JP2002543215A - Ａ−ｄｎａ型およびｂ−ｄｎａ型立体配座幾何学形状を有するオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ａ型立体配座幾何学形状およびＢ型立体配座幾何学形状両方のオリゴヌクレオチドを含有する修飾オリゴヌクレオチドを開示する。Ｂ型幾何学形状は、標的核酸鎖に結合した場合、該オリゴヌクレオチドをＲＮアーゼＨの基質として役立たせる。Ａ型幾何学形状は、結合親和性およびヌクレアーゼ耐性を調節する性質をオリゴヌクレオチドに与える。Ｃ２’エンド糖またはＯ４’エンド糖を利用することにより、Ｂ型特性をオリゴヌクレオチドの一部分に与える。３’エンド幾何学形状を有する２’−Ｏ−修飾ヌクレオチドの使用かまたは特定のヌクレアーゼ安定性を有する末端キャップの使用によって、またはこれら両方を互いに一緒に用いることによって、Ａ型特性を与える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、Ａ型およびＢ型両方の立体配座幾何学形状を有するオリゴヌクレオ
チドおよびこのようなオリゴヌクレオチドを使用する方法に関する。本発明のオ
リゴヌクレオチドは、治療および研究の目的に有用である。より具体的には、本
発明は、親和性およびヌクレアーゼ耐性を増加させる特別な修飾を有すると同時
に、標的ＲＮＡ鎖に結合した場合にＲＮアーゼＨの基質として役立つオリゴヌク
レオチドに関する。

【０００２】 発明の背景 大部分の疾患状態を含めた哺乳動物の身体状態の大部分は、タンパク質によっ
て影響されるということは周知である。古典的な治療方式は、概して、それら疾
患を引き起こすまたは疾患を悪化させる機能を緩和する努力において、このよう
なタンパク質との相互作用に焦点を合わせている。しかしながら、最近は、この
ようなタンパク質の実際の生産を、それらの合成を支配する細胞内ＲＮＡのよう
な分子との相互作用によって緩和する試みが成されている。タンパク質の生産を
妨げることにより、最大限の治療効果および最小限の副作用が実現するかもしれ
ない。望ましくないタンパク質形成をもたらす遺伝子発現を妨げるまたはそれ以
外の場合は調節することは、このような治療的アプローチの一般的な目的である
。

【０００３】 特定の遺伝子発現を阻害する一つの方法は、オリゴヌクレオチドの使用である
。オリゴヌクレオチドは、現在、治療薬として認められている。最初のこのよう
なオリゴヌクレオチドは、ヒト治療使用についてＦＤＡによって認可されており
、販売市場で入手可能である。

【０００４】 オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子にハイブリッド形成す
ることが知られている。ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドの核塩
基の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の核塩基への配列特異的塩基対水素結合である
。このような核塩基対は、互いに相補的であるといわれる。アンチセンス阻害と
しても知られる、標的ＲＮＡ配列へのオリゴヌクレオチドの配列特異的結合の使
用によって遺伝子発現を阻害する概念は、生細胞を含めたいろいろな系において
証明されている（例えば、Wagner et al., Science (1993) 260:1510-1513; Mil
ligan et al., J.Med.Chem., (1993) 36:1923-37; Uhlmann et al., Chem.Revie
ws, (1990) 90:543-584; Stein et al., Cancer Res., (1988) 48:2659-2668 を
参照されたい）。

【０００５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドによって核酸機能を破壊する場合（Cohen in
Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, (1989) CRC P
ress,Inc., Boca Raton, ＦＬ）には、二つの種類があると考えられる。第一の
ハイブリダイゼーション阻止は、オリゴヌクレオチド阻害物質が標的核酸に結合
し、それによって、単純な立体障害により、必須タンパク質、たいていはリボソ
ームの核酸への結合を妨げる終結である。メチルホスホネートオリゴヌクレオチ
ド：Miller,P.S. and Ts'O,P.O.P. (1987) Anti-Cancer Drug Design, 2:117-12
8 およびα−アノマーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション阻止によ
って核酸機能を破壊すると考えられる二つの最も充分に研究されたアンチセンス
物質である。

【０００６】 アンチセンスオリゴヌクレオチドについての第二の種類の終結には、細胞内Ｒ
ＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの酵素的切断が含まれる。２’−デオキシリボフラ
ノシルオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、標的ＲＮＡとハ
イブリッド形成し、そしてこの二重らせんは、ＲＮアーゼＨ酵素を活性化させて
ＲＮＡ鎖を切断し、それによってＲＮＡの正常な機能を破壊する。ホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドは、おそらくは、この種類のアンチセンス終結によっ
て作用するアンチセンス物質の最も顕著な例である。

【０００７】 オリゴヌクレオチドは、フーグスティーン型塩基対による配列特異的方法で、
二重らせん核酸に結合して三重らせん複合体を形成することもできる（Beal et
al., Science, (1991) 251:1360-1363; Young et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (1
991) 88:10023-10026）。アンチセンスおよび三重らせん両方の治療計画は、疾
患状態を決定するまたは維持することに関与するまたはその原因となる核酸配列
に対して向けられる。このような標的核酸配列は、細菌、酵母、真菌、原生動物
、寄生体、ウイルスを含めた病原性微生物のゲノム中で見出されうるし、または
天然において内因性であってよい。疾患状態の決定、維持または離脱に重要な遺
伝子にハイブリッド形成させることおよびその発現を修飾することにより、該当
する状態を、治癒させる、予防するまたは改善することができる。

【０００８】 オリゴヌクレオチドの相補的核酸へのハイブリダイゼーションの程度を決定す
る場合、相補的核酸に結合するオリゴヌクレオチドの相対能力は、具体的なハイ
ブリダイゼーション複合体の融解温度を決定することによって比較することがで
きる。二重らせんの特徴的な物理的性質である融解温度（Ｔ_m）は、５０％のヘ
リックス（ハイブリッド形成）型対コイル（非ハイブリッド形成）型が存在する
温度である。Ｔ_mは、ＵＶスペクトルを用いて測定されて、ハイブリダイゼーシ
ョン複合体の形成および分解（融解）を決定する。ハイブリダイゼーション中に
起こる塩基の積み重なりは、ＵＶ吸収の減少（淡色性）を伴う。結果として、Ｕ
Ｖ吸収の減少は、より高いＴ_mを示す。Ｔ_mが高いほど、鎖間結合の強さは大きい
。

【０００９】 オリゴヌクレオチドは、それらが細胞内または細胞外ポリペプチド、タンパク
質または酵素のような非核酸生体分子に結合する場合、治療的価値を有すること
もありうる。このようなオリゴヌクレオチドは、しばしば、‘アプタマー（apta
mers）’と称され、それらは、典型的には、タンパク質標的に結合し且つその機
能を妨げる（Griffin, et al., Blood, (1993),81:3271-3276; Bock, et al., N
ature,(1992) 355:564-566）。

【００１０】 オリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体は、診断目的、治療用途におよび研
究用試薬として開発され且つ用いられてきている。治療薬としての使用には、オ
リゴヌクレオチドは、細胞膜を越えて輸送されるまたは細胞によって吸収される
必要があるし、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに適当にハイブリッド形成する必要があ
る。これら臨界的機能は、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの初期
安定性に依存する。治療目的に関する標的ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイ
ゼーション可能性に影響を与える未修飾オリゴヌクレオチドの重大な欠陥は、ヌ
クレアーゼと称されるいろいろな細胞内および細胞外に存在する核酸分解酵素に
よる、投与されたオリゴヌクレオチドの酵素的分解である。オリゴヌクレオチド
が治療薬または診断薬として有用であるためには、それらオリゴヌクレオチドは
、相補的標的核酸への増加した結合親和性を示すべきであり、好ましくは、ヌク
レアーゼにかなり安定であり且つ分解に耐えるべきである。研究用試薬のような
非細胞使用には、オリゴヌクレオチドは、必ずしもヌクレアーゼ安定性を有する
必要がない。

【００１１】 多数の化学修飾は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合親和性を増加させ且つヌ
クレアーゼ分解に耐えるようにオリゴヌクレオチド中に導入されている。 修飾は、ヌクレアーゼへの耐性を増加させるように、リボースリン酸基主鎖に
行われている。これら修飾には、メチルホスホネート、ホスホロチオエートおよ
びホスホロジチオエートのような結合の使用、および２’−Ｏ−アルキルリボー
スのような修飾糖残基の使用が含まれる。他のオリゴヌクレオチド修飾には、吸
収および細胞内分布を調節するように行われるものが含まれる。ヌクレオチド間
結合の性状を劇的に変化させる多数の修飾は、文献中にも報告されている。これ
らには、非リン結合、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および２’−５’結合が含まれる
。オリゴヌクレオチドへのもう一つの修飾は、通常は、診断および研究用途のた
めに、非同位体標識、例えば、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ア
ルカリ性ホスファターゼ、または他のリポーター分子を用いて標識されている。

【００１２】 いろいろな修飾リン含有結合は、オリゴヌクレオチド中の天然の容易に切断さ
れるホスホジエステル結合に関する置換として研究されてきている。概して、そ
れらの大部分（ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホネートおよび
ホスホロジチオエートなど）は、相補的標的への減少した結合および低下したハ
イブリッド安定性を有するオリゴヌクレオチドを生じる。現在、いろいろな疾患
状態の治療に関するヒト臨床試験において、少なくとも１ダースのホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドおよび誘導体が、アンチセンス物質として用いられて
いる。ヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）網膜炎を治療するのに用いるため
のアンチセンス薬 Vitravine^TMは、監査機関によって認可されており、市販され
ている。

【００１３】 化学修飾された核酸の構造および安定性は、アンチセンスオリゴヌクレオチド
の設計に極めて重要である。この１０年間にわたって、ヌクレアーゼ耐性を増加
させるために、またはアンチセンス鎖のその標的ｍＲＮＡへの親和性を増加させ
るために、いろいろな合成修飾が考えられてきている（Crooke et al., Med.Res
.Rev., 1996,16,319-344; De Mesmaeker et al., Acc.Chem.Res., 1995,28,366-
374）。

【００１４】 ＲＮＡは、“Ａ型”と称されてきた幾何学形状で存在するが、ＤＮＡは“Ｂ型
”幾何学形状で存在する。概して、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重らせんは、ＤＮＡ：ＤＮ
Ａ二重らせんより安定である、またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する（Sang
er et al., Principles of Nucleic Acid Structure, 1984, Springer-Verlag;
New York, ＮＹ．；Lesnik et al., Biochemistry, 1995,34,10807-10815; Cont
e et al., Nucleic Acids Res., 1997,25,2627-2634）。増加したＲＮＡの安定
性は、いくつかの構造上の特徴、特に、Ａ型幾何学形状によって生じる改善され
た塩基の積み重なり相互作用に起因している（Searle et al., Nucleic Acids R
es., 1993,21,2051-2056）。ＲＮＡ中の２’−ペントフラノシル（すなわち、２
’−糖）位置でのヒドロキシル基の存在は、Ｃ３’エンドパッカー（ノーザンパ
ッカーとしても知られる）の方へ糖を偏らせると考えられ、これは、二重らせん
をＡ型幾何学形状が好都合であるようにさせる。もう一方において、２’−デオ
キシ核酸（２’−デオキシエリトロペントフラノシルヌクレオチドを有するもの
）は、Ｃ２’エンドパッカー（サザンパッカーとしても知られる）の方を選択し
、これは、あまり安定性でないＢ型幾何学形状を与えると考えられる（Sanger,W
. (1984) Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, New York
, ＮＹ）。更に、ＲＮＡの２’ヒドロキシル基は、ＲＮＡ二重らせんを安定化さ
せる水に媒介される水素結合のネットワークを形成することができる（Egli et
al., Biochemistry, 1996,35,8489-8494）。

【００１５】 ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二重らせんは、通常は、純粋なＲＮＡ：ＲＮＡ二
重らせんより安定性が小さいが、それらの配列によっては、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重
らせんより安定性が大きいかまたは小さいことがありうる（Searle et al., Nuc
leic Acids Res., 1993,21,2051-2056）。ハイブリッド二重らせんの構造は、Ａ
型幾何学形状とＢ型幾何学形状との中間であり、これは、不充分な積み重なり相
互作用を生じることがありうる（Lane et al., Eur.J.Biochem., 1993,215,297-
306; Fedoroff et al., J.Mol.Biol., 1993,233,509-523; Gonzalez et al., Bi
ochemistry, 1995,34,4969-4982; Horton et al., J.Mol.Biol., 1996,264,521-
533）。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの安定性は、その機構が、修飾ＤＮＡ鎖の
ｍＲＮＡ鎖への結合を必要とするので、アンチセンス療法への中心となる。ｍＲ
ＮＡを有効に阻害するためには、アンチセンスＤＮＡは、ｍＲＮＡとの極めて高
い結合親和性を有するべきである。それ以外の場合、ＤＮＡと標的ｍＲＮＡ鎖と
の間の所望の相互作用は、まれにしか生じないであろうし、したがって、アンチ
センスオリゴヌクレオチドの効力が低下するであろう。

【００１６】 増加したヌクレアーゼ耐性およびヌクレオチドへの極めて高い結合親和性を与
える一つの合成２’−修飾は、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ，２’−ＯＣＨ ₂ ＣＨ₂ＯＣＨ₃）側鎖である（Baker et al., J.Biol.Chem., 1997,272,11944-12
000; Freier et al., Nucleic Acids Res., 1997,25,4429-4443）。ＭＯＥ置換
の直接の利点の一つは、結合親和性の改善であり、これは、Ｏ−メチル、Ｏ−プ
ロピルおよびＯ−アミノプロピルのような多数の同様の２’修飾より大きい（Fr
eier and Altmann, Nucleic Acids Research, (1997) 25:4429-4443）。２’−
Ｏ−メトキシエチル置換化合物も、in vivo 使用に関する有望な特徴を有する遺
伝子発現のアンチセンス阻害物質であることが示されている（Martin,P., Helv.
Chim.Acta, 1995,78,486-504; Altmann et al., Chimia, 1996,50,168-176; Alt
mann et al., Biochem.Soc.Trans., 1996,24,630-637; および Altmann et al.,
Nucleosides Nucleotides, 1997,16,917-926）。このような化合物は、典型的
に、改善されたＲＮＡ親和性およびＤＮＡに相対して高いヌクレアーゼ耐性を示
す。２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオシドウイングおよび中心のＤＮＡ−
ホスホロチオエートウインドーを含むキメラオリゴヌクレオチドも、動物モデル
における腫瘍の成長を低用量で有効に減少させることが示されている。ＭＯＥ置
換オリゴヌクレオチドは、いくつかの疾患状態におけるアンチセンス物質として
の顕著な将来性を示している。一つのこのようなＭＯＥ置換オリゴヌクレオチド
は、現在、ＣＭＶ網膜炎の治療に関する臨床試験で研究されている。

【００１７】 最近、Damha et al. は、アラビノペントフラノシルヌクレオチドをビルディ
ングブロックとして利用した若干のオリゴヌクレオチドを記載した二つの論文を
公表した（Dahma et al., J.A.C.S., 1998,120,12976-12977 および Dahma et a
l., Bioconjugate Chem., 1999,10,299-305）。Damha et al. によって記載され
たアラビノペントフラノシルヌクレオチド、すなわち、アラビノ核酸は、それぞ
れのヌクレオチドの糖単位として、アラビノースかまたは２’−デオキシ−２’
−フルオロアラビノースを利用した。記載された２種類のアラビノ核酸の一方に
おいて、核酸のヌクレオチドは全てアラビノースであり、もう一方において、ヌ
クレオチドは全て２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノースであった。これ
ら核酸のどちらにおいても、ヌクレオチドはホスホジエステル結合によって結合
していた。これら著者らは、２’−フルオロアラビノ含有オリゴヌクレオチドが
、ＲＮＡに結合した場合、大腸菌およびＨＩＶ−ＲＴ ＲＮアーゼＨによるＲＮ
Ａの切断を活性化したということを示すことができた。この著者らは、更に、彼
らが記載した２種類のアラビノ核酸は、血清および細胞のヌクレアーゼにＤＮＡ
より安定していたが、それらは、正常なホスホロチオエートデオキシオリゴヌク
レオチドより安定性が小さいということに注目した。

【００１８】 オリゴヌクレオチドへの既知の修飾は、診断薬、治療薬中および研究用試薬と
しての使用を含めたいろいろな用途のためのオリゴヌクレオチドの開発に寄与し
ているが、当該技術分野においては、増加したハイブリッド結合親和性および／
または増加したヌクレアーゼ耐性を有する、およびＲＮアーゼＨ終結機序に利用
することができる更に別のオリゴヌクレオチドがなお要求されている。

【００１９】 発明の要旨 一つの側面において、本発明は、多数の性状を有するオリゴヌクレオチドに関
する。これら性状の一つは、ＲＮＡと一緒に二本鎖構造を形成し且つＲＮＡのＲ
ＮアーゼＨ切断を引き起こす能力である。オリゴヌクレオチドの更に別の性状に
は、改善された結合親和性およびヌクレアーゼ耐性を有することが含まれる。本
発明のオリゴヌクレオチドは、複数のヌクレオチドから形成されるオリゴヌクレ
オチドを含む。それらヌクレオチドの第一部分は、他のヌクレオチドと連続配列
中で結合した場合、Ｂ型立体配座幾何学形状を有するヌクレオチドとして選択さ
れるこの部分のそれぞれのヌクレオチドと連続配列中で互いに結合している。ヌ
クレオチドのこの第一部分に含まれるのは、リボヌクレオチドまたはアラビノヌ
クレオチドである。それらオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの連続配列中
で互いに結合している追加部分のヌクレオチドを含む。これら追加のヌクレオチ
ドはそれぞれ、連続配列中で結合した場合にＡ型立体配座幾何学形状を有するリ
ボヌクレオチドとして選択される。

【００２０】 本発明の好ましい態様において、ヌクレオチドの第一部分のヌクレオチドは、
それぞれ独立して、２’−ＳＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−ＮＨ₂リボヌクレオ
チド、２’−ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）リボヌクレオチド、２’−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₂ アルキル）₂リボヌクレオチド、２’−ＣＦ₃リボヌクレオチド、２’＝ＣＨ₂リ
ボヌクレオチド、２’＝ＣＨＦリボヌクレオチド、２’＝ＣＦ₂リボヌクレオチ
ド、２’−ＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−Ｃ₂Ｈ₅リボヌクレオチド、２’−Ｃ
Ｈ＝ＣＨ₂リボヌクレオチドまたは２’−Ｃ≡ＣＨリボヌクレオチドであるよう
に選択される。これらは、リン酸結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチ
オエート結合またはボラノホスフェート結合によって連続配列中で互いに結合し
ている。

【００２１】 本発明の更に好ましい態様において、ヌクレオチドの第一部分のヌクレオチド
は、それぞれ独立して、２’−フルオロヌクレオチド、または式ＩまたはII

【００２２】

【化２】

【００２３】 （式中、Ｅは、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、Ｎ（Ｑ₁）（Ｑ₂）またはＮ＝Ｃ（Ｑ₁）（Ｑ ₂ ）であり； Ｑ₁およびＱ₂は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、ジアルキルア
ミノアルキル、窒素保護基、束縛されたまたは束縛されていない結合基、固体支
持体へのリンカーであり、または Ｑ₁およびＱ₂は、一緒になって、窒素保護基中、またはＮおよびＯより選択さ
れる少なくとも１個の追加のヘテロ原子を含むことができる環構造中で結合して
いて； Ｒ₃は、ＯＸ、ＳＸまたはＮ（Ｘ）₂であり； Ｘは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₈アルキル、Ｃ₁−Ｃ₈ハロアルキル、Ｃ
（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＺまたはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚで
あり； Ｚは、ＨまたはＣ₁−Ｃ₈アルキルであり； Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は、約４〜約７個の炭素原子を有する、または約３〜約６
個の炭素原子および１個または２個のヘテロ原子であって、酸素、窒素および硫
黄より選択されるヘテロ原子を有する環系を含み、そしてここにおいて、その環
系は、脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、または飽和または不飽和の複素環式であ
り； Ｙは、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキルまたはハロアルキル、２〜約
１０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキ
ニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｑ₁）（Ｑ₂）、Ｏ（Ｑ₁
）、ハロ、Ｓ（Ｑ₁）またはＣＮであり； ｑ₁は、それぞれ独立して、２〜１０であり； ｑ₂は、それぞれ独立して、０または１であり； ｍは、０、１または２であり； ｐは、１〜１０であり；そして ｑ₃は、１〜１０であり、但し、ｐが０である場合、ｑ₃は１より大であるとい
う条件付である） を有する２’−置換基を有するヌクレオチドであるように選択される。

【００２４】 ヌクレオチドの追加部分として用いるのにより好ましい基は、２’−Ｆリボヌ
クレオチド、２’−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）リボヌクレオチド、または２’−
Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆置換アルキル）リボヌクレオチドであって、その置換がＣ₁−Ｃ₆ エーテル、Ｃ₁−Ｃ₆チオエーテル、アミノ、アミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）または
アミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）₂であるものである。これらヌクレオチドは、３’
−５’ホスホジエステル結合、２’−５’ホスホジエステル結合、ホスホロチオ
エート結合、Ｓｐホスホロチオエート結合、Ｒｐホスホロチオエート結合、ホス
ホロジチオエート結合、３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデート結合
、３’−メチレンホスホネート結合、メチレン（メチルイミノ）結合、ジメチル
ヒドラジノ結合、アミド３（すなわち、（３’）−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（
５’））結合、アミド４（すなわち、（３’）−ＣＨ₂−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（５
’））結合またはボラノホスフェート結合によって配列中で互いに結合している
。

【００２５】 本発明の一つの好ましい態様において、ヌクレオチドの追加部分の少なくとも
二つのヌクレオチドは、ヌクレオチドの第一部分の連続配列に３’位である連続
配列中で互いに結合している。本発明の更に別の好ましい態様において、ヌクレ
オチドの追加部分の少なくとも二つは、ヌクレオチドの第一部分の連続配列に５
’位である連続配列中で互いに結合している。

【００２６】 本発明の更に好ましい態様において、ヌクレオチドの追加部分の少なくとも二
つのヌクレオチドは、ヌクレオチドの第一部分の連続配列に３’位である連続配
列中で互いに結合していて、ヌクレオチドの追加部分の少なくとも二つは、ヌク
レオチドの第一部分の連続配列に５’位である連続配列中で互いに結合している
。

【００２７】 ヌクレオチドの第一部分として用いるためのヌクレオチドの第一の好ましい群
には、２’−ＳＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−ＮＨ₂リボヌクレオチド、２’−
ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）リボヌクレオチド、２’−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）₂
リボヌクレオチド、２’＝ＣＨ₂リボヌクレオチド、２’−ＣＨ₃リボヌクレオチ
ド、２’−Ｃ₂Ｈ₅リボヌクレオチド、２’−ＣＨ＝ＣＨ₂リボヌクレオチドおよ
び２’−Ｃ≡ＣＨリボヌクレオチドが含まれる。より好ましい群には、２’−Ｓ
ＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−ＮＨ₂リボヌクレオチド、２’−ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₂ アルキル）リボヌクレオチド、２’−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）₂リボヌクレオチ
ドおよび２’−ＣＨ₃リボヌクレオチドが含まれる。更に好ましい群には、２’
−ＳＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−ＮＨ₂リボヌクレオチドおよび２’−ＣＨ₃
リボヌクレオチドが含まれる。特に好ましいのは、２’−ＳＣＨ₃リボヌクレオ
チドである。

【００２８】 本発明のオリゴヌクレオチドの第一部分のヌクレオチドとして用いるのに好適
であるヌクレオチドの更に別の群は、２’−ＣＮアラビノヌクレオチド、２’−
Ｆアラビノヌクレオチド、２’−Ｃｌアラビノヌクレオチド、２’−Ｂｒアラビ
ノヌクレオチド、２’−Ｎ₃アラビノヌクレオチド、２’−ＯＨアラビノヌクレ
オチド、２’−Ｏ−ＣＨ₃アラビノヌクレオチドおよび２’−デヒドロ−２’−
ＣＨ₃アラビノヌクレオチドである。より好ましい群には、２’−Ｆアラビノヌ
クレオチド、２’−ＯＨアラビノヌクレオチドおよび２’−Ｏ−ＣＨ₃アラビノ
ヌクレオチドが含まれる。更に好ましい群には、２’−Ｆアラビノヌクレオチド
および２’−ＯＨアラビノヌクレオチドが含まれる。特に好ましいのは、２’−
Ｆアラビノヌクレオチドである。

【００２９】 本発明の特に好ましいオリゴヌクレオチドには、２’−ＳＣＨ₃リボヌクレオ
チド、２’−ＮＨ₂リボヌクレオチド、２’−ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）リボヌ
クレオチド、２’−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）₂リボヌクレオチド、２’−ＣＨ₃リ
ボヌクレオチド、２’−ＣＨ＝ＣＨ₂リボヌクレオチドまたは２’−Ｃ≡ＣＨリ
ボヌクレオチドであるようにヌクレオチドの第一部分のヌクレオチドを選択する
こと、および２’−Ｆリボヌクレオチド、２’−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）リボ
ヌクレオチド、または２’−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆置換アルキル）リボヌクレオチドで
あって、その置換がＣ₁−Ｃ₆エーテル、Ｃ₁−Ｃ₆チオエーテル、アミノ、アミノ
（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）またはアミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）₂であるものであるよ
うにヌクレオチドの追加部分のヌクレオチドを選択することが含まれる。

【００３０】 本発明の更に好ましいオリゴヌクレオチドには、２’−ＣＮアラビノヌクレオ
チド、２’−Ｆアラビノヌクレオチド、２’−Ｃｌアラビノヌクレオチド、２’
−Ｂｒアラビノヌクレオチド、２’−Ｎ₃アラビノヌクレオチド、２’−ＯＨア
ラビノヌクレオチド、２’−Ｏ−ＣＨ₃アラビノヌクレオチドまたは２’−デヒ
ドロ−２’−ＣＨ₃アラビノヌクレオチドであるようにヌクレオチドの第一部分
のヌクレオチドを選択すること、および２’−Ｆリボヌクレオチド、２’−Ｏ−
（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）リボヌクレオチド、または２’−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆置換アル
キル）リボヌクレオチドであって、その置換がＣ₁−Ｃ₆エーテル、Ｃ₁−Ｃ₆チオ
エーテル、アミノ、アミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）またはアミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキ
ル）₂であるものであるようにヌクレオチドの追加部分のヌクレオチドを選択す
ることが含まれる。

【００３１】 特に好ましいのは、ヌクレオチドの第一部分のヌクレオチドがそれぞれ、２’
−Ｆアラビノヌクレオチドまたは２’−ＯＨアラビノヌクレオチドであり、そし
てヌクレオチドの追加部分のヌクレオチドがそれぞれ、２’−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆置
換アルキル）リボヌクレオチドであって、その置換がＣ₁−Ｃ₆エーテル、Ｃ₁−
Ｃ₆チオエーテル、アミノ、アミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）またはアミノ（Ｃ₁−Ｃ ₆ アルキル）₂であるものである本発明のオリゴヌクレオチドである。

【００３２】 本発明の更に好ましいオリゴヌクレオチドにおいて、複数のヌクレオチドの追
加部分は、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する連続配列中で互いに結合し
た少なくとも二つのヌクレオチドを含む。本発明の更に別の好ましいオリゴヌク
レオチドにおいて、複数のヌクレオチドの追加部分は、オリゴヌクレオチドの５
’末端に位置する連続配列中で互いに結合した少なくとも二つのヌクレオチドを
含む。本発明のなお更に好ましいオリゴヌクレオチドにおいて、複数のヌクレオ
チドの追加部分は、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する連続配列中で互い
に結合した少なくとも二つのヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドの５’末
端に位置する連続配列中で互いに結合した少なくとも二つのヌクレオチドを含む
。本発明のオリゴヌクレオチド中のこれらヌクレオチドを互いに結合するのに好
ましい結合には、２’−５’ホスホジエステル結合、３’−メチレンホスホネー
ト結合、Ｓｐホスホロチオエート結合、メチレン（メチルイミノ）結合、ジメチ
ルヒドラジノ結合、３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデート結合、ア
ミド３結合またはアミド４結合が含まれる。特に好ましい結合は、２’−５’ホ
スホジエステル結合、３’−メチレンホスホネート結合、Ｓｐホスホロチオエー
ト結合またはメチレン（メチルイミノ）結合である。

【００３３】 本発明の更に好ましいオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオチドの追加部分
で用いるためのヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端また
は３’および５’両末端に位置する２’−アルキルアミノ置換ヌクレオチドを含
む。特に好ましいのは、２’−Ｏ−エチルアミンおよび２’−Ｏ−プロピルアミ
ンのような２’−Ｏ−アルキルアミンである。

【００３４】 本発明の更に別のオリゴヌクレオチドは、複数の結合したヌクレオチドの内の
少なくとも二つが、２’−デオキシエリスロペントフラノシルヌクレオチドでは
ない、Ｃ２’エンド型パッカーまたはＯ４’エンド型パッカーを有する、そして
連続配列中で互いに結合しているヌクレオチドを含む複数の結合したヌクレオチ
ド、およびＣ３’エンド型パッカーを有するヌクレオチドを含む他のヌクレオチ
ドから成るオリゴヌクレオチドを含む。好ましいのは、Ｃ２’エンド型パッカー
またはＯ４’エンド型パッカーを有するヌクレオチドの連続配列に３’位である
連続配列中で互いに結合したＣ３’エンド型パッカーヌクレオチドを有するオリ
ゴヌクレオチドである。更に好ましいオリゴヌクレオチドは、Ｃ３’エンド型パ
ッカーを有するヌクレオチドが、Ｃ２’エンド型パッカーまたはＯ４’エンド型
パッカーを有する連続配列に５’位である連続配列中で互いに結合しているオリ
ゴヌクレオチドである。更に別の好ましいオリゴヌクレオチドは、Ｃ３’エンド
型パッカーを有するヌクレオチドの一部分が、Ｃ２’エンド型パッカーまたはＯ
４’エンド型パッカーを有するヌクレオチドの連続配列に３’位である連続配列
中で互いに結合していて、そしてＣ３’エンド型パッカーを有するヌクレオチド
の追加部分が、Ｃ２’エンド型パッカーまたはＯ４’エンド型パッカーを有する
ヌクレオチドの連続配列に５’位である連続配列中で互いに結合しているオリゴ
ヌクレオチドである。 （発明の詳細な説明） 一つの態様において、本発明はＲＮａｓｅ Ｈの基質として働く能力と結びつ
けられた、結合親和性および／またはヌクレアーゼ耐性を増加させるために寄与
するある種の望ましい特性を持つ新規オリゴヌクレオチドに関している。

【００３５】 本発明のオリゴヌクレオチドは多数のヌクレオチドから形成され、それらはヌ
クレオチド間結合によりお互いに連結されている。オリゴヌクレオチド中でユニ
ットとしてお互いに連結されているとはいえ、オリゴヌクレオチドの個々のヌク
レオチドはいくつかの型を持っている。これらの型の各々がオリゴヌクレオチド
の独特の特性に寄与している。第一の型のヌクレオチドは連続した配列に一緒に
連結され、オリゴヌクレオチドの第一の部分を形成する。残りのヌクレオチドは
少なくとも一つの別の型であり、オリゴヌクレオチド内の一つまたはそれ以上の
残りの部分または位置に位置している。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは
一組の特性に寄与するヌクレオチド部分および別の組の特性に寄与するさらなる
部分（単数又は複数）を含んでいる。

【００３６】 望まれている一つの特性はＲＮａｓｅＨ活性を惹起することである。ＲＮａｓ
ｅＨ活性を惹起するため、本発明のオリゴヌクレオチドの一部分はＢ形様コンホ
メーション幾何配置を持つように選択される。このＢ形部分のためのヌクレオチ
ドは特にリボ−ペントフラノシルおよびアラビノ−ペントフラノシルヌクレオチ
ドを含むように選択される。２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌク
レオチドもまたＢ形幾何配置を持っており、ＲＮａｓｅＨ活性を惹起する。特に
除外するわけではないが、もし２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌ
クレオチドが本発明のオリゴヌクレオチドのＢ形部分に含まれているとしたら、
そのような２’−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシルヌクレオチドは好適に
はオリゴヌクレオチドのＢ形部分のヌクレオチドの全体を構築してはならず、リ
ボヌクレオチドまたはアラビノヌクレオチドと合同して使用されるべきである。
本明細書で使用される場合、Ｂ形幾何配置はＣ２’−エンドおよびＯ４’−エン
ドパッカーの両方を含んでおり、オリゴヌクレオチドＢ形部分での包含に選択さ
れたリボおよびアラビノヌクレオチドはＣ２’−エンドコンホメーションまたは
Ｏ４’−エンドコンホメーションを持つように選択される。これはＢｅｒｇｅｒ
．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，
２６，２４７３−２４８０、と一致しており、そこではヌクレオシドおよびヌク
レオチドが存在するフラノースコンホメーションの考察において、Ｏ４’−エン
ドパッカー寄与にはＢ形を考えなければならないことが指摘されている。

【００３７】 Ａ形ヌクレオチドはＣ３’−エンドパッカー（ノースまたはノーザンパッカー
としても知られている）を示すヌクレオチドである。上に示したＢ形ヌクレオチ
ドに加え、Ａ形ヌクレオチドはＣ３’−エンドパッカーヌクレオチドであること
があり、またはオリゴヌクレオチドの３’終端、５’終端または３’および５’
終端の両方に位置するヌクレオチドであってもよい。もしくは、Ａ形ヌクレオチ
ドはＣ３’−エンドパッカーの両方に存在でき、オリゴヌクレオチドの末端また
は終端に位置できる。Ｃ３’−エンドパッカーを持つヌクレオチドの選択におい
て、またはオリゴヌクレオチドの３’または５’末端に存在させるヌクレオチド
の選択において、そのようなヌクレオチドが生じるオリゴヌクレオチドに授ける
必要がある結合親和性およびヌクレアーゼ耐性が考慮される。

【００３８】 本発明のオリゴヌクレオチドの３’または５’終端に存在するように選択され
るヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を授けるように選択
される。このヌクレアーゼ耐性は、また、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単
位糖部分の修飾、ヌクレオチド間結合の修飾、または糖およびヌクレオチド間結
合両方の修飾を含むいくつかの機構により達成できる。

