JP2002522447A - アミノオキシ修飾ヌクレオシド化合物とそれから製造されるオリゴマー化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 高められたヌクレアーゼ抵抗性、相補的な鎖に対する結合親和性を高める置換基（例えば、２' −アミノオキシ基）及びＲＮアーゼＨを活性化する２' −デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオチドの領域を有する、ヌクレオシドモノマーとそれから製造されるオリゴマー化合物が提供される。そのようなオリゴマー化合物は、診断及び他の研究目的、生物体におけるタンパク質発現のモジュレーション、及びオリゴヌクレオチド治療薬に感受性がある他の病態の診断、検出及び治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【関連出願データ】

本出願は、特許出願第０９／１３０，９７３号、及び特許出願第０９／３４４
，２６０号（１９９８年１月３０日に出願された特許出願第０９／０１６，５２
０号の一部継続出願である）の一部継続出願であり、１９９７年２月１４日に出
願された米国暫定特許出願第６０／０３７，１４３号の優先利益を特許請求する
。上記特許出願のそれぞれの内容はそのまま参照により本明細書に組込まれてい
る。

【０００２】

【発明の分野】

本発明は、アミノオキシ修飾されたヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド、相
補的な核酸鎖における開裂のためにＲＮアーゼＨを誘発するオリゴヌクレオチド
、及びそのヌクレオチドの少なくともいくつかがヌクレアーゼ抵抗性であるよう
に機能化されていて、当該オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少なくともいく
つかが相補的な核酸鎖に対する当該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーショ
ンを増強する置換基を包含し、及び当該オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの少
なくともいくつかが２' −デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖部分を包含
する、オリゴヌクレオチドに向けられている。そのようなオリゴヌクレオチドに
１個又はそれ以上のアミノオキシ部分が含まれることにより、特に、相補鎖に対
するオリゴヌクレオチドの結合性が高まる。本発明のオリゴヌクレオチド及び高
分子は、治療薬、診断薬、及び研究用試薬として有用である。

【０００３】

【発明の背景】

オリゴヌクレオチドは、単鎖ＲＮＡ又は単鎖ＤＮＡにハイブリダイズすること
が知られている。ハイブリダイゼーションとは、標的ＲＮＡ又はＤＮＡの塩基に
対し、オリゴヌクレオチドの塩基が配列特異的な塩基対で水素結合することであ
る。そのような塩基対は互いに相補的であると言われる。

【０００４】 相補的な核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度を
決定する場合、相補的な核酸に結合するオリゴヌクレオチドの相対能力は、特定
のハイブリダイゼーション複合体の融解温度を定量することによって比較し得る
。融解温度（Ｔｍ）は、二重らせんに特徴的な物理特性であり、ヘリカル（ハイ
ブリダイズしている）とコイル（ハイブリダイズしていない）の形態がそれぞれ
５０％存在している温度（摂氏）である。Ｔｍを測定するには、ＵＶスペクトル
を用いて、ハイブリダイゼーション複合体の形成及び分解（融解）を定量する。
ハイブリダイゼーションの間に起こる塩基のスタッキング（積み重なり）により
、ＵＶ吸収は減少する（浅色効果）。従って、ＵＶ吸収の減少は、Ｔｍがより高
いことを示す。Ｔｍがより高ければ、鎖間の結合強度はより大きい。

【０００５】 オリゴヌクレオチドは、細胞内酵素であるＲＮアーゼＨを使用して、標的ＲＮ
Ａを酵素的に開裂させるために使用し得る。そのようなＲＮアーゼＨ開裂の機序
には、２' −デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡにハイブ
リダイズすることが必要とされる。生じたＤＮＡ−ＲＮＡの二重鎖がＲＮアーゼ
Ｈ酵素を活性化し、この活性化された酵素によりＲＮＡ鎖が開裂される。ＲＮＡ
鎖の開裂によりＲＮＡの正常な機能が破壊される。ホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドはこのタイプの機序を介して機能する。しかしながら、ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドがＲＮアーゼＨの細胞内活性化に有用であるためには、このオリゴ
ヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨ活性化に十分な時間の間細胞内で存続するために
、ヌクレアーゼに対して十分安定でなければならない。オリゴヌクレオチドを研
究用試薬として使用するような、細胞外の使用については、そのようなヌクレア
ーゼ安定性は必要でないかもしれない。

【０００６】 Walder et al. のいくつかの公表物には、ＲＮアーゼＨとオリゴヌクレオチド
との相互作用が記載されている。特に興味深いのは：（１）Dagle et al., Nucl
eic Acids Research 1990, 18, 4751 ；（２）Dagle et al., Antisense Resear
ch And Development 1991, 1, 11；（３）Eder et al., J. Biol. Chem. 1991,
266, 6472 ；及び（４）Dagle et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 180
5 である。これらの公表物によれば、非修飾ホスホジエステルのヌクレオシド間
連結と修飾ホスホロチオエートのヌクレオシド間連結の両方を有するＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドは、細胞質ＲＮアーゼＨの基質になる。それらは基質になるので
、ＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの開裂を活性化する。しかしながら、さらに著
者らは、ツメガエルの肺ではホスホジエステル連結とホスホロチオエート連結の
両方がエクソヌクレアーゼ分解も受けることに注目している。そのようなヌクレ
アーゼ分解は、ＲＮアーゼＨ活性化に利用し得るオリゴヌクレオチドを速やかに
枯渇させるので、不利益である。

【０００７】 参考文献（１）、（２）及び（４）に記載されているように、ＲＮアーゼＨ活
性化作用を依然として供しながらヌクレアーゼ分解に抗してオリゴヌクレオチド
を安定化させるために、ホスホロアミデート、アルキルホスホネート又はホスホ
トリエステル連結部分の間にホスホジエステル連結ヌクレオチドの短い部分が位
置づけられている２' −デオキシオリゴヌクレオチドが構築された。ホスホロア
ミデート含有オリゴヌクレオチドはエクソヌクレアーゼに抗して安定化されたが
、参考文献（４）では、著者はホスホロアミデート連結ごとにホスホロアミデー
ト含有オリゴヌクレオチドの測定Ｔｍ値が１．６℃損失することを認めた。その
ようなＴｍ値の減少は、オリゴヌクレオチドとその標的鎖とのハイブリダイゼー
ションにおける減少を示している。

【０００８】 他の著者もそのようなオリゴヌクレオチドとその標的鎖とのハイブリダイゼー
ションの損失がもたらし得る効果について述べている。Saison-Behmoaras et al
., EMBO Journal 1991, 10, 1111は、オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨの基質
になり得ても、ｍＲＮＡに対する弱いハイブリダイゼーションのためにＲＮアー
ゼＨによる開裂効率が低いことを認めた。この著者らはまた、オリゴヌクレオチ
ドの３' 末端にアクリジン置換を包含させることでオリゴヌクレオチドがエクソ
ヌクレアーゼから保護されることに注目した。

【０００９】 １９９１年５月７日発行の米国特許第５，０１３，８３０号は、ホスホジエス
テル連結を介してＤＮＡオリゴマーに抱合した、ＲＮＡオリゴマーを含んでなる
混合型のオリゴマー、又はその誘導体を開示する。このＲＮＡオリゴマーはまた
、２' −Ｏ−アルキル置換基をもつ。しかしながら、ホスホジエステルであるの
で、このオリゴマーはヌクレアーゼ開裂を受けやすい。 １９８９年４月１３日出願のヨーロッパ特許出願第３３９，８４２号は、２'
−Ｏ−メチルリボオリゴヌクレオチドホスホロチオエート誘導体を包含する、２
' −Ｏ−置換ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを開示する。上記の出願は
また、ヌクレアーゼ抵抗性を欠く２' −Ｏ−メチルホスホジエステルオリゴヌク
レオチドを開示する。

【００１０】 １９９２年９月２２日発行の米国特許第５，１４９，７９７号は、ホスホジエ
ステル連結により連結し、修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡ配列の一部と両端で隣接
する、デオキシヌクレオチドの内側部分を包含する混合型のリン酸骨格オリゴヌ
クレオチドを開示する。この隣接配列には、メチルホスホネート、ホスホロモル
ホリデート、ホスホロピペラジデート又はホスホロアミデート連結が含まれる。 １９９３年１０月２６日発行の米国特許第５，２５６，７７５号は、ホスホロ
アミデート連結と、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート連結を組み込
む混合型のオリゴヌクレオチドを記載する。

【００１１】 オリゴヌクレオチド及びＲＮアーゼＨを使用して標的ＲＮＡ鎖を開裂すること
が有用であると認められてきたが、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗性と
ハイブリダイゼーション忠実性はオリゴヌクレオチド治療薬の開発においてきわ
めて重要である。従って、ＲＮアーゼＨを活性化し得る一方で同時にハイブリダ
イゼーション特性を維持又は向上させ、ヌクレアーゼ抵抗性を提供する方法及び
材料への切望されたニーズが存在する。そのようなオリゴヌクレオチドはまた研
究用試薬及び診断薬としても所望されている。

【００１２】

【発明の要旨】

本発明の１つの態様によれば、構造：

【００１３】

【化６】

【００１４】 ［式中： Ｔ₄ は、Ｂｘ又はＢｘ−Ｌであって、Ｂｘは複素環塩基部分であり； Ｔ₁ 、Ｔ₂ 及びＴ₃ の１つは、Ｌ、水素、ヒドロキシル、保護されたヒドロキ
シル又は糖置換基であり； Ｔ₁ 、Ｔ₂ 及びＴ₃ のもう１つは、Ｌ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシ
ル、固形支持体への結合基又は活性化されたリン基であり； Ｔ₁ 、Ｔ₂ 及びＴ₃ の残る１つは、Ｌ、水素、ヒドロキシル又は糖置換基であ
るが、Ｔ₁ 、Ｔ₂ 、Ｔ₃ 及びＴ₄ のうち少なくとも１つは、Ｌ又はＢｘ−Ｌであ
り； 前記Ｌ基は、式：

【００１５】

【化７】

【００１６】 ｛式中： ｍ及びｍｍは、それぞれ独立して１〜１０であり； ｙは、１〜１０であり； Ｅは、Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）又はＮ＝Ｃ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）であり； Ｒ₁ 及びＲ₂ は、それぞれ独立して、Ｈ、窒素保護基、置換又は未置換Ｃ₁ 〜
Ｃ₁₀アルキル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ₁₀アルケニル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ ₁₀ アルキニルであって、前記置換基が、ＯＲ₃ 、ＳＲ₃ 、ＮＨ₃ + 、Ｎ（Ｒ₃ )(
Ｒ₄ ）、グアニジノ又はアシルであり、前記アシルが、酸、アミド又はエステル
であるか； 又は、Ｒ₁ 及びＲ₂ は、一緒になって、窒素保護基となるか、又はＮ及びＯか
ら選択される追加のへテロ原子を場合により包含する環構造になり；そして、 Ｒ₃ 及びＲ₄ は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基で
あるか、又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は一緒になって、窒素保護基となるか； 又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は、結合して、Ｎ及びＯから選択される追加のへテロ原子
を場合により包含する環構造になる。｝を有する。］ の化合物が提供される。

【００１７】 ある好ましい態様では、Ｔ₁ 、Ｔ₂ 又はＴ₃ の１つがＬである。さらに好まし
い態様では、Ｔ₃ がＬである。 さらに好ましい態様では、Ｌが−Ｏ−（ＣＨ₂)₂ −Ｏ−Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）であ
る。もう１つの好ましい態様では、Ｒ₁ がＨ、又はＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、又は置
換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルであり、Ｒ₂ が置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルであり、好ましく
は、ここでＲ₁ はＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである、及び／又は、Ｒ₂ はＮＨ₃ + 又は
Ｎ（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである。もう１つの好ましい態様では
、Ｒ₁ 及びＲ₂ が、いずれも置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルであり、好ましい置換基は
、独立してＮＨ₃ + 又はＮ（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）である。

【００１８】 ある好ましい態様では、Ｂｘがアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、ウラシ
ル、チミン、シトシン、２−アミノアデニン又は５−メチルシトシンである。 ある好ましい態様では、Ｒ₁ 及びＲ₂ が結合して、Ｎ及びＯから選択される少
なくとも１つのへテロ原子を包含し得る環構造になり、好ましい環構造はイミダ
ゾール、ピペリジン、モルホリン又は置換ピペラジンであり、ここで置換基は、
好ましくはＣ₁ 〜Ｃ₁₂アルキルである。 ある好ましい態様では、Ｔ₁ が保護されたヒドロキシルである。他の好ましい
態様では、Ｔ₂ が活性化されたリン基であるか又は固形支持体への結合基である
。ある好ましい態様では、固形支持体がミクロ粒子である。さらに好ましい態様
では、固形支持体物質がＣＰＧである。

【００１９】 ある好ましい態様では、ＬがＢｘの環外アミノ官能基に結合している。他の好
ましい態様では、ＬがＢｘの環員炭素原子に結合している。 さらに好ましい態様では、Ｔ₄ がＢｘ−Ｌである。なおさらに好ましい態様で
は、Ｂｘがアデニン、２−アミノアデニン又はグアニンである。さらに好ましい
態様では、Ｂｘがピリミジン複素環塩基であり、ＬがＢｘのＣ５に共有結合して
いる。なおさらに好ましい態様では、Ｂｘがピリミジン複素環塩基であり、Ｌが
ＢｘのＣ４に共有結合している。なおさらに好ましい態様では、Ｂｘがプリン複
素環塩基であり、ＬがＢｘのＮ２に共有結合している。なおさらに好ましい態様
では、Ｂｘがプリン複素環塩基であり、ＬがＢｘのＮ６に共有結合している。

【００２０】 ある好ましい態様によれば、そのヌクレアーゼ抵抗性を増加させるように機能
化されている少なくとも１つのヌクレオシド化合物を組込むオリゴマー化合物が
提供される。さらなる態様では、オリゴマー化合物は標的ＲＮＡに対するその結
合親和性を高めるように置換基で機能化されている。 本発明のオリゴマー化合物は、好ましくは、ヌクレオシド単位を複数含んでな
るオリゴマー化合物であって、ヌクレオシド単位が、構造：

【００２１】

【化８】

【００２２】 ［式中： 各々のヌクレオシド単位のＴ₄ は、独立してＢｘ又はＢｘ−Ｌであって、Ｂｘ
は複素環塩基部分であり； 各々のヌクレオシド単位のＴ₅ 、Ｔ₆ 及びＴ₇ の１つは、独立して、Ｌ、ヒド
ロキシル、保護されたヒドロキシル、糖置換基、活性化されたリン基、固形支持
体への結合基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド又はオリゴヌ
クレオチドであり； 各々のヌクレオシド単位のＴ₅ 、Ｔ₆ 及びＴ₇ のもう１つは、独立して、ヌク
レオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドであり； 各々のヌクレオシド単位のＴ₅ 、Ｔ₆ 及びＴ₇ の残る１つは、独立して、Ｌ、
水素、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル又は糖置換基である。 但し、前記ヌクレオシド単位の少なくとも１つで、Ｔ₄ がＢｘ−Ｌであるか、
又はＴ₅ 、Ｔ₆ 及びＴ₇ の少なくとも１つがＬであり； 前記Ｌ基は、式：

【００２３】

【化９】

【００２４】 ｛式中： ｍ及びｍｍは、それぞれ独立して１〜１０であり； ｙは、１〜１０であり； Ｅは、Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）又はＮ＝Ｃ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）であり； Ｒ₁ 及びＲ₂ は、それぞれ独立して、Ｈ、窒素保護基、置換又は未置換Ｃ₁ 〜
Ｃ₁₀アルキル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ₁₀アルケニル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ ₁₀ アルキニルであって、前記置換基が、ＯＲ₃ 、ＳＲ₃ 、ＮＨ₃ + 、Ｎ（Ｒ₃ )(
Ｒ₄ ）、グアニジノ又はアシルであり、前記アシルが、酸、アミド又はエステル
であるか； 又は、Ｒ₁ 及びＲ₂ は、一緒になって、窒素保護基となるか、又はＮ及びＯか
ら選択される追加のへテロ原子を場合により包含する環構造になり；そして、 Ｒ₃ 及びＲ₄ は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基で
あるか、又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は、一緒になって、窒素保護基となるか、又は、Ｒ ₃ 及びＲ₄ は、結合して、Ｎ及びＯから選択される追加のへテロ原子を場合によ
り包含する環構造になる。｝のうちの一方を有する。］ のオリゴマー化合物である。

【００２５】 本発明のオリゴマー化合物のある好ましい態様では、Ｔ₁ 、Ｔ₂ 又はＴ₃ の少
なくとも１つがＬである。さらに好ましい態様では、少なくとも１つのＴ₃ がＬ
である。 本発明のオリゴマー化合物のさらに好ましい態様では、少なくとも１つのＬが
−Ｏ−（ＣＨ₂)₂ −Ｏ−Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）である。本発明のオリゴマー化合物の
さらに好ましい態様では、Ｒ₁ がＨ、又はＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、又は置換Ｃ₁ 〜
Ｃ₁₀アルキルであり、Ｒ₂ が置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルであり、好ましくは、ここ
でＲ₁ はＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである、及び／又は、Ｒ₂ はＮＨ₃ + 又はＮ（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである。本発明のオリゴマー化合物のなおさら
に好ましい態様では、Ｒ₁ 及びＲ₂ が、いずれも置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルであり
、好ましい置換基は、独立してＮＨ₃ + 又はＮ（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）である。

【００２６】 本発明のオリゴマー化合物のある好ましい態様では、Ｂｘがアデニン、グアニ
ン、ヒポキサンチン、ウラシル、チミン、シトシン、２−アミノアデニン又は５
−メチルシトシンである。 本発明のオリゴマー化合物のある好ましい態様では、Ｒ₁ 及びＲ₂ が結合して
、Ｎ及びＯから選択される少なくとも１つのへテロ原子を包含し得る環構造にな
り、好ましい環構造はイミダゾール、ピペリジン、モルホリン又は置換ピペラジ
ンであり、ここで置換基は、好ましくはＣ₁ 〜Ｃ₁₂アルキルである。 本発明のオリゴマー化合物のある好ましい態様では、Ｔ₁ が保護されたヒドロ
キシルである。本発明のオリゴマー化合物の他の好ましい態様では、Ｔ₂ が活性
化されたリン基であるか又は固形支持体への結合基である。本発明のオリゴマー
化合物のある好ましい態様では、固形支持体がミクロ粒子である。さらに好まし
い態様では、固形支持体物質がＣＰＧである。

【００２７】 本発明のオリゴマー化合物のある好ましい態様では、ＬがＢｘの環外アミノ官
能基に結合している。本発明のオリゴマー化合物の他の好ましい態様では、Ｌが
Ｂｘの環員炭素原子に結合している。 本発明のオリゴマー化合物のさらに好ましい態様では、Ｔ₄ がＢｘ−Ｌである
。なおさらに好ましい態様では、Ｂｘがアデニン、２−アミノアデニン又はグア
ニンである。本発明のオリゴマー化合物のさらに好ましい態様では、Ｂｘがピリ
ミジン複素環塩基であり、ＬがＢｘのＣ５に共有結合している。本発明のオリゴ
マー化合物のなおさらに好ましい態様では、Ｂｘがピリミジン複素環塩基であり
、ＬがＢｘのＣ４に共有結合している。本発明のオリゴマー化合物のなおさらに
好ましい態様では、Ｂｘがプリン複素環塩基であり、ＬがＢｘのＮ２に共有結合
している。本発明のオリゴマー化合物のなおさらに好ましい態様では、Ｂｘがプ
リン複素環塩基であり、ＬがＢｘのＮ６に共有結合している。

【００２８】 本発明のオリゴマー化合物のある好ましい態様では、オリゴマー化合物は５〜
５０個のヌクレオシド単位の長さである。本発明のオリゴマー化合物のさらに好
ましい態様では、オリゴマー化合物は８〜３０個のヌクレオシド単位の長さであ
り、１５〜２５個のヌクレオシド単位の長さがより好ましい。 ある好ましい態様では、連結したヌクレオシド単位の配列を含んでなる、ＤＮ
Ａ又はＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るキメラオリゴマー化合物が提供さ
れる。好ましくは、この配列は、連結したヌクレオシド単位を有する第一の領域
と２' −デオキシ糖部分を有する連結したヌクレオシド単位からなる第二の領域
に分けられる。この第一又は第二の領域の少なくとも１つの連結したヌクレオシ
ド単位がホスホロチオエート連結により結合され、第一の領域の連結したヌクレ
オシド単位の少なくとも１つが、複素環塩基又は糖部分の２' 、３' 又は５' 位
に共有結合しているＬ基を有し、そのＬ基が、式：

【００２９】

【化１０】

【００３０】 ［式中： ｍ及びｍｍは、それぞれ独立して１〜１０であり； ｙは、１〜１０であり； Ｅは、Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）又はＮ＝Ｃ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）であり； Ｒ₁ 及びＲ₂ は、それぞれ独立して、Ｈ、窒素保護基、置換又は未置換Ｃ₁ 〜
Ｃ₁₀アルキル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ₁₀アルケニル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ ₁₀ アルキニルであって、前記置換基が、ＯＲ₃ 、ＳＲ₃ 、ＮＨ₃ + 、Ｎ（Ｒ₃ )(
Ｒ₄ ）、グアニジノ又はアシルであり、前記アシルが、酸、アミド又はエステル
であるか； 又は、Ｒ₁ 及びＲ₂ は、一緒になって、窒素保護基となるか、又はＮ及びＯか
ら選択される追加のへテロ原子を場合により包含する環構造になり；そして、 Ｒ₃ 及びＲ₄ は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基で
あるか、又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は、一緒になって、窒素保護基となるか； 又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は、結合して、Ｎ及びＯから選択される追加のへテロ原子
を場合により包含する環構造になる。］の一方を有する。

【００３１】 ある好ましい態様では、第一及び第二の領域のヌクレオシド単位がホスホロチ
オエートのヌクレオシド間連結により結合している。さらに好ましい態様では、
第一の領域のヌクレオシド単位がホスホジエステルのヌクレオシド間連結により
結合し、第二の領域のヌクレオシド単位がホスホロチオエートのヌクレオシド間
連結により結合している。なおさらに好ましい態様では、第一の領域のヌクレオ
シド単位がホスホロチオエートのヌクレオシド間連結により結合し、第二の領域
のヌクレオシド単位がホスホジエステルのヌクレオシド間連結により結合してい
る。

【００３２】 ある好ましい態様では、第二の領域が少なくとも３個のヌクレオシド単位を有
する。さらに好ましい態様では、第二の領域が少なくとも５個のヌクレオシド単
位を有する。 ある好ましい態様では、キメラのオリゴマー化合物は、２' −Ｏ−アルキルが
置換されたヌクレオシド単位を有する第三の領域を有し、ここで第二の領域は第
一及び第三の領域の間に位置している。さらに好ましい態様では、第一、第二及
び第三の領域のヌクレオシド単位がホスホロチオエート連結により結合している
。さらに好ましい態様では、第一及び第三の領域のヌクレオシド単位がホスホジ
エステル連結により結合し、第二の領域のヌクレオシド単位がホスホロチオエー
ト連結により結合している。もう１つの好ましい態様では、第一及び第三の領域
のヌクレオシド単位がホスホロチオエート連結により結合し、第二の領域のヌク
レオシド単位がホスホジエステル連結により結合している。

【００３３】 ある好ましい態様では、第二の領域が少なくとも３個のヌクレオシド単位を有
する。さらに好ましい態様では、第二の領域が少なくとも５個のヌクレオシド単
位を有する。 ある好ましい態様では、第三の領域の２' −Ｏ−アルキルが置換されたヌクレ
オシド単位がＬ基を有する。 本発明のオリゴヌクレオチドを形成するヌクレオチドはリン連結により結合し
得る。好ましいリン連結には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート及びホス
ホロジチオエート連結が含まれ、ホスホジエステル及びホスホロチオエート連結
が特に好ましい。

【００３４】

【好ましい態様の詳細な説明】

本発明の数多くの目的及び効果は、付帯の図を参照すれば当業者によりよく理
解され得る。 本発明では、修飾されたヌクレオシドモノマー群とそれから製造されるオリゴ
マーが提示される。このモノマーは、２' 、３' 又は５' 糖の位置にあるか又は
複素環塩基の位置にあり得る少なくとも１つの修飾を有するヌクレオシドをそれ
ぞれ含む。本発明のヌクレオシドモノマーか又はオリゴマーのいずれかにおいて
、１箇所以上の位置が修飾され得る。本発明のオリゴマー化合物は、ＲＮＡ又は
ＤＮＡの同定又は定量すること、又はＲＮＡ又はＤＮＡ分子の活性をモジュレー
トすることに有用である。修飾されたヌクレオシドモノマーをそのなかに有する
オリゴマー化合物は、好ましくは、一本鎖又は二本鎖の標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分
子の前もって選択されたヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズし得るよう
に製造される。究極的にはその合成がモジュレートされるか又は完全に阻害され
ることになるタンパク質の産生に関わるＤＮＡ又はＲＮＡの配列を選択すること
、又はその存在、非存在又は特定量が診断テストで定量されることになるＲＮＡ
又はＤＮＡの配列を選択することが、概して所望される。

【００３５】 本発明のヌクレオシドモノマー（モノマー）は、１つ又はそれ以上のアミノオ
キシ修飾を有して製造される。修飾部位は、糖部分上の２' 、３' 及び／又は５
' 位、及び／又はモノマーの複素環塩基部分であり得る。好ましい態様では、こ
のヌクレオシドモノマーは、式：

【００３６】

【化１１】

【００３７】 ［式中： Ｔ₄ は、Ｂｘ又はＢｘ−Ｌであって、Ｂｘは複素環塩基部分であり； Ｔ₁ 、Ｔ₂ 及びＴ₃ の１つは、Ｌ、水素、ヒドロキシル、保護されたヒドロキ
シル又は糖置換基であり； Ｔ₁ 、Ｔ₂ 及びＴ₃ のもう１つは、Ｌ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシ
ル、固形支持体への結合基又は活性化されたリン基であり； Ｔ₁ 、Ｔ₂ 及びＴ₃ の残る１つは、Ｌ、水素、ヒドロキシル又は糖置換基であ
るが、Ｔ₁ 、Ｔ₂ 、Ｔ₃ 及びＴ₄ のうち少なくとも１つは、Ｌ又はＢｘ−Ｌであ
り； 前記Ｌ基は、式：

【００３８】

【化１２】

【００３９】 ｛式中： ｍ及びｍｍは、それぞれ独立して１〜１０であり； ｙは、１〜１０であり； Ｅは、Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）又はＮ＝Ｃ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）であり； Ｒ₁ 及びＲ₂ は、それぞれ独立して、Ｈ、窒素保護基、置換又は未置換Ｃ₁ 〜
Ｃ₁₀アルキル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ₁₀アルケニル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ ₁₀ アルキニルであって、前記置換基が、ＯＲ₃ 、ＳＲ₃ 、ＮＨ₃ + 、Ｎ（Ｒ₃ )(
Ｒ₄ ）、グアニジノ又はアシルであり、前記アシルが、酸、アミド又はエステル
であるか； 又は、Ｒ₁ 及びＲ₂ は、一緒になって、窒素保護基となるか、又はＮ及びＯか
ら選択される追加のへテロ原子を場合により包含する環構造になり；そして、 Ｒ₃ 及びＲ₄ は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基で
あるか、又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は一緒になって、窒素保護基となるか； 又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は、結合して、Ｎ及びＯから選択される追加のへテロ原子
を場合により包含する環構造になる。｝を有する。］ のモノマーである。

【００４０】 特定の理論に縛られたくはないが、アミノオキシ修飾オリゴマー化合物の設計
は、以下を含む数多くの要因に集中している：Ｏ_4'−Ｏ_2'ゴーシュ効果を介した
Ｃ_3'−末端コンホメーションに必要であると考えられている、２' 結合部位の陰
性原子（結合親和性を高める）；２' −置換基である−Ｏ−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −Ｏ
−のゴーシュ効果（結合親和性／ヌクレアーゼ抵抗性を高める）；Ｎ−Ｏ結合周
辺の制限された動き（側鎖のコンホメーションが制約されると考えられている、
例：カリキアマイシン）；修飾部分の親脂質性（タンパク質の結合／吸着に関連
する）；及びアミノオキシ側鎖の融合産生（fusogenic ）特性。

【００４１】 ２' −Ｏ−ジメチルアミノオキシエチル（ＤＭＡＯＥ）置換基に関連している
と考えられている要因の１つは、潜在的な融合産生特性又は「プロトンスポンジ
仮説」である。ＤＭＡＯＥの窒素は４．５〜５．０のｐＫａを有すると予測され
ている。従って、この窒素は、細胞の外側や細胞膜の中では恐らくプロトン化さ
れないが、ｐＨが５．０付近であるエンドソームの内側ではプロトン化される可
能性があると信じられている。そのようなプロトン化は、酸性の至適ｐＨを有す
るリソソームヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドのエンドソーム分解を妨げ
ると期待される。そのような「プロトンスポンジ」は、エンドソーム小胞の浸透
性を変えることが期待される。エンドソームＡＴＰアーゼにより持込まれて蓄積
したプロトンは、流入する塩素アニオンと共役する。エンドソーム内でＤＭＡＯ
Ｅオリゴヌクレオチドが濃縮すると、エンドソーム内のイオン濃度が高まり、エ
ンドソームの浸透圧膨張をもたらす。さらに、ＤＭＡＯＥのプロトン化は、内部
の電荷反発も起こすと考えられている。上記効果のいずれもがエンドソームの融
合を引き起こし、オリゴヌクレオチドを細部質へ放出させると考えられている。
オリゴヌクレオチドは、細胞質に存在したならば、容易に核へ輸送されるはずで
ある。

【００４２】 本発明のオリゴヌクレオチドは、モジュレーションのために選択される標的Ｒ
ＮＡ又はＤＮＡのヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズし得るように適合
されていることが好ましい。本発明の１つ又はそれ以上の態様を実践するのに特
に適したオリゴヌクレオチドは、２' 、３' 又は５' 糖が修飾されているか又は
複素環塩基が修飾されているオリゴヌクレオチドを含み、ここでこの修飾はアミ
ノオキシ部分である。例えば、オリゴヌクレオチドは、複数の置換を含有するよ
うに修飾され、それには上記「Ｌ」を定義する式に示されたような修飾されたヌ
クレオシド単位を１つ又はそれ以上取込むことが含まれるが、それに限定されな
い。修飾されたヌクレオシド化合物は、オリゴヌクレオチド骨格内の連結により
オリゴヌクレオチドの内部に位置付けられるか、又はオリゴヌクレオチドの３'
及び５' 終末端の一方又は両方に位置づけられ得る。

【００４３】 本発明のヌクレオシドモノマーには、活性化されたリン酸基及び活性化された
亜リン酸基のような適切な活性化されたリン基が含まれ得る。本明細書で使用さ
れるように、活性化されたリン酸基及び活性化された亜リン酸基という用語は、
他のモノマー又はオリゴマー化合物のヒドロキシル基と反応してリン含有ヌクレ
オチド間連結を形成する活性化モノマー又はオリゴマーを意味する。そのような
活性化されたリン基はＰ^III 又はＰ^V 価状態の活性化された原子を含有する。そ
のような活性化されたリン基は当技術分野で知られていて、限定しないが、ホス
ホロアミダイト、Ｈ−ホスホネート及びリン酸トリエステルを包含する。好まし
い固相合成では活性化されたリン酸としてホスホロアミダイトが利用される。ホ
スホロアミダイトではＰ^III 化学が利用される。続いて、中間体の亜リン酸化合
物が既知の方法を用いてＰ^V 状態へ酸化され、好ましい態様において、ホスホジ
エステル又はホスホロチオエートのヌクレオチド間連結を生じる。追加の活性化
されたリン酸及び亜リン酸は Tetrahedron Report Number 309 (Beaucage and I
yer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311 に開示されている。

【００４４】 本発明のオリゴマー（オリゴマー化合物）は、好便にも機知の方法論の固相合
成を用いて合成され、好ましくは標的ＲＮＡ又はＤＮＡの前もって選択されたヌ
クレオチド配列に相補的であるか又はそれと特異的にハイブリダイズし得るよう
に設計される。オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体を合成するた
めの標準的な液相及び固相法は当業者によく知られている。上記の方法は、上記
の複雑な化合物を合成するのに必要とされる時間及びコストを低減させるやり方
で絶えず改良されている。代表的な液相技術は、１９９３年５月１１日発行の米
国特許第５，２１０，２６４号に記載されていて、本発明とともに譲渡されてい
る。標準的なホスホロアミダイト化学を活用するオリゴヌクレオチド及びオリゴ
ヌクレオチド類似体の合成に利用される代表的な固相技術は、Protocols For Ol
igonucleotides And Analogs, Agrawal, S., ed., Humana Press, Totowa, NJ,
1993に記載されている。

【００４５】 本発明のオリゴマー化合物には、配された連結により結合しているヌクレオシ
ドを含み、その配列が少なくとも２つの領域に分けられるものが含まれる。ある
好ましい態様では、第一タイプの連結により連結した２' −アミノオキシアルキ
ル置換ヌクレオシドが第一の領域に含まれ、第二タイプの連結により連結したヌ
クレオシドが第二の領域に含まれる。ある好ましい態様では、本発明のオリゴマ
ーは、第一の領域に用いられるようなヌクレオシドからなる第三の領域をさらに
包含し、第二の領域が第一の領域と第三の領域との間に位置づけられる。そのよ
うなオリゴマー化合物は「キメラ」、「キメラの」又は「ギャップのある」オリ
ゴヌクレオチドとして知られている。（例えば、１９９７年４月２２日発行の米
国特許第５，６２３，０６５号を参照のこと。この内容は参照により本明細書に
組込まれている。）

【００４６】 ＧＡＰ（ギャップ）マー技術は、ホスホロチオエートの「ギャップ」をＲＮア
ーゼＨの活性化中心に残したままオリゴマー化合物の両端（「ウィング」）で修
飾を取込むように開発されてきた（Cook, P. D., Anti-Cancer Drug Des., 1991
, 6, 585-607; Monia et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 14514-14522）。最
近の報告書では、ＨＵＶＥＣ細胞にあるヒトＩＣＡＭ−１転写物の５' −キャッ
プ領域に対してアンチセンスである、均一に２' −Ｏ修飾された２０マーのＲＮ
アーゼＨ非依存的オリゴヌクレオチドと元の２' −デオキシホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドが比較された（Baker et al., J. Bio. Chem., 1997, 272,
11994-12000 を参照のこと）。元のＰ＝Ｓオリゴヌクレオチド類似体のＩＣ₅₀が
６．５ｎＭ（Ｔｍ＝７９．２℃）であったのに対し、この２' −ＭＯＥ／Ｐ＝Ｏ
オリゴマーのＩＣ₅₀は２．１ｎＭ（Ｔｍ＝８７．１℃）で、最大の活性を示した
。活性と結合親和性との相関性は必ずしも見られなかった。２' −Ｆ／Ｐ＝Ｓ（
Ｔｍ＝８７．９℃）が２' −ＭＯＥ／Ｐ＝Ｓ（Ｔｍ＝７９．２℃）より４倍活性
が低かったからである。

【００４７】 本発明の文脈では、「オリゴマー」及び「オリゴマー化合物」という用語は、
特定の並列でともに結合した、天然に存在するか又は天然に存在しない複数のヌ
クレオシドを意味する。「オリゴマー」及び「オリゴマー化合物」には、オリゴ
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、及び非リン含有ヌクレオシド間連結
を有するキメラオリゴマー化合物が含まれる。ある好ましい態様では、本発明の
オリゴマー化合物群はそれぞれ少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを有し
、この修飾は本発明のアミノオキシ化合物である。本発明の好ましいヌクレオシ
ドはリン連結により糖部分を介して結合され、アデニン、グアニン、シトシン、
ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メ
チル、２−プロピル及び他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシ
トシン、６−アザウラシル、６−アザシトシン及び６−アザチミン、シュードウ
ラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオ
ールアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン及び他の
８位置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグア
ニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン及び他の８位置換
グアニン、他のアザ及びデアザウラシル、他のアザ及びデアザチミジン、他のア
ザ及びデアザシトシン、他のアザ及びデアザアデニン、他のアザ及びデアザグア
ニン、５−トリフルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシンを含有す
るものを包含する。

