropirrol, fosfo- ramidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4-nitrobenzimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2’-0- metoxietil inosina, 2’0-metoxietil nebularina, 2’-0-metoxietil 5-nitroindol, 2’-0-metoxietil 4-nitro-benzimidazol, 2’-0-metoxietil 3-nitropirrol e combinações dos mesmos. Mais preferencialmente, a base universal é de- sóxi-inosina, 1-(2’-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol ou 5- nitroindol, ainda mais preferencialmente, desóxi-inosina.

[000190] Preferencialmente, a porção de separação compreende nu- cleotídeos contíguos tendo pelo menos três, mais preferencialmente pelo menos quatro, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco bases universais.

[000191] Preferencialmente, na estrutura DPO a primeira porção de iniciação 5’ é mais longa do que a segunda porção de iniciação 3’ . A primeira porção de iniciação 5’ tem preferencialmente de 15 a 60 nu- cleotídeos, mais preferencialmente 15 a 40 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 15 a 25 nucleotídeos de comprimento. É preferencial que a segunda porção de iniciação 3’ tenha 3 a 15 nucleotídeos, mais preferencialmente 5 a 15 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 6 a 13 nucleotídeos de comprimento. A porção de separação tem preferencialmente 3 a 10 nucleotídeos, mais preferencialmente 4 a 8 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 5 a 7 nucleotídeos de comprimento. De acordo com uma modalidade preferencial, a Tm da primeira porção de iniciação 5’ varia de 40°C a 80°C, mais preferencialmente 45°C a 65°C. A Tm da segunda porção de iniciação 3’ varia preferencialmente de 10°C a 40°C. É preferencial que a Tm da porção de separação varie de 3°C a 15°C.

[000192] De acordo com uma modalidade preferencial, a Tm da primeira porção de iniciação 3’ varia de 40°C a 80°C, mais preferencialmente 45°C a 65°C. A Tm da segunda porção de iniciação 5’ varia preferencialmente de 10°C a 40°C. É preferencial que a Tm da porção de separação varie de 3°C a 15°C.

[000193] De acordo com uma modalidade preferencial, todos os dois iniciadores usados na amplificação da presente invenção têm a estrutura de DPO.

[000194] As tecnologias convencionais usando iniciadores para detectar ácido nucleico alvo não podem ser livres de sinais falsos em um nível satisfatório devido a limitações inerentes dos iniciadores e sondas usadas. Entretanto, os iniciadores tendo a estrutura DPO com tal desenho deliberativo são hibridizados com a sequência-alvo de ácidos nucleicos com uma especificidade dramaticamente aumentada, permitindo detectar a sequência-alvo de ácidos nucleicos sem sinais falsos.

[000195] Como usado neste pedido, o termo "convencional" em conjunto com iniciadores significa qualquer iniciador que não tem a estrutura de DPO. São descritos neste pedido como iniciadores convencionais.

[000196] De acordo com uma modalidade preferencial, uma da molécula repórter e da molécula inibidora é posicionada sobre a primeira porção de iniciação 5’ e a outra na primeira porção de iniciação 5’, segunda porção de iniciação 3’ ou porção de separação.

[000197] A presente invenção não requer que nenhuma sequência ou comprimento particular das sequências alvo de ácidos nucleicos sejam detectados e/ou amplificados.

[000198] Onde um mRNA é empregado como material inicial, uma etapa de transcrição reversa é necessária antes da execução de etapa de anelamento, os detalhes do qual são encontrados em Joseph Sam- brook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); e Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)). Para a transcrição reversa, um hexâmero randômico ou um iniciador oligonucleotídico dT hibridizável ao mRNA pode ser usado.

[000199] O iniciador oligonucleotídico dT é compreendido de dTMPs, um ou mais dos quais podem ser substituídos por outros dNMPs con- tanto que o iniciador dT possa servir como iniciador. A transcrição reversa pode ser feita com transcriptase reversa que tem atividade de RNase H. Se um usar uma enzima tendo atividade de RNase H, pode ser possível omitir uma etapa de digestão separada com RNase H escolhendo cuidadosamente as condições de reação.

[000200] Em particular, sequências alvo de ácidos nucleicos que podem ser detectadas e/ou amplificadas incluem qualquer um de ácido nucleico procariótico, eucariótico (por exemplo, protozoários e parasitas, fungos, levedura, plantas superiores, inferiores e animais superiores, incluindo mamíferos e humanos) ou viral de ocorrência natural (por exemplo, vírus de Herpes, HIV, vírus influenza, vírus Epstein-Barr, vírus de hepatite, vírus de poliomielite, etc.) ou viroide.

[000201] As vantagens da presente invenção podem ser destacadas em detecção simultânea (múltipla) de pelo menos duas sequências alvo de ácidos nucleicos.

[000202] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácidos nucleicos e os iniciadores de TSG compreendem pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de iniciadores. De acordo com uma modalidade preferencial, o iniciador contraparte capaz de amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos em conjunto com o iniciador de TSG compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de iniciadores.

[000203] Por exemplo, onde a presente invenção é realizada usando um vaso de reação contendo cinco iniciadores de TSG (cada um que tem uma molécula repórter fluorescente com o comprimento de onda de emissão diferente), cinco iniciadores contraparte e uma amostra de ácidos nucleicos, gera cinco sinais de fluorescência diferentes correspondente a cinco diferentes ácidos nucleicos alvo, permitindo a detecção simultânea de cinco diferentes sequências alvo de ácidos nuclei- cos em tempo real. Neste caso, todas de moléculas inibidoras de fluorescência usadas podem ser selecionadas para ter propriedades diferentes um de outro. Alternativamente, todas ou algumas moléculas ini- bidoras de fluorescência usadas podem ser selecionadas para ter as mesmas propriedades.

[000204] Além disso, a presente invenção é muito útil na detecção de uma variação de nucleotídeo. O termo "variação de nucleotídeo" usada neste pedido refere-se a um polimorfismo de nucleotídeo em uma sequência de DNA em uma particular posição entre segmentos de DNA contíguos que são de outra maneira similares em sequência. Tais segmentos de DNA contíguos incluem um gene ou qualquer outra porção de um cromossomo. Por exemplo, a variação de nucleotídeo detectada na presente invenção inclui SNP (polimorfismo de nucleotídeo único), deleção, inserção, substituição e translocação. A variação de nucleotídeo exemplificada inclui variações numerosas em um genoma humano (por exemplo, variações no MTHFR (metilenotetra-hidrofolato redutase) gene), variações envolvidas na resistência de fármaco de patógenos e variações causam tumorigênese.

[000205] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos usada na presente invenção é uma sequência de ácidos nucleicos pré-amplificada. A utilização da sequência de ácidos nucleicos pré-amplificada permite aumentar significativamente a sensibilidade e a especificidade da detecção alvo da presente invenção. A sequência nucleotídica alvo em uma menor quantidade é pré- amplificada para dar uma quantidade adequada e em seguida detectada pelo presente método, elevando a sensibilidade e a especificidade da detecção alvo da presente invenção. De maneira interessante, on- de o iniciador de TSG a ser hibridizado com uma sequência a jusante de iniciadores usados na pré-amplificação é usado no presente método, serve como um iniciador aninhado para aumentar a especificidade da detecção alvo da presente invenção.