【００３９】 オリゴヌクレオチド終端でのヌクレアーゼ耐性の増加に使用するために特に有
用なヌクレオチド群は、２’−Ｏ−アルキルアミノ基を持っているものである。
そのようなヌクレオチドのアミノ基は生理学的ｐＨではプロトン化されている基
であろう。これらにはアミン、モノアルキル置換アミン、ジアルキル置換アミン
およびイミダゾールのようなヘテロ環式アミンが含まれる。特に有用であるのは
２’−Ｏ−エチルアミンおよび２’−Ｏ−プロピルアミンを含む低級アルキルア
ミンである。そのようなＯ−アルキルアミンはまた３’終端ヌクレオチドの３’
位に含まれていてもよい。従って、３’終端ヌクレオチドは２’および３’−Ｏ
−アルキルアミノ置換基の両方を含んでいるかもしれない。

【００４０】 ヌクレアーゼ耐性のための選択においては、結合親和性を減じないことが重要
である。ある種のリン原子を基本とした結合はヌクレアーゼ耐性を増加させるこ
とが示されている。前に説明したホスホロチオエート結合はヌクレアーゼ耐性を
増加させるが、それはまた結合親和性の損失も起こす。従って、一般的に本発明
での使用には、もしホスホロチオエートヌクレオチド間結合が使用されるとした
ら、ホスホロチオエート結合により減少した親和性を補償するため、結合親和性
を増加させる他の修飾がヌクレオチド単位に行われるであろう。

【００４１】 結合親和性を減じずにヌクレアーゼ耐性を増加させる他のリン原子を基本とし
た結合には３’−メチレンホスホナートおよび３’−デオキシ−３’−アミノ−
ホスホロアミデート結合が含まれる。結合親和性を減じずにヌクレアーゼ耐性を
増加させる別の組の結合は本質的に非リン性である。これらのうち好適であるの
はメチレン（メチルイミノ）結合、ジメチルヒドラキシノ結合およびＦｒｅｉｅ
ｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
１９９７，２５，４４２９−４４４３、に説明されているようなアミン３および
アミド４結合である。

【００４２】 改良された結合親和性を持っているオリゴヌクレオチドを設計する場合、考慮
すべき多数の潜在的項目が存在する。非常に高いＲＮＡ結合親和性を持つ修飾オ
リゴヌクレオチドを構築するための一つの有効な方法は二つまたはそれ以上の異
なる種の修飾の組み合わせである、これらの各々は、結合親和性にとって重要で
ありうる種々な要因に好都合に寄与する。

【００４３】 Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓｅａｒｃｈ ，（１９９７）２５：４４２９−４４４３、は標的ＲＮＡとの二重
鎖安定性に対するオリゴヌクレオチド構造修飾の影響についての研究を最近報告
している。この研究において、合成された２００より多い異なった修飾を含む一
連のオリゴヌクレオチドが調べられ、そのハイブリダイゼーション親和性および
Ｔ_mが評価されている。糖修飾研究には、糖の２’−位での置換、３’−置換、
４’−酸素の置き換え、２環式糖の使用および４員環置き換えが含まれている。
いくつかの核酸塩基修飾もまた研究されており、チミンの５または６位での置換
、ピリミジンヘテロ環式の修飾およびプリンヘテロ環式の修飾が含まれている。
リン原子を持つ主鎖、リン原子を含んでいない主鎖および中性である主鎖を含む
多数の主鎖修飾もまた調べられている。

【００４４】 四つの一般的方法がＲＮＡ標的に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ
ーションを改良するために使用されるであろう。これらには以下の点が含まれる
：ハイブリッド形成のために好都合なコンホメーションへのオリゴデオキシヌク
レオチド鎖の糖およびリン酸の前組織化(preorganization)、オリゴヌクレオチ
ドのヌクレオチドのヘテロ環式塩基への分極可能な基の付加による核酸塩基積み
重ねの改良、Ａ−Ｕ対形成に利用可能なＨ−結合数の増加、および望ましくない
反発相互作用の除去を容易にするための主鎖電荷の中和。我々はこれらの内の最
初のもの、ハイブリッド形成を好むコンホメーションへのオリゴデオキシヌクレ
オチド鎖の糖およびリン酸の前組織化、を利用することが改良された結合親和性
を達成するために好適な方法であることを発見した。これは他の三つの方法と組
み合わせてさらに使用できる。

【００４５】 ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二重鎖はしばしばＣ３’エンドコンホメーション
をとる。従って、一本鎖中の糖部分のコンホメーション平衡をこのコンホメーシ
ョンに移行させる修飾は、ＲＮＡへの結合のためアンチセンス鎖を前組織化する
であろう。文献で報告および研究されているいくつかの糖修飾のうち、２’−フ
ルオロまたは２’−アルコキシのような電気陰性基の取り込みが糖コンホメーシ
ョンを３’エンド（ノーザン）パッカーコンホメーションへ移行させる。このこ
とは、そのような修飾を取り込んだオリゴヌクレオチドをＡ形コンホメーション
幾何配置に前組織化する。このＡ形コンホメーションは標的ＲＮＡ鎖へのオリゴ
ヌクレオチドの結合親和性を増加させる。

【００４６】 ヌクレオチドへＡ形コンホメーション特性を与える、本発明に従った代表的２
’−置換基には２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−置換アルキルおよび２’−フル
オロ置換基が含まれる。置換基として好適であるのは種々のアルキルおよびアリ
ールエーテルおよびチオエーテル、アミンおよびモノアルキルおよびジアルキル
置換アミンである。特に好適な基は式ＩまたはＩＩを持っているものである：

【００４７】

【化３】

【００４８】 式中 ＥはＣ₁−Ｃ₁₀アルキル、Ｎ（Ｑ₁）（Ｑ₂）またはＮ＝Ｃ（Ｑ₁）（Ｑ₂）であ
り； 各々のＱ₁およびＱ₂は、独立して、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、ジアルキルアミ
ノアルキル、窒素保護基、つなぎ止められたまたはつなぎ止められていない共役
基、固体支持体へのリンカー、またはＱ₁およびＱ₂は、一緒になって、窒素保護
基またはＮおよびＯから選択される少なくとも一つの追加のヘテロ原子を含むこ
とができる環構造に連結される； Ｒ₃はＯＸ、ＳＸまたはＮ（Ｘ）₂であり； 各々のＸは、独立して、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₈アルキル、Ｃ₁−Ｃ₈ハロアルキル、Ｃ（
＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＺまたはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚであ
り； ＺはＨまたはＣ₁−Ｃ₈であり； Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は約４から約７の炭素原子を持っている、または約３から
約６の炭素原子および１または２のヘテロ原子を持っている環系を含み、ここで
該ヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄から選択され、およびここで環系は脂肪族
、不飽和脂肪族、芳香族または飽和または不飽和ヘテロ環式である； Ｙは１から約１０の炭素原子を持っているアルキルまたはハロアルキル、２か
ら約１０の炭素原子を持っているアルケニル、２から約１０の炭素原子を持って
いるアルキニル、６から約１４のの炭素原子を持っているアリール、Ｎ（Ｑ₁）
（Ｑ₂）、Ｏ（Ｑ₁）、ハロ、Ｓ（Ｑ₁）またはＣＮであり； 各々のｑ₁は、独立して、２から１０であり； 各々のｑ₂は、独立して、０または１であり； ｍは０、１または２であり； ｐは１から１０であり； ｑ₃は１から１０であるが、ただしｐが０の場合、ｑ₃は１より大きい。

【００４９】 上記２’−置換は糖が取り込まれたところでそれらに３’−エンドパッカーを
与える。このパッカーコンホメーションはさらに標的と一緒になったオリゴヌク
レオチドのＴｍを増加させる。

【００５０】 ２’置換から生じる高結合親和性は、一部はＣ３’エンド糖のパッカーを起こ
す２’置換によるものであり、それは順にオリゴマーを好ましいＡ形様幾何配置
にすることができる。これは合理的な仮説であり、種々の電気陰性基（例えば、
フルオロ及びＯ−アルキル鎖）による２’位の置換がＣ３’エンド糖パッカリン
グを起こすことが報告されている（Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ ．，１９９５，２８，３６６−３７４；Ｌｅｓｎｉｋ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，７８３２−７８
３８）。

【００５１】 加えて、エチレングリコールモチーフを含んでいる２’−置換に対し、側鎖の
Ｏ−Ｃ−Ｃ−Ｏねじれによる酸素原子間のゴーシュ相互作用は二重鎖に対する安
定化効果を持っているであろう（Ｆｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，（１９９７）２５：４４２９−４４４２）。
そのようなゴーシュ相互作用は昔から実験的に観察されている（Ｗｏｌｆｅ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９７２，５，１０２；Ａｂｅ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７６，９８，４６８）。この
ゴーシュ効果は二重鎖形成に好ましい側鎖の立体配置を生じることができる。こ
の安定化立体配置の正確な本質は未だに説明されていない。理論に縛られるのを
望むわけではないが、Ｏ−Ｃ−Ｃ−Ｏのねじれを単一のゴーシュ立体配置に保つ
ことは、アルキル側鎖で観察されるより無作為な分布よりも、二重鎖形成のエン
トロピー的利点を提供するからであろう。

【００５２】 ２’−Ｏ−メトキシエチル置換ＲＮＡのより高いＲＮＡ親和性をより理解する
ため、および２’−Ｏ−メトキシエチル置換のコンホメーション特性を試験する
ため、自己相補的ドデカマーオリゴヌクレオチド ２’−Ｏ−ＭＯＥｒ（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ） 配列ＩＤ番号：１ が合成され、結晶化され、およびその構造が１．７オングストロームの分解能で
決定された。使用された結晶化条件は２ｍＭオリゴヌクレオチド、５０ｍＭ Ｎ
ａ ヘペスｐＨ６．２−７．５、１０．５０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１５％ ＰＥＧ
４００であった。示された結晶デ−タ：空間群Ｃ２、格子定数ａ＝４１．２Å、
ｂ＝３４．４Å、ｃ＝４６．６Å、β＝９２．４°。分解能は−１７０℃で１．
７Åであった。現在のＲ＝因子は２０％（Ｒ_free２６％）であった。

【００５３】 この結晶構造は、完全に修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチド類似体の最初の
結晶構造であると信じられる。二重鎖は全体ではＡ形コンホメーションをとり、
すべての修飾糖はＣ３’−エンドパッカーを示している。２’−Ｏ−置換基のほ
とんどにおいて、エチレングリコールリンカーのＡ’−Ｂ’結合（下記構造ＩＩ
に示されている）の回りのねじれ角はゴーシュコンホメーションを持っている。
２’−Ｏ−ＭＯＥに対し、下記構造ＩＩのＡ’およびＢ’はＭＯＥのエチル部分
のメチレン残基であり、Ｒ’はメトキシ部分である。

【００５４】

【化４】

【００５５】 結晶において、２’−Ｏ−ＭＯＥ ＲＮＡ二重鎖は結晶学的２倍回転軸は分子
２倍回転軸と一致しないような一般的配向をとっている。二重鎖は期待されたＡ
形幾何配置をとり、２４の２’−Ｏ−ＭＯＥ置換基のすべてが最高分解能で電子
密度地図に観察された。電子密度地図ならびに置換基原子の温度因子はいくつか
の場合２’−Ｏ−ＭＯＥ置換基の可動性を示している。

【００５６】 ２’−Ｏ−ＭＯＥ置換基のほとんどはエチルリンカーのＣ−Ｃ結合の回りのゴ
ーシュコンホメーションを示している。しかしながら、２つの場合、Ｃ−Ｃ結合
の回りのトランスコンホメーションが観察される。結晶における格子相互作用に
は副溝を経たお互いに対する二重鎖の充填が含まれる。従って、いくつかの残基
において、２’−Ｏ−置換基のコンホメーションは隣接する二重鎖との接触によ
り影響を受ける。一般に、置換基のコンホメーションの変位（例えば、Ｃ−Ｃ結
合の回りのｇ⁺またはｇ^-）は置換基間の相互作用に較差を作り出している（副溝
を横切る鎖間のおよび鎖内の両方の）。一つの位置において、二つの残基の置換
基原子は副溝を横切ったファンデルワールス接触を行っている。同様に、二つの
隣接する鎖内残基の置換基原子間で密接な接触が起こっている。

【００５７】 Ａ−ＤＮＡ二重鎖の以前に決定された結晶構造は、孤立した２’−Ｏ−メチル
Ｔ残基を取り込んだものであった。２’−Ｏ−ＭＯＥ置換基に対して言及した結
晶構造において、保存的水和パターンが２’−Ｏ−ＭＯＥ残基で観察された。一
つの水分子が置換基のＯ２’、Ｏ３’およびメトキシ酸素原子間に位置している
のがみられ、三つのすべてが２．９から３．４Å間の接触を形成している。加え
て、置換基の酸素原子はいくつかの他の水素結合接触に関与している。例えば、
特定の２’−Ｏ−置換基のメトキシ酸素原子は橋渡しの水分子を経て反対鎖のア
デノシンのＮ３と水素結合を形成している。

【００５８】 いくつかの場合、水分子が修飾ヌクレオシドのＯ２’、Ｏ３’およびＯＣ’の
酸素原子間に捕捉されている。エチレングリコールリンカーのＣ−Ｃ結合の回り
にトランスコンホメーションを持つ２’−Ｏ−ＭＯＥ置換基はＯＣ’と反対鎖の
グアノシンのＮ２間、および水を介したＯＣ’とＮ３（Ｇ）間の密接な接触が伴
っている。２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾鎖を含んでいる二重鎖の利用可能な熱力学的デ
ータと組み合わせると、この結晶構造は他のアンチセンス修飾のさらに詳細な構
造−安定性分析を可能にする。

【００５９】 結晶学的構造研究の拡大において、本発明の２’−Ｏ−修飾を持っているオリ
ゴヌクレオチドのさらに促進された結合親和性を研究するために分子モデル化実
験が実施された。オリゴヌクレオチドの各々のヌクレオシドに本発明の２’−Ｏ
−修飾を持っている上記配列ＩＤ番号：１の化合物についてコンピューターシミ
ュレーションが行われた。シミュレーションはＡＭＢＥＲ力場法（Ｃｏｒｎｅｌ
ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５，１１７，５１７
９−５１９７）（ＵＣＳＦ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ、からのモデル
化ソフトウェアパッケージ）を使用して、水溶液中のオリゴヌクレオチドについ
て実施された。計算はＩｎｄｉｇｏ２ ＳＧＩコンピューター（Ｓｉｌｉｃｏｎ
Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で実施された。

【００６０】 本発明のさらなる２’−Ｏ−修飾には構造ＩＩのＡ’およびＢ’原子に対応す
る二つの原子部分を取り込んだ環構造を持っているものが含まれる。環構造は一
つまたはそれ以上のヌクレオシドの糖部分の２’位に結合され、オリゴヌクレオ
チド内へ取り込まれる。ヌクレオシドの２’−酸素は構造ＩＩのＡ’原子に対応
する炭素原子を結合している。これらの環構造は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族
またはヘテロ環式であろう。環の別の原子（構造ＩＩのＢ’原子に対応する）は
さらに酸素原子または硫黄または窒素原子を持っている。この酸素、硫黄または
窒素原子は一つまたはそれ以上の水素原子、アルキル残基またはハロアルキル残
基に結合されているか、またはウレイド、カーバメート、アミドまたはアミジン
残基のようなさらなる化学残基の一部である。環構造の残りはこれら二つの環原
子を結合している結合の回転を制限している。このことは”さらなる酸素、硫黄
または窒素原子”（前記のＲ位の一部）の位置決めにおいて、さらなる原子がヌ
クレオシドの３’−酸素原子（Ｏ３’）に非常に近接して位置できるように助け
ている。

【００６１】 環構造はさらに環の親水性および疎水性を修飾するために有用な基で修飾でき
、それは環に結合され、本発明の２’−Ｏ−修飾を含むオリゴヌクレオチドの特
性が修飾される。荷電構造が仮定できる基がさらなる基として選択できる、例え
ば、アミン。このことは本発明の２’−Ｏ−修飾を含むオリゴヌクレオチドの全
体の電荷の修飾に特に有用である。オリゴヌクレオチドが荷電リン酸基（例えば
、ホスホロチオエートまたはホスホジエステル結合）により連結されている場合
、２’−Ｏ−修飾上のカウンターイオン（例えば、アミン官能性）の存在は２’
−Ｏ−修飾を持つヌクレオチドの局所環境における電荷を局所的に中和する。そ
のような電荷の中和は取り込み、細胞局在化およびオリゴヌクレオチドの他の薬
物動態学的および薬物動力学的効果を調節するであろう。

【００６２】 ２’−Ｏ−修飾としての包含のために好適な本発明の環構造には、シクロヘキ
シル、シクロペンチルおよびフェニル環ならびにシクロヘキシル、シクロペンチ
ルおよびフェニル環に類似した空間的フットプリントを持っているヘテロ環式環
が含まれる。特に好適な本発明の２’−Ｏ−置換基は以下に掲げられており、各
々の略語も含まれている： ２’−Ｏ−（トランス ２−メトキシシクロヘキシル） −−２’−Ｏ−（Ｔ
ＭＣＨＬ） ２’−Ｏ−（トランス ２−メトキシシクロペンチル） −−２’−Ｏ−（Ｔ
ＭＣＰＬ） ２’−Ｏ−（トランス ２−ウレイドシクロヘキシル） −−２’−Ｏ−（Ｔ
ＵＣＨＬ） ２’−Ｏ−（トランス ２−メトキシフェニル） −−２’−Ｏ−（２ＭＰ） そのような２−Ｏ−置換基を取り込んでいる二重鎖の構造的詳細が前記のＩｎ
ｄｉｇｏ２ ＳＧＩコンピューターによるＡＭＢＥＲ力場プログラムを使用して
分析された。シミュレートされた構造はシミュレーションの持続を通して安定な
Ａ形幾何配置を維持した。２’置換の存在は糖をＣ３’−エンドコンホメーショ
ンに固定した。

【００６３】 ＴＭＣＨＬ修飾のシミュレーションは２’−Ｏ−（ＴＭＣＨＬ）側鎖は二重鎖
に水和している水分子と直接相互作用を持っていることを明らかにした。２’−
Ｏ−（ＴＭＣＨＬ）側鎖中の酸素原子はリン酸主鎖の３’酸素と水仲介相互作用
を行うことができる。２’−Ｏ−（ＴＭＣＨＬ）側鎖中の二つの酸素原子の存在
は好ましいゴーシュ相互作用を与える。Ｏ−Ｃ−Ｃ−Ｏねじれの回りの回転障壁
はこの新規修飾でより大きくされる。Ａ形幾何配置での望ましい前組織化は標的
ＲＮＡへの２’−Ｏ−（ＴＭＣＨＬ）の結合親和性を増加させる。２’−Ｏ−（
ＴＭＣＨＬ）基における固定化された側鎖コンホメーションは水分子結合のため
のより好ましいポケットを作り出した。これらの水分子の存在は、側鎖を好適な
ゴーシュコンホメーションに保つための鍵となる役割を果たしている。理論に縛
られるのを望むわけではないが、置換基のかさ高さ、シクロヘキサン環における
置換基のジエクアトリアル配向、水和の水および発生されたコンホメーションに
おける金属イオンの捕捉可能性が、この２’−Ｏ−修飾を持っているヌクレオシ
ドを取り込んだオリゴヌクレオチドの改良された結合親和性およびヌクレアーゼ
耐性にさらに寄与するであろう。

【００６４】 上記ＴＭＣＨＬ修飾で説明したように、２’−Ｏ−（ＴＭＣＰＬ）、２’−Ｏ
−（２ＭＰ）および２’−Ｏ−（ＴＵＣＨＬ）修飾オリゴヌクレオチドの水溶液
での同じコンピューターシミュレーションもまたシミュレーションの持続を通し
て安定なＡ形幾何配置を維持するであろうことを例証する。２’置換の存在は糖
をＣ３’−エンドコンホメーションに固定するであろうし、側鎖は二重鎖に水和
している水分子と直接相互作用を持つであろう。各々の側鎖中の酸素原子はリン
酸主鎖の３’酸素と水仲介相互作用を行うことができる。各々の側鎖中の二つの
酸素原子の存在は好ましいゴーシュ相互作用を与える。Ｏ−Ｃ−Ｃ−Ｏねじれの
回りの回転障壁は各々の修飾でより大きくされるであろう。Ａ形幾何配置での望
ましい前組織化は標的ＲＮＡへの各々の２’−Ｏ−修飾オリゴヌクレオチドの結
合親和性を増加させるであろう。各々の修飾における固定化された側鎖コンホメ
ーションは水分子結合のためのより好ましいポケットを作り出すであろう。水分
子の存在は、側鎖を好適なゴーシュコンホメーションに保つための鍵となる役割
を果たしている。置換基のかさ高さ、各々の環における置換基のジエクアトリア
ル配向、水和の水および発生されたコンホメーションにおける金属イオンの捕捉
可能性が、これら各々の２’−Ｏ−修飾を持っているヌクレオシドを取り込んだ
オリゴヌクレオチドの改良された結合親和性およびヌクレアーゼ耐性にさらに寄
与するであろう。

【００６５】 ＲＮａｓｅＨを惹起するためのＢ形ヌクレオチドとしての使用に好適であるの
は、２’−デオキシ−２’−Ｓ−メチル、２’−デオキシ−２’−メチル、２’
−デオキシ−２’−アミノ、２’−デオキシ−２’−モノまたはジアルキル置換
アミノ、２’−デオキシ−２’−フルオロメチル、２’−デオキシ−２’−ジフ
ルオロメチル、２’−デオキシ−２’−トリフルオロメチル、２’−デオキシ−
２’−メチレン、２’−デオキシ−２’−フルオロメチレン、２’−デオキシ−
２’−ジフルオロメチレン、２’−デオキシ−２’−エチル、２’−デオキシ−
２’−エチレンおよび２’−デオキシ−２’−アセチレンを持っているリボヌク
レオチドである。これらのヌクレオチドはもしくは２’−ＳＣＨ₃リボヌクレオ
チド、２’−ＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−ＮＨ₂リボヌクレオチド、２’−Ｎ
Ｈ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）リボヌクレオチド、２’−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）₂リ
ボヌクレオチド、２’−ＣＨ₂Ｆリボヌクレオチド、２’−ＣＨＦ₂リボヌクレオ
チド、２’−ＣＦ₃リボヌクレオチド、２’＝ＣＨ₂リボヌクレオチド、２’＝Ｃ
ＨＦリボヌクレオチド、２’＝ＣＦ₂リボヌクレオチド、２’−Ｃ₂Ｈ₅リボヌク
レオチド、２’−ＣＨ＝ＣＨ₂リボヌクレオチド、２’−Ｃ≡ＣＨリボヌクレオ
チドとも記載できる。さらに有用なリボヌクレオチドはケージ様構造のリボース
環上に位置している環を持っているもので３’，Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌ
クレオチドが含まれる。そのようなケージ様構造はリボース環を望まれるコンホ
メーションに物理的に固定するであろう。

【００６６】 さらに、ＲＮａｓｅＨを惹起するためのＢ形ヌクレオチドとしての使用に好適
であるのは、２’−デオキシ−２’−シアノ、２’−デオキシ−２’−フルオロ
、２’−デオキシ−２’−クロロ、２’−デオキシ−２’−ブロモ、２’−デオ
キシ−２’−アジド、２’−メトキシを持っているアラビノヌクレオチドおよび
非修飾アラビノヌクレオチド（ヌクレオチドの塩基に向かって上方へ伸びた２’
−ＯＨを含んでいる）である。これらのアラビノヌクレオチドはもしくは２’−
ＣＮアラビノヌクレオチド、２’−Ｆアラビノヌクレオチド、２’−Ｃｌアラビ
ノヌクレオチド、２’−Ｂｒアラビノヌクレオチド、２’−Ｎ₃アラビノヌクレ
オチド、２’−Ｏ−ＣＨ₃アラビノヌクレオチドおよびアラビノヌクレオチドと
も記載できる。

【００６７】 そのようなヌクレオチドはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラ
ノホスフェートまたはホスホジエステル結合を通してお互いに結合される。特に
好適であるのはホスホロチオエート結合である。

【００６８】 本発明の使用のためのＢ形ヌクレオチドの例は、Ｃ２’エンドコンホメーショ
ンをとる２’−Ｓ−メチル（２’−ＳＭｅ）ヌクレオチドである。それはＣ３’
エンドコンホメーションをとる２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチド
と比較できる。これら二つのヌクレオチドの比較での使用に特に適しているのは
ＳＧＩコンピューター（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ
Ｖｉｅｗ，ＣＡ）およびコンピューターシミュレーションのためのモデル化ソ
フトウェアパッケージＡＭＢＥＲ（ＵＣＳＦ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃ
Ａ）を使用した分子動力学研究である。

【００６９】 Ｓ−メチル基を含んでいるＣ２’−修飾ヌクレオシドにおけるリボースコンホ
メーションが試験された。ヌクレオシドのコンホメーションに対する２’−Ｏ−
および２’−Ｓ−メチル基の影響を理解するため、２’−Ｏ−および２’−Ｓ−
メチルグアノシン、ならびに通常のデオキシグアノシンおよびリボグアノシンの
相対エネルギーを、ａｂ ｉｎｉｔｉｏ量子力学計算を使用し、Ｃ２’−エンド
およびＣ３’−エンドの両方から開始して評価した。すべての構造はＨＦ／６−
３１Ｇ^*レベルで完全に最適化され、電子−相関を持つ単一点エネルギーがＭＰ
２／６−３１Ｇ^*／／ＨＦ／６−３１Ｇ^*レベルで得られた。表１に示したように
、デオキシグアノシンのＣ２’−エンドコンホメーションは気相においてＣ３’
−エンドコンホメーションより０．６ｋｃａｌ／モル安定であると見積もられる
。Ｃ３’−エンドコンホメーションよりＣ２’−エンドのコンホメーション優先
性は、同じエネルギー相違を予測するＭＰ２／６−３１Ｇ^*／／ＨＦ／６−３１
Ｇ^*値により明らかにされたように電子相関にはあまり依存しないようである。
逆の傾向がリボグアノシンで指摘される。ＨＦ／６−３１Ｇ^*およびＭＰ２／６
−３１Ｇ^*／／ＨＦ／６−３１Ｇ^*レベルで、リボグアノシンからのＣ３’−エン
ド形はＣ２’−エンド形より各々約０．６５および１．４１ｋｃａｌ／モル安定
であることが示されている。

【００７０】

【表１】

【００７１】 表１はまたＣ２’−エンドおよびＣ３’−エンドコンホメーションの２’−Ｏ
−メチルグアノシンおよび２’−Ｓ−メチルグアノシンの相対エネルギーも含ん
でいる。このデータはＣ２’−置換の電子的性質がこれらのコンホメーションの
相対安定性に著しい影響を与えることを示している。２’−Ｏ−メチル基の置換
はＨＦ／６−３１Ｇ^*およびＭＰ２／６−３１Ｇ^*／／ＨＦ／６−３１Ｇ^*両方の
レベルで約０．４ｋｃａｌ／モルだけＣ３’−エンドコンホメーションに対する
優先性を増加させる（リボグアノシンと比較した場合）。対照的に、２’−Ｓ−
メチル基は傾向が逆転している。Ｃ２’−エンドコンホメーションがＨＦ／６−
３１Ｇ^*レベルで約２．６ｋｃａｌ／モル優先され、一方、同じ相違はＭＰ２／
６−３１Ｇ^*／／ＨＦ／６−３１Ｇ^*レベルで１．４１ｋｃａｌ／モルへ減少して
いる。比較のため、および２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｓ−メチル置換ヌクレ
オシドに用いた分子力学力場パラメーターの正確性を評価するため、ヌクレオシ
ドの気相エネルギーを計算した。結果は表１に報告されており、これらのヌクレ
オシドの計算相対エネルギーはａｂ ｉｎｉｔｉｏ計算と定性的によく対比して
いる。

【００７２】 ヌクレオシドコンホメーションの相対安定性に対する溶媒和の影響を評価する
ため追加の計算も実施された。ＨＦ／６−３１Ｇ^*幾何配置を使用して見積もら
れた溶媒和効果は、気相における４つのヌクレオシドの相対的エネルギー優先性
は同様に水相で維持されていることが確認された（表１）。溶媒和効果はまた明
らかな水中でのヌクレオシドの分子動力学シミュレーションを使用しても試験さ
れた。これらの軌線から、デオキシリボグアノシンおよび２’−Ｓ−メチルリボ
グアノシンに対してはＣ２’−エンドコンホメーションが優勢であり、一方、リ
ボグアノシンおよび２’−Ｏ−メチルリボグアノシンはＣ３’−エンドコンホメ
ーションを好むことが観察できる。これらの結果は２’−Ｓ−メチルリボヌクレ
オシドの入手可能なＮＭＲ結果と一致している。ビシナルスピン結合定数を使用
した糖パッカリング平衡のＮＭＲ研究は、２’−Ｓ−メチルピリミジンヌクレオ
シド中の糖環のコンホメーションが平均＞７５％のＳ−性を示すが、対応するプ
リン類似体は平均＞９０％Ｓ−パッカーを示すことを指摘している［Ｆｒａｓｅ
ｒ，Ａ．，Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｐ．，Ｃｏｏｋ．Ｐ．Ｄ．ａｎｄ Ｓａｎｇｈｖｉ
，Ｙ．Ｓ．，Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３０，１２７
７−１２８７］。デオキシヌクレオシドでの２’−Ｓ−メチル置換は、デオキシ
リボヌクレオシドと比較した場合、糖コンホメーションによりコンホメーション
的硬直性を与えることが観察されている。

【００７３】 ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＯＭｅ＿ＤＮＡ：ＲＮＡおよびＳＭｅ＿ＤＮＡ：ＲＮＡハイ
ブリッドの構造特性もまた観察された。出発ハイブリッド座標からのＤＮＡ：Ｒ
ＮＡ構造の平均ＲＭＳ偏差は、大体１．０Åの平均ＲＭＳ偏差でシミュレーショ
ン部分を通して構造が安定化されていることを示している。この偏差は、一部、
平均構造における（即ち、出発コンホメーション）および熱平衡での構造の固有
の相違によるものである。このハイブリッドの三つの中心的塩基対の糖パッカー
コンホメーションの変化は以前のＮＭＲ研究での観察と良好な一致を示した。Ｒ
ＮＡ鎖中の糖は、０°に近い環パッカー値を持つＣ３’−エンドコンホメーショ
ンでの非常に安定な幾何配置を維持している。対照的に、ＤＮＡ鎖の糖は著しい
変異性を示している。

【００７４】 ＯＭｅ＿ＤＮＡ：ＲＮＡの平均ＲＭＳ偏差は出発Ａ形コンホメーションから約
１．２Åであり；一方、ＳＭｅ＿ＤＮＡ：ＲＮＡは出発ハイブリッドコンホメー
ションからわずかに高い偏差（約１．８Å）を示している。ＳＭｅ＿ＤＮＡ鎖も
またＲＭＳ偏差でより大きな分散を示し、Ｓ−メチル基がいくらかの構造的揺動
を誘導しているようである。ＲＮＡ補体の糖パッカーはシミュレーションを通し
てＣ３’−エンドパッカリングを維持している。しかしなら、ヌクレオシド計算
から予測されたように、ＯＭｅ＿ＤＮＡおよびＳＭｅ＿ＤＮＡ鎖のパッカリング
の著しい相違が注目され、前者はＣ３’−エンド、および後者はＣ１’−エキソ
／Ｃ２’−エンドコンホメーションをとっている。

【００７５】 二重鎖コンホメーションをさらに特徴付けるため、三つすべてのハイブリッド
構造に対するらせんパラメーターの分析も実施された。二重鎖の異なった形を区
別する三つのより重要な軸−塩基対パラメーター、Ｘ−変位、プロペラよじれお
よび傾きが表２に報告されている。通常、ゼロ付近のＸ−変位はＢ形二重鎖を表
し；一方、らせん軸からのらせん逸脱の直接的尺度である負の変位は構造がより
Ａ様コンホメーションであろうことを示す。Ａ形二重鎖において、これらの値は
典型的に−４Åから−５Åまで変化している。これらの値を三つすべてのハイブ
リッドで比較すると、ＳＭｅ＿ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドはＡ形値からの最も
大きな逸脱を示し、ＯＭｅ＿ＤＮＡ：ＲＮＡは最も小さく、ＤＮＡ：ＲＮＡは中
間である。理想的なＡ形パラメーターと傾きおよびプロペラよじり値を比較した
場合、同様の傾向がまた明らかである。これらの結果はハイブリッド構造の主鎖
およびグリコシドねじれ角の分析によりさらに支持される。例えば、Ａ形幾何配
置のグリコシド角（Ｘ）は典型的には−１５９°近くであり、一方、Ｂ形角は−
１０２°近くである。これらの角度はＯＭｅ＿ＤＮＡ、ＤＮＡおよびＳＭｅ＿Ｄ
ＮＡ鎖に対して各々−１６２°、−１３３°および−１０８°であることが観察
された。すべてのＲＮＡ補体は−１６０°に近いＸ角をとる。加えて、”クラン
ク軸”転位もまたＳＭｅ＿ＤＮＡ：ＲＮＡおよびＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド中
のＲＮＡ鎖の中心ＵｐＵステップの主鎖よじれで認められた。そのような転位は
、より好ましくない全体的なコンホメーションを解放するために起こるいくつか
の局所的コンホメーション変化を示唆している。総体的には、これらの結果はＡ
−特性の量が ＯＭｅ＿ＤＮＡ：ＲＮＡ＞ＤＮＡ：ＲＮＡ＞ＳＭｅ＿ＤＮＡ：ＲＮＡ のように減少し、後の二つはＡ−およびＢ−形幾何配置を比較した場合により中
間的コンホメーションをとっていることを示している。