【００４８】 本発明に適用し得る複素環塩基部分（当技術分野では単に「塩基」と言われる
）には、天然及び非天然に存在するヌクレオ塩基及び複素環が両方含まれる。本
明細書で使用されるように、「未修飾の」又は「天然の」ヌクレオ塩基には、プ
リン塩基のアデニン及びグアニン、ピリミジン塩基のチミン、シトシン及びウラ
シルが含まれる。修飾されたヌクレオ塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ
−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−ア
ミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、ア
デニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル
、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−
プロピルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−
ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８
−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８位置換アデニン及
びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５位
置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−
アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニ
ン、及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンのような他の合成及び天然
のヌクレオ塩基が含まれる。さらなるヌクレオ塩基には、米国特許第３，６８７
，８０８号に開示されるもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And
Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 19
90に開示されるもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Ed
ition, 1991, 30, 613に開示されるもの、及び Sanghvi, Y. S., Chapter 15, A
ntisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Leb
leu, B., ed., CRC Press, 1993 に開示されるものが含まれる。これらヌクレオ
塩基のあるものは本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるのに特
に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラ
シル及び５−プロピニルシトシンを包含する、５位が置換されたピリミジン、６
−アザピリミジン、及びＮ−２、Ｎ−６、Ｏ−６位が置換されたプリンが含まれ
る。５−メチルシトシンの置換は核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃高める
ことが示され（Id., pages 276-278）、目下のところでは好ましい塩基置換であ
る。２' −メトキシエチル糖修飾と一緒になると、特にずっと好ましい。

【００４９】 上記の注目すべき修飾されたヌクレオ塩基、並びに他の修飾されたヌクレオ塩
基のいくつかの製造を教示する代表的な米国特許は、限定しないが、上記の米国
特許第３，６８７，８０８号、並びに米国特許第４，８４５，２０５号；第５，
１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，
３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，
４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，
５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，
５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号及び第５
，６８１，９４１号を包含する。このうちあるものは本出願とともに所有され、
これらはいずれも参照により本明細書に組込まれていて、１９９６年１２月１０
日に出願された米国特許出願０８／７６２，４８８号（参照により本明細書に組
込まれている）とともに所有されている。

【００５０】 好ましい糖部分はデオキシリボース又はリボースである。しかしながら、当技
術分野で知られている他の糖置換も本発明に適用可能である。 本明細書で使用されるように、「糖置換基」という用語は、本発明の化合物又
はオリゴマーの糖部分に付く基を意味する。糖置換基は糖の２' 、３' 及び５'
位に共有結合する。ある好ましい態様では、糖置換基は、糖の２' 、３' 及び／
又は５' −炭素原子に直接結合した酸素原子を有する。好ましくは、糖置換基は
２' 位で付くが、糖置換基はまた３' 及び５' 位にも位置づけられ得る。

【００５１】 本発明に適用し得る糖置換基には、フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルア
ミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護されたＯ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキル
アミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾール、及び式（Ｏ−アルキル）_m （ｍは
１〜約１０である）のポリエーテルが含まれる。上記ポリエーテルのなかで好ま
しいのは、線状及び環状のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、クラウンエーテ
ルのような（ＰＥＧ）含有基、及び Ouchi, et al., Drug Design and Discover
y 1992, 9, 93; Ravasio et al., J. Org. Chem. 1991, 56, 4329,及び Delgard
et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9, 2
49に開示されるものである（これらはいずれもそのまま参照により本明細書に組
込まれている）。さらなる糖置換は Cook, P. D., Anti-Cancer Drug Design, 1
991, 6, 585-607 に開示されている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルア
ミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキル及びアルキルア
ミノ置換は、Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2'
and 5' Substitutions という発明の名称で１９９５年３月６日に出願された米
国特許第出願第０８／３９８，９０１号（そのまま参照により本明細書に組込ま
れている）に記載されている。

【００５２】 本発明に適用可能な追加の糖置換基には、−ＳＲ及び−ＮＲ₂ 基が含まれるが
、ここで各々のＲは、独立して、水素、保護基、又は置換若しくは未置換アルキ
ル、アルケニル又はアルキニルである。２' −ＳＲヌクレオシドは、１９９７年
９月２３日発行の米国特許第第５，６７０，６３３号（そのまま参照により本明
細書に組込まれている）に開示されている。２' −ＳＲモノマーシンソンの取込
みについては Ham et al., J. Org. Chem., 1997, 62, 3415-3420 に開示されて
いる。２' −ＮＲ₂ ヌクレオチドは、Goettingen, M., J. Org. Chem., 1996, 6
1, 6273-6281; 及び Polushin et al., Tetrahedron Lett., 1996, 37, 3227-32
30に開示されている。 本発明に適用可能なさらに代表的な糖置換基には、式Ｉ又はII：

【００５３】

【化１３】

【００５４】 〔式中、 Ｚ₀ は、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり； Ｅは、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、Ｎ（Ｒ₄ )(Ｒ₅ ）又はＮ＝Ｃ（Ｒ₄ )(Ｒ₅ ）であ
り； Ｒ₄ 及びＲ₅ は、それぞれ独立して、Ｈ、窒素保護基、置換又は未置換Ｃ₁ 〜
Ｃ₁₀アルキル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ₁₀アルケニル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ ₁₀ アルキニルであって、前記置換基は、ＯＲ₆ 、ＳＲ₆ 、ＮＨ₃ + 、Ｎ（Ｒ₆ )(
Ｒ₇ ）、グアニジノ又はアシルであり、前記アシルは、酸、アミド又はエステル
であるか； 又は、Ｒ₄ 及びＲ₅ は、一緒になって、窒素保護基となるか、又は結合して、
Ｎ及びＯから選択される追加のへテロ原子を場合により包含する環構造になり；
そして、 Ｒ₆ 及びＲ₇ は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基で
あるか、又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は一緒になって、窒素保護基となるか； 又は、Ｒ₆ 及びＲ₇ は、結合して、Ｎ及びＯから選択される追加のへテロ原子
を場合により包含する環構造になり； Ｒ₃ はＯＸ、ＳＸ又はＮ（Ｘ）₂ であり； 各々のＸは、独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₈ アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₈ ハロアルキル、
Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚ
であり； ＺはＨ又はＣ₁ 〜Ｃ₈ アルキルであり； Ｌ₁ 、Ｌ₂ 及びＬ₃ は、約４〜約７個の炭素原子を有するか、又は約３〜約６
個の炭素原子と１〜２個のヘテロ原子を有する環系を含み、ここで前記ヘテロ原
子は、酸素、窒素及びイオウから選択され、前記環系は、脂肪族、不飽和脂肪族
、芳香族であるか、又は飽和又は不飽和複素環であり； Ｙは、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキル又はハロアルキル、２〜約１
０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキニ
ル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ₄ )(Ｒ₅ ）ＯＲ₄ 、ハロ
、ＳＲ₄ 又はＣＮであり； 各々のｑ₁ は、独立して、２〜１０であり； 各々のｑ₂ は、０又は１であり； ｐは１〜１０であり；及び ｒは１〜１０である。但し、ｐが０であるとき、ｒは１より大きい。〕 の一方を有するものが含まれる。

【００５５】 式Ｉの代表的な２' −Ｏ−糖置換基は、Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotid
esという発明の名称で１９９８年８月７日に出願された米国特許第出願第０９／
１３０，９７３号（そのまま参照により本明細書に組込まれている）に開示され
ている。 式ＩＩの代表的な環状２' −Ｏ−糖置換基は、RNA Targrted 2'-Modified Oli
gonucleotides that are Conformationally Preorganizedという発明の名称で１
９９８年７月２７日に出願された米国特許第出願第０９／１２３，１０８号（そ
のまま参照により本明細書に組込まれている）に開示されている。

【００５６】 特に好ましい糖置換基には、Ｏ［（ＣＨ₂)_n Ｏ］_m ＣＨ₃ 、Ｏ（ＣＨ₂)_n ＯＣ
Ｈ₃ 、Ｏ（ＣＨ₂)_n ＮＨ₂ 、Ｏ（ＣＨ₂)_n ＣＨ₃ 、Ｏ（ＣＨ₂)_n ＯＮＨ₂ 及びＯ
（ＣＨ₂)_n ＯＮ［（ＣＨ₂)_n ＣＨ₃ ］₂ が含まれ、ここでｎ及びｍは１〜約１０
である。 本発明のある好ましいオリゴマー化合物は、以下の１つを２' 位に有するヌク
レオシドを少なくとも１つ含有する：Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀低級アルキル、置換低級アルキ
ル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、ＳＨ、
ＳＣＨ₃ 、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃ 、ＯＣＦ₃ 、ＳＯＣＨ₃ 、ＳＯ₂ ＣＨ₃ 、ＯＮＯ₂ 、ＮＯ₂ 、Ｎ₃ 、ＮＨ₂ 、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシク
ロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、Ｒ
ＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬力学
特性を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、及び同様
の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、２' −メトキシエトキシ［２'
−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＯＣＨ₃ 、２' −Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２' −Ｍ
ＯＥとしても知られる］（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486)
、即ちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾は、２' −ジメ
チルアミノオキシエトキシ、即ち２' −ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ₂) ₂ ＯＮ（ＣＨ₃ ）₂ 基であるが、これは１９９８年１月３０日に出願された、共
に所有されている米国特許出願第０９／０１６，５２０号に記載されていて、こ
の内容は参照により本明細書に組込まれている。

【００５７】 他の好ましい修飾には、２' −メトキシ（２' −Ｏ−ＣＨ₃ ）、２' −アミノ
プロポキシ（２' −ＯＣＨ₂ ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＮＨ₂ ）及び２' −フルオロ（２' −
Ｆ）が含まれる。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の部位、特に３' 終端
ヌクレオチド上又は２' −５' 連結オリゴヌクレオチド内にある糖の３' 位、及
び５' 終端ヌクレオチドの５' 位でなし得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペン
トフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模擬体を有し得る。その
ような修飾された糖構造の製造を教示する代表的な米国特許は、限定しないが、
米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０
８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１
３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１
３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７
２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０
５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８
７３号；第５，６７０，６３３号及び第５，７００，９２０号（このうちのある
ものは本出願とともに所有され、これらはいずれも参照により本明細書に組込ま
れている）を包含し、やはり参照により本明細書に組込まれている、１９９５年
６月５日に出願された米国特許出願第０８／４６８，０３７号とともに所有され
ている。

【００５８】 Ｏ−置換をリボシル環上に有する糖も本発明に適用可能である。環のＯについ
ての代表的な置換基には、限定しないが、Ｓ、ＣＨ₂ 、ＣＨＦ及びＣＦ₂ が含ま
れる。例えば、そのまま参照により本明細書に組込まれている、Secrist et al.
, Abstract 21, Program & Abstracts, Tenth International Roundtable, Nucl
eosides, Nucleotides and their Biological Applications, Park City, Utah,
Sept. 16-20, 1992を参照のこと。

【００５９】 追加の修飾がオリゴヌクレオチドの他の位置、特に３' 終端ヌクレオチド上の
糖の３' 位と５' 終端ヌクレオチドの５' 位でもなされ得る。例えば、本発明の
オリゴヌクレオチドを追加的に修飾することは、オリゴヌクレオチドの活性、細
胞内分布又は細胞内取込みを増強する、１つ又はそれ以上の部分又は結合体をオ
リゴヌクレオチドへ化学的に連結することを含む。そのような部分には、限定し
ないが、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., US
A, 1989, 86, 6553 ）のような脂質部分、コール酸（Manoharan et al., Bioorg
. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053 ）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−
トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 30
6 ； Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765 ）、チオコ
レステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533）、脂肪
族の鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al
., EMBO J., 1991, 10, 111 ；Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327;
Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49）、リン脂質、例えばジ−ヘキサ
デシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム−１，２−ジ−Ｏ−
ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al.,
Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651 ；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990,
18 3777）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nu
cleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969）、アダマンタン酢酸（Manoharan et
al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651 ）、パルミチル部分（Mishra et al
., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）、又はオクタデシルアミン又は
ヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J.
Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923 ）が含まれる。

【００６０】 本発明の化合物には、窒素原子を包含する環構造（例えば、−Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）及び−Ｎ（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）、ここで（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）と（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）はそれぞれ
各々のＮの周りに環構造を形成する）が含まれ得る。生成する環構造は、複素環
又は複素環式の環構造であり、Ｎ、Ｏ及びＳから選択されるさらなるヘテロ原子
を包含し得る。そのような環構造は単環、二環又は三環式であり、オキソ、アシ
ル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキル、アルケニル、アルキニル、
アミノ、アミド、アジド、アリール、ヘテロアリール、カルボン酸、シアノ、グ
アニジド、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドラジノ、ＯＤＭＴ、アル
キルスルホニル、ニトロ、スルフィド、スルホン、スルホンアミド、チオール及
びチオアルコキシのような置換基で置換され得る。窒素を包含する好ましい二環
式の環構造はフタルイミドである。

【００６１】 本発明のへテロ環式環構造は、完全に飽和している、部分的に飽和している、
不飽和であるか、又は多環式複素環とともに上記の各々の環は可能な飽和状態の
いずれかであり得る。本発明のへテロ環式環構造にはヘテロアリールも含まれる
が、それには１つ又はそれ以上の縮合環がヘテロ原子を含有しない系が含まれる
。本発明によれば、窒素へテロ環を含む複素環には、限定しないが、イミダゾー
ル、ピロール、ピラゾール、インドール、１Ｈ−インダゾール、α−カルボリン
、カルバゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、テトラゾール、トリアゾー
ル、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン及びモルホリン基が含まれる。より好
ましい窒素へテロ環の群には、イミダゾール、ピロール、インドール及びカルバ
ゾール基が含まれる。

【００６２】 本発明は、複数の連結ヌクレオシドを含んでなるオリゴマー化合物を提供し、
ここで好ましいヌクレオシド環連結は３' −５' 連結である。他のやり方では、
（１９９８年７月１４日出願の米国特許出願第０９／１１５，０４３号に記載の
ように）２' −５' 連結も使用し得る。２' −５' 連結は、あるヌクレオチドサ
ブユニットの糖部分の２' 位をその隣接ヌクレオチドサブユニットの糖部分の５
' 位と結合させるものである。 本発明のオリゴヌクレオチドは約５〜約５０個の塩基の長さである。本発明の
オリゴヌクレオチドは８〜約３０個の塩基を有することがより好ましく、約１５
〜約２５個の塩基が利用されることがさらにより好ましい。

【００６３】 本発明のヌクレオシドモノマーをオリゴヌクレオチドのなかに位置づける場合
、適切にブロックないし活性化されているモノマーが、通常にブロックないし活
性化されている標準ヌクレオチドを取込むための標準法でオリゴヌクレオチドに
取込まれる。例を挙げると、例えばフタルイミド保護基で保護されているアミノ
オキシ部分を有するジイソプロピルホスホロアミダイトのヌクレオシドモノマー
が選択される。さらに、このヌクレオシドモノマー分子のヒドロキシル基の１つ
、例えば５' −ヒドロキシルがジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基で保護され
、他のヒドロキシル基（つまり、３' −ヒドロキシル基）はシアノエチル保護基
を担う。このヌクレオシドモノマーは、伸張するオリゴヌクレオチドにホスホロ
アミダイト部分を反応させる、当技術分野で知られているような通常の活性化剤
で処理することによって、伸張するオリゴヌクレオチドへ加えられる。これに続
いて、当技術分野で知られているように、標準法でＤＭＴ基を除去し、当技術分
野の標準である通常のヌクレオチドアミダイト単位を用いてオリゴヌクレオチド
の伸張を継続する。このヌクレオシドモノマーがオリゴヌクレオチド合成時に利
用される中間体の単位である場合、このヌクレオシド性のモノマーヌクレオシド
はオリゴヌクレオチドの内部に位置づけられる。このヌクレオシドモノマーがオ
リゴヌクレオチドに連結した最終単位である場合、このヌクレオシドモノマーは
オリゴヌクレオチドの５' 最終端部分を形成する。本発明のオリゴマー化合物を
製造する、当技術分野でよく知られている他の方法は多数ある。上記のホスホロ
アミダイト法はこれらの方法の１つを例示するためのものである。

【００６４】 本明細書の文脈では、アルキル（一般にＣ₁ 〜Ｃ₁₀）、アルケニル（一般にＣ ₂ 〜Ｃ₁₀）及びアルキニル（一般にＣ₂ 〜Ｃ₁₀）基には、限定しないが、飽和及
び不飽和の直鎖、分岐鎖及び脂環式の炭化水素が含まれ、それにはメチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ペンチル、へキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デ
シル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキ
サデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル及び他の高級
炭素アルキル基が含まれる。さらなる例には、２−メチル−プロピル、２−メチ
ル−４−エチルブチル、２，４−ジエチルブチル、３−プロピルブチル、２，８
−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチルオク
チル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチ
ルヘキシル及び他の分岐鎖基、アリル、クロチル、プロパルジル、２−ペンテニ
ル及びπ結合を含有する他の不飽和基、シクロヘキサン、シクロペンタン、アダ
マンタン、並びに他の脂環式基、３−ペンテン−２−オン、３−メチル−２−ブ
タノール、２−シアノオクチル、３−メトキシ−４−ヘプタナール、３−ニトロ
ブチル、４−イソプロポキシドデシル、４−アジド−２−ニトロデシル、５−メ
ルカプトノニル、４−アミノ−１−ペンテニル、並びに他の置換された基が含ま
れる。

【００６５】 さらに、本発明の文脈では、直鎖の化合物は、脂肪族化合物のような開鎖化合
物を意味し、アルキル、アルケニル又はアルキニル化合物が含まれ；本明細書で
使用されるような低級アルキル、アルケニル又はアルキニル化合物には、限定し
ないが、約１〜約６個の炭素原子からなるヘテロカルビル化合物が含まれる。本
明細書で使用するように、分岐鎖の化合物は、アルキル、アルケニル、アルキニ
ル化合物のような直鎖の化合物を含み、直鎖の炭素原子に付いた直鎖又は分岐鎖
をさらに有する。本明細書で使用されるような環式化合物は、閉鎖化合物、つま
り脂環式又は芳香族の化合物のような炭素原子の環を意味する。直鎖、分岐鎖又
は環式の化合物は、アルコキシ又は複素環式化合物にあるように、内側で中断さ
れ得る。本発明の文脈では、「内側で中断される」とは炭素鎖がＯ、Ｎ又はＳの
ようなヘテロ原子で中断され得ることを意味する。しかしながら、所望されるな
らば、炭素鎖にはヘテロ原子を有さなくてもよい。

【００６６】 本発明の１つの側面では、ヌクレオシドモノマーに付くアルキル基の全体の長
さは、そのアルキル基の両端間に位置付けられるアミノオキシ基が１１個より少
ないように選択される。本発明のある好ましいヌクレオシドモノマーでは、少な
くとも２つのメチレン基の付いたアミノオキシ基をそれとヌクレオシドモノマー
のヒドロキシル基の一方との間に位置付けることが好ましい。このことは、メチ
レン単位をアルキル骨格か又はアミノオキシ側鎖のいずれかと結合させることに
よって達成され得る。そのように位置付けられると、アミノオキシ部分の酸素原
子とヒドロキシル基の酸素原子とはアセタールタイプの構造を形成しない。他の
態様では、アミノオキシ部分は、唯１つのメチレン基を有し、それとヒドロキシ
ル基の一方又は他方との間に位置付けられ、アセタールタイプの構造を形成する
。

【００６７】 本発明の置換されたヌクレオシドモノマーでは、第一に好ましい置換基の群に
２' −Ｏ−アミノオキシアルキル置換基が含まれる。次に好ましい置換基の群に
は、２' −Ｏ−アルキルアミノオキシアルキル、２' −Ｏ−ジ−アルキルアミノ
オキシアルキル及び２' −Ｏ−モノアルキルアミノオキシアルキル、例えばジメ
チルアミノオキシエチル及びエチルアミノオキシエチルが含まれる。追加の好ま
しい置換基群には、上記２' −Ｏ−アミノオキシアルキル置換基の前駆体又はブ
ロックされた形態が含まれ、それにはフタルイミド及びホルムアルデヒドの付加
物、即ち、フタルイミド−Ｎ−オキシ及びホルマルオキシミル基が含まれる。よ
り好ましい置換基の群には、アミノ基が１つ又はそれ以上の置換アルキル基で置
換されている２' −アミノオキシアルキルが含まれるが、ここで好ましい置換基
はアミノ及び置換アミノである。

【００６８】 本発明のある好ましい態様では、オリゴマー化合物がリン連結を介して連結し
ている。好ましいリン連結には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート及びホ
スホロジチオエート連結が含まれる。本発明の１つの好ましい態様では、ホスホ
ロチオエートのヌクレオシド間連結を活用することによって、オリゴヌクレオチ
ドにヌクレアーゼ抵抗性が付与される。 本明細書で使用されるように、オリゴヌクレオチドという用語には、非リン連
結部分を有する２個又はそれ以上のヌクレオシドサブユニットを含有するオリゴ
マー又はポリマーが含まれる。本発明によるオリゴヌクレオチドは、複素環塩基
部分にグリコシル結合を介して付いたリボフラノース部分を有するモノマーサブ
ユニット又はヌクレオシドを有する。

【００６９】 オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドは、キメラ性のオリゴマー化合物
をもたらすように結合し得る。天然に存在するホスホジエステル連結基に加えて
、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及びオリゴマーキメラ化合
物（オリゴマー化合物）を製造するために使用し得るリン含有連結基及びリンを
含有しない連結基は先行技術において十分記述されていて、限定しないが、以下
を包含する：

【００７０】リンを含有する連結 ： ホスホロジチオエート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ)(Ｓ）−Ｏ−）； ホスホロチオエート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ)(Ｏ）−Ｏ−）； ホスホロアミデート（−Ｏ−Ｐ（Ｏ)(ＮＪ）−Ｏ−）； ホスホネート（−Ｏ−Ｐ（Ｊ)(Ｏ）−Ｏ−）； ホスホトリエステル（−Ｏ−Ｐ（ＯＪ)(Ｏ）−Ｏ−）； ホホスホロアミデート（−Ｏ−Ｐ（Ｏ)(ＮＪ）−Ｓ−）； チオノアルキルホスホネート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ)(Ｊ）−Ｏ−）； チオノアルキルホスホトリエステル（−Ｏ−Ｐ（Ｏ)(ＯＪ）−Ｓ−）； ボラノリン酸（−Ｒ⁵ −Ｐ（Ｏ)(Ｏ）−Ｊ−）；

【００７１】リンを含有しない連結 ： チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）； チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ)(ＮＪ）−Ｓ−）； シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｊ）₂ −Ｏ−）； カルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−及び−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）； スルファメート（−Ｏ−Ｓ（Ｏ)(Ｏ）−Ｎ−及び−Ｎ−Ｓ（Ｏ)(Ｏ）−Ｎ−）
； モルホリノスルファミド（−Ｏ−Ｓ（Ｏ)(Ｎ（モルホリノ）−）； スルホンアミド（−Ｏ−ＳＯ₂ −ＮＨ−）； スルフィド（−ＣＨ₂ −Ｓ−ＣＨ₂ −）； スルホネート（−Ｏ−ＳＯ₂ −ＣＨ₂ −）； Ｎ，Ｎ' −ジメチルヒドラジン（−ＣＨ₂ −Ｎ（ＣＨ₃ ）−Ｎ（ＣＨ₃ ）−）
； チオホルムアセタール（−Ｓ−ＣＨ₂ −Ｏ−）； ホルムアセタール（−Ｏ−ＣＨ₂ −Ｏ−）； チオケタール（−Ｓ−Ｃ（Ｊ）₂ −Ｏ−）；及び ケタール（−Ｏ−Ｃ（Ｊ）₂ −Ｏ−）； アミン（−ＮＨ−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −）； ヒドロキシルアミン（−ＣＨ₂ −Ｎ（Ｊ）−Ｏ−）； ヒドロキシルイミン（−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−）；及び ヒドラジニル（−ＣＨ₂ −Ｎ（Ｈ）−Ｎ（Ｈ）−）； 「Ｊ」は、通常水素又はアルキル基である置換基を指すが、連結のタイプによ
り異なるより複雑な基であり得る。

【００７２】 天然に存在する連結の−Ｏ−Ｐ（Ｏ）₂ −Ｏ−原子の１つ又はそれ以上の修飾
又は置換に関わる上記の連結基に加え、本発明の範囲内には、天然に存在する連
結の１つ又はそれ以上の原子だけでなく５' −メチレン基の修飾を包含する連結
基が含まれる。このタイプの連結は文献に十分記載されていて、限定せずに、以
下を包含する： アミド（−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ））及び−ＣＨ₂ −Ｏ−Ｎ＝Ｃ
Ｈ−；及び リンアルキル（−Ｃ（Ｊ)₂−Ｐ（＝Ｏ)(ＯＪ）−Ｃ（Ｊ)₂−Ｃ（Ｊ)₂−）。 ここで、Ｊは上記の通りである。

【００７３】 上記の置換ヌクレオシド間連結の合成についての合成スキームは、以下に開示
されている：ＷＯ９１／０８２１３号；ＷＯ９０／１５０６５号；ＷＯ９１／１
５５００号；ＷＯ９２／２０８２２号；ＷＯ９２／２０８２３号；ＷＯ９１／１
５５００号；ＷＯ８９／１２０６０号；ＥＰ２１６８６０号；ＵＳ９２／０４２
９４号；ＵＳ９０／０３１３８号；ＵＳ９１／０６８５５号；ＵＳ９２／０３３
８５号；ＵＳ９１／０３６８０号；米国特許第０７／９９０，８４８号；第０７
／８９２，９０２号；第０７／８０６，７１０号；第０７／７６３，１３０号；
第０７／６９０，７８６号；第５，４６６，６７７号；第５，０３４，５０６号
；第５，１２４，０４７号；第５，２７８，３０２号；第５，３２１，１３１号
；第５，５１９，１２６号；第４，４６９，８６３号；第５，４５５，２３３号
；第５，２１４，１３４号；第５，４７０，９６７号；第５，４３４，２５７号
；Stirchak, E. P., et al., Nucleic Acid Res., 1989, 17, 6129-6141; Hewi
tt, J. M. et al., 1992, 11, 1661-1666; Sood, A., et al., J. Am. Chem. So
c., 1990, 112, 9000-9001; Vaseur, J. J., et al., J. Amer. Chem. Soc., 19
92, 114, 4006-4007; Musichi, B., et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 4231-4
233; Reynolds, R. C., et al., J. Org. Chem., 1992, 57, 2983-2985; Mertes
, M. P. et al., J. Med. Chem., 1969, 12, 154-157; Mungall, W. S., et al.
, J. Org. Chem., 1977, 42, 703-706; Stirchak, E. P., et al., J. Org. Che
m., 1987, 52, 4202-4206; Coull, J. M., et al., Tet. Lett., 1987, 28, 745
; 及び Wang, H., et al., Tet. Lett., 1991, 32, 7385-7388。

【００７４】 ヌクレオチドの糖、塩基、又はリン酸基に対して他の置換をなし得る。代表的
な置換は、１９９１年７月２５日公開の国際公開特許番号ＷＯ９１／１０６７１
号、１９９２年２月２０日公開のＷＯ９２／０２２５８号、１９９２年３月５日
公開のＷＯ９２／０３５６８号、及び米国特許第５，１３８，０４５号、第５，
２１８，１０５号、第５，２２３，６１８号、第５，３５９，０４４号、第５，
３７８，８２５号、第５，３８６，０２３号、第５，４５７，１９１号、第５，
４５９，２５５号、第５，４８９，６７７号、第５，５０６，３５１号、第５，
５４１，３０７号、第５，５４３，５０７号、第５，５７１，９０２号、第５，
５７８，７１８号、第５，５８７，３６１号、第５，５８７，４６９号に開示さ
れ、これらはすべて本出願の譲渡人へ譲渡されている。上記参考文献のいずれの
開示内容も参照により本明細書に組込まれている。

【００７５】 オリゴヌクレオチド及びその類似体へコンジュゲート基を付けることは先行技
術において十分文書化されている。本発明の化合物には、１級又は２級ヒドロキ
シル基のような官能基に共有結合しているコンジュゲート基を包含し得る。本発
明のコンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン
、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特
性を増強する基、オリゴマーの薬物動態特性を増強する基が含まれる。典型的な
コンジュゲート基には、コレステロール、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フ
ェナンスリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、
クマリン及び染料がある。薬力学特性を増強する基には、本発明の文脈では、オ
リゴマーの取込みを向上させ、分解に対するオリゴマー抵抗性を増強し、及び／
又はＲＮＡに対する配列特異的なハイブリダイゼーションを強める基が含まれる
。薬物動態特性を増強する基には、本発明の文脈では、オリゴマーの取込み、分
布、代謝又は排泄を向上させる基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、１
９９２年１０月２３日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号、１
９９７年７月１日発行の米国特許第５，５７８，７１８号、及び米国特許第５，
２１８，１０５号に開示されている。上記はいずれも本出願とともに譲渡されて
いる。それぞれの開示内容はすべて参照により本明細書に組込まれている。

【００７６】 アンチセンス特性を修飾するための他の基には、ＲＮＡ開裂複合体、ピレン類
、金属キレート剤、ポルフィリン、アルキル化剤、ハイブリッドインターカレー
ター／リガンド及び光架橋剤が含まれる。ＲＮＡ開裂剤には、ｏ−フェナントロ
リン／Ｃｕ複合体とＲｕ（ビピリジン）₃2+ 複合体が含まれる。Ｒｕ（ｂｐｙ） ₃ 2+ 複合体は核酸と相互作用して、光化学的に核酸を開裂する。金属キレート剤
にはＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ及びｏ−フェナントロリンが含まれる。アルキル化剤に
は、ヨードアセトアミドのような化合物が含まれる。ポルフィリンには、ポルフ
ィン、その置換された形態、及び金属複合体が含まれる。ピレン類にはピレン及
び、同様のプロトコールを用いて結合し得る他のピレンベースのカルボン酸が含
まれる。

【００７７】 ハイブリッドインターカレーター／リガンドには、光ヌクレアーゼ／インター
カレーターリガンドの６−［［［９−［［６−（４−ニトロ−ベンズアミド）へ
キシル］アミノ］アクリジン−４−イル］カルボニル］アミノ］ヘキサノイル−
ペンタフルオロフェニルエステルが含まれる。この化合物には、インターカレー
ターであるアクリジン部分と光ヌクレアーゼであるｐ−ニトロベンズアミド基と
いう２つの注目すべき特徴がある。 光架橋剤には、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジド安息香
酸塩（ＨＳＡＢ）及びＮ−スクシンイミジル−６（−４' −アジド−２' −ニト
ロフェニル−アミノ）ヘキサン酸塩（ＳＡＮＰＡＨ）のようなアリールアジドが
含まれる。オリゴヌクレオチドに結合したアリールアジドは、照射されると、核
酸及びタンパク質との架橋形成をもたらす。それらはまた（ＫＬＨ又はＢＳＡの
ような）担体タンパク質とも架橋形成し、オリゴヌクレオチドに対する抗体を産
生させる。

【００７８】 本発明によるビタミンは、一般に水溶性又は脂溶性として分類され得る。水溶
性ビタミンには、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸又はナイアシン、ビタミ
ンＢ₆ ピリドキサール群、パントテン酸、ビオチン、葉酸、Ｂ₁₂コバミド補酵素
、イノシトール、コリン及びアスコルビン酸が含まれる。脂溶性ビタミンには、
ビタミンＡファミリー、ビタミンＤ、ビタミンＥトコフェロールファミリー及び
ビタミンＫ（及びフィトール類）が含まれる。レチノール酸とレチノールを含む
ビタミンＡファミリーは、細胞質レチノール結合タンパク質ＩＩ型（ＣＲＢＰ−
ＩＩ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）及び細胞内レチノール結合タンパ
ク質（ＣＲＢＰ）のような特定タンパク質との相互作用を通して標的組織へ吸収
及び輸送される。これらのタンパク質は、人体の様々な部分で見出されてきたが
、約１５ｋＤの分子量を有する。それらは、ビタミンＡファミリーの化合物、特
にレチノール酸及びレチノールと特定の相互作用をする。

【００７９】 本発明の文脈では、「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン−クリック、フ
ーグスティーン又は逆フーグスティーン型の水素結合であり得る、相補的なヌク
レオチド間の水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形
成を介して対合する相補的なヌクレオ塩基である。本明細書で使用されるように
、「相補的」はまた、２つのヌクレオチド間の配列相補性を意味する。例えば、
オリゴヌクレオチドのある位置にあるヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同
じ位置にあるヌクレオチドと水素結合し得る場合、このオリゴヌクレオチドとＤ
ＮＡ又はＲＮＡはその位置で互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオ
チドとＤＮＡ又はＲＮＡが互いに相補的であるのは、各々の分子内の対応する位
置の十分な数が互いに水素結合し得るヌクレオチドに占められるときである。こ
のように、「特異的にハイブリダイズし得る」及び「相補的」とは、オリゴヌク
レオチドとＤＮＡ又はＲＮＡ標的との間に安定で特異的な結合が起こるほど十分
な程度の相補性を明示するために使用される。特異的にハイブリダイズし得るの
に、オリゴヌクレオチドは、その標的ＤＮＡ配列に対して１００％相補的である
必要はないと理解されている。オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズし
得るのは、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対するこのオリゴヌクレオチドの結合が
標的ＤＮＡ又はＲＮＡの正常機能に干渉するとき、及び特異的な結合が所望され
る条件、即ちin vivo アッセイ又は治療処置の場合の生理学的条件、又はin vit
roアッセイでアッセイが実施される条件の下で、非標的配列に対するオリゴヌク
レオチドの非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性があるときである
。

【００８０】 核酸分解（nucleolytic ）酵素によるオリゴヌクレオチドの開裂には、酵素−
基質複合体、特に、ヌクレアーゼ−オリゴヌクレオチド複合体の形成が必要とさ
れる。一般にヌクレアーゼ酵素は、適切に付着するために、オリゴヌクレオチド
上に位置づけられる特定の結合部位を必要とする。ヌクレアーゼがオリゴヌクレ
オチドに付着し得ないようにこのオリゴヌクレオチド結合部位を除去又はブロッ
クすると、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ抵抗性になる。配列特異的なパリ
ンドローム二本鎖ＤＮＡを開裂する制限エンドヌクレアーゼの場合、３位及び７
位の環窒素のようなある結合部位が要求される結合部位として同定された。これ
らの部位の１つ又はそれ以上を除去するか、オリゴヌクレオチド内のこれらの特
定部位に対するヌクレアーゼの接近を立体的にブロックすると、特定のヌクレア
ーゼに対して様々なレベルの抵抗性がもたらされる。

【００８１】 本発明は優れたハイブリダイゼーション特性を有するオリゴヌクレオチドを提
供する。構造活性相関の試験から、ある２' −糖修飾オリゴヌクレオチドのＲＮ
Ａ標的（相補体）に対する結合（Ｔｍ）の増加がヘテロ二重鎖の「Ａ」タイプコ
ンホメーションの増加と相関することが示された。さらに、修飾されたオリゴヌ
クレオチドの絶対フィデリティは維持されている。本発明の２' 糖修飾配列特異
的オリゴヌクレオチドの結合性が高まると、文献に知られているメチルホスホネ
ート、リン酸トリエステル及びホスホロアミデートのようなリン修飾オリゴヌク
レオチドに比較して、より優れた強度及び特異性を提供する。