[000206] De acordo com uma modalidade preferencial, onde a sequência de ácidos nucleicos pré-amplificada é usada na presente invenção para detectar as sequências alvo de ácidos nucleicos pela reação de amplificação, o par de iniciadores usado na presente invenção é um par de iniciadores de uma amplificação aninhada.

[000207] Em outro aspecto desta invenção, é fornecido um kit para detectar uma sequência de ácido nucleico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos usando um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG), que compreende:

[000208] (a) o iniciador de TSG compreendendo (i) uma sequência nucleotídica hibridizante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência; em que quando o iniciador de TSG não é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente adjacentes entre si para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter; em que quando o iniciador de TSG é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula repórter, pelo qual o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos é gerado e obtido; e

[000209] (b) um ácido nucleico polimerase dependente de molde ca paz de induzir a reação de extensão 3’ na extremidade 3’ do iniciador de TSG atuando sobre um resultante de hibridização entre o iniciador de TSG e a sequência-alvo de ácidos nucleicos.

[000210] Uma vez que o kit desta invenção é construído para realizar o método de detecção da presente invenção descrita acima, as descrições comuns entre eles são omitidas a fim de evitar a redundância excessiva que leva à complexidade deste relatório descritivo.

[000211] Os presentes kits podem incluir opcionalmente os reagentes necessários para realizar reações de PCR de amplificação alvo (por exemplo, reações de PCR), tais como tampões, cofatores de DNA polimerase, e desoxiribonucleotídeo-5-trifosfatos. Opcionalmente, os kits também podem incluir várias moléculas de polinucleotídeo, transcriptase reversa, vários tampões e reagentes, e anticorpos que inibem a atividade de DNA polimerase.

[000212] Os kits também podem incluir reagentes necessários para realizar reações de controle positivas e negativas. As quantidades ótimas de reagentes a serem usados em uma dada reação podem ser prontamente determinadas pelo versado que tem o benefício da revelação atual. Os kits, tipicamente, são adotados para conter os constituintes antes descritos na embalagem separada ou compartimentos.

[000213] Os atributos e vantagens da presente invenção serão resumidos como se segue:

[000214] (a) A presente invenção é desenhada para um novo método de PCR em tempo real para detectar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos. O iniciador de TSG é capaz de gerar sinais indicativos da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos do sistema de marcador interativo dual e amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos pela sua reação de extensão 3’ durante a reação de PCR. Consequentemente, pode ser apreciado que a presente invenção pode fornecer um novo método para detectar as sequências alvo de ácidos nucleicos simultaneamente com a amplificação alvo em PCR em tempo real.

[000215] (b) A reação de extensão do iniciador de TSG permite in corporar o iniciador de TSG marcado dual no produto expandido, por meio disso gerando a intensidade de sinal em paralelo com a quantidade do produto amplificado. Tal estratégia de acoplamento adotada para presente invenção assegura análise quantitativa mais exata das sequências alvo de ácidos nucleicos.

[000216] (c) As sondas improvavelmente marcadas, onde o iniciador de TSG per si, são não especificamente hibridizadas com sequências não alvo sem qualquer extensão de iniciador, os sinais falsos-positivos não podem ser gerados pela realização da detecção de sinal sob altas condições estringentes, tais como alta temperatura.

[000217] (d) A geração de sinal na presente invenção pode ser reali zada somente pela hibridização com as sequências alvo de ácidos nu- cleicos sem reações de clivagem por atividades de nuclease. Nesta conexão, a presente invenção necessariamente não requer que as ácido nucleico polimerases deveriam ter atividade nuclease 5’ para 3’ ou atividade 3’ para 5’ de nuclease e, dessa forma, permitem usar uma ampla variedade de ácido nucleico polimerases para diversas aplicações.

[000218] (e) Onde o uso de ácido nucleico polimerases tendo ativi dade nuclease 5’ para 3’, a presente invenção pode obter sinais da reação de clivagem 5’ do iniciador de TSG hibridizado com as sequências alvo de ácidos nucleicos, aumentando eficiência de detecção alvo.

[000219] (f) Os métodos convencionais de PCR em tempo real re querem sondas marcadas ou estrutura de iniciador modificadas mais complicadas, tais como uma estrutura de grampo, que torna o desenho, síntese ou seleção de sequência da sonda e iniciador difíceis. Entretanto, uma vez que o iniciador de TSG da presente invenção é usado para não somente a amplificação alvo mas também a amplificação de sinal sem sondas marcadas adicionais ou estrutura de iniciador modificada mais complicada, seu desenho, síntese e seleção de sequência para PCR em tempo real são muito simples e fáceis. Por isso, a presente invenção fornece um novo método de PCR em tempo real que pode ser executado de maneira muito mais adequada do que as tecnologias de PCR em tempo real convencionais.

[000220] (g) A otimização de métodos de PCR em tempo real basea dos em sonda convencionais é difícil porque é necessário que as condições de hibridização devam ser otimizadas para sondas bem como iniciadores. Supõe-se que métodos convencionais de PCR em tempo real usando iniciadores com caudas para formar grampo-alças para otimizar condições de reação com consideração de formação e deformação de grampo-alças em iniciadores. Ao contrário, a presente invenção pode ser completamente livre das matérias incômodas e falhas associadas com a otimização de tais métodos convencionais de PCR em tempo real porque sua otimização pode ser feita com consideração somente a iniciadores sem qualquer modificação estrutural.

[000221] (h) Os métodos convencionais de PCR em tempo real pro vavelmente não adotarão um ensaio multiplex devido a dificuldades no desenho e otimização do iniciador ou sonda. Ao contrário, uma vez que a presente invenção usa somente um iniciador marcado sem sondas adicionais ou estrutura de iniciador modificada mais complicadas em PCR em tempo real, é possível exibir detecção excelente alvo em tempo real de uma maneira multiplex.

[000222] (i) Em comparação com as sondas convencionais de PCR em tempo real, o iniciador de TSG é expandido durante o processo e o iniciador de TSG expandido mostra força de ligação mais alta para sequências alvo de ácidos nucleicos. Os iniciadores convencionais de PCR em tempo real requerem uma estrutura modificada mais complicada, tal como um grampo-alça que prejudica a ligação à sequência- alvo de ácidos nucleicos. Ao contrário, o iniciador de TSG não requer tais modificações para que o iniciador de TSG tenha a melhor eficiência de ligação para sequências alvo de ácidos nucleicos. Este atributo é responsável em parte por aumentar a eficiência de detecção alvo do presente método.