【００７６】

【表２】

【００７７】 Ｃ２’−修飾ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの安定性が決定された。ＤＮＡ：Ｒ
ＮＡハイブリッドの全体的安定性は配列依存性およびＤＮＡまたはＲＮＡ鎖中の
プリン含量を含むいくつかの因子に依存しており、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド
は通常ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖よりも不安定であり、ある場合には、ＤＮＡ：ＤＮ
Ａ二重鎖よりさえも不安定である。利用可能な実験データは、比較的低下したＤ
ＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの安定性は主としてＤＮＡ：ＤＮＡ（Ｂファミリー）
およびＲＮＡ：ＲＮＡ（Ａファミリー）二重鎖間の中間的コンホメーション特性
にありとしている。核酸二重鎖の全体の熱力学的安定性は、主鎖のコンホメーシ
ョン、塩基対形成および積み重ね相互作用を含むいくつかの因子に起因すると考
えられる。二重鎖の全体的安定性に寄与する個々の熱力学を確かめることは困難
であるが、ハイブリッド二重鎖の安定性を増加させる主因子はよりよい積み重ね
相互作用（静電的π−π相互作用）および水和のためのより好ましい溝次元であ
ることを論ずることは合理的である。Ｃ２’−Ｓ−メチル置換はハイブリッド二
重鎖を不安定化させることが示されている。三つのハイブリッド間の上昇値の目
立った相違がいくつかの説明を与えるであろう。２’−Ｓ−メチル基は高い上昇
値（〜３．２Å）で塩基積み重ねの減少に強く影響し、２’−Ｏ−メチル基はＡ
形二重鎖に等しい（〜２．６Å）上昇値で全体の構造をより密にする。その全体
ではＡ様構造特色にもかかわらず、ＳＭｅ＿ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド構造は
３．２Åの平均上昇値を持っており、それはＢファミリー二重鎖にかなり近い。
実際、いくつかの局所塩基ステップ（ＣＧステップ）は異常に高い上昇値（４．
５Åほどの高さ）を持つことが観察されるようである。従って、２’−Ｓ−メチ
ル置換ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの大きな不安定化の一部は乏しい積み重ね相
互作用にあるようである。

【００７８】 ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド複合体の副溝に結合すると説明さ
れており、糖リン酸主鎖原子およびＲＮａｓｅＨ間の相互作用を最適化するため
に、理想的Ａ−およびＢ−形幾何配置間の中間の副溝幅を必要としている。コン
ピューターシミュレーションを使用したハイブリッド二重鎖のための平均構造の
綿密な精査は表３に示したような副溝幅次元の著しい変異を明らかにした。Ｏ−
メチル置換は、標準ＤＮＡ：ＲＮＡ複合体と比較した場合、わずかな副溝幅の拡
大を導いたが、Ｓ−メチル置換は一般的に収縮（約０．９Å）を導く。これらの
変化は、Ａ−かまたはＢ−様一本鎖コンホメーションを誘導するアンチセンス鎖
で注目された好適な糖パッカリングによるものであろう。副溝変異に加え、結果
はまた副溝の立体的組み立てにおける潜在的相違を示している。Ｏ−メチル基は
副溝内へ向いているが、一方、Ｓ−メチルは主溝の方向に向けられている。本質
的に、Ｓ−メチル基はＣ２’−エンドパッカリングの結果として主溝内へ塩基を
通してはじかれている。

【００７９】

【表３】

【００８０】 前記の修飾に加え、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、その修飾
が前記の特性を著しく減じない限り種々の他の修飾を持つことができる。従って
、本発明のオリゴヌクレオチド内へ取り込まれているヌクレオチドに対し、これ
らのヌクレオチドは天然に存在する糖または修飾糖に対応する糖部分に持つこと
ができる、代表的な修飾糖には、炭素環式または非環式糖、その２’位に置換基
を持っている糖、その３’位に置換基を持っている糖、および糖の一つまたはそ
れ以上の水素原子の代わりに置換基を持っている糖が含まれる。他の改変塩基部
分および改変糖部分は米国特許第３，６８７，８０８号およびＰＣＴ出願ＰＣＴ
／ＵＳ８９／０２３２３に開示されている。

【００８１】 改変塩基部分および改変糖部分はまた本発明の精神と一致した他の修飾も含ん
でいる。そのようなオリゴヌクレオチドは、天然に存在しているまたは合成野生
型オリゴヌクレオチドと機能的には相互交換的ではあるが、構造的には区別可能
であるとして最もよく説明される。すべてのそのようなオリゴヌクレオチドは、
それらが望まれるＲＮＡまたはＤＮＡ鎖の構造を機能的に有効に模倣する限り、
本発明に含まれている。代表的塩基修飾には”Ｇクランプ”と称される三環式シ
トシン類似体が含まれる（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ ．１９９８，１２０，８５３１）。この類似体は標的化されたＧのワトソン−ク
リックおよびフーグスティーン面を同時に認識することによりらせん内の相補的
グアニン（Ｇ）と四つの水素結合を作る。このＧクランプ修飾はホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチド内へ取り込まれた場合、アンチセンス能力を細胞培養で
劇的に促進する。本発明のオリゴヌクレオチドはまたＦｌａｎａｇａｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ，１９９９，１７（１），４８−５２、に
記載されているフェノキサジン−置換塩基型を含むことができる。

【００８２】 追加の修飾をオリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド
の糖の３’位に、および５’末端ヌクレオチドの５’位に行うことができる。例
えば、本発明のオリゴヌクレオチドの一つの追加の修飾にはオリゴヌクレオチド
の活性、細胞分布または細胞取り込みを促進する一つまたはそれ以上の部分また
は抱合体のオリゴヌクレオチドへの化学的連結が含まれる。そのような修飾には
コレステロール部分のような脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，１９８９，８６，６５５３）、
コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ ｍ，Ｌｅｔｔ ．，１９９４，４，１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル
−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．，１９９２，６６０，３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６
５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．，１９９２，２０，５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカ
ンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ
ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａ
ｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕ
ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９）、リン脂質、
例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンミニウ
ム １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート
（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，
１９９５，３６，３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．，１９９０，１８，３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコ
ール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎ ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ，１９９５，１４，９６９）、またはアダマンタン酢酸（
Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１
９９５，３６，３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂ ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ，１９９５，１２６４，２２９）、ま
たはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロ
ール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔ ｈｅｒ ．，１９９６．２７７，９２３）が含まれるがこれらに限定されるわけで
はない。

【００８３】 本明細書で使用する場合、用語”アルキル”とはメチル、エチルおよびイソプ
ロピル基を含む（これらに限定されるわけではない）直鎖、分岐鎖および環式不
飽和炭化水素基が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明のアルキ
ル基は置換されていてもよい。代表的アルキル置換基は米国特許第５，２１２，
２９５号、１２段、４１−５０行（本明細書において全体が援用される）に開示
されている。

【００８４】 本発明に従ったアルケニル基は少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含んで
いる直鎖、分岐鎖および環式炭化水素基が含まれ、アルキニル基は少なくとも一
つの炭素−炭素三重結合を含んでいる直鎖、分岐鎖および環式炭化水素基が含ま
れる。本発明のアルケニルおよびアルキニル基は置換できる。

【００８５】 アリール基は置換および無置換芳香族環式部分であり、フェニル、ナフチル、
アントラニル、フェナントリル、ピレニルおよびキシリル基が含まれるがこれら
に限定されるわけではない。アルカリール部分はアリール部分がアルキル部分を
中心構造に結合しているものであり、アラルキル基はアルキル部分がアリール部
分を中心構造に結合しているものである。

【００８６】 一般に、用語”へテロ”は炭素以外の原子を表しており、好適にはＮ、Ｏまた
はＳであるが他を除外するものではない。従って、用語”へテロ環式環”とは一
つまたはそれ以上のヘテロ原子（即ち、非炭素原子）を持っている炭素を基本と
した環系を表している。好適なヘテロ環式には例えば、イミダゾール、ピロリジ
ン、１，３−ジオキサン、ピペラジン、モルホリン環が含まれるがこれらに限定
されるわけではない。本明細書で使用される場合、用語”へテロ環式環”とはま
た一つまたはそれ以上の二重結合および一つまたはそれ以上のヘテロ原子を持っ
ている環系も表している。好適なヘテロ環式環には例えば、ピロリジノ環が含ま
れるがこれに限定されるわけではない。

【００８７】 標的核酸にハイブリダイズできる本発明のオリゴヌクレオチドは好適には約５
から約５０のヌクレオシドを含んでいる。そのような化合物は約８から約３０の
ヌクレオシドを含むのがより好適であり、１５から２５のヌクレオシドが特に好
適である。本明細書で使用される場合、標的核酸とは相補的核酸様化合物とハイ
ブリダイズできる任意の核酸である。さらに本発明の文脈において、”ハイブリ
ダイゼーション”とは、相補的核酸塩基間のワトソン−クリック、フーグスティ
ーンまたは逆フーグスティーン水素結合であろう水素結合を意味するであろう。
本明細書で使用される”相補性”とは二つの核酸塩基間の正確な対形成のための
能力を指している。例えば、アデニンおよびチミンは相補的核酸塩基であり、そ
れらは水素結合の形成を通して対形成する。本明細書で使用される”相補性”お
よび”特異的にハイブリダイズ可能”とはヌクレオシドサブユニットを含んでい
る第一および第二の核酸様オリゴマー間の正確な対形成または配列相補性を指し
ている。例えば、もし第一の核酸のある部分の核酸塩基が第二の核酸の同じ位置
の核酸塩基と水素結合できるとしたら、第一の核酸および第二の核酸はその位置
でお互いに相補的であると考えられる。各々の分子中の十分な数の対応する位置
が、お互いに水素結合できる核酸塩基で占められている場合第一および第二の核
酸はお互いに相補的である。”特異的にハイブリダイズ可能”および”相補性”
とは本発明の化合物および標的ＲＮＡ分子間で安定でおよび特異的な結合が起こ
るように、十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。本発明のオ
リゴマー化合物は特異的にハイブリダイズ可能であるその標的ＲＮＡ配列と１０
０％相補的である必要はないことを理解されたい。標的ＲＮＡ分子へオリゴマー
化合物が結合した場合に標的ＲＮＡの正常の機能の邪魔をして有用性の損失を起
こす場合、および特異的結合が望まれる条件下（即ち、インビボアッセイまたは
治療的処置の場合の生理学的条件下、またはインビトロアッセイの場合のアッセ
イが実施される条件下）、非標的配列へのオリゴマー化合物の非特異的結合を避
けるのに十分な程度の相補性が存在する場合、オリゴマー化合物は特異的にハイ
ブリダイズ可能である。

【００８８】 本発明のオリゴヌクレオチドは診断薬、治療薬および研究試薬及びキットなど
で使用できる。それらは適した医薬として受容可能な希釈剤または担体を含ませ
ることにより医薬組成物で使用できる。さらに望まれない蛋白質産生により特徴
付けられる疾患を持つ生物体を処置するためにも使用できる。生物体は望まれな
い蛋白質をコードしている核酸鎖と特異的にハイブリダイズできる配列を持って
いるオリゴヌクレオチドと接触させなければならない。この型の処置は単細胞原
核生物および真核生物体から多細胞真核生物体の範囲の種々の生物体で実施でき
る。ＤＮＡ−ＲＮＡ転写またはＲＮＡ−蛋白質翻訳をその遺伝、代謝または細胞
調節の基本的部分として利用している生物体は本発明に従った治療的および／ま
たは予防的処置に感受性がある。表面上、細菌、酵母、原虫、藻類、すべての植
物およびすべての高等動物形（温血動物を含んで）のような種々の生物体が処置
できる。さらに、多細胞真核生物の各々の細胞は、その細胞活性の必須の部分と
してＤＮＡ−ＲＮＡ転写およびＲＮＡ−蛋白質翻訳の両方を含んでいるので処理
可能である。さらに、真核生物細胞の多くの細胞内器官（例えば、ミトコンドリ
アおよびクロロプラスト）もまた転写および翻訳機構を含んでいる。従って、単
一細胞、細胞集団または細胞内小器官もまた、治療的または診断的オリゴヌクレ
オチドで処置できる生物体の定義に含むことができるであろう。

【００８９】 本発明の化合物のためのいくつかの代表的治療的指示およびその他の使用は以
下のようである： 特に興味を持たれる一つの治療的指示は乾癬である。乾癬は乾燥、充分な限局
性、銀白色、丘疹のはがれ、種々のサイズの溶菌斑で特徴付けられる普通の慢性
および再発性疾患である。本疾患はわずかな病変から手足などをきかなくなる関
節炎または表皮剥脱を含む広く拡がった皮膚病までの重度で変化する。乾癬の最
終的な原因は解っていないが、生じる厚い剥離は多分増加した表皮細胞増殖に依
るものであろう（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉ ｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ，１５ｔｈ Ｅｄ．，ｐｐ．２２８３−２２８５，
Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９８７）
。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の阻害剤がインビトロにおいて抗増殖および
抗炎症効果の両方を持っていることが示されている。シクロスポリンＡおよびア
ントラリンのようないくつかの抗乾癬薬がＰＫＣを阻害することが示されており
、およびＰＫＣの阻害が乾癬を処置するための治療法として示唆されている（Ｈ
ｅｇｅｍａｎｎ，Ｌ．ａｎｄ Ｇ．Ｍａｈｒｌｅ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｋｉｎ ，Ｈ．Ｍｕｋｈｔａｒ，ｅｄ．，ｐｐ．３５７−３６８
，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９２）。プロテイン
キナーゼＣ（ＰＫＣ）蛋白質を標的としたアンチセンス化合物がＣｏｏｋらによ
る米国特許第５，６２０，９６３号およびＢｏｇｇｓらによる米国特許第５，６
８１，７４７号に説明されている。

【００９０】 興味ある別の型の治療的指示は皮膚の炎症性障害である。これらは例えば、扁
平苔癬、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、多形性紅斑などを含む種々の形で起こる
（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔ ｈｅｒａｐｙ ，１５ｔｈ Ｅｄ．，ｐｐ．２２８６−２２９２，Ｂｅｒｋｏｗ
ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９８７）。ＩＣＡＭ−１
の発現が、アレルギー性接触皮膚炎、固定薬剤発疹、扁平苔癬および乾癬のよう
な種々の炎症性皮膚障害に関連している（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ａｃ ａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ ．，１９９０，２２，６４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ
ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９８９，１３５，１０４５；Ｌｉ
ｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９８９，１２０，４
７９；Ｓｈｉｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９
８９．１２５，１３７１；Ｒｅｇｅｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ． Ｏｒａｌ Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ ．，１９９６，８１，６８２）。さ
らに、ＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の腹腔内投与はマウスにおいて
皮膚へのオブアルブミン誘導好酸球浸潤を減少させた（Ｈａｋｕｇａｗａ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９７，２４，７３）。ＩＣＡＭ−１を
標的とするアンチセンス化合物が米国特許第５，５１４，７８８および５，５９
１，６２３号および１９９８年１月２０日および１９９８年４月１７日に出願さ
れた各々同時係属中の米国特許出願番号０９／００９，４９０および０９／０６
２，４１６（すべてＢｅｎｎｅｔｔ ｅｔ．ａｌ．，による）に記載されている
。

【００９１】 皮膚炎症性障害のための別のアンチセンス標的はＶＣＡＭ−１およびＰＥＣＡ
Ｍ−１である。ＶＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の腹腔内投与はマウス
において皮膚へのオブアルブミン誘導好酸球浸潤を減少させた（Ｈａｋｕｇａｗ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９７，２４，７３）。ＶＣＡ
Ｍ−１を標的とするアンチセンス化合物が米国特許第５，５１４，７８８および
５，５９１，６２３号に記載されている。ＰＥＣＡＭ−１蛋白質は糖蛋白質であ
り、種々の細胞型の表面上に発現されている（総説として、Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ．，１９９７，９９，３およびＤｅＬｉｓｓｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１９９４，１５，４９０を参照された
い）。細胞−細胞相互作用での直接的関与に加え、ＰＥＣＡＭ−１はまた明らか
に細胞性相互作用に関与する他の分子の活性および／または発現を制御し（Ｌｉ
ｔｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９７，１３９，２１
９）、およびいくつかの細胞−細胞相互作用の鍵となるメディエーターである。
ＰＥＣＡＭ−１を標的とするアンチセンス化合物はＢｅｎｎｅｔｔ ｅｔ．ａｌ
．，により１９９８年３月１９日に出願された同時係属中の米国特許出願番号０
９／０４４，５０６に記載されている。

【００９２】 オリゴヌクレオチドの興味ある別の型の治療的指示には皮膚の種々の癌が含ま
れる。代表的な皮膚癌には良性腫瘍（いぼ、黒あざなど）および例えば、基底細
胞癌腫、扁平上皮癌、悪性メラノーマ、ページェット病、カポジ肉腫などのよう
な悪性腫瘍が含まれる（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎ ｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ，１５ｔｈ Ｅｄ．，ｐｐ．２３０１−２３
１０，Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９
８７）。腫瘍発生、過増殖状態の維持および転移に関与している多数の分子標的
が、皮膚癌を防止または阻害するため、または他の組織へ拡がることを防止する
ために標的化される。

【００９３】 ｒａｓ腫瘍遺伝子はグアニン結合蛋白質であり、例えば、一般にヒト腫瘍の約
３０％で活性化ｒａｓ腫瘍遺伝子が観察された事実から癌に関係があるとされて
いる；この数字は膵臓外分泌部の癌腫では１００％に達している（総説としてＤ
ｏｗｎｗａｒｄ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，１９９０，１５，
４６９を参照されたい）。Ｈ−ｒａｓおよびＫ−ｒａｓを標的としたアンチセン
ス化合物がＬｉｍａらによる米国特許第５，５８２，９７２号、Ｍｏｎｉａらに
よる５，５８２，９８６号およびＣｏｏｋらによる５，６６１，１３４号、およ
び公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／０８００３、に記載されている。

【００９４】 プロテインキナーゼ（ＰＫＣ）蛋白質もまた腫瘍発生に関係するとされている
。プロテインキナーゼ（ＰＫＣ）蛋白質を標的としたアンチセンス化合物がＣｏ
ｏｋらによる米国特許第５，６２０，９６３およびＢｏｇｇｓらによる５，６８
１，７４７号に記載されている。また興味を持たれるのは特に、腫瘍発生および
転移における役割に関係してＡＰ−１サブユニットおよびＪＮＫ蛋白質である。
転移の過程には一連の出来事が含まれている（１）癌細胞がその細胞外マトリッ
クスから離れる、（２）離れた癌細胞がしばしば循環系を経て動物の体の別の部
分に移動する、および（３）遠位および不適当な細胞外マトリックスへ結合し、
それにより細胞増殖巣を作りだし、そこから第二の腫瘍が生じうる。正常細胞は
侵襲または転移能力を持っておらず、もしそのようなことが起こればアポトーシ
ス（プログラムされた細胞死）を受ける（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｓｃｉ．Ａｍｅ
ｒ．，１９９６，２７５，７２）。しかしながら、多くのヒト腫瘍は一つまたは
それ以上のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の上昇したレベルの活
性を持っている（Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ．，１９９３，９，５４１；Ｂｅｒｎｈａｒｄ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），
１９９４，９１， ４２９３）。ＭＭＰは細胞外マトリックスの成分を分解する
能力を持っている酵素のファミリーである（Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ．Ｂｉｏｌ ．，１９９５，７，７２８）。特に、このファ
ミリーの一つの構成酵素、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９
）はしばしば腫瘍および他の疾患組織のみで発現されているのが観察されている
（Ｈｉｍｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖａｓｉｏｎ ＆ Ｍｅｔａｓｔ ａｓｉｓ ，１９９４，１４，２４６）。

【００９５】 いくつかの研究はＭＭＰ−９遺伝子の制御がＡＰ−１転写因子により調節され
るであろうことを示している（Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９
８８，２４２，１２４２；Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９０，６１
，２６７；Ｇｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７
１，１０６７２；Ｈｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９６，
５６，５２７９）。ＡＰ−１機能の阻害はＭＭＰ−９発現を弱くすることが示さ
れた（米国特許出願番号０８／８３７，２０１）。ＡＰ−１は二つのサブユニッ
トを持つヘテロ二量体タンパク質であり、ｆｏｓおよびｊｕｎの遺伝子産物であ
る。ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎを標的化したアンチセンス化合物はＤｅａｎ
ｅｔ．ａｌ．，により１９９７年３月１４日に出願された同時係属中の米国特許
出願番号０８／８３７，２０１に記載されている。

【００９６】 さらに、ＡＰ−１はある種の環境下、Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）によ
りＪｕｎサブユニットのアミノ末端位のリン酸化によりそれ自身が活性化される
。従って、一つまたはそれ以上のＪＮＫの阻害はＡＰ−１活性の減少を生じるこ
とが期待され、その結果としてＭＭＰ発現を減少させる。ＪＮＫを標的化したア
ンチセンス化合物はＤｅａｎ ｅｔ ａｌ．、により１９９７年８月１３日に出
願された同時係属中の米国特許出願番号０８／９１０，６２９に記載されている
。

【００９７】 皮膚の感染性疾患はウイルス、細菌または真菌因子により起こされる。ライム
病の場合、そのダニ媒介原因因子、スピロヘータ ボレリア ブルグドルフェリ 、はインビトロにおいて内皮細胞上のＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＥＬＡ
Ｍ−１の発現を上方制御する（Ｂｏｇｇｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ．Ｃｏｍｍ ．，１９９４，２，１４５）。さらに、抗炎症剤プレド
ニゾロンによる疾患の仲介は一部この接着分子の上方制御の仲介によることが提
案されている（Ｈｕｒｔｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｐｈａｒｍａｃ ．，１９９６，１８，２８１）。従って、ライム病の治療的仲
介（または予防）のための可能性のある標的にはＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１お
よびＥＬＡＭ−１が含まれる（上記文献）。

【００９８】 本発明の組成物および方法を使用して治療に扱いやすい皮膚の他の感染性疾患
には細菌、ウイルスまたは真菌因子の感染により生じる障害が含まれる（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａ ｐｙ ，１５ｔｈ Ｅｄ．，ｐｐ．２２６３−２２７７，Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａ
ｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９８７）。真菌因子によリ起こさ
れる皮膚の感染に関して、米国特許第５，６９１ ，４６１号はカンジダ アル ビカンス の増殖を阻害するアンチセンス化合物を提供している。

【００９９】 ウイルス因子によリ起こされる皮膚の感染に関して、米国特許第５，１６６，
１９５、５，５２３，３８９および５，５９１，６００号はヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）のオリゴヌクレオチド阻害剤を提供している。米国特許第５，００
４，８１０号はヘルペス単純ウイルスＶｍｗ６５ ｍＲＮＡへハイブリダイズで
きその複製を阻害するオリゴマーを提供している。米国特許第５，１９４，４２
８および５，５８０，７６７号はインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活
性を持っているアンチセンス化合物を提供している。米国特許第４，８０６，４
６３号はＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製を阻害するアンチセンス化合物およびそれらを用
いる方法を提供している。米国特許第４，６８９，３２０、５，４４２，０４９
、５，５９１，７２０および５，６０７，９２３号はサイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）に特異的な抗ウイルス剤としてのアンチセンス化合物に関している。米国
特許第５，２４２，９０６号は潜在性エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）
感染の処置に有用なアンチセンス化合物を提供している。米国特許第５，２４８
，６７０、５，５１４，５７７または５，６５８，８９１号はヘルペスウイルス
感染の処置に有用なアンチセンス化合物を提供している。米国特許第５，４５７
，１８９および５，６８１，９４４号はパピローマウイルス感染の処置に有用な
アンチセンス化合物を提供している。これらの特許（本明細書において援用され
る）に開示されているアンチセンス化合物は示された病原性因子により起こされ
るまたは悪化される疾患からの予防的、軽減的または治療的救済を達成するため
に本発明の組成物と使用されるであろう。

【０１００】 本発明の組成物で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、疾患に対す
る体の性質、機能および種々の遺伝子成分の潜在的関係または動物の体の状態を
決定するためにも使用されるであろう。従来、遺伝子の機能は主として遺伝子中
に機能を失った突然変異の構築により（即ち”ノックアウト”突然変異）動物で
試験されてきた（例えば、トランスジェニックマウス）。そのような仕事は困難
であり、時間がかかりおよび動物発生に必須な遺伝子では”ノックアウト”突然
変異は致死的表現型を生み出すので達成できなかった。さらに、機能を失った表
現型は動物の生活環の特定の部分または疾患状態の間に一時的に導入できない；
”ノックアウト”突然変異は常に存在する。”アンチセンスノックアウト”即ち
、直接的な遺伝子操作というよりもむしろアンチセンスオリゴヌクレオチドによ
る遺伝子発現の選択的調節は、これらの制限（例えば、Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｓ，１９９４，１５，２５０）を克服している。加えて、いくつかの遺伝子は別
のスプライシングのような過程の結果として種々のｍＲＮＡ転写体を産生する；
”ノックアウト”突然変異は典型的にはそのような遺伝子により産生されるすべ
ての形のｍＲＮＡ転写体を除去し、従って、特定のｍＲＮＡ転写体の生物学的役
割を試験するために使用できない。アンチセンスオリゴヌクレオチドが神経死に
おけるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプターの役割を研究するためにラッ
トに、プロテインキナーゼＣ−ａの生物学的役割を調べるためにマウスに、およ
び不安における神経ペプチドＹ１レセプター役割を試験するためにラットに全身
投与された（各々Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９
３，３６３：２６０；Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ．，１９９４，９１：１１７６２；およびＷａｈｌｅｓｔ
ｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２５９：５２８）。関連す
る蛋白質の複雑なファミリーが研究されている例では、”アンチセンスノックア
ウト”（即ち、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身投与による遺伝子の阻害
）はファミリーの特定のメンバーを調べるための最も正確な手段であろう（一般
的には、Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓ ｃｉ ．，１９９４，１５，２５０を参照されたい）。オリゴヌクレオチドおよび
その他の核酸の単純な非非経口送達のための組成物および方法を提供することに
より、本発明はこれらおよびその他の欠点を克服する。

【０１０１】 本発明のオリゴヌクレオチドを含んでいる治療または医薬組成物の投与は当業
者にまかせられると思われる。一般には、治療または予防を必要としている患者
に、通常医薬として受容可能な担体と一緒に、患者の年齢および処置されている
障害または疾患状態の重度に依存して、体重ｋｇ当たり０．０１μｇから１００
ｇの用量範囲で本発明の化合物を含んでいる組成物が投与される。投与量は処置
すべき疾患状態の重度および応答性に依存して、数日から数ヶ月続く処置過程の
、または治癒が達成されるまでまたは疾患状態の軽減または防止が達成されるま
で続く。最適投与計画は患者体内の薬剤蓄積の測定から計算できる。当業者は容
易に最適投与量、投与方法および反復率を決定できる。最適投与量は個々のアン
チセンス化合物の相対的効力に依存して変化するであろうし、一般的にはインビ
トロおよびインビボ動物モデルで達成されたＥＣ₅₀に基づいて見積もることがで
きる。

【０１０２】 本発明の文脈において、用語”処置計画”とは本発明の一つまたはそれ以上の
組成物の投与による治療的、軽減的および予防的療法を包含している。特別の処
置計画は、特定の疾患または障害の質、その重度および患者の全体的状態に依存
して変化するであろう期間継続され、１日１回から２０年毎に１回までの範囲で
あろう。処置に続いて、患者はその状態の変化、障害または疾患状態の徴候の軽
減がモニターされる。組成物の投与量は、患者が現在の投与量レベルに有意に応
答していなければ増加させ、もし障害または疾患状態の徴候の軽減が観察される
と、またはもし障害または疾患状態がなくなると投与量を減少させる。

【０１０３】 最適投与スケジュールが本発明のオリゴヌクレオチドの治療的有効量を送達す
るように使用される。本発明の目的のためには、用語”治療的有効量”とは望ま
しくない副作用を起こさず（毒性、刺激またはアレルギー性応答）に意図する目
的を達成するのに有効なオリゴヌクレオチド含有医薬組成物量を意味している。
個々の必要量は変化するけれども、医薬組成物有効量の最適範囲の決定は当業者
が行えるであろう。ヒト投与量は動物研究から外挿できる（Ｋａｔｏｃｓ ｅｔ
ａｌ．，２７章：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ，１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ，編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０）。一般的には、医薬組成物の有
効量を提供するために必要な投与量は（当業者が調節できる）、年齢、健康状態
、身体状態、体重、受容者の疾患または障害の型および程度、処置の頻度、同時
に行う治療の性質（もしあれば）および望まれる効果（単数又は複数）の質およ
び範囲に依存して変化するであろう（Ｎｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，３章：Ｇｏｏｄ ｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂ ａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ，９版，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，編，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９６）。

【０１０４】 処置が成功した後、疾患状態の再発を防止するために患者は維持治療を受ける
のが望ましく、そこでは体重ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇの投与量範囲
で、１日１回から２０年毎に１回まで、生物活性薬剤が維持投与量で投与される
。例えば、自己免疫または炎症状態になりやすいことが解っているまたは疑われ
る個体の場合、体重ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇの投与量範囲で、１日
１回から２０年毎に１回まで、予防的投与量の投与により予防効果が達成される
であろう。同様の様式で、いくつかの医学処置、例えば、細胞、組織または器官
の個体内への移植により生じる移植片対宿主疾患、の結果として起こることが予
測される炎症状態へなりにくい個体にする。

【０１０５】 高危険性個体のための予防的療法もまた本発明に包含されている。本明細書で
使用される場合、用語”高危険性個体”とは、例えば、個人のまたは家族の歴史
または遺伝子試験により、疾患または障害の発生または再発を起こしやすい可能
性が正常よりも有意に高いことが決定されている個体を意味している。例えば、
実験動物は、特定の疾患または障害の頻繁な発生を含む個体および／または家族
歴史を持つことができる。別の例としては、実験動物は本分野で知られている技
術に従った遺伝子スクリーニングにより決定されたそのような感受性を持ってい
る可能性がある（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，５章：Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｎｉ
ｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｏｒｋｐｌａｃ
ｅ，ＯＴＡ−ＢＡ−４５５，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ
Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９０，ページ７５−９
９）。高危険性個体の処置計画の一部として、個体は疾患または障害の発生また
は再発を防ぐため、予防的に処置できる。用語”予防的有効量”とは、疾患また
は障害の発生または再発の防止が観察される効果を生み出す医薬組成物の量を示
すことを意味している。医薬組成物の予防的有効量は典型的には、その効果を活
性成分が欠けた第二の医薬組成物を同様の状態の個体に投与した場合に観察され
た効果と比較して決定される。

【０１０６】 治療的使用のためには、いくつかの蛋白質により調節された疾患を患っている
動物へオリゴヌクレオチド類似体が投与される。そのような疾患を患っていると
疑われる患者にその疾患の総体的徴候を減少させるのに有効であるオリゴヌクレ
オチド類似体量を投与するのが好適である。当業者はそのような処置計画のため
の最適投与量および処置スケジュールを決定できる。

【０１０７】 蛋白質により調節された疾患での使用では、その形成または活性が調節される
べき蛋白質をコード化しているＤＮＡまたはＲＮＡの一部が標的化される。用い
られるべき組成物の標的化部分は、それ故、前もって選択されたＤＮＡまたはＲ
ＮＡの一部と相補的であるように選択され、その部分のためのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドであるべきである。

【０１０８】 本発明に従った治療薬は経口、静脈内、筋肉内のように内部に投与されるのが
一般的に好適である。経皮、局所または病巣内のような他の形の投与もまた有用
である。座剤への封入も有用であろう。医薬として受容可能な担体もまたいくつ
かの態様で好適である。

【０１０９】 本発明はまた研究および診断目的のためのＲＮＡの選択的結合法にも関してお
り、そこでは酵素的ＲＮａｓｅＨ切断を利用して鎖切断を達成するのが有用であ
り、結合親和性および／またはヌクレアーゼ耐性の調節が同時に達成される。そ
のような選択性はそのようなＲＮＡまたはＤＮＡと、分解性ヌクレアーゼに耐性
でありおよび既知のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体よりも
強くおよびより高い適合度でハイブリダイズする本発明の組成物と相互作用させ
ることにより達成される。

【０１１０】 本発明に従ったオリゴヌクレオチドは溶液中でまたは固相反応により、例えば
、本発明に従ったヌクレオシド、ホスホロアミダイトおよび誘導体化制御孔ガラ
ス（ＣＰＧ）および／または標準ヌクレオチド前駆体を利用して適したＤＮＡ合
成機で組み立てることができる。本発明の新規修飾を含んだヌクレオシドに加え
、オリゴヌクレオチド内の他のヌクレオシドはさらに２’位に他の修飾を持つよ
うにさらに修飾してもよい。そのような追加の修飾を形成するために使用される
前駆体ヌクレオシドおよびヌクレオチド前駆体は２’かまたは３’位に置換基を
持っているであろう。そのような前駆体は少なくとも１つの遊離の２’または３
’ヒドロキシル基を持っている適切に保護されたヌクレオシドを、アルコキシア
ルキルハライド、アルコキシアルキルスルホナート、ヒドロキシアルキルハライ
ド、ヒドロキシアルキルスルホナート、アミノアルキルハライド、アミノアルキ
ルスルホナート、フタールイミドアルキルハライド、フタールイミドアルキルス
ルホナート、アルキルアミノアルキルハライド、アルキルアミノアルキルスルホ
ナート、ジアルキルアミノアルキルハライド、ジアルキルアミノアルキルスルホ
ナート、ジアルキルアミノオキシアルキルハライド、ジアルキルアミノオキシア
ルキルスルホナート、およびその適切な保護体のような（これらに限定されるわ
けではない）適切なアルキル化剤と反応させることにより本発明に従って合成さ
れる。アルキル化反応に使用された好適なハライドには塩素、臭素、フッ素およ
びヨウ素が含まれる。アルキル化反応に使用された好適なスルホナート脱離基に
はベンゼンスルホナート、メチルスルホナート、トシラート、ｐ−ブロモベンゼ
ンスルホナート、トリフラート、トリフルオロエチルスルホナート、および（２
，４−ジニトロアニリノ）ベンゼンスルホナートが含まれる（これらに限定され
るわけではない）。

【０１１１】 適切に保護されたヌクレオシドは既知の技術に従ってオリゴヌクレオチドへ組
み立てることができる。例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ ，１９９２，４８，２２２３、を参照されたい。

【０１１２】 相補標的鎖に結合するオリゴヌクレオチドの能力は、オリゴヌクレオチドおよ
びその相補鎖とのハイブリダイゼーション複合体の融解温度（Ｔ_m）を決定する
ことにより比較される。融解温度（Ｔ_m）、二重らせんの特徴的物理特性、は５
０％らせん（ハイブリダイズした）対コイル（ハイブリダイズしていない）形が
存在する温度（摂氏度で）を意味している。Ｔ_mはハイブリダイゼーション複合
体の形成および分解（融解）を決定するためにＵＶスペクトルを使用して測定さ
れる。ハイブリダイゼーション間に起こる塩基積み重ねはＵＶ吸収の減少（淡色
効果）を伴っている。従って、ＵＶ吸収の減少はより高いＴ_mを示している。Ｔ_m がより高いと鎖間の結合の強度がより強い。多数の核酸修飾の構造−安定性相関
が概説されている（Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ，１９９７，２５，４４２９−４４３）。

