JP2015506951A - 成長ホルモン変異体および成長ホルモン受容体を標的化するオリゴヌクレオチドを含む併用療法 - Google Patents

Abstract

本開示は、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の上昇したレベルを有する疾患の治療または予防のための方法に関する。本方法は、必要とする対象へ、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）を標的化するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、拮抗活性を有する成長ホルモン（ＧＨ）変異体を投与することを含む。

Description

本開示は、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のレベルの上昇によって引き起こされる、および／またはそれに関連付けられる疾患の治療または予防のための方法に関し、それは成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせた拮抗活性を有する成長ホルモン（ＧＨ）変異体の投与に依存する。

下垂体によって放出される成長ホルモン（ＧＨ）は、身体およびその臓器の成長を制御するホルモンのカスケードのメンバーである。血流へのＧＨの分泌の後に、多くの細胞および臓器タイプ上での成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）への結合が続く。成長ホルモンシグナル伝達は、この相互作用によって伝えられる。成長ホルモンシグナル伝達は、肝臓、脂肪組織、腎臓、および他の臓器中で生成され、血流中に分泌される別のホルモンである、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の生成をもたらす。血清ＩＧＦ−Ｉの約７５％が、ＧＨ刺激作用に応答して肝臓で生成される。多くの障害は、血漿および／または組織中の上昇したＧＨレベルおよび／または上昇したＩＧＦ−Ｉレベルによって引き起こされるか、および／またはそれらに関連付けられ、先端巨大症、巨人症、網膜症、黄斑変性症、腎症、糖尿病、および癌が含まれる。これらおよび他の障害におけるＧＨおよびＩＧＦ−Ｉの役割は、よく知られている。多くのＧＨ効果の媒介におけるＩＧＦ−Ｉの役割がよく知られており、この相互関係は、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸と称される。正常なフィードバックループにおいて、ＩＧＦ−Ｉはまた、減少させるべき下垂体によるＧＨの生成を引き起こす。例えば、より効果的に、安全に、好都合に、および／または削減された費用で、対象におけるＩＧＦ−Ｉレベルを低下させる治療に対する必要性が存在する。

拮抗活性を有するＧＨ変異体であるソマバートは、患者における血清ＩＧＦ−Ｉレベルを低下させるその能力に対して先端巨大症の治療において承認された。先端巨大症の治療に対する現在の慣習の概説に関しては、Ｇｕｉｓｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１１を参照されたい。簡潔に言うと、先端巨大症では、腫瘍を減量させ、かつ下垂体腫瘍のＧＨ分泌を減少させるための外科手術が治療において最初に使用され、血清におけるＩＧＦ−Ｉの生成を減少させる。血清ＩＧＦ−Ｉを減少させるため、ならびにいくつかの場合においては、ＧＨ放出をまた低下させるための薬物治療も使用される。すべての治療は、薬物単独療法か、またはその組み合わせが２つの異なる生物学的標的を対象とする併用療法を使用する。第一選択薬物治療はソマトスタチン（ＳＳＴ）アゴニストを用いるものであり、この治療は、最初は低用量で開始され、ＧＨを低下させ、かつ患者の血清ＩＧＦ−Ｉを正常化する用量に徐々に増大される。ＳＳＴアゴニスト治療が失敗した場合、ドーパミンアゴニストがＳＳＴアゴニストと組み合わせて使用されるか、またはソマバートがＳＳＴアゴニストと組み合わせて使用される、あるいは単独療法としてソマバートが使用される。ソマバートの用量は典型的に、初日に４０ｍｇの負荷量および１０ｍｇの１日用量で開始され、この１日用量は、血清ＩＧＦ−Ｉの正常化まで最大３０ｍｇの認可された１日用量に徐々に増大される。ソマバートの認可された最大の１日用量には不足があり、臨床医は認可用量を超えて増量した。ソマバートは、しかしながら、法外に高価であり、不便な毎日（１日に１回または２回）の注射を必要とし、凍結乾燥された粉末であり、再構成を必要とし、注射部位反応および肝臓酵素の増大を引き起こす安全性の問題を有し、さらに望ましくないＧＨの増大を生み出す。このため、臨床医は典型的に、上述のものとは異なる併用療法において、ソマバートを使用しようとはしない。臨床医は、ＳＳＴを使用する第一選択療法が失敗した患者における、またはソマバート単独療法もしくはＳＳＴとの組み合わせが失敗した患者における、新しいより効果的な単独療法を探し求めている。例えば、ソマバートを使用する併用療法は、異なる生物学的標的を対象とする薬物と、ならびにＳＳＴアゴニストが腫瘍の大きさを減少させる可能性を有するため、典型的にＳＳＴアゴニストとのみ考えられる。