【００８２】 ＤＮＡ及びＲＮＡ二重鎖の間にある唯一の構造上の違いは、（ウラシル環系の
メチル基の有無は影響しないという前提で）ＲＮＡ分子では糖部分の２' 位がヒ
ドロキシル基であるのに対し、ＤＮＡ分子では糖部分の２' 位が水素原子である
ことである。しかしながら、ＤＮＡ及びＲＮＡ二重鎖の間には全体的なコンホメ
ーションに違いがある。

【００８３】 核酸繊維のＸ線回折分析（Arnott and Hukins, Biochem. Biophys. Res. Comm
., 1970, 47, 1504 ）と二本鎖核酸の結晶解析とから、ＤＮＡが「Ｂ」型構造を
とり、ＲＮＡはより強固な「Ａ」型構造をとることが知られている。二本鎖核酸
間の主要なコンホメーション上の違いは、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドの糖の
すぼみ（puckering ）間の違い（ＤＮＡは「Ｂ」のＣ２' 末端により形成され、
ＲＮＡは「Ａ」のＣ３' 末端により形成される）なのである。

【００８４】 ペントフラノシル部分のコンホメーションの主因となるのは２' 位の置換基の
性質である。つまり、２' −置換基の電気陰性度が高まるにつれて、Ｃ２' −末
端型に対してＣ３' −末端型の集団が増加する。例えば、２' −デオキシ−２'
−ハロアデノシン群の中では、Ｃ３' −末端型の集団が最大（６５％）を示すの
は２' −フルオロ誘導体であり、最小（７％）を示すのは２' −ヨードである。
アデノシン（２' −ＯＨ）及びデオキシ−アデノシン（２' −Ｈ）のそれはそれ
ぞれ３６％及び１９％である。さらに、アデノシンダイマー（２' −デオキシ−
２' −フルオロアデノシン−２' −デオキシ−２' −フルオロアデノシン）の２
' −フルオロ基の効果は、スタック（した）コンホメーションの安定化にさらに
関連している。研究によると、ジヌクレオシドリン酸はＡ−Ａと同様の幾何学を
有するスタックコンホメーションを有するが、Ａ−Ａよりも大きい程度の塩基−
塩基重複を有する。「Ａ」構造においてスタックコンホメーションが安定化し得
るのは、このＣ２' −Ｆ結合の高極性とＣ３' −末端のすぼみに対する極端な選
好性によると考えられている。 ＵＶ浅色効果、円二色性、及び¹ Ｈ−ＮＭＲからのデータは、また、ハロ置換
基の電気陰性度が減少するにつれてスタッキングの程度が減少することを示して
いる。さらに、糖部分の２' 位における立体バルクは「Ｂ」型二重鎖よりも「Ａ
」型２重鎖においてよりよく収容されるものである。

【００８５】 このように、ジヌクレオシドモノリン酸の３' −ヌクレオチジル単位上の２'
−置換基は、スタッキングコンホメーションに対し、立体反発、フラノースのす
ぼみ選好、静電気反発、疎水性の吸引、及び水素結合能力といった数多くの効果
を及ぼすと考えられている。これらの置換基の効果は、置換基の分子サイズ、電
気陰性度、及び疎水性によって決定されると考えられる。 ２' −デオキシグアノシン、シチジン及びウリジンジヌクレオシドリン酸の２
' −ＯＭｅ修飾についての試験は、対応する非メチル化種（２' −ＯＨ）に比較
してスタッキング効果が増強されること示す。この場合、メチル基の疎水性の吸
引力がその立体バルクの不安定化効果に勝るものであると考えられている。 ２' −置換アデノシンジリン酸では融解温度（相補的な結合）が増加する。コ
ンホメーションの３' −末端選好性と置換基の存在のいずれがこの結合性の増加
の原因であるかは明らかでない。しかしながら、３' −末端コンホメーションで
は、隣接塩基のより大きな重複（スタッキング）が達成され得る。 理論に縛られたくはないが、本発明のアミノオキシアルキル置換基はまた、Ｃ
３' −末端のすぼみがあるヌクレオシドの糖のすぼみをもたらすと考えられてい
る。

【００８６】 本発明の化合物は、診断薬、治療薬及び研究用の試薬及びキットとして活用し
得る。それらは、本発明のオリゴヌクレオチドの有効量を好適な製剤的に許容さ
れる希釈剤又は担体に加えることによって、医薬組成物において活用され得る。
それらは、さらに、所望されないタンパク質の産生により特徴づけられる疾患を
有する生物を治療するために使用され得る。その生物は、所望されないタンパク
質をコードする標的核酸の鎖に特異的にハイブリダイズし得る配列を有する本発
明のオリゴヌクレオチドと接触され得る。

【００８７】 治療組成物の製剤、及びその後続の投与は当業者の技術の範囲内にあると考え
られる。一般に、治療薬としては、そのような治療を必要とする患者へ、患者の
年齢及び治療される病態の重症度に依存して、体重ｋｇあたり０．０１μｇ〜１
００ｇの範囲の用量で、通常製剤的に許容される担体において、本発明によるオ
リゴマーが投与される。さらに、治療は、単回用量であるか又は、特定疾患の性
質、その重症度、及び患者の状態全般に応じて変化し得る期間の間続き、１日１
回から２０年に１回まで広がり得る治療方式であり得る。治療の後で、患者はそ
の状態の変化と病状の寛解についてモニターされる。オリゴマーの用量は、患者
が現行の投与量レベルに対して有意に反応しないときに増やしてよいし、又は用
量は、病状の寛解が観察されるか又は病的状態が止んだならば減らしてもよい。

【００８８】 ある症例では、本発明のオリゴマーとともに他の従来的な治療モダリティで患
者を治療することがより効果的であり得る。例えば、ＡＩＤＳの治療を受けてい
る患者へは、ＡＺＴとともにオリゴマーが投与され、また、動脈硬化症の患者で
は、処置された動脈の再閉塞を予防する血管形成術を施した後に、本発明のオリ
ゴマーで治療され得る。 投与は治療される病態の重症度と反応性に依存し、治療期間は数日から数ヶ月
、又は治療が効果を示すか又は病態の減衰が達成されるまで続く。最適な投与ス
ケジュールは、患者体内の薬物蓄積量の測定から算出され得る。当業者は、最適
投与量、投与方法及び反復率を容易に決定し得る。最適投与量は個々のオリゴマ
ーの相対効力によって変化し得るが、一般にはin vitro及びin vivo の動物モデ
ルにおいて有効とされたＥＣ₅₀に基づいて推定され得る。一般に、投与量は体重
ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日、１週、１月又は１年につき１
回又はそれ以上、又は２〜数年ごとに１回でさえ与えられ得る。

【００８９】 治療がうまくいけば、患者に維持療法を施し、病態の再発を予防することが所
望され得る。ここでオリゴマーは、体重ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇの範
囲で、１日１回又は数回に１回まで、維持用量で投与される。 本発明の医薬組成物は、局所又は全身治療のどちらが所望されかということ、
及び治療される部位に依存して、数多くの方法で投与され得る。投与は、局所投
与（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口投与又は腸管外投与であり得る
。腸管外投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内又は筋肉内注射、又は鞘内又は脳
室内投与が含まれる。

【００９０】 局所投与用の製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ド
ロップ、坐剤、スプレー、液剤及び粉末が含まれ得る。従来の製剤用担体、水性
の粉末又は油状の基剤、濃化剤等が必要であるか又は所望され得る。被覆された
コンドーム、グラブなどもまた有用であり得る。 経口投与用の組成物には、粉末又は顆粒剤、水又は非水性媒体に溶けた懸濁液
又は溶液、カプセル剤、小袋（sachet）又は錠剤が含まれる。濃化剤、芳香剤、
希釈剤、乳化剤、分散補助剤又は結合剤も所望され得る。 鞘内又は脳室内投与用の組成物は、緩衝剤、希釈剤、及び他の好適な添加物も
含有し得る滅菌水溶液を包含し得る。

【００９１】 腸管外投与用の製剤は、緩衝剤、希釈剤、及び他の好適な添加物も含有し得る
滅菌水溶液を包含し得る。 本発明は、単細胞の原核生物及び真核生物から多細胞の真核生物に至る多種多
様な生物において実施され得る。ＤＮＡ−ＲＮＡ転写又はＲＮＡ−タンパク質翻
訳をその遺伝、代謝又は細胞機構の根本部分として利用する生物は、そのような
治療的及び／又は予防的処置に影響されやすい。細菌、酵母、原生動物、藻類、
植物及び、高温動物を含む高等動物の形態のように一見多様な生物がこの方法で
処置し得る。さらに、多細胞真核生物の細胞はいずれもその細胞活動の必須部分
としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写とＲＮＡ−タンパク質翻訳の両方を包含するので、そ
のような治療薬及び／又は診断薬は、そのような細胞集団に対しても実施され得
る。さらに、真核生物のオルガネラ、例えばミトコンドリア及び葉緑体の多くに
も転写及び翻訳の機構が含まれている。単細胞、細胞集団又はオルガネラも、そ
のまま、本発明の治療薬又は診断薬オリゴヌクレオチドで処置され得る生物の定
義のなかに包含され得る。本明細書で使用されるように、治療薬とは、病態の消
滅、微生物、例えば細菌、原生動物又は他の感染体の殺傷、又は異常又は所望さ
れない細胞の増殖ないし発現を制御することをすべて含むことを意味する。

【００９２】 天然に存在するオリゴヌクレオチド、並びにホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドのような修飾されたオリゴヌクレオチドの製造に第一に選択される現行法
は、固相合成を介するものであり、ここでオリゴヌクレオチドは、制御孔ガラス
（ＣＰＧ）；オキサリル制御孔ガラス（例えば、Alul, et al., Nucleic Acids
Research 1991, 19, 1527 を参照のこと）；ＴＥＮＴＡＧＥＬ Ｓｕｐｐｏｒｔ
（例えば、Wright, et al., Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373を参照のこと
）；又はＰＯＲＯＳ（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから提供さ
れるポリスチレン樹脂）のようなポリマー支持体（固形支持体）上で製造される
。そのような合成の装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙａｔｅｍｓ（
フォスターシティ、ＣＡ）を含むベンダー数社により販売されている。当技術分
野で知られているそのような合成の他の手段は、追加的又は代替的に利用し得る
。自動合成技術を含む好適な固相技術については、F. Eckstein (ed.), Oligonu
cleotides and Analogues, a Practical Approach, Oxford University Press,
New York (1991) に記載されている。

【００９３】 固相合成の基本は、伸張するオリゴヌクレオチド鎖の一端にヌクレオチドを連
続的に付加することである。一般的には、（存在する環外アミン官能基に保護基
を有する）第一のヌクレオシドを適切なガラスビーズ支持体に付け、活性化され
た亜リン酸化合物（一般的にはヌクレオチドホスホロアミダイトであり、やはり
適切な保護基を有する）を段階的に付加し、伸張するオリゴヌクレオチドを伸ば
してゆく。固相合成についての追加の方法は、Caruthers 米国特許第４，４１５
，７３２号；第４，４５８，０６６号；第４，５００，７０７号；第４，６６８
，７７７号；第４，９７３，６７９号；及び第５，１３２，４１８号；及び Kos
ter 米国特許第４，７２５，６７７号、及びＲｅ．３４，０６９号に見出し得る
。

【００９４】 本発明による固形支持体には、制御孔ガラス（ＣＰＧ）、オキサリル制御孔ガ
ラス（例えば、Alul, et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527 を参照
のこと）、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ−−アミノポリエチレングリコー
ル誘導化した支持体（例えば、Wright, et al., Tetrahedron Letters 1993, 34
, 3373を参照のこと）、又はＰｏｒｏｓ−−ポリスチレン／ジビニルベンゼンの
共重合体のようなポリマー支持体（固形支持体）が含まれる。

【００９５】 ２' −置換オリゴヌクレオチドは、Ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ（パーキンエルマー
／アプライドバイオシステムズ）又はＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ７５００又は８８００のような自動合成機を使用する標準的な固相核酸合成によ
り合成した。トリエステル、ホスホロアミダイト、又は水素ホスホネートカップ
リング化学品（Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression.
M. Caruthers, p. 7, J. S. Cohen (Ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida,
1989）をこれら合成機とともに使用して、所望のオリゴヌクレオチドを提供する
。Beaucage試薬（J. Amer. Chem. Soc., 1990, 112, 1253）又はイオウ元素（Be
aucage et al., Tet. Lett., 1981, 22, 1859 ）をホスホロアミダイト又は水素
ホスホネート化学品とともに使用して、２' −置換ホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドを提供する。

【００９６】 必要な２’−置換ヌクレオシド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）及び、修飾されたヌク
レオ塩基及び／又は追加の糖修飾を有する他のヌクレオシド）は、以下に記載の
方法を活用して製造する。 本発明のヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドを合成する間、化学保護基を使
用して１つ又はそれ以上の官能基の変換を促進する一方で、他の官能基は不活性
にしておく。ブロックされた形態にある本発明の化合物へは、数多くの化学官能
基が導入され、後に脱ブロックされて所望される最終化合物を形成し得る。一般
に、ブロック基は、分子の化学官能基を特定の反応条件に対して不活性にし、後
で、分子の残り部分を実質的に傷めることなく分子内のそのような官能基から除
去され得る（Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d.
edition, John Wiley & Sons, New York, 1991）。例えば、アミノ基は、フタル
イミド基、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基として、及びト
リフェニルメチルスルフェニル、ｔ−Ｂｏｃ、ベンゾイル又はベンジル基ととも
に保護され得る。カルボキシル基はアセチル基として保護され得る。代表的なヒ
ドロキシル保護基は、Beaucage et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223 に記載さ
れている。好ましいヒドロキシル保護基は、トリチル、モノメトキシトリチル、
ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、９−フェニルキサンチン−９−イ
ル（ピキシル）及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯ
Ｘ）基のように酸に不安定である。化学官能基はまた、前駆体の形態でそれを包
含することによっても「ブロック化」され得る。従って、アジド基がアミンの「
ブロックされた」形態として使用し得るのは、アジド基が容易にアミンへ変換さ
れるからである。オリゴヌクレオチド合成に活用される代表的な保護基について
は、Agrawal, et al., Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Eds, Huma
na Press; New Jersey, 1994; Vol. 26 pp. 1-72に論じられている。

【００９７】 他の使用のなかでは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ｒａｓ−ルシフェラー
ゼトランス活性化を使用するｒａｓ−ルシフェラーゼ融合系において有用である
。国際公開特許第ＷＯ９２／２２６５１号（１９９２年１２月２３日公開）及び
米国特許第５，５８２，９７２号及び第５，５８２，９８６号（本出願とともに
譲渡され、その全内容は参照により本明細書に組込まれている）に記載のように
、ｒａｓ腫瘍遺伝子は、原形質膜の内面に局在化している関連タンパク質をコー
ドする遺伝子ファミリーのメンバーである。ｒａｓタンパク質は、アミノ酸レベ
ルで高度に保存されていること、高い親和性及び特異性でＧＴＰに結合すること
、ＧＴＰアーゼ活性を保有することが示されている。ｒａｓ遺伝子産物の細胞内
での機能は知られていないが、その生化学的特質から、ＧＴＰ結合タンパク質又
はＧタンパク質として知られているシグナル伝達タンパク質クラスとのその有意
な配列相同性に相俟って、原形質膜を通る細胞外シグナルの伝達に関連する基本
的な細胞調節機能においてｒａｓ遺伝子産物が基本的な役割を担っていることが
示唆されている。

【００９８】 Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、及びＮ−ｒａｓと明示される３種のｒａｓ遺伝子が
哺乳動物のゲノムに同定されている。哺乳動物のｒａｓ遺伝子は、そのコーディ
ング配列内の点突然変異によって、形質転換誘導特性を獲得する。天然に存在す
るｒａｓ腫瘍遺伝子の突然変異は、コドン１２、１３及び６１に局在化している
。ヒトの腫瘍に見出される活性化ｒａｓ突然変異のなかで最も一般的に検出され
ているのはＨ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２においてであり、ここではＧＧＣから
ＧＴＣへ塩基が変化して、ｒａｓタンパク質産物のＧＴＰ調節ドメインにおいて
グリシンからバリンへの置換が生じている。この単一のアミノ酸変化がｒａｓタ
ンパク質機能の正常制御を失わせ、それにより正常に調節される細胞タンパク質
が不断に活性であるものへ変換してしまうと考えられている。正常ｒａｓタンパ
ク質機能のそのような統制解除が正常増殖から悪性増殖への形質転換の原因であ
ると考えられている。

【００９９】 ｒａｓ遺伝子のモジュレーションに加えて、他の核酸と特異的にハイブリダイ
ズし得る本発明のオリゴヌクレオチドは、そのような他の核酸の発現をモジュレ
ートするために使用し得る。そのような例にｒａｆ遺伝子が含まれるが、これは
天然に存在する細胞の遺伝子であり、異常な細胞増殖と腫瘍形成との関連が示唆
されている活性化形態へ変換するときがある。他の核酸の例には、プロテインキ
ナーゼＣ（ＰＫＣ）の発現をモジュレートすることが見出されているＰＫＣに関
連するもの、ＩＣＡＭのような細胞吸着分子に関連しているもの、多剤耐性関連
タンパク質に関連しているものが含まれ、ウイルスゲノムの核酸には、ＨＩＶ、
ヘルペスウイルス、エプスタイン−バー・ウイルス、サイトメガロウイルス、パ
ピローマ・ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及びインフルエンザウイルスが含まれる
（米国特許第５，１６６，１９５号、第５，２４２，９０６号、第５，２４８，
６７０号、第５，４４２，０４９号、第５，４５７，１８９号、第５，５１０，
４７６号、第５，５１０，２３９号、第５，５１４，５７７号、第５，５１４，
７８６号、第５，５１４，７８８号、第５，５２３，３８９号、第５，５３０，
３８９号、第５，５６３，２５５号、第５，５７６，３０２号、第５，５７６，
９０２号、第５，５７６，２０８号、第５，５８０，７６７号、第５，５８２，
９７２号、第５，５８２，９８６号、第５，５９１，７２０号、第５，５９１，
６００号及び第５，５９１，６００号を参照のこと。これらは本出願とともに譲
渡され、その開示内容は参照により本明細書に組込まれている）。

【０１００】 認識されるように、本発明の方法の工程は、ある特定の回数や特定の順序で実
施されるに及ばない。本発明の追加の目的、効果及び新規な特徴は、それについ
ての以下の実施例を検討すれば当業者に明らかになるが、それらは例示のための
ものであって、限定することを意図したものではない。

【０１０１】

【実施例】

実施例１ メチル−２−Ｏ−（２−エチルアセチル）−３，５−ビス−Ｏ−（２，４−ジク
ロロベンジル）−α−Ｄ−リボフラノシド（図１、３） 化合物（２）（図１）（Martin, P. Helv. Chem. Acta, 1995, 78, 486-504に
ある文献の方法により（１）から数グラムの（２）を製造した）を５℃へ冷却し
ながらＤＭＦ（８６ｍＬ）に溶かし、ＮａＨ（６０％分散液、１．３８ｇ，３４
．３８ミリモル）を加えた。この反応混合液を５分間、５℃で撹拌した後、周囲
温度へ温めて２０分撹拌した後、反応混合液を５℃へ冷やし、ブロモ酢酸エチル
（３．８１ｍＬ，３４．４ミリモル）を滴加してガスを発生させた。この反応混
合液を周囲温度へ温めて３時間撹拌した後、この混合液を５℃へ冷やし、飽和Ｎ
Ｈ₄ Ｃｌ水溶液でｐＨを３に調整した。溶媒を真空蒸発させて得たシロップをＥ
ｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に溶かし、水、次いで鹹水で洗浄した。有機層を分離し
、ＭｇＳＯ₄ で乾燥させ、溶媒を真空蒸発させて油状物を得た。ヘキサン−Ｅｔ
ＯＡｃ（６０：４０）を用いるフラッシュクロマトグラフィーによりこの油状物
を精製し、表題化合物（３）（１５．５２ｇ，９５％）を油状物として得た。

【０１０２】

【化１４】

【０１０３】 Ｃ₂₄Ｈ₂₆Ｃｌ₄ Ｏ₇ ・Ｈ₂ Ｏの理論値：Ｃ，４９．１７；Ｈ，４．８１。実測値
：Ｃ，４９．３３；Ｈ，４．３１。

【０１０４】 実施例２ １−［２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）−３' ，５' −ビス−Ｏ−（２，４−
ジクロロベンジル）−β−Ｄ−リボフラノシル］チミン（図１、４） チミン（６．９０ｇ，５４．６ミリモル）を無水ジクロロエタン（１３６ｍＬ
）に懸濁させ、ビス−トリメチルシリルアセトアミド（４０．５ｍＬ，１６４ミ
リモル）を加えた。この反応混合液を１０分間還流加熱して溶液とした。周囲温
度に冷やした後、この溶液を撹拌させながら化合物（３）へ加えた。トリメチル
シリルトリフルオロメタンスルホネート（６．８６ｍＬ、３５．５ミリモル）を
加え、この反応混合物を６時間還流加熱した。この混合液を５℃に冷やし、飽和
ＮａＨＣＯ₃ をゆっくり加えてｐＨを７へ調整した。この混合液をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （３ｘ１５０ｍＬ）で抽出し、有機抽出液を集め、鹹水で洗浄し、溶媒を真空蒸
発させて油状物を得た。この油状物をＣＨ₂ Ｃｌ₂ に溶かし、ヘキサン−ＥｔＯ
Ａｃ（４５：５５）を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、表題
化合物（４）（７．９２ｇ，４４％）を油状物として得た。（α−アノマーは後
の分画に含まれていた）。

【０１０５】

【化１５】

【０１０６】 Ｃ₂₈Ｈ₂₈Ｃｌ₄ Ｎ₂ Ｏ₈ ・Ｈ₂ Ｏの理論値：Ｃ，４９．４３；Ｈ，４．４４；Ｎ
，４．１２。実測値：Ｃ，４９．２５；Ｈ，４．１０；Ｎ，３．９４。

【０１０７】 実施例３ １−［２' −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−３' ，５' −ビス−Ｏ−（２，４
−ジクロロベンジル）−β−Ｄ−リボフラノシル］チミン（図１、５） 化合物（４）（９．９２ｇ，１５．０ミリモル）を温ＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）
に溶かし、この溶液を水浴で周囲温度へ冷やした。この溶液へＮａＢＨ₄ （１．
１３ｇ，３０．０ミリモル）を１０分かけて慎重に加えた。３時間後、追加のＮ
ａＢＨ₄ （２８２ｍｇ，７．４５ミリモル）を加え、この反応混合液を１時間撹
拌した後、８時間静置した。飽和ＮＨ₄ Ｃｌ（２５ｍＬ）を加えてｐＨを４に調
整すると、ゴム状物を生じた。溶媒をデカントして真空蒸発させると、白色の固
形物が得られ、これをＣＨ₂ Ｃｌ₂ （２５０ｍＬ）に溶かした。ゴム状物を飽和
ＮａＨＣＯ₃ に溶かし、この溶液を先の生成物を含有するＣＨ₂ Ｃｌ₂ で穏やか
に抽出した。有機層を分離し、水層を再びＣＨ₂ Ｃｌ₂ （２ｘ５０ｍＬ）で抽出
した。有機層を集め、溶媒をＭｇＳＯ₄ で乾燥させ、真空蒸発させて白色の泡状
物を得た。この泡状物をＣＨ₂ Ｃｌ₂ に溶かし、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（２０：
８０）を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、表題化合物（５）
（８．３９ｇ，９０％）を白色の泡状物として得た。

【０１０８】

【化１６】

【０１０９】 実施例４ １−［２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−ヒドロキシエチル）−３' ，５' −
ビス−Ｏ−（２，４−ジクロロベンジル）−β−Ｄ−リボフラノシル］チミン（
図１、６） 化合物（５）を無水アセトニトリルとの共沸により乾燥させた後、さらに周囲
温度で１２時間真空（０．１トル）乾燥した。新たに蒸留したＴＨＦ（９７ｍＬ
）にこの乾燥した物質（８．３９ｇ，１３．５３ミリモル）を溶かし、ＰＰｈ₃ （３．９０ｇ，１４．９ミリモル）、及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（２．４
３ｇ，１４．９ミリモル）を加えた。この反応混合物を−７８℃へ冷却し、アゾ
ジカルボン酸ジエチル（２．３４ｍＬ，１４．９ミリモル）を加えた。この反応
混合物を周囲温度へ温め、溶媒を真空蒸発させて、泡状物を得た。この泡状物を
ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶かし、飽和ＮａＨＣＯ₃ 水溶液（３ｘ３０ｍＬ）
で洗浄した。有機層を分離し、鹹水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄ で乾燥させ、溶媒を蒸
発させて泡状物を得た。ＣＨ₂ Ｃｌ₂ −アセトン（８５：１５）を用いるフラッ
シュクロマトグラフィーによりこの泡状物を精製し、表題化合物（６）（３．２
２ｇ，３１％）を白色の泡状物として得た。２回目のクロマトグラフィー精製に
より、追加の（６）（５．１８ｇ，５０％）を白色の泡状物として得た。

【０１１０】

【化１７】

【０１１１】 実施例５ １−［２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル）−３' ，５' −ビス
−Ｏ−（２，４−ジクロロベンジル）−β−Ｄ−リボフラノシル］チミン（図２
、７） 化合物（６）（１．７９ｇ，２．３４ミリモル）をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （１２ｍＬ）
に溶かし、この溶液を−７８℃に冷却して、１．０Ｍ三塩化ホウ素／ＣＨ₂ Ｃｌ ₂ 溶液（５．１５ｍＬ，５．１５ミリモル）を加え、この反応混合物を１．５時
間、５℃に保った。追加の１．０Ｍ三塩化ホウ素／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 溶液（５．１５
ｍＬ，５．１５ミリモル）を加え、さらに１．５時間、５℃でこの溶液を撹拌し
た。飽和ＮａＨＣＯ₃ 水溶液（３０ｍＬ）を用いてｐＨを７へ調整した。ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （１００ｍＬ）で希釈した後、有機層を分離し、水層をＣＨＣｌ₃ （５ｘ
２５ｍＬ）、次いでＥｔＯＡＣ（３ｘ２５ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、Ｎ
ａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、真空蒸発させて油状物を得た。ＣＨ₂ Ｃｌ₂ −アセトン
（４５：５５）を用いるフラッシュクロマトグラフィーによりこの油状物を精製
し、表題化合物（７）（６１９ｍｇ，５９％）を白色の泡状物として得た。２回
目のクロマトグラフィー精製により、追加の（６）（５．１８ｇ，５０％）を白
色の泡状物として得た。

【０１１２】

【化１８】

【０１１３】 実施例６ １−［２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル）−５' −Ｏ−（４，
４' −ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］チミン（図２、８） 化合物（７）を無水アセトニトリルとの共沸により乾燥させた後、１２時間、
周囲温度で真空（０．１トル）乾燥させた。乾燥した物質（６１９ｍｇ，１．３
８ミリモル）を無水ピリジン（７ｍＬ）に溶かし、４，４' −ジメトキシトリチ
ルクロリド（５１４ｍｇ，１．５２ミリモル）を加えた。２時間後、追加の４，
４' −ジメトキシトリチルクロリド（２５７ｍｇ，０．７６ミリモル）を加えた
。この溶液を２時間撹拌し、最後の４，４' −ジメトキシトリチルクロリド（２
５７ｍｇ，０．７６ミリモル）を加えた。１２時間後、この反応混合液へＭｅＯ
Ｈ（１０ｍＬ）を加え、１０分撹拌し、溶媒を真空蒸発させて得られた油状物を
トルエンと共沸させた。ＣＨ₂ Ｃｌ₂ −アセトン−ピリジン（８０：２０：１）
でシリカを前処理してからＣＨ₂ Ｃｌ₂ −アセトン（８０：２０）を用いるフラ
ッシュクロマトグラフィーによりこの油状物を精製し、表題化合物（８）（７０
４ｍｇ，６８％）を黄色の固形物として得た。

【０１１４】

【化１９】

【０１１５】 Ｃ₄₁Ｈ₃₉Ｎ₃ Ｏ₁₁・Ｈ₂ Ｏの理論値：Ｃ，６５．１４；Ｈ，５．３８；Ｎ，５．
４７。実測値：Ｃ，６３．８５；Ｈ，５．１６；Ｎ，５．１４。Ｃ₄₁Ｈ₃₉Ｎ₃ Ｏ ₁₁ の理論値：Ｃ，６５．６８；Ｈ，５．２４；Ｎ，５．６０。実測値：Ｃ，６５
．２３；Ｈ，５．２７；Ｎ，５．４５。

【０１１６】 実施例７ １−［２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル）−５' −Ｏ−（４，
４' −ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］チミン−３' −［（２
−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（図２、９） 化合物（８）を無水ピリジン（２ｘ２０ｍＬ）との共沸により乾燥させた後、
１２時間、周囲温度で真空（０．１トル）乾燥させた。乾燥した物質（７０４ｍ
ｇ，０．９３９ミリモル）をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （９ｍＬ）に溶かし、ジイソプロピル
アミンテトラゾリド（８０．４ｍｇ，０．４７ミリモル）及び２−シアノエチル
−Ｎ，Ｎ，Ｎ' ，Ｎ' −テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．３３ｍ
Ｌ，１．０３ミリモル）を撹拌させながら加えた。周囲温度で２時間の後、追加
の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ' ，Ｎ' −テトライソプロピルホスホロジアミ
ダイト（０．３３ｍＬ，１．０３ミリモル）を加え、この溶液を２０時間撹拌し
た。溶媒を真空蒸発させて得られた油状物を、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ −アセトン−ピリジ
ン（８５：１５：１）でシリカを前処理してからＣＨ₂ Ｃｌ₂ −アセトン（８５
：１５）を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、表題化合物（９
）（７０４ｍｇ，６８％）を油状物として得た。この生成物を無水アセトニトリ
ル（２ｘ３０ｍＬ）、及びＣＨ₂ Ｃｌ₂ （２ｘ３０ｍＬ）と共沸させ、黄色の泡
状物を得た。

【０１１７】

【化２０】

【０１１８】 Ｃ₅₀Ｈ₅₆Ｎ₅ Ｏ₁₂Ｐ・Ｈ₂ Ｏの理論値：Ｃ，６２．０４；Ｈ，６．０４；Ｎ，７
．２４。実測値：Ｃ，６２．２０；Ｈ，５．９４；Ｎ，７．３４。

【０１１９】 実施例８ ２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）−３' ，５' −Ｏ−（１，１，３，３−テト
ライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン（図３、１１） アデノシン（３０．００ｇ，１１２ミリモル）を温無水ＤＭＦ（６００ｍＬ）
に溶かし、この溶液を周囲温度に冷やした。ＮａＨ（６０％分散油、４．９４ｇ
，１２４ミリモル）を加え、機械スターラーを用いて、この混合液を１時間撹拌
した。生成した懸濁液を５℃へ冷やし、ブロモ酢酸エチル（１３．７ｍＬ，１２
４ミリモル）を加えた。得られた溶液を周囲温度で１２時間撹拌し、溶媒を真空
蒸発させて得た残渣には、２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）アデノシン（１０
）とその推定される３' −Ｏ−異性体が含まれていた。この物質をピリジンと共
沸させて得られる泡状物を無水ピリジン（４００ｍＬ）に溶かした。１，３−ジ
クロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（３９．５２ｍＬ，
１２４ミリモル）を加え、この溶液を周囲温度で２４時間撹拌した。溶媒を真空
蒸発させて得た油状物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶かし、鹹水で３回洗浄し
た。有機層を分離し、ＭｇＳＯ₄ で乾燥させ、溶媒を真空蒸発させて油状物を得
た。ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（８０：２０）を用いるフラッシュクロマトグラフィ
ーによりこの油状物を精製し、表題化合物（１１）（１４．６３ｇ，２２％）を
油状物として得た。

【０１２０】

【化２１】

【０１２１】 Ｃ₂₆Ｈ₄₅Ｎ₅ Ｏ₇ Ｓｉ₂ の理論値：Ｃ，５２．４１；Ｈ，７．６１；Ｎ，１１．
７５。実測値：Ｃ，５２．２３；Ｈ，７．３４；Ｎ，１１．６９。

【０１２２】 実施例９ ２' −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−３' ，５' −Ｏ−（１，１，３，３−テ
トライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン（図３、１２） 化合物（１１）（４．１７５ｇ，７．０１ミリモル）をエタノール（９５％，
４０ｍＬ）に溶かし、得られた溶液を５℃へ冷やした。ＮａＢＨ₄ （６０％油状
懸濁液、０．６４ｇ，１６．８ミリモル）を加え、この混合液を周囲温度まで温
めた。１２時間撹拌した後、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （２００ｍＬ）を加え、この溶液を鹹
水で２回洗浄し、有機層を分離した。この有機層をＭｇＳＯ₄ で乾燥させ、溶媒
を真空蒸発させて油状物を得た。ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（９５：５）を用いるフ
ラッシュクロマトグラフィーによりこの油状物を精製し、表題化合物（１２）（
０．３６８ｇ，９．５％）を油状物として得た。

【０１２３】

【化２２】

【０１２４】 実施例１０ ２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−ヒドロキシエチル）−３' ，５' −Ｏ−（
１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシ
ン（図４、１３） 化合物（１２）（０．３３０ｇ，０．５９６ミリモル）の無水ＴＨＦ（１０ｍ
Ｌ）溶液へトリフェニルホスフィン（０．１８０ｇ，０．６８５ミリモル）及び
Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（０．１１２ｇ，０．６８５ミリモル）を加えた。
この混合液へアゾジカルボン酸ジエチル（０．１１ｍＬ，６８５ミリモル）を５
℃で滴加した。周囲温度で３時間撹拌した後、溶媒を蒸発させて油状物を得た。
この油状物をＥｔＯＡｃに溶かし、飽和ＮａＨＣＯ₃ 水溶液（ｘ３）及び鹹水で
洗浄した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ₄ で乾燥させた。溶媒を真空蒸発させて油
状物を得た。ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（９５：５）を用いるフラッシュクロマトグ
ラフィーによりこの油状物を精製し、表題化合物（１３）（０．２８５ｇ，６８
％）を油状物として得た。

【０１２５】

【化２３】

【０１２６】 実施例１１ Ｎ６−ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−ヒドロキシエチル）−
３' ，５' −Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３
−ジイル）アデノシン（図４、１４） ５℃へ冷却した化合物（１３）（１．０９ｇ，１．９７ミリモル）の無水ピリ
ジン（１９ｍＬ）溶液へベンゾイルクロリド（１．１４ｍＬ，９．８ミリモル）
を加え、得られた混合液を周囲温度で１２時間撹拌した。この混合液を５℃へ冷
やした後、氷水（３．８ｍＬ）を加え、この混合液を１５分間撹拌し、濃ＮＨ₄ ＯＨ（３．８ｍＬ）を加えた。５℃で３０分撹拌した後、溶媒を蒸発させて得た
残渣を水に溶かし、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で３回抽出した。有機抽出液を集め、ＭｇＳＯ ₄ で乾燥させ、真空蒸発させて油状物を得た。ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（５０：５
０）、次いでヘキサン−ＥｔＯＡｃ（２０：８０）を用いるフラッシュクロマト
グラフィーによりこの油状物を精製し、表題化合物（１４）（０．６１８ｇ，４
８％）を油状物として得た。

【０１２７】

【化２４】

【０１２８】 実施例１２ Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−ヒドロキシエチル）ア
デノシン（図４、１５） ５℃のポリエチレン反応器にある化合物（１４）（０．６８０ｇ，０．８４７
ミリモル）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液へＨＦ−ピリジン（７０％，０．４８ｍＬ
，１６．９ミリモル）を加え、得られた混合液を周囲温度へ温めた。１２時間撹
拌した後、溶媒を真空蒸発させ、ＥｔＯＡｃを加え、この溶液を水で洗浄し、水
層を分離して、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を集め、ＭｇＳＯ₄ で乾燥させ、
溶媒を真空蒸発させて表題化合物（１５）（４０８ｍｇ，８６％）を固形物とし
て得た。