【０１１３】 本発明のオリゴヌクレオチドの相対結合能力が文献（Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ
Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５，
４４２９−４４３）に記載されているプロトコールを使用して決定された。典型
的吸収対温度曲線は、４μＭオリゴヌクレオチドを含む１００ｍＭ Ｎａ⁺、１
０ｍＭリン酸、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、および４μＭ相補的、長さ一致ＲＮＡを
含んでいる試料を使用して決定された。

【０１１４】 オリゴヌクレオチドのインビボ安定性は、オリゴヌクレオチド治療薬の開発で
考慮すべき重要な因子である。ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼおよびその
他の酵素による分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性が決定される。本発明の
オリゴヌクレオチド安定性の典型的なインビボ評価は、５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌ
クレオチドのリン酸緩衝化生理食塩液を１回量でＢＡＬＢ／ｃマウスに投与する
ことにより実施される。投与後、特定の時間間隔で血液を採取し、循環系に残っ
ている無傷のオリゴヌクレオチド量および分解生成物の性質を決定するためにＨ
ＰＬＣおよびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）で分析する。

【０１１５】 本発明に従ったヘテロ環式塩基には天然に存在するおよび天然には存在しない
核酸塩基およびヘテロ環式の両方が含まれる。代表的なリストにはアデニン、グ
アニン、シトシン、ウリジン、およびチミン、ならびにキサンチン、ヒポキサン
チン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他
のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアル
キル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンお
よびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ
、オキサ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置
換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシ
ルおよびシトシン、７−メチルグアニンのような他の合成および天然の核酸塩基
が含まれる。さらに別のヘテロ環式塩基には米国特許第３，６８７，８０８号に
記載されているもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏ ｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ，ページ８５８
−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，編．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，１９９０に記載されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅ ｄｉｔｉｏｎ １９９１，３０，６１３に記載されているものが含まれる。

【０１１６】 本発明の追加の目的、利点および新規特色は以下の、制限は意図されていない
実施例に従った試験により当業者には明らかになるであろう。すべてのオリゴヌ
クレオチドは左から右へ標準の５’から３’で掲げられている。

【０１１７】 実施例１ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（メトキシエチル）−５−メチルウリジンと５’
−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン ２’，３’−Ｏ−ジブチルスタニレン ５−メチルウリジン（３４５ｇ）（Ｗ
ａｇｎｅｒ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７４，３９，２４に従って製造）
を７０℃においてＤＭＦ（３Ｌ）中、テトラブチルアンモニウムヨージド（２３
５ｇ）の存在下で２−メトキシエチルブロミド（１９６ｇ）によってアルキル化
して、ほぼ１：１の異性体比率で２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチ
ルウリジンと３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジンとの混合
物（１５０ｇ）を得た。この混合物をピリジン（１Ｌ）中のＤＭＴクロリド（１
１０ｇ，ＤＭＴ−Ｃｌ）によって処理して、５’−Ｏ−ＤＭＴ−ヌクレオシドの
混合物を得た。標準的な仕上げ処理後に、異性体をシリカゲルカラム・クロマト
グラフィーによって分離した。２’−異性体が最初に溶出し、次に３’−異性体
が溶出した。

【０１１８】 実施例２ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン−
２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン
（５ｇ，０．００８ｍｏｌ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍｌ）中に溶解して、この溶液
に、アルゴン下で、ジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．４１５ｇ）と２−
シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（３．９ｍｌ）と
を加えた。この反応を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカカラムに供
給し、酢酸エチルによって溶出して、３．７５ｇの標題化合物を得た。

【０１１９】 実施例３ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ⁴−ベンゾイル−５
−メチル−シチジン ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン（
１５ｇ）を１５０ｍｌの無水ピリジンと４．５ｍｌの無水酢酸とによって、アル
ゴン下で、処理し、一晩撹拌した。ピリジンを蒸発させ、残渣を２００ｍｌの飽
和ＮａＨＣＯ₃溶液と２００ｍｌの酢酸エチルとに分配した。有機層を乾燥させ
（無水ＭｇＳＯ₄）、蒸発させて、１６ｇの２’−アセトキシ−５’−Ｏ−（Ｄ
ＭＴ）−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジンを得た。

【０１２０】 トリエチルアミン（５０ｍｌ）とアセトニトリル（１５０ｍｌ）中のトリアゾ
ール（１９．９ｇ）の氷冷溶液に、機械的に撹拌しながら、９ｍｌのＰＯＣｌ₃
を滴加した。添加後に、氷浴を除去し、混合物を３０分間撹拌した。２’−アセ
トキシ−５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチ
ルウリジン（５０ｍｌ ＣＨ₃ＣＮ中１６ｇ）を、受容フラスコを氷浴温度に維
持しながら、上記溶液に滴加した。２時間後に、ＴＬＣはより迅速に移動するヌ
クレオシド、Ｃ−４−トリアゾール誘導体を示した。反応フラスコを蒸発させ、
ヌクレオシドを酢酸エチル（５００ｍｌ）とＮａＨＣＯ₃（５００ｍｌ）とに分
配した。有機層を飽和ＮａＣｌ溶液によって洗浄し、乾燥させ（無水ＮｇＳＯ₄
）、蒸発させて、１５ｇのＣ−４−トリアゾール・ヌクレオシドを得た。次に、
この化合物をＮＨ₄ＯＨ／ジオキサン（１００ｍｌ：２００ｍｌ）の２：１混合
物中に溶解し、一晩撹拌した。ＴＬＣは出発物質の消失を示した。この溶液を蒸
発させて、メタノール中に溶解して、９．６ｇの５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−３’−
Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジンを析出させた。

【０１２１】 ５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチ
ジン（９．６ｇ，０．０１５ｍｏｌ）を５０ｍｌのＤＭＦ中に溶解して、７．３
７ｇの無水安息香酸によって処理した。２４時間撹拌した後に、ＤＭＦを蒸発さ
せ、残渣をシリカカラムに負荷し、１：１ヘキサン：酢酸エチルによって溶出し
て、所望のヌクレオシドを得た。

【０１２２】 実施例４ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ⁴−ベンゾイル−５
−メチル−シチジン−２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル
）ホスホロアミダイト 上記ヌクレオシドから、対応メチル−ウリジン誘導体に関して述べたホスフィ
チル化プロトコール(phosphitylation protocol)を用いて、５’−Ｏ−ＤＭＴ−
３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ⁴−ベンゾイル−５−メチル−シチジン
−２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイ
トを得た。

【０１２３】 実施例５ Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）
アデノシン ５℃の乾燥ジメチルホルムアミド（８００ｍｌ）中のアデノシン（４２．７４
ｇ，０．１６ｍｏｌ）の溶液を水素化ナトリウム（８．２４ｇ，ヘキサンによっ
て予め３回洗浄した油中６０％，０．２１ｍｏｌ）によって処理した。３０分間
撹拌した後に、２−メトキシエチルブロミド（０．１６ｍｏｌ）を２０分間にわ
たって加えた。反応を５℃において８時間撹拌してから、Ｃｅｌｉｔｅに通して
濾過した。濾液を減圧下で濃縮した後に、トルエン（２ｘ１００ｍｌ）と共に共
沸蒸発させた(coevaporated)。残渣をシリカゲル（１００ｇ）に吸着させ、クロ
マトグラフィーした（８００ｇ，クロロホルム−メタノール９：１４：１）。選
択した画分を減圧下で濃縮した、残渣は２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）アデ
ノシンと３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）アデノシンとの４：１の比率での混
合物であった。

【０１２４】 ピリジン（１００ｍｌ）中の上記混合物（０．０５６ｍｏｌ）を減圧下で蒸発
乾燥させた。残渣をピリジン（５６０ｍｌ）中に再溶解し、氷水浴中で冷却した
。塩化トリメチルシリル（３６．４ｍｌ，０．２９１ｍｏｌ）を加え、反応を５
℃において３０分間撹拌した。塩化ベンゾイル（３３．６ｍｌ，０．２９１ｍｏ
ｌ）を加えて、反応を２５℃に２時間温度上昇させ、次に５℃に冷却した。反応
を冷水（１１２ｍｌ）によって希釈し、１５分間撹拌した後に、濃水酸化アンモ
ニウム（１１２ｍｌ）を加えた。３０分間後に、反応を減圧下で濃縮し（３０℃
未満）、次にトルエン（２ｘ１００ｍｌ）と共に共沸蒸発させた。残渣を酢酸エ
チル−メタノール（４００ｍｌ，９：１）中に溶解し、望ましくないシリル副生
成物を濾過によって除去した。濾液を減圧下で濃縮してから、シリカゲル（８０
０ｇ，クロロホルム−メタノール９：１）上でクロマトグラフィーした。選択し
た画分を一緒にし、減圧下で濃縮して、２５℃／０．２ｍｍＨｇにおいて２時間
乾燥させて、純粋なＮ⁶−ベンゾイル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）アデ
ノシンと純粋なＮ⁶−ベンゾイル−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）アデノシ
ンとを得た。

【０１２５】 ピリジン（１００ｍｌ）中のＮ⁶−ベンゾイル−３’−Ｏ−（２−メトキシエ
チル）アデノシン（１１．０ｇ，０．２８５ｍｏｌ）の溶液を減圧下で蒸発させ
て、油状物を得た。残渣を乾燥ピリジン（３００ｍｌ）中に再溶解し、ＤＭＴ−
Ｃｌ（１０．９ｇ，９５％，０．３１ｍｏｌ）を加えた。この混合物を２５℃に
おいて１６時間撹拌してから、氷水（５００ｍｌ）中の炭酸水素ナトリウム（２
０ｇ）の溶液上に注入した。生成物を酢酸エチル（２ｘ１５０ｍｌ）によって抽
出した。有機層をブライン（５０ｍｌ）によって洗浄し、硫酸ナトリウム（粉状
）上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた（４０℃未満）。残渣をシリカゲル（４０
０ｇ，酢酸エチル−アセトニトリル−トリエチルアミン９９：１：１９５：５：
１）上でクロマトグラフィーした。選択した画分を一緒にし、減圧下で濃縮し、
２５℃／０．２ｍｍＨｇにおいて乾燥させて、１６．８ｇ（７３％）の標題化合
物を泡状物として得た。ＴＬＣは均質であった。

【０１２６】 実施例６ ［Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル
）アデノシン−２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホス
ホロアミダイト 実施例５の標題化合物から出発することによって、実施例２及び４の５−メチ
ル−シチジン及び５−メチルウリジン類似体と同様な方法で標題化合物を製造し
た。クロマトグラフィー溶離剤として酢酸エチル−ヘキサン−トリエチルアミン
（５９：４０：１）を用いた精製は６７％収率の標題化合物を固体泡状物として
生成した。ＴＬＣは均質であった。³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，Ｈ₃ＰＯ₄ｓｔｄ
．）δ１４７．８９；１４８．３６（ジアステレオマー）。

【０１２７】 実施例７ ５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−Ｎ²−イソブチリル−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル
）グアノシン Ａ．２，６−ジアミノプリンリボシド ２Ｌステンレス鋼Ｐａｒｒボンベに、グアノシン水和物（１００ｇ，０．３５
ｍｏｌ，Ａｌｄｒｉｃｈ）と、ヘキサメチルジシラザン（３２０ｍｌ，１．５２
ｍｏｌ，４．４当量）と、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（
８．２ｍｌ）と、トルエン（３５０ｍｌ）とを加えた。このボンベをシールし、
油浴（１７０℃；内部Ｔ １５０℃；１５０ｐｓｉ）中に５日間部分的に沈めた
。ボンベをドライアイス／アセトン浴中で冷却して、開けた。内容物をメタノー
ル（３００ｍｌ）によってフラスコに移し、溶媒を減圧下で蒸発させた。水性メ
タノール（５０％，１．２Ｌ）を加えた。生じた褐色懸濁液を５時間加熱還流さ
せた。メタノールの大部分を除去するために、懸濁液を減圧下で１／２量まで濃
縮した。水（６００ｍｌ）を加え、溶液を加熱還流させ、木炭(charcoal)（５ｇ
）によって処理し、高温状態でＣｅｌｉｔｅに通して濾過した。溶液を２５℃に
冷却させた。生じた沈殿を回収して、水（２００ｍｌ）によって洗浄し、９０℃
／０．２ｍｍＨｇにおいて５時間乾燥させて、８７．４ｇ（８９％）の黄褐色、
結晶質固体の一定重量に達した；ｍｐ ２４７℃（収縮），２５５℃（実際に分
解(dec,lit.)，（１）ｍｐ ２５０−２５２℃）；ＴＬＣ均質（Ｒｆ０．５０，
イソプロパノール−水酸化アンモニウム−水１６：３：１）；ＰＭＲ（ＤＭＳＯ
），δ５．７３（ｄ，２，２−ＮＨ₂），５．７８（ｓ，１，Ｈ−１），６．８
３（ｂｒｓ，２，６−ＮＨ₂）． Ｂ．２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−２，６−ジアミノプリンリボシドと
３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−２，６−ジアミノプリンリボシド アルゴン雰囲気下、０℃の乾燥ジメチルホルムアミド（３５０ｍｌ）中の２，
６−ジアミノプリンリボシド（１０．０ｇ，０．０３５ｍｏｌ）の溶液に、水素
化ナトリウム（油中６０％，１．６ｇ，０．０４ｍｏｌ）を加えた。３０分間後
に、２−メトキシエチルブロミド（０．４４ｍｏｌ）を１度に加え、反応を２５
℃において１６時間撹拌した。メタノール（１０ｍｌ）を加え、混合物を減圧下
で濃縮して、油状物（２０ｇ）を得た。４：１の比率の２’／３’異性体を含有
する粗生成物をシリカゲル（５００ｇ，クロロホルム−メタノール ４：１）上
でクロマトグラフィーした。適当な画分を一緒にして、減圧下で濃縮して、半固
体（１２ｇ）を得た。これにメタノール（５０ｍｌ）を加えて磨砕して、白色吸
湿性固体を得た。この固体を４０℃／０．２ｍｍＨｇにおいて６時間乾燥させて
、純粋な２’生成物と純粋な３’異性体とを得て、これらをＮＭＲによって確認
した。

【０１２８】 Ｃ．３’−Ｏ−２−（メトキシエチル）グアノシン 迅速に撹拌しながら、３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−２，６−ジアミノ
プリンリボシド（０．０７８ｍｏｌ）を２５℃の一塩基性リン酸ナトリウム緩衝
液（０．１Ｍ，５２５ｍｌ，ｐＨ７．３−７．４）中に溶解した。アデノシンデ
アミナーゼ（ＳｉｇｍａタイプＩＩ，１単位／ｍｇ，３５０ｍｇ）を加えて、反
応を２５℃において６０時間撹拌した。混合物を５℃に冷却し、濾過した。固体
を水（２ｘ２５ｍｌ）によって洗浄し、６０℃／０．２ｍｍＨｇにおいて５時間
乾燥させて、１０．７ｇの第１回収物を得た。母液を減圧下で１２５ｍｌまで濃
縮し、５℃に冷却し、固体を回収し、冷水（２ｘ２０ｍｌ）によって洗浄し、上
記のように乾燥させることによって、第２回収物を得て、６．７ｇの付加的物質
を得て、総重量１５．４ｇ（グアノシン水和物から３１％）の淡黄褐色固体とし
た；ＴＬＣ純度９７％。

【０１２９】 Ｄ．Ｎ²−イソブチリル−３’−Ｏ−２−（メトキシエチル）グアノシン ピリジン（３００ｍｌ）中の３’−Ｏ−２−（メトキシエチル）グアノシン（
１８．１ｇ，０．０６１３ｍｏｌ）の溶液に、塩化トリメチルシリル（５０．４
ｍｌ，０．４６ｍｏｌ）を加えた。反応を２５℃において１６時間撹拌した。塩
化イソブチリル（３３．２ｍｌ，０．３１６ｍｏｌ）を加えて、反応を２５℃に
おいて４時間撹拌した。この反応を水（２５ｍｌ）によって希釈した。３０分間
撹拌した後に、水酸化アンモニウム（濃縮，４５ｍｌ）をｐＨ６に達するまで加
えた。この混合物を水浴中で３０分間撹拌してから、減圧下で蒸発させて、油状
物を得た。この油状物を酢酸エチル（６００ｍｌ）と水（１００ｍｌ）との混合
物中に溶液が形成されるまで懸濁させた。この溶液を２５℃において１７時間放
置した。生じた沈殿を回収し、酢酸エチル（２ｘ５０ｍｌ）によって洗浄し、６
０℃／０．２ｍｍＨｇにおいて５時間乾燥させて、１６．１ｇ（８５％）の黄褐
色固体を得た；ＴＬＣ純度９８％。

【０１３０】 Ｅ．５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−Ｎ²−イソブチリル−３’−Ｏ−（２−メトキシ
エチル）グアノシン ピリジン（１５０ｍｌ）中のＮ²−イソブチリル−３’−Ｏ−２−（メトキシ
エチル）グアノシン（０．０５１ｍｏｌ）の溶液を減圧下で蒸発乾燥させた。残
渣をピリジン（３００ｍｌ）中に再溶解して、１０〜１５℃に冷却した。ＤＭＴ
−Ｃｌ（２７．２ｇ，９５％，０．０８０ｍｏｌ）を加えて、反応を２５℃にお
いて１６時間撹拌した。この反応を減圧下で蒸発させて、油状物を得て、最少量
の塩化メチレン中に溶解して、シリカゲルカラム（５００ｇ）上に供給した。生
成物を塩化メチレン−トリエチルアミン（９９：１）から塩化メチレン−メタノ
ール−トリエチルアミン（９９：１：１）までの勾配によって溶出した。選択し
た画分を一緒にし、減圧下で濃縮して、４０℃／０．２ｍｍＨｇにおいて２時間
乾燥させて、１５ｇ（グアノシン水和物から１５．５％）の黄褐色泡状物を得た
；ＴＬＣ純度９８％。

【０１３１】 実施例８ ［５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−Ｎ²−イソブチリル−３’−Ｏ−（２−メトキシエチ
ル）グアノシン−２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホ
スホロアミダイト 実施例７からの保護ヌクレオシド（０．０４８６ｍｏｌ）をＴｅｆｌｏｎ撹拌
バーを含有する乾燥１ Ｌ丸底フラスコに入れた。フラスコをアルゴンによって
パージした。無水塩化メチレン（４００ｍｌ）をフラスコ中にカニューレで挿入
して、ヌクレオシドを溶解した。予め真空乾燥させたＮ，Ｎ−ジイソプロピルア
ミノヒドロテトラゾリド（３．０ｇ，０．０１７４ｍｏｌ）をアルゴン下で加え
た。撹拌しながら、ビス−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノシアノエチル−ホス
ホロアミダイト（１８．８ｇ，０．０６８９ｍｏｌ）を注射器を介して１分間に
わたって加えた（発熱は認められなかった）。反応を２５℃においてアルゴン下
で１６時間撹拌した。ＴＬＣによって反応の完成を立証した後に、反応を分液ロ
ート（１ Ｌ）に移した。反応フラスコを塩化メチレン（２ｘ５０ｍｌ）によっ
てすすぎ洗いした。一緒にした有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２００
ｍｌ）によって、次にブライン（２００ｍｌ）によって洗浄した。有機層を硫酸
ナトリウム(５０ｇ，粉状）上で２時間乾燥させた。溶液を濾過し、減圧下で濃
縮し、粘性な油状物を得た。生じたホスホロアミダイトをシリカゲル・フラッシ
ュクロマトグラフィー（８００ｇ，酢酸エチル−トリエチルアミン ９９：１）
によって精製した。選択した画分を一緒にし、減圧下で濃縮して、２５℃／０．
２ｍｍＨｇにおいて１６時間乾燥させて、１８．０ｇ（４６％，グアノシン水和
物から３％）のＴＬＣ均質な固体泡状物を得た。³¹Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，Ｈ₃ ＰＯ₄ｓｔｄ．）δ１４７．９６；１４８．２０（ジアステレオマー）。

【０１３２】 実施例９ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチル−ウリジン
−２’−Ｏ−スクシネート ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−チミジンを最初に２
’−位置においてスクシニル化した。チミジンヌクレオシド（４ｍｍｏｌ）を１
０．２ｍｌのジクロロエタン、６１５ｍｇ（６．１４ｍｍｏｌ）の無水コハク酸
、５７０μｌ（４．０９ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン及び２５１ｍｇ（２．０
５ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジンと反応させた。反応物を溶解するま
で渦流させ、５５℃の加熱ブロック(heating block)に約３０分間入れた。反応
の完成を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってチェックした。反応混合物
を冷１０％クエン酸によって３回洗浄し、続いて水によって３回洗浄した。有機
相を取り出し、硫酸ナトリウム下で乾燥させた。スクシニル化ヌクレオシドを真
空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一晩乾燥させた。

【０１３３】 実施例１０ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチル−ウリジン−２’−
Ｏ−スクシノイル結合ＬＣＡ ＣＰＧ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−２’−Ｏ−スクシニ
ル−チミジンを制御多孔質ガラス(controlled pore glass)（ＣＰＧ）に結合さ
せた。１．０９ｇ（１．５２ｍｍｏｌ）のスクシネートを真空オーブン内で４−
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、２，２’−ジチオビス（５−ニトロ−ピ
リジン）（ｄＴＮＰ）、トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）及び予め酸洗浄した
ＣＰＧ（制御多孔質ガラス）と共に一晩乾燥させた。約２４時間後に、該スクシ
ネートにＤＭＡＰ（１．５２ｍｍｏｌ，１８６ｍｇ）とアセトニトリル（１３．
７ｍｌ）とを加えた。混合物をアルゴン雰囲気下で、マグネチックスターラーを
用いて撹拌した。別のフラスコにおいて、ｄＴＮＰ（１．５２ｍｍｏｌ，４７２
ｍｇ）をアセトニトリル（９．６ｍｌ）とジクロロメタン（４．１ｍｌ）中にア
ルゴン下で溶解した。この反応混合物を次に該スクシネートに加えた。もう１つ
の別のフラスコにおいて、ＴＰＰ（１．５２ｍｍｏｌ，３９９ｍｇ）をアセトニ
トリル（３７ｍｌ）中にアルゴン下で溶解した。この反応混合物を次に該スクシ
ネート／ＤＭＡＰ／ｄＴＮＰ反応混合物に加えた。最後に、１２．２３ｇの予め
酸洗浄したＬＣＡ ＣＰＧ（負荷＝１１５．２μｍｏｌ／ｇ）を主要反応混合物
に加え、短時間渦流させ、シェーカー(shaker)上に約３時間載せた。３時間後に
、混合物をシェーカーから取り出し、負荷(loading)をチェックした。ＣＰＧの
小サンプルを多量のアセトニトリルと、ジクロロメタンと、次にエーテルとによ
って洗浄した。最初の負荷は６３μｍｏｌ／ｇであると判明した（３．９ｍｇの
ＣＰＧをトリクロロ酢酸によって切断し、放出されたトリチルカチオンの吸収を
分光光度計上で５０３ｎｍにおいて読み取って、負荷を判定した）。次に、全Ｃ
ＰＧサンプルを上述したように洗浄して、真空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一晩乾燥
させた。翌日、このＣＰＧをシェーカー上で２５ｍｌのＣＡＰ Ａ（テトラヒド
ロフラン／無水酢酸）と２５ｍｌのＣＡＰ Ｂ（テトラヒドロフラン／ピリジン
／１−メチルイミダゾール）によって約３時間キャップした。濾過し、ジクロロ
メタンとエーテルとによって洗浄した。ＣＰＧを真空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一
晩乾燥させた。乾燥させた後、１２．２５ｇのＣＰＧを９０μｍｏｌ／ｇの最終
負荷と共に単離した。

【０１３４】 実施例１１ ３’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチル−Ｎ−ベンゾイル−シチジン−２’−Ｏ
−スクシネート ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−Ｎ−ベンゾイル−シ
チジンを最初に２’−位置においてスクシニル化した。シチジンヌクレオシド（
４ｍｍｏｌ）を１０．２ｍｌのジクロロエタン、６１５ｍｇ（６．１４ｍｍｏｌ
）の無水コハク酸、５７０μｌ（４．０９ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン及び２
５１ｍｇ（２．０５ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジンと反応させた。反
応物を溶解するまで渦流させ、５５℃の加熱ブロックに約３０分間入れた。反応
の完成を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってチェックした。反応混合物
を冷１０％クエン酸によって３回洗浄し、続いて水によって３回洗浄した。有機
相を取り出し、硫酸ナトリウム下で乾燥させた。スクシニル化ヌクレオシドを真
空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一晩乾燥させた。

【０１３５】 実施例１２ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチル−Ｎ−ベンゾイル−
シチジン−２’−Ｏ−スクシノイル結合ＬＣＡ ＣＰＧ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−２’−Ｏ−スクシニ
ル−Ｎ⁴−ベンゾイル−シチジンを制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）に結合させた。
１．０５ｇ（１．３０ｍｍｏｌ）のスクシネートを真空オーブン内で４−ジメチ
ルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、２，２’−ジチオビス（５−ニトロ−ピリジン
）（ｄＴＮＰ）、トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）及び予め酸洗浄したＣＰＧ
（制御多孔質ガラス）と共に一晩乾燥させた。翌日、該スクシネートにＤＭＡＰ
（１．３０ｍｍｏｌ，１５９ｍｇ）とアセトニトリル（１１．７ｍｌ）とを加え
た。混合物をアルゴン下で、マグネチックスターラーによって“混合した”。別
のフラスコにおいて、ｄＴＮＰ（１．３０ｍｍｏｌ，４００ｍｇ）をアセトニト
リル（８．２ｍｌ）とジクロロメタン（３．５ｍｌ）中にアルゴン下で溶解した
。この反応混合物を次に該スクシネートに加えた。もう１つの別のフラスコにお
いて、ＴＰＰ（１．３０ｍｍｏｌ，３３８ｍｇ）をアセトニトリル（１１．７ｍ
ｌ）中にアルゴン下で溶解した。この混合物を次に該スクシネート／ＤＭＡＰ／
ｄＴＮＰ反応混合物に加えた。最後に、１０．４６ｇの予め酸洗浄したＬＣＡ
ＣＰＧ（負荷＝１１５．２μｍｏｌ／ｇ）を主要反応混合物に加え、短時間渦流
させ、シェーカー上に約２時間載せた。２時間後に、一部をシェーカーから取り
出し、負荷をチェックした。ＣＰＧの小サンプルを多量のアセトニトリルと、ジ
クロロメタンと、次にエーテルとによって洗浄した。最初の負荷は４６μｍｏｌ
／ｇであると判明した（３．４ｍｇのＣＰＧをトリクロロ酢酸によって切断した
）。放出されたトリチルカチオンの吸収を分光光度計上で５０３ｎｍにおいて読
み取って、負荷を判定した。次に、全ＣＰＧサンプルを上述したように洗浄して
、真空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一晩乾燥させた。翌日、このＣＰＧをシェーカー
上で２５ｍｌのＣＡＰ Ａ（テトラヒドロフラン／無水酢酸）と２５ｍｌのＣＡ
Ｐ Ｂ（テトラヒドロフラン／ピリジン／１−メチルイミダゾール）によって約
３時間キャップした。この物質を濾過し、ジクロロメタンとエーテルとによって
洗浄した。ＣＰＧを真空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一晩乾燥させた。乾燥させた後
、１０．７７ｇのＣＰＧを６３μｍｏｌ／ｇの最終負荷と共に単離した。

【０１３６】 実施例１３ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−メトキシエチル−Ｎ⁶−ベンゾイル−アデノシン
−２’−Ｏ−スクシネート ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ⁶−ベンゾイル−
アデノシンを最初に２’−位置においてスクシニル化した。３．０ｇ（４．０９
ｍｍｏｌ）のアデノシンヌクレオシドを１０．２ｍｌのジクロロエタン、６１５
ｍｇ（６．１４ｍｍｏｌ）の無水コハク酸、５７０μｌ（４．０９ｍｍｏｌ）の
トリエチルアミン及び２５１ｍｇ（２．０５ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピ
リジンと反応させた。反応物を溶解するまで渦流させ、５５℃の加熱ブロックに
約３０分間入れた。反応の完成を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってチ
ェックした。反応混合物を冷１０％クエン酸によって３回洗浄し、続いて水によ
って３回洗浄した。有機相を取り出し、硫酸ナトリウム下で乾燥させた。スクシ
ニル化ヌクレオシドを真空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一晩乾燥させた。

【０１３７】 実施例１４ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ⁶−ベンゾイル−ア
デノシン−２’−Ｏ−スクシノイル結合ＬＣＡ ＣＰＧ スクシニル化後、５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−２
’−Ｏ−スクシニル−Ｎ⁶−ベンゾイル−アデノシンを制御多孔質ガラス（ＣＰ
Ｇ）に結合させた。３．４１ｇ（４．１０ｍｍｏｌ）のスクシネートを真空オー
ブン内で４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、２，２’−ジチオビス（５
−ニトロ−ピリジン）（ｄＴＮＰ）、トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）及び予
め酸洗浄したＣＰＧ（制御多孔質ガラス）と共に一晩乾燥させた。翌日、該スク
シネートにＤＭＡＰ（４．１０ｍｍｏｌ，５０１ｍｇ）とアセトニトリル（３７
ｍｌ）とを加えた。混合物をアルゴン下で、マグネチックスターラーによって“
混合した”。別のフラスコにおいて、ｄＴＮＰ（４．１０ｍｍｏｌ，１．２７ｇ
）をアセトニトリル（２６ｍｌ）とジクロロメタン（１１ｍｌ）中にアルゴン下
で溶解した。この反応混合物を次に該スクシネートに加えた。もう１つの別のフ
ラスコにおいて、ＴＰＰ（４．１０ｍｍｏｌ，１．０８ｇ）をアセトニトリル（
３７ｍｌ）中にアルゴン下で溶解した。この混合物を次に該スクシネート／ＤＭ
ＡＰ／ｄＴＮＰ反応混合物に加えた。最後に、３３ｇの予め酸洗浄したＬＣＡ
ＣＰＧ（負荷＝１１５．２μｍｏｌ／ｇ）を主要反応混合物に加え、短時間渦流
させ、シェーカー上に約２０時間載せた。２０時間後に、シェーカーから取り出
し、負荷をチェックした。ＣＰＧの小サンプルを多量のアセトニトリルと、ジク
ロロメタンと、次にエーテルとによって洗浄した。最初の負荷は４９μｍｏｌ／
ｇであると判明した（２．９ｍｇのＣＰＧをトリクロロ酢酸によって切断した）
。放出されたトリチルカチオンの吸収を分光光度計上で５０３ｎｍにおいて読み
取って、負荷を判定した。次に、全ＣＰＧサンプルを上述したように洗浄して、
真空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一晩乾燥させた。翌日、このＣＰＧをシェーカー上
で５０ｍｌのＣＡＰ Ａ（テトラヒドロフラン／無水酢酸）と５０ｍｌのＣＡＰ
Ｂ（テトラヒドロフラン／ピリジン／１−メチルイミダゾール）によって約１
時間キャップした。この物質を濾過し、ジクロロメタンとエーテルとによって洗
浄した。ＣＰＧを真空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一晩乾燥させた。乾燥させた後、
３３．００ｇのＣＰＧが６６μｍｏｌ／ｇの最終負荷を有して得られた。

【０１３８】 実施例１５ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ²−イソブチリル−
グアノシン−２’−Ｏ−スクシネート ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ²−イソブチリル
−グアノシンを２’−糖位置においてスクシニル化した。３．０ｇ（４．２０ｍ
ｍｏｌ）のグアノシンヌクレオシドを１０．５ｍｌのジクロロエタン、６３１ｍ
ｇ（６．３０ｍｍｏｌ）の無水コハク酸、５８５μｌ（４．２０ｍｍｏｌ）のト
リエチルアミン及び２５７ｍｇ（２．１０ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリ
ジンと反応させた。反応物を溶解するまで渦流させ、５５℃の加熱ブロックに約
３０分間入れた。反応の完成を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってチェ
ックした。反応混合物を冷１０％クエン酸によって３回洗浄し、続いて水によっ
て３回洗浄した。有機相を取り出し、硫酸ナトリウム下で乾燥させた。スクシニ
ル化ヌクレオシドを真空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一晩乾燥させた。

【０１３９】 実施例１６ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−メトキシエチル−Ｎ²−イソブチリル−グアノシ
ン−２’−Ｏ−スクシノイル結合ＬＣＡ ＣＰＧ スクシニル化後、５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−２
’−Ｏ−スクシニル−Ｎ²−ベンゾイル−グアノシンを制御多孔質ガラス（ＣＰ
Ｇ）に結合させた。３．４２ｇ（４．２０ｍｍｏｌ）のスクシネートを真空オー
ブン内で４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、２，２’−ジチオビス（５
−ニトロ−ピリジン）（ｄＴＮＰ）、トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）及び予
め酸洗浄したＣＰＧ（制御多孔質ガラス）と共に一晩乾燥させた。翌日、該スク
シネートにＤＭＡＰ（４．２０ｍｍｏｌ，５１３ｍｇ）とアセトニトリル（３７
．５ｍｌ）とを加えた。混合物をアルゴン下で、マグネチックスターラーによっ
て“混合した”。別のフラスコにおいて、ｄＴＮＰ（４．２０ｍｍｏｌ，１．４
３ｇ）をアセトニトリル（２６ｍｌ）とジクロロメタン（１１ｍｌ）中にアルゴ
ン下で溶解した。この反応混合物を次に該スクシネートに加えた。もう１つの別
のフラスコにおいて、ＴＰＰ（４．２０ｍｍｏｌ，１．１０ｇ）をアセトニトリ
ル（３７．５ｍｌ）中にアルゴン下で溶解した。この混合物を次に該スクシネー
ト／ＤＭＡＰ／ｄＴＮＰ反応混合物に加えた。最後に、３３．７５ｇの予め酸洗
浄したＬＣＡ ＣＰＧ（負荷＝１１５．２μｍｏｌ／ｇ）を主要反応混合物に加
え、短時間渦流させ、シェーカー上に約２０時間載せた。２０時間後に、シェー
カーから取り出し、負荷をチェックした。ＣＰＧの小サンプルを多量のアセトニ
トリルと、ジクロロメタンと、次にエーテルとによって洗浄した。最初の負荷は
６４μｍｏｌ／ｇであると判明した（３．４ｍｇのＣＰＧをトリクロロ酢酸によ
って切断した）。放出されたトリチルカチオンの吸収を分光光度計上で５０３ｎ
ｍにおいて読み取って、負荷を判定した。次に、ＣＰＧを上述したように洗浄し
て、真空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一晩乾燥させた。翌日、このＣＰＧをシェーカ
ー上で５０ｍｌのＣＡＰ Ａ（テトラヒドロフラン／無水酢酸）と５０ｍｌのＣ
ＡＰ Ｂ（テトラヒドロフラン／ピリジン／１−メチルイミダゾール）によって
約１時間キャップした。この物質を濾過し、ジクロロメタンとエーテルとによっ
て洗浄した。ＣＰＧを真空オーブン内、Ｐ₂Ｏ₅下で一晩乾燥させた。乾燥させた
後、３３．７５ｇのＣＰＧが７２μｍｏｌ／ｇの最終負荷を有して単離された。