[000223] (j) O presente método pode realizar prontamente uma rea ção de PCR em tempo real marcando simplesmente os iniciadores que são projetados para serem usados para reações de PCR convencionais e aplicação dos iniciadores marcados como iniciadores de TSG à reação de PCR em tempo real. Em resumo, os iniciadores para gerar amplicons em reações de PCR convencionais são facilmente marcados com marcadores adequados e em seguida usados para detectar as sequências alvo de ácidos nucleicos na presente invenção por reações de PCR em tempo real. Neste sentido, considera-se que o presente método é mais efetivo em tempo e custo no desenvolvimento de um ensaio de PCR em tempo real.

[000224] (k) Como discutido mais acima, os iniciadores usados na presente invenção tendo a estrutura DPO dão origem à melhora na sua especificidade de ligação, por meio disso eliminando sinais falsos- positivos associados com a ligação não alvo de iniciadores em reações de PCR em tempo real.

[000225] A presente invenção será descrita agora em detalhes adicionais através de exemplos. Seria óbvio para os versados na técnica que estes exemplos são destinados para ser mais concretamente ilustrativos e o escopo da presente invenção como apresentados nas reivindicações acrescentadas não é limitado aos ou pelos exemplos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Avaliação do iniciador de TSG com DNA polimerase que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’ na detecção de sequências alvo de ácidos nucleicos

[000226] O iniciador de TSG desta invenção foi avaliado se o iniciador de TSG pode gerar um sinal suficiente para detectar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos somente pela sua hibridização alvo e ex- tensão em que um ácido nucleico polimerase dependente de molde sem atividade 5’ para 3’ de exonuclease é usada.

[000227] Para testar esta avaliação, usamos o gene de Streptococcus pneumoniae ou gene de Staphylococcus aureus como moldes alvo. Para conveniência experimental, os oligonucleotídeos sintéticos foram usados como moldes de gene de S. pneumoniae e gene de S. aureus. O Fragmento de Stoffel sem atividade intrínseca 5’ para 3’ de exonuclease foi usado como DNA polimerase. Dois iniciadores de TSG que têm distâncias diferentes entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência foram examinados respectivamente sobre cada alvo. 6-FAM (6-carboxifluoresceína) foi usada como uma molécula repórter fluorescente e localizada na extremidade 5’ de iniciadores de TSG. O inibidor Black Hole 1 (BHQ-1) foi usado como uma molécula inibidora. A reação de síntese de ácidos nucleicos foi conduzida sem repetição de desnaturação, hibridização e extensão de iniciador. Os sinais foram medidos em um intervalo de tempo predeterminado.

A. Reação de síntese de ácidos nucleicos para a detecção do gene de S. pneumoniae

[000228] Quando a sequência-alvo de ácidos nucleicos do gene de S. pneumoniae é usada como um molde, as sequências do molde sintético e os iniciadores de TSG usados neste Exemplo são: SP_T105 5’- TTACTGAAAGACAATGAAGACAACCTAACAGGGGAAGATGTT- CGCG AAGGCTTAACTGCAGTTATCTCAGTTAAACACCCAAATCCACAG- TTTGAAGGACAAACC-3’ (SEQ ID NO: 1) SP_TSG(9) 5’-[6-FAM]TCCTTCAAAC[T(BHQ- 1)]GTGGATTTGGGTGT-3’ (SEQ ID NO: 2) SP_TSG(21) 5’-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATTTGGG[T(BHQ- 1)]GT-3’ (SEQ ID NO: 3) (O número 9 ou 21 em parênteses significa a distância de nucleotídeos entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência)

[000229] A reação de síntese de ácidos nucleicos com o iniciador de TSG foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 2 pmols do molde (SEQ ID NO: 1), 2 μl de tampão 10X de Stoffel [contendo Tris-HCl 100 mM (pH 8,3) e KCl 100 mM], 1 unidade de AmpliTaq® DNA polime- rase, Fragmento de Stoffel (Applied BioSystems, EUA), 200 μM cada um dos quatro dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 5 mM de MgCl2 e 5 pmols do iniciador de TSG (SEQ ID NO: 2 ou 3); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 2 min a 95°C e submetida a incubação por 40 min a 50°C. A detecção do sinal gerado foi realizada no intervalo de 1 min.

[000230] Como representado na FIG. 5, cada um dos dois iniciadores de TSG mostrou intensidade fluorescente muito mais alta na presença do molde (Nos. 1 e 3) do que aquele na ausência do molde (Nos. 2 e 4). Por isso, pode ser entendido que os iniciadores de TSG podem fornecer sinais suficientes para detectar o gene de S. pneumoniae pela hibridização e extensão dos iniciadores de TSG durante a reação de síntese de ácidos nucleicos.

[000231] É notável que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 3) que tem uma molécula repórter 21 nucleotídeos afastada de uma molécula ini- bidora mostrou modificações mais distintas da intensidade de sinal (isto é, modificação em valores de RFU) na presença e na ausência do molde do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 2) que tem uma molécula repórter 9 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora.

B. Reação de síntese de ácidos nucleicos para a detecção do gene de S. aureus

[000232] Quando a sequência-alvo de ácidos nucleicos do gene de S. aureus é usada como um molde, as sequências do molde sintético e os iniciadores de TSG usadas neste Exemplo são: SA_T200 5’- GCCAATAAAACTAGGAGGAAATTTAAATGTTAGAATTTGAACAAG- GAT TTAATCATTTAGCGACTTTAAAGGTCATTGGTGTAGGTGGTGG- CGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAA- TGTTGAATTTATCGCTATCAACACAGACGGTCAAGCTTTAAACTTA- TCTAAAGCTGAATCTAAA-3’ (SEQ ID NO: 4) SA_TSG(6) 5’-[6-FAM]CATTCCG[T(BHQ-1)]GGTCAATCATTCGGTT-3’ (SEQ ID NO: 5) SA_TSG(21) 5’-[6-FAM]CATTCCGTGGTCAATCATTCGG[T(BHQ-1)]T- 3’ (SEQ ID NO: 6) (O número 6 ou 21 nos parênteses significa a distância de nucleotí- deos entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência)

[000233] A reação de síntese de ácidos nucleicos foi conduzida como o protocolo usado para S. pneumoniae, exceto para o molde (0,2 pmols de S. aureus) e iniciadores de TSG (SEQ ID NO: 5 ou 6).

[000234] Como representado na FIG. 6, cada um dos dois iniciadores de TSG mostrou intensidade fluorescente muito mais alta na presença do molde (Nos. 1 e 3) do que aquele na ausência do molde (Nos. 2 e 4). Por isso, pode ser apreciado que os iniciadores de TSG podem fornecer sinais suficientes para detectar o gene de S. aureus por hibridização e extensão dos iniciadores de TSG durante a reação de síntese de ácidos nucleicos.

[000235] É notável que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 6) que tem uma molécula repórter 21 nucleotídeos afastada de uma molécula ini- bidora mostrou modificações mais distintas de intensidade de sinal (is- to é, modificação em valores de RFU) na presença e na ausência do molde do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 5) que tem uma molécula repórter 6 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora.

