JP2007524373A - 成長ホルモン受容体の発現およびインスリン様成長因子の発現のモジュレーション - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、U.S.仮出願No. 60/451,455(2003年2月28日に出願)およびU.S.仮出願No. 60/490,230(2003年7月24日に出願)に基づく利益を主張し、これらの開示の全体を、すべての目的のためにそれらの全体を参考文献として取り込む。
本発明は、成長ホルモン受容体の発現をモジュレートするための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、好ましい態様において成長ホルモン受容体をコードする核酸分子にハイブリダイズする化合物、具体的には、オリゴヌクレオチド化合物に関する。そのような化合物は、本明細書中で、成長ホルモン受容体の発現をモジュレートすることが示され、そしてインスリン様成長因子1(IGF-I)の発現を、先端肥大症、巨人症、年齢に関連した黄斑変性、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病、および成長ホルモンおよびIGF-I依存性腫瘍を含む疾患の治療に関係がある動物およびヒトの対応物の治療的レベルにモジュレートすることが示される。成長ホルモン受容体モジュレート作用は、関節炎および成長ホルモン受容体および/または成長ホルモン/インスリン様成長因子-I軸が関与するその他の症状の治療にも関係がある。同様に、成長ホルモン、成長ホルモン受容体、IGF-IおよびIGF-I受容体を含む成長ホルモン/インスリン様成長因子-I軸のいずれかの1またはそれ以上の標的に対するアンチセンス化合物を、同一の症状の治療において使用することができる。
下垂体により放出される成長ホルモンは、身体およびその器官の成長を制御するホルモンのカスケードの一構成因子である。血流中への成長ホルモンの分泌は、多数の細胞および器官型上の成長ホルモン受容体(GHR)に結合することにより生じる。成長ホルモンのシグナル伝達は、この相互作用により媒介される。成長ホルモンのシグナル伝達は、肝臓、脂肪組織、および腎臓において産生されそして血流中に分泌される別のホルモン、インスリン様成長因子-I(IGF-IまたはIGF-1)の産生を引き起こす。約75%の血清IGF-Iは、成長ホルモン刺激に応答して肝臓で産生される。先端肥大症、巨人症、網膜症、黄斑変性、腎症、糖尿病および癌を含む多数の症状は、血漿中および/または組織中の成長ホルモンレベルの上昇および/または血漿中および/または組織中のIGF-Iレベルの上昇により引き起こされおよび/またはそれに関連している。多数の成長ホルモンの作用を媒介する際のIGF-Iのこの役割はよく知られており、そしてこの相互関係は、成長ホルモン/インスリン様成長因子-I軸と呼ばれる。正常なフィードバックループにおいて、IGF-Iはまた、減少させるべき下垂体による成長ホルモンの生成を引き起こす。
肝臓:インスリン様成長因子-Iの分泌増加、血漿タンパク質の合成、窒素平衡酵素の制御、炭水化物合成/保存の増加、および脂肪分解の増加;脂肪組織:保存脂肪の分解;筋肉:タンパク質合成の増加、タンパク質分解の減少;軟骨:成長板における軟骨細胞増殖および分化の増加による高さの増加;骨および歯:組織ターンオーバーの増加、合成および分解の両方;腎臓:ナトリウム、炭酸水素イオンおよび水貯留のの増加;目:網膜血管新生の増加;心臓血管:肥大、収縮性の増加、1回拍出量(stroke volume)の増加、心血液量(cardiac output)の増加;腸管:肥大、アミノ酸の取り込みの増加、ナトリウムの取り込みの増加、カルシウムの取り込みの増加、ホスフェートの取り込みの増加およびB12の取り込みの増加;生殖系:精子産生および運動性の増加、雄性における副腺分泌の増加、濾胞数および排卵頻度の増加、濾胞成熟頻度の増加、乳産生の増加;皮膚:皮膚厚および強度の増加、毛髪成長および幅の増加;脳:出生前のニューロン増殖および連結度の増加、ミエリン形成の増加、長期記憶の改善;内分泌系:インスリン合成および分泌の増加、副腎ステロイド生成の増加;免疫系:免疫細胞増殖の増加、単球、マクロファージおよびNK細胞による傷害の増加、抗体産生の増加。
この10年において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して遺伝子機能を調べることの報告や、核酸ベースの薬物の開発についてのいくつかの報告が存在している。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNase H導入を介して標的mRNAを破壊すること、またはRNAプロセッシング、核外輸送、折り畳み、またはリボゾームスキャニングを妨害することを含む、多数の選択的方法を介して、mRNA翻訳を阻害する。
本発明は、成長ホルモン受容体をコードする核酸を標的とし、成長ホルモンシグナル伝達または成長ホルモン/インスリン様成長因子-I軸、特に成長ホルモン受容体の発現および/またはインスリン様成長因子-Iの発現を修飾する、化合物、特に核酸および核酸-様オリゴマーに関する。成長ホルモン受容体および/またはインスリン様成長因子-Iのモジュレータをスクリーニングする方法、および細胞、組織または動物中の成長ホルモン受容体の発現および/またはインスリン様成長因子-Iの発現をモジュレートする方法であって前記細胞、組織、または動物を1またはそれ以上のの本発明の化合物または組成物と接触させることを含む方法を、さらに提供する。診断方法およびキットもまた、提供される。成長ホルモンシグナル伝達または成長ホルモン/インスリン様成長因子-1軸、特に成長ホルモン受容体の発現および/またはインスリン様成長因子-Iの発現に関連する疾患または症状を有していることが疑われるか、またはそのような疾患または症状にかかりやすいことが疑われる動物、特にヒトを治療する方法もまた、本明細書中に記載する。
A. 本発明のあらまし
本発明は、成長ホルモン受容体をコードする核酸分子の機能および作用をモジュレートする際に使用するための化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドおよび同様のものを利用する。このことは、成長ホルモン受容体をコードする1またはそれ以上の核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにより達成される。本明細書中で使用する場合、用語“標的核酸”および“成長ホルモン受容体をコードする核酸分子”は、成長ホルモン受容体をコードするDNA、このようなDNAから転写されるRNA(プレ-mRNAおよびmRNAまたはその部分を含む(コード領域および非コード領域の両方を含む))、およびこのようなRNAに由来するcDNAも含む。本発明の化合物のその標的核酸とのハイブリダイゼーションは、一般的には“アンチセンス”と呼ばれる。結果として、本発明のいくつかの好ましい態様の実施に含まれると考えられている好ましいメカニズムは、本明細書中で“アンチセンス阻害”と呼ばれている。そのようなアンチセンス阻害は、典型的には、オリゴヌクレオチド鎖または部分の水素結合-ベースのハイブリダイゼーションに基づいており、それにより少なくとも1つの鎖または部分が、切断され、分解され、またはそうでなければ機能不能にさせられる。この観点において、特異的核酸分子およびそのようなアンチセンス阻害のためのそれらの機能を標的とすることが現在のところ好ましい。
本発明によれば、化合物には、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー(alternate splicers)、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも部分にハイブリダイズするその他のオリゴマー化合物が含まれる。このように、これらの化合物は、一本鎖オリゴマー化合物、二本鎖オリゴマー化合物、環状オリゴマー化合物、またはヘアピンオリゴマー化合物の形態中に導入されてもよく、そして内部または末端のバルジまたはループなどの構造要素を含有してもよい。一旦システム中に導入されると、本発明の化合物は、1またはそれ以上の酵素または構造タンパク質の作用を引き出し、標的核酸の修飾を生み出す可能性がある。このような酵素の1つの限定的ではない例は、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼのRNAse Hである。“DNA-様”である一本鎖アンチセンス化合物は、RNAse Hを引き起こすことが、当該技術分野において知られている。従って、RNase Hの活性化の結果、RNA標的の切断が引き起こされ、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド-媒介性阻害の効率が非常に亢進される。同様の役割は、RNase IIIおよびリボヌクレアーゼLファミリーの酵素におけるものなどのその他のリボヌクレアーゼについても、自明なものとされた。
例示されたアンチセンス化合物中から選択された少なくとも8個の連続した核酸塩基の範囲を含む長さ8〜80の核酸塩基のアンチセンス化合物もまた、適したアンチセンス化合物であると考えられる。
アンチセンス化合物を特定の核酸分子に対して“標的化すること”は、本発明の文脈において、複数工程のプロセスである可能性がある。このプロセスは通常、機能をモジュレートすべき標的核酸の同定から始める。この標的核酸は、例えば、発現が特定の症状または疾患状態と関連している細胞性遺伝子(またはその遺伝子から転写されたmRNA)、または病原体由来の核酸分子であってもよい。本発明においては、標的核酸は成長ホルモン受容体をコードする。
好ましいアンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は、本明細書中の以下において、“好ましい標的部分”と呼ばれる。本明細書中で使用される場合、用語“好ましい標的部分”は、活性なアンチセンス化合物を標的化する標的領域の少なくとも8-核酸塩基の部分として定義される。理論により縛られることを望むわけではないが、これらの標的部分は、ハイブリダイゼーションのために接近可能な標的核酸の一部分を提示すると、現在のところ考えられている。