【０１４０】 実施例１７ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［ヘキシル−（６−フタルイミド）］−ウリジン ２’，３’−Ｏ−ジブチルスタニレン−ウリジンをＷａｇｎｅｒ等，Ｊ．Ｏｒ
ｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７４，３９，２４の方法に従って合成した。この化合物を
真空下、Ｐ₂Ｏ₅上で１２時間乾燥させた。２００ｍｌの無水ＤＭＦ中のこの化合
物（２９ｇ，４２．１ｍｍｏｌ）の溶液に、１６．８ｇ（５５ｍｍｏｌ）の６−
ブロモヘキシルフタルイミドと４．５ｇのヨウ化ナトリウムとを加え、混合物を
アルゴン下、１３０℃において１６時間加熱した。反応混合物を蒸発させ、トル
エンと共に１回共沸蒸発させ、ガム状タール残渣をシリカカラム（５００ｇ）上
に供給した。カラムを２ＬのＥｔＯＡｃによって洗浄し、続いて１０％メタノー
ル（ＭｅＯＨ）：９０％ＥｔＯＡｃによって溶出した。生成物、Ｏ−ヘキシル−
６−Ｎ−フタルイミドウリジンの２’−異性体と３’−異性体が分離不能な混合
物（ＥｔＯＡｃ中１０％ＭｅＯＨにおいて、Ｒ_f＝０．６４）として溶出した。^{1 3} Ｃ ＮＭＲによって、異性体比率は約５５％の２’異性体と約４５％の３’異
性体であった。一緒にした収量は９．２ｇ（４６．２％）であった。この混合物
を真空下で乾燥させ、ピリジンと共に２回再蒸発させた。これを１５０ｍｌの無
水ピリジン中に溶解して、７．５ｇのＤＭＴ−Ｃｌ（２２．１３ｍｍｏｌ）と５
００ｍｇのジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）とによって処理した。２時間後
に、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；６：４ ＥｔＯＡｃ：ヘキサン）は出発
物質の完全な消失と、２’異性体と３’異性体との良好な分離（２’異性体に対
してはＲ_f＝０．２９、３’異性体に対してはＲ_f＝０．１２）を示した。反応混
合物を５ｍｌのＣＨ₃ＯＨの添加によってクエンチし、減圧下で蒸発させた。残
渣を３００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ₃によって、続いて飽
和ＮａＣｌ溶液によって連続的に洗浄した。これをＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、蒸
発させて、１５ｇの褐色泡状物を得て、これをシリカゲル（５００ｇ）上で精製
して、６．５ｇの２’異性体と３．５ｇの３’異性体を得た。

【０１４１】 実施例１８ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［ヘキシル−（６−フタルイミド）］−ウリジン
−２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイ
ト ５’−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［ヘキシル−（６−フタルイミド）］−ウリジン（
２ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解した。この溶液に
、ジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．２ｇ，１．１６ｍｍｏｌ）と２．０
ｍｌの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロア
ミダイト（６．３ｍｍｏｌ）とを撹拌しながら一晩加えた。ＴＬＣ（１：１ Ｅ
ｔＯＡｃ／ヘキサン）は出発物質の完全な消失を示した。反応混合物をＣＨ₂Ｃ
ｌ₂によって移し、飽和ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ）によって、続いて、飽和Ｎａ
Ｃｌ溶液によって洗浄した。有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、蒸発させて
、３．８ｇの粗生成物を得て、これを１：１ ヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いてシ
リカカラム（２００ｇ）で精製して、１．９ｇ（１．９５ｍｍｏｌ，７４％収率
）の所望のホスホロアミダイトを得た。

【０１４２】 実施例１９ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［ヘキシル−（６−フタルイミド）］−ウリジン
−２’−Ｏ−スクシノイル−アミノプロピルＣＰＧ スクシニル化され、キャップされたアミノプロピル制御多孔質ガラス（ＣＰＧ
；５００Å孔径，アミノプロピルＣＰＧ，１．０ｇ，Ｄａｍｈａ等，ＮｕＣｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８，３８１３に従って製造）を、１００ｍｌ
の丸底フラスコ中の１２ｍｌの無水ピリジンに加えた。１−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド（ＤＥＣ；０．３８ｇ，２．０ｍｍ
ｏｌ）］と、トリエチルアミン（ＴＥＡ；１００μｌ，ＣａＨ₂上で蒸留したも
の）と、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；０．０１２ｇ，０．１ｍｍｏｌ）
と、ヌクレオシド５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［ヘキシル−（６−フタルイミ
ド）］ウリジン（０．６ｇ，０．７７ｍｍｏｌ）とをアルゴン下で加え、混合物
を２４時間機械的に振とうした。追加のヌクレオシド（０．２ｇ）を加え、混合
物を２４時間振とうした。ＣＰＧを濾別し、ジクロロメタン、トリエチルアミン
及びジクロロメタンによって連続的に洗浄した。次に、ＣＰＧを真空下で乾燥さ
せ、１０ｍｌのピペリジン中に懸濁させ、１５分間振とうした。ＣＰＧを濾別し
、ジクロロメタンによって完全に洗浄し、再度、真空下で乾燥させた。負荷度（
４９８ｎｍにおいて０．３Ｍ ｐ−トルエンスルホン酸中のＤＭＴカチオンの分
光測光アッセイによって測定）は約２８μｍｏｌ／ｇであった。５’−Ｏ−（Ｄ
ＭＴ）−３’−Ｏ−［ヘキシル−（６−フタルイミド）］ウリジン−２’−Ｏ−
スクシニル−アミノプロピル制御多孔質ガラスを用いて、ＡＢＩ３８０Ｂ ＤＮ
Ａ合成装置においてホスホロアミダイト化学標準条件によってオリゴマーを合成
した。４塩基オリゴマー５’−ＧＡＣＵ^*−３’を用いて、オリゴヌクレオチド
中に導入された３’−Ｏ−ヘキシルアミン・テザーの構造をＮＭＲによって確認
した。予想したように、¹Ｈ ＮＭＲにおいて１．０〜１．８ｐｐｍ間に多重線
シグナルが観察された。

【０１４３】 実施例２０ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［ヘキシルアミノ］−ウリジン ５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−３’−Ｏ−［ヘキシル−（６−フタルイミド）］ウリ
ジン（４．５ｇ，５．８ｍｍｏｌ）を５００ｍｌのフラスコ中の２００ｍｌのメ
タノール中に溶解する。ヒドラジン（１ｍｌ，３１ｍｍｏｌ）を撹拌反応混合物
に加える。この混合物を油浴中で６０〜６５℃に加熱し、１４時間還流させる。
溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をジクロロメタン（２５０ｍｌ）中に溶解し、等
量のＮＨ₄ＯＨによって２回抽出する。有機層を蒸発させて、ＮＭＲが完全には
純粋でないことを示す粗生成物を得る。１００％酢酸エチル中でＲ_f＝０．この
生成物をさらに精製せずに次の反応に用いる。

【０１４４】 実施例２１ ３’−Ｏ−［プロピル−（３−フタルイミド）］−アデノシン ５℃の乾燥ジメチルホルムアミド（５５０ｍｌ）中のアデノシン（２０．０ｇ
，７５ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ナトリウム（６０％油，４．５ｇ，１１２ｍ
ｍｏｌ）を加えた。１時間後に、Ｎ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（２
３．６ｇ，８６ｍｍｏｌ）を加え、温度を３０℃に高めて、１６時間維持した。
氷を加えて、溶液を真空下で蒸発させて、ガム状物を得る。このガム状物を水と
酢酸エチル（４ｘ３００ｍｌ）に分配した。有機相を分離し、乾燥させ、真空下
で蒸発させ、生じたガム状物をシリカゲル（９５／５ ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ）
上でクロマトグラフィーして、白色固体（５．７ｇ）の２’−Ｏ−（プロピルフ
タルイミド）アデノシンを得た。３’−Ｏ−（プロピルフタルイミド）アデノシ
ンを含有する３画分をシリカゲル上で同じ溶媒系を用いて再度クロマトグラフィ
ーした。

【０１４５】 メタノールからの２’−Ｏ−（プロピルフタルイミド）アデノシン画分の結晶
化は結晶質固体、ｍ．ｐ．１２３−１２４℃を生じた。

【０１４６】

【数１】

【０１４７】 Ｈ₂Ｏからの３’−Ｏ−（プロピルフタルイミド）アデノシン画分の結晶化は
分析サンプル、ｍ．ｐ．１７８−１７９℃を生じた。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨ
Ｚ：ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ５．８６（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１’）． 実施例２２ ３’−Ｏ−［プロピル−（３−フタルイミド）］−Ｎ⁶−ベンゾイル−アデノシ
ン ３’−Ｏ−（３−プロピルフタルイミド）アデノシンを塩化ベンゾイルによっ
て、Ｇａｆｆｎｅｙ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８２，２３，
２２５７の方法と同様な方法で処理する。シリカゲル（酢酸エチル−メタノール
）上でのクロマトグラフィーによる粗生成物の精製は、標題化合物を生じる。

【０１４８】 実施例２３ ３’−Ｏ−［プロピル−（３−フタルイミド）］−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ⁶−ベ
ンゾイル−アデノシン ピリジン（２５０ｍｌ）中の３’−Ｏ−（プロピル−３−フタルイミド）−Ｎ ⁶ −ベンゾイルアデノシン（４．０ｇ）の溶液に、ＤＭＴ−Ｃｌ（３．３ｇ）を
加える。この反応を１６時間撹拌する。この反応を氷／水／酢酸エチルに加え、
有機層を分離し、乾燥させ、真空下で濃縮し、生じるガム状物をシリカゲル（酢
酸エチル−メタノール トリエチルアミン）上でクロマトグラフィーして、標題
化合物を得る。

【０１４９】 実施例２４ ３’−Ｏ−［プロピル−（３−フタルイミド）］−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ⁶−ベ
ンゾイル−アデノシン−２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ル）ホスホロアミダイト ３’−Ｏ−（プロピル−３−フタルイミド）−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ⁶−ベン
ゾイル−アデノシンをＳｅｅｌａ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８７，２
６，２２３３の方法と同様な方法で（β−シアノエトキシ）クロロ−Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピル）アミノホスファンによって処理する。シリカゲル（ＥｔＯＡｃ／
ヘキサン）上でのクロマトグラフィーは標題化合物を白色泡状物として生じる。

【０１５０】 実施例２５ ３’−Ｏ−（アミノプロピル）アデノシン ３’−Ｏ−（プロピル−３−フタルイミド）アデノシン（８．８ｇ，１９ｍｍ
ｏｌ）と、９５％エタノール（４００ｍｌ）と、ヒドラジン（１０ｍｌ，３２ｍ
ｍｏｌ）との溶液を室温において１６時間撹拌する。反応混合物を濾過し、濾液
を真空下で濃縮する。水（１５０ｍｌ）を加え、酢酸によってｐＨ５．０に酸性
化する。水溶液をＥｔＯＡｃ（２ｘ３０ｍｌ）によって抽出し、水相を真空下で
濃縮して、標題化合物をＨＯＡｃ塩として得る。

【０１５１】 実施例２６ ３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロピル］−アデノシン メタノール（５０ｍｌ）とトリエチルアミン（１５ｍｌ，１０８ｍｍｏｌ）中
の３’−Ｏ−（プロピルアミノ）アデノシンの溶液をエチル トリフルオロアセ
テート（１８ｍｌ，１５１ｍｍｏｌ）によって処理する。この反応を１６時間撹
拌してから、真空下で濃縮して、生じるガム状物をシリカゲル（９／１，ＥｔＯ
Ａｃ／ＭｅＯＨ）上でクロマトグラフィーして、標題化合物を得る。

【０１５２】 実施例２７ Ｎ⁶−ジベンゾイル−３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロ
ピル］−アデノシン ３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロピル］−アデノシン
を実施例２２により、仕上げ処理において水酸化アンモニアの代わりにテトラブ
チルアンモニウムフルオリドを用いるＪｏｎｅｓ改変法(modification)を用いて
処理する。粗生成物をシリカゲル・クロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ
１／１）を用いて精製して、標題化合物を得る。

【０１５３】 実施例２８ Ｎ⁶−ジベンゾイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロ
アセトアミド）プロピル］−アデノシン 室温においてピリジン（１００ｍｌ）中のＮ⁶−（ジベンゾイル）−３’−Ｏ
−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロピル］−アデノシンの溶液にＤ
ＭＴ−Ｃｌ（３．６ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）を加え、１６時間撹拌する。この溶
液を真空下で濃縮し、シリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＴＥＡ ９９／１）上でクロマ
トグラフィーして、標題化合物を得る。

【０１５４】 実施例２９ Ｎ⁶−ジベンゾイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロ
アセトアミド）プロピル］−アデノシン−２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，
Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト 乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂中のＮ⁶−（ジベンゾイル）−５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−３’−
Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロピル］−アデノシンの溶液を
ビス−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスフィット（１．１当量）
とＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノテトラゾリド（触媒量）とによって室温におい
て１６時間処理する。反応を真空下で濃縮し、シリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ヘキサ
ン／ＴＥＡ ６／４／１）上でクロマトグラフィーして、標題化合物を得る。

【０１５５】 実施例３０ ３’−Ｏ−（ブチルフタルイミド）−アデノシン 標題化合物を実施例２１によって、１−ブロモプロパンの代わりにＮ−（４−
ブロモブチル）フタルイミドを用いて製造する。シリカゲル（ＥｔＯＡｃ−Ｍｅ
ＯＨ）上でのクロマトグラフィーによって、標題化合物を得る。

【０１５６】

【数２】

【０１５７】 実施例３１ Ｎ⁶−ベンゾイル−３’−Ｏ−（ブチルフタルイミド）−アデノシン 実施例２２による３’−Ｏ−（ブチルフタルイミド）アデノシンのベンゾイル
化によって、標題化合物を得る。

【０１５８】 実施例３２ Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（ブチルフタルイミド）−ア
デノシン 標題化合物を３’−Ｏ−（ブチル−フタルイミド）−Ｎ⁶−ベンゾイルアデノ
シンから実施例２２によって製造する。

【０１５９】 実施例３３ Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（ブチルフタルイミド）−ア
デノシン−２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロ
アミダイト 標題化合物を３’−Ｏ−（ブチルフタルイミド）−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ⁶−
ベンゾイルアデノシンから実施例２４によって製造する。

【０１６０】 実施例３４ ３’−Ｏ−（ペンチルフタルイミド）−アデノシン 標題化合物を実施例２１によってＮ−（５−ブロモペンチル）フタルイミドを
用いて製造する。抽出からの粗物質をシリカゲル上でＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ（９
５／５）を用いてクロマトグラフィーして、２’異性体と３’異性体を得る。２
’異性体をＥｔＯＨ／ＭｅＯＨ ８／２から再結晶する。母液をシリカゲル上で
再クロマトグラフィーして、３’異性体を得る。 ２’−Ｏ−（ペンチルフタルイミド）アデノシン：ｍ．ｐ．１５９−１６０℃．

【０１６１】

【数３】

【０１６２】 実施例３５ Ｎ⁶−ベンゾイル−３’−Ｏ−（ペンチルフタルイミド）−アデノシン ３’−Ｏ−（ペンチルフタルイミド）アデノシンのベンゾイル化を実施例２２
の方法によって達成して、標題化合物を得る。

【０１６３】 実施例３６ Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（ペンチルフタルイミド）−
アデノシン 標題化合物を実施例２３の方法によって３’−Ｏ−（ペンチル−フタルイミド
）−Ｎ⁶−ベンゾイルアデノシンから製造する。シリカゲル（酢酸エチル、ヘキ
サン、トリエチルアミン）上でのクロマトグラフィーによって、標題化合物を得
る。

【０１６４】 実施例３７ Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（ペンチルフタルイミド）−
アデノシン−２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホ
ロアミダイト 標題化合物を得るための実施例２４の方法によって、３’−Ｏ−（ペンチル−
フタルイミド）−５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−Ｎ⁶−ベンゾイルアデノシンから標題
化合物を製造する。

【０１６５】 実施例３８ ３’−Ｏ−（プロピルフタルイミド）ウリジン 乾燥ＤＭＦ（１５０ｍｌ）中のウリジン−スズ錯体（４８．２ｇ，１１５ｍｍ
ｏｌ）とＮ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（４６ｇ，１７２ｍｍｏｌ）
との溶液を１３０℃において６時間加熱した。粗生成物をシリカゲルＣＨＣｌ₃
／ＭｅＯＨ ９５／５上で直接クロマトグラフィーした。精製した混合物の異性
体比率は２’／３’ ８１／１９であった。２’異性体をＭｅＯＨからの結晶化
によって回収した。濾液をシリカゲル上でＣＨＣｌ₃ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ（９５
／５）を用いて、再クロマトグラフィーして、３’異性体を泡状物として得た。
２’−Ｏ−（プロピルフタルイミド）ウリジン：ＭｅＯＨから再結晶した分析サ
ンプル、ｍ．ｐ．１６５．５−１６６．５℃．

【０１６６】

【数４】

【０１６７】 実施例３９ ３’−Ｏ−（アミノプロピル）−ウリジン 標題化合物を実施例２５の方法によって製造する。

【０１６８】 実施例４０ ３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロピル］−ウリジン ３’−Ｏ−（プロピルアミノ）ウリジンを実施例２６の方法によって処理して
、標題化合物を得る。

【０１６９】 実施例４１ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロピ
ル］−ウリジン ３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロピル］ウリジンを実
施例２８の方法によって処理して、標題化合物を得る。

【０１７０】 実施例４２ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロピ
ル］−ウリジン−２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホ
スホロアミダイト ５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）
プロピル］ウリジンを実施例２９の方法によって処理して、標題化合物を得る。

【０１７１】 実施例４３ ３’−Ｏ−（プロピルフタルイミド）−シチジン 標題化合物を実施例２１の方法によって製造した。

【０１７２】 ２’−Ｏ−（プロピルフタルイミド）シチジン：¹Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨＺ
，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ５．８２（ｄ，１Ｈ，Ｃ_1'Ｈ）． ３’−Ｏ−（プロピルフタルイミド）シチジン：¹Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨＺ
，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ５．７２（ｄ，１Ｈ，Ｃ_1'Ｈ）． 実施例４４ ３’−Ｏ−（アミノプロピル）−シチジン ３’−Ｏ−（プロピルフタルイミド）シチジンを実施例２５の方法によって処
理して、標題化合物を得る。

【０１７３】 実施例４５ ３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロピル］−シチジン ３’−Ｏ−（プロピルアミノ）シチジンを実施例２６の方法によって処理して
、標題化合物を得る。

【０１７４】 実施例４６ Ｎ⁴−ベンゾイル−３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロピ
ル］−シチジン ３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）プロピル］シチジンを実
施例２７の方法によって処理して、標題化合物を得る。

【０１７５】 実施例４７ Ｎ⁴−ベンゾイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロア
セトアミド）プロピル］−シチジン Ｎ⁴−（ベンゾイル）−３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロアセトアミド）
プロピル］シチジンを実施例２８の方法によって処理して、標題化合物を得る。

【０１７６】 実施例４８ Ｎ⁴−ベンゾイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリフルオロア
セトアミド）プロピル］−シチジン−２’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピル）ホスホロアミダイト Ｎ⁴−（ベンゾイル）−５’−Ｏ−（ＤＭＴ）−３’−Ｏ−［３−（Ｎ−トリ
フルオロアセトアミド）プロピル］シチジンを実施例２９の方法によって処理し
て、標題化合物を得る。

【０１７７】 実施例４９ オリゴヌクレオチド合成の一般的方法 オリゴヌクレオチドをＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐ
ｅｄｉｔｅ ８９０１核酸合成系で合成した。各オリゴヌクレオチドに関して、
多重１−μｍｏｌ合成を行なった。トリチル基をトリクロロ酢酸（９７５μｌ、
１分間にわたって）によって除去し、アセトニトリル洗浄を行なった。全ての標
準アミダイト（０．１Ｍ）をサイクルにつき２回結合させた（総結合時間(total
coupling time)は約４分間であった）。全ての新規なアミダイトを乾燥アセト
ニトリルに溶解して（１００ｍｇのアミダイト／１ｍｌのアセトニトリル）、約
０．０８〜０．１Ｍ溶液を得た。総結合時間は約６分間であった（１０５μｌの
アミダイトをデリバーした）。アセトニトリル中の１−Ｈ−テトラゾールを活性
化剤(activating agent)として用いた。過剰なアミダイトはアセトニトリルによ
って洗い流した。（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファースルホニル）オキサジ
リジン（ＣＳＯ，１．０ｇ ＣＳＯ／８．７２ｍｌ 乾燥アセトニトリル）を用
いて、ホスホジエステル結合を酸化し（４分間待ち工程(wait step)）、３Ｈ−
１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ
試薬，３．４ｇ Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬／２００ｍｌ アセトニトリル）を用い
て、ホスホロチオエート結合を酸化した（１分間待ち工程）。未反応官能基(unr
eacted functionalities)に５０：５０混合物のテトラヒドロフラン／無水酢酸
とテトラヒドロフラン／ピリジン／１−メチルイミダゾールによってキャップし
た。この合成の期間中、トリチル収率(yields)をトリチルモニターによって追跡
した。最終的ＤＭＴ基は完全な状態で残された。オリゴヌクレオチドを１ｍｌの
２８．０〜３０％水酸化アンモニウム（ＮＨ₄ＯＨ）中で、５５℃において約１
６時間にわたって脱保護した。オリゴヌクレオチドをより大きい規模（２０μｍ
ｏｌ／合成）でも製造した。トリチル基を８ｍｌをやや超える量のトリクロロ酢
酸によって除去した。全ての標準アミダイト（０．１Ｍ）をサイクルにつき２回
結合させた（１３分間結合工程）。全ての新規なアミダイトもサイクルにつき４
回結合させたが、結合時間は約２０分間に増加した（４８０μｌのアミダイトを
デリバーリング）。酸化時間は同じに留まったが、酸化剤のデリバリーはサイク
ルにつき約１．８８ｍｌに増加した。オリゴヌクレオチドを切断し、５ｍｌの２
８．０〜３０％のＮＨ₄ＯＨ中で５５℃において約１６時間にわたって脱保護し
た。

【０１７８】

【表４】

【０１７９】 実施例５０ オリゴヌクレオチド精製の一般的方法 切断及び脱保護工程後に、粗オリゴヌクレオチド（例えば、実施例４９で合成
されたもの）をＧｅｌｍａｎ０．４５μｍナイロンアクロディスク・シリンジフ
ィルター(nylon acrodisc syringe filter)を用いてＣＰＧから濾過した。過剰
なＮＨ₄ＯＨをＳａｖａｎｔ ＡＳ１６０自動スピードバク(automatic speed va
c.)において蒸発させた。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５２Ａ Ｄｉ
ｏｄｅ Ａｒｒａｙ分光光度計で２６０ｎｍにおいて粗収率を測定した。次に、
粗サンプルをＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ エレクトロスプレイ質量分析計
での質量分析法（ＭＳ）とＢｅｃｋｍａｎｎ Ｐ／ＡＣＥシステム５０００での
毛管ゲル電気泳動（ＣＧＥ）とによって分析した。トリチル−オン オリゴヌク
レオチドを逆相分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した
。ＨＰＬＣ条件は次の通りであった：９９１デテクター付きＷａｔｅｒｓ ６０
０Ｅ；Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ４カラム（７．８Ｘ３００ｍｍ）
；Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａ：５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ−
Ａｃ），ｐＨ７．０；Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂ：１００％アセトニトリル；２．５ｍ
ｌ／分流量；勾配：最初の５分間の５％Ｂから次の５５分間にＢが６０％まで直
線的に増加。より大きな２０μｍｏｌ合成からのより大きな収量はより大きなＨ
ＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｂｏｎｄａｐａｋ ＨＣｌ８ＨＡ）上で精製し、
流量を５．０ｍｌ／分に増加させた。適当な画分を回収し、溶媒をスピードバク
中で乾燥させた。オリゴヌクレオチドを８０％酢酸中で約４５分間脱トリチル化
して、再度凍結乾燥させた。脱トリチル化オリゴヌクレオチドをＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−２５（サイズ排除クロマトグラフィー）に通して、適当なサンプルをＰ
ｈａｒｍａｃｉａフラクションコレクターに通して回収することによって、遊離
トリチルと過剰な塩とを除去した。溶媒を再びスピードバクにおいて蒸発させた
。次に、精製されたオリゴヌクレオチドをＣＧＥ、ＨＰＬＣ（流量：１．５ｍｌ
／分；Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ４カラム、３．９Ｘ３００ｍｍ）
及びＭＳによって純度に関して分析した。最終収量を２６０ｎｍにおいて分光光
度計によって測定した。

【０１８０】

【表５】

【０１８１】 実施例５１ 修飾オリゴヌクレオチドに関するＴ_m研究 実施例４９と５０において合成したオリゴヌクレオチドをそれらの融解温度（
Ｔ_m）の測定によって、それらの相補的核酸に対するそれらの相対的結合能力に
関して評価した。融解温度（Ｔ_m）、二重らせん(double helices)の特徴的な物
理的な性質は、コイル（非ハイブリッド形成(unhybridized)）形に対して５０％
のらせん（ハイブリッド形成(hybridized)）形が存在する温度（摂氏度）を意味
する。ＵＶスペクトルを用いて、Ｔ_mを測定して、ハイブリダイゼーション複合
体の形成と破壊（融解）を判定する。ハイブリダイゼーション中に生じる塩基重
層はＵＶ吸収の減少（浅色効果）を付随する。その結果、ＵＶ吸収の減少は高い
Ｔ_mを意味する。Ｔ_mが高ければ高いほど、鎖の間の結合の強度は大きくなる。

【０１８２】 選択した試験オリゴヌクレオチドとそれらの相補的核酸とを、緩衝液（１００
ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）中で各オリゴヌクレオチドの４μＭの標準濃度においてインキュベートし
た。サンプルを９０℃に加熱し、初期吸光度をＧｕｉｌｆｏｒｄ Ｒｅｓｐｏｎ
ｓｅ ＩＩ分光光度計（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて測定した。次に、サンプルを
１５℃に徐々に冷却してから、熱変性処置中に加熱しながら２６０ｎｍにおける
吸光度の変化をモニターした。温度を１℃／吸光度読取りによって上昇させ、変
性プロフィルを融解曲線の一次導関数(I^st derivative)を用いて分析した。デー
タを二状態線形回帰分析を用いても分析して、Ｔ_m＝ｓを測定した。実施例４９
と５０からのオリゴヌクレオチドの幾つかに関するこれらの試験結果を以下の表
ＩＩＩに示す。

【０１８３】

【表６】

【０１８４】 実施例５２ ３’，５’ヌクレオチド間結合対２’，５’ヌクレオチド間結合と、ＮＭＲによ
る２’−置換対３’−置換との修飾オリゴヌクレオチド比較に関するＮＭＲ実験 オリゴマーｄ（ＧＡＵ₂ ^*ＣＴ）［式中、Ｕ₂ ^*＝２’−Ｏ−アミノヘキシルウリ
ジン］の４００ＭＨｚ ¹Ｈ スペクトルは、８個の芳香族プロトンに対応する
８シグナルを７．５〜９．０ｐｐｍ間に示した。さらに、Ｕ^*のアノマー・プロ
トンはＪ_1',2'＝７．５Ｈｚによって５．９ｐｐｍに二重線として出現し、Ｃ２
’−エンド糖パッカリング(C2'-endo sugar puckering)を実証する。対応する２
’−５’結合異性体はＪ_1',2'＝３．８５Ｈｚによって５．７５ｐｐｍに同様な
構造を示し、ｍＲＮＡターゲットへのハイブリダイゼーションのために好都合な
新規な修飾部位におけるＲＮＡ型糖パッカリングを実証する。オリゴマーｄ（Ｇ
ＡＣＵ₃ ^*）［式中、Ｕ₃ ^*＝３’−Ｏ−ヘキシルアミン］のプロトン・スペクトル
は、Ｊ_1',2'＝４．４Ｈｚによって７．５〜９．０ｐｐｍ間の予想７芳香族プロ
トンシグナルと、５．９ｐｐｍにおけるアノマー・プロトン二重線とを示した。
このことは、３’−Ｏ−アルキルアミノ化合物のＣ３’−エンドパッカリングが
それらの２’類似体に比べて大きいことを示唆する。これらのオリゴヌクレオチ
ドの³¹Ｐ ＮＭＲは、それぞれ、ｄ（ＧＡＵ^*ＣＴ）とｄ（ＧＡＣＵ^*）に関する
ヌクレオチド間リン酸結合(internucleotide phosphate linkages)からの予想４
シグナルと３シグナルを示した。３’−５’結合対２’−５’結合はＲＰ ＨＰ
ＬＣにおいて異なる保持時間を有し、それ故、異なる親脂性(lipophilicities)
を有し、これは細胞膜との可能性として異なる相互作用度を意味する。

【０１８５】 実施例５３ ２’，５’−結合オリゴヌクレオチド対３’，５’−結合オリゴヌクレオチドの
Ｔ_m分析 標準的な文献方法によって、加熱溶融(thermal melt)を行なった。オリゴヌク
レオチド同定は次の通りである： オリゴヌクレオチドＡは、配列ｄ（ＧＧＣＴＧＵ^*ＣＴＧＣＧ）［式中、^*は２’
−アミノリンカーの付着部位を示す］の正常な３’−５’結合ホスホジエステル
オリゴデオキシリボヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドＢは、配列ｄ（Ｇ
ＧＣＴＧＵ^*ＣＴＧＣＧ）［式中、^*は２’−アミノリンカーの付着部位を示す］
の正常な３’−５’結合ホスホジエステルオリゴリボヌクレオチドである。^*置
換基を有するリボヌクレオチドを除いた、オリゴヌクレオチドの各リボヌクレオ
チドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドＣは^*位
置における３’−アミノリンカーの他に、この部位に２’−５’結合を有する。
残りのオリゴヌクレオチドは、配列ｄ（ＧＧＣＴＧＵ^*ＣＴＧＣＧ）のホスホジ
エステルオリゴデオキシリボヌクレオチドである。基本(base)オリゴヌクレオチ
ド（２’−アミノリンカーなし）はこの研究に含めなかった。

【０１８６】

【表７】

【０１８７】 ２’−５’結合はＤＮＡターゲットに比べてＲＮＡターゲットに対してより高
い融解温度を示した。 実施例５４ オリゴヌクレオチド安定性に関するヘビ毒ホスホジエステラーゼと肝臓ホモジ
ネート実験 下記オリゴヌクレオチドを実施例４９の方法に従って合成した。

【０１８８】

【表８】

【０１８９】 オリゴヌクレオチドを実施例５０の方法に従って精製し、それらの構造に関し
て分析した。

【０１９０】

【表９】

【０１９１】 ¹星印を有する全てのヌクレオシドは３’−Ｏ−（２−メトキシエチル）を含
有する。＃を有する全てのヌクレオシドは２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチルを
含有する。²条件：デテクター９９１付きのＷａｔｅｒｓ６００Ｅ；Ｗａｔｅｒ
ｓ Ｃ４カラム（３．９Ｘ３００ｍｍ）；溶媒Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡ−Ａｃ，ｐ
Ｈ７．０；溶媒Ｂ：１００％アセトニトリル；１．５ｍｌ／分流量；勾配：最初
の５分間５％Ｂ、次の５５分間にＢを６０％まで直線的に増加させる。

【０１９２】 実施例５５ ３’−Ｏ−アミノプロピル修飾オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドの合成に関して上記に例示した方法に従って、慣用的なア
ミダイトの他に修飾３’−アミダイトを用いて、表ＶＩとＶＩＩに列挙したオリ
ゴヌクレオチドを製造した。用いたヌクレオシドはＮ６−ベンゾイル−３’−Ｏ
−プロピルフタルイミド−Ａ−２’−アミダイト、２’−Ｏ−プロピルフタロイ
ル−Ａ−３’−アミダイト、２’−Ｏ−メトキシエチル−チミジン−３’−アミ
ダイト（ＲＩＣ，Ｉｎｃ．）、２’−Ｏ−ＭＯＥ−Ｇ−３’−アミダイト（ＲＩ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン−３’
−アミダイト、２’−Ｏ−メトキシエチル−アデノシン−３’−アミダイト（Ｒ
Ｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、及び５−メチルシチジン−３’−アミダイトを包含す
る。３’−プロピルフタルイミド−Ａと２’−プロピルフタルイミド−ＡをＬＣ
Ａ−ＣＰＧ固体サポートとして用いた。必要量のアミダイトを乾燥したバイアル
に入れ、アセトニトリル中に溶解して（非修飾ヌクレオシドは１Ｍ溶液にしたが
、修飾ヌクレオシドは１００ｍｇ／ｍｌであった）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘ
ｐｅｄｉｔｅ^TM核酸合成系上の適当なポート(ports)に連結させた。固体サポー
ト樹脂（６０ｍｇ）を２Ｘ１μｍｏｌｅ規模合成用の各カラムに用いた（各オリ
ゴに対して２カラムを用いた）。ホスホロチオエート・バックボーンと、ホスホ
ジエステル用のＣＳＯ−８とに対してＩＢＰ−ＰＳ（１μｍｏｌｅ）結合プロト
コールを用いて合成を行なった。トリチル報告は正常な結合結果を示した。