本発明者らは、ここで、拮抗活性を有する成長ホルモン（ＧＨ）変異体およびＧＨＲを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、対象におけるインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）レベルを低下させるように相乗的に作用するという驚くべき発見をした。言い換えると、ＧＨＲへのＧＨ変異体およびオリゴヌクレオチドの併用投与は、相加効果を上回って発現する。これは驚くべきことであり、具体的には、同じ標的への薬物を使用することにより予期される相乗作用がないと考えられ、標的への薬物の用量を増大し得るとも言える。したがって、本開示は、ＩＧＦ−Ｉのレベルの上昇によって引き起こされる、および／またはそれに関連付けられる疾患の治療または予防のための方法を提供し、その方法は、それを必要とする対象に、ＧＨＲの発現を阻害するように、ＧＨＲをコードする核酸を標的化する８〜８０個の核酸塩基の長さのオリゴヌクレオチドと組み合わせてＧＨ拮抗活性を有するＧＨ変異体を投与することを含み、それにより対象におけるＩＧＦ−Ｉのレベルを低下させる。１つの実施形態において、血清／血漿ＩＧＦ−Ｉのレベルが低下される。

１つの実施形態において、本方法は、その対象のＧＨＲおよび／またはＩＧＦ−Ｉレベル、例えば血清／血漿ＩＧＦ−Ｉレベルの低下を必要とする対象を識別することをさらに含む。

１つの実施形態において、疾患は、先端巨大症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、または前立腺、骨髄腫、肺、乳、もしくは結腸癌等のＩＧＦ−Ｉ陽性ならびに／またはＩＧＦ−Ｉおよび／もしくはＧＨ応答性癌である。

１つの実施形態において、ＧＨ変異体は、アミノ酸Ｇｌｙ１２０が欠失しているか、またはあるアミノ酸、例えば、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、またはＬｅｕで置換されているヒトＧＨ変異体である。１つの実施形態において、Ｇｌｙ１２０はＬｙｓで置換される。

さらなる実施形態において、ヒトＧＨ変異体は、以下の組のアミノ酸置換を含む：Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔ。

１つの実施形態において、核酸は、ヒトＧＨＲをコードする。核酸は、配列番号４または配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有し得る。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２〜５０個の核酸塩基の長さである。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１５〜３０個の核酸塩基の長さである。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、例えば短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＧＨＲをコードする核酸と少なくとも７０％の相補性を有する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＧＨＲをコードする核酸と少なくとも８０％の相補性を有する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＧＨＲをコードする核酸と少なくとも９０％の相補性を有する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＧＨＲをコードする核酸と少なくとも９５％の相補性、例えば、９６％、９７％、９８％、または９９％の相補性を有する。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９、８０、または８１の少なくとも８個の連続した核酸塩基部分を含む。