さらなる態様において、本明細書中で特定される“好ましい標的部分”は、成長ホルモン受容体の発現をモジュレートする追加の化合物のためのスクリーニングにおいて利用することができる。“モジュレータ”は、成長ホルモン受容体をコードする核酸分子の発現を減少させるかまたは増加させ、そして好ましい標的部分に相補的な少なくとも8-核酸塩基部分を含む化合物である。スクリーニング方法は、成長ホルモン受容体をコードする核酸分子の好ましい標的部分を、1またはそれ以上の候補モジュレータと接触させる工程、および成長ホルモン受容体をコードする核酸分子の発現を減少させるかまたは増加させる1またはそれ以上の候補モジュレータについて選択する工程を含む。いったん1または複数の候補モジュレータが成長ホルモン受容体をコードする核酸分子の発現をモジュレートすること(例えば、減少させることまたは増加させることのいずれか)ができることが示されると、次いで、モジュレータを、成長ホルモン受容体の機能をさらに調査研究する際に、または本発明による研究用試薬、診断用試薬、治療用薬物として使用するため、使用することができる。
本発明の化合物を、診断薬、治療薬、予防薬のために、そして研究用試薬およびキットとして、使用することができる。さらに、非常に強い特異性により遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば、特定の遺伝子の機能を評価し、または生物学的経路の様々な構成要素の機能間を識別するために、当業者により使用される。
当該技術分野において知られているように、ヌクレオシドは、塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、ヘテロ環式塩基である。このようなヘテロ環式塩基の2つの最も一般的なクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の2'、3'または5'ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基が隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。引き続いて、この直鎖ポリマー化合物のそれぞれの末端がさらに一緒になって、環状化合物を形成することができるが、しかしながら、直鎖化合物が一般的には好ましい。さらに、直鎖化合物は、内部核酸塩基相補性を有していてもよく、そして従って、完全な二本鎖化合物または部分的二本鎖化合物を生成する様に折り畳まれる可能性がある。オリゴヌクレオチド中において、リン酸基とは、一般的には、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものと言われる。RNAおよびDNAの正常な結合またはバックボーンは、3'から5'のホスホジエステル結合である。
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾バックボーンまたは非-天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書中で定義する場合、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、バックボーン中にリン原子を保持するものや、バックボーン中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のため、そして当該技術分野において時々参照される場合、そのヌクレオシド間バックボーン中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
その他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間結合の両方(すなわち、バックボーン)を、新規の基により置換する。核酸塩基ユニットは、適した標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されたそのような化合物の一つであるオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれている。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖-バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンにより置換される。核酸塩基は、保持され、そしてバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 5,539,082;5,714,331;および5,719,262が含まれるが、これらだけには限定されず、そのそれぞれを本明細書中に参考文献として援用する。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsen et al(Science, 1991, 254, 1497-1500)中に見出すことができる。
修飾オリゴヌクレオチドは、1またはそれ以上の置換糖部分も含有する。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位で以下のものの一つを含む:OH;F;O-、S-、またはN-アルキル;O-、S-、またはN-アルケニル;O-、S-またはN-アルキニル;またはO-アルキル-O-アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のC1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルでありうる。特に好ましいものは、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2であり、ここでnおよびmは1から約10である。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下のものの一つを含む:C1〜C10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理特性を向上するための基、そして同様の特性を有するその他の置換基を含む。好ましい修飾には、2'-メトキシエトキシ(2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても知られる)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504)、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の以下の実施例に記載する場合、2'-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基、そして2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(当該技術分野において2'-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2'-DMAEOEとしても知られる)、すなわち、本明細書中の以下の実施例においても記載される2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2と、が含まれる。
オリゴヌクレオチドには、核酸塩基(しばしば当該技術分野において単に“塩基”としても呼ばれる)の修飾または置換も含まれうる。本明細書中で使用される場合、“非修飾”または“天然”核酸塩基には、プリン塩基、アデニン(A)およびグアニン(G)、そしてピリミジン塩基、チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)が含まれる。修飾核酸塩基には、その他の合成および天然核酸塩基、たとえば5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよびその他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニル(−C≡C-CH3)ウラシルおよびシトシン、およびピリミジン塩基類の他のアルキニル誘導体、6-アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよびその他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよびその他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが含まれる。さらなる修飾核酸塩基には、フェノキサジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンズオキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)などの三環式ピリミジン類、置換フェノキサジンシチジン(例えば9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンズオキサジン-2(3H)-オン)、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド[3',2':4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)などのG-クランプが含まれる。修飾核酸塩基には、プリン塩基またはピリミジン塩基が、例えば7-デアザアデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジンおよび2-ピリドンなどのその他のヘテロ環で置換されているものもまた、含まれていてもよい。さらなる核酸塩基には、米国特許No. 3,687,808に開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されたもの、そしてSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993により開示されたもの、が含まれる。これらの核酸塩基の特定のものは、本発明の化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示され、そして現在は好ましい塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にさらにより具体的である。