【０１９３】 合成後に、オリゴヌクレオチドを、４０％メチルアミン溶液（ａｑ）１０％を
含有する濃水酸化アンモニウム（ａｑ）によって５５℃において約１６時間脱保
護した。次に、これらをＳａｖａｎｔ ＡＳ１６０ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｓｐ
ｅｅｄ Ｖａｃを用いて蒸発させ（アンモニアを除去するため）、濾過して、Ｃ
ＰＧ樹脂を除去した。粗サンプルをＭＳ、ＨＰＬＣ及びＣＥによって分析した。
次に、これらをＷａｔｅｒｓ Ｃ４ Ｐｒｅｐ．規模カラム（Ａｌｉｃｅ Ｃ４
Ｐｒｅｐ．）と下記溶媒：溶媒Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡ−Ａｃ，ｐＨ７．０及び
溶媒Ｂ：アセトニトリルとを用いる９９１デテクター付きＷａｔｅｒｓ ６００
Ｅ ＨＰＬＣ系上で、ＡＭＰＲＥＰ２＠方法によって精製した。精製後に、オリ
ゴヌクレオチドを蒸発乾燥させてから、室温において８０％酢酸によって約３０
分間脱トリチル化した。次に、これらを蒸発させた。

【０１９４】 オリゴヌクレオチドを濃水酸化アンモニウム中に溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５含有カラムに通して溶媒としての水とＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ
ＳｕｐｅｒＦｒａｃフラクションコレクターとを用いて処理した。得られた精製
オリゴヌクレオチドを蒸発させ、ＭＳ、ＣＥ及びＨＰＬＣによって分析した。

【０１９５】

【表１０】

【０１９６】

【表１１】

【０１９７】 実施例５６ 修飾オリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ安定性 実施例４９と５５において合成された、選択した修飾オリゴヌクレオチドのｉ
ｎ ｖｉｖｏ安定性をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価した。５ｍｇ／ｋｇのオ
リゴヌクレオチドを単回ｉ．ｖ．投与した後に、種々な時間間隔で血液サンプル
を採取し、ＣＧＥによって分析した。試験した各オリゴヌクレオチドに対して、
９匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス、体重約２５ｇ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗ
ｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を用いた。１週間順化させた後に、これらのマウス
にリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．０中で投与したオリゴヌクレオ
チド（５ｍｇ／ｋｇ）の単回尾静脈注射を受けさせた。一方の眼窩後方出血(one
retro-orbital bleed)（投与後０．２５、０．５、２若しくは４時間のいずれ
か）と末梢出血(terminal bleed)（投与後１、３、８若しくは２４時間のいずれ
か）とを各グループから回収した。末梢出血（約０．６〜０．８ｍｌ）はケタミ
ン／キシラジン麻酔後の心臓穿刺によって回収した。血液をＥＤＴＡ被覆回収管
(collection tube)に移し、遠心分離して血漿を得た。終了時に、各マウスから
肝臓と腎臓を回収した。血漿と組織ホモジネートとを分析に用いて、完全なオリ
ゴヌクレオチドの含量をＣＧＥによって判定した。全てのサンプルは回収後直ち
にドライアイス上で凍結させ、分析まで−８０℃において貯蔵した。

【０１９８】 ＣＥＧ分析は、ＩＳＩＳ １１０６１（表ＩＩＩ、実施例５１）（マウスｃ−
ｒａｆをターゲットとする、均質な２’−デオキシ−ホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチド）に比較した２’，５’−結合オリゴマーの相対的ヌクレアーゼ耐
性を示した。３’−メトキシエトキシ置換基が存在して、さらにヌクレアーゼ保
護を与えるという事実と結びつけて考えられる、２’，５’−結合のヌクレアー
ゼ耐性のために、オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １７１７６、ＩＳＩＳ １７１
７７、ＩＳＩＳ １７１７８、ＩＳＩＳ １７１８０、ＩＳＩＳ １７１８１及
びＩＳＩＳ ２１４１５は血漿中で比較的安定であることが判明しが、ＩＳＩＳ
１１０６１（表ＩＩＩ）は安定ではなかった。同様な観察が腎臓及び肝臓組織
において認められた。このことは、３’−メトキシエトキシ置換基を有する２’
，５’−結合が血漿、腎臓及び肝臓において５’−エキソヌクレアーゼ及び３’
−エキソヌクレアーゼに対する優れたヌクレアーゼ耐性を与えることを意味する
。したがって、２’，５’−結合と３’−メトキシエトキシ・モチーフの両方を
オリゴヌクレオチドの構造に組み入れることによって、より長い作用期間を有す
るオリゴヌクレオチドを設計することができる。２’，５’−ホスホロチオエー
ト結合が２’，５’−ホスホジエステル結合よりも安定であることも観察された
。５ｍｇ／ｋｇオリゴヌクレオチドのｉ．ｖ．ボラスの投与後１時間に血漿中に
完全な状態で留まる全長オリゴヌクレオチドの％のプロットを図４に示す。

【０１９９】 ５ｍｇ／ｋｇオリゴヌクレオチドのｉ．ｖ．ボラスの投与後２４時間に組織中
に完全な状態で留まる全長オリゴヌクレオチドの％のプロットは図５に示す。 ２４時間後のマウス肝臓サンプルとマウス腎臓サンプルの両方における試験オ
リゴヌクレオチドと標準ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとのＣＧＥトレ
ースを図６に示す。これらのトレースから明らかであるように、パネルＡに見ら
れる標準に比べて、本発明のオリゴヌクレオチドではより多量の完全な状態のオ
リゴヌクレオチドが存在する。パネルＢに示したオリゴヌクレオチドはホスホロ
チオエート・オリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端の各々に本発明の１置換
基を包含するが、パネルＣに見られるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは
５’末端に１置換基と３’末端に２置換基とを包含した。パネルＤのオリゴヌク
レオチドはその５’末端と３’末端の両方において２’，５’ホスホロジエステ
ル結合に組み入れられた本発明の置換基を包含する。これはパネルＢとＣに見ら
れるオリゴヌクレオチドよりも低い安定性であるが、パネルＡの全長ホスホロチ
オエート標準オリゴヌクレオチドよりも大きく安定性である。

【０２００】 実施例５７ 修飾オリゴヌクレオチドを用いる、ｂＥＮＤ細胞におけるｃ−ｒａｆメッセージ
の制御 幾つかのオリゴヌクレオチドの活性を評価するために、ｂＥＮＤ細胞における
ｃ−ｒａｆ発現の細胞レベルを測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイを用
いた。

【０２０１】 細胞と試薬 ｂＥｎｄ．３細胞系、脳内皮腫はＤｒ．Ｗｅｒｎｅｒ Ｒｉｓａｕ（Ｍａｘ−
Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、トリプ
シン−ＥＤＴＡと、高グルコースを有するＤＭＥＭとはＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇ
ｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳはＩ
ｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から購入した。無菌
の１２穴組織培養プレートとＦａｃｓｆｌｏｗ溶液とはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）から購入した。超純粋なホルムアルデ
ヒドはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から購入した
。ＮＡＰ−５カラムはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）か
ら購入した。

【０２０２】 オリゴヌクレオチド処理 ４．５ｇ／Ｌグルコースと１０％ＦＢＳとを含有するＤＭＥＭを含む１２穴プ
レートにおいて、細胞を約７５％集密度まで増殖させた。細胞を３７℃に予め温
めたＯｐｔｉ−ＭＥＭによって３回洗浄した。オリゴヌクレオチドにカチオン性
脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ試薬、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）をプレミックスし、所
望の濃度まで連続的に希釈し、３７℃において４時間インキュベーションするた
めに洗浄済み細胞上に移した。次に、ｍＲＮＡのノーザンブロット分析のために
培地を取り出し、標準増殖培地と２４時間交換した。

【０２０３】 ノーザンブロット分析 ノーザンブロット分析によってｍＲＮＡレベルを測定するために、オリゴヌク
レオチド処理の開始後２４時間に、グアニジンイソチオシアネート方法（Ｍｏｎ
ｉａ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，１
５４８１−１５４８４）によって、細胞から総ＲＮＡを調製した。ＣｓＣｌクッ
ション上での細胞溶解物(cell lysates)の遠心分離によって、総ＲＮＡを単離し
た。ノーザンブロット分析、ＲＮＡ定量及びＧ＃ＰＤＨｍＲＮＡレベルへの標準
化を、報告された方法（ＤｅａｎとＭｃＫａｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，１１７６２−１１７６６）に従って行なっ
た。ｂＥＮＤ細胞では、２−，５−結合−３’−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌク
レオチドはｃ−ｒａｆメッセージ活性の減少を濃度の関数として示した。これら
の修飾オリゴヌクレオチドが活性を保持したという事実は、ｉｎ ｖｉｖｏヌク
レアーゼ耐性の上昇をも示すこれらのオリゴヌクレオチドによる投与頻度の減少
を見込みあるもとする。全ての２’，５’−結合オリゴヌクレオチドは親１１０
６１（表ＩＩＩ）オリゴヌクレオチドの活性を保持し、この活性をさらに一層改
良した。ｂＥＮＤ細胞におけるｃ−ｒａｆ発現に対する本発明のオリゴヌクレオ
チドの効果（対照に比較）のグラフを図７に示す。

【０２０４】 実施例５８ ＭＭＩ含有オリゴヌクレオチドの合成 ａ．ビス−２’−Ｏ−メチルＭＭＩビルディングブロック ＭＭＩ（即ち、Ｒ＝ＣＨ₃）ダイマー・ビルディングブロックの合成は既に述
べられている（例えば、Ｓｗａｙｚｅ等，Ｓｙｎｌｅｔｔ １９９７，８５９；
Ｓａｎｇｈｖｉ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １
９９７，１６９０７；Ｓｗａｙｚｅ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅｓ １９９７，１６，９７１；Ｄｉｍｏｃｋ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉ
ｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９７，１６，１６２６参照）。一般
に、３：１ ＭｅＯＨ／ＴＨＦ中の１当量のＢＨ₃ピリジン／１当量のピリジニ
ウム パラ−トルエンスルホネート（ＰＰＴＳ）を用いて、５’−Ｏ−（４，４
’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｃ−ホルミルヌクレオシ
ドを５’−Ｏ−（Ｎ−メチルヒドロキシアミノ）−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ
−ＴＢＤＰＳヌクレオシドと縮合させた。得られたＭＭＩダイマーブロックを次
にＴＨＦ中の１５当量のＥｔ₃Ｎ−２ＨＦによって、糖の下部において脱保護し
た。このようにして、Ｔ^*Ｇ^iBuダイマー単位を合成し、ホスフィチル化して、Ｔ ^* Ｇ（ＭＭＩ）ホスホロアミダイトを得た。同様なやり方で、Ａ^BZ*Ｔ（ＭＭＩ）
ダイマーを合成し、スクシニル化して、制御多孔質ガラスに付着させた。

【０２０５】 ｂ．オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチドをＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐ
ｅｄｉｔｅ ８９０１核酸合成系上で合成した。各オリゴヌクレオチドに対して
多重１−μｍｏｌ合成を行なった。Ａ^* _MMIＴ固体サポートをカラムに装填した。
トリチル基をトリクロロ酢酸（１分間にわたって９７５μｌ）によって除去し、
アセトニトリル洗浄した。改変チオエート・プロトコールを用いて、オリゴヌク
レオチドを構築した。このプロトコールでは、標準アミダイトを３分間にわたっ
てデリバーした（２１０μｌ）。Ｔ^* _MMIＧアミダイトを２１０μｌを用いて全体
で２０分間にわたって二重結合させた(double coupled)。酸化剤、３Ｈ−１，２
−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬、
３．４ｇ Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬／２００ｍｌ アセトニトリル）の量は２２５
μｌであった（１分間待ち工程）。未反応ヌクレオシドを５０：５０混合物のテ
トラヒドロフラン／無水酢酸とテトラヒドロフラン／ピリジン／１−メチルイミ
ダゾールによってキャップした。合成期間中、トリチル・モニターによってトリ
チル収量を追跡した。最終ＤＭＴ基は完全な状態で残された。合成後に、合成カ
ートリッジの内容（１μｍｏｌｅ）をＰｙｒｅｘバイアルに移して、５ｍｌの３
０％水酸化アンモニウム（ＮＨ₄ＯＨ）を用いて、５５℃において約１６時間制
御多孔質ガラス（ＣＰＧ）からオリゴヌクレオチドを切断した。

【０２０６】 ｃ．オリゴヌクレオチド精製 脱保護工程後に、Ｇｅｌｍａｎ０．４５μｍナイロンアクロディスク・シリン
ジフィルター(nylon acrodisc syringe filter)を用いて、サンプルをＣＰＧか
ら濾別した。Ｓａｖａｎｔ ＡＳ１６０自動ＳｐｅｅｄＶａｃにおいて、過剰な
ＮＨ₄ＯＨを蒸発させた。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５２Ａ Ｄｉ
ｏｄｅ Ａｒｒａｙ分光光度計上で２６０ｎｍにおいて粗収量を測定した。次に
、粗サンプルをＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄエレクトロスプレイ質量分析計
上での質量分析法（ＭＳ）によって分析した。トリチル−オン オリゴヌクレオ
チドを逆相分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。Ｈ
ＰＬＣ条件は次の通りであった：９９１デテクター付きＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ
；Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ４カラム（７．８Ｘ３００ｍｍ）；Ｓ
ｏｌｖｅｎｔ Ａ：５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡ−Ａｃ
），ｐＨ７．０；Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂ：１００％アセトニトリル；２．５ｍｌ／
分流量；勾配：最初の５分間の５％Ｂから次の５５分間にＢが６０％まで直線的
に増加。所望の生成物を含有する画分（ＤＭＴ−ＯＮ−１６３１４に関しては保
持時間＝４１分間；ＤＭＴ−ＯＮ−１６３１５に関しては保持時間＝４２．５分
間）を回収し、溶媒をＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥させた。オリゴヌクレオチドを
８０％酢酸中で約６０分間脱トリチル化して、再度凍結乾燥させた。脱トリチル
化オリゴヌクレオチドをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（サイズ排除クロマトグラ
フィー）に通して、適当なサンプルをＰｈａｒｍａｃｉａフラクションコレクタ
ーに通して回収することによって、遊離トリチルと過剰な塩とを除去した。溶媒
を再びＳｐｅｅｄＶａｃにおいて蒸発させた。次に、精製されたオリゴヌクレオ
チドをＣＧＥ、ＨＰＬＣ（流量：１．５ｍｌ／分；Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ
Ｐａｋ Ｃ４カラム、３．９Ｘ３００ｍｍ）及びＭＳによって純度に関して分析
した。最終収量を２６０ｎｍにおいて分光光度計によって測定した。

【０２０７】 合成オリゴヌクレオチドとそれらの物理的特徴とをそれぞれ表ＶＩＩＩとＩＸ
に示す。星印を有するヌクレオシドの全てはＭＭＩ結合を含有する。

【０２０８】

【表１２】

【０２０９】

【表１３】

【０２１０】 ＨＰＬＣ条件：９９１デテクター付きＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ；Ｗａｔｅｒｓ Ｃ４カラム（３．９Ｘ３００ｍｍ）；Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡ
−Ａｃ，ｐＨ７．０；Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂ：１００％アセトニトリル；１．５ｍ
ｌ／分流量；勾配：最初の５分間の５％Ｂから次の５５分間にＢが６０％まで直
線的に増加。

【０２１１】 実施例５９ Ｓｐ末端オリゴヌクレオチドの合成 ａ．３’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−チミジン（１） ５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンをＤＭＦ溶媒中の１当量のｔ−ブチル
ジフェニルシリルクロリド（ＴＢＤＰＳＣｌ）と２当量のイミダゾールによって
、室温において、シリル化する。ＣＨ₂Ｃｌ₂中３％ジクロロ酢酸によって処理す
ることによって、５’−保護基を除去する。

【０２１２】 ｂ．５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン−３’−Ｏ−イル−Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピルアミノ（Ｓ−ピバロイル−２−メルカプトエトキシ）ホスホロアミ
ダイト（２） Ｇｕｚａｅｖ等，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９８，８，１１２３が述べているように、５
’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンをＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＣＮ中のビス−（Ｎ
、Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−Ｓ−ピバロイル−２−メルカプトエトキシホス
ホロアミダイトとテトラゾールによって処理して、標題化合物を得る。

【０２１３】 ｃ．５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−アデノシン−３’−Ｏ
−イル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ（Ｓ−ピバロイル−２−メルカプトエト
キシ）ホスホロアミダイト（３） ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベンゾイル−２’−デオキシ−アデ
ノシンを先行実施例におけるようにホスフィチル化して、所望のアミダイトを得
る。

【０２１４】 ｄ．３’−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−デオキシ−Ｎ₂−イソブ
チリル−グアノシン（４） ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−Ｎ₂−イソブチリル−グア
ノシンをＤＭＦ中のＴＢＤＰＳＣｌとイミダゾールによってシリル化する。次に
、５’−ＤＭＴをＣＨ₂Ｃｌ₂中の３％ＤＣＡによって除去する。

【０２１５】 ｅ．Ｔ_(Sp)ＧダイマーとＴ_(S)ホスホロアミダイト 化合物４と２とをＣＨ₃ＣＮ溶媒中の１Ｈ−テトラゾールを用いて縮合させた
（１：１当量）後に、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（例えば、Ｉｙｅｒ等，Ｊ．Ｏｒｇ
．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，４６９３参照）を用いて硫化(sulfurization)す
る。ダイマー（ＴＧ）をカラムクロマトグラフィーによって分離し、ｔ−ブチル
アンモニウムフルオリド／ＴＨＦを用いて、シリル基を脱保護して、Ｔ_SＧのＲ
ｐとＳｐダイマーを得る。少量のこれらのダイマーを完全に脱保護して、Ｐ１ヌ
クレアーゼ又はヘビ毒ホスホジエステラーゼのいずれかによって処理する。Ｒ異
性体はＰ１ヌクレアーゼに耐性であり、ＳＶＰＤによって加水分解される。Ｓ異
性体はＳＶＰＤに耐性であり、Ｐ１ヌクレアーゼによって加水分解される。完全
に保護されたＴ_SＧダイマーのＳｐ異性体をホスフィチル化して、ＤＭＴ−Ｔ−
Ｓｐ−Ｇ−ホスホロアミダイトを得る。

【０２１６】 ｆ．Ａ，Ｔダイマーと、固体サポート含有Ａ_spＴダイマー 化合物３と１とをＣＨ₃ＣＮ溶媒中の１Ｈ−テトラゾールを用いて縮合させた
後に、硫化してＡＴダイマーを得る。これらのダイマーをカラムクロマトグラフ
ィーによって分離し、ＴＢＡＦ／ＴＨＦを用いて、シリル基を脱保護する。一般
的に先行実施例におけるように、配置割当て(configurational assignments)を
行なう。次に、Ｓｐ異性体を標準方法によって制御多孔質ガラスに付着させて、
末端にキラル純粋なＳｐダイマーを有するＤＭＴ−Ａ_SP−Ｔ−ＣＰＧオリゴマー
(oligomerization)を得る。

【０２１７】 ｇ．オリゴヌクレオチド合成 配列Ｔ^*ＧＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡ^*Ｔを有するオリゴヌクレオチ
ドを合成する、この場合Ｔ^*ＧとＡ^*Ｔは上述したキラルＳｐダイマーブロックを
表す。ＤＭＴ−Ａ_SP−Ｔ−ＣＰＧを合成カラムに入れ、次の１６ｂ残基を標準ホ
スホロチオエート・プロトコールと、硫化剤としての３Ｈ−１，２−ベンゾジチ
オール−３−オン １，１−ジオキシドとを用いて構築する。この１８マー単位
を構築し、最終的に脱トリチル化した後に、５’−ＤＭＴ−Ｔ_SP−Ｇアミダイト
のキラルＳｐダイマーホスホロアミダイトを結合させて、所望のアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを得る。次に、この化合物を３０％ＮＨ₄ＯＨ中で１６時間に
わたって脱保護して、オリゴマーをＨＰＬＣにおいて精製し、Ｓｅｐｈａｄｅｒ
Ｇ−２５カラムで脱塩する。最終オリゴマーは５’−末端と３’−末端にＳｐ
配置を有し、内部はＲｐ配置とＳｐ配置とのジアステレオマー混合物を有する。

【０２１８】 実施例６０ ＭＭＩキャップしたオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ安定性の評価 マウス実験方法 試験した各オリゴヌクレオチドに対して、９匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス、体重
約２５ｇ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を用い
た。１週間順化させた後に、これらのマウスにリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ
）、ｐＨ７．０中で投与したオリゴヌクレオチド（５ｍｇ／ｋｇ）の単回尾静脈
注射を受けさせた。一方の眼窩後方出血（投与後０．２５、０．５、２若しくは
４ｌｖのいずれか）と末梢出血（投与後１、３、８若しくは２４時間のいずれか
）とを各グループから回収した。末梢出血（約０．６〜０．８ｍｌ）はケタミン
／キシラジン麻酔後の心臓穿刺によって回収した。血液をＥＤＴＡ被覆回収管に
移し、遠心分離して血漿を得た。終了時に、各マウスから肝臓と腎臓を回収した
。血漿と組織ホモジネートとを分析に用いて、完全なオリゴヌクレオチドの含量
をＣＧＥによって判定した。全てのサンプルは回収後直ちにドライアイス上で凍
結させ、分析まで−８０℃において貯蔵した。

【０２１９】 毛管ゲル電気泳動分析は、ＩＳＩＳ ３０８２（均質な２’−デオキシ−ホス
ホロチオエート）に比較したＭＭＩキャップしたオリゴマーの相対的ヌクレアー
ゼ耐性を示した。ＭＭＩ結合のヌクレアーゼ耐性のために、化合物１６３１４は
血漿中で安定であることが判明したが、３０８２は安定ではなかった。しかし、
腎臓及び肝臓においては、化合物１６３１４はある程度の分解をも示した。この
ことは、３’−エキソヌクレアーゼが血漿中では重要であるが、５’−エキソヌ
クレアーゼ又はエンドヌクレアーゼが組織中では活性でありうることを意味する
。これらの２つの可能性を区別するために、１６３１５からのデータを分析した
。組織（肝臓及び腎臓）中と同様に血漿中では、この化合物は種々な時点（１，
３及び２４時間）において安定であった。分解が検出されなかったという事実は
、組織中では５’−エキソヌクレアーゼと３’−エキソヌクレアーゼとが優勢で
あり、エンドヌクレアーゼは活性ではないことを実証した。その上、単結合（Ｍ
ＭＩ又はＳｐチオエート結合）はヌクレアーゼに対するゲートキーパーとして十
分である。

【０２２０】 ＩＣＡＭ−１発現細胞の対照と試薬 ｂＥｎｄ．３細胞系、脳内皮腫はＤｒ．Ｗｅｒｎｅｒ Ｒｉｓａｕ（Ｍａｘ−
Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の親切な贈り物であった。Ｏｐｔｉ−ＭＥ
Ｍ、トリプシン−ＥＤＴＡと高グルコースを有するＤＭＥＭとはＧｉｂｃｏ−Ｂ
ＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰ
ＢＳはＩｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から購入し
た。無菌の１２穴組織培養プレートとＦａｃｓｆｌｏｗ溶液とはＢｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）から購入した。超純粋なホル
ムアルデヒドはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）から
購入した。組換えヒトＴＮＦ−ａはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏ
ｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。マウス インターフェロン−γはＧｅｎｚｙｍｅ
（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入した。Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ，ＢＳＡは
Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。マウスＩＣＡＭ−１−Ｐ
Ｅ、ＶＣＡＭ−１−ＦＩＴＣ、ハムスターＩｇＧ−ＦＩＴＣ及びラットＩｇＧ_2a −ＰＥ抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した
。Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅナイロン・ブロッティング膜はＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃ
ｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から購入した。ＱｕｉｃｋＨｙｂ溶液はＳｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。ｃＤＮＡラベリングキット、Ｐｒ
ｉｍｅ−ａ−ＧｅｎｅはＰｒｏＭｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した
。ＮＡＰ−５カラムはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）か
ら購入した。

【０２２１】 オリゴヌクレオチド処理 ４．５ｇ／Ｌグルコースと１０％ＦＢＳとを含有するＤＭＥＭを含む１２穴プ
レートにおいて、細胞を約７５％集密度まで増殖させた。細胞を３７℃に予め温
めたＯｐｔｉ−ＭＥＭによって３回洗浄した。オリゴヌクレオチドにＯｐｔｉ−
ＭＥＭをプレミックスし、所望の濃度まで連続的に希釈し、３７℃において４時
間インキュベーションするために洗浄済み細胞上に移した。次に、培地を取り出
し、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αと２００Ｕ／ｍｌのインターフェロン−γを含む
又は含まない標準増殖培地と交換し、ｍＲＮＡのノーザンブロット分析のために
２時間又は細胞表面タンパク質発現のサイトメトリー分析のために一晩インキュ
ベートした。

【０２２２】 フローサイトメトリー オリゴヌクレオチド処理後に、細胞をプレートから短時間トリプシン−ＥＤＴ
Ａ処理（１〜２分間）によって脱離させた。細胞を１２ｘ７５ｍｍポリスチレン
管に移し、４℃においてＤ−ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ、０．２％アジ化ナトリウム
によって洗浄した。細胞をＢｅｃｋｍａｎ ＧＰＲ遠心分離機において１０００
ｒｐｍで遠心分離し、次に上澄み液をデカントした。ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−
１及び対照抗体を０．３ｍｌの上記緩衝液中の１μｇ／ｍｌで加えた。抗体を細
胞と共に、暗所で穏やかに撹拌しながら、４℃において３０分間インキュベート
した。細胞を再び上記と同様に洗浄してから、０．５％超純粋ホルムアルデヒド
を含むＦａｃｓＦｌｏｗ緩衝液 ０．３ｍｌ中に再懸濁させた。細胞をＢｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ上で分析した。結果は対照発現の％
として表す、これは次のように算出した：［（（オリゴヌクレオチド処理サイト
カイン誘導細胞のＣＡＭ発現）−（基底ＣＡＭ発現））／（（サイトカイン誘導
ＣＡＭ発現）−（基底ＣＡＭ発現））］ｘ１００．カチオン性脂質を包含する実
験のためには、基底対照細胞とサイトカイン処理対照細胞の両方をＬｉｐｏｆｅ
ｃｔｉｎによってオリゴヌクレオチドの不存在下で４時間、前処理した。

【０２２３】 これらの結果は次のことを明らかにする：（１）Ｉｓｉｓ ３０８２は予想さ
れた用量反応（２５〜２００ｎＭ）を示した；（２）Ｉｓｉｓ １３００１は、
ミスマッチ化合物から予想されるようにＩＣＡＭ−１発現を阻害するその能力を
失い、したがってアンチセンス機構を実証した；（３）３’−ＭＭＩキャップし
たオリゴマー１６３１４は３０８２の活性を改良し、２００ｎＭ濃度において、
３０８２のほぼ２倍活性であった；（４）５’−及び３’−ＭＭＩキャップした
オリゴマーは最も強力な化合物であり、１００ｎＭ及び２００ｎＭ濃度において
親化合物よりもほぼ４〜５倍有効である。したがって、改良されたヌクレアーゼ
耐性はアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を高めた。

【０２２４】 実施例６１ Ｈ−ｒａｓ発現の制御 Ｈ−ｒａｓメッセージをターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチドを
、Ｔ−２４細胞におけるＨ−ｒａｓ ｍＲＮＡの産生を阻害するそれらの能力に
関して試験した。これらの試験のために、Ｔ−２４細胞を６穴プレートで平板培
養し(plated)、１００ｎＭ オリゴヌクレオチドにつき２．５μｇ／ｍｌ Ｌｉ
ｐｏｆｅｃｔｉｎの比率でのカチオン性脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ，ＧＩＢＣ
Ｏ）の存在下で、種々な上昇する濃度のオリゴヌクレオチドによって処理した。
オリゴヌクレオチド処理は無血清培地中で４時間にわたって実施した。処理後１
８時間に、総ＲＮＡを回収し、Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡと対照遺伝子(control gen
e)Ｇ３ＰＤＨに関してノーザンブロットによって分析した。データは、図８と９
に、Ｇ３ＰＤＨシグナルに対して標準化した対照％として棒グラフで表す。見る
ことができるように、隣接領域の各々に単ＭＭＩ結合を有するオリゴヌクレオチ
ドはＨ−ｒａｓ ｍＲＮＡの顕著な減少を示した。

【０２２５】 実施例６２ ５−リポキシゲナーゼ分析とアッセイ Ａ．治療薬 治療用途に関して、５−リポキシゲナーゼの過剰な又は異常な供給を特徴とす
る疾患を有すると疑われる動物を本発明の化合物を投与することによって治療す
る。通常に熟練した人々は最適投与量、投与方法及び反復速度を容易に決定する
ことができる。このような治療は一般に、治癒が生じるか又は症状の軽減が達成
されるまで続けられる。幾つかの疾患に対しては、長期間治療が適当である。

【０２２６】 Ｂ．研究試薬 本発明のオリゴヌクレオチドは、粗細胞溶解物中又は部分的若しくは完全な精
製ＲＮＡ製剤中の５−リポキシゲナーゼｍＲＮＡを切断する又は他のやり方でモ
ジュレートするために用いる場合に、研究試薬(research reagents)としても有
用である。本発明のこの適用は、例えば、細胞を標準方法によって溶解し、ＲＮ
Ａを最適に抽出してから、これを、例えば、５０ｍｍリン酸塩、約４〜１０の範
囲のｐＨから成る緩衝液中の総ＲＮＡ １０Ｍｇにつき約１００〜約５００ｎｇ
の範囲の濃度の組成物によって、約３０〜約５０℃の温度において処理すること
によって達成される。切断した５−リポキシゲナーゼＲＮＡをアガロースゲル電
気泳動と、放射性標識ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションとによって、
又は他の標準方法によって分析することができる。

【０２２７】 Ｃ．診断薬 本発明のオリゴヌクレオチドは診断用途にも、特に、種々な組織中の特異的ｍ
ＲＮＡ種の発現又は異常な若しくは突然変異ＲＮＡ種の発現を判定するために有
用である。この実施例では、マクロ分子は異常な配列に相補的に設計されること
によって異常なｍＲＮＡをターゲットにするが、これらは正常なｍＲＮＡにハイ
ブリダイズしない。組織サンプルはホモジナイズすることができ、ＲＮＡを標準
方法によって抽出することができる。粗ホモジネート又は抽出物を例えばターゲ
ットＲＮＡの切断が生じるように処理することができる。次に、生成物を、切断
部位の５’側の領域に相補的な結合オリゴヌクレオチドを含有する固体サポート
にハイブリダイズさせることができる。ｍＲＮＡの正常な５’領域と異常な５’
領域の両方が固体サポートに結合すると考えられる。切断される、異常なＲＮＡ
の３’領域はサポートに結合しないので、正常なｍＲＮＡから分離されると考え
られる。

【０２２８】 モジュレーションのためのターゲットｍＲＮＡ種は５−リポキシゲナーゼに関
連する；しかし、本発明がこれに限定されず、一般的に適用可能であることを当
業者は理解するであろう。酵素５−リポキシゲナーゼの産生の阻害又はモジュレ
ーションは、疾患の治療分野に有意な治療的利益をもたらすと期待される。組成
物の有効性を評価するために、アッセイ又は一連のアッセイが必要である。

【０２２９】 Ｄ．ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ ５−リポキシゲナーゼに関する細胞アッセイは好ましくは、ヒト前骨髄球性白
血病細胞系ＨＬ−６０を用いる。これらの細胞は種々な既知作用剤によって、単
球様細胞又は好中球様細胞のいずれかに分化するように誘導されうる。１．３％
ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯによる細胞の処理が細胞の好中球への分化を促
進することが知られている。基底ＨＬ−６０細胞が検出可能なレベルの５−リポ
キシゲナーゼタンパク質を合成しない又はロイコトリエン（５−リポキシゲナー
ゼの下流産物）を分泌しないことが、現在判明している。ＤＭＳＯによるこれら
の細胞の分化が、ＤＭＳＯの添加後４８時間に、５−リポキシゲナーゼタンパク
質及びロイコトリエンの生合成を出現させる。したがって、これらの細胞におけ
る５−リポキシゲナーゼ合成を妨害するオリゴヌクレオチドの分析のための試験
系として、５−リポキシゲナーゼタンパク質合成の誘導を利用することができる
。オリゴヌクレオチドの第２試験系は、５−リポキシゲナーゼが、基質との反応
時にそれ自体を不活化することから、“自殺”酵素であるという事実を利用する
。 分化したＨＬ−６０又は５−リポキシゲナーゼを発現する他の細胞の、１０μＭ
Ａ２３１８７、カルシウムイオノホアによる処理は、細胞質ゾルから膜への５
−リポキシゲナーゼのトランスロケーションを促進し、その後の酵素の活性化を
付随する。活性化及び数ラウンドの触媒作用後に、この酵素は触媒的に不活性に
なる。したがって、カルシウムイオノホアによるこれらの細胞の処理は内因性５
−リポキシゲナーゼを不活化する。ロイコトリエンＢ₄を合成するこれらの細胞
の能力によって判定すると、これらの細胞がＡ２３１８７処理から回復するには
約２４時間を要する。５−リポキシゲナーゼに対して向けられるマクロ分子を、
２つのＨＬ−６０モデル系における活性に関して、下記定量アッセイを用いて試
験することができる。これらのアッセイは、完全な状態の細胞における５−リポ
キシゲナーゼタンパク質合成の阻害の最も直接的な測定から、例えば、完全な状
態の細胞における５−リポキシゲナーゼ活性の測定のような、より下流のイベン
トまで述べられている。

【０２３０】 オリゴヌクレオチドが完全な状態の細胞に及ぼすことができ、容易に定量され
ることができる直接的効果は、５−リポキシゲナーゼタンパク質合成の特異的な
阻害である。この技法を実行するためには、細胞を³⁵Ｓ−メチオニン（５０μＣ
ｉ／ｍｌ）によって３７℃において２時間標識して、新たに合成されたタンパク
質を標識することができる。細胞を抽出して、総細胞タンパク質を可溶化し、５
−リポキシゲナーゼを５−リポキシゲナーゼ抗体によって免疫沈降させてから、
プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズから溶離した。免疫沈降したタンパク
質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分解して、オートラジオ
グラフィーに暴露させる。免疫沈降した５−リポキシゲナーゼの量を走査デンシ
トメトリーによって定量する。これらの実験からの予測結果は次の通りである。
対照細胞からの免疫沈降５−リポキシゲナーゼタンパク質の量を１００％に標準
化する。本発明のマクロ分子の１μＭ、１０μＭ及び３０μＭによる４８時間の
細胞処理は、免疫沈降５−リポキシゲナーゼをそれぞれ対照の５％、２５％及び
７５％減少させると考えられる。