別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９、８０、または８１の核酸塩基配列から成る。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号６の核酸塩基配列から成る。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＧＨＲをコードする領域と特異的にハイブリッド形成し、その領域は、翻訳開始コドン、終止コドン、コード領域、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、イントロン：エクソン接合部、またはエクソン：イントロン接合部を含む。１つの実施形態において、その領域は、配列番号８４〜１５４から選択される配列の少なくとも８個の連続した核酸塩基部分を含む。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号４のヌクレオチド２６０〜３３９、３３２〜３５１、および３４４〜４２３から成る群から選択される配列番号４の領域に相補性である少なくとも８個の連続した核酸塩基部分を含む。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＧＨＲおよび／または成長ホルモン結合タンパク質（ＧＨＢＰ）の発現を少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５％阻害する。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基を含む。オリゴヌクレオチドは、例えば、少なくとも１つの２′−Ｏ−メトキシエチル糖部分および／または少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合および／または少なくとも１つの５−メチルシトシンを含み得る。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２０個の結合されたヌクレオシドから成り、オリゴヌクレオチドは配列番号６の核酸塩基から成り、オリゴヌクレオチドは、１０デオキシヌクレオチドの領域の５’末端および３’末端の両方で５つの２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドと隣接した１０デオキシヌクレオチドの領域から成り、オリゴヌクレオチド中の各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、オリゴヌクレオチド中の各シトシンは５−メチルシトシンである。

本開示はまた、対象におけるＩＧＦ−Ｉのレベルを低下させる方法も提供し、本方法は、ＧＨＲの発現を阻害するように、ＧＨＲをコードする核酸を標的化する８〜８０個の核酸塩基の長さのオリゴヌクレオチドと組み合わせてＧＨ拮抗活性を有するＧＨ変異体を投与することを含み、それにより対象におけるＩＧＦ−Ｉのレベルを低下させる。１つの実施形態において、血清／血漿ＩＧＦ−Ｉのレベルが低下される。

１つの実施形態において、本方法は、その対象のＧＨＲおよび／またはＩＧＦ−Ｉレベル、例えば血清／血漿ＩＧＦ−Ｉレベルの低下を必要とする対象を識別することをさらに含む。

ＧＨ変異体、ＧＨＲ、およびオリゴヌクレオチドは、上記特徴のうちのいずれか１つをさらに特徴とし得る。

本開示はまた、ＩＧＦ−Ｉのレベルの上昇によって引き起こされる、および／またはそれに関連付けられる疾患の治療または予防のための薬物の製造における、ＧＨ変異体およびＧＨＲをコードする核酸を標的化する８〜８０個の核酸塩基の長さのオリゴヌクレオチドの使用を提供する。１つの実施形態において、血清／血漿ＩＧＦ−Ｉのレベルが低下される。

１つの実施形態において、疾患は、先端巨大症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、または前立腺、骨髄腫、肺、乳、もしくは結腸癌等のＩＧＦ−Ｉ陽性癌である。

ＧＨ変異体、ＧＨＲ、およびオリゴヌクレオチドは、上記特徴のうちのいずれか１つをさらに特徴とし得る。

本開示はまた、対象におけるＩＧＦ−Ｉのレベルを低下させるための薬物の製造における、ＧＨ変異体およびＧＨＲをコードする核酸を標的化する８〜８０個の核酸塩基の長さのオリゴヌクレオチドの使用も提供する。

ＧＨ変異体、ＧＨＲ、およびオリゴヌクレオチドは、上記特徴のうちのいずれか１つをさらに特徴とし得る。

本開示はまた、ＩＧＦ−Ｉのレベルの上昇によって引き起こされる、および／またはそれに関連付けられる疾患の治療または予防のための、ＧＨ変異体およびＧＨＲをコードする核酸を標的化する８〜８０個の核酸塩基の長さのオリゴヌクレオチドを含む組成物も提供する。

ＧＨ変異体、ＧＨＲ、およびオリゴヌクレオチドは、上記特徴のうちのいずれか１つをさらに特徴とし得る。

本開示はまた、対象におけるＩＧＦ−Ｉのレベルを低下させるためのＧＨ変異体およびＧＨＲをコードする核酸を標的化する８〜８０個の核酸塩基の長さのオリゴヌクレオチドを含む組成物も提供する。