本発明のオリゴヌクレオチドのその他の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを向上する、化学的にオリゴヌクレオチドに対して1またはそれ以上の成分または複合体を結合することが含まれる。これらの部分または複合体には、第一または第二ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した共役基(Conjugate groups)が含まれていてもよい。本発明の共役基には、インターカレーター、リポーター分子、ポリアミン類、ポリアミド類、ポリエチレングリコール類、ポリエーテル類、オリゴマーの薬力学的特性を亢進する基、そしてオリゴマーの薬物動態学的特性を亢進する基が含まれる。典型的な共役基には、コレステロール類、脂質類、リン脂質類、ビオチン、フェナジン、フォレート(葉酸塩)、フェナントリジン(phenanthridine)、アントラキノン、アクリジン、フルオロセイン、ローダミン類、クマリン類、および色素類が含まれる。薬力学的特性を亢進する基には、本発明の文脈において、取り込みを向上させ、分解に対する抵抗性を亢進し、および/または標的核酸との配列-特異的ハイブリダイゼーションを増強する基が含まれる。薬物動態学的特性を亢進する基には、本発明の文脈において、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝、または排泄を向上させる基が含まれる。代表的な共役基は、1992年10月23日に出願した国際特許出願PCT/US92/09196およびU.S.特許6,287,860中に開示され、その開示の全体を本明細書中では参考文献として援用する。共役成分には、脂質成分、たとえばコレステロール成分、コール酸、チオエーテル、たとえば、ヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、たとえば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル成分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール成分が含まれるが、これらには限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン(fenbufen)、ケトプロフェン(ketoprofen)、(S)-(+)-プラノプロフェン(pranoprofen)、カプロフェン(carprofen)、ダンシルサルコシン(dansylsarcosine)、2,3,5-トリヨード-安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド(chlorothiazide)、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗細菌剤または抗生物質などの、活性薬剤物質と共役化されていてもよい。オリゴヌクレオチド-薬物共役体およびそれらの調製は、米国特許出願09/334,130(1999年6月15日に出願)中に記載され、その全体を参考文献として本明細書中に援用する。
所定の化合物中のすべての位置を均一に修飾されることは必要ではなく、そして実際に、一つ以上の上述した修飾を、単一の化合物中あるいはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシドにおいても組み込むことができる。
本発明の化合物は、取り込み、分布および/または吸収を助けるために、たとえば、リポソーム、受容体-標的化分子、経口、直腸、局所またはその他の製剤として、その他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合し、カプセル化し、複合体化することができ、またはそうでなければ、結合させてもよい。そのような取り込み、分布および/または吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 5,108,921;5,354,844;5,416,016;5,459,127;5,521,291;5,543,158;5,547,932;5,583,020;5,591,721;4,426,330;4,534,899;5,013,556;5,108,921;5,213,804;5,227,170;5,264,221;5,356,633;5,395,619;5,416,016;5,417,978;5,462,854;5,469,854;5,512,295;5,527,528;5,534,259;5,543,152;5,556,948;5,580,575;および5,595,756が含まれるが、それらには限定されず、そのそれぞれを参考文献として本明細書中に援用する。
同様に好ましいアンチセンス化合物は、2'MOEアンチセンス化合物およびモルホリノホスホロジアミデートなどの経口投与することができるものである。このことは、従来技術における成長ホルモン受容体化合物に関して、使用者にさらに利便性を提供する。いくつかの症状の治療において好ましい化合物は、幅広く分散されるものであり、そして従って肝臓を介した局所的作用および/または全身的作用の両方が可能になるものである。しかしながら、その他の症状においては、より少ない器官に分散されることが好ましい可能性があることが理解されるだろう。
治療用組成物の製剤化およびそれに引き続く投与(dosing)は、当該技術分野の範囲内のものであると考えられる。投与は、治療すべき疾患状態の重症度および反応性に依存し、数日間から数ヶ月間持続する治療経過、あるいは治癒が得られるかまたは疾患の減退が得られるまでの治療経過を伴う。最適な投与スケジュールは、患者体内での薬物の蓄積を測定することから算出することができる。当業者であれば、最適用量、投与方法、および反復頻度を容易に決定することができる。最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの比効力に依存して変更することができ、そして一般的には、in vitroおよびin vivo動物モデルにおいて効果的であることが見いだされるEC50に基づいて見積もることができる。一般的には、用量は、0.01μg〜100 g/kg体重であり、そして1日、1週間、1ヶ月、あるいは1年に一度またはそれ以上与えることができ、あるいは2〜20年ごとに1度であってもよい。当業者は、体液あるいは組織における測定された薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投与のための反復頻度を容易に見積もることができる。好結果の治療の後、患者に維持療法を受けさせて、疾患状態の再発を防止することが好ましく、ここでオリゴヌクレオチドは、1日に1回またはそれ以上〜20年間ごとに1回で、0.01μg〜100 g/kg体重の範囲で、維持用量で投与する。
アミダイトおよびそれらの中間体を含む以下の化合物を、US特許6,426,220に記載されたように、そしてPCT WO 02/36743において公開されたように調製した;5-メチル dCアミダイトのための5'-O-ジメトキシトリチル-チミジン中間体、5-メチル-dCアミダイトのための5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-5-メチルシチジン中間体、5-メチル dCアミダイトのための5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジンの最後から二番目の中間体、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト(5-メチル dCアミダイト)、2'-フルオロデオキシアデノシン、2'-フルオロデオキシグアノシン、2'-フルオロウリジン、2'-フルオロデオキシシチジン、2'-O-(2-メトキシエチル)修飾アミダイト、2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン中間体、5'-O-DMT-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジンの最後から二番目の中間体、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト(MOE Tアミダイト)、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルシチジン中間体、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチル-シチジンの最後から二番目の中間体、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト(MOE 5-Me-Cアミダイト)、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-メトキシエチル)-N6-ベンゾイルアデノシン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト(MOE Aアミダイト)、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-イソブチリルグアノシン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト(MOE Gアミダイト)、2'-O-(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトおよび2'-O-(ジメチルアミノ-オキシエチル)ヌクレオシドアミダイト、2'-(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-無水-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウリジン、2'-O-([2-フタルイミドキシ)エチル]-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[(2-ホルムアドキシイミノオキシ)エチル]-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,Nジメチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジン、2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト]、2'-(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシン-3'-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト]、2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2'-DMAEOE)ヌクレオシドアミダイト、2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル]-5-メチルウリジン、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)-エチル)]-5-メチルウリジン、および5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)-エチル)]-5-メチルウリジン-3'-O-(シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)ホスホールアミダイト。