EXEMPLO 2: Exame do iniciador de TSG com DNA polimerase que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’ sob condições de reação de PCR em tempo real para a detecção de um ácido nu- cleico alvo

[000236] Ainda examinamos se o iniciador de TSG pode gerar um sinal suficiente para detectar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos durante a reação de PCR em tempo real usando um ácido nucleico polimerase dependente de molde sem atividade 5’ para 3’ de exonuclease.

[000237] Para examinar esta avaliação, as reações de PCR em tempo real para a detecção de genes de S. pneumoniae, S. aureus, Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis foram conduzidas respectivamente usando pares de iniciadores incluindo iniciadores de TSG. Fragmento de Stoffel sem atividade intrínseca 5’ para 3’ de exonuclease foi usado como uma DNA polimerase. Dois iniciadores de TSG tendo distâncias diferentes entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência foram examinados sobre cada gene alvo. A. PCR em tempo real para a detecção do gene de S. pneumoniae

[000238] Quando a sequência-alvo de ácidos nucleicos do gene de S. pneumoniae é usada como um molde, as sequências de um iniciador de sentido direto e iniciadores de TSG (como iniciadores de sentido reverso) usadas neste Exemplo são: SP_F1 5’-GGTTTCCGTACAGCCTTGAIIIIIGTTATCAATG-3’ (SEQ ID NO: 7) SP_TSG(9) 5’-[6-FAM]TCCTTCAAAC[T(BHQ- 1)]GTGGATTTGGGTGT-3’ (SEQ ID NO: 2) SP_TSG(21) 5’-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATTTGGG[T(BHQ- 1)]GT-3’ (SEQ ID NO: 3) (I representa desóxi-inosina e o número 9 ou 21 nos parênteses significa a distância de nucleotídeos entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência)

[000239] A reação de PCR em tempo real para a detecção de S. pneumoniae foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 10 ng de DNA genômico de S. pneumoniae, 2 μl de tampão 10X de Stoffel contendo Tris-HCl 100 mM (pH 8,3) e KCl 100 mM, 1 unidade de Ampli- Taq® DNA polimerase, Fragmento de Stoffel (Applied BioSystems, EUA), 200 μM cada um dos quatro dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 5 mM de MgCl2, 5 pmols do iniciador de sentido direto (SEQ ID NO: 7) e 5 pmols do iniciador de TSG (SEQ ID NO: 2 ou 3) como um iniciador de sentido reverso; o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 2 min a 95°C e submetida a 30 ciclos de 30 s a 94°C, 60 s a 55°C e 10 s a 72°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de anelamento (55°C) de cada ciclo.

[000240] Como mostrado na Fig. 7, os sinais fluorescentes de S. pneumoniae foram observados na presença do molde de S. pneumoniae (Nos. 1 e 3) na reação de PCR em tempo real usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde que não tem atividade nuclease 5’ para 3’, ao passo que não houve nenhum sinal fluorescente nos controles negativos sem o molde alvo (Nos. 2 e 4).

[000241] O iniciador de TSG (SEQ ID NO: 3) que tem uma molécula repórter 21 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora mostrou valores de Ct mais baixos e valores de RFU mais altos do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 2) que tem uma molécula repórter 9 nucleo- tídeos afastada de uma molécula inibidora.

B. PCR em tempo real para a detecção do gene de S. aureus

[000242] Quando a sequência-alvo de ácidos nucleicos de S. aureus é usada como um molde, as sequências de um iniciador de sentido direto e iniciadores de TSG (como iniciadores de sentido reverso) usadas neste Exemplo é: SA_F1 5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT-3’ (SEQ ID NO: 8) SA_TSG(6) 5’-[6-FAM]CATTCCG[T(BHQ- 1)]GGTCAATCATTCGGTT-3’ (SEQ ID NO: 5) SA_TSG(21) 5’-[6-FAM]CATTCCGTGGTCAATCATTCGG[T(BHQ- 1)]T-3’ (SEQ ID NO: 6) (I representa desóxi-inosina e o número 6 ou 21 nos parênteses significa a distância de nucleotídeos entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência)

[000243] A reação de PCR em tempo real foi conduzida como o protocolo usado para detecção de S. pneumoniae, exceto para o molde (S. aureus), iniciador de sentido direto (SEQ ID NO: 8) e iniciadores de TSG (SEQ ID NO: 5 ou 6) como iniciadores de sentido reverso.

[000244] Como mostrado na Fig. 8, os sinais fluorescentes de S. aureus foram observados na presença do molde de S. aureus (Nos. 1 e 3) na reação de PCR em tempo real usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde que não tem atividade nuclease 5’ para 3’, ao passo que não houve nenhum sinal fluorescente nos controles negativos sem o molde alvo (Nos. 2 e 4)

[000245] O iniciador de TSG (SEQ ID NO: 6) que tem uma molécula repórter 21 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora mostrou valores de Ct mais baixos e valores de RFU mais altos do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 5) que tem uma molécula repórter 6 nucleo- tídeos afastada de uma molécula inibidora.

C. PCR em tempo real para detecção do gene de N. gonorrhoeae Quando a sequência-alvo de ácidos nucleicos de N. gonorrhoeae é usada como um molde, as sequências de um iniciador de sentido dire to e iniciadores de TSG (como iniciadores de sentido reverso) usadas neste Exemplo são: NG_F1 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGAT-3’ (SEQ ID NO: 9) NG_TSG(4) 5’-[6-FAM]CTCAT[T(BHQ- 1)]GGCGTGTTTCGCATATTTAAG-3’ (SEQ ID NO: 10) NG_TSG(22) 5’-[6-FAM]CTCATTGGCGTGTTTCGCATATT[T(BHQ- 1)]AAG-3’ (SEQ ID NO: 11) (I representa desóxi-inosina e o número 4 ou 22 nos parênteses significa a distância de nucleotídeos entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência)

[000246] A reação de PCR em tempo real foi conduzida como o protocolo usado para detecção de S. pneumoniae, exceto para o molde (N. gonorrhoeae), um iniciador de sentido direto (SEQ ID NO: 9) e iniciadores de TSG (SEQ ID NO: 10 ou 11) como iniciadores de sentido reverso.

[000247] Como mostrado na FIG 9, os sinais fluorescentes de N. go- norrhoeae foram observados na presença do molde de N. gonor- rhoeae (Nos. 1 e 3) na reação de PCR em tempo real usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde que não tem atividade nuclease 5’ para 3’, ao passo que não houve nenhum sinal fluorescente nos controles negativos sem o molde alvo (Nos. 2 e 4) [000248] Além disso, o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 11) que tem uma molécula repórter 22 nucleotídeos afastada de uma molécula ini- bidora mostrou valores de Ct mais baixos e valores de RFU mais altos do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 10) que tem uma molécula repórter 4 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora, como mostrado na FIG 9.

[000248] Além disso, o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 11) que tem uma molécula repórter 22 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora mostrou valores de Ct mais baixos e valores de RFU mais altos do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 10) que tem uma molécula repórter 4 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora, como mostrado na FIG 9.