ＧＨ変異体、ＧＨＲ、およびオリゴヌクレオチドは、上記特徴のうちのいずれか１つをさらに特徴とし得る。

別途具体的定めのない限り、本明細書におけるいずれの実施形態も、任意の他の実施形態に対して準用するように受け取られるものとする。

本発明は、これ以降、次の非限定的な実施例を用いて、および添付の図を参照して記載される。

配列表の要点
配列番号１ 野生型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ヌクレオチド配列
配列番号２ 野生型ｈＧＨポリペプチド配列
配列番号３ ソマバートポリペプチド配列
配列番号４ ヒト成長ホルモン受容体（ｈＧＨＲ）ｃＤＮＡ配列
配列番号５ ｈＧＨＲ遺伝子配列
配列番号６〜８３ ｈＧＨＲを標的化するオリゴヌクレオチド
配列番号８４〜１５４ ｈＧＨＲの標的配列

一般的な技法および選択された定義
別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、（例えば、アンチセンス技術、組み換え技術、細胞培養、分子遺伝子学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生物化学の）当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有しなければならない。

別途指示されない限り、本開示において利用される組み換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的技法は、当業者によく知られた標準手順である。そのような技法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６），Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのすべての改訂を含む），Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８），ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（現在までのすべての改訂を含む）等のソースにおいて、文献全体にわたって記載および説明される。

「および／または」という用語、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するように理解されるものとし、両方の意味またはいずれかの意味に対する明示的な支持を提供するように受け取られるものとする。

本明細書で使用されるとき、「約」または「およそ」は、概して、所与の値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、およびさらにより好ましくは５％以内を意味するものとする。

本明細書全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変型は、指定の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群の包含を暗示するが、任意の他の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群の除外を意味しないことが理解されるであろう。

本明細書全体を通じて、別途具体的定めのない限り、または文脈上そうでないとする要求がない限り、単一のステップ、主題の組成物、ステップの群または組成物の群への言及は、１つおよび複数の（すなわち１つ以上の）それらのステップ、組成物、ステップの群または組成物の群を包含するように受け取られるものとする。

ＩＧＦ−Ｉ陽性疾患の治療および予防
本発明は、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のレベルの上昇によって引き起こされる、および／またはそれに関連付けられる疾患、障害、または状態の予防および／または治療に有用な方法を提供する。本明細書に使用される場合、「治療」という用語は、疾患、障害、または状態の変化または改善をもたらすための薬学的組成物を投与することを指す。本明細書に使用される場合、「予防」という用語は、疾患、障害、または状態の少なくとも１つの症状の発達を止めるか、または妨げるための薬学的組成物を投与することを指す。治療に対して標的とされる対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。本明細書に使用される場合、「インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のレベルの上昇」とは、年齢および性別で調整される正常範囲を超えるレベル、またはその範囲内、例えば、正常範囲の上限を含む。

方法は、対象に対するＧＨ拮抗活性を有する成長ホルモン（ＧＨ）変異体および成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）を標的化するオリゴヌクレオチドの投与を含む。本「対象」は、任意の哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。理論に制限されるものではないが、オリゴヌクレオチドはその対象におけるＧＨＲ発現を阻害するように作用する一方、ＧＨ変異体はＧＨＲへのＧＨ結合を防ぐように作用し、それにより対象における（ＧＨシグナル伝達に応答して生成される）ＩＧＦ−Ｉのレベルを低下させる。インスリン様成長因子Ｉは、細胞の広範囲で強力な分裂促進効果を有する増殖に重要であり、アポトーシスを制御する細胞生存において重要な広範に分布するポリペプチドである。

理論に制限されるものではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡレベルでＧＨＲ発現を阻害する一方、ＧＨ変異体は、フィードバック阻害によってＧＨＲ ＲＮＡを増加し得る。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドはまた、成長ホルモン結合タンパク質（ＧＨＢＰ）発現を減少させるように作用する。ＧＨＢＰは、（例えば、マウスおよびラットにおける）ｍＲＮＡ転写物の選択的ｍＲＮＡスプライシング、または（例えば、ヒト、ウシ、およびブタにおける）ＧＨＲのタンパク分解性切断によって派生する、ＧＨ受容体の溶解性の細胞外部分である。