【０１２９】

【化２５】

【０１３０】 実施例１３ Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル）−５'
−Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）アデノシン（図４、１６） 化合物（１５）（０．２５８ｇ，０．４６ミリモル）の無水ピリジン（５ｍＬ
）溶液へ４，４' −ジメトキシトリチルクロリド（０．１７９ｇ，０．５３ミリ
モル）を加え、この溶液を周囲温度で１２時間撹拌した。水を加え、この混合液
をＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機抽出液を集め、真空蒸発させて、ＭｇＳＯ₄ で乾燥させた。生成した油状物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（９０：１０）を用い
るフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、表題化合物（１６）（０．２４
９ｇ，６３％）を油状物として得た。

【０１３１】

【化２６】

【０１３２】 ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ Ｃ₄₈Ｈ₄₂Ｎ₆ Ｏ₁₀の理論値：９９５．２０１７（
Ｍ＋Ｃｓ＋）。実測値：９９５．２０５３（Ｍ＋Ｃｓ＋）。

【０１３３】 実施例１４ Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル）−５'
−Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）アデノシン−３' −［（２−シアノエ
チル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（図４、１７） 化合物（１６）（０．３００ｇ，０．３４６ミリモル）のＣＨ₂ Ｃｌ₂ （１０
ｍＬ）溶液へジイソプロピルアミンテトラゾリド（０．０３０ｇ，０．１７４ミ
リモル）及び２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ' ，Ｎ' −テトライソプロピルホス
ホロジアミダイト（０．１３ｍＬ，０．４１８ミリモル）を加えた。周囲温度で
１２時間撹拌した後、追加のジイソプロピルアミンテトラゾリド（０．０６０ｇ
，０．３４８ミリモル）及び２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ' ，Ｎ' −テトライ
ソプロピルホスホロジアミダイト（０．２６ｍＬ，０．８３２ミリモル）を２４
時間にわたり２回に分けて加えた。２４時間後、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ −ＮＥｔ₃ （１０
０：１）を加え、この混合液を飽和ＮａＨＣＯ₃ 水溶液及び鹹水で洗浄した。有
機層を分離し、ＭｇＳＯ₄ で乾燥させ、溶媒を真空蒸発させた。生成した油状物
を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ−ＮＥｔ₃ （４０：６０：１）でシリカを前処理して
から同溶媒系を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、表題化合物
（１７）（２０３ｍｇ，５５％）を油状物として得た。³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ ₃ ）：δ151.0, 150.5。ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ Ｃ₅₇Ｈ₅₉Ｎ₈ Ｏ₁₁Ｐの理
論値：１１９５．３０９５（Ｍ＋Ｃｓ＋）。実測値：１１９５．３０４６（Ｍ＋
Ｃｓ＋）。

【０１３４】 実施例１５ ２' −Ｏ−（２−アミノオキシエチル）−３' ，５' −Ｏ−（１，１，３，３−
テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン（図５、１８） 化合物（１３）（０．２２８ｇ，０．３２６ミリモル）のＣＨ₂ Ｃｌ₂ （５ｍ
Ｌ）溶液へ、５℃でメチルヒドラジン（０．０１７ｍＬ，０．３２６ミリモル）
を加え、２時間撹拌した。この混合液を濾過して沈澱物を除去し、濾液を水及び
鹹水で洗浄した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ₄ で乾燥させ、真空蒸発させて、表
題化合物（１８）（１８６ｍｇ）を油状物として得た。この油状物は後続の反応
に十分な純度であった。

【０１３５】

【化２７】

【０１３６】 実施例１６ ２' −Ｏ−（２−Ｏ−ホルムアルドキシミルエチル）−３' ，５' −Ｏ−（１，
１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン（
図５、１９） 化合物（１８）（０．１８６ｇ，０．３２６ミリモル）のＥｔＯＡｃ（２ｍＬ
）＋ＭｅＯＨ（２ｍＬ）溶液へ、ホルムアルデヒド（３７％水溶液、０．０２８
ｍＬ，０．３４２ミリモル）を加え、３時間、周囲温度で撹拌した。溶媒を真空
蒸発させて、表題化合物（１９）（１８９ｍｇ）を油状物として得た。この油状
物は後続の反応に十分な純度であった。

【０１３７】

【化２８】

【０１３８】 実施例１７ Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−Ｏ−ホルムアルドキシミルエチル）−３'
，５' −Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジ
イル）アデノシン（図５、２０） 化合物（１９）（０．１８９ｇ，０．３２６ミリモル）のピリジン（５ｍＬ）
溶液へ５℃でベンゾイルクロリド（０．１９ｍＬ，１．６３ミリモル）を加え、
得られた溶液を周囲温度で３時間撹拌した。この溶液を５℃に冷却し、濃ＮＨ₄ ＯＨ（１．５ｍＬ）を加えて１時間撹拌した。溶媒を真空蒸発させて得た油状物
をＣＨ₂ Ｃｌ₂ に溶かした。この溶液を水で洗浄し、有機層を分離し、ＭｇＳＯ ₄ で乾燥させ、溶媒を真空蒸発させて、表題化合物（２０）（２２３ｍｇ）を油
状物として得た。これは後続の反応に十分な純度であった。

【０１３９】

【化２９】

【０１４０】 実施例１８ Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−Ｏ−ホルムアルドキシミルエチル）アデノ
シン（図５、２１） ５℃のポリエチレン反応器にある化合物（２０）（２２３ｍｇ，０．３２６ミ
リモル）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液へＨＦ−ピリジン（７０％，０．１９ｍＬ，
６．５ミリモル）を加え、この混合液を周囲温度へ温めた。４８時間撹拌した後
、溶媒を真空蒸発させて得た残渣をＥｔＯＡｃに溶かし、水で洗浄した。有機層
を分離して、水層をＥｔＯＡｃで抽出し、有機層を集め、ＭｇＳＯ₄ で乾燥させ
、真空蒸発させた。生成した残渣をＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（９５：５）を用いる
フラッシュクロマトグラフィーにより精製し、表題化合物（２１）（２４ｍｇ，
（１３）から１７％）を固形物として得た。

【０１４１】

【化３０】

【０１４２】 実施例１９ Ｎ６−ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−Ｏ−ホルムアルドキシミルエチル）−５'
−Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）アデノシン（図５、２１Ａ） 化合物（２１）（０．３４ｇ，０．７６８ミリモル）のピリジン（７ｍＬ）溶
液へ、４，４' −ジメトキシトリチルクロリド（０．３１２ｇ，０．９２２ミリ
モル）を加え、この反応混合液を周囲温度で５時間撹拌した。追加量の４，４'
−ジメトキシトリチルクロリド（５２０ｍｇ，１．５４ミリモル及び３４０ｍｇ
，０．７６８ミリモル）を２４時間にわたり加えた。溶媒を蒸発させ、粗生成物
をＥｔＯＡｃに溶かし、水で洗浄した。有機層を分離して、ＭｇＳＯ₄ で乾燥さ
せ、溶媒を真空蒸発させた。ＥｔＯＡｃ−ヘキサン−ＮＥｔ₃ （８０：２０：０
．５，ｖ／ｖ／ｖ）、次いでＥｔＯＡｃ−ＮＥｔ₃ （１００：０．５，ｖ／ｖ）
を溶媒として用いるカラムクロマトグラフィーによりこの粗物質を精製し、表題
化合物（２１Ａ）（０．２６９ｇ，４７％）を油状物として得た。

【０１４３】

【化３１】

【０１４４】 ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ Ｃ₄₁Ｈ₄₀Ｎ₆ Ｏ₈ の理論値：８７７．１９６２（
Ｍ＋Ｃｓ＋）。実測値：８７７．１９８８（Ｍ＋Ｃｓ＋）。

【０１４５】 実施例２０ ２' −Ｏ−アリル−５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン １００ｍＬのステンレス鋼圧力リアクターにおいて、ホウ素のテトラヒドロフ
ラン溶液（１Ｍ，１０ｍＬ，１０ミリモル）へ、撹拌させながらゆっくりとアリ
ルアルコール（２０ｍＬ）を加えた。水素ガスが速やかに発生した。泡立ちが静
まったときに、２，２' −アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．０ｇ，０．４
２ミリモル）及び重炭酸ナトリウム（６ｍｇ）を加え、リアクターをシールした
。リアクターを湯浴に置き、１８時間で内部温度を１７０℃へ加熱した。リアク
ターを室温まで冷やして開いた。Ｔｌｃによると、出発物質はすべてなくなって
いた（出発物質と生成物のＲｆは、酢酸エチル／メタノール（４：１）／シリカ
ゲルでそれぞれ０．２５と０．６０である）。この粗溶液を濃縮し、メタノール
（５０ｍＬ）、沸騰水（１５ｍＬ）、無水エタノール（２ｘ２５ｍＬ）と共沸さ
せ、次いで残渣を乾燥して（１ｍｍＨｇ，２５℃，２時間）褐色の泡状物１．４
ｇを得た。この粗ヌクレオシドの一部（１．２ｇ）を、さらに精製することなく
、次の反応工程に使用した。残渣をピリジン（３０ｍＬ）と共沸させ、ピリジン
（３０ｍＬ）に再び溶かした。ジメトキシトリチルクロリド（１．７ｇ，５．０
ミリモル）を室温で一時に加えた。２時間後、反応液をメタノール（５ｍＬ）で
急冷し、真空濃縮し、飽和重炭酸ナトリウムと酢酸エチル（それぞれ１５０ｍＬ
）の溶液の間に分画した。有機層を分離し、濃縮し、ヘキサン−酢酸エチル−ト
リエチルアミン（５０：４９：１）〜（６０：３９：１）の溶媒勾配を使用する
カラムクロマトグラフィー（シリカゲル：４５ｇ）に残渣をかけた。生成物を含
む分画を集め、濃縮し、アセトニトリル（３０ｍＬ）と共沸させ、乾燥（１ｍｍ
Ｈｇ，２５℃，２４時間）して、白色の泡状固形物８４０ｍｇ（２工程収率：３
４％）を得た。ＮＭＲは、文献に報告されている非メチル化ウリジン類似体に一
致していた。

【０１４６】 実施例２１ ２' −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メ
チルウリジン ２' −Ｏ−アリル−５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１
．０ｇ，１．６ミリモル）、四酸化オスミウム水溶液（０．１５Ｍ、０．３６ｍ
Ｌ，０．００５６ミリモル、０．０３５当量）及び４−メチルモルホリンＮ−オ
キシド（０．４１ｇ，３．５ミリモル、２．１５当量）をジオキサン（２０ｍＬ
）に溶かし、２５℃で４時間撹拌した。Ｔｌｃによると、ジオールへの完全な反
応が認められた（出発物質とジオールのＲｆは、ジクロロメタン／メタノール（
９７：３）／シリカでそれぞれ０．４０と０．１５である）。過ヨウ素酸カリウ
ム（０．８１ｇ，３．５６ミリモル、２．２当量）を水（１０ｍＬ）に溶かし、
この反応液へ加えた。１７時間後、ｔｌｃは９０％の完全な反応を示した（アル
デヒドのＲｆは上記の系で０．３５である）。この反応液を濾過し、５％亜硫酸
ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）で急冷し、生成物のアルデヒドを酢酸エチル（
２ｘ２００ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、鹹水（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄し
、油状物になるまで濃縮した。この油状物を無水エタノール（１５ｍＬ）に溶か
し、ホウ酸水素ナトリウム（１ｇ）を加えた。２５℃で２時間後、ｔｌｃは、完
全な反応を示した。水（５ｍＬ）を加えて、ホウ酸水素塩を壊した。２時間後、
反応液を除き、酢酸エチルと飽和重炭酸ナトリウム溶液（各５０ｍＬ）の間に残
渣を分画した。有機層を真空濃縮し、残渣をカラム処理（シリカゲル：３０ｇ、
ジクロロメタン−メタノール（９７：３））した。生成物を含有する分画を集め
、溶媒を除去して、乾燥させ、白色の泡状物０．５０ｇ（５０％）を得た。ＮＭ
Ｒは、グリコシル化の経路により製造した物質のそれと一致していた。

【０１４７】 実施例２２ ２' −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン １００ｍＬのステンレス鋼圧力リアクターにおいて、ホウ素のテトラヒドロフ
ラン溶液（１Ｍ，１０ｍＬ，１０ミリモル）へ、撹拌させながらゆっくりとエチ
レングリコール（２０ｍＬ）を加えた。水素ガスが速やかに発生した。泡立ちが
静まったときに、２，２' −アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．０ｇ，０．
４２ミリモル）及び重炭酸ナトリウム（３ｍｇ）を加え、リアクターをシールし
た。リアクターを湯浴に置き、７２時間で内部温度を１５０℃へ加熱した。ボン
ベを室温まで冷やして開いた。ＴＬＣによると、出発物質の６５％がなくなって
いた（出発物質と生成物のＲｆは、酢酸エチル／メタノール（４：１）／シリカ
ゲルでそれぞれ０．２５と０．４０である）。反応が不完全なまま後処理した。
この粗溶液を濃縮し（１ｍｍＨｇ，１００℃）、メタノール（５０ｍＬ）、沸騰
水（１５ｍＬ）及び無水エタノール（２ｘ２５ｍＬ）と共沸させ、次いで残渣を
乾燥（１ｍｍＨｇ，２５℃，２時間）して薄白色の泡状物１．３ｇを得た。この
粗生成物のＮＭＲは、所望の生成物６５％と出発物質３５％に一致していた。こ
のＴＬＣのＲｆは、上記のＤＭＴ誘導体を希塩酸／メタノールで処理したときに
生成する同じ生成物（共スポット）に一致していた。並びに、この生成物サンプ
ルをジメトキシトリチルクロリドで処理したときに生成するスポットは、既知の
ＤＭＴ誘導体に一致した（他のスポットは、側鎖のＤＭＴとビス置換生成物であ
った）。

【０１４８】 実施例２３ Ｎ４−ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル）−５'
−Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）シチジン−３' −［（２−シアノエチ
ル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（図６、２５） ２' −Ｏ−アミノオキシエチルシチジン及びグアノシン類似体は、報告された
文献の方法に組み合わせた同様の化学により製造し得る。この合成経路にとって
重要なのは、保護されたヌクレオシドの選択的な２' −Ｏ−アルキル化である（
Guinosso, C. J., Hoke, G. D., Frier, S., Martin, J. F., Ecker, D. J., Mi
rabelli, C. K., Crooke, S. T., Cook, P. D., Nucleosides Nucleotides, 199
1, 10, 259; Manoharan, M., Guinosso, C. J., Cook, P. D., Tetrahedron Let
t., 1991, 32, 7171; Izatt, R. M., Hansen, L. D., Rytting, J. H., Christe
nsen, J. J., J. Am. Chem. Soc., 1965, 87, 2760; Christensen, L. F., Broo
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O. P., Biochim. Biophys. Acta, 1980, 629, 178; Takaku, H., Kamaike, K.,
Chemistry Lett. 1982, 189)。このように、シチジンは選択的にアルキル化され
て、中間体の２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）シチジン（２２）を提供し得る
。一般に、（２２）の３' −異性体が微量に存在していて、クロマトグラフィー
又は結晶化によって分離し得る。化合物（２２）は保護し得て、２' −Ｏ−（２
−エチルアセチル）−５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）シチジン（
２３）になる。このエステル（２３）を還元すれば、Ｎ−４ベンゾイル化し得る
２' −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリ
チル）シチジン（２４）を生じ、１級ヒドロキシル基は Mitsunobu反応を介して
Ｎ−ヒドロキシフタルイミドにより置換され得て、保護されたヌクレオシドは通
常通りにホスフェチル化されて、Ｎ４−ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−フタルイ
ミド−Ｎ−オキシエチル）−５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）シチ
ジン−３' −［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダ
イト］（２５）を生じる。

【０１４９】 実施例２４ Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２' −Ｏ−（２−エチ
ルアセチル）−５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）グアノシン−３'
−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（３
１） 同様のやり方で、２' −Ｏ−アミノオキシエチルグアノシン類似体は、ジアミ
ノプリンリボシドの選択的な２' −Ｏ−アルキル化により得られる（シェーリン
グＡＧ（ベルリン）より購入し得る数グラム量のジアミノプリンリボシドから２
' −Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシド（２６）並びに微量の
３' −Ｏ−異性体を得る）。化合物（２６）は、アデノシンデアミナーゼを用い
た処理によって分解し、２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシン（２７）
へ変換され得る（McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C. J., PCT Int.
Appl., 85 pp.; PIXXD2;ＷＯ９４／０２５０１号 Ａ１ ９４０２０３．）。標
準的な保護の方法により、２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）−５' −Ｏ−（４
，４' −ジメトキシトリチル）グアノシン（２８）、及び２Ｎ−イソブチリル−
６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）−５' −
Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）グアノシン（２９）を生じ、これは還元
されて、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２' −Ｏ−
（２−エチルアセチル）−５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）グアノ
シン（３０）になり得る。先に述べたように、ヒドロキシル基は Mitsunobu反応
を介してＮ−ヒドロキシフタルイミドにより置換され得て、保護されたヌクレオ
シドは通常通りにホスフェチル化されて、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフ
ェニルカルバモイル−２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）−５' −Ｏ−（４，４
' −ジメトキシトリチル）グアノシン−３' −［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（３１）を生じる。

【０１５０】 実施例２５ Ｎ−（１−ヒドロキシフタルイミド）−５−ヘキセン（図９、３２） ５−ヘキサン−１−オール（２０ｇ，０．２モル）のＴＨＦ（５００ｍＬ）溶
液へトリフェニルホスフィン（８０ｇ，０．３モル）及びＮ−ヒドロキシフタル
イミド（４９ｇ，０．３モル）を加えた。この混合液を０℃へ冷やし、アジドカ
ルボン酸ジエチル（４８ｍＬ，０．３モル）を１時間にわたりゆっくりと加えた
。この反応混合液を室温へ温め、黄色い溶液を一晩撹拌した。次いで溶媒を蒸発
させて黄色い油状物を得た。この油状物をＣＨ₂ Ｃｌ₂ に溶かし、水、飽和Ｎａ
ＨＣＯ₃ 水溶液、次いで飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。有機層を真空濃縮し、生
成した油状物をＣＨ₂ Ｃｌ₂ ／エーテルの溶液に溶かし、できる限り多くのＰｈ ₃ Ｐ＝Ｏを析出させた。３回の精製工程の後、表題化合物を黄色いロウ状の固形
物として得た（収率９３％）。¹³Ｃ ＮＭＲ：δ21.94, 24.83, 27.58, 33.26,
78.26, 114.91, 123.41, 128.40, 128.54, 128.63, 134.45 及び163.8 ppm 。

【０１５１】 実施例２６ Ｎ−（１−ヒドロキシフタルイミド−５，６−ヘキサン−ジオール）（図９、３
３） 化合物（３２）（２．５９ｇ，１０ミリモル）、四酸化オスミウム水溶液（０
．１５Ｍ、３．６ｍＬ，０．０５６ミリモル）及びＮ−メチルモルホリン−Ｎ−
オキシド（２．４６ｇ，２１ミリモル）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かした。こ
の反応混合液をアルミホイルで覆い、２５℃で４時間撹拌した。Ｔｌｃは、ジオ
ールが形成したことを示した。溶媒を蒸発させ、水とＣＨ₂ Ｃｌ₂ の間に残渣を
分画した。有機層を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄ で乾燥させた。
有機層を濃縮し、褐色がかった油状物とし、¹³Ｃ ＮＭＲで特徴づけて、さらに
精製することなく次の工程に使用した。¹³Ｃ ＮＭＲ：δ21.92, 28.08, 32.62,
66.76, 71.96, 78.33, 123.43, 128.47, 128.71, 131.93, 132.13, 134.49, 16
3.89。

【０１５２】 実施例２７ Ｎ−１−ヒドロキシフタルイミド−６−Ｏ−ジメトキシトリチル−５，６−ヘキ
サン−ジオール）（図９、３４） 先の工程の生成物（３．０ｇ）をピリジン（２ｘ２０ｍＬ）と共沸させ、ピリ
ジン（１００ｍＬ）に溶かした。ジメトキシトリチルクロリド（３．５ｇ，１０
ミリモル）をピリジン（３０ｍＬ）に溶かした液を３０分にわたりこのジオール
へ滴加した。４時間後、反応液をメタノール（１０ｍＬ）で急冷した。溶媒を蒸
発させ、残渣の生成物を、飽和重炭酸ナトリウムとＣＨ₂ Ｃｌ₂ （それぞれ１０
０ｍＬ）の間に分画した。有機層を無水ＭｇＳＯ₄ で乾燥し、濃縮し、ヘキサン
−酢酸エチル−トリエチルアミン（６０：３９：１）を使用するシリカゲルのフ
ラッシュクロマトグラフィーに残渣をかけた。生成物を含む分画を集め、真空濃
縮し、乾燥して黄色の泡状固形物を得た。ＮＭＲにより、表題化合物が均一にジ
メトキシトリチル化された純粋な固形物であることが示された（５．０５ｇ，収
率：８３％）。

【０１５３】 実施例２８ （図９、３５） ジイソプロピルアミンテトラゾリド（２１４ｍｇ，１．２５ミリモル）及び２
−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ' ，Ｎ' −テトライソプロピルホスホロジアミダイ
ト（１．３ｍＬ，４．０ミリモル）を加えることにより、化合物（３４）（１．
５ｇ，２．５ミリモル）をＣＨ₂ Ｃｌ₂ 溶媒（２０ｍＬ）においてホスフィチル
化した。溶液を一晩撹拌した後、溶媒を蒸発させ、残渣をシリカカラムにかけ、
ヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン（５０：４９：１）で溶出した。適切
な分画を濃縮し、ホスフィチル化した化合物（１．６１ｇ）を黄色い泡状物とし
て得た（８１％）。

【０１５４】 実施例２９ Ｏ−ＮリンカーのＣＰＧへの付着（図１０、３６） P. D. Cook et al. （米国特許第５，５４１，３０７号）に記載の方法により
、スクシニル化キャップＣＰＧを製造した。化合物（３４）（０．８ミリモル）
、ジメチルアミノピリジン（０．２ミリモル）、スクシニル化キャップＣＰＧ（
２．０ｇ）、トリエチルアミン（１６０μＬ）及びＤＥＣ（４．０ミリモル）を
一緒にして２４時間振盪した。次いでペンタクロロフェニル（１．０ミリモル）
を加え、得られた混合液を２４時間振盪した。ＣＰＧビーズを濾過してとり、ピ
リジン（３０ｍＬ）、ジクロロメタン（２ｘ３０ｍＬ）、ＣＨ₃ ＯＨ（３０ｍＬ
）／エーテルでよく洗浄した。このＣＰＧ固形支持体をＰ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させ、
そのローディング量を２８μモル／ｇと定量した。

【０１５５】 実施例３０ ＯＮリンカーを用いるオリゴヌクレオチドの合成 化合物（３５）（オリゴヌクレオチドの５' 末端にあるＸとして示す）を用い
て、以下のオリゴヌクレオチドを合成した： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ５' ＸＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ３' ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ５' Ｘ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＣＣ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＴＴＴ Ｔ ３' 上記のオリゴヌクレオチドはホスホロチオエートとして合成した。化合物（３５
）は、０．１ＭのＣＨ₃ ＣＮ溶液として使用した。ＯＮ−リンカーのカップリン
グ効率は、トリチルの色で示されるように９５％を越えていた。オリゴヌクレオ
チドを固形支持体に保持して固相結合に用いた。

【０１５６】 実施例３１ ＯＮ−リンカーを用いるピレンのオリゴヌクレオチドへの結合 ＣＰＧのオリゴヌクレオチド（１μモル）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１をガラス製
の通気筒付きリアクターにとり、メチルヒドラジンの５％ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ／ＣＨ₃ ＯＨ（９：１）溶液（５ｍＬ）を加えた。このリアクターを３０分振盪した。メ
チルヒドラジンを排水し、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で洗浄し、このメチルヒドラジン反応を
繰り返した。ビーズをＣＨ₂ Ｃｌ₂ 、次いでエーテルで洗浄した後、乾燥させた
。ピレンブチル酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（１１０ｍｇ）のＤＭＦ（５
ｍＬ）溶液を加えた。２時間振盪した後、このピレンブチレート溶液を排水し、
オリゴヌクレオチドを室温で３０分、ＮＨ₄ ＯＨにおいて脱保護した。次いで、
水溶液を濾過し、ＨＰＬＣ分析を実行した。生成物のピークの保持時間は３４．
８５分であり、ダイオード−アレイの分光光度計によりピレンの吸収が示された
。

【０１５７】 実施例３２ ピレンブチルアルデヒドのオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）への
結合 ＭｅＮＨＮＨ₂ 処理後に、ピレンブチルアルデヒドをＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
へ加える。次いで、ＮａＣＮＢＨ₃ ／ＭｅＯＨを加えた。ＣＰＧを脱保護してＣ
ＰＧをＮＨ₄ ＯＨで開裂させることにより、オリゴヌクレオチドにピレンの結合
していることが示された。

【０１５８】 実施例３３ １，６−ヘキサン−ジオールＮ−ヒドロキシフタルイミド（６．５２５ｇ，０
．０３９モル）及びトリフェニルホスフィン（１０．２ｇ，０．０３９モル）の
無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液へ、撹拌させながら、アルゴン環境下、５℃で１
時間にわたり、ジエチルアジドカルボキシレート（ＤＥＡＤ：７．８３ｇ，０．
０４５モル）を加えた。次いで、この反応混合液を室温で一晩撹拌した。この明
黄色の溶液を真空濃縮してＴＨＦを除去し、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ と水との間に分画した
。次いで有機層を飽和ＮａＨＣＯ₃ 、飽和ＮａＣｌで洗浄した。次いで無水Ｍｇ
ＳＯ₄ で乾燥させ、シリカカラムにかけ、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）で溶
出させて、９．８ｇを得た。この物質にはＰｈ₃ Ｐ＝Ｏが混在していたので、Ｃ
Ｈ₂ Ｃｌ₂ ／エーテルを用いて再結晶させた。

【０１５９】 実施例３４ （図１１及び１２） イミダゾール／ＴＢＤＰＳ−ＣｌのＣＨ₂ Ｃｌ₂ 溶液を用いて５−ヘキセン−
１−オールをシリル化し、化合物（３７）を得る。次いで化合物（３７）を、（
化合物（３３）の実施例２５にあるように）ＯＳＯ₄ ／ＮＭＭＯでジヒドロキシ
ル化して、化合物（３８）を得る。化合物（３８）を１級アルコール官能基でジ
メトキシトリチル化して化合物（３９）を得る。次いで、Ｎ−ヒドロキシフタル
イミドを用いて Mitsunobu反応させ、化合物（４０）を得る。次いで、化合物（
４０）をＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフルオリド、１Ｍ ＴＨＦ溶液）
でジシリル化して化合物（４１）を得る。次いで、化合物（４１）をホスホロア
ミダイト（４２）へ誘導する。化合物（４１）はまた、別に制御孔ガラスビーズ
（化合物４３）に連結させた。

【０１６０】 実施例３５ ヘキサンで洗浄済みの６０％水素化ナトリウム油溶液８００ｍｇのＤＭＦ（１
００ｍＬ）懸濁液へ、アルゴン下で、２，６，９−（β−Ｄ−リボフラノシル）
プリン（５．６４ｇ，２０ミリモル）を加えた。室温で１時間撹拌した後、アリ
ルブロミド（２ｍＬ，１．１等量）をこの溶液へ加え、室温で一晩撹拌した。こ
の反応混合液を蒸発させ、シリカカラムにかけ、１％トリエチルアミン含有ＣＨ ₂ Ｃｌ₂ ／ＣＨ₃ ＯＨ（２０：１）で溶出させた。２' 及び３' −Ｏ−アリル化
合物の全収量は５．０２ｇ（７７％）であった。２' 及び３' 異性体の混合物を
、ＤＭＦ−ＤＭＡ／ＭｅＯＨで処理し、定量的な収量で、環外アミンを保護した
。次いで、この物質を５' −Ｏ−ジメトキシトリチル化して、５' −Ｏ−ジメト
キシトリチル−Ｎ−２−ホルムアミジン−２' −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）
−グアノシン及び５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−２−ホルムアミジン−３
' −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）グアノシンの混合物を２：１の比率で得た。
この最終化合物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した
。

【０１６１】 実施例３６ ヘキサンで洗浄済みの６０％水素化ナトリウム油溶液４０ｍｇの無水ＤＭＦ（
５ｍＬ）懸濁液へ、２，６−ジアミノ−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン
（２８２ｍｇ，１ミリモル）を加えた。この溶液へ２−（ブロモエトキシ）−ｔ
−ブチル−ジメチルシラン（２２０ｍＬ）を加えた。この混合液を室温で一晩撹
拌した。この反応混合液を蒸発させ、生成した油状物を水と酢酸エチルとの間に
分画した。有機層をＮａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させた。この反応混合液をシリカゲルで
精製し、２' 及び３' の異性体を得た。次いで、２' −物質をＤＭＦ−ＤＭＡ／
でアミン保護し、５' −ジメトキシトリチル化して、５' −Ｏ−ジメトキシトリ
チル−Ｎ−２−ホルムアデニン−２' −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−グアノ
シンと５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−ホルムアミジン−２' −Ｏ−（２
−ＴＢＤＭＳ−ヒドロキシエチル）グアニンの混合物を得た。

【０１６２】 実施例３７ オリゴヌクレオチド合成 未置換及び置換オリゴヌクレオチドは、ヨウ素酸化を用いた標準的なホスホロ
アミダイト化学を使用する自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ、モデル３８０Ｂ）で合成する。ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチ
ドでは、亜リン酸連結の段階的チオエート化に用いる３Ｈ−１，２−ベンゾジチ
オール−３−オン−１，１−ジオキシドの０．２Ｍアセトニトリル溶液に標準酸
化ボトルを置き換える。チオエート化の待ち工程を６８秒まで高め、キャッピン
グ工程を続ける。ＣＰＧカラムから分離し、濃水酸化アンモニウムにて５５℃（
１８時間）で脱保護した後、２．５倍量のエタノールで２度沈殿させることによ
って、０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液からオリゴヌクレオチドを精製する。分析用のゲ
ル電気泳動は、２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５４ｍＭトリス−ホウ酸緩
衝液、ｐＨ＝７．０において実施する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づ
いて、オリゴヌクレオチド及びホスホロチオエートが完全長の物質の８０％以上
であることを判定する。

【０１６３】 実施例３８ ＣＰＧ支持体に結合したヌクレオシドの５' −ヒドロキシルへ、２' −デオキ
シ−２' −置換５' −ジメトキシトリフェニルメチルリボヌクレオシドを付ける
一般的な方法 オリゴヌクレオチドの終端３' 位に存在する２' −デオキシ−２' −置換ヌク
レオシドを、５' −ＤＭＴ基として保護し（シトシン及びアデニンの環外アミノ
基をベンゾイル化し、グアニンのアミノをイソブチル化する）、トリフルオロ酢
酸／ブロモ酢酸の無水ピリジン混液、及びジメチルアミノピリジンで、５０℃、
５時間処理する。次いで、この溶液を減圧下で蒸発させ、薄いシロップとし、酢
酸エチルに溶かしてシリカゲルのカラムに通す。均質な分画を回収し、蒸発乾固
させる。アセトニトリル１０ｍＬ、３' −Ｏ−ブロモメチルエステル修飾ヌクレ
オシド１０μＭ、及びピリジン／ジメチルアミノピリジン（１：１）の溶液（１
０ｍＬ）を、標準条件によりすでに酸処理したＣＰＧチミジン（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の１μＭカラムへ、シリンジでゆっくりと（６０〜
９０秒）流し、フリーの５' −ヒドロキシル基を得る。他のヌクレオシド結合Ｃ
ＰＧカラムを利用してもよい。溶出液を回収し、再びシリンジを用いてカラムに
通す。この方法を３回繰り返す。ＣＰＧカラムをアセトニトリル１０ｍＬでゆっ
くり洗浄し、次いでＡＢＩ ３８０Ｂ核酸合成機に付ける。オリゴヌクレオチド
合成を開始する。チミジンエステル連結をＣＰＧ支持体から開裂させる、この濃
水酸化アンモニウムによる脱保護の標準条件では、初めはＣＰＧヌクレオシドに
結合していたチミジンへピリミジン修飾ヌクレオシドを連結させる３' ，５' エ
ステル連結も開裂される。このようにして、２' 置換ヌクレオシド、又は複素環
及び／又は糖に修飾を有する任意のヌクレオシドを、オリゴヌクレオチドの３'
末端で付けることができる。

【０１６４】 実施例３９ ２' 置換ヌクレオチドを取込むための修飾オリゴヌクレオチドの合成 Ａ．ＡＢＩ合成機 １−［２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル）−５' −Ｏ−（４
，４' −ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］チミンを取込むオリ
ゴヌクレオチド配列を、ダブルカップリングと増加したカップリング時間（５及
び１０分）で行なうホスホロアミダイト化学を活用して、ＡＢＩ ３８０Ｂにお
いて合成した。２' −Ｏ−アミノオキシエトキシホスホロアミダイトは、０．０
８Ｍの出発濃度で使用し、過酸化tert−ブチルの１０％アセトニトリル溶液を酸
化剤として使用した。デオキシホスホロアミダイトは０．２Ｍで使用した。２'
−Ｏ−アミノオキシエトキシ及びデオキシアミダイトの最終濃度は、それぞれ０
．０４Ｍと０．１Ｍであった。５５℃、６時間で、オリゴヌクレオチドをＣＰＧ
支持体から開裂させ、濃アンモニア水を用いて塩基保護基を除去した。Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ２５のサイズ排除クロマトグラフィーによりオリゴヌクレオチドを
精製し、エレクトロスプレイ質量分析法及び毛細管ゲル電気泳動により分析した
。デオキシホスホロアミダイトはＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
ＧｍｂＨより購入した。

【０１６５】 （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）ＣＴＣ ＧＴＡ ＣＣｔ ＴＴＣ ＣＧＧ ＴＣＣ
．ＬＲＭＳ（ＥＳ−）ｍ／ｚ：理論値：５４５３．２；実測値：５４５３．５。
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）ＣＴＣ ＧＴＡ Ｃｔｔ ｔｔＣ ＣＧＧ ＴＣＣ
．ＬＲＭＳ（ＥＳ−）ｍ／ｚ：理論値：５６９３．２；実測値：５６９２．９。
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）ＧＣＧ ｔｔｔ ｔｔｔ ｔｔｔ ｔＧＣ Ｇ．Ｌ
ＲＭＳ（ＥＳ−）ｍ／ｚ：理論値：５６２５．７；実測値：５６２５．９。

【０１６６】 Ｂ．Ｅｘｐｅｄｉｔｅ合成機 １−［２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル−５' −Ｏ−ジメト
キシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−Ｎ−ベンゾイル］チミンを取込
むオリゴヌクレオチドをＥｘｐｅｄｉｔｅ ８６９０合成機において合成した。
アミダイト１３０ｍｇを乾燥ＣＨ₃ ＣＮ（１．３ｍＬ，約０．０８Ｍ）に溶かし
た。ｔ−ＢｕＯＯＨの１０（ｖ／ｖ）％ＣＨ₃ ＣＮ溶液を酸化剤として用いた。
延長したカップリング時間と待ち時間を用い、１０分の酸化を利用した。このオ
リゴヌクレオチド合成は、優れたカップリング収率（＞９８％）を示した。オリ
ゴヌクレオチドを精製し、その質量特性とプロフィールを決定した。

【０１６７】 オリゴヌクレオチド 配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ─────────────────────────────────── Ｖ ＣＴＣ ＧＴＡ ＣＣａ ＴＴＣ ＣＧＧ ＴＣＣ ７ ＶＩ ＧＧａ ＣＣＧ Ｇａａ ＧＧＴ ａＣＧ ａＧ ８ ＶＩＩ ａＣＣ ＧａＧ ＧａＴ ＣａＴ ＧＴＣ ＧＴａ ＣＧＣ ９ （ここで、「ａ」は、１−［２' −Ｏ−（２−アミノオキシエチル）−β−Ｄ−
リボフラノシル］アデノシンを表す）