【０２３１】 細胞ホモジネート中の５−リポキシゲナーゼ酵素活性の測定は、ロイコトリエ
ンを合成することができる、存在する酵素量を定量するために用いることもでき
る。現在、放射分析は、逆相ＨＰＬＣを用いて、細胞ホモジネート中の５−リポ
キシゲナーゼ酵素活性の定量のために発展している。プロテアーゼ阻害剤とＥＤ
ＴＡとを含有する緩衝液中での音波処理によって、細胞を破壊する。細胞ホモジ
ネートを１０，０００ｘｇにおいて３０分間遠心分離して、上澄み液を５−リポ
キシゲナーゼ活性に関して分析する。細胞質ゾルタンパク質を１０μＭ¹⁴Ｃ−ア
ラキドン酸、２ｍＭ ＡＴＰ、５０μＭ遊離カルシウム、１００μｇ／ｍｌホス
ファチジルコリン及び５０ｍＭビス−Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．０と共に３７℃
において５分間インキュベートする。反応を当量のアセトンの添加によってクエ
ンチし、脂肪酸を酢酸エチルによって抽出する。基質と反応生成物とをＮｏｖａ
ｐａｋ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｉｎｃ．Ｍｉｌｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上で
の逆相ＨＰＬＣによって分離する。放射性ピークをＢｅｃｋｍａｎモデル１７１
ラジオクロマトグラフィー・デテクターによって検出する。アラキドン酸の量を
ｄｉ−ＨＥＴＥ’ｓに転化し、ｍｏｎｏ−ＨＥＴＥ’ｓを５−リポキシゲナーゼ
活性の尺度として用いる。

【０２３２】 １μＭ、１０μＭ及び３０μＭの本発明の有効なマクロ分子による７２時間の
ＤＭＳＯ分化ＨＬ−６０細胞の処理に関する予測結果は次の通りである。対照細
胞は２００ｐｍｏｌアラキドン酸／５分間／１０⁶細胞を酸化する。１μＭ、１
０μＭ及び３０μＭの有効オリゴヌクレオチドによって処理した細胞は、それぞ
れ、１９５ｐｍｏｌ、１４０ｐｍｏｌ及び６０ｐｍｏｌのアラキドン酸／５分間
／１０⁶細胞を酸化すると考えられる。

【０２３３】 細胞中の総５−リポキシゲナーゼタンパク質の測定のための定量的競合エンザ
イムイムノアッセイ(enzyme linked immunosorbant assay)（ＥＬＩＳＡ）が開
発されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に発現され、抽出、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ、ヒドロキシアパタイト及び逆相ＨＰＬＣによって精製されたヒト５−リ
ポキシゲナーゼを標準として及びマイクロタイタープレートに塗布するための一
次抗原として用いる。精製した５−リポキシゲナーゼ（２５ｎｇ）をマイクロタ
イタープレートに４℃において一晩結合させる。１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＴＢＳ
）の存在下の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中で希釈した５％
ヤギ血清によって、穴を９０分間ブロックする。細胞抽出物（０．２％Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００，１２，０００ｘｇ，３０分間）又は精製５−リポキシゲナー
ゼをマイクロタイター穴中で総量１００μｌにおいて５−リポキシゲナーゼポリ
クローナル抗体の１：４０００希釈物と共に９０分間インキュベートした。精製
ヒト組換え５−リポキシゲナーゼによってウサギを免疫性にすることによって、
抗体を調製する。穴を０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳＴ
）によって洗浄してから、ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｐｐ
ｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）の１：１０００希釈
物 １００μｌと共に２５℃において６０分間インキュベートする。穴をＴＢＳ
Ｔによって洗浄し、オキシダーゼ標識二次抗体の量をテトラメチルベンジジンに
よって展開させて、測定する。

【０２３４】 １μＭ、１０μＭ及び３０μＭにおいて３０マーのオリゴヌクレオチドを用い
た、このようなアッセイからの予測結果は、それぞれ、１０⁶細胞につき３０ｎ
ｇ、１８ｎｇ及び５ｎｇの５−リポキシゲナーゼであり、非処理細胞は約３４ｎ
ｇの５−リポキシゲナーゼを含有する。５−リポキシゲナーゼ生合成の阻害の正
味効果は、刺激された細胞から放出されるロイコトリエン量の減少である。ＤＭ
ＳＯ分化ＨＬ−６０細胞はカルシウムイオノホアＡ２３１８７によって刺激され
たときにロイコトリエンＢ４を放出する。細胞培地中に放出されるロイコトリエ
ンＢ４は商業的に入手可能な診断キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅ
ａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いるラジオイムノアッセイによって定量するこ
とができる。ロイコトリエンＢ４産生は、細胞を好中球様細胞に分化させるＤＭ
ＳＯの添加後４８時間に、ＨＬ−６０細胞中で検出することができる。細胞（２
ｘ１０⁵細胞／ｍｌ）を上昇する濃度のマクロ分子によって１．３％ＤＭＳＯの
存在下で４８〜７２時間処理する。細胞を洗浄し、２ｘ１０⁶細胞／ｍｌの濃度
で、１％脱脂ウシ血清アルブミンを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生
理食塩水中に再懸濁させる。細胞を１０μＭカルシウムイオノホアＡ２３１８７
によって１５分間刺激して、５ｘ１０⁵細胞から産生されるＬＴＢ４量を製造者
が述べているようにラジオイムノアッセイによって測定する。

【０２３５】 このアッセイを用いると、５−ＬＯｍＲＮＡに向けられるオリゴヌクレオチド
によって次の結果が得られうる。細胞を１μＭ、１０μＭ又は３０μＭのマクロ
分子のいずれかによって１．３％ＤＭＳＯの存在下で７２時間処理する。５ｘ１
０⁵細胞から産生されるＬＴＢ₄量は、それぞれ、約７５ｐｇ、５０ｐｇ及び３５
ｐｇであり、非処理分化細胞は７５ｐｇのＬＴＢ₄を産生すると予想される。

【０２３６】 Ｅ．ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ マウスにおける５−リポキシゲナーゼ産生の阻害は下記プロトコールによって
実証することができる。アラキドン酸の局所塗布が皮膚におけるロイコトリエン
Ｂ₄、ロイコトリエンＣ₄及びプロスタグランジンＥ₂の迅速な産生と、それに続
く浮腫と細胞浸潤を生じる。５−リポキシゲナーゼのある一定の阻害剤はこのア
ッセイにおいて活性を示すことが知られている。アッセイのために、２ｍｇのア
ラキドン酸をマウスの耳に塗布し、対側の耳は対照として用いる。アラキドン酸
の投与後１時間に、バイオプシーから採取されたホモジネート中のミエロペルオ
キシダーゼ活性によって、多形核細胞浸潤を分析する。耳厚さの測定と穿刺バイ
オプシーの湿重量とによって、浮腫反応を定量する。バイオプシー試験片(speci
men)中に産生されたロイコトリエンＢ₄の測定を、組織における５−リポキシゲ
ナーゼ活性の直接の測定として行なう。化合物の最適の活性を可能にするために
アラキドン酸投与前１２〜２４時間に、両耳にオリゴヌクレオチドを局所塗布す
る。アラキドン酸によるチャレンジ前に０．１μｍｏｌ、０．３μｍｏｌ又は１
．０μｍｏｌのマクロ分子によって両耳を２４時間前処理する。数値は濃度当り
の３動物の平均値として表す。０．１μｍｏｌ、０．３μｍｏｌ及び１μｍｏｌ
での多形核細胞浸潤の阻害は、それぞれ、対照活性の約１０％、７５％及び９２
％であると予想される。浮腫の阻害はそれぞれ約３％、５８％及び９０％である
と予想され、ロイコトリエンＢ₄産生の阻害はそれぞれ約１５％、７９％及び９
９％であると予想される。

【０２３７】 実施例６３ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メチレン−５−メチルウリジン−３
’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト ２’−デオキシ−２’−メチレン−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジ
シロキサン−１，３−ジイル）−５−メチルウリジンを、対応するウリジン誘導
体に関して報告された方法（Ｈａｎｓｓｋｅ，Ｆ．；Ｍａｄｅｊ，Ｄ．；Ｒｏｂ
ｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９８４）４０，１２５；Ｍａｔ
ｓｕｄａ，Ａ．；Ｔａｋｅｎｕｓｉ，Ｋ．；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．；Ｓａｓａｋｉ
，Ｔ．；Ｕｅｄａ，Ｔ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）３４，８１２；
さらに、Ｃｏｒｙ，Ａ．Ｈ．；Ｓａｍａｎｏ，Ｖ．；Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．；
Ｃｏｒｙ，Ｊ．Ｇ．，“培養中のＬ１２１０細胞増殖の阻害剤としてのアデノシ
ン、グアノシン、ツベルシジン、シチジン及びウリジンの２’−デオキシ−２’
−メチレン誘導体”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９４），４
７（２），３６５−７１も参照）に従って合成する。

【０２３８】 これをＴＨＦ中のＩＭ ＴＢＡＦによって処理して、２’−デオキシ−２’−
メチレン−５−メチルウリジンを得る。これをピリジン中に溶解して、ＤＭＴ−
Ｃｌによって処理し、撹拌して、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−メ
チレン−５−メチルウリジンを得る。この化合物を２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピルホスホロアミダイトとジイソプロピルアミノテトラゾリドとによ
って処理する。同様な方法で、対応するＮ−６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ−４
−ベンゾイルシトシン、Ｎ−２−イソブチリルグアノシンホスホロアミダイト誘
導体が合成される。

【０２３９】 実施例６３ ３’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシドの合成 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレンウリジンと５−メチルウリ
ジンを合成して、Ｏｂｉｋａ等の方法（Ｏｂｉｋａ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．
Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）９，５１５−１５８）によってホスフィチル
化する。アミダイトを上記プロトコールを用いて、オリゴヌクレオチドに組み入
れる。

【０２４０】 実施例６４ ２’−メチレンホスホロアミダイトの合成 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−（メチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，
Ｎ−ジイソプロピルアミン）−５−メチルウリジン−ホスホロアミダイト、５’
−Ｏ−ＤＭＴ−２’−（メチル）−Ｎ−６−ベンゾイルアデノシン（３’−Ｏ−
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、５’
−Ｏ−ＤＭＴ−２’−（メチル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−
（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト及び
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−（メチル）−Ｎ−４−ベンゾイルシチジン−３’−Ｏ
−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイトを
対応ヌクレオシドのホスフィチル化によって得た。これらのヌクレオシドをＩｒ
ｉｂａｒｒｅｎ，Ａｄｏｌｆｏ Ｍ．；Ｃｉｃｅｒｏ，Ｄａｎｉｅｌ Ｏ．；Ｎ
ｅｕｎｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐｅ Ｊ．“（２’Ｓ）−２’−デオキシ−２’−Ｃ
−メチルオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解耐性，新規な可能アンチセンス
プローブ”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，（１９９４）、４（２）、
９５−８；Ｓｃｈｍｉｔ，Ｃｈａｎｔａｌ；Ｂｅｖｉｅｒｒｅ，Ｍａｒｃ−Ｏｌ
ｉｖｉｅｒ；Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ，Ａｌａｉｎ；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋａｒ
ｌ−Ｈｅｉｎｚ，“オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び安定性に
及ぼす２’−及び３’−アルキル置換基の効果”，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｌｅｔｔ．（１９９４），４（１６），１９６９−７４によって述べられ
ている合成した。

【０２４１】 ホスフィチル化はビスアミダイト方法を用いて実施する。 実施例６５ ２’−Ｓ−メチルホスホロアミダイトの合成 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｓ−（メチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン）−５−メチルウリジン−ホスホロアミダイト、
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｓ−（メチル）−Ｎ−６−ベンゾイルアデノシン（３
’−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイ
ト、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｓ−（メチル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン
−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロア
ミダイト及び５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｓ−（メチル）−Ｎ−４−ベンゾイルシ
チジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホス
ホロアミダイトを対応ヌクレオシドのホスフィチル化によって得た。ヌクレオシ
ドはＦｒａｓｅｒ等が述べている方法（Ｆｒａｓｅｒ，Ａ．；Ｗｈｅｅｌｅｒ，
Ｐ．；Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｄ．；Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙ
ｃｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）３１，１２７７−１２８７）によって合成した。
ホスフィチル化はビスアミダイト方法を用いて実施する。

【０２４２】 実施例６６ ２’−Ｏ−メチル−β−Ｄ−アラビノフラノシル化合物の合成 ２’−Ｏ−メチル−β−Ｄ−アラビノフラノシル−チミジン含有オリゴヌクレ
オチドはＧｏｔｆｒｅｄｓｏｎ等の方法（Ｇｏｔｆｒｅｄｓｏｎ，Ｃ．Ｈ．等，
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９４）３５，６９４１−６９４４；
Ｇｏｔｆｒｅｄｓｏｎ，Ｃ．Ｈ．等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９
９６）４，１２１７−１２２５）に従って合成した。５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−
ａｒａ−（Ｏ−メチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロ
ピルアミン）−５−メチルウリジン−ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ＤＭＴ−
２’−ａｒａ−（Ｏ−メチル）−Ｎ−６−ベンゾイルアデノシン（３’−Ｏ−２
−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、５’−
Ｏ−ＤＭＴ−２’−ａｒａ−（Ｏ−メチル）−Ｎ２−イソブチリルグアノシン−
３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミ
ダイト及び５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−ａｒａ−（Ｏ−メチル）−Ｎ−４−ベンゾ
イルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ
）ホスホロアミダイトを対応ヌクレオシドのホスフィチル化によって得る。ヌク
レオシドはＧｏｔｆｒｅｄｓｏｎ，Ｃ．Ｈ．等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔ．（１９９４）３５，６９４１−６９４４；Ｇｏｔｆｒｅｄｓｏｎ，Ｃ．Ｈ
．等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）４，１２１７−１２２５
が述べている方法に従って合成する。ホスフィチル化はビスアミダイト方法を用
いて実施する。

【０２４３】 実施例６７ ２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル化合物の合成 ２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシルオリゴヌクレオチドは、Ｋｏｉ
ｓ，Ｐ．等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １２，１０９
３，１９９３とＤａｍｈａ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，１２９
７６，１９９８及びこれらに引用された参考文献による方法に従って合成する。
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−ａｒａ−（フルオロ）−３’−Ｏ−（２−シアノエチ
ル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン）−５−メチルウリジン−ホスホロアミダイ
ト、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−ａｒａ−（フルオロ）−Ｎ−６−ベンゾイルアデ
ノシン（３’−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホ
ロアミダイト、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−ａｒａ−（フルオロ）−Ｎ２−イソブ
チリルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルア
ミノ）ホスホロアミダイト及び５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−ａｒａ−（フルオロ）
−Ｎ−４−ベンゾイルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルアミノ）ホスホロアミダイトは、対応ヌクレオシドのホスフィチル化
によって得る。これらのヌクレオシドはＫｏｉｓ，Ｐ．等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ
ｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １２，１０９３，１９９３とＤａｍｈａ等，Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，１２９７６，１９９８が述べている方法
によって合成する。ホスフィチル化はビスアミダイト方法を用いて実施する。

【０２４４】 実施例６８ ２’−ヒドロキシル−β−Ｄ−アラビノフラノシル化合物の合成 ２’−ヒドロキシル−β−Ｄ−アラビノフラノシルオリゴヌクレオチドは、Ｒ
ｅｓｍｉｎｉとＰｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７６，
１５８，１９９３；Ｓｃｈｍｉｔ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ
ｔ．４，１９６９，１９９４；Ｒｅｓｍｉｎｉ，Ｍ．；Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，
Ｗ．，“アラビノ核酸（ｔＡＮＡ）の合成”，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ
．Ｌｅｔｔ．（１９９４），１６，１９１０；Ｒｅｓｍｉｎｉ Ｍａｔｔｈｉａ
ｓ；Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｗ．，“ヌクレオシド パートＬＶ． アラビノグ
アノシン構築ブロックの効果的な合成”（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，（１
９９４），７７，４２９−３４とＤａｍｈａ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
，１９９８，１２０，１２９７６及びこれらに引用されている参考文献）が述べ
ている方法に従って合成する。

【０２４５】 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−ａｒａ−（ヒドロキシ）−３’−Ｏ−（２−シアノ
エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン）−５−メチルウリジン−ホスホロアミ
ダイト、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−ａｒａ−（ヒドロキシ）−Ｎ−６−ベンゾイ
ルアデノシン（３’−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）
ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−ａｒａ−（ヒドロキシ）−Ｎ２
−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプ
ロピルアミノ）ホスホロアミダイト及び５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−ａｒａ−（ヒ
ドロキシ）−Ｎ−４−ベンゾイルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ
，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイトは、対応ヌクレオシドのホス
フィチル化によって得る。これらのヌクレオシドはＫｏｉｓ，Ｐ．等，Ｎｕｃｌ
ｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １２，１０９３，１９９３とＤａｍ
ｈａ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，１２９７６，１９９８が述べ
ている方法によって合成する。ホスフィチル化はビスアミダイト方法を用いて実
施する。

【０２４６】 実施例６９ ジフルオロメチレン化合物の合成 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−５−メチル
ウリジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダ
イト）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフルオロメチレン−Ｎ−
４−ベンゾイル−シチジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−ジフル
オロメチレン−Ｎ−６−ベンゾイルアデノシン及び５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デ
オキシ−２’−ジフルオロエチレン−Ｎ₂−イソブチリルグアノシンは、Ｕｓｍ
ａｎ等（米国特許５６３９６４９，１９９７年６月１７日）が述べている方法に
従って合成する。

【０２４７】 実施例７０ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−β−（Ｏ−アセチル）−２’−α−
メチル−Ｎ６−ベンゾイル−アデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの合成 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−β−（ＯＨ）−２’−α−メチル
アデノシンは、化合物 ５’−３’−保護−２’−ケト−アデノシンから合成す
る（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｓｐｒｉｎｚｌ及びＢａｋｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ．４２３３，１９７０；核酸関連化合物も参照）。２’−及び３
’−ケトヌクレオシドを合成するための便利な方法は、Ｈａｎｓｓｋｅ等，Ｄｅ
ｐ．Ｃｈｅｍ．，Ｕｎｉｖ．Ａｌｂｅｒｔａ，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ｃａｎ．，Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８３），２４（１５），１５８９−９
２が、ＴＨＦ溶媒中のＭｅＭｇＩのＧｒｉｇａｎｄ添加、その後の異性体分離に
よって示している。２−β−（ＯＨ）はアセテートとして保護される。５’−３
’−アセタール基を除去し、５’−位置ジメトキシをトリチル化し、Ｎ−６位置
をベンゾイル化し、次に３’−位置をホスフィチル化して、５’−Ｏ−ＤＭＴ−
２’−デオキシ−２’−β−（Ｏ−アセチル）−２’−α−メチル−Ｎ６−ベン
ゾイル−アデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホ
スホロアミダイトを得る。

【０２４８】 実施例７１ ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−α−エチニル−Ｎ６−ベンゾイル−アデノシン−３’
−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの合成 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−２’−β−（ＯＨ）−２’−α−エチニ
ル−アデノシンは、化合物 ５’−３’−保護−２’−ケト−アデノシン（Ｒｏ
ｓｅｎｔｈａｌ，Ｓｐｒｉｎｚｌ及びＢａｋｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔ．４２３３，１９７０）から、ＴＨＦ溶媒中のエチニル−ＭｇＩのＧｒｉ
ｇａｎｄ添加、その後の異性体分離によって合成する。２’−β−（ＯＨ）をＲ
ｏｂｉｎｓの脱酸素方法（Ｒｏｂｉｎｓ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１
９８３），１０５，４０５９−６５）によって除去する。５’−３’−アセター
ル基を除去し、５’−位置をジメトキシトリチル化し、Ｎ−６位置をベンゾイル
化し、次に３’−位置をホスフィチル化して、標題化合物を得る。

【０２４９】 実施例７２ ２’−Ｏ−（グアイアコリル）−５−メチルウリジン １００ｍｌボンベにおいてテトラヒドロフラン中のボランの溶液（１Ｍ，１０
ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）に撹拌しながら、２−メトキシフェノール（６．２ｇ，５
０ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。固体が溶解するにつれて水素ガスが発生した、Ｏ
−２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．２ｇ，５ｍｍｏｌ）と炭酸
水素ナトリウム（２．５ｍｇ）を加え、ボンベをシールし、油浴に入れ、１５５
℃に３６時間加熱した。ボンベを室温に冷却して、開けた。粗溶液を濃縮し、残
渣を水（２００ｍｌ）とヘキサン（２００ｍｌ）とに分配した。過剰なフェノー
ルをヘキサン中に抽出した。水層を酢酸エチル（３ｘ２００ｍｌ）によって抽出
し、一緒にした有機層を水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃
縮した。残渣を溶離剤としてメタノール：塩化メチレン（１／１０，ｖ／ｖ）を
用いるシリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。画
分を回収して、ターゲット画分を濃縮して、４９０ｍｇの純粋な生成物を白色固
体として得た。ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ（１０：１）中でＲｆ＝０．５４５．Ｃ_{1 7} Ｈ₂０Ｎ₂Ｏ₇としてのＭＳ／ＥＳ，３６４．４；実測３６４．９． 実施例７３ ５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシフェニル）−５−メチル
ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホ
スホロアミダイト ２’−Ｏ−（グアイアコリル）−５−メチル−ウリジンをピリジン中の１．２
当量のジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ）によって処理して、５’−
Ｏ−ジメトキシトリチル化ヌクレオシドを得る。ピリジンを蒸発させ、仕上げ処
理（ＣＨ₂Ｃｌ₂／飽和ＮａＨＣＯ₃溶液）した後に、化合物をシリカゲルカラム
で精製する。５’−保護ヌクレオシドを無水塩化メチレン中に溶解し、アルゴン
雰囲気下で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノヒドロテトラゾリド（０．５当量）
とビス−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチル−ホスホロアミダイ
ト（２当量）とをシリンジから１分間かけて加える。反応混合物をアルゴン下、
室温において１６時間撹拌してから、シリカカラムに供給する。ヘキサン：酢酸
エチル（２５：７５）によって溶出して、標題化合物を得る。

【０２５０】 実施例７４ ５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシフェニル）−５−メチル
ウリジン−３’−Ｏ−スクシネート 実施例７３からの５’−保護ヌクレオシドをピリジン中の２当量の無水コハク
酸と０．２当量の４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンによって処理する。２時
間後に、ピリジンを蒸発させ、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解し、１００ｍｌの１０
％クエン酸溶液によって３回洗浄する。有機層を無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥させて
、所望のスクシネートを得る。次に、このスクシネートを確立された方法を用い
て、制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）に付着させる（Ｐｏｎ，Ｒ．Ｔ．，“オリゴヌ
クレオチド合成のための固相サポート”，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ（
編集），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔａｗａ，ＮＪ，１９９３，４６５−
４９６）。

【０２５１】 実施例７５ ５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（トランス−２−メトキシシクロヘキシ
ル）−５−メチルウリジン ２’−３’−Ｏ−ジブチルスタニル−５−メチルウリジン（Ｗａｇｎｅｒ等，
Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７４，３９，２４）をトランス−２−メトキシシ
クロヘキシルトシラートによってＤＭＦ中、７０℃においてアルキル化する。こ
の反応では、２’−Ｏ−（トランス−２−メトキシシクロヘキシル）−５−メチ
ルウリジンと３’−Ｏ−（トランス−２−メトキシシクロヘキシル）−５−メチ
ルウリジンとの１：１混合物が得られる。ＤＭＦ溶媒を蒸発させた後に、粗混合
物をピリジン中に溶解し、ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ）（１．
５当量）によって処理する。得られた混合物をシリカゲル・フラッシュカラムク
ロマトグラフィーによって精製して、標題化合物を得る。

【０２５２】 実施例７６ ５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（トランス−２−メトキシシクロヘキシ
ル）−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプ
ロピルアミノ）ホスホロアミダイト ５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（トランス−２−メトキシシクロヘキ
シル）−５−メチルウリジンを上記方法によってホスフィチル化して、所望のホ
スホロアミダイトを得る。

【０２５３】 実施例７７ ５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（トランス−２−メトキシシクロヘキシ
ル）−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（スクシニル−アミノ）ＣＰＧ ５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（トランス−２−メトキシシクロヘキ
シル）−５−メチルウリジンをスクシニル化して、制御多孔質ガラスに付着させ
て、固相サポート結合ヌクレオシドを得る。

【０２５４】 実施例７８ トランス−２−ウレイド−シクロヘキサノール トランス−２−アミノ−シクロヘキサノール（Ａｌｄｒｉｃｈ）を塩化メチレ
ン中のトリホスゲン（１／３当量）によって処理する。得られた溶液に、過剰な
水酸化アンモニウムを加えて、仕上げ処理後、標題化合物を得る。

【０２５５】 実施例７９ ２’−Ｏ−（トランス−２−ウレイド−シクロヘキシル）−５−メチルウリジン １０ｍｌボンベにおいてテトラヒドロフラン中のボランの溶液（１Ｍ，１０ｍ
ｌ，１０ｍｍｏｌ）に撹拌しながら、トランス−２−ウレイド−シクロヘキサノ
ール（５０ｍｍｏｌ）を加える。反応物が溶解するにつれて水素ガスが発生する
。Ｏ−２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（５ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナ
トリウム（２．５ｍｇ）をボンベに加え、シールする。次に、これを１４０に７
２時間加熱する。ボンベを室温に冷却して、開ける。粗物質を上記で例示したよ
うに仕上げ処理し、次に、シリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィーに
よって精製して、標題化合物を得た。

【０２５６】 実施例８０ ５’−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（トランス−２−ウレイド−シ
クロヘキシル）３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ウリ
ジンホスホロアミダイト 実施例２に例示した方法に従って、２’−Ｏ−（トランス−２−ウレイド−シ
クロヘキシル）−５−メチルウリジンを５’−ＯＨにおいてトリチル化し、３’
−ＯＨにおいてホスフィチル化して、標題化合物を得る。

【０２５７】 実施例８１ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（トランス−２−ウレイド−シクロ
ヘキシル）−５−メチル−３’−Ｏ−（スクシニル）−アミノＣＰＧウリジン 上述したように、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（トランス−２
−ウレイド−シクロヘキシル）−５−メチルウリジンをスクシニル化し、ＣＰＧ
に付着させる。

【０２５８】 実施例８２ ２’−Ｏ−（トランス−２−メトキシ−シクロヘキシル）アデノシン トランス−２−メトキシシクロペンタノール、トランス−２−メトキシシクロ
ヘキサノール、トランス−２−メトキシ−シクロペンチルトシラート及びトラン
ス−２−メトキシ−シクロヘキシルトシラートを報告された方法（Ｒｏｂｅｒｔ
ｓ，Ｄ．Ｄ．，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｗ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９
６７，３４，２４１５−２４１７；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６２，
１８５７−１８５９）によって製造する。５℃において乾燥ジメチルホルムアミ
ド（８００ｍｌ）中のアデノシン（４２．７４ｇ，０．１６ｍｏｌ）の溶液を水
素化ナトリウム（８．２４ｇ，ヘキサンによって３回予め洗浄した油中６０％，
０．２１ｍｏｌ）によって処理する。３０分間撹拌した後、トランス−２−メト
キシシクロヘキシルトシラート（０．１６ｍｏｌ）を５℃において２０分間にわ
たって加える。反応を室温において４８時間撹拌してから、Ｃｅｌｉｔｅに通し
て濾過する。濾液を減圧下で濃縮して、トルエン（２ｘ１００ｍｌ）と共に共沸
蒸発させて、標題化合物を得る。

【０２５９】 実施例８３ Ｎ⁶−ベンゾイル−２’−Ｏ−（トランス−２−メトキシシクロヘキシル）アデ
ノシン ピリジン（１００ｍｌ）中の２’−Ｏ−（トランス−２−メトキシ−シクロヘ
キシル）アデノシン（０．０５６ｍｏｌ）の溶液を減圧下で蒸発乾燥させる。残
渣をピリジン（５６０ｍｌ）中に再溶解して、氷水浴中で冷却する。トリメチル
シリルクロリド（３６．４ｍｌ，０．２９１ｍｏｌ）を加えて、反応を５℃にお
いて３０分間撹拌する。塩化ベンゾイル（３３．６ｍｌ，０．２９１ｍｏｌ）を
加えて、反応を２５℃に２時間温度上昇させてから、５℃に冷却する。反応を冷
水（１１２ｍｌ）によって希釈し、１５分間撹拌した後に、濃水酸化アンモニウ
ム（１１２ｍｌ）を加える。３０分間後に、反応を減圧下で濃縮し（３０℃未満
）、次にトルエン（２ｘ１００ｍｌ）と共に共沸蒸発させる。残渣を酢酸エチル
−メタノール（４００ｍｌ，９：１）中に溶解し、望ましくないシリル副生成物
を濾過によって除去する。濾液を減圧下で濃縮してから、シリカゲルフラッシュ
カラムクロマトグラフィー（８００ｇ，クロロホルム−メタノール９：１）によ
って精製する。選択した画分を一緒にし、減圧下で濃縮して、２５℃／０．２ｍ
ｍＨｇにおいて２時間乾燥させて、標題化合物を得る。

【０２６０】 実施例８４ Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（トランス
−２−メトキシシクロヘキシル）アデノシン ピリジン（１００ｍｌ）中のＮ⁶−ベンゾイル−２’−Ｏ−（トランス−２−
メトキシシクロヘキシル）アデノシン（０．２８５ｍｏｌ）の溶液を減圧下で蒸
発させて、油状物を得る。残渣を乾燥ピリジン（３００ｍｌ）中に再溶解し、４
，４’−ジメトキシトリフェニルメチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ，１０．９ｇ，
９５％，０．３１ｍｏｌ）を加える。この混合物を２５℃において１６時間撹拌
してから、氷水（５００ｍｌ）中の炭酸水素ナトリウム（２０ｇ）の溶液上に注
入する。生成物を酢酸エチル（２ｘ１５０ｍｌ）によって抽出する。有機層をブ
ライン（５０ｍｌ）によって洗浄し、硫酸ナトリウム（粉状）上で乾燥させ、減
圧下で蒸発させる（４０℃未満）。残渣をシリカゲル（４００ｇ，酢酸エチル−
ヘキサン１：１）上でクロマトグラフィーする。選択した画分を一緒にし、減圧
下で濃縮し、２５℃／０．２ｍｍＨｇにおいて乾燥させて、標題化合物を得た。

【０２６１】 実施例８５ ［Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ
−（トランス−２−メトキシシクロヘキシル）アデノシン−３’−Ｏ−イル］−
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−シアノエトキシホスホロアミダイト Ｎ⁶−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（トラン
ス−２−メトキシシクロヘキシル）アデノシンのホスフィチル化を上記で例示し
たように行なって、標題化合物を得た。

【０２６２】 実施例８６ キメラＣ３’−エンド及びＣ２’−エンド修飾オリゴヌクレオチド合成の一般的
方法 オリゴヌクレオチドをＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐ
ｅｄｉｔｅ ８９０１核酸合成系で合成する。各オリゴヌクレオチドに関して、
多重１−ｍｍｏｌ合成を行なう。固体サポートを含有する３’−エンドヌクレオ
シドをカラムに負荷する。トリチル基をトリクロロ酢酸（９７５μｌ、１分間に
わたって）によって除去し、続いてアセトニトリル洗浄を行なう。修飾ジエステ
ル（Ｐ＝Ｏ）又はチオエート（Ｐ＝Ｓ）プロトコールを用いて、オリゴヌクレオ
チドを構築する。

【０２６３】 ホスホジエステルプロトコール 全ての標準アミダイト（０．１Ｍ）を１．５分間の時間枠にわたって結合させ
る、１０５μｌ物質をデリバーする。全ての新規なアミダイトを乾燥アセトニト
リルに溶解して（１００ｍｇのアミダイト／１ｍｌのアセトニトリル）、約０．
０８〜０．１Ｍ溶液を得る。２’−修飾アミダイト（リボモノマーとアラビノモ
ノマーの両方）を２１０μｌを用いて全体で５分間にわたって２回結合させる。
総結合時間は約５分間である（２１０ｍｌのアミダイトをデリバーする）。アセ
トニトリル中の１−Ｈ−テトラゾールを活性化剤として用いる。過剰なアミダイ
トはアセトニトリルによって洗い流す。（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファー
スルホニル）オキサジリジン（ＣＳＯ，１．０ｇ ＣＳＯ／８．７２ｍｌ 乾燥
アセトニトリル）を用いて、酸化し（３分間待ち工程）、約３７５μｌの酸化剤
をデリバーする。標準アミダイトを３分間にわたってデリバーする（２１０μｌ
）。

【０２６４】 ホスホロチオエートプロトコール ２’−修飾アミダイトを、２１０μｌを用いて全体で５分間にわたって２回結
合させる。酸化剤、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオ
キシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬，３．４ｇ Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬／２００ｍｌ
アセトニトリル）の量は２２５μｌである（１分間待ち工程）。未反応ヌクレ
オシドに５０：５０混合物のテトラヒドロフラン／無水酢酸とテトラヒドロフラ
ン／ピリジン／１−メチルイミダゾールによってキャップする。この合成の期間
中、トリチル収率をトリチルモニターによって追跡する。最終的ＤＭＴ基は完全
な状態で残される。合成後に、合成カートリッジの内容（１ｍｍｏｌｅ）をＰｙ
ｒｅｘバイアルに移し、３０％水酸化アンモニウム（ＮＨ₄ＯＨ，５ｍｌ）を５
５℃において約１６時間用いて、オリゴヌクレオチドを制御多孔質ガラス（ＣＰ
Ｇ）から切断する。