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を通じて、便利にそして日常的に調製することができる。そのような合成のための装置は、例えば、Applied Biosystems(Foster City, CA)を含むいくつかの販売者により販売されている。当該技術分野において公知のそのような合成のための手段のいずれかその他のものを、さらにまたは代替的に利用することができる。同様の技術を使用してホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製することは、周知である。
3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用する、U.S.特許5,610,289または5,625,050に記載の通り、調製する。
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用する、公開されたPCT出願PCT/US94/00902及びPCT/US93/06976(それぞれWO 94/17093及びWO 94/02499として公開)に記載の通り、調製する。
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用されるU.S.特許5,023,243に記載の通り、調製する。
オリゴヌクレオシド:MMI結合オリゴヌクレオシドとも特定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとも特定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド-3結合オリゴヌクレオシドとも特定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド-4結合オリゴヌクレオシドとも特定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、ならびに、例えば、MMIとP=OあるいはP=S結合とを換えたものを有する混合バックボーン化合物は、そのすべてが本明細書中で参考文献として援用される、U.S.特許5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240および5,610,289に記載の通り、調製する。
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、U.S.特許5,223,618に記載の通り、調製する。
一般的には、RNA合成化学は、戦略的な中間反応における様々な保護基の選択的取り込みに基づく。当業者は、有機合成において保護基を使用することを理解しうるが、有用な保護基のクラスには、シリルエーテルが含まれる。特に、大型(bulky)シリルエーテルを使用して、2'-ヒドロキシル上の酸-不安定なオルソエステル保護基と組み合わせて、5'-ヒドロキシルを保護化する。次いで、この組み合わせの保護基は、標準的な固相合成技術と共に使用される。すべてのその他の合成工程の後、酸-不安定なオルソエステル保護基を最終的に除去することは、重要なことである。さらに、合成のあいだシリル保護基を初期に使用することは、2'ヒドロキシルの所望されない脱保護化なしに、所望したときに容易に除去することを保証する。
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または、混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型でありうる。これらには、結合ヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが結合ヌクレオシドの5'あるいは3'“ウィング”セグメントの間に位置する第一の型、及び、“ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の3'端あるいは5'端のどちらかに位置する、第二の“オープンエンド”型が含まれる。第一の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ギャップマー”あるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ヘミマー”あるいは“ウィングマー”としても知られる。
2'-O-アルキルホスホロチオエートを有するキメラオリゴヌクレオチド及び2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを、上記の通り、Applied Biosystems自動DNAシンセサイザーModel 394を使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーを用い、及び、DNA部分には2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホールアミダイトを、そして、5'及び3'ウィングには5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホールアミダイトを使用して、合成する。標準的な合成サイクルを、5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホールアミダイトについての反応時間を増加させたカップリング工程を取り込むことにより修飾する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切り出し、そして、濃縮アンモニア(NH4OH)中で55℃にて12〜16時間、脱保護化する。次いで、脱保護化したオリゴを、適切な方法(沈殿、カラムクロマトグラフィー)により回収し、減圧下にて容量を減少させ、そしてキャピラリー電気泳動により、および、質量分析により、収量について、および、純度について、分光光度的に分析される。
〔2'-O-(2-メトキシエチル)〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-(メトキシエチル)〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-(メトキシエチル)アミダイトを2'-O-メチルアミダイトに置き換えた2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドのための上記の方法に従って、調製した。
〔2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕--〔2'-デオキシホスホロチオエート〕--〔2'-O-(メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチドは、2'-O-(メトキシエチル)アミダイトを2'-O-メチルアミダイトに置き換えた、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記の方法、キメラ構造のウィング部分中のホスホジエステルヌクレオチド間結合を作るためのヨウ素を用いる酸化、中央ギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を作るための3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を使用する硫化に従って、調製する。
本発明に従って、本発明のアンチセンス化合物およびそれらの相補物を含む一連の核酸二本鎖を、成長ホルモン受容体を標的とするように設計することができる。一態様において、これらの核酸二本鎖は、二本鎖RNA化合物である(短い干渉RNAあるいはsiRNA)。一般的には、RNase H-依存的アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性部位は、siRNAの活性部位であると予想される(Vickers et al., 2003, J. Biol Chem. 278, 7108-7118)。本発明の一態様において、二本鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、少なくとも表1に示されるオリゴヌクレオチド配列の部分を含む。あるいは、成長ホルモン受容体を標的とする一連のdsRNAを合成しそして試験する新規の“ジーンウォーキング(gene walk)”を使用することができる。
細胞が80%コンフルエントに達したら、それらを本発明の二本鎖アンチセンス化合物を用いて処理する。96-ウェルプレート中で増殖させた細胞に関して、ウェルを、200μLのOPTI-MEM-1減少血清培地(Gibco BRL)を用いて一度洗浄し、そして次いで、12μg/mL LIPOFECTIN(Gibco BRL)および最終濃度200 nMの所望の二本鎖アンチセンス化合物を含有する130μLのOPTI-MEM-1により処理しする。処理後5時間後に、培地を新鮮な培地に置換する。細胞を処理後16時間後に回収し、その時点でRNAを単離し、そして標的の減少をRT-PCRにより測定する。