【０１６８】 実施例４０ 中央の２' −デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド領域に隣接する
２' −置換オリゴヌクレオチド領域を有するオリゴヌクレオチド 配列５' ＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧ３' （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
の１５マーＲＮＡ標的を、ＲＮＡプロトコールを用いて、ＤＮＡシークエンサー
において通常の方法で製造する。既知の文献の製造法（つまり、２' −Ｏ−メチ
ル）又は１９９２年３月５日公開の国際公開特許第ＷＯ９２／０３５６８号に記
載の方法のように、２' −デオキシ領域に隣接する領域に２' −Ｏ−置換ヌクレ
オチドを有する相補的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの系列を、２'
−Ｏ−置換ヌクレオチド前駆体を活用して製造する。２' −Ｏ−置換ヌクレオチ
ドは、ＤＮＡ合成機において普通の方法でその５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−
３' −ホスホロアミダイトとして加えられる。相補的なオリゴヌクレオチドは、
５' ＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣ ３' （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４）の配列を有する。２' −Ｏ−置換基は、上記オリゴヌクレオチドのＣＧＣ及
びＣＧ領域に位置している。使用される２' −Ｏ−置換基は、２' −アミノオキ
シエチル、２' −Ｏ−エチルアミノオキシエチル、及び２' −Ｏ−ジメチルアミ
ノオキシエチルである。

【０１６９】 実施例４１ ハイブリダイゼーション分析 Ａ．２' −修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの熱力学的評価 ２' −修飾オリゴヌクレオチドがその相補的なＲＮＡ又はＤＮＡ配列にハイブ
リダイズする能力を熱融解分析により判定する。ＲＮＡ相補体は、Ｔ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼ、及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８０Ｂで合成さ
れた鋳型ＤＮＡプロモータから合成する。ＲＮＡ分子種はＦＰＬＣ（ＬＫＢファ
ルマシア社）を用いるイオン交換により精製する。天然のアンチセンスオリゴヌ
クレオチド又は特定部位に２' −修飾を含有するオリゴヌクレオチドを化学量論
的な濃度でＲＮＡ又はＤＮＡ相補体のいずれかへ加え、Ｇｌｉｆｏｒｄ Ｒｅｓ
ｐｏｎｓｅ ＩＩ分光光度計を用いて、ランダムコイル移行に対する二重鎖形成
時の吸光度（２６０ｎｍ）の深色効果をモニターする。上記の測定は、１０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及びＮａＣｌ（イオン
強度１０、０．１Ｍ又は１．０Ｍ）の緩衝液で実施する。データは、１／Ｔｍ対
ｌｎ（Ｃｔ）のグラフ表示により分析し、ここで（Ｃｔ）は全オリゴヌクレオチ
ド濃度である。この分析から、熱力学的パラメータを決定する。形成されるヘテ
ロ二重鎖の二重鎖安定性に関して得られる情報に基づいて、オリゴヌクレオチド
内に修飾されたピリミジンを配置することのヘリックス安定性に関する効果につ
いて評価する。ハイブリッドの安定性を劇的に変える修飾は、自由エネルギー（
ΔＧ）を減少させるので、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての有用性に関
する決定が下される。

【０１７０】 以下の表（表１）に示すように、本発明の２' −置換ヌクレオシドをオリゴヌ
クレオチドへ取込ませると、修飾されたオリゴヌクレオチド鎖（アンチセンス鎖
）とその相補ＲＮＡ鎖（センス鎖）の二重鎖安定性が有意に増加し得る。二重鎖
の安定性は、アンチセンス鎖内の２' −置換ヌクレオシドの数が増えるにつれて
増加した。表１から明らかなように、２' −置換ヌクレオシドを追加することは
、個々のヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド配列におけるそのヌクレオシドの
位置にかかわらず、二重鎖の安定性の増加をもたらした。 表１では、小文字のヌクレオシドは本発明の置換基を包含するヌクレオシドを
表す。

【０１７１】 ＤＮＡ（アンチセンス）−ＲＮＡ（センス）二重鎖の安定性に対する２' −Ｏ−
アミノオキシエトキシ修飾の効果

【表１】 ｔ＝１−［２' −Ｏ−（２−アミノオキシエチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］
チミン。ａ＝１−［２' −Ｏ−（２−アミノオキシエチル）−β−Ｄ−リボフラ
ノシル］アデノシン。^* ＝センス鎖のＤＮＡにハイブリダイズしたもの。

【０１７２】

【表２】 表１で、「ｓｕｂｓ」は、上記のように、置換の数である。

【０１７３】 表１から明らかなように、ＲＮＡと本発明の２' 置換基を含有するオリゴヌク
レオチドとの間で形成される二重鎖は、ハイブリダイゼーションの熱力学的安定
性により測定されるように、増加した結合安定性を示した。理論に縛られること
を望まないが、これは、本発明の２' −置換基があるために、２' −置換ヌクレ
オシドの糖部分が実質的に３' −末端コンホメーションをとり、これにより、オ
リゴヌクレオチド−ＲＮＡ複合体がＡ−タイプのらせんコンホメーションをとる
ためであると今のところ考えられている。

【０１７４】 実施例４２ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−Ｏ² −２' −アンヒドロ−５−メチ
ルウリジン（１０１） Ｏ² −２' −アンヒドロ−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ．Ｂｉｏ．Ｓｉｎｔ．
，Ｖａｒｅｓｅ，イタリア、１００．０ｇ，０．４１６ミリモル）、ジメチルア
ミノピリジン（０．６６ｇ，０．０１３当量、０．００５４ミリモル）を、アル
ゴン下、周囲温度で機械的に撹拌しながら乾燥ピリジン（５００ｍＬ）に溶かし
た。tert−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ｇ，１１９．０ｍＬ，１
．１当量）を一時に加えた。この反応液を周囲温度で１６時間撹拌した。Ｔｌｃ
（Ｒｆ：０．２２，酢酸エチル）は、完全な反応を示した。この溶液を減圧濃縮
して、濃い油状物とした。ジクロロメタン（１Ｌ）と飽和重炭酸ナトリウム（２
ｘ１Ｌ）及び鹹水（１Ｌ）との間にこれを分画した。有機層を硫酸マグネシウム
で乾燥させ、減圧濃縮して濃い油状物とした。酢酸エチル及びエチルエーテルの
１：１混液（６００ｍＬ）にこの油状物を溶かし、この溶液を−１０℃に冷却し
た。生成した結晶様の生成物を濾過して回収し、エチルエーテル（３ｘ２００ｍ
Ｌ）で洗浄して乾燥し（４０℃，１ｍｍＨｇ，２４時間）、白色の固形物１４９
ｇ（７４．８％）を得た。ＴＬＣ及びＮＭＲは純粋な生成物に一致していた。

【０１７５】 実施例４３ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル
）−５−メチルウリジン（１０２） ２Ｌのステンレス鋼製、非撹拌圧リアクターにホウ素／テトラヒドロフラン（
１．０Ｍ，２．０当量、６２２ｍＬ）を加えた。排気フードにおいて手動で撹拌
させながら、エチレングリコール（３５０ｍＬ、過剰量）を、水素ガスの発生が
止むまで、はじめは慎重に加えた。５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−
Ｏ² −２' −アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ｇ，０．３１１モル）及
び重炭酸ナトリウム（０．０７４ｇ，０．００３当量）を手動で撹拌させながら
加えた。リアクターをシールして、内部温度が１６０℃に達するまで油浴で加熱
し、１６時間この温度を維持した（圧力＜１００ｐｓｉｇ）。反応容器を周囲温
度へ冷やし、開封した。ＴＬＣ（所望の生成物はＲｆ：０．６７、ａｒａ−Ｔの
副生成物はＲｆ：０．８２、酢酸エチル）は、生成物へ約７０％変換したことを
示した。さらに副生成物が形成するのを避けるために、反応を停止させ、エチレ
ングリコールを除去するのに使用されるより極端な条件で、温水浴（４０〜１０
０℃）において減圧（１０〜１ｍｍＨｇ）濃縮した。［他のやり方では、低沸点
溶媒の消失後、酢酸エチルと水との間で残りの溶液を分画し得る。生成物は有機
層にある。］カラムクロマトグラフィー（シリカゲル２ｋｇ、酢酸エチル−ヘキ
サンの１：１〜４：１勾配液）により残渣を精製した。適切な分画を集め、溶媒
を除去し、乾燥させて白色のカリカリした泡状物（８４ｇ，５０％）を得た。こ
れには出発物質（１７．４ｇ）と純粋な再使用し得る出発物質２０ｇが混在して
いた。出発物質及び低純度の回収された出発物質をもとにした収率は５８％であ
った。ＴＬＣとＮＭＲは、９９％の純生成物に一致していた。

【０１７６】

【化３２】

【０１７７】 実施例４４ ２' −Ｏ−［（２−フタルイミドキシ）エチル］−５' −ｔ−ブチルジフェニル
シリル−５−メチルウリジン（１０３） ヌクレオシド（１０２）（２０ｇ，３６．９８ミリモル）をトリフェニルホス
フィン（１１．６３ｇ，４４．３６ミリモル）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド
（７．２４ｇ，４４．３６ミリモル）と混合した。次いで高真空下、４０℃で２
日間、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させた。この反応混合液をアルゴンで処理し、乾燥ＴＨ
Ｆ（３６９．８ｍＬ、アルドリッチ、密封ボトル）を加えて澄明な溶液を得た。
この反応混合液へジエチルアゾジカルボキシレート（６．９８ｍＬ，４４．３６
ミリモル）を滴加した。滴加の速度は、生成する深赤の発色が丁度消えてから次
の一滴を加えるように維持する。この滴加が完了してから、この反応液を４時間
撹拌した。そのときまでに、ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン、６０：４０）は、
反応の完了を示した。真空で溶媒を蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラ
ムにかけ、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出させ、（１０３）（２１
．８１９ｇ，８６％）を白色の泡状物として得た。Ｒｆ：０．５６（酢酸エチル
：ヘキサン、６０：４０）。ＭＳ（ＦＡＢ^- ）ｍ／ｅ ６８４（Ｍ−Ｈ⁺ ）。

【０１７８】 実施例４５ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−［（２−ホルムアルドキ
シミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１０４） 化合物（１０３）（３．１ｇ，４．５ミリモル）を乾燥ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （４．５
ｍＬ）に溶かし、メチルヒドラジン（３００ｍＬ，４．６４ミリモル）を−１０
℃〜０℃で滴加した。１時間後、この混合液を濾過し、濾液を氷冷ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で洗浄し、合わせた有機層を水、鹹水で洗浄し、無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させた
。この溶液を濃縮して、２' −Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得て、次
いでこれをＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）に溶かした。これへホルムアルデヒド（２
０ｗ／ｗ％水溶液、１．１当量）を加え、１時間混合した。溶媒を真空除去し、
残渣をクロマトグラフ処理して化合物（１０４）（１．９５ｇ，７８％）を白色
の泡状物として得た。Ｒｆ：０．３２（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。ＭＳ（
エレクトロスプレイ^- ）ｍ／ｅ：５６６（Ｍ−Ｈ⁺ ）。

【０１７９】 実施例４６ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノオキシエチル］−５−メチルウリジン（１０５） 化合物（１０４）（１．７７ｇ，３．１２ミリモル）を、ｐ−トルエンスルホ
ン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）の１Ｍ乾燥ＭｅＯＨ溶液（３０．６ｍＬ）に溶か
した。この溶液へ、不活性気体下、１０℃でシアノホウ酸水素ナトリウム（０．
３９ｇ，６．１３ミリモル）を加えた。この反応混合物を１０℃で１０分間撹拌
した。その後、氷浴からこの反応容器を取り出し、ＴＬＣ（５％ ＭｅＯＨ／Ｃ
Ｈ₂ Ｃｌ₂ ）により反応をモニターしながら、室温で２時間撹拌した。ＮａＨＣ
Ｏ₃ 水溶液（５％，１０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した
。酢酸エチル層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、蒸発乾固させた。１Ｍ ＰＰＴ
Ｓ／ＭｅＯＨ溶液（３０．６ｍＬ）に残渣を溶かした。ホルムアルデヒド（２０
ｗ／ｗ％，３０ｍＬ，３．３７ミリモル）を加え、この反応混合液を室温で１０
分間撹拌した。反応混合液を氷浴で１０℃へ冷却し、シアノホウ酸水素ナトリウ
ム（０．３９ｇ，６．１３ミリモル）を加え、反応混合液を１０℃で１０分間撹
拌した。１０分後、反応混合液を氷浴から取り出し、室温で２時間撹拌した。こ
の反応混合液へ５％ ＮａＨＣＯ₃ 溶液（２５ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２ｘ
２５ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、蒸発乾固
させた。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で溶出させ、（１０５）（１４．６ｇ，８０％）を白色
の泡状物として得た。Ｒｆ：０．３５（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。ＭＳ（
ＦＡＢ⁺ ）ｍ／ｅ：５８４（Ｍ＋Ｈ⁺ ）。

【０１８０】 実施例４７ ２' −Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１０６） トリエチルアミントリヒドロフルオリド（３．９１ｍＬ，２４．０ミリモル）
を乾燥ＴＨＦ及びトリエチルアミン（１．６７ｍＬ，１２ミリモル、乾燥品、Ｋ
ＯＨ上に保管）に溶かした。次いで、このトリエチルアミン−２ＨＦの混合液へ
化合物（１０５）（１．４０ｇ，２．４ミリモル）を加え、室温で２４時間撹拌
した。反応はＴＬＣ（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）によりモニターした。溶
媒を真空除去し、残渣をフラッシュカラムにかけ、１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃ
ｌ₂ で溶出させて（１０６）（７６６ｍｇ，９２．５％）を得た。Ｒｆ：０．２
７（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。ＭＳ（ＦＡＢ⁺ ）ｍ／ｅ：３４６（Ｍ＋Ｈ ⁺ ）。

【０１８１】 実施例４８ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウ
リジン（１０７） 化合物（１０６）（７５０ｍｇ，２．１７ミリモル）を、４０℃で一晩、高真
空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させた。次いで、無水ピリジン（２０ｍＬ）と共沸させ
た。得られた残渣をアルゴン気体下でピリジン（１１ｍＬ）に溶かした。この混
合液へ、４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ｍｇ，２．６０ミリモル）、４
，４' −ジメトキシトリチルクロリド（８８０ｍｇ，２．６０ミリモル）を加え
、この反応混合液を、出発物質が消失するまで室温で撹拌した。ピリジンを真空
除去し、残渣をクロマトグラフ処理し、１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （ピリ
ジン数滴を含有する）で溶出させて、（１０７）（１．１３ｇ，８０％）を得た
。Ｒｆ：０．４４（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。ＭＳ（ＦＡＢ⁺ ）ｍ／ｅ
：６４８（Ｍ＋Ｈ⁺ ）。

【０１８２】 実施例４９ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−
５−メチルウリジン−３' −［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル
ホスホロアミダイト］（１０８） 化合物（１０７）（１．０８ｇ，１．６７ミリモル）をトルエン（２０ｍＬ）
と共沸させた。この残渣へＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾリド（０．２
９ｇ，１．６７ミリモル）を加え、４０℃で一晩、高真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥
させた。次いで、この反応混合液を無水アセトニトリル（８．４ｍＬ）に溶かし
、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ¹ ，Ｎ¹ −テトライソプロピルホスホロアミダ
イト（２．１２ｍＬ，６．０８ミリモル）を加えた。この反応混合液を、不活性
気体の下、周囲温度で４時間撹拌した。反応の進行はＴＬＣ（へキサン：酢酸エ
チル、１：１）によりモニターした。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチル（７０
ｍＬ）に溶かし、５％ ＮａＨＣＯ₃ 水溶液（４０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチ
ル層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させて、濃縮した。得られた残渣をクロマトグラ
フ処理し（溶出液：酢酸エチル）、（１０８）（１．０４ｇ，７４．９％）を泡
状物として得た。Ｒｆ：０．２５（酢酸エチル：ヘキサン、１：１）。³¹Ｐ Ｎ
ＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）δ 150.8ppm ；ＭＳ（ＦＡＢ⁺ ）ｍ／ｅ：８４８（Ｍ＋Ｈ⁺ ）。

【０１８３】 実施例５０ ２' ／３' −Ｏ−アリルアデノシン（１０９） アデノシン（２０ｇ，７４．８４ミリモル）を、４０℃で２日間、高真空下、
Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させた。次いで、不活性気体の下でＤＭＦに懸濁した。水素化
ナトリウム（２．５ｇ，７４．８４ミリモル、鉱油の６０％分散液）を加え、室
温で１０分間撹拌した。次いで、アリルブロミド（７．１４ｍＬ，８２．４５ミ
リモル）を１滴ずつ加え、この反応混合液を室温で一晩撹拌した。ＤＭＦを真空
除去し、残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層をデカント
した。濾液に生成物が含まれていた。次いで、フラッシュカラムにかけ、１０％
ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で溶出させて、（１０９）（１５．１９ｇ，６６％）
を得た。Ｒｆ：０．４，０．４ａ（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。

【０１８４】 実施例５１ ２' ／３' −Ｏ−アリル−Ｎ⁶ −ベンゾイルアデノシン（１１０） 化合物（１０９）（１５．１９ｇ，５１．１ミリモル）を、４０℃で一晩、高
真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させた。次いで、不活性気体の下で無水ピリジン（５
０４．６ｍＬ）に溶かした。トリメチルクロロシラン（３２．０２ｍＬ，２５２
．３ミリモル）を０℃で加え、この反応混合液を不活性気体の下で１時間撹拌し
た。次いで、ベンゾイルクロリド（２９．４ｍＬ，２５２．３ミリモル）を１滴
ずつ加えた。ベンゾイルクロリドの滴加が終了した時点で、この反応混合液を室
温へ戻し、４時間撹拌した。次いで、この反応混合液を氷浴中で０℃にした。水
（１００．９ｍＬ）を加え、この反応混合液を３０分撹拌した。次いで、ＮＨ₄ ＯＨ（１００．０ｍＬ，３０ｗ／ｗ％水溶液）を加え、反応混合液を０℃に保ち
ながら、さらに１時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、水とエーテルの間で残渣を分
画した。油状物として沈澱する生成物をクロマトグラフ処理し（５％ ＭｅＯＨ
／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)、（１１０）（１２．６７ｇ，６２％）を白色の泡状物として得
た。

【０１８５】 実施例５２ ３' −Ｏ−アリル−５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−Ｎ⁶ −ベンゾイ
ル−アデノシン（１１１） 化合物（１１０）（１１．１７ｇ，２７．８４ミリモル）を、４０℃で真空下
、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させ、次いで、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （５６ｍＬ，アルドリッチ製、
密封品）に溶かした。４−ジメチルアミノピリジン（０．３４ｇ，２．８ミリモ
ル）、トリエチルアミン（２３．８２ｍＬ，１６７ミリモル）及びｔ−ブチルジ
フェニルシリルクロリドを加えた。この反応混合液を１２時間激しく撹拌した。
反応はＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン、１：１）によりモニターした。次いで、
ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （５０ｍＬ）で希釈し、水（３ｘ３０ｍＬ）で洗浄した。ジクロロ
メタン層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させてから、蒸発乾固させた。残渣をフラッ
シュクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル：ヘキサン、１：１）により精製
し、（１１１）（８．８５ｇ，４９％）を白色の泡状物として得た。Ｒｆ：０．
３５（酢酸エチル：ヘキサン、１：１）。

【０１８６】 実施例５３ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２
，３−ジヒドロキシプロピル）−アデノシン（１１２） 化合物（１１１）（５．５ｇ，８．４６ミリモル）、４−メチルモルホリン−
Ｎ−オキシド（１．４３ｇ，１２．１８ミリモル）をジオキサン（４５．４２ｍ
Ｌ）に溶かした。ＯＳＯ₄ の４％水溶液（１．９９ｍＬ，０．３１ミリモル）を
加えた。この反応混合液を遮光して、３時間撹拌した。反応はＴＬＣ（５％ Ｍ
ｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）によりモニターした。酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え
、得られた反応混合液を水（１ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎ
ａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させて、蒸発させ、（１１２）（５．９ｇ）を得て、精製せず
に次の工程に使用した。Ｒｆ：０．１７（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。

【０１８７】 実施例５４ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（ホ
ルミルメチル）−アデノシン（１１３） 化合物（１１２）（５．５９ｇ，８．１７ミリモル）を乾燥ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （４
０．４２ｍＬ）に溶かした。シリカゲルに吸着させたＮａＩＯ₄ （Ref. J. Org.
Chem. 1997, 62, 2622-2624）（１６．３４ｇ，２ｇ／ミリモル）を加え、周囲
温度で３０分撹拌した。反応はＴＬＣ（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)によりモ
ニターした。反応混合液を濾過し、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で濾液を十分洗浄した。ジクロ
ロメタン層を蒸発させ、アルデヒド（１１３）（５．６０ｇ）を得て、精製せず
に次の工程に使用した。Ｒｆ：０．３（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。

【０１８８】 実施例５５ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−Ｎ⁶ −２' −Ｏ−（２−ヒドロキシ
エチル）−アデノシン（１１４） 化合物（１１３）（５．５５ｇ，８．５０ミリモル）をｐ−トルエンスルホン
酸ピリジニウムの１Ｍ無水ＭｅＯＨ溶液（８５ｍＬ）に溶かした。反応混合液を
湿気から保護した。シアノホウ酸水素ナトリウム（１．０８ｇ，１７．２７ミリ
モル）を加え、反応混合液を周囲温度で５時間撹拌した。反応の進行はＴＬＣ（
５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）によりモニターした。反応混合液を酢酸エチル
（１５０ｍＬ）で希釈し、次いで、５％ ＮａＨＣＯ₃ （７５ｍＬ）及び鹹水（
７５ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させて、蒸発乾
固させた。フラッシュクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）に
より残渣を精製し、（１１４）（４．３１ｇ，７７．８％）を得た。Ｒｆ：０．
２１（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。ＭＳ（ＦＡＢ⁺ ）ｍ／ｅ：６５５（Ｍ＋
Ｈ⁺ ），６７７（Ｍ＋Ｎａ⁺ ）。

【０１８９】 実施例５６ ５' −tert−ブチルジフェニルシリル−Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−フ
タルイミドオキシエチル）−アデノシン（１１５） 化合物（１１４）（３．２２ｇ，４．９２ミリモル）をトリフェニルホスフィ
ン（１．５５ｇ，５．９０ミリモル）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（０．９
６ｇ，５．９０ミリモル）とともに混合した。４０℃で真空下、２日間Ｐ₂ Ｏ₅ 上でこれを乾燥させた。不活性気体の下で、乾燥した混合物を無水ＴＨＦ（４９
．２ｍＬ）に溶かした。アゾジカルボン酸ジエチル（０．９３ｍＬ，５．９０ミ
リモル）を滴加した。滴加の速度は、生成する深赤の発色が丁度消えてから次の
一滴を加えるように維持する。この滴加が完了した後、ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘ
キサン、７０：３０）でモニターしながら、この反応液を４時間撹拌した。溶媒
を真空除去し、残渣を酢酸エチル（７５ｍＬ）に溶かした。酢酸エチル層を水（
７５ｍＬ）で洗浄し、次いでＮａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、濃縮して、クロマトグラ
フ処理し（酢酸エチル：ヘキサン、７０：３０）、（１１５）（３．６０ｇ，９
１．５％）を得た。Ｒｆ：０．２７（酢酸エチル：ヘキサン、７：３）。ＭＳ（
ＦＡＢ⁺ ）ｍ／ｅ：７９９（Ｍ＋Ｈ⁺ ），８２１（Ｍ＋Ｎａ⁺ ）。

【０１９０】 実施例５７ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２
−ホルムアルドキシミノオキシエチル）アデノシン（１１６） 化合物（１１５）（３．５ｇ，４．２８ミリモル）をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （４３．８
ｍＬ）に溶かした。Ｎ−メチルヒドラジン（０．２８ｍＬ，５．２７ミリモル）
を−１０℃で加え、この反応混合液を−１０℃〜０℃で１時間撹拌した。反応は
ＴＬＣ（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）によりモニターした。形成した白色の
沈澱物を濾過し、濾液を氷冷ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で十分洗浄した。水浴の温度を２５℃
未満に保ちながら、回転エバポレーターでジクロロメタン層を蒸発させた。次い
で、得られた残渣をＭｅＯＨ（６５．７ｍＬ）に溶かした。ホルムアルデヒド（
７１０ｍＬ，４．８ミリモル、２０％水溶液）を加え、周囲温度で１時間撹拌し
た。反応を¹ Ｈ ＮＭＲによりモニターした。反応混合液を濃縮し、クロマトグ
ラフ処理（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）して、（１１６）（２．４７ｇ，８
３％）を白色の泡状物として得た。Ｒｆ：０．３７（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃ
ｌ₂)。ＭＳ（ＦＡＢ⁺ ）ｍ／ｅ：６８１（Ｍ＋Ｈ⁺ ）。

【０１９１】 実施例５８ ５' −tert−ブチルジフェニルシリル−Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−Ｎ
，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）アデノシン（１１７） 化合物（１１６）（２．２ｇ，３．２３ミリモル）をｐ−トルエンスルホン酸
ピリジニウム（ＰＰＴＳ）の１Ｍ ＭｅＯＨ溶液（３２ｍＬ）に溶かした。反応
混合液を湿気から保護した。シアノホウ酸水素ナトリウム（０．３１ｇ）を１０
℃で加え、反応混合液を１０℃で１０分間撹拌した。次いでこれを周囲温度とし
、ＴＬＣ（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）によりモニターしながら、２時間撹
拌した。５％重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（３ｘ
５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させて、蒸発乾
固させた。残渣を１Ｍ ＰＰＴＳ／ＭｅＯＨ（３２ｍＬ）に溶かした。ホルムア
ルデヒド（０．５４ｍＬ，３．５５ミリモル、２０％水溶液）を加え、室温で１
０分撹拌した。シアノホウ酸水素ナトリウム（０．３１ｇ）を１０℃で加え、１
０℃で１０分撹拌した。反応混合液を氷浴から取り出し、ＴＬＣ（５％ ＭｅＯ
Ｈ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）によりモニターしながら、室温でさらに２時間撹拌した。反
応混合液を５％ ＮａＨＣＯ₃ 水溶液（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３
ｘ５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を乾燥させ、蒸発させ、クロマトグラフ
処理（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）して、（１１７）（１．９ｇ，８１．８
％）を得た。Ｒｆ：０．２９（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。ＭＳ（ＦＡＢ⁺ ）ｍ／ｅ：６９７（Ｍ＋Ｈ⁺ ），７１９（Ｍ＋Ｎａ⁺ ）。

【０１９２】 実施例５９ Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）アデノ
シン（１１８） 無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）にＥｔ₃ Ｎ−３ＨＦ（１．６ｇ，１０ミリモル）を溶
かした溶液へトリエチルアミン（０．７１ｍＬ，５．１２ミリモル）を加えた。
次いで、この混合液へ化合物（１１７）（０．７２ｇ，１ミリモル）を加え、不
活性気体の下、室温で２４時間撹拌した。反応はＴＬＣ（１０％ ＭｅＯＨ／Ｃ
Ｈ₂ Ｃｌ₂ ）によりモニターした。溶媒を真空下で除去し、クロマトグラフ処理
（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）して、（１１８）（０．４０９ｇ，８９％
）を得た。Ｒｆ：０．４０（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。ＭＳ（ＦＡＢ⁺ ）ｍ／ｅ：４５９（Ｍ＋Ｈ⁺ ）。

【０１９３】 実施例６０ ５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ⁶ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−
ジメチルアミノオキシエチル）アデノシン（１１９） 化合物（１１８）（０．４ｇ，０．８７ミリモル）を、４０℃で真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で一晩乾燥させた。４−ジメチルアミノピリジン（０．０２２ｇ，０．１
７ミリモル）を加えた。次いで、これを無水ピリジン（９ｍＬ）と共沸させた。
不活性気体の下で、残渣を無水ピリジン（２ｍＬ）に溶かし、４，４' −ジメト
キシトリチルクロリド（０．５８ｇ，１．７２ミリモル）を加え、室温で４時間
撹拌した。ＴＬＣ（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）は、反応の完了を示した。
ピリジンを真空下で除去し、残渣をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （５０ｍＬ）に溶かし、５％
ＮａＨＣＯ₃ 水溶液（３０ｍＬ）、次いで鹹水（３０ｍＬ）で洗浄した。ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、蒸発させた。残渣をクロマトグラフ処
理（ピリジン数滴を含有する５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）して、（１１９）
（０．５ｇ，７５％）を得た。Ｒｆ：０．２０（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）。ＭＳ（エレクトロスプレイ^- ）ｍ／ｅ：７５９（Ｍ＋Ｈ⁺ ）。

【０１９４】 実施例６１ Ｎ⁶ −ベンゾイル−５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオ
キシエチル）アデノシン−３' −Ｏ−ホスホロアミダイト（１２０） 化合物（１１９）（０．４７ｇ，０．６２ミリモル）をトルエン（５ｍＬ）と
共沸させた。この残渣をＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾリド（０．１０
６ｇ，０．６２ミリモル）と混合し、一晩、高真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させた
。次いで、不活性気体の下でこれを無水ＣＨ₃ ＣＮ（３．２ｍＬ）に溶かした。
２−シアノエチル−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．７９ｍＬ，
２．４８ミリモル）を滴加し、この反応混合液を、不活性気体の下、室温で６時
間撹拌した。反応はＴＬＣ（ピリジン数滴を含有する酢酸エチル）によりモニタ
ーした。溶媒を除去し、残渣を酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶かし、５％ ＮａＨ
ＣＯ₃ 水溶液（２ｘ２５ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で
乾燥させて、蒸発させ、残渣をクロマトグラフ処理し（ピリジン数滴を含有する
酢酸エチル）、（１２０）（０．４５ｇ，７６％）を得た。ＭＳ（エレクトロス
プレイ^- ）ｍ／ｅ：９５９（Ｍ＋Ｈ⁺ ）。³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）δ 151.3
6, 150.77 ppm 。

【０１９５】 実施例６２ ２'/３'-Ｏ−アリル−２，６−ジアミノプリンリボシド（１２１及び１２２） ２，６−ジアミノプリンリボシド（３０ｇ，１０６．４ミリモル）を無水ＤＭ
Ｆ（５４０ｍＬ）に懸濁させた。反応槽をアルゴンで処理した。水素化ナトリウ
ム（３．６ｇ，１０６．４ミリモル、鉱油の６０％分散液）を加え、反応液を１
０分撹拌した。アリルブロミド（１４．１４ｍＬ，１１７．２２ミリモル）を２
０分にわたり滴加した。得られた反応混合液を室温で２０時間撹拌した。ＴＬＣ
（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）は、出発物質の完全な消失を示した。真空
下でＤＭＦを除去し、残渣をシリカに吸着させてからフラッシュカラムにかけ、
１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で溶出させた。２' 及び３' アリル化生成物の
混合物を含有する分画をプールし、濃縮乾固して（１２１）及び（１２２）の混
合物（２６．３８ｇ，７７％）を得た。Ｒｆ：０．２６，０．４（１０％ Ｍｅ
ＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。

【０１９６】 実施例６３ ２' −Ｏ−アリル−グアノシン（１２３） （１２１）及び（１２２）の混合物（２０ｇ，６２．１２ミリモル）をリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬに懸濁させ、アデノシンデアミナー
ゼ（１ｇ）を加えた。反応槽を開放させたまま、得られた溶液をごくゆっくりと
６０時間撹拌した。次いで、反応混合液を氷浴で１時間冷やし、生成した沈澱物
を濾過し、高真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥し、（１２３）（１３．９２ｇ、収率６
９．６％）を白色の粉末として得た。Ｒｆ：０．１９（２０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ ₂ Ｃｌ₂)。

【０１９７】 実施例６４ ２' −Ｏ−アリル−３' ，５' −ビス（tert−ブチルジフェニルシリル）グアノ
シン（１２４） ２' −Ｏ−アリル−グアノシン（６ｇ，１８．６９ミリモル）をイミダゾール
（１０．１８ｇ，１４．９５２ミリモル）と混合し、高真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で一
晩乾燥させた。次いで、これをアルゴンで処理した。無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）を
加え、この反応混合液とともに１０分撹拌した。tert−ブチルジフェニルシリル
クロリド（１９．４４ｍＬ，７４．７６ミリモル）をこれへ加え、この反応混合
液をアルゴン気体下で一晩撹拌した。ＤＭＦを真空除去し、残渣を酢酸エチル（
１００ｍＬ）に溶かし、水（２ｘ７５ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎ
ａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣をフラッシュカラムにかけ、５％
ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で溶出させた。生成物を含有する分画をプールし、蒸
発させて、（１２４）（１０．８４ｇ，収率７２％）を白色の泡状物として得た
。Ｒｆ：不明。ＭＳ（ＦＡＢ⁺ ）ｍ／ｅ：８００（Ｍ＋Ｈ⁺ ），８２２（Ｍ＋Ｎ
ａ⁺ ）。

【０１９８】 実施例６５ ２' −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−３' ，５' −ビス（tert−ブチルジフェ
ニルシリル）−グアノシン（１２５） 化合物（１２４）（９ｇ，１１．２３ミリモル）をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （８０ｍＬ）
に溶かした。この澄明な溶液へアセトン（５０ｍＬ）、４−メチルモルホリン−
Ｎ−オキシド（１．８９ｇ，１６．１７ミリモル）を加えた。この反応フラスコ
は遮光した。このようにしてから、四酸化オスミウムの４％水溶液を加え、この
反応混合液を室温で６時間撹拌した。反応液の容量を半分まで濃縮し、酢酸エチ
ル（５０ｍＬ）を加えた。次いで、水（３０ｍＬ）及び鹹水（３０ｍＬ）で洗浄
した。酢酸エチル層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、蒸発乾固させた。次いで、
残渣をＣＨ₂ Ｃｌ₂ に溶かし、シリカゲルに吸着させたＮａＩＯ₄ （２１．１７
ｇ，２ｇ／ミリモル）を加え、反応混合液とともに３０分撹拌した。反応混合液
を濾過し、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ でシリカを十分洗浄した。集めたＣＨ₂ Ｃｌ₂ 層を蒸発
乾固させた。ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）の１Ｍ乾燥Ｍｅ
ＯＨ溶液（９９．５ｍＬ）に、不活性気体下で、残渣を溶かした。この澄明な溶
液へ室温でシアノホウ酸水素ナトリウム（１．１４ｇ，１８．２ミリモル）を加
え、室温で４時間撹拌した。この反応混合液へ５％重炭酸ナトリウム水溶液（５
０ｍＬ）をゆっくり加え、酢酸エチル（２ｘ５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル
層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣をフラッシュカラムに
かけ、１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で溶出させて、（１２５）（６．４６ｇ
，収率７２％）を得た。ＭＳ（エレクトロスプレイ^- ）ｍ／ｅ：８０２（Ｍ−Ｈ ⁺ ）。

【０１９９】 実施例６６ ２' −Ｏ−［（２−フタルイミドキシ）エチル］−３' ，５' −ビス（tert−ブ
チルジフェニルシリル）グアノシン（１２６） 化合物（１２５）（３．７ｇ，４．６１ミリモル）をＰｈ₃ Ｐ（１．４０ｇ，
５．３５ミリモル）及びヒドロキシフタルイミド（０．８７ｇ，５．３５ミリモ
ル）と混合した。次いで高真空下、４０℃で２日間、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させた。
不活性気体の下で無水ＴＨＦ（４６．１ミリモル）を加えて澄明な溶液を得た。
ジエチルアジドカルボキシレート（０．７３ｍＬ，４．６１ミリモル）を、赤色
が消えてから次の一滴を加えるように滴加した。次いで、得られた溶液を室温で
４時間撹拌した。ＴＨＦを真空下で除去し、残渣を酢酸エチル（７５ｍＬ）に溶
かし、水（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥
させ、濃縮乾固させた。カラムクロマトグラフィーにより残渣を精製し、７％ ＭｅＯＨ／酢酸エチルで溶出させ、（１２６）（２．６２ｇ，収率６０％）を得
た。Ｒｆ：０．４８（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。ＭＳ（ＦＡＢ^- ）ｍ／
ｅ ９４７（Ｍ−Ｈ⁺ ）。