D. PCR em tempo real para a detecção do gene de N. meningitidis

[000249] Quando a sequência-alvo de ácidos nucleicos de N. menin gitidis é usada como um molde, as sequências de um iniciador de sentido reverso e iniciadores de TSG (como iniciadores de sentido direto) usadas neste Exemplo são: NM_R1 5’-CCATAACCTTGAGCAATCCAIIIIICCTGACGTTC-3’ (SEQ ID NO: 12) NM_TSG(7) 5’-[6-FAM]CTTATCGC[T(BHQ-1)]TTCTGAAGCCATTG-3’ (SEQ ID NO: 13) NM_TSG(20) 5’-[6-FAM]CTTATCGCTTTCTGAAGCCAT[T(BHQ-1)]G- 3’ (SEQ ID NO: 14) (I representa desóxi-inosina e o número 7 ou 20 nos parênteses significa a distância de nucleotídeos entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência)

[000250] A reação de PCR em tempo real foi conduzida como o protocolo usado para detecção de S. pneumoniae, exceto para o molde (N. meningitidis), um iniciador de sentido reverso (SEQ ID NO: 12) e iniciadores de TSG (SEQ ID NO: 13 ou 14) como iniciadores de sentido direto.

[000251] Como mostrado na FIG 10, os sinais fluorescentes de N. meningitidis foram observados na presença do molde de N. meningitidis (Nos. 1 e 3) na reação de PCR em tempo real usando iniciadores de TSG e uma DNA polimerase dependente de molde que não tem atividade nuclease 5’ para 3’, ao passo que não houve nenhum sinal fluorescente nos controles negativos sem o molde alvo (Nos. 2 e 4) [000252] Além disso, o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 14) que tem uma molécula repórter 20 nucleotídeos afastada de uma molécula ini- bidora mostrou valores de Ct mais baixos e valores de RFU mais altos do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 13) que tem uma molécula repórter 7 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora, como mostrado na FIG 10.

[000252] Além disso, o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 14) que tem uma molécula repórter 20 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora mostrou valores de Ct mais baixos e valores de RFU mais altos do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 13) que tem uma molécula repórter 7 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora, como mostrado na FIG 10.

EXEMPLO 3: A sensibilidade de PCR em tempo real usando o ini-ciador de TSG e DNA polimerase que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’ para a detecção de S. aureus

[000253] A sensibilidade de PCR em tempo real usando o iniciador de TSG e DNA polimerase que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’ foi testada pela detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos do gene de S. aureus. Para este estudo, o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 6) como um iniciador de sentido reverso foi usado na reação de PCR em tempo real. O DNA genômico diluído em série (diluição de 10 vezes) de S. aureus de 100 pg a 10 fg foi usado como um molde.

[000254] As sequências de um iniciador de sentido direto e o iniciador de TSG (como um iniciador de sentido reverso) usadas neste Exemplo são: SA_F1 5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT-3’ (SEQ ID NO: 8) SA_TSG(21) 5’-[6-FAM]CATTCCGTGGTCAATCATTCGG[T(BHQ- 1)]T-3’ (SEQ ID NO: 6)(I representa desóxi-inosina e o número 21 nos parênteses significa a distância de nucleotídeos entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência)

[000255] A reação de PCR em tempo real foi conduzida no volume final de 20 μl contendo DNA genômico diluído (de 100 pg a 10 fg; diluição de 10 vezes) de S. aureus, 2 μl de tampão 10X de Stoffel contendo Tris-HCl 100 mM (pH 8,3) e KCl 100 mM, 1 unidade de AmpliTaq® DNA polimerase, Fragmento de Stoffel (Applied BioSystems, EUA), 200 μM cada um dos quatro dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 5 mM de MgCl2, 5 pmols de iniciador de sentido direto (SEQ ID NO: 8) e 5 pmols de iniciador de TSG (SEQ ID NO: 6) como um iniciador de sentido reverso; o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 2 min a 95°C e submetida a 40 ciclos de 30 s a 94°C, 60 s a 55°C e 10 s a 72°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de anelamento (55°C) de cada ciclo.

[000256] Como mostrado em FIG. 11, quando PCR em tempo real foi realizada usando a diluição serial de DNA genômico de S. aureus como descrito na Fig. 11, pode detectar a sequência-alvo de ácidos nu- cleicos até 100 fg (Números 1-4).

EXEMPLO 4: Geração de sinal por reação de clivagem 5’ em porção de extremidade 5’ do iniciador de TSG pelo ácido nucleico po- limerase dependente de molde tendo atividade 5’ para 3’ de exo- nuclase

[000257] Encontramos que os iniciadores marcados hibridizados com as sequências alvo de ácidos nucleicos passando por uma reação de clivagem 5’ na sua porção de extremidade 5’ pela atividade nuclease 5’ para 3’ de um ácido nucleico polimerase dependente de molde e reação de clivagem 5’ intricadamente adota à detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos gerando sinais de sequências alvo (ver PCT/KR2009/007064).

[000258] Por isso, examinamos se os sinais são gerados por reação de clivagem 5’ em porção de extremidade 5’ do iniciador de TSG pelo ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo a atividade 5’ para 3’ de exonuclase.

[000259] Para testar esta avaliação, usamos S. pneumoniae como um molde alvo e para conveniência experimental, o oligonucleotídeo sintético foi usado como um molde do gene de S. pneumoniae. Dois iniciadores de TSG tendo distâncias diferentes entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência foram examinados respectivamente. 6-FAM (6-carboxifluoresceína) foi usada como uma molécula repórter fluorescente e localizada na extremidade 5’ de iniciadores de TSG. O inibidor Black Hole 1 (BHQ-1) foi usado como uma molécula inibidora. A reação de síntese de ácidos nucleicos foi condu- zida com repetição de desnaturação, hibridização e extensão de iniciador. O sinal foi medido na etapa de hibridização de cada repetição. O Fragmento de Stoffel sem atividade intrínseca 5’ para 3’ de exonuclease e DNA polimerase Taq tendo atividade exonuclease 5’ para 3’ foi usado como DNA polimerases.

[000260] As sequências do molde sintético e os iniciadores de TSG usados neste Exemplo são: SP_T105 5’- TTACTGAAAGACAATGAAGACAACCTAACAGGGGAAGATGTT- CGCG AAGGCTTAACTGCAGTTATCTCAGTTAAACACCCAAATCCACAG- TTTGAAGGACAAACC-3’ (SEQ ID NO: 1) SP_TSG(9) 5’-[6-FAM]TCCTTCAAAC[T(BHQ- 1)]GTGGATTTGGGTGT-3’ (SEQ ID NO: 2) SP_TSG(21) 5’-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATTTGGG[T(BHQ- 1)]GT-3’ (SEQ ID NO: 3) (O número 9 ou 21 nos parênteses significa a distância de nucleotídeos entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência) A. Reação de síntese de ácidos nucleicos com repetição de desnaturação, hibridização e extensão de iniciador usando DNA polimerase que não tem atividade exonuclease 5’ para 3’

[000261] A reação de síntese de ácidos nucleicos foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 2 pmols do molde (SEQ ID NO: 1), 2 μl de tampão 10X de Stoffel [contendo Tris-HCl 100 mM (pH 8,3) e KCl 100 mM], 1 unidade de AmpliTaq® DNA polimerase, Fragmento de Stoffel (Applied BioSystems, EUA), 200 μM cada um dos quatro dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 5 mM de MgCl2 e 5 pmols do iniciador de TSG (SEQ ID NO: 2 ou 3); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 2 min a 95°C e submetida a 40 ciclos de 30 s a 94°C e 60 s a 50°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de anelamento (50°C) de cada ciclo.