１つの実施形態において、治療は、先端巨大症の１つ以上の症状の発生を低減させるか、または防ぐ、例えば、先端巨大症における上昇した血清ＩＧＦ−Ｉレベルを正常レベルに低下させる、または軟部組織膨化、内臓の拡大、四肢同様の顎の過成長、手足の拡大、声が低音化、皮膚の肥厚化、不快な体臭、関節軟骨の問題、高リン酸血症、末梢神経障害、高血圧、糖尿病、心疾患、および癌を低減させる。

別の実施形態において、治療は、網膜症の１つ以上の症状、例えば、新生血管形成の減少および／または目の浮腫、霧視、複視、もしくは乱視、または読字困難、視覚内の浮遊物もしくは斑点、視力損失または視野にわたる影もしくは覆い、目の痛み、圧力、もしくは持続性充血の発生を低下させるか、または防ぐ。

別の実施形態において、治療は、糖尿病性腎症の１つ以上の症状、例えば、糸球体濾過、微量アルブミン尿、タンパク尿、腎傷害、下肢における膨化、悪心および嘔吐、不快感、疲労、頭痛、掻痒、頻繁な吃逆、意図しない重量減少、顔の膨化、体液蓄積による意図しない重量増加、ならびに高血圧の発生を低減させるか、または防ぐ。

別の実施形態において、治療は、腫瘍または癌（前立腺、骨髄腫、肺、乳、もしくは結腸癌等）の大きさおよび／もしくは成長を低下させるか、ならびに／または腫瘍もしくは癌（前立腺癌等）の進行をアンドロゲン応答性／依存性からアンドロゲン非応答性／非依存性に遅らせる。腫瘍もしくは癌の大きさおよび／または成長は、例えば、腫瘍／癌細胞の増殖速度を低下させること、腫瘍／癌細胞のアポトーシス速度を上昇させること、腫瘍／癌細胞シグナル伝達を修飾すること、化学感作（ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）、ならびに／または腫瘍／癌細胞の接着、固定、転移、および／もしくは細胞、例えば前立腺細胞の形質転換を阻害することによって、低下され得る。治療は、年齢および性別で調整されるにように、例えば、正常範囲の上限のＩＧＦ−Ｉレベルをより低いレベルに、および／または第１四分位数から第２四分位数、第３もしくは第４四分位数に、および／または第２四分位数から第３もしくは第４四分位数に低下させ得る。治療は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＧＨ変異体が組織中で作用し得るように、ＩＧＦ−Ｉの内分泌、自己分泌、またはパラ分泌レベルを低下させ得る。

成長ホルモン拮抗活性を有する成長ホルモン変異体
本開示の方法は、ＧＨ拮抗活性を有する成長ホルモン（ＧＨ）変異体の使用に依存する。１つの実施形態において、ＧＨ変異体は、ヒトおよびウシ成長ホルモン等の哺乳類成長ホルモンが挙げられるが、これらに限定されない脊椎動物ＧＨに対する配列および／または二次構造における類似性を有するペプチドまたはタンパク質である。

ＧＨは、脳下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞によって合成および分泌される。ＧＨ遺伝子は、２１７−アミノ酸前駆体タンパク質をコードする５エクソンおよび４イントロンから成る。アミノ末端シグナルペプチドは、タンパク質分解によって取り除かれ、２２ｋＤａの分子質量の発達単鎖１９１−アミノ酸ポリペプチドを得る。ヒト（ｈ）ＧＨおよび他の哺乳類種からのＧＨの３次元構造は、Ｘ線結晶解析によって確立された（Ｕｌｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｕｌｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３；ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。そのタンパク質は、逆平行のバンドルに一緒にまとめられる非らせん鎖の一続きによって一緒に結合される２０〜３０個のアミノ酸残基を有する４つのαへリックスから成る（Ｕｌｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。その４つのαヘリックスバンドルＧＨは、２つの同一でない結合表面を持つが、規則正しい配列中で類似の受容体結合部位に結合し、最初の結合部位が高親和性を持つ（部位１）ことが示されている（国際公開第９２／２１０２９号）。部位２結合は、２つのサイトカイン相同性モジュールの下において「二量体形成領域」に関与するさらなる受容体間の相互作用によって安定化される（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１；ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