【０２００】 実施例６７ ２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル）−３' ，５' −Ｏ−ビス−
tert−ブチルジフェニルシリル−Ｎ２−イソブチリルグアノシン（１２７） ２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル）−３' ，５' −Ｏ−ビス
−tert−ブチルジフェニルシリル−グアノシン（３．６６ｇ，３．８６ミリモル
）を無水ピリジン（４０ｍＬ）に溶かし、この溶液を５℃に冷やし、イソブチリ
ルクロリド（０．８０８ｍＬ，７．７２ミリモル）を滴加した。この反応混合液
を２５℃へ温め、２時間後、追加のイソブチリルクロリド（０．４０ｍＬ，３．
３５ミリモル）を２５℃で加えた。１時間後、３０℃で真空（０．１トル）にお
いて溶媒を蒸発させ、得られた泡状物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に溶かし、希
薄な懸濁液とした。この懸濁液を水（２ｘ１５ｍＬ）及び鹹水（４ｍＬ）で洗浄
し、有機層を分離してＭｇＳＯ₄ で乾燥させた。溶媒を真空蒸発させて泡状物を
得て、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ −ＭｅＯＨ（９４：６）ｖ／ｖを用いるカラムクロマトグラ
フィーによりこれを精製し、表題化合物（２．５７ｇ，収率６５％）を白色の泡
状物として得た。

【０２０１】

【化３３】

【０２０２】 Ａ及びＴの類似体についての上記化学を用いて、対応するホスホロアミダイト
へ上記化合物を誘導体化し、化合物（１２８）を得た。

【０２０３】 実施例６８ ３' −Ｏ−アセチル−２' −Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）
−５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−チミジン（１２９） 化合物（１０５）（３．０４ｇ，５．２１ミリモル）をクロロホルム（１１．
４ｍＬ）に溶かした。これにジメチルアミノピリジン（０．９９ｇ，８．１０ミ
リモル）を加え、この反応混合液を１０分撹拌した。無水酢酸（０．７０１ｇ，
６．８７ミリモル）を加え、この反応混合液を一晩撹拌した。次いで、この反応
混合液をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （４０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ₃ （３０ｍＬ）及
び鹹水（３０ｍＬ）で洗浄した。ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 層を蒸発乾固した。残渣をフラッ
シュカラムにかけ、酢酸エチル：ヘキサン（８０：２０）で溶出し、（１２９）
を得た。Ｒｆ：０．４３（酢酸エチル：ヘキサン、８０：２０）。ＭＳ（エレク
トロスプレイ^- ）ｍ／ｅ ６２４（Ｍ−Ｈ⁺ ）。

【０２０４】 実施例６９ ２' −Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５' −Ｏ−tert−ブ
チルジフェニルシリル−５−メチルシチジン（１３０） １，２，４−トリアゾール（５．８６ｇ，８４．８３ミリモル）の無水ＣＨ₃ ＣＮ（４９ｍＬ）懸濁液を、アルゴン気体下、５〜１０分氷浴で冷やした。この
冷懸濁液へ、ＰＯＣｌ₃ （１．８７ｍＬ，２０ミリモル）をゆっくりと１０分か
けて加え、さらに５分間撹拌を続けた。氷浴の温度を約０〜２℃に保ちながら、
トリエチルアミン（１３．９１ｍＬ，９９．８ミリモル）をゆっくりと３０分か
けて加えた。この滴加が終了してから、この反応混合液を上記の温度でさらに３
０分撹拌し、無水アセトニトリル（３ｍＬ）に溶かした化合物（３５）（３．１
２ｇ，４．９９ミリモル）を一時に加えた。この反応混合液を０〜２℃で１０分
撹拌した。氷浴を外し、この反応混合液を室温で１．５時間撹拌した。反応混合
液を０℃に冷やし、これを少量へ濃縮し、酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶かし、
水（２ｘ３０ｍＬ）及び鹹水（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ₂ ＳＯ ₄ で乾燥させ、濃縮乾固させた。次いで、得られた残渣をＮＨ₃ の飽和ジオキサ
ン溶液（２５ｍＬ）に溶かし、室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去した。
カラムクロマトグラフィーにより残渣を精製し、１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ ₂ で溶出させ、（１３０）を得た。

【０２０５】 実施例７０ ２' −Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−Ｎ⁴ −ベンゾイル−
５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルシチジン（１３１） 化合物（１３０）（２．８ｇ，４．８１ミリモル）を無水ＤＭＦ（１２．３３
ｍＬ）に溶かした。無水安息香酸（１．４ｇ，６．１７ミリモル）を加え、この
反応混合液を室温で一晩撹拌した。メタノール（１ｍＬ）を加え、溶媒を蒸発乾
固した。ジクロロメタン（５０ｍＬ）に残渣を溶かし、飽和ＮａＨＣＯ₃ 溶液（
２ｘ３０ｍＬ）、次いで鹹水（３０ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメタン層を無水
Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、濃縮させた。。得られた残渣をカラムクロマトグラフ
ィーにより精製し、５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で溶出させ、（１３１）を泡
状物として得た。

【０２０６】 実施例７１ Ｎ⁴ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−
５−メチルシチジン（１３２） 化合物（１３１）（２．５ｇ，３．９ミリモル）を、高真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で
乾燥させた。１００ｍＬの丸底フラスコにおいて、トリエチルアミントリヒドロ
フルオリド（６．３６ｍＬ，３９ミリモル）を無水ＴＨＦ（３９ｍＬ）に溶かす
。これにトリエチルアミン（２．７２ｍＬ，１９．５ミリモル）を加え、この混
合液を速やかに化合物（１３１）へ注ぎ込み、室温で一晩撹拌した。溶媒を真空
除去し、残渣をフラッシュカラムにかけ、１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で溶
出させて、（１３２）を得た。

【０２０７】 実施例７２ Ｎ⁴ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−
５−Ｏ' −ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（１３３） 化合物（１３２）（１．３ｇ，２．９８ミリモル）を、高真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上
で一晩乾燥させた。次いで、これを無水ピリジン（１０ｍＬ）と共沸させた。残
渣を無水ピリジン（１５ｍＬ）に溶かし、４−ジメチルアミノピリジン（１０．
９ｍｇ，０．３ミリモル）を加え、この溶液をアルゴン気体下、室温で４時間撹
拌した。ピリジンを真空除去し、残渣を酢酸エチルに溶かし、５％ ＮａＨＣＯ ₃ （２０ｍＬ）及び鹹水（２０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ₂ Ｓ
Ｏ₄ で乾燥させ、濃縮乾固した。残渣をフラッシュカラムにかけ、ピリジン数滴
を含有する１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で溶出させ、化合物（１３３）を得
た。

【０２０８】 実施例７３ Ｎ⁴ −ベンゾイル−２' −Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−
５−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３' −Ｏ−ホスホロアミダイト
（１３４） 化合物（１３３）（１．５４ｇ，２．０９ミリモル）をトルエン（１０ｍＬ）
と共沸させた。次いで、これをジイソプロピルアミンテトラゾリド（０．３６ｇ
，２．０９ミリモル）と混合し、４０℃で一晩、高真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥さ
せた。次いで、無水アセトニトリル（１１ｍＬ）にこれを溶かし、２−シアノエ
チル−テトライソプロピルホスホロアミダイト（２．６６ｍＬ，８．３６ミリモ
ル）を加えた。この反応混合液を、不活性気体の下、室温で４時間撹拌した。溶
媒を真空下で除去した。残渣に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、５％ＮａＨＣＯ ₃ （３０ｍＬ）及び鹹水（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で
乾燥させて、濃縮乾固した。残渣をフラッシュカラムにかけ、ピリジン数滴を含
有する酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出させ、（１３４）を得た。

【０２０９】 実施例７４ ２' −Ｏ−ジメチルアミノオキシエチル−２，６−ジアミノプリンリボシドホス
ホロアミダイト（１３５） ２' −Ｏ−ジメチルアミノオキシエチル−２，６−ジアミノプリンリボシドを
オリゴヌクレオチドへ取込むために、保護された６−アミノ−２−フルオロプリ
ンリボシド（１３５）のホスホロアミダイトを用いることを選択した。オリゴ合
成の後で、オリゴヌクレオチド保護基の脱保護と同時に、２−フルオロ基をアン
モニアに置換して、２，６−ジアミノプリンリボシド類似体を得る。このように
して得た２，６−ジアミノプリンリボシドをジメチルアミノオキシエチルブロミ
ド（１３６）でアルキル化して、２' −Ｏ−ジメチルアミノオキシエチル−２，
６−ジアミノプリンリボシド（１３７）とその３' −異性体（１３８）の混合物
を得る。一般的には、５' −ヒドロキシルをＤＭＴの官能基で置換して５' −Ｏ
−（４，４' −ジメトキシトリチル）−２' −Ｏ−ジメチルアミノオキシエチル
−２，６−ジアミノプリンリボシド（１３９）を得た後で、２' −異性体をクロ
マトグラフにより分離し得る。Schiemann 反応（Krolikiewicz, K.; Vorbruggen
, H. Nucleosides & Nucleotides, 1994, 13, 673-678 ）を介して（１３９）を
フッ素化することにより、２' −Ｏ−ジメチルアミノオキシエチル−６−アミノ
−２−フルオロ−プリンリボシド（１４０）が得られ、標準的な保護化プロトコ
ールでは、５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）−２' −Ｏ−ジメチル
アミノオキシエチル−６−ジメチルホルムアミジン−２−フルオロプリンリボシ
ド（１４０）が得られる。（１４０）をホスフィチル化すると、５' −Ｏ−（４
，４' −ジメトキシトリチル）−２' −Ｏ−ジメチルアミノオキシエチル−６−
ジメチルホルムアミジン−２−フルオロプリンリボシド−３' −［（２−シアノ
エチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（１３８）が得られる
。

【０２１０】 化合物（１３９）がクロマトグラフで３' −異性体から分離し得ない場合、化
合物（１３７）及び（１３８）の混合物を、アデノシンデアミナーゼで処理し（
これは３' −Ｏ−異性体より２' −Ｏ−置換アデノシン類似体を選択的に脱アミ
ノ化することが知られている）、２' −Ｏ−ジメチルアミノオキシエチルグアノ
シン（１４２）を得ることができる。５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチ
ル）−２' −Ｏ−ジメチルアミノオキシエチルグアノシン（１４０）は、６−オ
キソ基のアミノ化により２，６−ジアミノプリンリボシド類似体（１３９）へ変
換し得る（Gryaznov, S.; Schultz, R. G. Tetrahedron Lett. 1994, 2489-2492
）。次いで、標準的な保護の方法とホスフィチル化のプロトコールにより、対応
するアミダイト（１４４）へこれを変換した。

【０２１１】 実施例７５ ２' ／３' −Ｏ−［２−（tert−ブチルジメチルシリルヒドロキシ）エチル］−
２，６−ジアミノプリンリボシド（１４５及び１４６） ２，６−ジアミノプリンリボシド（１０ｇ，３５．４６ミリモル）を、高真空
下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させた。無水ＤＭＦ（１８０ｍＬ）に懸濁させ、ＮａＨ（
１．２ｇ，３５．４６ミリモル、鉱油の６０％分散液）を加えた。この反応混合
液を、不活性気体下、周囲温度で３０分間撹拌した。これに（２−ブロモエトキ
シ）−tert−ブチルジメチルシラン（１２．７３ｇ，５３．２ミリモル）を滴加
し、生成した溶液を室温で一晩撹拌した。ＤＭＴを真空除去し、残渣を酢酸エチ
ル（１００ｍＬ）に溶かし、水（２ｘ７０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無
水ＭｇＳＯ₄ で乾燥させ、濃縮乾固した。残渣をフラッシュカラムにかけ、５％
ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で溶出させ、生成物の混合物（６．０７１１ｇ，収率
３１％）を得た。Ｒｆ：０．４９，０．５９，０．６８（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ ₂ Ｃｌ₂)。

【０２１２】 実施例７６ ２' −Ｏ−アミノオキシエチル類似体 様々な他の２' −Ｏ−アミノオキシエチルヌクレオシド類似体（例えば、２，
６−ジアミノプリンリボシド）を化合物群（１５４）として製造し得る。従って
、２，６−ジアミノプリンを（２−ブロモエトキシ）−tert−ブチルジメチルシ
ランでアルキル化すると、２' −Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルオキシエチル
−２，６−ジアミノプリンリボシド（１４５）とその３' −異性体（１４６）が
得られる。所望の２' −Ｏ−異性体は、５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリ
チル）−２' −Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルオキシエチル−２、６−ジアミ
ノプリンリボシド（１４７）を製造し、この混合物をカラムクロマトグラフィー
にかけることにより分離し得る。シリル基を脱保護すると、５' −Ｏ−（４，４
' −ジメトキシトリチル）−２' −Ｏ−ヒドロキシエチル−２，６−ジアミノプ
リンリボシド（１４８）となり、これが Mitsunobu反応を受けると５' −Ｏ−（
４，４' −ジメトキシトリチル）−２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシ
エチル）−２，６−ジアミノプリンリボシド（１４９）となる。Schiemann 条件
の下で（１４９）を処理すると、ＤＭＴ基がフッ素化及び脱保護され、２' −Ｏ
−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル）−６−アミノ−２−フルオロプリン
リボシド（１５０）を生じる。標準的な保護化条件により、５' −Ｏ−（４，４
' −ジメトキシトリチル）−２' −Ｏ−（２−フタルイミド−Ｎ−オキシエチル
）−６−ジメチルホルムアミジン−２−フルオロプリンリボシド（１５１）を生
じ、このフタルイミド官能基を脱保護すれば、５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキ
シトリチル）−２' −Ｏ−アミノオキシエチル−６−ジメチルホルムアミジン−
２−フルオロプリンリボシド（１５２）が得られる。 （１５２）をアルデヒド又はジアルデヒドで還元アミノ化すると、環状又は非
環状の重置換された２' −Ｏ−アミノオキシエチル類似体群（１５３）になる。
（１５３）をホスフィチル化すると、ホスホロアミダイトとしての環状又は非環
状の重置換された２' −Ｏ−アミノオキシエチル類似体群（１５４）が得られる
。

【０２１３】 実施例７７ ２' ／３' −Ｏ−（２−tert−ブチルジメチルシリルヒドロキシエチル）アデノ
シン（１５５及び１５６） アデノシン（１０ｇ，３７．４２ミリモル）を、高真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥
させた。次いで、無水ＤＭＦ（１５０ｍＬ）に懸濁させ、ＮａＨ（１．３５ｇ，
５６．１３ミリモル）を加えた。この反応混合液を、不活性気体下、室温で３０
分間撹拌した。次いで、（２−ブロモエチル）−tert−ブチルジメチルシラン（
９．６８ｍＬ，４４．９０ミリモル）を滴加し、この反応混合液を室温で一晩撹
拌した。ＤＭＴを真空除去し、残渣へジクロロメタン（１００ｍＬ）を加え、水
（２ｘ８０ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメタン層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ
、蒸発乾固した。残渣をカラムで精製し、生成物の混合物（４．３０ｇ）を得た
。Ｒｆ：０．４９，０．５７（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。

【０２１４】 実施例７８ ２' −Ｏ−（２−メチレンイミノオキシエチル）チミジン（１５７） 化合物（１０４）（３．１０ｇ，５．４８ミリモル）を、高真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させた。１００ｍＬの丸底フラスコにおいて、トリエチルアミントリヒ
ドロフルオリド（８．９３ｍＬ，５４．８ミリモル）を無水ＴＨＦに溶かし、ト
リエチルアミン（３．８２ｍＬ，２７．４ミリモル）を加えた。得られた溶液を
速やかに化合物（１０４）へ加え、この反応混合液を室温で一晩撹拌した。溶媒
を真空除去し、残渣をフラッシュカラムにかけ、１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ ₂ で溶出させて、（１５７）（１．３５ｇ，収率７５％）を白色の泡状物として
得た。Ｒｆ：０．４５（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。ＭＳ（ＦＡＢ⁺ ）ｍ／
ｅ：３３０（Ｍ＋Ｈ⁺ ），３５２（Ｍ＋Ｎａ⁺ ）。

【０２１５】 実施例７９ ５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−２' −Ｏ−（２−メチレンイミノオキシエチル
）チミジン（１５８） 化合物（１５７）（０．６４ｇ，１．９５ミリモル）を、高真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で一晩乾燥させた。次いで、これを無水ピリジン（５ｍＬ）と共沸させた。残
渣を無水ピリジン（４．４３ｍＬ）に溶かし、ジメトキシトリチルクロリド（０
．７９ｇ，２．３４ミリモル）、及び４−ジメチルアミノピリジン（２３．８ｍ
ｇ，０．２ミリモル）を加えた。反応混合液を、不活性気体下、周囲温度で４時
間撹拌した。溶媒を真空除去し、残渣をカラムにより精製し、ピリジン数滴を含
有する５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で溶出させ、泡状物として（１５８）（１
．０９ｇ，収率８８％）を得た。Ｒｆ：０．４（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）。ＭＳ（エレクトロスプレイ^- ）ｍ／ｅ ６３０（Ｍ−Ｈ⁺ ）。

【０２１６】 実施例８０ ５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−２' −Ｏ−（２−メチレンイミノオキシエチル
）チミジン−３' −Ｏ−ホスホロアミダイト（１５９） 化合物（１５８）（０．８７ｇ，１．３４ミリモル）をトルエン（１０ｍＬ）
と共沸させた。次いで、残渣をジイソプロピルアミンテトラゾリド（０．２３ｇ
，１．３４ミリモル）と混合し、高真空下、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で一晩乾燥させた。次い
で、これをアルゴンで処理した。無水アセトニトリル（６．７ｍＬ）を加え、澄
明な溶液を得た。この溶液へ２−シアノエチル−テトライソプロピルホスホロジ
アミダイト（１．７ｍＬ，５．３６ミリモル）を加え、この反応混合液を、不活
性気体の下、室温で６時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を酢酸エチル
（４０ｍＬ）で希釈し、５％ ＮａＨＣＯ₃ （２０ｍＬ）及び鹹水（２０ｍＬ）
で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させて、濃縮乾固した。残
渣をフラッシュカラムにかけ、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出させ
、（１５９）（１．９２ｇ，収率８０％）を得た。Ｒｆ：０．３４（酢酸エチル
：ヘキサン、６０：４０）。³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）δ 150.76ppm；ＭＳ（
エレクトロスプレイ^- ）ｍ／ｅ：８３０（Ｍ−Ｈ⁺ ）。

【０２１７】 実施例８１ ヌクレオシドを固形支持体に付ける一般法 化合物（１０７）（２００ｍｇ，０．３１ミリモル）をＤＭＡＰ（１９ｍｇ，
１６ミリモル）、無水コハク酸（４７ｍｇ，０．４７ミリモル）、トリエチルア
ミン（８６ｍＬ，０．６２ミリモル）及びジクロロメタン（０．８ｍＬ）と混合
し、４時間撹拌した。この混合液をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （５０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 層をはじめ氷冷１０％クエン酸で、次いで水で洗浄した。有機層を濃縮乾
固して、（１６１）を得た。残渣（１６１）を無水アセトニトリル（２３ｍＬ）
に溶かした。これにＤＭＡＰ（３７ｍｇ，０．３ミリモル）、及び２' ，２' −
ジチオビス（５−ニトロピリジン）（１０３ｍｇ，０．３３ミリモル）を加えた
。この溶液を５分撹拌した。これにトリフェニルホスフィン（７８．６９ｍｇ，
０．３ミリモル）の無水アセトニトリル（３ｍＬ）溶液を加えた。この溶液を１
０分撹拌し、次いでそれにＣＰＧを加えた。このスラリーを２時間振盪した。次
いで、濾過し、アセトニトリル及びＣＨ₂ Ｃｌ₂ で洗浄した。この官能基の付い
たＣＰＧを乾燥させ、キャッピング溶液でキャップして（１６１）を得た。ロー
ディングキャパシティを測定した（５８．３μモル／ｇ）。

【０２１８】 実施例８２ アミノオキシ誘導体の合成：代替法 ジオール（１６２）を、１当量のｐ−トルエンスルホニルクロリド−ピリジン
で処理して標準的な後処理をすることにより、そのトシレート誘導体（１６３）
へ変換する。次いで、トシレートを置換するときの求核試薬として作用するいく
つかのアミノ−ヒドロキシ化合物でこのトシレートを処理し、一連のオキシ−ア
ミノ化合物を産生する。この反応は、水素化ナトリウムを無水条件下で使用して
アミノアルコール又はヒドロキシルアミン誘導体からアニオンを前形成させるこ
とによって促進される。

【０２１９】 実施例８３ ＤＭＡＯＥオリゴヌクレオチド及びギャップのあるオリゴヌクレオチドの一般的
な製造法 各々の２' −Ｏ−ＤＭＡＯＥアミダイトの０．１Ｍ溶液を無水アセトニトリル
溶液として調製し、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ核酸合成システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
にロードし、オリゴヌクレオチドを合成した。合成に使用する他のアミダイト（
Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）も無水アセ
トニトリルの０．１Ｍ溶液とした。合成はすべてＤＭＴオンモード（DMT on mod
e ）で実行した。２' −Ｏ−ＤＭＡＯＥアミダイトのカップリングについては、
カップリング時間を１０分へ延ばし、この工程を２回実施した。Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ提供のプロトコールにある他の工程は、延長した酸化時間（２４０秒）の他
は、すべてそのまま使用した。酸化剤として（Ｓ）−（＋）−１０−カンフルス
ルホニルオキサジリジンの０．５Ｍ無水アセトニトリル溶液を使用した。ホスホ
ロチオエート合成には Beaucage 試薬を使用した。全体のカップリング効率は９
０％以上であった。オリゴヌクレオチドを制御孔ガラス（ＣＰＧ）支持体から開
裂させ、濃ＮＨ₄ ＯＨ水（３０％）を５５℃で使用する標準条件下で脱保護した
。次いで、５' −Ｏ−ＤＭＴ含有オリゴマーを逆相液体クロマトグラフィー（Ｃ
−４，Ｗａｔｅｒｓ，７−８ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモ
ニウム（ｐＨ１）、Ｂ＝１００％ ＣＨ₃ ＣＮ，５〜６０％ Ｂ／６０分）によ
り精製した。８０％酢酸水溶液で脱トリチル化し（１ｍＬ，３０分、室温）、蒸
発させ、Ｓｅｐｈａｄｅｓｅ Ｇ−２５カラムを用いて脱塩し、純粋な泡状物と
してオリゴヌクレオチドを得た。次いで全オリゴマーをＣＧＥ、ＨＰＬＣ及び質
量分析によって分析した。

【０２２０】

【表３】

【０２２１】 ^* ＝修飾された位置：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、１９及び２０は２' −Ｏ−
ＭＯＥとして修飾され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９及び２０は２' −Ｏ−ＤＭＡ
ＯＥとして修飾される；下線を施したヌクレオチドはホスホロチオエート連結に
より結合され、他のヌクレオチド間連結はすべてホスホジエステルである；Ｃは
すべて５−メチルＣである；及び以下のＨＰＬＣ条件を用いて分離を実施した：
Ｃ−４カラム、Ｗａｔｅｒｓ，３．９ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＡｃ
、Ｂ＝ＣＨ₃ ＣＮ，５〜６０％／６０分、流速１．５ｍＬ／分、ｔ＝２６０ｎｍ
。

【０２２２】 上記オリゴヌクレオチド、特にＭＯＥギャップマーの合成については、対照と
して以下の修飾アミダイトを使用した：２' −Ｏ−メトキシエチル−チミジン（
ＲＩＣ社、ロット＃Ｅ１０５０−Ｐ−１０）、２' −Ｏ−メトキシエチル−５−
メチルシチジン（ロット＃Ｓ１９４１／ＲＳ）、２' −Ｏ−メトキシエチル−ア
デノシン及び５−メチルシチジン（ロット＃３１１０９４）。 必要量のアミダイトを乾燥バイアルに入れ、アセトニトリルに溶かし（非修飾
ヌクレオシドは１Ｍ溶液とし、修飾ヌクレオシドは１００ｍｇ／ｍＬとした）、
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ^TM核酸合成システム（ＩＳＩＳ ４）上
で適切な部分に結合した。１μモルスケールの合成につき、各々のカラムで３０
ｍｇの固形支持体樹脂を用いた。合成は、ホスホロチオエート骨格についてはＩ
ＢＰ−ＰＳ（１μモル）ｄｂｌカップリングプロトコールを、ホスホジエステル
についてはＣＳＯ−８を用いて実行した。トリチルレポート基により正常なカッ
プリング結果が示された。

【０２２３】 合成の後、５５℃、約１６時間で濃水酸化アンモニウム（水溶液）を用いてオ
リゴヌクレオチドを脱保護した。次いで、（アンモニアを除去するために）Ｓａ
ｖａｎｔ ＡＳ１６０ 自動ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて蒸発させ、濾過してＣＰ
Ｇ−樹脂を除去した。 この粗サンプルをＭＳ、ＨＰＬＣ、及びＣＥで分析した。次いで、Ｗａｔｅｒ
ｓ Ｃ４ 調製スケールカラム（Ａｌｉｃｅ Ｃ４ Ｐｒｅｐ．１０−１６−９
６）及び以下の溶媒（Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡ−Ａｃ，ｐＨ７．０及びＢ：アセト
ニトリル）を用いる、９９１検出器の付いたＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ ＨＰＬＣ
システムで、「ＭＰＲＥＰ２」法を活用してこれを精製した。 精製した後、オリゴを蒸発乾固させ、次いで室温、約３０分で８０％酢酸を用
いて脱トリチル化した。次いで、蒸発させた。 濃水酸化アンモニウムにオリゴを溶かし、水を溶媒として用いて、Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ ＳｕｐｅｒＦｒａｃのフラクションコレクターを用いるＳｅ
ｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５含有カラムに通した。得られた精製オリゴを蒸発させ、
ＭＳ、ＣＥ及びＨＰＬＣにより分析した。

【０２２４】 実施例８３ ＤＭＡＯＥオリゴヌクレオチド及びギャップのあるオリゴヌクレオチドの一般的
な製造法 各々の２' −Ｏ−ＤＭＡＯＥアミダイトの０．１Ｍ溶液を無水アセトニトリル
溶液として調製し、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ核酸合成システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
にロードし、オリゴヌクレオチドを合成した。合成に使用する他のアミダイト（
Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）も無水アセ
トニトリルの０．１Ｍ溶液とした。合成はすべてＤＭＴオンモードで実行した。
２' −Ｏ−ＤＭＡＯＥアミダイトのカップリングについては、カップリング時間
を１０分へ延ばし、この工程を２回実施した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ提供のプロト
コールにある他の工程は、延長した酸化時間（２４０秒）の他は、すべてそのま
ま使用した。酸化剤として（Ｓ）−（＋）−１０−カンフルスルホニルオキサジ
リジンの０．５Ｍ無水アセトニトリル溶液を使用した。ホスホロチオエート合成
には Beaucage 試薬を使用した。全体のカップリング効率は９０％以上であった
。オリゴヌクレオチドを制御孔ガラス（ＣＰＧ）支持体から開裂させ、濃ＮＨ₄ ＯＨ水（３０％）を５５℃で使用する標準条件下で脱保護した。次いで、５' −
Ｏ−ＤＭＴ含有オリゴマーを逆相液体クロマトグラフィー（Ｃ−４，Ｗａｔｅｒ
ｓ，７−８ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ１）
、Ｂ＝１００％ ＣＨ₃ ＣＮ，５〜６０％ Ｂ／６０分）により精製した。８０
％酢酸水溶液で脱トリチル化し（１ｍＬ，３０分、室温）、蒸発させ、Ｓｅｐｈ
ａｄｅｓｅ Ｇ−２５カラムを用いて脱塩し、純粋な泡状物としてオリゴヌクレ
オチドを得た。次いで全オリゴマーをＣＧＥ、ＨＰＬＣ及び質量分析によって分
析した。

【０２２５】

【表４】

【０２２６】 ^* ＝修飾された位置：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９ａ及び２０ａは２' −Ｏ−Ｍ
ＯＥとして修飾され、１９ｂ及び２０ｂは２' −Ｏ−ＤＭＡＯＥとして修飾され
る；小文字のｓはホスホロチオエート・ヌクレオシド連結を示し、他のヌクレオ
チド間連結はすべてホスホジエステルである；Ｃはすべて５−メチルＣである；
及び以下のＨＰＬＣ条件を用いて分離を実施した：Ｃ−４カラム、Ｗａｔｅｒｓ
，３．９ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＡｃ、Ｂ＝ＣＨ₃ ＣＮ，５〜６０
％／６０分、流速１．５ｍＬ／分、ｔ＝２６０ｎｍ。

【０２２７】 上記オリゴヌクレオチド、特にＭＯＥギャップマーの合成については、対照と
して以下の修飾アミダイトを使用した：２' −Ｏ−メトキシエチル−チミジン（
ＲＩＣ社、ロット＃Ｅ１０５０−Ｐ−１０）、２' −Ｏ−メトキシエチル−５−
メチルシチジン（ロット＃Ｓ１９４１／ＲＳ）、２' −Ｏ−メトキシエチル−ア
デノシン及び５−メチルシチジン（ロット＃３１１０９４）。 必要量のアミダイトを乾燥バイアルに入れ、アセトニトリルに溶かし（非修飾
ヌクレオシドは１Ｍ溶液とし、修飾ヌクレオシドは１００ｍｇ／ｍＬとした）、
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ^TM核酸合成システム（ＩＳＩＳ ４）の
適切な部分に結合した。１μモルスケールの合成につき、各々のカラムで３０ｍ
ｇの固形支持体樹脂を用いた。合成は、ホスホロチオエート骨格についてはＩＢ
Ｐ−ＰＳ（１μモル）ｄｂｌカップリングプロトコールを、ホスホジエステルに
ついてはＣＳＯ−８を用いて実行した。トリチルレポート基により正常なカップ
リング結果が示された。

【０２２８】 合成の後、５５℃、約１６時間で濃水酸化アンモニウム（水溶液）を用いてオ
リゴヌクレオチドを脱保護した。次いで、（アンモニアを除去するために）Ｓａ
ｖａｎｔ ＡＳ１６０ 自動ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて蒸発させ、濾過してＣＰ
Ｇ−樹脂を除去した。 この粗サンプルをＭＳ、ＨＰＬＣ、及びＣＥで分析した。次いで、Ｗａｔｅｒ
ｓＣ４調製スケールカラム（Ａｌｉｃｅ Ｃ４ Ｐｒｅｐ．１０−１６−９６）
及び以下の溶媒（Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡ−Ａｃ，ｐＨ７．０及びＢ：アセトニト
リル）を用いる、９９１検出器の付いたＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ ＨＰＬＣシス
テムで、「ＭＰＲＥＰ２」法を活用してこれを精製した。

【０２２９】 精製した後、オリゴを蒸発乾固させ、次いで室温、約３０分で８０％酢酸を用
いて脱トリチル化した。次いで、蒸発させた。 濃水酸化アンモニウムにオリゴを溶かし、水を溶媒として用いて、Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ ＳｕｐｅｒＦｒａｃのフラクションコレクターを用いるＳｅ
ｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５含有カラムに通した。得られた精製オリゴを蒸発させ、
ＭＳ、ＣＥ及びＨＰＬＣにより分析した。これらのオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１９及び２０の２' −ＤＭＡＯＥチオエート及びジエステル類似体であ
る。

【０２３０】 ＳＥＱ ＩＤ： 分子量（ｇ／モル） 分子量（ｇ／モル） ＮＯ （実測値） （実測値） ２０ ７２４０．９２９ ７２３９．９１（Ｐ＝Ｓウィング） １９ ６８８７．３４１ ６８８２．５１（Ｐ＝Ｓウィング） ２０ ７０８０．９２９ ７０７６．０４（Ｐ＝Ｏウィング） １９ ６７５９．３４１ ６７５６．５１（Ｐ＝Ｏウィング）

【０２３１】 実施例８４ 均一に修飾されたＤＭＡＯＥオリゴヌクレオチドの一般的な製造法 Ａ（２２５ｍｇ，０．２３ミリモル）、^5me Ｃ（１５０ｍｇ，０．１６ミリモ
ル）、Ｇ（３００ｍｇ，０．３１ミリモル）及びＴ（１６９．４ｍｇ，０．２ミ
リモル）の２−Ｏ−ＤＭＡＯＥアミダイトを無水アセトニトリルに溶かして０．
１Ｍ溶液とした。この溶液をＥｘｐｅｄｉｔｅ核酸合成システム（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ）にロードし、オリゴヌクレオチドを合成した。カップリング効率は９０
％以上であった。アミダイトのカップリングについては、１カップリング時間を
１０分へ延ばし、この工程を２回実施した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ提供のプロトコ
ールにある他の工程は、延長したカップリング時間の他は、すべてそのまま使用
した。硫化剤として Beaucage 試薬（０．１Ｍ アセトニトリル）を使用した。
ジエステル合成には、ＣＳＯを酸化剤として使用した。

【０２３２】 オリゴマーを制御孔ガラス（ＣＰＧ）支持体から開裂させ、濃ＮＨ₄ ＯＨ水（
３０％）を５５℃で使用する標準条件下で脱保護した。次いで、５' −Ｏ−ＤＭ
Ｔ含有オリゴマーを逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｃ−４，Ｗａｔｅｒｓ，
７．８ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）、Ｂ
＝アセトニトリル、Ｂの５〜６０％／６０分、流速１．５ｍＬ／分）により精製
した。８０％酢酸水溶液で脱トリチル化し、蒸発させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−
２５カラムにおいて脱塩し、オリゴヌクレオチド群、２８０５９、２８０６０及
び２２７８６を得た。ＨＰＬＣ、ＣＧＥ及び質量分析によってオリゴヌクレオチ
ドを分析した。

【０２３３】

【表５】

【０２３４】 ＨＰＬＣ条件：Ｃ−１８，Ｗａｔｅｒｓ，３．９ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭ
酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７；Ｂ＝アセトニトリル；Ｂの５〜６０％／
５５分；流速１ｍＬ／分、又はＢの５〜１５％／３０分；流速１．５ｍＬ／分。
Ｔ^* ＝２' −Ｏ−ＤＭＡＯＥ Ｔ、Ａ^* ＝２' −Ｏ−ＤＭＡＯＥ Ａ、Ｃ^* ＝２
' −Ｏ−ＤＭＡＯＥ ^5me Ｃ、Ｇ^* ＝２' −Ｏ−ＤＭＡＯＥ Ｇ。

【０２３５】 実施例８５ Ｏ² ，２' −アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウ
リジン］ ５−メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ、銚子、日本より市販）（７２
．０ｇ，０．２７９モル）、炭酸ジフェニル（９０．０ｇ，０．４２０モル）及
び重炭酸ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４モル）をジメチルホルムアミド（３
００ｍＬ）に加えた。この混合液を、生成する二酸化炭素ガスを制御したやり方
で放出させながら撹拌し、加熱して還流させた。１時間後、やや黒ずんだ溶液を
減圧下で濃縮した。生成したシロップを撹拌させながらジエチルエーテル（２．
５Ｌ）へ注ぎ込んだ。生成物はゴム状物を形成した。エーテルをデカントし、残
渣を最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶かした。この溶液を上記のような
新鮮なエーテル（２．５Ｌ）へ注ぎ込むと、固いゴム状物を生じた。エーテルを
デカントし、このゴムを真空オーブン（６０℃，１ｍｍＨｇ，２５時間）で乾燥
させて得た固形物を粉砕し、明褐色の粉末（５７ｇ，粗収率８５％）を得た。Ｎ
ＭＲはその構造とフェノール及びそのナトリウム塩（約５％）の混在に一致して
いた。この物質を開環に使用した。これは、メタノールの酢酸エチル勾配液（１
０〜２５％）を使用するカラムクロマトグラフィーによりさらに精製し得て、白
色の固形物（ｍｐ．２２２〜４℃）を生じる。