[000262] Na Fig. 12 mostrando os resultados após normalização, as modificações de sinal não foram observadas até na presença do molde (Nos. 1 e 5) onde o Fragmento de Stoffel sem atividade intrínseca 5’ para 3’ de exonuclease foi usado como uma DNA polimerase.

[000263] Estes resultados indicam que a intensidade de sinal gerada somente por hibridização e extensão de iniciador não foi transformada nos ciclos de reação porque o molde não foi amplificado durante a reação de ácidos nucleicos.

[000264] Por isso, seria reconhecido que somente a hibridização e a extensão de um iniciador de TSG em reações de síntese de ácidos nucleicos com ciclos não são capazes de acumular sinais detectáveis até na presença das sequências alvo de ácidos nucleicos (Nos. 1 e 5). B. Reação de síntese de ácidos nucleicos com repetição de desnaturação, hibridização e extensão de iniciador usando DNA polimerase tendo atividade exonuclease 5’ para 3’

[000265] A reação de síntese de ácidos nucleicos foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 2 pmols do molde (SEQ ID NO: 1), 10 μl de DiastarTaq PCR Master Mix 2X (Solgent, Coreia) contendo [MgCl2 12 mM, tampão DiastarTaq PCR, 2 U de DNA polimerase Dias- tarTaq e mistura de dNTP], 5 pmols do iniciador de TSG (SEQ ID NO: 2 ou 3); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termoci- clador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 15 min a 95°C e submetida a 40 ciclos de 30 s a 94°C e 60 s a 50°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de anelamento (50°C) de cada ciclo.

[000266] Como mostrado na Fig. 12, modificações de sinal de S. pneumoniae foram observadas (Nos. 3 e 7) onde a Taq DNA polimera- se tendo a atividade 5’ para 3’ de exonuclease foi usada como uma DNA polimerase.

[000267] Estes resultados indicam que a utilização da polimerase dependente de molde tendo atividade 5’ para 3’ de exonuclase é capaz de induzir reação de clivagem 5’ na porção de extremidade 5’ do iniciador de TSG. Consequentemente, os sinais dos fragmentos marcados liberados dos iniciadores de TSG são gerados e acumulados em cada ciclo, resultando nos sinais observáveis que indicam a pre-sença da sequência-alvo de ácidos nucleicos (Nos. 3 e 7).

[000268] Ao mesmo tempo, o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 2) que tem uma molécula repórter 9 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora mostrou valores de Ct mais baixos do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 3) que tem uma molécula repórter 21 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora. Estes resultados sugerem que os iniciadores de TSG com menor comprimento entre um repórter e um inibidor mostra maiores modificações em uma extensão de inibição antes e após reação de clivagem 5’ do que aqueles com maior comprimento entre um repórter e um inibidor.

EXEMPLO 5: Exame do iniciador de TSG com DNA polimerase tendo atividade exonuclease 5’ para 3’ sob condições de reação de PCR em tempo real para a detecção de um ácido nucleico alvo

[000269] Ainda examinamos se o iniciador de TSG pode gerar um sinal suficiente para detectar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos durante a reação de PCR em tempo real usando um ácido nucleico poli- merase dependente de molde tendo atividade exonuclease 5’ para 3’.

[000270] Para examinar esta avaliação, os mesmos moldes e iniciadores usados no Exemplo 2 foram usados exceto o ácido nucleico po- limerase dependente de molde tendo atividade exonuclease 5’ para 3’ e as condições de reação.

A. PCR em tempo real para a detecção de S. pneumoniae

[000271] A PCR em tempo real foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 10 ng de DNA genômico de S. pneumoniae, 10 μl de Dias- tarTaq PCR Master Mix 2X (Solgent, Coreia) contendo [MgCl2 12 mM, tampão DiastarTaq PCR, 2 U de DNA polimerase DiastarTaq e mistura de dNTP], 5 pmols do iniciador de sentido direto (SEQ ID NO: 7) e 5 pmols do iniciador de TSG (SEQ ID NO: 2 ou 3) como um iniciador de sentido reverso; o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 15 min a 95°C e submetida a 30 ciclos de 30 s a 94°C, 60 s a 55°C e 10 s a 72°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de anelamento (55°C) de cada ciclo.

[000272] Como mostrado na Fig. 13, os sinais fluorescentes de S. pneumoniae foram observados na presença do molde de S. pneumoniae (Nos. 1 e 3), ao passo que não houve nenhum sinal fluorescente nos controles negativos sem o molde (Nos. 2 e 4).

[000273] Além disso, o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 3) que tem uma molécula repórter 21 nucleotídeos afastada de uma molécula ini- bidora mostrou valores de Ct mais baixos e valores de RFU mais altos do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 2) que tem uma molécula repórter 9 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora.

B. PCR em tempo real para a detecção de S. aureus

[000274] A reação de PCR em tempo real foi conduzida como o protocolo usado para detecção de S. pneumoniae, exceto para o molde (S. aureus), iniciador de sentido direto (SEQ ID NO: 8) e iniciadores de TSG (SEQ ID NO: 5 ou 6) como iniciadores de sentido reverso.

[000275] Como mostrado na Fig. 14, os sinais fluorescentes de S. aureus foram observados na presença do molde de S. aureus (Número 1 e 3), ao passo que não houve nenhum sinal fluorescente nos controles negativos sem o molde (Nos. 2 e 4). Além disso, o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 6) que tem uma molécula repórter 21 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora mostrou valores de Ct mais baixos e valores de RFU mais altos do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 5) que tem uma molécula repórter 6 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora.

C. PCR em tempo real para a detecção de N. gonorrhoeae

[000276] A reação de PCR em tempo real foi conduzida como o protocolo usado para detecção de S. pneumoniae, exceto para o molde (N. gonorrhoeae), iniciador de sentido direto (SEQ ID NO: 9) e iniciadores de TSG (SEQ ID NO: 10 ou 11) como iniciadores de sentido reverso.

[000277] Como mostrado na Fig. 15, os sinais fluorescentes de N. gonorrhoeae foram observados na presença do molde de N. gonor- rhoeae (Nos. 1 e 3), ao passo que não houve nenhum sinal fluorescente nos controles negativos sem o molde (Nos. 2 e 4). Além disso, o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 11) que tem uma molécula repórter 22 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora mostrou valores de Ct mais baixos e valores de RFU mais altos do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 10) que tem uma molécula repórter 4 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora.