【０２６５】 オリゴヌクレオチドの精製 脱保護後に、サンプルをＧｅｌｍａｎ０．４５μｍナイロンアクロディスク・
シリンジフィルターを用いてＣＰＧから濾別する。過剰なＮＨ₄ＯＨをＳａｖａ
ｎｔ ＡＳ１６０自動スピードバクにおいて蒸発させる。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａ
ｃｋａｒｄ ８４５２Ａ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ分光光度計で２６０ｎｍにお
いて粗収率を測定する。次に、粗サンプルをＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ
エレクトロスプレイ質量分析計での質量分析法（ＭＳ）によって分析する。トリ
チル−オン オリゴヌクレオチドを逆相分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）によって精製する。ＨＰＬＣ条件は次の通りである：９９１デテクター付
きＷａｔｅｒｓ ６００Ｅ；Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ４カラム（
７．８Ｘ３００ｍｍ）；Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａ：５０ｍＭトリエチルアンモニウム
アセテート（ＴＥＡ−Ａｃ），ｐＨ７．０；Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｂ：１００％アセ
トニトリル；２．５ｍｌ／分流量；勾配：最初の５分間の５％Ｂから次の５５分
間にＢが６０％まで直線的に増加。所望の生成物(product/s)を含有する画分（
ＤＭＴ−ＯＮ−１６３１４では保持時間＝４１分間；ＤＭＴ−ＯＮ−１６３１５
では保持時間＝４２．５分間）を回収し、溶媒をスピードバクにおいて乾燥させ
る(dried off)。オリゴヌクレオチドを８０％酢酸中で約６０分間脱トリチル化
し、再び凍結乾燥させる。次に、脱トリチル化したオリゴヌクレオチドをＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−２５（サイズ排除クロマトグラフィー）に通し、Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａフラクションコレクターに通して適当なサンプルを回収することによって
、遊離トリチルと過剰な塩を除去する。溶媒をスピードバクにおいて再び蒸発さ
せる。精製されたオリゴヌクレオチドを次にＣＧＥ、ＨＰＬＣ（流量：１．５ｍ
ｌ／分；Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ４カラム、３．９Ｘ３００ｍｍ
）及びＭＳによって純度に関して分析する。最終収量を２６０ｎｍにおいて分光
光度計によって測定する。

【０２６６】 方法 方法１ ＩＣＡＭ−１発現 ＨＵＶＥＣ_Sのオリゴヌクレオチド処理 ３７℃に予め温めたＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｉｎｃ．）によって、細胞を３回洗浄した。オリゴヌクレオチドにＯｐｔｉ−
ＭＥＭ中の１０ｇ／ｍｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）をプレミックスし、所望の濃度まで連続的に希釈し、洗浄
済み細胞に供給した。基底対照細胞と非処理（オリゴヌクレオチド含まず）対照
細胞もＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎによって処理した。細胞を３７℃において４時間イ
ンキュベートし、この時点で培地を取り出し、５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−α７＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓを含む又は含まない標準増殖培地と交換した。３７℃における
インキュベーションは指定時間まで続けた。

【０２６７】 蛍光活性化セルソーターによるＩＣＡＭ−１タンパク質発現の定量 ＰＢＳ中の０．２５％トリプシンによる短時間のトリプシン処理によって、プ
レート表面から細胞を取り出した。トリプシンの活性をＰＢＳ（＋Ｍｇ／Ｃａ）
中の２％ウシ血清アルブミンと０．２％アジ化ナトリウムの溶液によってクエン
チした。細胞を遠心分離（１０００ｒｐｍ，Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＰＲ遠心分離機
）によってペレット化し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、３ｌ／１０⁵細胞のＩＣＡＭ
−１特異性抗体、ＣＤ５４−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｉｎ）によって染色した。
暗所で４℃において、穏やかに撹拌しながら、抗体を細胞と共に３０分間インキ
ュベートした。細胞を遠心分離方法によって洗浄してから、０．５％ホルムアル
デヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＦａｃｓＦｌｏｗ緩衝液（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）０．３ｍｌ中に、再懸濁させた。次に、細胞表面Ｉ
ＣＡＭ−１の発現をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを用い
てフローサイトメトリーによって測定した。対照ＩＣＡＭ−１発現の％を次のよ
うに算出した：［（オリゴヌクレオチド処理ＩＣＡＭ−１値）−（基底ＩＣＡＭ
−１値）／（非処理ＩＣＡＭ−１値）−（基底ＩＣＡＭ−１値）］。（Ｂａｋｅ
ｒ，Ｂｒｅｎｄａ等，“２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル修飾抗細胞間接着分
子１（ＩＣＡＭ−１）オリゴヌクレオチドは、ヒト臍静脈内皮細胞中で、ＩＣＡ
Ｍ−１ｍＲＮＡレベルを選択的に増加させ、ＩＣＡＭ−１翻訳開始複合体の形成
を阻害する”，ＴＨｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，２７２，１１９９４−１２０００，１９９７）。

【０２６８】 本発明のキメラＣ３’−エンド及びＣ２’−エンド修飾オリゴヌクレオチドの
ＩＣＡＭ−１発現を、処理したＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＣＡＭ−１レベルの減
少によって測定する。これらのオリゴヌクレオチドはＲＮアーゼＨ切断機構によ
って作用すると考えられる。適当なスクランブル対照(scrambled control)オリ
ゴヌクレオチドを対照として用いる。これらは試験配列と同じ塩基組成を有する
。

【０２６９】 以下の表Ｘに列挙されたような、キメラＣ３’−エンド（２’−ＭＯＥ）及び
Ｃ２’−エンド（下記修飾：２’−Ｓ−Ｍｅ、２’−Ｍｅ、２’−ａｒａ−Ｆ、
２’−ａｒａ−ＯＨ、２’−ａｒａ−Ｏ−Ｍｅの１つ）を含有する配列を調製し
て、上記アッセイにおいて試験する。配列番号：４３、Ｃ−ｒａｆターゲットオ
リゴヌクレオチド(targeted oligonucleotide)を対照として用いる。

【０２７０】

【表１４】

【０２７１】 太字の全てのヌクレオシドは２’−Ｏ−（メトキシエチル）であり；下付き文
字ｓはホスホロチオエート結合を意味し；下線付きヌクレオシドは２’−Ｓ−Ｍ
ｅ−修飾を意味する。Ｃ上の上付き文字ｍ（Ｃｍ）は５−メチル−Ｃを意味する
。

【０２７２】

【表１５】

【０２７３】 太字の全てのヌクレオシドは２’−Ｏ−（メトキシエチル）であり；下付き文
字ｓはホスホロチオエート結合を意味し；下線付きヌクレオシドは２’−メチル
修飾を意味する。Ｃ上の上付き文字ｍ（Ｃｍ）は５−メチル−Ｃを意味する。

【０２７４】

【表１６】

【０２７５】 太字の全てのヌクレオシドは２’−Ｏ−（メトキシエチル）であり；下付き文
字ｓはホスホロチオエート結合を意味し；下線付きヌクレオシドは２’−ａｒａ
−（フルオロ）修飾を意味する。Ｃ上の上付き文字ｍ（Ｃｍ）は５−メチル−Ｃ
を意味する。

【０２７６】

【表１７】

【０２７７】 太字の全てのヌクレオシドは２’−Ｏ−（メトキシエチル）であり；下付き文
字ｓはホスホロチオエート結合を意味し；下線付きヌクレオシドは２’−ａｒａ
−（ＯＨ）修飾を意味する。Ｃ上の上付き文字ｍ（Ｃｍ）は５−メチル−Ｃを意
味する。

【０２７８】

【表１８】

【０２７９】 太字の全てのヌクレオシドは２’−Ｏ−（メトキシエチル）であり；下付き文
字ｓはホスホロチオエート結合を意味し；下線付きヌクレオシドは２’−ａｒａ
−（ＯＭｅ）修飾を意味する。Ｃ上の上付き文字ｍ（Ｃｍ）は５−メチル−Ｃを
意味する。

【０２８０】 方法２ ２’−Ｏ−修飾オリゴヌクレオチドの酵素分解 以下の表２に示すように３’−末端に修飾を組み入れた３種類のオリゴヌクレ
オチドを合成する。これらの修飾オリゴヌクレオチドをヘビ毒ホスホジエステラ
ーゼ作用にさらす。

【０２８１】 オリゴヌクレオチド（３０ナノモル）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８
．５、１４ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び７２ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液 ２０ｍ
ｌ中に溶解する。この溶液に、０．１単位のヘビ毒ホスホジエステラーゼ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、２３単位のヌクレアーゼＰ１
（Ｇｉｂｃｏ ＬＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）及び２４単位のウ
シ腸ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎ
ａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を加え、この反応混合物を３７℃において１００時間イン
キュベートする。ＨＰＬＣ分析をＷａｔｅｒｓモデル７１５自動インジェクター
、モデル６００Ｅポンプ、モデル９９１デテクター及びＡｌｔｅｃｈ（Ａｌｌｔ
ｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）ヌクレ
オシド／ヌクレオチドカラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）を用いて、行なう。全ての
分析は室温において実施する。用いた溶媒はＡ：水と、Ｂ：アセトニトリルであ
る。ヌクレオシド組成物の分析は下記勾配：０〜５分、２％Ｂ（イソクラチック
）；５〜２０分：２％Ｂ〜１０％Ｂ（直線）；２０〜４０分：１０％Ｂ〜５０％
Ｂで達成される。ヌクレオシド標準を用いて、ナノモル当りの積分面積を算出す
る。積分面積をモル値に換算し、全ての値をチミジンに比較することによって、
相対的なヌクレオシド比率を算出する、チミジンは各オリゴマーに関してその予
想値に設定される。

【０２８２】

【表１９】

【０２８３】 方法３ Ｈａ−ｒａｓをターゲットとするキメラＣ３’−エンド及びＣ２’−エンド修飾
オリゴヌクレオチドの一般的評価方法 肉腫、神経芽腫、白血病及びリンパ腫を含めた、種々なタイプのヒト腫瘍はら
ｓ遺伝子ファミリーの活性腫瘍遺伝子を含有する。Ｈａ−ｒａｓは小分子量ＧＴ
Ｐアーゼのファミリーであり、このファミリーの機能は、ｒａｓの構成性活性化
を生じるシグナルを伝達することによって細胞増殖と分化を調節することであり
、多様なヒト癌の高い割合に関連する。したがって、ｒａｓは抗癌性治療方法の
魅力的なターゲットである。

【０２８４】 配列番号：４６は、ヒトＨａ−ｒａｓの翻訳領域の開始をターゲットとする２
０塩基ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドであり、これはスクリー
ニングアッセイに基づくと、細胞培養におけるＨａ−ｒａｓの強力なアイソタイ
プ特異性阻害剤である（ＩＣ₅₀＝４５ｎｍ）。配列番号：４６によるｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでの細胞の処理は、Ｈａ−ｒａｓ ｍＲＮＡ及びタンパク質合成の迅速な
減少と、活性化Ｈａ−ｒａｓ突然変異を含有する細胞の増殖の阻害とを生じる。
配列番号：４６は、１日１回腹腔内注入（ＩＰ）によって２５ｍｇ／ｋｇ以下の
投与量で投与すると、種々な腫瘍異種移植片モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を
示すが、ミスマッチ対照は抗腫瘍活性を示さない。配列番号：４６は、マウス異
種移植片研究（Ｃｏｗｓｅｒｔ，Ｌ．Ｍ．，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ
ｄｅｓｉｇｎ，１９９７，１２，３５９−３７１）において、肺、胸部、膀胱
及び膵臓を含めた、種々な腫瘍タイプに対して活性であることが判明している。
この配列の５’末端と３’末端（“ｗｉｎｇｓ”）を２’−メトキシエチル（Ｍ
ＯＥ）修飾によって修飾し、バックボーンをホスホロチオエートとして維持した
、配列番号：４６の第２世代類似体（表ＸＶ、配列番号：５２）は細胞培養アッ
セイにおいて１５ｎｍのＩＣ₅₀を示す、したがって、このキメラ類似体から３倍
の効力改良が観察される。２’−ＭＯＥホスホロチオエートの改良されたヌクレ
アーゼ耐性のために、配列番号：５２はｉｎ ｖｉｔｒｏでアンチセンス効果の
持続期間を高める。これは癌患者に対するこの薬物の投与頻度に関連する。配列
番号：５２は現在、ｒａｓ依存性腫瘍モデルにおいて評価中である（Ｃｏｗｓｅ
ｒｔ，Ｌ．Ｍ．，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ、１９９７
，１２，３５９−３７１）。親化合物、配列番号：４６は、全身注入(systemic
infusion)によって固体腫瘍に対するＰｈａｓｅ Ｉ臨床試験中である。

【０２８５】 ２’−Ｍｅ修飾を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製して、活性の
測定に関して述べた方法で上記アッセイにおいて試験する。 キメラＣ３’−エンド及びＣ２’−エンド修飾を有するＨａ−ｒａｓアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドと、それらの対照

【０２８６】

【表２０】

【０２８７】 方法７ ｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼ耐性 キメラＣ３’−エンド及びＣ２’−エンド修飾オリゴヌクレオチドのｉｎ ｖ
ｉｖｏヌクレアーゼ耐性を、マウスの血漿と組織（腎臓と肝臓）において研究す
る。このために、Ｃ−ｒａｆオリゴヌクレオチド系列配列番号：５４を用いて、
以下の表に列挙した下記５ヌクレオチドを相対的ヌクレアーゼ耐性に関して評価
する。

【０２８８】

【表２１】

【０２８９】

【表２２】

【０２９０】

【表２３】

【０２９１】

【表２４】

【０２９２】

【表２５】

【０２９３】 方法８ ｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼ耐性に関する動物研究 研究すべき各オリゴヌクレオチドに対して、９匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃ
ｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、体重約２５ｇを用
いる（Ｃｒｏｏｋｅ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９
６，２７７，９２３）。１週間の順化後に、マウスにリン酸緩衝化生理食塩水（
ＰＢＳ）、ｐＨ７．０中で投与されるオリゴヌクレオチド（５ｍｇ／ｋｇ）の単
回尾静脈注射を受けさせる。投与溶液中のオリゴヌクレオチドの最終濃度はＰＢ
Ｓ製剤に対して（５ｍｇ／ｋｇ）である。一方の眼窩後方出血（投与後０．２５
、９．０５、２若しくは４のいずれか）と末梢出血（投与後１、３、８若しくは
２４時間のいずれか）とを各グループから回収する。末梢出血（約０．６〜０．
８ｍｌ）はケタミン／キシラジン麻酔後の心臓穿刺によって回収する。血液をＥ
ＤＴＡ被覆回収管に移し、遠心分離して血漿を得る。終了時に、各マウスから肝
臓と腎臓を回収する。血漿と組織ホモジネートとを分析に用いて、完全なオリゴ
ヌクレオチドの含量をＣＧＥによって判定する。全てのサンプルは回収後直ちに
ドライアイス上で凍結させ、分析まで−８０℃において貯蔵する。

【０２９４】 方法９ ヌクレアーゼ耐性キャップを有する及び有さない、キメラＣ３’−エンド及びＣ
２’−エンド修飾オリゴヌクレオチドによるＲＮアーゼＨ研究 オリゴヌクレオチドの³²Ｐ標識 オリゴリボヌクレオチド（センス鎖）を［³²Ｐ］ＡＴＰ、Ｔ⁴ポリヌクレオチ
ドキナーゼ及び標準方法を用いて³²Ｐによって５’−末端標識した（Ａｕｓｕｂ
ｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ
，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．及びＳｔｒｕｈ
ｌ，Ｋ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））。標
識したＲＮＡを１２％変性ＰＡＧＥ上での電気泳動によって精製した（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐ
ｌａｉｎｖｉｅｗ（１９８９））。標識オリゴヌクレオチドの比活性は約６００
０ｃｐｍ／ｆｍｏｌであった。

【０２９５】 ＲＮアーゼＨ切断パターンの測定 ７５０ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチド、５００ｎＭセンスオリゴリボヌ
クレオチド及び１００，０００ｃｐｍ³²Ｐ標識センスオリゴリボヌクレオチドを
含有する反応緩衝液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭ ＤＴＴ］１２０μｌ中でのハイブリ
ダイゼーション反応を用意した。反応を９０℃において５分間加熱し、１単位の
Ｉｎｈｉｂｉｔ−ＡＣＥを加えた。サンプルを３７℃において一晩インキュベー
トした。ハイブリダイゼーション反応を初期速度測定のために１．５ｘ１０．８ ^-8 ｍｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮアーゼＨ酵素と共に、３７℃においてイン
キュベートしてから、特定の時点においてクエンチした。サンプルをトリクロロ
酢酸（ＴＣＡ）アッセイによって又は変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
って既述されたように分析した［Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．，Ｌｅｍｏｎｉｄｉｓ
，Ｋ．Ｍ．、Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｌ．，Ｇｒｉｆｆｅｙ，Ｒ．，Ｌｅｓｎｉｋ，Ｅ
．Ａ．及びＭｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．，大腸菌ＲＮアーゼＨ１の動力学的特徴：種々
なアンチセンスオリゴヌクレオチド−ＲＮＡ二本鎖の切断，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ
．，３１２，５９９（１９９５）；Ｌｉｍａ，Ｗ．Ｆ．とＣｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ
．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，３９０−３９８，１９９７］。

【０２９６】 当業者は、本発明の好ましい実施態様に対して非常に多様な変更と修飾がなさ
れうること、及びこのような変更と修飾が本発明の要旨から逸脱せずになされう
ることを理解するであろう。それ故、特許請求の範囲はこのような同等の変化の
全てを、本発明の要旨及び範囲内に入るものとして包含するように意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明のオリゴヌクレオチドのＢ形部分（Ｃ２’エンド／Ｃ４’エン
ド部分）に用いるためのヌクレオチドフラグメントの好ましいグループを例示す
る。

【図２】 図２は、本発明のオリゴヌクレオチドのＡ形部分（Ｃ３’エンド部分）に用い
るためのヌクレオチドフラグメントの好ましいグループを例示する。

【図３】 図３は、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端のＡ形部分に用いるためのヌ
クレオチドフラグメントの好ましいグループを例示する。

【図４】 図４は、５ｍｇ／ｋｇオリゴヌクレオチドのｉ．ｖ．ボラスの投与後１時間に
血漿中に完全な状態で残留する全長オリゴヌクレオチドの％のプロットである。

【図５】 図５は、５ｍｇ／ｋｇオリゴヌクレオチドのｉ．ｖ．ボラスの投与後２４時間
に組織中に完全な状態で残留する全長オリゴヌクレオチドの％のプロットである
。

【図６】 図６は、２４時間後のマウス肝臓サンプルとマウス腎臓サンプルの両方におけ
る試験オリゴヌクレオチドと標準ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのＣＧ
Ｅトレースを示す。

【図７】 図７は、ｂＥＮＤ細胞におけるＣ−ｒａｆ発現に及ぼす本発明のオリゴヌクレ
オチドの効果のグラフ（対照と比較）である。

【図８】 図８は、特定の化合物による治療後１８時間のＧ３ＰＤＨシグナルに対して標
準化した対照％としての棒グラフを示す。

【図９】 図９は、特定の化合物による治療後１８時間のＧ３ＰＤＨシグナルに対して標
準化した対照％としての棒グラフを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 モーハン，ベンカトラマン アメリカ合衆国カリフォルニア州92009， カールズバッド，ビア・カバナ 7042 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA05 HA12 HA17 4C057 AA18 BB04 DD03 LL29 MM02 4C084 AA13 BA35 CA59 MA66 ZB212 ZB262 ZB272

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、 該複数のヌクレオチドの第一部分は、Ｂ型立体配座幾何学形状を有し、しかも
   連続配列中で互いに結合していて、該第一部分の該ヌクレオチドの少なくとも二
   つは、リボヌクレオチドまたはアラビノヌクレオチドであり；そして 該複数のヌクレオチドの追加部分は、Ａ型立体配座幾何学形状を有するリボヌ
   クレオチドであり、しかも少なくとも一つの連続配列中で互いに結合しているオ
   リゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記第一部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’−
   ＳＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−ＮＨ₂リボヌクレオチド、２’−ＮＨ（Ｃ₁−
   Ｃ₂アルキル）リボヌクレオチド、２’−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）₂リボヌクレオ
   チド、２’−ＣＦ₃リボヌクレオチド、２’＝ＣＨ₂リボヌクレオチド、２’＝Ｃ
   ＨＦリボヌクレオチド、２’＝ＣＦ₂リボヌクレオチド、２’−ＣＨ₃リボヌクレ
   オチド、２’−Ｃ₂Ｈ₅リボヌクレオチド、２’−ＣＨ＝ＣＨ₂リボヌクレオチド
   または２’−Ｃ≡ＣＨリボヌクレオチドである請求項１に記載のオリゴヌクレオ
   チド。
3. 【請求項３】 前記第一部分の前記ヌクレオチドがそれぞれ、リン酸基結合
   、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合またはボラノホスフェー
   ト結合によって前記連続配列中で互いに結合している請求項１に記載のオリゴヌ
   クレオチド。
4. 【請求項４】 前記追加部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’−
   フルオロヌクレオチド、または式ＩまたはII 【化１】 （式中、Ｅは、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、Ｎ（Ｑ₁）（Ｑ₂）またはＮ＝Ｃ（Ｑ₁）（Ｑ ₂ ）であり； Ｑ₁およびＱ₂は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、ジアルキルア
   ミノアルキル、窒素保護基、束縛されたまたは束縛されていない結合基、固体支
   持体へのリンカーであり、または Ｑ₁およびＱ₂は、一緒になって、窒素保護基中、またはＮおよびＯより選択さ
   れる少なくとも１個の追加のヘテロ原子を含むことができる環構造中で結合して
   いて； Ｒ₃は、ＯＸ、ＳＸまたはＮ（Ｘ）₂であり； Ｘは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₈アルキル、Ｃ₁−Ｃ₈ハロアルキル、Ｃ
   （＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＺまたはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚで
   あり； Ｚは、ＨまたはＣ₁−Ｃ₈アルキルであり； Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は、約４〜約７個の炭素原子を有する、または約３〜約６
   個の炭素原子および酸素、窒素および硫黄より選択される１個または２個のヘテ
   ロ原子を有する環系を形成し、そしてここにおいて、該環系は、脂肪族、不飽和
   脂肪族、芳香族、または飽和または不飽和の複素環式であり； Ｙは、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキルまたはハロアルキル、２〜約
   １０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキ
   ニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｑ₁）（Ｑ₂）、Ｏ（Ｑ₁
   ）、ハロ、Ｓ（Ｑ₁）またはＣＮであり； ｑ₁は、それぞれ独立して、２〜１０であり； ｑ₂は、それぞれ独立して、０または１であり； ｍは、０、１または２であり； ｐは、１〜１０であり；そして ｑ₃は、１〜１０であり、但し、ｐが０である場合、ｑ₃は１より大であるとい
   う条件付である） を有する２’−置換基を有するヌクレオチドである請求項１に記載のオリゴヌク
   レオチド。
5. 【請求項５】 前記追加部分の前記ヌクレオチドが、それぞれ独立して、２
   ’−Ｆリボヌクレオチド、２’−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）リボヌクレオチド、
   または２’−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆置換アルキル）リボヌクレオチドであって、その置
   換がＣ₁−Ｃ₆エーテル、Ｃ₁−Ｃ₆チオエーテル、アミノ、アミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アル
   キル）またはアミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）₂であるものである請求項１に記載の
   オリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 前記追加部分の前記ヌクレオチドの全部が、３’−５’ホス
   ホジエステル結合、２’−５’ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合
   、Ｓｐホスホロチオエート結合、Ｒｐホスホロチオエート結合、ホスホロジチオ
   エート結合、３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデート結合、３’−メ
   チレンホスホネート結合、メチレン（メチルイミノ）結合、ジメチルヒドラジノ
   結合、アミド３結合、アミド４結合またはボラノホスフェート結合によって連続
   配列中で互いに結合している請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
7. 【請求項７】 前記追加部分の前記ヌクレオチドの少なくとも二つが、前記
   複数のヌクレオチドの前記第一部分の前記連続配列に３’位である連続配列中で
   互いに結合している請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
8. 【請求項８】 前記追加部分の前記ヌクレオチドの少なくとも二つが、前記
   第一部分の前記連続配列に５’位である連続配列中で互いに結合している請求項
   １に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 【請求項９】 前記追加部分の前記ヌクレオチドの少なくとも二つが、前記
   第一部分の前記連続配列に３’位である連続配列中で互いに結合していて、前記
   追加部分の少なくとも二つが、前記第一部分の前記連続配列に５’位である連続
   配列中で互いに結合している請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 前記第一部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’
    −ＳＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−ＮＨ₂リボヌクレオチド、２’−ＮＨ（Ｃ₁
    −Ｃ₂アルキル）リボヌクレオチド、２’−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）₂リボヌクレ
    オチド、２’＝ＣＨ₂リボヌクレオチド、２’−ＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−
    Ｃ₂Ｈ₅リボヌクレオチド、２’−ＣＨ＝ＣＨ₂リボヌクレオチドまたは２’−Ｃ
    ≡ＣＨリボヌクレオチドである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
11. 【請求項１１】 前記第一部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’
    −ＳＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−ＮＨ₂リボヌクレオチド、２’−ＮＨ（Ｃ₁
    −Ｃ₂アルキル）リボヌクレオチド、２’−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）₂リボヌクレ
    オチドまたは２’−ＣＨ₃リボヌクレオチドである請求項１に記載のオリゴヌク
    レオチド。
12. 【請求項１２】 前記第一部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’
    −ＳＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−ＮＨ₂リボヌクレオチドまたは２’−ＣＨ₃
    リボヌクレオチドである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
13. 【請求項１３】 前記第一部分のヌクレオチドがそれぞれ、２’−ＳＣＨ₃
    リボヌクレオチドである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
14. 【請求項１４】 前記第一部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’
    −ＣＮアラビノヌクレオチド、２’−Ｆアラビノヌクレオチド、２’−Ｃｌアラ
    ビノヌクレオチド、２’−Ｂｒアラビノヌクレオチド、２’−Ｎ₃アラビノヌク
    レオチド、２’−ＯＨアラビノヌクレオチド、２’−Ｏ−ＣＨ₃アラビノヌクレ
    オチドまたは２’−デヒドロ−２’−ＣＨ₃アラビノヌクレオチドである請求項
    １に記載のオリゴヌクレオチド。
15. 【請求項１５】 前記第一部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’
    −Ｆアラビノヌクレオチド、２’−ＯＨアラビノヌクレオチドまたは２’−Ｏ−
    ＣＨ₃アラビノヌクレオチドである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
16. 【請求項１６】 前記第一部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’
    −Ｆアラビノヌクレオチドまたは２’−ＯＨアラビノヌクレオチドである請求項
    １に記載のオリゴヌクレオチド。
17. 【請求項１７】 前記第一部分のヌクレオチドがそれぞれ、２’−Ｆアラビ
    ノヌクレオチドである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
18. 【請求項１８】 前記第一部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’
    −ＳＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−ＮＨ₂リボヌクレオチド、２’−ＮＨ（Ｃ₁
    −Ｃ₂アルキル）リボヌクレオチド、２’−Ｎ（Ｃ₁−Ｃ₂アルキル）₂リボヌクレ
    オチド、２’−ＣＨ₃リボヌクレオチド、２’−ＣＨ＝ＣＨ₂リボヌクレオチドま
    たは２’−Ｃ≡ＣＨリボヌクレオチドであり；そして 前記追加部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’−Ｆリボヌクレオチ
    ド、２’−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）リボヌクレオチド、または２’−Ｏ−（Ｃ ₁ −Ｃ₆置換アルキル）リボヌクレオチドであって、その置換がＣ₁−Ｃ₆エーテル
    、Ｃ₁−Ｃ₆チオエーテル、アミノ、アミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）またはアミノ（
    Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）₂であるものである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
19. 【請求項１９】 前記第一部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’
    −ＣＮアラビノヌクレオチド、２’−Ｆアラビノヌクレオチド、２’−Ｃｌアラ
    ビノヌクレオチド、２’−Ｂｒアラビノヌクレオチド、２’−Ｎ₃アラビノヌク
    レオチド、２’−ＯＨアラビノヌクレオチド、２’−Ｏ−ＣＨ₃アラビノヌクレ
    オチドまたは２’−デヒドロ−２’−ＣＨ₃アラビノヌクレオチドであり；そし
    て 前記追加部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’−Ｆリボヌクレオチ
    ド、２’−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）リボヌクレオチド、または２’−Ｏ−（Ｃ ₁ −Ｃ₆置換アルキル）リボヌクレオチドであって、その置換がＣ₁−Ｃ₆エーテル
    、Ｃ₁−Ｃ₆チオエーテル、アミノ、アミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）またはアミノ（
    Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）₂であるものである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
20. 【請求項２０】 前記第一部分のヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’
    −Ｆアラビノヌクレオチドまたは２’−ＯＨアラビノヌクレオチドであり；そし
    て 前記追加部分のヌクレオチドがそれぞれ、２’−Ｏ−（Ｃ₁−Ｃ₆置換アルキル
    ）リボヌクレオチドであって、その置換がＣ₁−Ｃ₆エーテル、Ｃ₁−Ｃ₆チオエー
    テル、アミノ、アミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）またはアミノ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル） ₂ であるものである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
21. 【請求項２１】 前記追加部分が、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に位
    置する連続配列中で互いに結合した少なくとも二つのヌクレオチドを含む請求項
    １に記載のオリゴヌクレオチド。
22. 【請求項２２】 前記追加部分が、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に位
    置する連続配列中で互いに結合した少なくとも二つのヌクレオチドを含む請求項
    １に記載のオリゴヌクレオチド。
23. 【請求項２３】 前記追加部分が、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に位
    置する連続配列中で互いに結合した少なくとも二つのヌクレオチド；および 前記オリゴヌクレオチドの５’末端に位置する連続配列中で互いに結合した少
    なくとも二つのヌクレオチドを含む請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
24. 【請求項２４】 前記互いに結合した少なくとも二つのヌクレオチドが、２
    ’−５’ホスホジエステル結合、３’−メチレンホスホネート結合、Ｓｐホスホ
    ロチオエート結合、メチレン（メチルイミノ）結合、ジメチルヒドラジノ結合、
    ３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデート結合、アミド３結合またはア
    ミド４結合によって互いに結合したヌクレオチドを含む請求項２１に記載のオリ
    ゴヌクレオチド。
25. 【請求項２５】 前記二つのヌクレオチドが、２’−５’ホスホジエステル
    結合、３’−メチレンホスホネート結合、Ｓｐホスホロチオエート結合またはメ
    チレン（メチルイミノ）結合によって互いに結合している請求項２４に記載のオ
    リゴヌクレオチド。
26. 【請求項２６】 前記互いに結合した少なくとも二つのヌクレオチドが、２
    ’−５’ホスホジエステル結合、３’−メチレンホスホネート結合、Ｓｐホスホ
    ロチオエート結合、メチレン（メチルイミノ）結合、ジメチルヒドラジノ結合、
    ３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデート結合、アミド３結合またはア
    ミド４結合によって互いに結合したヌクレオチドを含む請求項２２に記載のオリ
    ゴヌクレオチド。
27. 【請求項２７】 前記二つのヌクレオチドが、２’−５’ホスホジエステル
    結合、３’−メチレンホスホネート結合、Ｓｐホスホロチオエート結合またはメ
    チレン（メチルイミノ）結合によって互いに結合している請求項２６に記載のオ
    リゴヌクレオチド。
28. 【請求項２８】 前記互いに結合し且つ前記３’末端に位置した少なくとも
    二つのヌクレオチドが、２’−５’ホスホジエステル結合、３’−メチレンホス
    ホネート結合、Ｓｐホスホロチオエート結合、メチレン（メチルイミノ）結合、
    ジメチルヒドラジノ結合、３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデート結
    合、アミド３結合またはアミド４結合によって互いに結合したヌクレオチドを含
    み；そして 前記互いに結合し且つ前記５’末端に位置した少なくとも二つのヌクレオチド
    が、２’−５’ホスホジエステル結合、３’−メチレンホスホネート結合、Ｓｐ
    ホスホロチオエート結合、メチレン（メチルイミノ）結合、ジメチルヒドラジノ
    結合、３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデート結合、アミド３結合ま
    たはアミド４結合によって互いに結合したヌクレオチドを含む請求項２３に記載
    のオリゴヌクレオチド。
29. 【請求項２９】 前記３’末端で互いに結合した前記二つのヌクレオチドお
    よび前記５’末端で互いに結合した前記二つのヌクレオチドが、独立して、２’
    −５’ホスホジエステル結合、３’−メチレンホスホネート結合、Ｓｐホスホロ
    チオエート結合またはメチレン（メチルイミノ）結合によって互いに結合してい
    る請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
30. 【請求項３０】 前記互いに結合した二つのヌクレオチドの少なくとも一つ
    が、２’−アルキルアミノ置換ヌクレオチドである請求項２１に記載のオリゴヌ
    クレオチド。
31. 【請求項３１】 前記互いに結合した二つのヌクレオチドの少なくとも一つ
    が、２’−アルキルアミノ置換ヌクレオチドである請求項２２に記載のオリゴヌ
    クレオチド。
32. 【請求項３２】 前記３’末端で互いに結合した前記二つのヌクレオチドの
    少なくとも一つが、２’−アルキルアミノ置換ヌクレオチドであり、そして 前記５’末端で互いに結合した前記二つのヌクレオチドの少なくとも一つが、
    ２’−アルキルアミノ置換ヌクレオチドである請求項２３に記載のオリゴヌクレ
    オチド。
33. 【請求項３３】 複数の結合したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドで
    あって、 該ヌクレオチドの少なくとも一つが、Ｃ３’エンド型パッカーを有し；そして 該複数のヌクレオチドの少なくとも二つが、連続配列中で互いに結合していて
    且つＣ２’エンド型パッカーまたはＯ４’エンド型パッカーを有し、但し、該ヌ
    クレオチドは、２’−デオキシエリスロペントフラノシルヌクレオチドではない
    という条件付であるオリゴヌクレオチド。
34. 【請求項３４】 前記Ｃ３’エンド型パッカーを有する前記ヌクレオチドが
    、前記Ｃ２’エンド型パッカーまたはＯ４’エンド型パッカーを有するヌクレオ
    チドの前記連続配列に３’位である連続配列中で互いに結合している請求項３３
    に記載のオリゴヌクレオチド。
35. 【請求項３５】 前記Ｃ３’エンド型パッカーを有する前記ヌクレオチドが
    、前記Ｃ２’エンド型パッカーまたはＯ４’エンド型パッカーを有するヌクレオ
    チドの前記連続配列に５’位である連続配列中で互いに結合している請求項３３
    に記載のオリゴヌクレオチド。
36. 【請求項３６】 前記Ｃ３’エンド型パッカーを有する前記ヌクレオチドの
    少なくとも二つが、前記Ｃ２’エンド型パッカーまたはＯ４’エンド型パッカー
    を有する前記ヌクレオチドの前記連続配列に３’位である連続配列中で互いに結
    合していて；そして 前記Ｃ３’エンド型パッカーを有する前記ヌクレオチドの少なくとも二つが、
    前記Ｃ２’エンド型パッカーまたはＯ４’エンド型パッカーを有する前記ヌクレ
    オチドの前記連続配列に５’位である連続配列中で互いに結合している請求項３
    ３に記載のオリゴヌクレオチド。