【０２３６】 実施例８６ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−Ｏ² −２' −アンヒドロ−５−メチ
ルウリジン（１ａ） Ｏ² ，２' −アンヒドロ−５−メチルウリジン（１００．０ｇ，０．４１６ミ
リモル）及びジメチルアミノピリジン（０．６６ｇ，０．０１３当量、０．００
５４ミリモル）を、アルゴン気体下、周囲温度で機械的に撹拌しながら乾燥ピリ
ジン（５００ｍＬ）に溶かした。tert−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５
．８ｇ，１１９．０ｍＬ，１．１当量、０．４５８ミリモル）を一時に加え、こ
の反応液を周囲温度で１６時間撹拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ：０．２２、酢酸エチル
）は完全な反応を示した。この溶液を減圧濃縮して得た濃い油状物をジクロロメ
タン（１Ｌ）と飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ１Ｌ）及び鹹水（１Ｌ）との間で分
画した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮して濃い油状物とした
。酢酸エチルとエチルエーテルの１：１混液（６００ｍＬ）にこの油状物を溶か
し、この溶液を−１０℃へ冷却した。得られた結晶性の生成物を濾過により採取
し、エチルエーテル（３ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥（４０℃，１ｍｍＨｇ，
２４時間）し、白色の固形物として表題化合物（１４９ｇ，７４．８％）を得た
。ＴＬＣ及びＮＭＲは純粋な生成物に一致していた。

【０２３７】 実施例８７ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−（２−ヒドロキシエチル
）−５−メチルウリジン（２ａ） ２Ｌのステンレス鋼製、非撹拌圧リアクターにホウ素／ＴＨＦ（１．０Ｍ，２
．０当量、６２２ｍＬ）を加えた。排気フードにおいて手動で撹拌させながら、
エチレングリコール（３５０ｍＬ、過剰量）を、水素ガスの発生が止むまで、は
じめは慎重に加えた。５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−Ｏ² −２' −
アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ｇ，０．３１１モル）及び重炭酸ナト
リウム（０．０７４ｇ，０．００３当量）を手動で撹拌させながら加えた。リア
クターをシールして、内部温度が１６０℃に達するまで油浴で加熱し、１６時間
この温度を維持した（圧力＜１００ｐｓｉｇ）。反応容器を周囲温度へ冷やし、
開封した。ＴＬＣ（所望の生成物はＲｆ：０．６７、ａｒａ−Ｔの副生成物はＲ
ｆ：０．８２、酢酸エチル）は、生成物へ約７０％変換したことを示した。さら
に副生成物が形成するのを避けるために、反応を停止させ、エチレングリコール
を除去するのに使用されるより極端な条件で、温水浴（４０〜１００℃）におい
て減圧（１０〜１ｍｍＨｇ）濃縮した。［他のやり方では、低沸点溶媒の消失後
、酢酸エチルと水との間で残りの溶液を分画し得る。生成物は有機層にある。］
カラムクロマトグラフィー（シリカゲル２ｋｇ、酢酸エチル−ヘキサンの１：１
〜４：１勾配液）により残渣を精製した。適切な分画を集め、濃縮し、乾燥させ
て白色のカリカリした泡状物（８４ｇ，５０％）を得た。また、混在する出発物
質（１７．４ｇ）及び純粋な再使用し得る出発物質（２０ｇ）をカラムから回収
した。出発物質及び低純度の回収された出発物質をもとにした収率は５８％であ
った。ＴＬＣとＮＭＲは、９９％の純度である表題化合物に一致していた。

【０２３８】

【化３４】

【０２３９】 実施例８８ ２' −Ｏ−［（２−フタルイミドキシ）エチル］−５' −tert−ブチルジフェニ
ルシリル−５−メチルウリジン（３ａ） ヌクレオシド（２ａ）（２０ｇ，３６．９８ミリモル）をトリフェニルホスフ
ィン（１１．６３ｇ，４４．３６ミリモル）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（
７．２４ｇ，４４．３６ミリモル）と混合した。次いで真空下、４０℃で２日間
、Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させた。この反応混合液をアルゴンで処理し、乾燥ＴＨＦ（
３６９．８ｍＬ）を加えて澄明な溶液を得た。この反応混合液へジエチルアゾジ
カルボキシレート（６．９８ｍＬ，４４．３６ミリモル）を滴加した。滴加の速
度は、生成する深赤の発色が丁度消えてから次の一滴を加えるように維持した。
この滴加が完了してから、この反応液を４時間撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：
ヘキサン、６０：４０）は、反応の完了を示した。真空で溶媒を蒸発させ、得ら
れた残渣を、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）を溶出液として使用するフラ
ッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、表題化合物（２１．８１ｇ，８６％
）を白色の泡状物として得た。ＴＬＣ Ｒｆ：０．５６（酢酸エチル：ヘキサン
、６０：４０）。ＭＳ（ＦＡＢ^- ）ｍ／ｚ ６８４（Ｍ−Ｈ⁺ ）。

【０２４０】 実施例８９ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−［２−（ホルムアルドキ
シミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（４ａ） 乾燥ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （４．５ｍＬ）に溶かした化合物（３ａ）（３．１ｇ，４．
５ミリモル）へ、メチルヒドラジン（３００ｍＬ，４．６４ミリモル）を−１０
℃〜０℃で滴加した。１時間後、この混合液を濾過し、濾液を氷冷ＣＨ₂ Ｃｌ₂ で洗浄し、合わせた有機層を水、鹹水で洗浄し、無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させた
。この溶液を濃縮して、２' −Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得て、こ
れをＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）に溶かした。ホルムアルデヒド（２０ｗ／ｗ％水
溶液、１．１当量）を加え、この混合液を室温で１時間混合した。溶媒を真空除
去し、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して表題化合物（１．９５ｇ，７
８％）を白色の泡状物として得た。 Ｒｆ：０．３２（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。

【０２４１】

【化３５】

【０２４２】 ＭＳ（エレクトロスプレイ）ｍ／ｚ：５６６（Ｍ−Ｈ）。 実施例９０ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−［２−（Ｎ−メチルアミ
ノオキシエチル］−５−メチルウリジン（５ａ） 化合物４ａ（２．３ｇ，４．１７ミリモル）を１Ｍ ｐ−トルエンスルホン酸
ピリジニウム／ＭｅＯＨ溶液（４１．７ｍＬ）に溶かした。この反応混合液を氷
浴上で１０℃へ冷やし、ＮａＢＨ₃ ＣＮ（０．５２ｇ，８．３５ミリモル）を冷
やしながら加え、１５分間撹拌した。この混合液を室温へ温め、４時間撹拌した
。反応の進行は、ＴＬＣ（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）により示されるよう
に、完全であった。この混合液をシロップ状になるまで濃縮し、酢酸エチル（５
０ｍＬ）で希釈し、水（３０ｍＬ）、５％ ＮａＨＣＯ₃ 水溶液（３０ｍＬ）及
び鹹水（３０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、
蒸発乾固し、表題化合物（２．３２ｇ）を泡状物として得た。この泡状物をさら
に精製することなく次の工程に使用した。Ｒｆ（０．３４，５％ ＭｅＯＨ／Ｃ
Ｈ₂ Ｃｌ₂)。

【０２４３】 実施例９１ ５' −Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−｛２−［（Ｎ−メチル）
−Ｎ−（２−フタルイミド）エチル］アミノオキシエチル｝−５−メチルウリジ
ン（６ａ） 化合物５ａ（２ｇ，３．４４ミリモル）を１Ｍ ｐ−トルエンスルホン酸ピリ
ジニウム／ＭｅＯＨ溶液（３４ｍＬ）に溶かした。α−フタルイミドアセトアル
デヒド（０．７２ｇ，３．７８ミリモル）を加え、この混合液を周囲温度で１０
分撹拌した。この反応混合液を氷浴上で１０℃へ冷やし、撹拌させながらＮａＢ
Ｈ₃ ＣＮ（０．４３ｇ，０．８９ミリモル）を１０℃、１５分間で加えた。この
混合液を室温へ温め、４時間撹拌し、油状物になるまで濃縮し、酢酸エチル（５
０ｍＬ）で希釈した。この酢酸エチル層を水（４０ｍＬ）、５％ ＮａＨＣＯ₃ （４０ｍＬ）及び鹹水（２５ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾
燥させ、蒸発乾固した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製
し、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出させて、表題化合物（１．５４
ｇ，６０％）を得た。 Ｒｆ＝０．６８（酢酸エチル）。

【０２４４】

【化３６】

【０２４５】 ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）Ｃ₃₉Ｈ₄₆Ｏ₉ Ｎ₄ ＳｉＮａ⁺ の理論値：７６５．２９３
２；実測値：７６５．２９２２。

【０２４６】 実施例９２ ２' −Ｏ−｛２−［（Ｎ−メチル）−Ｎ−（２−フタルイミド）エチル］アミノ
オキシエチル｝−５−メチルウリジン（７ａ） トリエチルアミン三水素フルオリド（２．６４ｍＬ，１６．２ミリモル）及び
トリエチルアミン（１．１３ｍＬ，８．１モル）のＴＨＦ溶液を化合物６ａ（１
．２ｇ，１．６２ミリモル）に撹拌させながら加え、室温で１８時間撹拌した。
ＴＬＣ（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）は、この時点で反応が完全であるこ
とを示した。溶媒を真空除去し、残渣を酢酸エチル（３０ｍＬ）に溶かし、有機
層を水（３０ｍＬ）、鹹水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ
た。有機層を蒸発させ、５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ を溶出液として用いるフ
ラッシュカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製し、表題化合物（０．４２
ｇ，５２％）を固形物として得た（Ｒｆ＝０．３４，１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。

【０２４７】

【化３７】

【０２４８】 ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）Ｃ₂₃Ｈ₂₉Ｏ₉ Ｎ₄ の理論値：５０５．１９２７；実測値：５
０５．１９２７。

【０２４９】 実施例９３ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−｛２−［Ｎ−（メチル）−Ｎ−（２−フタルイミ
ド）エチル］アミノ−オキシエチル）−５−メチルウリジン（８ａ） 化合物（７ａ）（０．４ｇ，０．７９ミリモル）を、４０℃で一晩、真空下、
Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させ、ピリジン（３ｍＬ）と共沸させた。残渣を無水ピリジン
（１．９ｍＬ）に溶かし、ＤＭＴＣｌ（０．２９ｇ，２．３４ミリモル）を加え
た。この混合液へ、４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ｍｇ，０．８７ミリ
モル）を加えた。この反応混合液を、ＴＬＣ（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ）
によりモニタリングしながら、不活性気体下、室温で８時間撹拌した。追加のＤ
ＭＴＣｌ（０．１５ｍｇ）を加え、出発物質が消失するまで撹拌を続けた。ピリ
ジンを真空除去し、酢酸：ヘキサン（６０：４０）を溶出液として使用するフラ
ッシュクロマトグラフィーで残渣を精製し、表題化合物（０．４７ｇ，７３％）
を得た。Ｒｆ：０．３５（５％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。

【０２５０】

【化３８】

【０２５１】 ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）Ｃ₄₄Ｈ₄₆Ｏ₁₁Ｎ₄ Ｎａの理論値：８２９．３０６１；実測値
：８２９．３０６６。

【０２５２】 実施例９４ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−｛２−［Ｎ−（メチル）−Ｎ−（２−フタルイミ
ド）エチル］アミノオキシエチル｝−５−メチル−ウリジン−３' −Ｏ−［（２
−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト］（９ａ） 化合物（８ａ）（０．２６ｇ，０．３２ミリモル、トルエンと共沸させたもの
）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾリド（０．０５５ｇ，０．３２ミ
リモル、真空下、４０℃で一晩Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させたもの）を加えた後、無水
アセトニトリル（１．６ｍＬ）を加え、不活性気体の下、室温で１８時間撹拌し
た。ＴＬＣ（酢酸エチル：へキサン、６０：４０）による分析は、この時点で反
応が完了したことを示した。溶媒を真空蒸発させ、ピリジン（０．５％）含有酢
酸エチルを溶出液として用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーにより残渣
を精製し、表題化合物（０．２８ｇ，８５％）を得た。 Ｒｆ：０．２８（酢酸エチル：ヘキサン、６０：４０）。³¹Ｐ ＮＭＲ（８０
ＭＨＺ，ＣＤＣｌ₃ ）δ 150.82, 150.61 ；ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ：１０２９（
Ｍ＋Ｎａ）。

【０２５３】 実施例９５ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−｛２−［Ｎ−（メチル）−Ｎ−（２−フタルイミ
ド）エチル］アミノオキシエチル｝−３' −Ｏ−［（２−スクシニル−５−メチ
ルウリジン（１０ａ） 化合物（８ａ）（０．１６ｇ，０．２ミリモル）をＤＭＡＰ（０．０１３ｇ，
０．１０ミリモル）、無水コハク酸（０．０３ｇ，０．３ミリモル）と混合し、
真空下、４０℃で一晩Ｐ₂ Ｏ₅ 上で乾燥させた。ＣＨ₂ Ｃｌ₂ （０．５ｍＬ）及
びトリエチルアミン（０．０６ｍＬ，０．４ミリモル）を加え、不活性気体下、
室温で４時間撹拌した。この混合液をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （３０ｍＬ）で希釈し、１０
％クエン酸（３０ｍＬ）、及び水（２ｘ１５ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎ
ａ₂ ＳＯ₄ で乾燥させ、濃縮して、泡状物として表題化合物（０．１６２ｇ，９
０％）を得た。 Ｒｆ：０．４３（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂ Ｃｌ₂)。¹ Ｈ ＮＭＲ（２００Ｍ
ＨＺ，ＤＭＳＯ−ｄ₆ ）δ 1.4 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 2.56 (m, 4H,ＤＭＳＯ
ピークと部分重複), 2.75 (t, 2H, J=6.29 Hz), 3.24 (m, 2H,Ｈ₂ Ｏピークと部
分重複), 3.53-3.8 (m, 6H), 3.72 (s, 6H), 4.13 (brs, 1H), 4.37 (t, 1H, J=
5.85 Hz), 5.29 (t, 1H, J=4.1 Hz), 5.87 (d, 1H, J=6.36 Hz), 6.89 (d, 4H,
J=8.72 Hz), 7.21-7.39 (m, 9H), 7.49 (s, 1H), 7.82 (s, 4H), 11.42 (s, 1H)
, 12.24 (brs, 1H);ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ ９２９［Ｍ＋Ｎａ］。

【０２５４】 実施例９６ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−｛２−［Ｎ−（メチル）−Ｎ−（２−フタルイミ
ド）エチル］アミノオキシエチル｝−５−メチル−ウリジン−３' −Ｏ−スクシ
ニル−ＣＰＧ（１１ａ） 化合物（１０ａ）（０．１５ｇ，０．１７ミリモル）及びＤＭＡＰ（０．０２
１ｇ，０．１７ミリモル）を無水アセトニトリルに溶かした。この反応混合液を
湿気から守るために２' ，２' −ジチオビス（５−ニトロピリジン）（０．０６
８ｇ，０．１９ミリモル）を加えた。この溶液を室温で５分撹拌した。この溶液
にトリフェニルホスフィン（０．０４５ｇ，０．１７ミリモル）の無水アセトニ
トリル（１．１２ｍＬ）溶液を加えた。この溶液を周囲温度で１０分撹拌した。
活性化されたＣＰＧ（制御孔ガラス、１．１２ｇ，１１５．２ミリモル／ｇ，粒
子サイズ：１２０／２００、平均孔径：５２０Ａ（オングストローム））を加え
、シェーカー上で２時間振盪した。アリコートを採取し、以下の標準法によりロ
ーディングキャパシティを測定した（６１．５２ミリモル／ｇ）。官能基を付け
たＣＰＧ（１１ａ）を濾過し、ＣＨ₃ ＣＮ、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 及びＥｔ₂ Ｏで十分洗
浄した。次いで真空下で一晩乾燥させた。ＣＰＧの未反応部位をキャッピング試
薬［ＣａｐＡ（２ｍＬ）、無水酢酸／リューティクル／ＴＨＦ；ＣａｐＢ（２ｍ
Ｌ）、１−メチルイミダゾール／ＴＨＦ，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社］を用いてキャップし、シェーカー上で２時間振盪した。官能基を付
けたＣＰＧを濾過し、ＣＨ₃ ＣＮ、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 及びＥｔ₂ Ｏで十分洗浄した。
次いで乾燥させ、最終ローディングキャパシティを測定した（６０．７４ミリモ
ル／ｇ）。

【０２５５】 実施例９７ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−｛２−［（Ｎ，Ｎ−ビス−２−フタルイミドエチ
ル）アミノオキシ］エチル｝−５−メチル−ウリジン−３' −Ｏ−［（２−シア
ノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト（１２ａ） 化合物（４ａ）をメチルヒドラジンで処理してアミノオキシ化合物を得た後で
、フタルイミドアセトアルデヒドで処理し、対応するオキシムを得る。酸触媒で
還元アミノ化する条件でこのオキシムを還元して得られる２−フタルイミドエチ
ル誘導体を、還元アミノ化条件の下で等量のフタルイミドアセトアルデヒドで処
理し、ビス（２−フタルイミドエチル）アミノオキシエチル誘導体を得る。この
ビス（２−フタルイミドエチル）アミノオキシエチル誘導体を脱シリル化し、５
' 位でトリチル化し、次いで３' −ホスフィチル化して表題化合物を得る。

【０２５６】 実施例９８ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−｛２−［（Ｎ，Ｎ−ビス−２−フタルイミドエチ
ル）アミノオキシ］エチル｝−５−メチルウリジン−３' −Ｏ−スクシニルＣＰ
Ｇ（１３ａ） 化合物（１１ａ）及び（１２ａ）について記載した方法により、５' −Ｏ−Ｄ
ＭＴ−２' −Ｏ−｛２−［Ｎ，Ｎ−ビス−（２−フタルイミド）エチルアミノオ
キシ］エチル｝−５−メチル−ウリジンから出発して、化合物（１４ａ）を合成
する。

【０２５７】 実施例９９ ２' −Ｏ−｛２−［Ｎ−（２−アミノ）エチル−Ｎ−（メチル）］アミノオキシ
エチル｝修飾を含有するオリゴヌクレオチドの合成 ホスホロアミダイト（９ａ）を無水アセトニトリルに溶かし（０．１Ｍ溶液）
、オリゴヌクレオチド合成に使用するＥｘｐｅｄｉｔｅ核酸合成システム（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ ８９０９）にロードした。カップリング効率は９８％以上と判
定された。修飾されたホスホロアミダイト（９ａ）のカップリングについては、
カップリング時間を１０分へ延ばし、この工程を２回実施した。Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ提供のプロトコールにある他の工程は、変更せずに使用した。合成の終了後
、１０％メチルアミン（４０重量％溶液）を含有するＮＨ₄ ＯＨ水溶液（３０重
量％）にＣＰＧを懸濁させ、５５℃で６時間加熱した。生成したオリゴヌクレオ
チドをＨＰＬＣに（Ｗａｔｅｒｓ，Ｃ−４，７．８ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭ
酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）、Ｂ＝アセトニトリル、Ｂの５〜６０％
／５５分、流速２．５ｍＬ／分、λ＝２６０ｎｍ）により精製した。８０％酢酸
水溶液で脱トリチル化し、蒸発させ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃ−４カラムのＨＰＬＣに
より脱塩し、２' −修飾オリゴヌクレオチド群を得た（表Ｉ）。ＨＰＬＣ、ＣＧ
Ｅ及び質量分析によってオリゴヌクレオチドを分析した。

【０２５８】

【表６】

【０２５９】 Ｔ^* ＝２' −Ｏ−｛２−［Ｎ−（２−アミノ）エチル−（Ｎ−メチル）アミノオ
キシ］エチル｝^5Me Ｕ。^a Ｗａｔｅｒｓ Ｃ−４，７．８ｘ３００ｍｍ，溶媒：
Ａ＝５０ｍＭ ＴＥＡＡｃ、ｐＨ７；Ｂ＝ＣＨ₃ ＣＮ；Ｂの５〜４０％勾配液／
５５分；流速１．５ｍＬ／分、λ＝２６０ｎｍ

【０２６０】

【表７】 Ｔ^* ＝２' −Ｏ−｛２−［Ｎ−（２−アミノ）エチル−Ｎ−（メチル）アミノオ
キシ］エチル｝^5Me Ｕ。

【０２６１】 実施例１００ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−｛２−［Ｎ−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エ
チル−Ｎ−（メチル）−アミノオキシ］エチル｝−５−メチルウリジン−３' −
Ｏ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト（１
４ａ） 化合物（１４ａ）は化合物（３ａ）から合成する。フタルイミド化合物である
（３ａ）をメチルヒドラジンで脱保護して、アミノオキシ化合物を形成させる。
反応性のアミノオキシ化合物をα−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）アセトアルデヒ
ドジエチルアセタールで処理して、対応するオキシムを得る。酸触媒で還元アミ
ノ化する条件でこのオキシムを還元して得られる２−｛［２−Ｎ，Ｎ−（ジメチ
ル）アミノ］エチルアミノオキシ｝エチル誘導体を、還元アミノ化条件の下でホ
ルムアルデヒドで処理し、２−｛［Ｎ−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）アミノ］エチ
ル−Ｎ−（メチル）アミノオキシ｝エチル誘導体を得る。上記の実施例のように
脱シリル化、トリチル化及びホスフィチル化して表題のホスホロアミダイトを得
る。

【０２６２】 実施例１０１ ５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−｛２−［Ｎ−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エ
チル−Ｎ−（メチル）−アミノオキシ］エチル｝−５−メチルウリジン−３' −
Ｏ−スクシニルＣＰＧ（１５ａ） 化合物（１１ａ）及び（１２ａ）について記載した方法により、５' −Ｏ−Ｄ
ＭＴ−２' −Ｏ−｛２−［Ｎ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル−Ｎ−（
メチル）アミノオキシ］エチル｝−５−メチル−ウリジンから出発して、化合物
（１５ａ）を合成する。

【０２６３】 方法１ ヌクレアーゼ抵抗性 Ａ．血清及び細胞質のヌクレアーゼに対する修飾オリゴヌクレオチド抵抗性の
評価 本発明の修飾オリゴヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドは、様々な濃
度の胎仔血清又は成人血清を含有する培地においてオリゴヌクレオチドをインキ
ュベーションすることにより、その血清ヌクレアーゼ抵抗性を評価し得る。標識
化オリゴヌクレオチドを様々な時間インキュベートし、プロテアーゼＫで処理し
、次いで２０％ポリアクリルアミド−尿素変性ゲルの電気泳動、後続のオートラ
ジオグラフィーにより分析する。レーザー密度計にによりオートラジオグラムを
定量化する。オリゴヌクレオチドの修飾位置及び既知の長さに基づいて、特定の
修飾によるヌクレアーゼ分解に対する効果を判定することが可能である。細胞質
ヌクレアーゼについては、ＨＬ６０細胞系が使用される。ミトコンドリアを含ま
ない上清をディファレンシャル遠心分離により調製し、標識化したオリゴヌクレ
オチドをこの上清において様々な時間インキュベートする。インキュベーション
した後、血清の核酸分解について上記に概説したように、分解についてオリゴヌ
クレオチドを評価する。非修飾及び修飾オリゴヌクレオチドを比較するためにオ
ートラジオグラフィーの結果を定量化する。対照としての非修飾ホスホジエステ
ルオリゴヌクレオチドは、１時間以内に５０％分解され、２０時間以内に１００
％分解されることが見出された。

【０２６４】 Ｂ．修飾オリゴヌクレオチドの特定エンド−及びエクソヌクレアーゼに対する
抵抗性の評価 天然及び修飾オリゴヌクレオチドの特定ヌクレアーゼ（即ち、エンドヌクレア
ーゼ、３' ，５' −エクソ−及び５' ，３' −エクソヌクレアーゼ）に対する抵
抗性を、分解に対する修飾の正確な効果を定量することによって評価する。様々
な選択ヌクレアーゼに特有の規定された反応緩衝液において、修飾オリゴヌクレ
オチドをインキュベートする。プロテアーゼＫで生成物を処理した後に尿素を加
え、尿素含有２０％ポリアクリルアミドゲル上で分析を実施する。ゲル生成物は
、Ｓｔａｉｎｓ Ａｌｌ（シグマケミカル社）を用いた染色により視覚化した。
レーザー密度計を用いて分解の程度を定量する。特定のヌクレアーゼについて修
飾の効果を決定し、血清及び細胞質の系から得られた結果と比較する。

【０２６５】

【表８】

【０２６６】 Ｔ１９ジエステル及びチオエートの対照とともに、ゲル精製オリゴの５' 末端
を³²Ｐで標識し、標準的なヌクレアーゼアッセイプロトコールで試験した。ＰＡ
ＧＥ／ホスホイメージングにより、インタクトの比率（％）及び（インタクト＋
（Ｎ−１））の比率（％）について定量化し得る造影を産生した。この比率をプ
ロットして半減期を算出し、これを以下の表にリストする。この表には２' −Ｏ
−メトキシエチル（ＭＯＥ）の半減期が含まれる。この結果は、２' −ジメチル
アミノオキシエチル（ＤＭＡＯＥ）がヌクレアーゼ抵抗性の高い修飾であること
を示した（図１４及び１５）。

【０２６７】

【表９】

【０２６８】 ２' −ＤＭＡＯＥ修飾でキャップしたオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗
性に関する最初のアッセイは、アッセイ間比較において、２' −Ｏ−メトキシエ
チル修飾に優る抵抗性を示した（図１３）。上記の結果は、２つのモチーフにお
ける様々な修飾間のアッセイ内比較である。第一のモチーフは完全なホスホジエ
ステル骨格であり、４個の修飾ヌクレオチドのキャップが３' 最端ヌクレオチド
から始まっている。第二のモチーフも同様であるが、３' 末端のヌクレオチド間
連結に単一のホスホロチオエートを含有する。

【０２６９】

【表１０】

【０２７０】 Ｔ１９ホスホロチオエートの対照とともに、オリゴをゲル精製し、標準的なヌ
クレアーゼプロトコールで試験した。上記のアッセイから、Ｔ^* ＝２' −Ｏ−ジ
メチルアミノオキシエチルであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４が、二番目に抵抗性
のあるオリゴヌクレオチドであることが判明した。Ｔ^* ＝２' −Ｏ−メトキシエ
チルであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４はより迅速に分解され、Ｔ^* ＝２' −Ｏ−
プロピルであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４はかなり速く分解される。ゲルの底部
にいくつか反応生成物が示されるが、抵抗性のあるオリゴヌクレオチドのｎ−２
やｎ−３はほとんど無い。上記の生成物はＳＶＰＤによる核酸内分解的な開裂の
結果であるらしい。このタイプの活性はいつでも基底速度で存在しているが、必
ずしもほとんどのオリゴヌクレオチドに対して３' −エクソヌクレアーゼ活性が
優勢であるからではない。しかしながら、上記のオリゴヌクレオチドは３' −エ
クソヌクレアーゼに対して非常に抵抗性があるので、エンドヌクレアーゼ活性が
、完全長のオリゴに対する大部分の開裂反応の原因になる。エンドヌクレアーゼ
反応の２' −デオキシホスホジエステル生成物は速やかに開裂してモノマーにな
る。上記の反応には２組の定量がなされる。１つは３' −エクソヌクレアーゼ生
成物のみを計数するものであり、もう１つは全反応の生成物を計数する。いずれ
の場合でも、Ｔ^* ＝２' −Ｏ−ジメチルアミノオキシエチルであるＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１４の半減期は２４時間より長かった。Ｔ^* ＝２' −Ｏ−メトキシエチ
ルであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４については、エクソヌクレアーゼ処理時の半
減期は２４時間以上であるが、他のタイプの定量では、約１００分の半減期が得
られる。単一のホスホロチオエート連結を含有するモチーフのオリゴヌクレオチ
ドは上記エンドヌクレアーゼ活性の基質となるが、このアッセイの経時変化では
３' エクソヌクレアーゼ活性の生成物は検出されない。

【０２７１】

【表１１】

【０２７２】

【表１２】 ΔＴｍは、ＤＮＡ及びホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについて報告され
た文献値に基づいている。

【０２７３】 方法２ Ｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アセンブリー 本試験で説明されるｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子はＰＣＲ技術を
用いて組み立てられる。突然変異体（コドン１２）と非突然変異体（野生型）ヒ
トＨ−ｒａｓ遺伝子の両方のエクソン１・５' −領域をＰＣＲクローニングする
ためのプライマ−として使用する、オリゴヌクレオチドプライマーを合成する。
Ｈ−ｒａｓ遺伝子の鋳型はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ番号、４１０００及び４１００１）、ベテスダ、Ｍ
Ｄより購入する。突然変異体及び非突然変異体のＨ−ｒａｓ遺伝子を鋳型として
使用する標準的なＰＣＲ反応では、オリゴヌクレオチドのＰＣＲプライマ−、５
' −ＡＣＡ−ＴＴＡ−ＴＧＣ−ＴＡＧ−ＣＴＴ−ＴＴＴ−ＧＡＧ−ＴＡＡ−ＡＣ
Ｔ−ＴＧＴ−ＧＧＧ−ＧＣＡ−ＧＧＡ−ＧＡＣ−ＣＣＴ−ＧＴ−３' （センス）
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と５' −ＧＡＧ−ＡＴＣ−ＴＧＡ−ＡＧＣ−ＴＴ
Ｃ−ＴＧＧ−ＡＴＧ−ＧＴＣ−ＡＧＣ−ＧＣ−３' （アンチセンス）（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１１）を使用する。これらのプライマーは、ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接した、正常及び突然変異体のＨ−ｒａ
ｓの（翻訳開始部位に対する）配列−５３〜＋６５に対応する１４５塩基対のＤ
ＮＡ生成物を産生することが予測される。このＰＣＲ産物を、標準法を用いて、
ゲルで精製し、沈澱させ、水で洗浄及び懸濁させる。

【０２７４】 P. pyrelis（ホタル）ルシフェラーゼ遺伝子をクローニングするためのＰＣＲ
プライマーは、ＰＣＲ生成物が完全長のルシフェラーゼタンパク質をコードする
ように設計したが、例外として、アミノ末端メチオニンを２つのアミノ酸、アミ
ノ末端のリジン残基とそれに続くロイシン残基に置換させた。ルシフェラーゼ遺
伝子のクローニングに使用したオリゴヌクレオチドのＰＣＲプライマーは、５'
−ＧＡＧ−ＡＴＣ−ＴＧＡ−ＡＧＣ−ＴＴＧ−ＡＡＧ−ＡＣＧ−ＣＣＡ−ＡＡＡ
−ＡＣＡ−ＴＡＡ−ＡＧ−３' （センス）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）と５'
−ＡＣＧ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＧＣＧ−ＣＧＣ−ＣＧＡ−ＴＡＣ−ＣＧＴ−ＣＧＡ
−ＣＣＴ−ＣＧＡ−３' （アンチセンス）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）であり
、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する市販プラスミド（ｐＴ３／Ｔ７−
Ｌｕｃ）を鋳型として使用する標準的なＰＣＲ反応に用いる。これらのプライマ
ーは、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｓＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接した
、ルシフェラーゼ遺伝子に対応する約１．９ｋｂの生成物を産出すると予測され
る。このフラグメントを、標準法を用いて、ゲルで精製し、沈澱させ、水で洗浄
及び懸濁させる。

【０２７５】 ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子の組立てを完成させるには、ｒ
ａｓとルシフェラーゼのＰＣＲ産物を適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、
制限エンドヌクレアーゼのＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｓＨＩＩを用いて
、ステロイド誘導性マウス乳癌ウイルスプロモーターＭＭＴＶ含有発現ベクター
へ３つの部分を連結してクローン化する。生成したクローンには、ホタルルシフ
ェラーゼ遺伝子に正しいフレームで融合したＨ−ｒａｓの５' 配列（−５３〜＋
６５）が挿入されている。この得られた発現ベクターは、ステロイド誘導性ＭＭ
ＴＶプロモーターの制御下で発現されるｒａｓ−ルシフェラーゼ融合産物をコー
ドする。

【０２７６】 方法３ プラスミドＤＮＡを用いた細胞のトランスフェクション Greenberg in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., E
ds., John Wiley and Sons, New Yorkに記載の方法に、以下の変更をしてトラン
スフェクションを実施する：ヒーラ細胞は１ディッシュあたり５ｘ１０⁵ 細胞で
６０ｍｍのディッシュにまく。各々のディッシュに全量１０μｇのＤＮＡを加え
るが、そのうち９μｇはｒａｓ−ルシフェラーゼレポータープラスミドであり、
１μｇはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の構成プロモーターの制御下でラットの
グルココルチコイド受容体を発現するベクターである。３ｍＭ ＥＧＴＡ含有ト
リス緩衝化生理食塩水（５０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）で洗浄することによって、１６〜２０時間後にリン酸カルシウム−ＤＮ
Ａ共沈殿物を除去する。次いで、１０％胎仔血清を補充した新鮮な培地を細胞へ
加える。この時点で、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで前処理した後、
デキサメサゾンによりレポーター遺伝子の発現を活性化する。

【０２７７】 方法４ 細胞のオリゴヌクレオチド処理 プラスミドのトランスフェクションをしたすぐ後で、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ（
ＧＩＢＣＯ）で３回洗浄し、３７℃へ前もって温める。Ｎ−［１−（２，３−ジ
オレチルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）
（ＤＯＴＭＡ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）１０μｇ／ｍＬを含有するＯｐｔｉＭＥＭの２ｍＬを各
々のディッシュに加え、オリゴヌクレオチドを直接加え、３７℃で４時間インキ
ュベートする。次いでＯｐｔｉＭＥＭを除去し、オリゴヌクレオチドを含有する
適切な細胞増殖培地と交換する。この時点で、最終濃度２μＭのデキサメサゾン
で細胞を処理し、レポーター遺伝子の発現を活性化する。ステロイド処理から１
２〜１６時間に細胞を採取する。

【０２７８】 方法５ ルシフェラーゼアッセイ Greenberg in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., E
ds., John Wiley and Sons, New Yorkに記載のように、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００で溶解することにより細胞からルシフェラーゼを抽出する。Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ ＭＬ１０００蛍光計を使用して、ルシフェリン（シグマ）を６２５
μＭまで加えるときのピーク蛍光を測定する。各々の抽出液につきルシフェラー
ゼアッセイを数回実施し、様々な量の抽出液を用いて、アッセイの比例範囲でデ
ータが収集されることを確認する。

【０２７９】 方法６ ｒａｓ−ルシフェラーゼ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻
害 活性化Ｈ−ｒａｓのコドン１２点突然変異を標的にした一連のアンチセンスホ
スホロチオエート・オリゴヌクレオチド類似体を、上記実施例に記載のｒａｓ−
ルシフェラーゼレポーター遺伝子系を用いて試験する。基本配列には上記国際特
許公開第ＷＯ９２／２２６６１号に報告されたような既知の活性がある。基本配
列とその類似体の両方で、いずれのヌクレオチドサブユニットもヌクレアーゼ抵
抗性をもたらすホスホロチオエート連結を取込んでいた。類似体はいずれも、２
' −Ｏ−置換及び２' −デオキシ−エリスロ−ペンタフラノシル糖を含有するヌ
クレオチドサブユニットを取込んでいた。類似体では、２' −デオキシ−エリス
ロ−ペントフラノシル糖含有サブユニットの配列の両端で、２' −Ｏ−置換サブ
ユニットが隣接している。類似体は、２' −デオキシ−エリスロ−ペントフラノ
シル糖含有ヌクレオチドのサブ配列の長さに関して互いに異なるものであった。
これら配列の長さは１〜全９ヌクレオチドの２ヌクレオチドだけ異なっている。
２' −デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオチドのサブ配列は、活性
化ｒａｓのコドン１２点突然変異の点突然変異部分に集中している。