１つの実施形態において、ＧＨ変異体は、脊椎動物ＧＨの第３のαヘリックスと少なくとも約５０％のアミノ酸配列相同性を有するαヘリックスを含む。野生型ＧＨの他のαヘリックスは、これがＧＨアンタゴニスト活性の消失を伴わずにできる場合、取り除かれ得る。「アンタゴニスト」という用語の使用は、機能的意味におけるものであり、本開示を作用の特定の機序を有する化合物に制限するとは意図されない。好適なＧＨ変異体は、米国第５，３５０，８３６号および米国第５，８４９，５３５号において記述される。

変異体ＧＨ配列表記法は、ＧＨ変異体中の実際のアミノ酸置換を明らかにする。変異体において、置換は、（一文字コードにおける）野生型残基を示す一文字、野生型配列におけるアミノ酸位置を示す数、および置換されたアミノ酸残基を示す２つ目の文字によって示される。例えば、Ｇ１２０Ｋは、１２０位のグリシンがリジンで置換された変異を示す。複数の変異種が、コンマで分けられる一連の単一変異種で示される。

１つの実施形態において、成長ホルモン変異体は、ｈＧＨ変異体である。野生型ｈＧＨのＤＮＡ（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）配列が報告されている（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。

１つの実施形態において、ｈＧＨ変異体は、アミノ酸Ｇｌｙ１２０における変異を含む。Ｇｌｙ１２０は、欠失しているか、またはあるアミノ酸で置換され得る。１つの実施形態において、そのアミノ酸は、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、およびＬｅｕから成る群から選択される。ある好ましい実施形態において、アミノ酸は、Ｌｙｓである。この変異は、部位２結合を破壊する。この変異を含むｈＧＨ変異体は、ｈＧＨアンタゴニストとして作用する。

さらなる実施形態において、ｈＧＨ変異体は、以下の組のアミノ酸置換を含む：Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔ。これらの置換は、部位１でのｈＧＨ受容体に対する結合親和性を上昇させる。この組のアミノ酸置換を含むｈＧＨ変異体は、部位２におけるｈＧＨＲへの結合を破壊するさらなる修飾がない場合は、ｈＧＨアゴニストとして作用する。

１つの実施形態において、ｈＧＨ変異体は、Ｇ１２０アミノ酸欠失または置換、およびアミノ酸置換Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔを含む。１つの実施形態において、ｈＧＨ変異体は、以下の組のアミノ酸置換を含む：Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｇ１２０Ｋ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔ。１つの実施形態において、ｈＧＨ変異体は、そこにいくつかのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーが共有結合的に結合される１９１アミノ酸残基を有するタンパク質である、ソマバート（登録商標）（注射用ペグビソマント）（配列番号３）である（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

変異導入
ＧＨをコードするＤＮＡ配列は、１つ以上の選択されたコドンで変異される。変異は、ＧＨをコードするＤＮＡにおける１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入として定義され、ＧＨの野生型配列と比較してＧＨのアミノ酸配列における変化をもたらす。好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸は、タンパク質の１つ以上の領域において任意の他のアミノ酸で置換される。

部位特異性変異導入（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、カセット変異導入（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、制限選択変異導入（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６）、または他の既知の技術が、アミノ酸配列における変化をコードする変異体ＤＮＡを生成するために、ＧＨ ＤＮＡ上で実践され得る。

オリゴヌクレオチド媒介変異導入は、ＧＨの置換、欠失、または挿入変異体の調製のための好ましい方法である。その技術は、Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７によって記述されるように当該技術分野でよく知られている。簡潔に言うと、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドは、単鎖形態のＧＨの野生型ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ鋳型とハイブリッド形成される。ハイブリッド形成後、ＤＮＡポリメラーゼを使用してこの鋳型の完全な第２相補鎖を合成し、このため、オリゴヌクレオチドプライマーが組み込まれ、ＧＨ ＤＮＡ中の選択された変化をコードする。