制御孔ガラスカラム固相支持体から切り出し、そして、濃縮された水酸化アンモニウム中、55℃にて12〜16時間、脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは、1 M NH4OAcから>3倍量のエタノールを用いた沈殿により回収する。合成されたオリゴヌクレオチドは、エレクトロスプレー質量分析(分子量決定)により、そしてキャピラリーゲル電気泳動により分析され、そして、少なくとも70%の全長物質であると判断された。合成により得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル結合の相対量は、-16 amu生成物に対する正確な分子量の比率により決定した(+/- 32 +/-48)。いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをChiang ら(J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171)により記載の通り、HPLCで精製した。HPLC精製物質を用いて得られた結果は、非HPLC精製物質から得られたものと同様だった。
オリゴヌクレオチドを、固相P(III)ホスホールアミダイト化学により、96ウェルフォーマットで同時に96配列を構築することができる自動シンセサイザーで合成した。ホスホロジエステルヌクレオチド間結合はヨウ素水溶液を用いる酸化によって得られた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を使用した硫化により、生成した。標準的な塩基-保護β-シアノエチル-ジイソ-プロピルホスホールアミダイトは、商業販売者(例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAまたはPharmacia, Piscataway, NJ)から購入した。非標準ヌクレオシドは、標準的な方法、あるいは、特許の方法の通り、合成する。それらは、塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトとして使用される。
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈及びUV吸収分光器により調査した。個々の生成物の全長の完全性を、キャピラリー電気泳動(CE)により、96ウェルフォーマット(Beckman P/ACETM MDQ)で、あるいは、個々に調製した試料については市販のCE器具(例えば、Beckman P/ACETM5000、ABI 270)で、評価した。塩基組成及びバックボーン組成は、エレクトロスプレー質量分光計を使用する化合物の質量分析により、確かめられた。すべてのアッセイ試験プレートは、マスタープレートから、シングルチャネルあるいはマルチチャネルのロボットピペッターを使用して希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも85%が、少なくとも85%完全長であれば、許容可能であると判断した。
標的核酸の発現に対するアンチセンス化合物の効果は、測定可能なレベルで標的核酸が存在する場合、様々な細胞タイプのいずれにおいても、試験することができる。これは、例えば、PCRあるいはノザンブロット分析を使って日常的に決定することができる。以下の細胞タイプは説明のために提供されるが、選択された細胞タイプ中において標的が発現される場合には、他の細胞タイプを日常的に使用することができる。これは、当該技術分野において日常的な方法、たとえばノザンブロット解析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、あるいはRT-PCR、により容易に確認することができる。
ヒト移行上皮細胞(transitional cell)膀胱癌細胞株T-24細胞はAmerican Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より入手した。T-24細胞は、10%ウシ胎児血清(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)、100 unit/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)を添加した、完全McCoy's 5A基本培地(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)で、日常的に培養した。細胞は、それが90%コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により、日常的に継代した。RT-PCR分析において使用するため、細胞を96ウェルプレート(Falcon-Primaria #353872)に7000細胞/ウェルの濃度でまいた。
ヒト肺癌細胞株A549は、American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より入手した。A549細胞は、10%ウシ胎児血清(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)、100 unit/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)を加えた、DMEM基本培地(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)で、日常的に培養した。細胞は、それが90%コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により、日常的に継代した。
ヒト新生児皮膚線維芽細胞(NHDF)は、Clonetics Corporation(Walkersville MD)より入手した。NHDFは、提供者により推奨される通り添加した線維芽細胞成長培地(Clonetics Corporation, Walkersville MD)で、日常的に維持した。細胞は提供者により推奨される通り、10継代まで維持した。
ヒト胎児ケラチノサイト(HEK)はClonetics Corporation(Walkersville MD)より入手した。HEK細胞は、提供者により推奨される通り処方されたケラチノサイト増殖培地(Clonetics Corporation, Walkersville MD)で、日常的に維持した。細胞は、提供者により推奨される通り、10継代まで、日常的に維持した。
ヒト乳房癌腫細胞株MCF-7を、American Type Culure Collection(Manassas, VA)から入手した。MCF-7細胞は、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を添加したDMEM、低グルコース(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)中で、日常的に培養した。細胞が90%コンフルエントに達したときに、細胞を、トリプシン処理および希釈により、日常的に継代した。細胞を、RT-PCR解析において使用するため、96-ウェルプレート(Falcon-Primaria#3872)中に、7000細胞/ウェルの濃度でまいた。
マウス脳内皮細胞株、b.ENDを、Max Plank研究所(Bad Nauheim, Germany)のDr. Werner Risauより入手した。b.END細胞は、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を添加したDMEM、高グルコース(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)中で日常的に培養された。細胞が90%コンフルエントに達した際に、細胞を、トリプシン処理と希釈により、日常的に継代した。細胞を、RT-PCR解析において使用するため、3000細胞/ウェルの濃度で96-ウェルプレート(Falcon-Primaria #3872)中にまいた。
細胞が65〜75%コンフルエントに達したとき、オリゴヌクレオチドにより処理した。96ウェルプレートで増殖させた細胞について、ウェルを100μLのOPTI-MEMTM-1減少血清培地(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)で一度洗浄し、次に3.75μg/mL LIPOFECTINTM(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)及び望ましい濃度のオリゴヌクレオチドを含有する、130μLのOPTI-MEMTM-1で処理した。細胞を処理し、そしてデータを3回繰り返しで得る。37℃にて4〜7時間処理後、培地をフレッシュな培地に交換した。オリゴヌクレオチド処理後16〜24時間後に細胞を回収した。
成長ホルモン受容体発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野において知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、成長ホルモン受容体mRNAレベルは、例えばノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、あるいは、リアルタイムPCR(RT-PCR)により、定量することができる。リアルタイム定量PCRが現在のところ好ましい。RNA分析は、全細胞内RNA、あるいは、ポリ(A)+mRNAについて行うことができる。本発明のRNA解析の好ましい方法は、本明細書中の他の実施例に記載する様な、全細胞内RNAを使用するものである。RNA単離の方法は、当該技術分野において周知である。ノザンブロット分析もまた、当該技術分野においては、日常的な方法である。リアルタイム定量(PCR)は、PE-Applied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能な、市販のABI PRISMTM 7600、7700または7900 Sequence Detection Systemを使用することにより、都合よく成し遂げることができ、そして、製造者の指示に従って使用される。
表現型アッセイ