D. PCR em tempo real para a detecção de N. meningitidis

[000278] A reação de PCR em tempo real foi conduzida como o protocolo usado para detecção de S. pneumoniae, exceto para o molde (N. meningitidis), iniciador de sentido reverso (SEQ ID NO: 12) e iniciadores de TSG (SEQ ID NO: 13 ou 14) como iniciadores de sentido direto.

[000279] Como mostrado na Fig. 16, os sinais fluorescentes de N. meningitidis foram observados na presença do molde de N. meningitidis (Número 1 e 3), ao passo que não houve nenhum sinal fluorescente nos controles negativos sem o molde (Nos. 2 e 4). Além disso, o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 14) que tem uma molécula repórter 20 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora mostrou valores de Ct mais baixos e valores de RFU mais altos do que o iniciador de TSG (SEQ ID NO: 13) que tem uma molécula repórter 7 nucleotídeos afastada de uma molécula inibidora.

[000280] Finalmente, onde uma DNA polimerase dependente de molde tendo atividade nuclease 5’ para 3’ é usada, sinais indicativos da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos pode estar presente de duas outras maneiras: (i) geração de sinal pela não inibição do sinal do sistema de marcador interativo no iniciador de TSG causada pela modificação de conformação na hibridização com a sequência- alvo de ácidos nucleicos; e (ii) geração de sinal por reação de clivagem 5’ na sua porção de extremidade 5’ do iniciador de TSG pelo ácido nucleico polimerase dependente de molde tendo atividade nuclease 5’ para 3’.

EXEMPLO 6: A sensibilidade de PCR em tempo real usando o iniciador de TSG e DNA polimerase tendo atividade exonuclease 5’ para 3’ para a detecção de S. aureus

[000281] A sensibilidade PCR em tempo real usando o iniciador de TSG e DNA polimerase tendo atividade exonuclease 5’ para 3’ foi testada pela detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos do gene de S. aureus. Para examinar esta avaliação, os mesmos moldes e os iniciadores usados no Exemplo 3 foram usados exceto o ácido nuclei- co polimerase dependente de molde tendo atividade exonuclease 5’ para 3’ e as condições de reação.

[000282] A PCR em tempo real foi conduzida no volume final de 20 μl contendo DNA genômico diluído (de 100 pg a 10 fg; diluição de 10 vezes) de DNA genômico de S. aureus, 10 μl de QuantiTect Multiplex PCR Master Mix 2X (Qiagen) contendo [MgCl2 11 mM, tampão Quanti- Tect Multiplex PCR, HotstartTaq DNA polimerase e mistura de dNTP], 5 pmols do iniciador de sentido direto (SEQ ID NO: 8) e 5 pmols do inici- ador de TSG (SEQ ID NO: 6) como um iniciador de sentido reverso; o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 15 min a 95°C e submetida a 40 ciclos de 30 s a 94°C, 60 s a 55°C e 10 s a 72°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de anelamento (55°C) de cada ciclo.

[000283] Como mostrado na FIG. 17, quando PCR em tempo real foi realizada usando a diluição serial de DNA genômico de S. aureus como descrito na Fig. 11, pode detectar a sequência-alvo de ácidos nu- cleicos até 100 fg (Nos. 1 a 4).

EXEMPLO 7: Avaliação do iniciador de TSG para a detecção alvo da sequência de ácidos nucleicos no chip

[000284] Quando a sequência-alvo de ácidos nucleicos do gene de S. pneumoniae é usada como um molde, as sequências do molde sintético e os iniciadores de TSG usados neste Exemplo são: SP_T105 5’- TTACTGAAAGACAATGAAGACAACCTAACAGGGGAAGATGTT- CGCG AAGGCTTAACTGCAGTTATCTCAGTTAAACACCCAAATCCACAG- TTTGAAGGACAAACC-3’ (SEQ ID NO: 1) SP_TSG(21)_S 5’- [Ami-noC6]TTTTT[T(Fluoresceína)]CCTTCAAACTGTGGATTTGGG[T(BHQ- 1)]GT (SEQ ID NO: 15) (O número 21 nos parênteses significa a distância de nucleotídeos entre uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência) A. Imobilização do iniciador de TSG em lâmina de chip

[000285] O iniciador de TSG (SEQ ID NO: 15) foi dissolvido a uma concentração final de 50 uM em Solução Genorama Spotting Tipo I. O iniciador de TSG dissolvido foi colocado em uma lâmina de vidro (Ge-norama, Estônia) à temperatura ambiente e umidade relativa de 70%. A lâmina foi incubada em uma câmara úmida a 37°C por 2 horas. Então, a lâmina foi embebida em solução de amônia 1% por 10 minutos, seguida por lavagem com água destilada à temperatura ambiente.

B. Reação de síntese de ácidos nucleicos no chip

[000286] A reação de síntese de ácidos nucleicos foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 2 pmols do molde (SEQ ID NO: 1), 2 μl de tampão 10X de Stoffel [contendo Tris-HCl 100 mM (pH 8,3) e KCl 100 mM], 1 unidade de AmpliTaq® DNA polimerase, Fragmento de Stoffel (Applied BioSystems, EUA), 200 μM cada um dos quatro dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 5 mM de MgCl2; a mistura de reação foi transferida para a lâmina. A lâmina foi colocada na máquina de PCR in situ (GeneAmp in situ, Perkin Elmer); a lâmina foi incubada por 2 min a 95°C para desnaturação e submetida por 40 min a 50°C. Após reação de síntese de ácidos nucleicos, a lâmina foi lavada (a 70°C) e os sinais da lâmina foram detectados por um scanner de microarranjo (ScanAr- ray4000, Perkin Elmer), seguidos pela análise das imagens.

[000287] Tendo descrito uma modalidade preferencial da presente invenção, deve ser entendido que variantes e modificações das mesmas que estão incluídas no espírito da invenção podem ficar evidentes para os versados nesta técnica, e o escopo desta invenção deve ser determinado pelas reivindicações acrescentadas e seus equivalentes.