【０２８０】 方法７ ｍＲＮＡの過剰発現を検出する診断アッセイ オリゴヌクレオチドの合成後に、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５' 末端
を³²Ｐ標識で放射標識する。Sambrook et al. （"Molecular Cloning. A Labora
tory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Volume 2, pg. 1
1. 31-11. 32）。特異的なハイブリダイゼーションが起こり得る条件の下で、患
者由来のサンプルのような、ｍＲＮＡの過剰発現が疑われる組織又は細胞のサン
プルに放射標識オリゴヌクレオチドを接触させ、サンプルを洗浄して非結合オリ
ゴヌクレオチドを除去する。同様の対照では、特異的なハイブリダイゼーション
が可能になる条件の下で正常な細胞又は組織サンプルと放射標識オリゴヌクレオ
チドを接触させ、サンプルを洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去する。サ
ンプルに残る放射活性は結合したオリゴヌクレオチドを示し、シンチレーション
カウンター又は他の定常的な手段を用いて定量する。正常細胞と罹患細胞に由来
するサンプルに残る放射活性の比較により、関心対象のｍＲＮＡの過剰発現が示
される。

【０２８１】 本発明の放射標識オリゴヌクレオチドはオートラジオグラフィーにも有用であ
る。組織切片を放射標識オリゴヌクレオチドで処理し、上記のように洗浄し、次
いで標準的なオートラジオグラフィー法により、写真用乳剤に漬ける。正常の細
胞又は組織サンプルを用いた対照も同様に処理する。現像すると、乳剤はｍＲＮ
Ａを過剰発現している領域で銀粒の造影を生じるので、これを定量する。正常細
胞と罹患細胞について観測される銀粒を比較して、ｍＲＮＡの過剰発現の程度を
定量する。

【０２８２】 ｍＲＮＡ発現を蛍光検出するための同様のアッセイでは、フルオレセイン又は
他の蛍光タグで標識した本発明のオリゴヌクレオチドが使用される。標識ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドは、ヨウ素で酸化する標準的なホスホロアミダイト化学を使
用する自動化ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ モデル ３８０Ｂ）で合成する。β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティ、ＣＡ）より購入す
る。フルオレセイン標識アミダイトは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（スターリ
ング、ＶＡ）から購入する。オリゴヌクレオチド及び生物学的サンプルのインキ
ュベーションは放射標識オリゴヌクレオチドについての記載と同じように実施す
るが、シンチレーションカウンターの代わりに、蛍光を検出する蛍光顕微鏡を使
用する。正常細胞及び罹患細胞由来のサンプルにおいて観測される蛍光を比較す
れば、ｍＲＮＡの過剰発現の検出が可能になる。

【０２８３】 方法８ 異常なｍＲＮＡ発現の検出 異常なｍＲＮＡを発現していると疑われる組織又は細胞のサンプルを、野生型
（正常）ｍＲＮＡを標的にした第一の³²Ｐ又はフルオレセインで標識したオリゴ
ヌクレオチドとともにインキュベートする。同一の細胞又は組織のサンプルを、
特異的なハイブリダイゼーションが起こり得る条件下で、異常なｍＲＮＡを標的
にした第二の標識オリゴヌクレオチドとインキュベートし、次いでこのサンプル
を洗浄し、非結合オリゴヌクレオチドを除去する。サンプルに残っているラベル
は結合したオリゴヌクレオチドを示し、シンチレーションカウンター、蛍光計又
は他の定常的な手段を用いて定量し得る。結合が第二のサンプルで観察され、第
一のサンプルで観察されなければ、異常なｍＲＮＡの存在が示される。

【０２８４】 本発明のオリゴヌクレオチド及び方法については、異常なｍＲＮＡの発現を特
異的に検出するために、二重標識法も使用し得る。単一の組織サンプルを、野生
型ｍＲＮＡを標的にした第一の³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチド、及び異常なｍＲ
ＮＡを標的にした第二のフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドと、特異的なハ
イブリダイゼーションが起こり得る条件下で、インキュベートする。このサンプ
ルを洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去し、シンチレーション計数及びフ
ルオロメトリーによりラベルを検出する。このサンプルが³²Ｐ−標識オリゴヌク
レオチドに結合しない（つまり、放射活性でない）が、蛍光ラベルを保持する（
即ち、蛍光性である）ならば、異常なｍＲＮＡの存在が示される。

【０２８５】 方法９ ＤＭＡＯＥと２' −デオキシホスホロチオエートの結合親和性比較 ４個又は１０個のＤＭＡＯＥ修飾を有するオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１５及び２）の結合親和性を３種の相補配列のそれぞれと比較定量した
。この相補配列は、ａ）ＤＭＡＯＥオリゴヌクレオチドと同じ位置で各々のＭＯ
Ｅオリゴヌクレオチドが置換されているＭＯＥホスホジエステル；ｂ）均一な２
' −デオキシホスホロチオエート；及びｃ）均一な２' −デオキシホスホロチオ
エートであった。ＤＭＡＯＥ修飾オリゴヌクレオチドは、均一２' −デオキシホ
スホロチオエートに比較して、各々の修飾ごとに約２．５℃のＴｍ増加を示す。
非修飾均一２' −デオキシホスホジエステルに比較して、ＤＭＡＯＥオリゴヌク
レオチドは約１．６℃のＴｍ増加を示した。このことは、Ｐ＝Ｓの均一２' −デ
オキシホスホロチオエートＤＮＡに比較して、１つの修飾につき２．５℃（のＴ
ｍ増）と解釈される。より重要なことは、この増加が、各々の修飾につき０．４
℃という２' −ＭＯＥよりずっと高いことであり、これはＭＯＥオリゴヌクレオ
チドに比較してＤＭＡＯＥのサイズが大きいことに照らせば、驚くべきことであ
る。

【０２８６】

【表１３】

【０２８７】 方法１０ 方法Ａ ＩＣＡＭ−１の発現 ＨＵＶＥＣのオリゴヌクレオチド処理：細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で３回洗浄し、前もって３７℃へ温めた。Ｏｐｔ
ｉ−ＭＥＭにおいてオリゴヌクレオチドをＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）（１００μｇ／ｍＬ）と混合し、所望の濃度へ連続
希釈し、洗浄済みの細胞へ適用した。基準及び未処理（オリゴヌクレオチドなし
）の対照細胞もＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎで処理した。細胞を３７℃で４時間インキ
ュベートした後に、培地を除去し、ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（５
ｍｇ／ｍＬ）を含むか又は含まない標準増殖培地に置き換えた。指定の時間まで
３７℃でインキュベーションを続けた。

【０２８８】 蛍光表示式細胞分取器によるＩＣＡＭ−１タンパク質発現の定量：０．２５％
トリプシン／ＰＢＳを用いた簡単なトリプシン処理によりプレート表面から細胞
を除去した。２％ウシ血清アルブミン及び０．２％アジ化ナトリウム／ＰＢＳ（
＋Ｍｇ／Ｃａ）の溶液を用いてトリプシン活性を止めた。遠心分離（１０００ｒ
ｐｍ，Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＰＲ遠心機）により細胞をペレット化し、ＰＢＳで再
懸濁させ、１０⁵ 個の細胞につき３μＬのＩＣＡＭ−１特異抗体、ＣＤ５４−Ｐ
Ｅ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｉｎ）で染色した。抗体をこの細胞とともに、暗所で、穏
やかに揺らしながら、４℃で３０分インキュベートした。遠心操作により細胞を
洗浄し、次いで、０．５％ホルムアミド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）含有Ｆａ
ｃｓＦｌｏｗ緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）０．３ｍＬに再懸濁
させた。細胞表面ＩＣＡＭ−１の発現を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを用いるフローサイトメトリーにより定量した。対照のＩＣＡＭ
−１発現の比率を以下のように算出した：［（オリゴヌクレオチド処理ＩＣＡＭ
−１値）−（基準ＩＣＡＭ−１値）／（未処理ＩＣＡＭ−１値）−（基準ＩＣＡ
Ｍ−１値）］。１つの試験では、２' −Ｏ−（２−メトキシ）エチルで修飾した
抗−細胞内吸着分子１（ＩＣＡＭ−１）オリゴヌクレオチドは、ヒト臍静脈の内
皮細胞において、ＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡレベルを選択的に増加させ、ＩＣＡＭ
−１の翻訳開始複合体の形成を阻害することが示された（Baker, et al., The J
ournal of Biological Chemistry, 1997, 272, 11994-12000）。

【０２８９】 ＩＣＡＭ−１の発現データは、ＤＭＡＯＥオリゴマーのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２１（均一ＤＭＡＯＥ、Ｐ＝Ｓ）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８（均一ＤＭＡＯ
Ｅ、Ｐ＝Ｏ）がＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＣＡＭ−１発現の制御において有効で
あることを示す。このオリゴマーは、直接結合的なＲＮアーゼＨ非依存的な機序
によって作用しているらしい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１（Ｐ＝Ｓ）及びＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２１（Ｐ＝Ｏ）を有するＭＯＥオリゴマーは対照の値となる。そ
れらはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８と同じ配列組成
を有する。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８の両化合物は、３〜１
００ｎＭの範囲で用量依存的なＩＣＡＭ−１発現の阻害を示す。

【０２９０】 方法Ｂ Ａ５４９細胞におけるＰＫＣ−α・ｍＲＮＡの発現 このアッセイは、報告された方法（Dean, N. et al., Journal of Biology an
d Chemistry, 269, 16416-16424, 1994 ）により実施した。ヒトＡ５４９肺癌細
胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入
手した。グルコース（１ｇ／リットル）及び１０％ＦＣＳ含有ダルベッコ改良イ
ーグル培地でこれを増殖させ、９０〜９５％の集密度で定常的に継代培養した。

【０２９１】 ＰＫＣ−αタンパク質合成のオリゴヌクレオチド阻害アッセイ：Ａ５４９細胞
を６穴プレート（ＦａｌｃｏｎＬａｂｗａｒｅ，リンカーンパーク、ＮＪ）にま
き、２４〜４８時間後（８０〜９０％の集密度）に１μＭの１２，１３−ジブチ
ル酸ホルボール（ＰＤＢｕ）で１８時間処理した。この方法により、免疫活性な
ＰＫＣ−αタンパク質の７５％以上が細胞から除去される（「結果」を参照のこ
と）。次いで、（ＰＤＢｕを除去するために）細胞をＤＭＥＭ（３ｍＬ）で３回
洗浄し、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥの２０μｇ／ｍＬ溶液（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^R ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え
た。次いで、オリゴヌクレオチドが必要とされる濃度（最初のスクリーニングで
は１μＭ）になるように、１０μＭのストック溶液から加え、ディッシュを廻し
てこの２つの溶液を混合した。細胞を３７℃で４時間インキュベートし、ＤＭＥ
Ｍ＋１０％ＦＣＳで１回洗浄してＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ溶液を除去し、次いで追
加のＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ（３ｍＬ）を加え、さらに１０時間かけて細胞を回
復させた。ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥとのインキュベーション時間が４時間を越すと
、細胞に対する毒性が強まってしまう。この時点で、細胞をＰＢＳで１回洗浄し
、次いで、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、５
ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭフッ化ナトリウム、１０
ｍＭリン酸ナトリウム、ロイペプチン（２μｇ／ｍＬ）及びアプロチニン（１μ
ｇ／ｍＬ）を含む溶解緩衝液２００μｌにおいて（４℃で）抽出した。ＰＫＣ−
α特異的なモノクローナル抗体とのイムノブロッティングにより、ＰＫＣ−αの
タンパク質レベルを定量した。

【０２９２】 結果：ＤＭＡＯＥオリゴヌクレオチドギャップマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９
（Ｐ＝Ｓ／Ｐ＝Ｓ／Ｐ＝Ｓギャップマー）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９（Ｐ＝
Ｏ／Ｐ＝Ｓ／Ｐ＝Ｏギャップマー）は、５０〜４００ｎＭの範囲で用量依存的に
Ａ５４９細胞におけるＰＫＣ−αのｍＲＮＡ発現を阻害する。均一Ｐ＝Ｓギャッ
プマーは混在骨格のギャップマーより効果的である。この実験においては、対応
するＭＯＥオリゴマーを対照化合物として使用した。ＤＭＡＯＥオリゴマーとＭ
ＯＥオリゴマーは、ＰＫＣ−αのｍＲＮＡレベルを減少させる点で同様の活性を
示す。

【０２９３】 本明細書において引用又は言及された特許、出願、印刷物、及び他の公表文献
は、いずれもそのまま参照により本明細書に組込まれている。 当業者は、本発明の好ましい態様に対して数多くの変更及び改良がなし得るこ
と、及びそのような変更及び改良が本発明の精神から逸脱することなくなし得る
ことを理解されるだろう。従って、付帯の特許請求項は、本発明の真の精神及び
範囲に該当するそのような同等のバリエーションをすべて含むものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のある中間体の合成を示す。

【図２】 保護されたアミノオキシエチル基を２' −Ｏ位に有する５−メチルウリジンＤ
ＭＴ−ホスホロアミデートの合成を示す。

【図３】 本発明のある中間体の合成を示す。

【図４】 保護されたアミノオキシエトキシ基を２' 位に有するアデノシンＤＭＴ−ホス
ホロアミデートの合成を示す。

【図５】 本発明のある中間体の合成を示す。

【図６】 保護されたアミノオキシエトキシ基を２' 位に有するシチジンＤＭＴ−ホスホ
ロアミデートの合成を示す。

【図７】 本発明のある中間体の合成を示す。

【図８】 保護されたアミノオキシエトキシ基を２' 位に有するグアニジンＤＭＴ−ホス
ホロアミデートの合成を示す。

【図９】 本発明のいくつかの中間体及びモノマーの合成を示す。

【図１０】 本発明の化合物のＣＰＧへの連結を示す。

【図１１】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図１２】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図１３】 オリゴヌクレオチドに対するヌクレアーゼ作用の効果に関連する、完全長オリ
ゴヌクレオチドの比率（％）と時間（分）のグラフを示す。

【図１４】 オリゴヌクレオチドに対するヌクレアーゼ作用の効果に関連する、完全長オリ
ゴヌクレオチドの比率（％）と時間（分）のグラフを示す。

【図１５】 オリゴヌクレオチドに対するヌクレアーゼ作用の効果に関連する、完全長オリ
ゴヌクレオチドの比率（％）と時間（分）のグラフを示す。

【図１６】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図１７】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図１８】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図１９】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図２０】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図２１】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図２２】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図２３】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図２４】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図２５】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図２６】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図２７】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図２８】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図２９】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図３０】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図３１】 本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図３２】 本発明の中間体及びＤＭＴホスホロアミダイトモノマーの合成を示す。

【図３３】 ＣＰＧに付いた本発明の中間体及びモノマーの合成を示す。

【図３４】 本発明の中間体及びＤＭＴホスホロアミダイトモノマーの合成を示す。

【図３５】 本発明の中間体及びＤＭＴホスホロアミダイトモノマーの合成を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＺ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クック，フィリップ・ダン アメリカ合衆国カリフォルニア州92069， レーク・サン・マルコス，ラ・カサ 1155 (72)発明者 プラカシュ，タザ・ピー アメリカ合衆国カリフォルニア州92008， カールズバッド，アベニダ・デ・アニタ 2703，アパートメント・ナンバー 12 (72)発明者 カワサキ，アンドリュー・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州92056， オーシャンサイド，ランチョ・デル・オ ロ・ロード・ナンバー 31 2395 Ｆターム(参考） 4C057 BB02 DD01 LL10 LL11 LL14 LL17 LL18 LL21 LL28 LL29 LL30 LL40 MM01 MM02

Claims (89)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 化合物であって、構造： 【化１】 ［式中： Ｔ₄ は、Ｂｘ又はＢｘ−Ｌであって、Ｂｘは複素環塩基部分であり； Ｔ₁ 、Ｔ₂ 及びＴ₃ の１つは、Ｌ、水素、ヒドロキシル、保護されたヒドロキ
   シル又は糖置換基であり； Ｔ₁ 、Ｔ₂ 及びＴ₃ のもう１つは、Ｌ、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシ
   ル、固形支持体への結合基又は活性化されたリン基であり； Ｔ₁ 、Ｔ₂ 及びＴ₃ の残る１つは、Ｌ、水素、ヒドロキシル又は糖置換基であ
   るが、Ｔ₁ 、Ｔ₂ 、Ｔ₃ 及びＴ₄ のうち少なくとも１つは、Ｌ又はＢｘ−Ｌであ
   り； 前記Ｌ基は、式： 【化２】 ｛式中： ｍ及びｍｍは、それぞれ独立して１〜１０であり； ｙは、１〜１０であり； Ｅは、Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）又はＮ＝Ｃ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）であり； Ｒ₁ 及びＲ₂ は、それぞれ独立して、Ｈ、窒素保護基、置換又は未置換Ｃ₁ 〜
   Ｃ₁₀アルキル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ₁₀アルケニル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ ₁₀ アルキニルであって、前記置換基が、ＯＲ₃ 、ＳＲ₃ 、ＮＨ₃ + 、Ｎ（Ｒ₃ )(
   Ｒ₄ ）、グアニジノ又はアシルであり、前記アシルが、酸、アミド又はエステル
   であるか； 又は、Ｒ₁ 及びＲ₂ は、一緒になって、窒素保護基となるか、又はＮ及びＯか
   ら選択される追加のへテロ原子を場合により包含する環構造になり；そして、 Ｒ₃ 及びＲ₄ は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基で
   あるか、又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は一緒になって、窒素保護基となるか； 又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は、結合して、Ｎ及びＯから選択される追加のへテロ原子
   を場合により包含する環構造になる。｝を有する。］ の化合物。
2. 【請求項２】 Ｔ₁ 、Ｔ₂ 又はＴ₃ の１つがＬである、請求項１に記載の化
   合物。
3. 【請求項３】 Ｔ₃ がＬである、請求項２に記載の化合物。
4. 【請求項４】 Ｔ₄ がＢｘ−Ｌである、請求項１に記載の化合物。
5. 【請求項５】 Ｌが−Ｏ−（ＣＨ₂)₂ −Ｏ−Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）である、請求
   項１に記載の化合物。
6. 【請求項６】 Ｒ₁ が、Ｈ、又はＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、又は置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀ アルキルであり、Ｒ₂ が置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである、請求項２に記載の化合
   物。
7. 【請求項７】 Ｒ₁ がＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである、請求項６に記載の化合物
   。
8. 【請求項８】 Ｒ₂ が、ＮＨ₃ + 又はＮ（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アル
   キルである、請求項６に記載の化合物。
9. 【請求項９】 Ｒ₁ 及びＲ₂ が、いずれも置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである、
   請求項６に記載の化合物。
10. 【請求項１０】 置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル上の置換基が、独立してＮＨ₃ +
    又はＮ（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）である、請求項９に記載の化合物。
11. 【請求項１１】 Ｂｘがアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、ウラシル、
    チミン、シトシン、２−アミノアデニン又は５−メチルシトシンである、請求項
    １に記載の化合物。
12. 【請求項１２】 Ｒ₁ 及びＲ₂ が、結合して、Ｎ及びＯから選択される少な
    くとも１つのへテロ原子を包含し得る環構造になる、請求項１に記載の化合物。
13. 【請求項１３】 前記環構造が、イミダゾール、ピペリジン、モルホリン又
    は置換ピペラジンである、請求項１２に記載の化合物。
14. 【請求項１４】 前記置換ピぺラジンが、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₂アルキルで置換されて
    いる、請求項１３に記載の化合物。
15. 【請求項１５】 Ｔ₁ が保護されたヒドロキシルである、請求項１に記載の
    化合物。
16. 【請求項１６】 Ｔ₂ が活性化されたリン基であるか又は固形支持体への結
    合基である、請求項１に記載の化合物。
17. 【請求項１７】 前記固形支持体物質がミクロ粒子である、請求項１６に記
    載の化合物。
18. 【請求項１８】 前記固形支持体物質がＣＰＧである、請求項１６に記載の
    化合物。
19. 【請求項１９】 ＬがＢｘの環外アミノ官能基に結合している、請求項４に
    記載の化合物。
20. 【請求項２０】 ＬがＢｘの環員炭素原子に結合している、請求項４に記載
    の化合物。
21. 【請求項２１】 Ｂｘが、アデニン、２−アミノアデニン又はグアニンであ
    る、請求項４に記載の化合物。
22. 【請求項２２】 Ｂｘがピリミジンの複素環塩基であり、ＬがＢｘのＣ５に
    共有結合している、請求項４に記載の化合物。
23. 【請求項２３】 Ｂｘがピリミジンの複素環塩基であり、ＬがＢｘのＣ４に
    共有結合している、請求項４に記載の化合物。
24. 【請求項２４】 Ｂｘがプリンの複素環塩基であり、ＬがＢｘのＮ２に共有
    結合している、請求項４に記載の化合物。
25. 【請求項２５】 Ｂｘがプリンの複素環塩基であり、ＬがＢｘのＮ６に共有
    結合している、請求項４に記載の化合物。
26. 【請求項２６】 ヌクレオシド単位を複数含んでなるオリゴマー化合物であ
    って、ヌクレオシド単位が、構造： 【化３】 ［式中： 各々のヌクレオシド単位のＴ₄ は、独立してＢｘ又はＢｘ−Ｌであって、Ｂｘ
    は複素環塩基部分であり； 各々のヌクレオシド単位のＴ₅ 、Ｔ₆ 及びＴ₇ の１つは、独立して、Ｌ、ヒド
    ロキシル、保護されたヒドロキシル、糖置換基、活性化されたリン基、固形支持
    体への結合基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド又はオリゴヌ
    クレオチドであり； 各々のヌクレオシド単位のＴ₅ 、Ｔ₆ 及びＴ₇ のもう１つは、独立して、ヌク
    レオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドであり； 各々のヌクレオシド単位のＴ₅ 、Ｔ₆ 及びＴ₇ の残る１つは、独立して、Ｌ、
    水素、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル又は糖置換基である。 但し、前記ヌクレオシド単位の少なくとも１つで、Ｔ₄ がＢｘ−Ｌであるか、
    又はＴ₅ 、Ｔ₆ 及びＴ₇ の少なくとも１つがＬであり； 前記Ｌ基は、式： 【化４】 ｛式中： ｍ及びｍｍは、それぞれ独立して１〜１０であり； ｙは、１〜１０であり； Ｅは、Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）又はＮ＝Ｃ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）であり； Ｒ₁ 及びＲ₂ は、それぞれ独立して、Ｈ、窒素保護基、置換又は未置換Ｃ₁ 〜
    Ｃ₁₀アルキル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ₁₀アルケニル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ ₁₀ アルキニルであって、前記置換基が、ＯＲ₃ 、ＳＲ₃ 、ＮＨ₃ + 、Ｎ（Ｒ₃ )(
    Ｒ₄ ）、グアニジノ又はアシルであり、前記アシルが、酸、アミド又はエステル
    であるか； 又は、Ｒ₁ 及びＲ₂ は、一緒になって、窒素保護基となるか、又はＮ及びＯか
    ら選択される追加のへテロ原子を場合により包含する環構造になり；そして、 Ｒ₃ 及びＲ₄ は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基で
    あるか、又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は、一緒になって、窒素保護基となるか、又は、Ｒ ₃ 及びＲ₄ は、結合して、Ｎ及びＯから選択される追加のへテロ原子を場合によ
    り包含する環構造になる。｝のうちの一方を有する。］ であるオリゴマー化合物。
27. 【請求項２７】 Ｔ₅ 、Ｔ₆ 及びＴ₇ の少なくとも１つがＬである、請求項
    ２６に記載のオリゴマー化合物。
28. 【請求項２８】 少なくとも１つのＴ₃ がＬである、請求項２６に記載のオ
    リゴマー化合物。
29. 【請求項２９】 少なくとも１つのＴ₄ がＢｘ−Ｌである、請求項２６に記
    載のオリゴマー化合物。
30. 【請求項３０】 前記ヌクレオシド単位の１つのＬが、−Ｏ−（ＣＨ₂)₂ −
    Ｏ−Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）である、請求項２６に記載のオリゴマー化合物。
31. 【請求項３１】 Ｒ₁ が、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、又は置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀ア
    ルキルであり、Ｒ₂ が置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである、請求項２６に記載のオリ
    ゴマー化合物。
32. 【請求項３２】 Ｒ₁ が、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである、請求項３１に記載の
    オリゴマー化合物。
33. 【請求項３３】 Ｒ₂ が、ＮＨ₃ + 又はＮ（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀ア
    ルキルである、請求項３１に記載のオリゴマー化合物。
34. 【請求項３４】 Ｒ₁ 及びＲ₂ が、いずれも置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである
    、請求項３１に記載のオリゴマー化合物。
35. 【請求項３５】 置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル上の置換基が、独立してＮＨ₃ +
    又はＮ（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）である、請求項３４に記載のオリゴマー化合物。
36. 【請求項３６】 Ｂｘが、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、ウラシル
    、チミン、シトシン、２−アミノアデニン又は５−メチルシトシンである、請求
    項２６に記載のオリゴマー化合物。
37. 【請求項３７】 Ｒ₁ 及びＲ₂ が、結合して、Ｎ及びＯから選択される少な
    くとも１つのへテロ原子を包含し得る環構造になる、請求項２６に記載のオリゴ
    マー化合物。
38. 【請求項３８】 前記環構造が、イミダゾール、ピペリジン、モルホリン又
    は置換ピペラジンである、請求項３７に記載のオリゴマー化合物。
39. 【請求項３９】 前記置換ピぺラジンが、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₂アルキルで置換されて
    いる、請求項３８に記載のオリゴマー化合物。
40. 【請求項４０】 Ｔ₁ が保護されたヒドロキシルである、請求項２６に記載
    のオリゴマー化合物。
41. 【請求項４１】 Ｔ₂ が活性化されたリン基であるか又は固形支持体への結
    合基である、請求項２６に記載のオリゴマー化合物。
42. 【請求項４２】 前記固形支持体物質がミクロ粒子である、請求項４１に記
    載のオリゴマー化合物。
43. 【請求項４３】 前記固形支持体物質がＣＰＧである、請求項４１に記載の
    オリゴマー化合物。
44. 【請求項４４】 ＬがＢｘの環外アミノ官能基に結合している、請求項２９
    に記載のオリゴマー化合物。
45. 【請求項４５】 ＬがＢｘの環員炭素原子に結合している、請求項２９に記
    載のオリゴマー化合物。
46. 【請求項４６】 Ｂｘが、アデニン、２−アミノアデニン又はグアニンであ
    る、請求項２９に記載のオリゴマー化合物。
47. 【請求項４７】 Ｂｘがピリミジン複素環塩基であり、ＬがＢｘのＣ５に共
    有結合している、請求項２９に記載のオリゴマー化合物。
48. 【請求項４８】 Ｂｘがピリミジン複素環塩基であり、ＬがＢｘのＣ４に共
    有結合している、請求項２９に記載のオリゴマー化合物。
49. 【請求項４９】 Ｂｘがプリン複素環塩基であり、ＬがＢｘのＮ２に共有結
    合している、請求項２９に記載のオリゴマー化合物。
50. 【請求項５０】 Ｂｘがプリン複素環塩基であり、ＬがＢｘのＮ６に共有結
    合している、請求項２９に記載のオリゴマー化合物。
51. 【請求項５１】 ５〜５０個のヌクレオシド単位を有する、請求項２６に記
    載のオリゴマー化合物。
52. 【請求項５２】 ８〜３０個のヌクレオシド単位を有する、請求項２６に記
    載のオリゴマー化合物。
53. 【請求項５３】 １５〜２５個のヌクレオシド単位を有する、請求項２６に
    記載のオリゴマー化合物。
54. 【請求項５４】 連結したヌクレオシド単位の配列を含んでなる、ＤＮＡ又
    はＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なオリゴマー化合物であって： 前記配列が、連結したヌクレオシド単位を有する第一の領域と２' −デオキシ
    糖部分を有する連結したヌクレオシド単位から構成される第二の領域に分けられ
    ； 前記第一又は第二の領域の少なくとも１つの前記連結したヌクレオシド単位が
    ホスホロチオエート連結により結合され； 前記第一の領域の前記連結したヌクレオシド単位の少なくとも１つが、複素環
    塩基か又は糖部分の２' 、３' 又は５' 位に共有結合しているＬ基を有し； 前記Ｌ基が、式： 【化５】 ［式中： ｍ及びｍｍは、それぞれ独立して１〜１０であり； ｙは、１〜１０であり； Ｅは、Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）又はＮ＝Ｃ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）であり； Ｒ₁ 及びＲ₂ は、それぞれ独立して、Ｈ、窒素保護基、置換又は未置換Ｃ₁ 〜
    Ｃ₁₀アルキル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ₁₀アルケニル、置換又は未置換Ｃ₂ 〜Ｃ ₁₀ アルキニルであって、前記置換基が、ＯＲ₃ 、ＳＲ₃ 、ＮＨ₃ + 、Ｎ（Ｒ₃ )(
    Ｒ₄ ）、グアニジノ又はアシルであり、前記アシルが、酸、アミド又はエステル
    であるか； 又は、Ｒ₁ 及びＲ₂ は、一緒になって、窒素保護基となるか、又はＮ及びＯか
    ら選択される追加のへテロ原子を場合により包含する環構造になり；そして、 Ｒ₃ 及びＲ₄ は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、窒素保護基で
    あるか、又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は、一緒になって、窒素保護基となるか； 又は、Ｒ₃ 及びＲ₄ は、結合して、Ｎ及びＯから選択される追加のへテロ原子
    を場合により包含する環構造になる。］の一方を有する オリゴマー化合物。
55. 【請求項５５】 前記第一及び第二の領域の前記ヌクレオシド単位が、ホ
    スホロチオエートのヌクレオシド間連結により結合している、請求項５４に記載
    のオリゴマー化合物。
56. 【請求項５６】 前記第一の領域の前記ヌクレオシド単位が、ホスホジエス
    テルのヌクレオシド間連結により結合し、前記第二の領域の前記ヌクレオシド単
    位が、ホスホロチオエートのヌクレオシド間連結により結合している、請求項５
    ４に記載のオリゴマー化合物。
57. 【請求項５７】 前記第一の領域の前記ヌクレオシド単位が、ホスホロチオ
    エートのヌクレオシド間連結により結合し、前記第二の領域の前記ヌクレオシド
    単位が、ホスホジエステルのヌクレオシド間連結により結合している、請求項５
    ４に記載のオリゴマー化合物。
58. 【請求項５８】 前記第二の領域が少なくとも３個のヌクレオシド単位を有
    する、請求項５４に記載のオリゴマー化合物。
59. 【請求項５９】 前記第二の領域が少なくとも５個のヌクレオシド単位を有
    する、請求項５４に記載のオリゴマー化合物。
60. 【請求項６０】 ５〜５０個のヌクレオシド単位を有する、請求項５４に記
    載のオリゴマー化合物。
61. 【請求項６１】 ８〜３０個のヌクレオシド単位を有する、請求項５４に記
    載のオリゴマー化合物。
62. 【請求項６２】 １５〜２５個のヌクレオシド単位を有する、請求項５４に
    記載のオリゴマー化合物。
63. 【請求項６３】 前記第一の領域の前記連結したヌクレオシドの少なくとも
    １つが、複素環塩基に共有結合した前記Ｌ基を有する、請求項５４に記載のオリ
    ゴマー化合物。
64. 【請求項６４】 前記第一の領域の前記連結したヌクレオシドの少なくとも
    １つが、糖部分の２' 、３' 又は５' 位に共有結合した前記Ｌ基を有する、請求
    項５４に記載のオリゴマー化合物。
65. 【請求項６５】 前記Ｌ基が、糖部分の２' 位に共有結合している、請求項
    ６４に記載のオリゴマー化合物。
66. 【請求項６６】 Ｌが、−Ｏ−（ＣＨ₂)₂ −Ｏ−Ｎ（Ｒ₁ )(Ｒ₂ ）である、
    請求項５４に記載のオリゴマー化合物。
67. 【請求項６７】 Ｒ₁ が、Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、又は置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀ア
    ルキルであり、Ｒ₂ が置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである、請求項５４に記載のオリ
    ゴマー化合物。
68. 【請求項６８】 Ｒ₁ がＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである、請求項６７に記載のオ
    リゴマー化合物。
69. 【請求項６９】 Ｒ₂ が、ＮＨ₃ + 又はＮ（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀ア
    ルキルである、請求項６７に記載のオリゴマー化合物。
70. 【請求項７０】 Ｒ₁ 及びＲ₂ が、いずれも置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである
    、請求項６７に記載のオリゴマー化合物。
71. 【請求項７１】 置換Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル上の置換基が、独立してＮＨ₃ +
    又はＮ（Ｒ₃ )(Ｒ₄ ）である、請求項７０に記載のオリゴマー化合物。
72. 【請求項７２】 Ｂｘが、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、ウラシル
    、チミン、シトシン、２−アミノアデニン又は５−メチルシトシンである、請求
    項５４に記載のオリゴマー化合物。
73. 【請求項７３】 Ｒ₁ 及びＲ₂ が、結合して、Ｎ及びＯから選択される少な
    くとも１つのへテロ原子を包含し得る環構造になる、請求項５４に記載のオリゴ
    マー化合物。
74. 【請求項７４】 前記環構造が、イミダゾール、ピペリジン、モルホリン又
    は置換ピペラジンである、請求項７３に記載のオリゴマー化合物。
75. 【請求項７５】 前記置換ピぺラジンがＣ₁ 〜Ｃ₁₂アルキルで置換されてい
    る、請求項７４に記載のオリゴマー化合物。
76. 【請求項７６】 Ｌが、複素環塩基の環外アミノ官能基に結合している、請
    求項６３に記載のオリゴマー化合物。
77. 【請求項７７】 Ｌが複素環塩基の環員炭素原子に結合している、請求項６
    ３に記載のオリゴマー化合物。
78. 【請求項７８】 複素環塩基が、アデニン、２−アミノアデニン又はグアニ
    ンである、請求項６３に記載のオリゴマー化合物。
79. 【請求項７９】 複素環塩基がピリミジンであり、Ｌが前記ピリミジンのＣ
    ５に共有結合している、請求項６３に記載のオリゴマー化合物。
80. 【請求項８０】 複素環塩基がピリミジンであり、Ｌが前記ピリミジンのＣ
    ４に共有結合している、請求項６３に記載のオリゴマー化合物。
81. 【請求項８１】 複素環塩基がプリンであり、Ｌが前記プリンのＮ２に共有
    結合している、請求項６３に記載のオリゴマー化合物。
82. 【請求項８２】 複素環塩基がプリンであり、Ｌが前記プリンのＮ６に共有
    結合している、請求項６３に記載のオリゴマー化合物。
83. 【請求項８３】 第三の領域を有する、請求項５４に記載のオリゴマー化合
    物であって、前記第三の領域は２' −Ｏ−アルキルヌクレオシド単位を有し、前
    記アルキル基は置換され、前記第二の領域は前記第一及び第三の領域の間に位置
    する、前記オリゴマー化合物。
84. 【請求項８４】 前記第一、第二及び第三の領域の前記ヌクレオシド単位が
    ホスホロチオエート連結により結合している、請求項８３に記載のオリゴマー化
    合物。
85. 【請求項８５】 前記第一及び第三の領域の前記ヌクレオシド単位が、ホス
    ホジエステル連結により結合し、前記第二の領域の前記ヌクレオシド単位が、ホ
    スホロチオエート連結により結合している、請求項８３に記載のオリゴマー化合
    物。
86. 【請求項８６】 前記第一及び第三の領域の前記ヌクレオシド単位が、ホス
    ホロチオエート連結により結合し、前記第二の領域の前記ヌクレオシド単位が、
    ホスホジエステル連結により結合している、請求項８３に記載のオリゴマー化合
    物。
87. 【請求項８７】 前記第二の領域が少なくとも３個のヌクレオシド単位を有
    する、請求項８３に記載のオリゴマー化合物。
88. 【請求項８８】 前記第二の領域が少なくとも５個のヌクレオシド単位を有
    する、請求項８３に記載のオリゴマー化合物。
89. 【請求項８９】 前記第三の領域の前記２' −Ｏ−アルキルヌクレオシド単
    位の少なくとも１が、前記式のうちの１を有する２' −アミノオキシ基を有して
    いる、請求項８３に記載のオリゴマー化合物。