成長ホルモン受容体阻害剤が、本明細書中に開示される方法によりいったん特定されたら、化合物を1またはそれ以上の表現型アッセイでさらに調べる。それぞれのアッセイは、特定の疾患状態または症状の治療における有効性についての測定可能な最終目標予測を有する。表現型アッセイ、およびそれらに使用するためのキット、および試薬は、当業者に対して周知であり、そして本明細書中では、健康および疾患における成長ホルモン受容体の役割および/または関連性を調べるために使用される。いくつかの商業的供給元のいずれか一つから購入することができる代表的な表現型アッセイには、細胞生存率、細胞傷害性、増殖または細胞生存を測定するためのもの(Molecular Probes, Eugene, OR;PerkinElmer, Boston, MA)、酵素的アッセイを含むタンパク質ベースのアッセイ(Panvera, LLC, Madison, WI;BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ;Oncogene Research Products, San Diego, CA)、細胞制御、シグナル伝達、炎症、酸化プロセス、およびアポトーシスに関するもの(Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI)、トリグリセリド蓄積に関するもの(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、血管形成アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイおよび代謝アッセイに関するもの(Chemicon International Inc., Temecula, CA;Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)が含まれる。
本明細書中に記載するin vivo研究の個々の被験体は、ヒトを含む温血の脊椎動物である。
ポリ(A)+ mRNA単離
ポリ(A)+ mRNAは、Miuraら(Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764)に従って、単離された。ポリ(A)+ mRNA単離のための他の方法は、当該技術分野において日常的なものである。簡潔には、96ウェルプレート上で増殖させた細胞について、細胞から増殖培地を除き、そして、各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。60μL溶解バッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.6、1 mM EDTA、0.5 M NaCl、0.5%NP-40、20 mMバナジル-リボヌクレオシド複合体)を各ウェルに加え、プレートをゆっくり揺り動かし、そして次に、室温で5分間インキュベートした。溶解物55μLをオリゴd(T)をコートした96ウェルプレート(AGCT Inc., Irvine CA)に移した。プレートを、室温にて60分間インキュベートし、洗浄バッファー(10 mM Tris-HCl pH 7.6、1 mM EDTA、0.3 M NaCl)200μLで3回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオルに当てて、余分な洗浄バッファーを取り除き、そしてその後、5分間風乾した。
70℃に前もって熱した、溶出バッファー(5 mM Tris-HCl pH 7.6)60μLを、各ウェルに加え、プレートを90℃ホットプレートで5分間インキュベートし、そして、次に溶出物を新しい96ウェルプレートに移した。
全RNA単離
全RNAは、Qiagen Inc.(Valencia CA)より購入したRNEASY 96TMキット及びバッファーを用い、製造者の推奨する方法に従って単離した。簡潔には、96ウェルプレート上で増殖させた細胞について、増殖培地を細胞から除き、そして、各ウェルを200μL冷PBSで洗浄した。150μLのバッファーRLTを各ウェルに加え、そして、プレートを20秒間激しく揺り動かした。70%エタノール150μLを次に各ウェルに加え、内容物を3回上下にピペッティングして混ぜた。次に試料を排水回収トレイを備えたQIAVACTMマニホルドに取り付け、そして減圧装置に取り付けた、RNEASY 96TMウェルプレートに移した。減圧は1分間行われた。500μLのバッファーRW1をRNEASY 96TMプレートの各ウェルに加え、15分間インキュベートし、そして、再び減圧を1分間行った。その後、500μLのバッファーRW1をRNEASY 96TMプレートの各ウェルの添加し、そして減圧を2分間行った。その後、1 mLのバッファーRPEをRNEASY 96TMプレートの各ウェルの添加し、そして減圧を90秒間行った。次に、バッファーRPE洗浄を繰り返し、さらに3分間減圧を行った。プレートをQIAVACTMマニホルドから取り外し、そしてペーパータオルにあてて乾燥させた。次に、プレートを、1.2 mL回収チューブを含む、回収チューブラックを備えたQIAVACTMマニホルドにもう一度取り付けた。RNAを次に各ウェル中の140μLのRNAseフリー水をピペッティングすることにより溶出し、1分間インキュベートし、そして次に、3分間減圧を行った。
成長ホルモン受容体mRNAレベルの定量は、ABI PRISMTM 7600、7700、または7900 Sequence Detection System(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)を製造者の指示に従って使用して、リアルタイム定量PCRにより決定された。これは、閉じられたチューブで、ゲルに基づかず、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物のハイスループット定量ができる蛍光検出システムである。PCRが終了した後に、増幅産物が定量される標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量PCRにおける産物はそれが蓄積するに従って定量される。これは、フォワードPCRプライマー及びリバースPCRプライマーの間に特異的にアニールし、そして2つの蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドをPCR反応物中に含むことにより達せられる。レポーター色素(例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CA、Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはIntegrated DNA Technologies Inc., Coralville, IAのいずれかから入手可能なFAMあるいはJOE)を、プローブの5'端に結合させ、そして、クエンチャー色素(例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CA、Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはIntegrated DNA Technologies Inc., Coralville, IAのいずれかから入手可能なTAMRA)を、プローブの3'端に結合させる。プローブ及び色素が無傷なとき、レポーター色素の発光は3'クエンチャー色素の近接により消光される。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングはTaqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性により切断されうる基質を作り出す。PCR増幅サイクルの伸長相の間、Taqポリメラーゼによるプローブの切り出しは、プローブの残りから(そしてつまりクエンチャー成分から)レポーター色素を遊離し、そして、配列特異的な蛍光シグナルが生み出される。各サイクルで、さらなるレポーター色素分子はその対応するプローブから切り出され、そして、蛍光強度は、ABI PRISMTM Sequence Detection Systemに組み込まれるレーザー光学系により、一定の間隔でモニターされる。各アッセイにおいて、未処理の対照試料由来mRNAの希釈系列を含有する一連の並行反応は、試験試料の、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パーセントを定量するのに用いられる、標準曲線を生み出す。
フォワードプライマー:GATGTCCCAATGTGACATGCA(SEQ ID NO: 5)、
リバースプライマー:AAGTAGGCATTGTCCATAAGGAAGTT(SEQ ID NO: 6)、および
PCRプローブ:FAM-CCGGAAATGGTCTCACTCTGCCAAGA-TAMRA(SEQ ID NO: 7)、であり、ここでFAMは蛍光色素であり、そして、TAMRAはクエンチャー色素である。ヒトGAPDH用のPCRプライマーは:
フォワードプライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO: 8)、
リバースプライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO: 9)であり、及び
PCRプローブは:5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3'(SEQ ID NO: 10)、
であり、JOEは蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRAはクエンチャー色素である。
フォワードプライマー:TTGACGAAATAGTGCAACCTGATC(SEQ ID NO: 12)、
リバースプライマー:CGAATCCCGGTCAAACTAATG(SEQ ID NO: 13)、および
PCRプローブ:FAM-CATTGGCCTCAACTGGACTTTACTAA-TAMRA(SEQ ID NO: 14)、
であり、ここでFAMは蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRAはクエンチャー色素である。マウスGAPDHについてPCRプライマーは:
フォワードプライマー:GGCAAATTCAACGGCACAGT(SEQ ID NO: 15)、
リバースプライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT(SEQ ID NO: 16)であり、及び
PCRプローブは:5' JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA 3'(SEQ ID NO: 17)