Claims

1. Método para detecção de uma sequência de ácido nu- cleico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos usando um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com o iniciador de TSG para gerar e obter um sinal indicativo da presença da sequência-alvo dos ácidos nucleicos; em que o iniciador de TSG compreende (i) uma sequência nucleotídica hibridizante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência; em que o iniciador de TSG não apresenta sequência auto-complementar que é funcional na formação de uma estrutura de alça de grampo em todo o seu comprimento; em que quando o iniciador de TSG não é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente adjacentes entre si com nenhuma ajuda de estruturas de alça de grampo para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter, assim não gerando sinal indicativo da presença da sequência-alvo dos ácidos nucleicos; em que quando o iniciador de TSG é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula repórter, assim gerando o sinal indicativo da presença da sequência-alvo dos ácidos nucleicos com a molécula repórter e a molécula inibidora que permanece anexada ao iniciador de TSG; em que um ácido nucleico polimerase dependente de molde que apresenta uma atividade nucleasse 3’ para 5’ e o iniciador de TSG compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeo incompatível em sua porção de extremidade 3’ ou extremidade 3’, a sequência de nucleotídeo incompatível não apresenta marcador; (b) contato do resultante da etapa (a) com um ácido nuclei- co polimerase dependente de molde sob condições de extensão de iniciador tal que a reação de extensão 3’ na extremidade 3’ do iniciador de TSG seja induzida; e (c) detecção do sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos, pelo qual o sinal indica a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos no DNA ou na mistura de ácidos nu- cleicos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que quando o ácido nucleico polimerase dependente de molde na etapa (b) apresenta uma atividade nuclease 5’ para 3’, uma porção dos iniciadores de TSG são adicionalmente clivados na sua extremidade 5’ pela atividade nuclease 5’ para 3’ do ácido nucleico po- limerase dependente de molde.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a repetição das etapas (a) - (b) ou (a) - (c) com desnaturação entre ciclos de repetição pelo menos duas vezes para amplificar o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a molécula repórter ou a molécula inibidora de fluorescência no iniciador de TSG estão localizadas na sua extremidade 5’ ou 1 a 5 nucleotídeos afastadas da sua extremidade 5’.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula inibidora é fluorescente e o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos a ser detectada na etapa (c) é um sinal da molécula inibidora de fluorescência fluorescente.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico polimerase dependente de molde é um ácido nucleico polimerase dependente de molde que tem uma atividade exonuclease 3’ a 5’.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o iniciador de TSG tem pelo menos um nucleotídeo incompatível tendo uma estrutura principal resistente à atividade exonuclease 3’ a 5’ do ácido nucleico polimerase dependente de molde na sua porção de extremidade 3’.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em fase sólida e o iniciador de TSG é imobilizado na superfície de um substrato sólido pela sua extremidade 5’.

9. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 8, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos e os iniciadores de TSG compreendem pelo menos dois tipos de iniciadores.

10. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 8, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo de ácidos nucleicos compreende uma variação de nucleotídeo.

11. Método para detecção de uma sequência de ácido nu- cleico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos usando um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG) em uma reação de amplificação, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com um par de iniciadores composto de dois iniciadores como um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso capaz de amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos para gerar e obter um sinal indicativo da presença da sequência-alvo dos ácidos nucleicos; em que pelo menos um dos dois iniciadores é o iniciador de TSG; em que o iniciador de TSG compreende (i) uma sequência nucleotídica hibridi- zante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência; em que o iniciador de TSG não apresenta sequência auto-complementar que é funcional na formação de uma estrutura de alça de grampo em todo o seu comprimento; em que quando o iniciador de TSG não é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a mo-lécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente adjacentes entre si com nenhuma ajuda de estruturas de alça de grampo para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter, assim não gerando sinal indicativo da presença da sequência-alvo dos ácidos nucleicos; em que quando o iniciador de TSG é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula repórter, assim gerando o sinal indicativo da presença da sequência-alvo dos ácidos nucleicos com a molécula repórter e a molécula inibidora que permanece anexada ao iniciador de TSG; em que um ácido nucleico polimerase dependente de molde que apresenta uma atividade nucleasse 3’ para 5’ e o iniciador de TSG compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeo incompatível em sua porção de extremidade 3’ ou extremidade 3’, a sequência de nucleotídeo incompatível não apresenta marcador; (b) contato do resultante da etapa (a) com um ácido nuclei- co polimerase dependente de molde sob condições de extensão de iniciador tal que a reação de extensão 3’ nas extremidades 3’ dos dois iniciadores seja induzida; (c) desnaturação do resultante da etapa (b); (d) repetição das etapas (a) - (c) pelo menos duas vezes para amplificar tanto a sequência-alvo de ácidos nucleicos como o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos; e (e) detecção do sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos, em que a detecção é realizada para cada ciclo de repetição da etapa (d), no fim da repetição da etapa (d) ou em cada um dos intervalos de tempo predeterminados durante a repetição, tal que o sinal indique a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que quando o ácido nucleico polimerase dependente de molde na etapa (b) apresenta uma atividade nuclease 5’ para 3’, uma porção dos iniciadores de TSG são adicionalmente clivados na sua extremidade 5’ pela atividade nuclease 5’ para 3’ do ácido nucleico polimerase dependente de molde.

13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a molécula repórter ou a molécula inibidora de fluorescência no iniciador de TSG estão localizadas na sua extremidade 5’ ou 1 a 5 nucleotídeos afastadas da sua extremidade 5’.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a molécula inibidora é fluorescente e o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos a ser detectada na etapa (e) é um sinal da molécula inibidora de fluorescência fluorescente.

15. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico polimerase dependente de molde é um ácido nucleico polimerase dependente de molde que tem uma atividade exonuclease 3’ a 5’.

16. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em fase sólida, pelo menos um dos dois iniciadores é imobilizado na superfície de um substrato sólido pela sua extremidade 5’ e o iniciador imobilizado é o iniciador de TSG.

17. Kit para detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo a partir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos usando um iniciador de geração de sinal alvo (iniciador de TSG) para uso no método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o iniciador de TSG que compreende (i) uma sequência nucleotídica hibridizante complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos e (ii) uma molécula repórter e uma molécula inibidora de fluorescência; em que o iniciador de TSG não apresenta sequência auto- complementar que é funcional na formação de uma estrutura de alça de grampo em todo o seu comprimento; em que quando o iniciador de TSG não é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente adjacentes entre si com nenhuma ajuda de estruturas de alça de grampo para permitir à molécula inibidora de fluorescência inibir um sinal da molécula repórter, assim não gerando sinal indicativo da presença da sequência-alvo dos ácidos nucleicos; em que quando o iniciador de TSG é hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nu- cleicos, a molécula repórter e a molécula inibidora de fluorescência são tridimensionalmente separadas para permitir à molécula inibidora de fluorescência não inibir o sinal da molécula repórter, pelo qual o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos é gerado e obtido com a molécula repórter e a molécula inibidora que permanece anexada ao iniciador de TSG; e (b) um ácido nucleico polimerase dependente de molde capaz de induzir a reação de extensão 3’ na extremidade 3’ do iniciador de TSG atuando sobre um resultante de hibridização entre o iniciador de TSG e a sequência-alvo de ácido nucleico.

18. Kit de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o kit compreende um par de iniciadores composto de dois iniciadores como um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso capaz de amplificar a sequência-alvo de ácidos nuclei- cos; em que pelo menos um dos dois iniciadores é o iniciador de TSG.

19. Kit de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico polimerase dependente de molde tem uma atividade nuclease 5’ para 3’ para induzir tanto a reação de extensão 3’ na extremidade 3’ do iniciador de TSG pela sua atividade de polimerase quanto a reação de clivagem 5’ na extremidade 5’ do iniciador de TSG pela sua atividade nuclease 5’ para 3’.

20. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que a molécula repórter ou a molécula inibidora de fluorescência no iniciador de TSG estão localizadas na sua extremidade 5’ ou 1 a 5 nucleotídeos afastadas da sua extremidade 5’.

21. Kit de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico polimerase dependente de molde é um ácido nucleico polimerase dependente de molde que tem uma atividade exonuclease 3’ a 5’.