であり、JOEは蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRAはクエンチャー色素である。
アンチセンス処理の18時間後、単層の細胞を冷PBSで2回洗浄し、そして、1 mL RNAZOLTM(TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX)中で溶解した。全RNAは製造者が推奨するプロトコルに従って調製した。MOPSバッファーシステム(AMRESCO, Inc. Solon, OH)を用い、1.1%ホルムアルデヒドを含有する1.2%アガロースゲルによる電気泳動により、20μgの全RNAを分離した。Northern/Southern Transferバッファーシステム(TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX)を使用して、一晩キャピラリートランスファーすることによって、RNAをゲルからHYBONDTM-N+ ナイロンメンブレン(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)に移した。RNAのトランスファーは、UV可視化により確認した。メンブレンをSTRATALINKERTMUV Crosslinker 2400(Stratagene, Inc, La Jolla, CA)を使用して、UV架橋により固定し、そしてその後QUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液(Stratagene, La Jolla, CA)を使用して、ストリンジェントな条件についての製造者の推奨を用いて、プローブ化した。
本発明に従って、刊行物に記載された配列(本明細書中でSEQ ID NO: 4として援用されるGenBankアクセッション番号NM_000163.1、および本明細書中でSEQ ID NO: 18として援用されるGenBankアクセッション番号NT_006702.8の配列の位置468085〜502183の相補鎖)を用いて、一連のオリゴヌクレオチドを、ヒト成長ホルモン受容体RNAの異なる領域を標的とするように設計した。化合物は表1に示す。“標的部位”は、化合物が結合する特定の標的配列上の最初の(最も5'側の)ヌクレオチドを示す。表1中のすべての化合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)であり、両方の端(5'及び3'方向)を5-ヌクレオチドの“ウィング”によって挟まれた、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される。ウィングは、2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は5-メチルシチジンである。化合物を、ヒト成長ホルモン受容体mRNAレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に記載の通り、定量的リアルタイムPCRにより分析した。データは、MCF7細胞を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理した3回の実験からの平均である。それぞれのデータ点についての陽性対照は、SEQ ID NOにより表中に特定する。存在する場合、“N.D.”は“データなし”を示す。
本発明に従って、2番目の一連のアンチセンス化合物を、刊行物に記載された配列(本明細書中でSEQ ID NO: 11として援用されるGenBankアクセッション番号NM_010284.1、本明細書中でSEQ ID NO: 97として援用される、エクソン1B:エクソン2に由来する選択的スプライシング部位を有するGenBankアクセッション番号AF120480.2の変異体、本明細書中でSEQ ID NO: 98として援用される、エクソン1C:エクソン2に由来する選択的スプライシング部位を有するGenBankアクセッション番号AF120480.2の変異体、本明細書中でSEQ ID NO: 99として援用される、エクソン1D:エクソン2に由来する選択的スプライシング部位を有するGenBankアクセッション番号AF120480.2の変異体、および本明細書中でSEQ ID NO: 100として援用されるゲノム配列に示されるGenBankアクセッション番号AF120480.2およびGenBankアクセッション番号AC073753.1由来の配列)を用いて、マウス成長ホルモン受容体RNAの異なる領域を標的とするように設計した。化合物は表2に示す。“標的部位”は、化合物が結合する特定の標的核酸上の最初の(最も5'側の)ヌクレオチド番号を示す。表2中のすべての化合物は、長さが20ヌクレオチドの、キメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)であり、両方の側(5'及び3'方向)を5-ヌクレオチドの“ウィング”によって挟まれた、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される。ウィングは、2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間(バックボーン)結合はオリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は5-メチルシチジンである。化合物を、マウス成長ホルモン受容体mRNAレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に記載の通り、定量的リアルタイムPCRにより分析した。データは、b.END細胞を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処置した3回の実験からの平均である。それぞれのデータ点についての陽性対照は、SEQ ID NOにより表中に特定する。
存在する場合、“N.D.”は“データなし”を示す。
ウエスタンブロット分析(イムノブロット分析)は標準的な方法を用いて行われる。細胞をオリゴヌクレオチド処理の16〜20時間後に回収し、PBSで1回洗浄し、Laemmliバッファー(100μl/well)に懸濁し、5分間煮沸し、そして、16%SDS-PAGEゲルにロードする。ゲルを1.5時間、150 Vで泳動し、そして、ウエスタンブロットのために、メンブレンにトランスファーする。成長ホルモン受容体に対する適切な一次抗体を、一次抗体の種に対する放射標識した、あるいは、蛍光標識した二次抗体とともに使用する。バンドをPHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)を使用して、可視化する。
体重が9〜lO gの40匹のオスBalb/C(a)マウスを、4匹/ケージでケージの中に入れ、そして1週間の研究の開始までの約1週間(Day -7)、新しい同腹子をそれらの環境中に順応させた。この齢のマウスは、成長率が最高であった。それらのマウスの体重は、この期間中2日ごとに測定しそして記録した。マウスが11 gとなったとき(day -2)、血液サンプルを以下に記載する様に麻酔下にて回収し、そして血清IGF-Iアッセイを行い、前処置値を決定し、そして動物の変動性を減少させるためにマウスを処置群に割り当てる際の補助とした。血液サンプルを得るため、動物をペントバルビタール(50 mg/kg腹腔内)を用いて麻酔し、そして非-空腹時血液サンプルを、正確に5分後に、軽いエーテル麻酔下にてヘパリン化毛細管を介して眼球後部血管叢から回収した。40匹の動物を5群に分類し、試験のために各群は同様の体重平均および同様のIGF-I平均濃度を有する様にした。
対照-塩類溶液(2日ごとに1回)、
ASO(成長ホルモン受容体に対するアンチセンス)-ISIS 227446(SEQ ID NO: 104)(2日ごとに1回、3および30 mg/kg)、
ミスマッチ(陰性対照オリゴヌクレオチド)-ISIS 261303(SEQ ID NO: 267、ISIS 227446に対して8-塩基ミスマッチ)(2日ごとに1回、30 mg/kg)、
オクトレオチド(Octreotide)-(25 pg/kg/1日2回)、
に指定した。
特異的結合アッセイを、ヨウ化ヒト成長ホルモン[125I]hGHを使用して肝臓組織を用いて行った。
アンチセンス処理後のこれらの成長ホルモン受容体レベル測定値は、30 mg/kgのアンチセンスを1日おきに使用する本発明者らの研究において、対照(塩類溶液)と比較して、血清インスリン様成長因子-Iレベルを45%減少させることと一致している。
オスBalb/C(a)マウスを調製し、そして上述の実施例18における様に、解析のためにグループ分けした。
対照-塩類溶液(2日ごとに1回)
ASO(成長ホルモン受容体に対するアンチセンス)-ISIS 227446(SEQ ID NO: 104)(2日ごとに1回、30および50 mg/kg)
無関係な陰性対照オリゴヌクレオチド-ISIS 260120(TTACCGTATGGTTCCTCACT;SEQ ID NO: 268、(2日ごとに1回、50 mg/kg))、
に指定した。
2週間の研究を、実施例18における1週間の研究と同様の方法で、今回はISIS 227446を、3、5、10、20および30 mg/kgの用量で使用して、行った。ミスマッチ対照を同一用量で与えた。マウスを、14日間、1日おきに、アンチセンス化合物または塩類溶液で処置した。
未熟児の網膜症は、極低出生児体重の新生児において失明を引き起こす可能性がある血管新生障害である。網膜症(異常血管形成)は、例えば、保育器の中で見られる様な相対的に高い酸素レベルにより引き起こされる。網膜症(網膜における異常血管形成)のマウスモデルを使用して、血管新生の程度に対する薬物の作用を研究する。
以下の病理学的動物モデルにおいてそしてヒトにおいて、当業者により理解される様に、成長ホルモン受容体のアンチセンス阻害剤を使用する研究もまた行われる:I型およびII型糖尿病性腎症モデル、癌モデル、関節炎モデル、および化学療法により引き起こされる下痢モデル。
Claims (45)
- 成長ホルモン受容体をコードする核酸分子を標的とする長さ8〜80核酸塩基の化合物であって、成長ホルモン受容体をコードする前記核酸分子(SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 18)と特異的にハイブリダイズし、そして成長ホルモン受容体の発現を阻害する、前記化合物。
- 長さ12〜50核酸塩基である、請求項1に記載の化合物。
- 長さ15〜30核酸塩基である、請求項1に記載の化合物。
- オリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の化合物。
- オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の化合物。
- オリゴヌクレオチドがDNAオリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の化合物。
- オリゴヌクレオチドがRNAオリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の化合物。
- オリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項4に記載の化合物。
- 短い干渉RNA(siRNA)分子である、請求項7に記載の化合物。
- 成長ホルモン受容体をコードする核酸分子(SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 18)と、少なくとも70%の相補性を有する、請求項1に記載の化合物。
- 成長ホルモン受容体をコードする核酸分子(SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 18)と、少なくとも80%の相補性を有する、請求項1に記載の化合物。
- 成長ホルモン受容体をコードする核酸分子(SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 18)と、少なくとも90%の相補性を有する、請求項1に記載の化合物。
- 成長ホルモン受容体をコードする核酸分子(SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 18)と、少なくとも95%の相補性を有する、請求項1に記載の化合物。
- SEQ ID NO: 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、73、74、75、76、77、78、79、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93または94の少なくとも8-核酸塩基部分を含む、請求項1に記載の化合物。
- オリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、73、74、75、76、77、78、79、81、82、83、84、85、86、87、88、89、91、92、93および94から選択される、請求項14に記載の化合物。
- オリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 30、44および57から選択される、請求項15に記載の化合物。
- 成長ホルモン受容体(SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 18)をコードする領域に特異的にハイブリダイズし、この領域、またはその部分または部位が、翻訳開始コドン、停止コドン、コード領域、5'非翻訳領域、3'非翻訳領域、イントロン:エクソン結合部、またはエクソン:イントロン結合部を含む、請求項1に記載の化合物。
- 核酸分子の領域、部分または部位が、SEQ ID NO: 161〜232から選択される配列の少なくとも8-核酸塩基部分を含む、請求項17に記載の化合物。
- 成長ホルモン受容体の発現を少なくとも45%阻害する、請求項1に記載の化合物。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基を有する、請求項1に記載の化合物。
- 少なくとも1つの2'-O-メトキシエチル糖部分を有する、請求項20に記載の化合物。
- 少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する、請求項20に記載の化合物。
- 少なくとも1つの5-メチルシトシンを有する、請求項20に記載の化合物。
- 細胞または組織における成長ホルモン受容体の発現を阻害する方法であって、前記細胞または組織を請求項1に記載の化合物と接触させることを含む、前記方法。
- 成長ホルモン受容体のモジュレータをスクリーニングする方法であって、以下の工程:
a)成長ホルモン受容体をコードする核酸分子の好ましい標的部分を、成長ホルモン受容体の1またはそれ以上の候補モジュレータと接触させる工程;そして
b)成長ホルモン受容体の発現をモジュレートする、成長ホルモン受容体発現の1またはそれ以上のモジュレータを同定する工程;
を含む、前記方法。 - 成長ホルモン受容体発現のモジュレータが、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、RNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド-RNA二本鎖を形成することができる前記RNAオリゴヌクレオチドの少なくとも部分を有するRNAオリゴヌクレオチド、またはキメラオリゴヌクレオチドを含む、請求項25に記載の方法。
- 成長ホルモン受容体のシグナル伝達、活性、または発現の既知阻害剤、または成長ホルモン/インスリン様成長因子軸の既知阻害剤に関連する成長ホルモン受容体の候補モジュレータを“ベンチマークテスト”することをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 成長ホルモン受容体シグナル伝達、活性または発現の既知阻害剤が、ドーパミンアゴニスト、ソマトスタチン類似体または成長ホルモン受容体アンタゴニストである、請求項27に記載の方法。
- 成長ホルモン受容体のシグナル伝達、活性または発現の既知阻害剤が、Trovert、オクトレオチド(octreotide)、Sandostatin、メシル酸ブロモクリプチン(bromocriptine mesylate)、またはカベルゴリン(cabergoline)、または請求項1の化合物である、請求項28に記載の方法。
- サンプル中の成長ホルモン受容体の存在を、SEQ ID NOs 5または6を含む少なくとも1つのプライマー、またはSEQ ID NO 7を含むプローブを使用して同定することを含む、疾患状態を同定するための診断方法。
- 請求項1の化合物を含む、キットまたはアッセイデバイス。
- 成長ホルモン受容体のシグナル伝達または成長ホルモン/インスリン様成長因子軸に関連する疾患または症状を有する動物を治療する方法であって、前記動物に対して、成長ホルモン受容体またはインスリン様成長因子レベルまたは発現をモジュレートすることができる治療的または予防的有効量のオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
- オリゴヌクレオチドが、請求項1に記載の化合物である、請求項32に記載の方法。
- 前記疾患または症状疾患または症状が、先端肥大症、巨人症、癌、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、異所性血管新生、異所性血管形成、黄斑変性、リウマチ性関節炎、または短寿命である、請求項32に記載の方法。
- 動物がヒトである、請求項32に記載の方法。
- 細胞または組織におけるインスリン様成長因子-1の発現を阻害する方法であって、前記細胞または組織を、請求項1に記載の化合物と接触させ、それにより成長ホルモン受容体の発現およびインスリン様成長因子-1の発現を阻害することを含む、前記方法。
- 成長ホルモン受容体のシグナル伝達のモジュレータをスクリーニングする方法であって、以下の工程:
a)成長ホルモン受容体をコードする核酸分子の好ましい標的部分を、成長ホルモン受容体の1またはそれ以上の候補モジュレータと接触させる工程;そして
b)成長ホルモン受容体のシグナル伝達をモジュレートする成長ホルモン受容体発現の1またはそれ以上のモジュレータを同定する工程;
を含む、前記方法。 - 成長ホルモン受容体発現のモジュレータが、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、RNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド-RNA二本鎖を形成することができる前記RNAオリゴヌクレオチドの少なくとも部分を有するRNAオリゴヌクレオチド、またはキメラオリゴヌクレオチドを含む、請求項37に記載の方法。
- 成長ホルモン受容体発現のモジュレータが、インスリン様成長因子-1発現をモジュレートする、請求項37に記載の方法。
- 成長ホルモン受容体シグナル伝達、活性または発現の既知阻害剤、または成長ホルモン/インスリン様成長因子軸の既知阻害剤に関連する成長ホルモン受容体の候補モジュレータを“ベンチマークテスト”することを更に含む、請求項37に記載の方法。
- 成長ホルモン受容体シグナル伝達、活性または発現の既知阻害剤が、ドーパミンアゴニスト、ソマトスタチン類似体または成長ホルモン受容体アンタゴニストである、請求項40に記載の方法。
- 成長ホルモン受容体シグナル伝達、活性または発現の既知阻害剤が、Trovert、オクトレオチド、Sandostatin、メシル酸ブロモクリプチン、またはカベルゴリンもしくは請求項1の化合物である、請求項41に記載の方法。
- 成長ホルモン受容体のシグナル伝達と関連する疾患または症状の治療のための医薬の製造における、成長ホルモン受容体をコードする核酸分子を標的とする化合物の使用。
- 成長ホルモン受容体をコードする核酸分子を標的とする化合物が、成長ホルモンをコードする核酸分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項43に記載の使用。
- 疾患または症状が、先端肥大症、巨人症、癌、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、異所性血管新生、異所性血管形成、黄斑変性、リウマチ性関節炎、または短寿命である、請求項43に記載の使用。
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