概して、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使用される。より小さいオリゴヌクレオチドが用いられ得るが、最適なオリゴヌクレオチドは、変異（複数可）をコードしているヌクレオチド（複数可）の両側に、鋳型に完全に相補的である１２〜１５ヌクレオチドを有する。これにより、オリゴヌクレオチドが単鎖ＤＮＡ鋳型分子に適切にハイブリッド形成することが確実になる。このオリゴヌクレオチドは、Ｃｒｅａ ｅｔ ａｌ．，１９７８で記述されるもの等の当該技術分野で既知の方法を用いて容易に合成される。

このＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（市販のＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが好適である）から導かれるベクター、またはＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、１９８７が記載しているような単鎖ファージ複製起点を含有するベクターによってのみ生成されることができる。このため、変異されるべきＤＮＡは、単鎖の鋳型を生成するために、これらベクターのうちの１つに挿入されなければならない。単鎖の鋳型の生成は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらの４．２１〜４．４１節に記載されている。

野生型ＤＮＡ配列を変化させるために、このオリゴヌクレオチドを好適なハイブリッド形成条件の下で単鎖の鋳型とハイブリッド形成させる。次いで、ＤＮＡ重合酵素、通常はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを加え、このオリゴヌクレオチドを合成のためのプライマーとして用いて鋳型の相補鎖を合成する。このようにして、ＤＮＡの一方の鎖が変異形をコードし、他方の鎖（最初の鋳型）が野生型ＧＨをコードしているヘテロ二重鎖分子が形成される。次いで、このヘテロ二重鎖分子を好適な宿主細胞、通常は大腸菌ＪＭ１０１等の原核生物に形質転換する。この細胞を増殖させた後、アガロースプレートに蒔き、３２−リン酸で放射標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングして、変異したＤＮＡを含有する細菌コロニーを同定する。

すぐ上に記載した方法を、ＤＮＡの両方の鎖が変異（複数可）を含むホモ二重鎖分子が作製されるように修飾することができる。この修飾は次のようである：単鎖のオリゴヌクレオチドを上記のように単鎖ＤＮＡの鋳型にアニールさせる。３つのデオキシリボヌクレオチド、すなわちデオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオ−デオキシリボシトシンと組み合わせる。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチドの複合体に加える。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを加えると、変異した塩基（複数可）を除いて鋳型と同一のＤＮＡの鎖が生成される。さらに、この新たなＤＮＡの鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ＡＳ）を含有しており、これがこの鎖を制限エンドヌクレアーゼ消化から保護するように働く。二本鎖のヘテロ二重鎖の鋳型鎖に適切な制限酵素で切れ目を入れた後、この鋳型鎖を、変異誘発されるべき部位（複数可）を含む領域を越えてＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは別の適切なヌクレアーゼで消化することができる。次いで、この反応を停止させて一部だけが単鎖である分子を残す。次いで、４種すべてのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰ、およびＤＮＡリガーゼの存在下にＤＮＡポリメラーゼを用いて、完全な二本鎖ＤＮＡホモ二重鎖が形成される。次いで、このホモ二重鎖分子を、上述のように大腸菌ＪＭ１０１等の好適な宿主細胞に形質転換することができる。

１つを越える置換すべきアミノ酸を有する変異種は、いくつかの方法の１つにおいて生成され得る。これらアミノ酸がポリペプチド鎖中に互いに近接して存在している場合、所望のアミノ酸置換のすべてをコードしている１つのオリゴヌクレオチドを用いて同時に変異させることができる。しかしながら、アミノ酸が互いにある程度の距離を置いて存在しているときには（約１０以上のアミノ酸によって隔てられている）、所望の変化のすべてをコードしている単一のオリゴヌクレオチドを生成するのはより困難である。これに代えて、２種類の代替方法のいずれかを用いることができる。

第１の方法では、独立したオリゴヌクレオチドを置換されるべきアミノ酸のそれぞれに対して生成する。次いで、そのオリゴヌクレオチドを単鎖の鋳型ＤＮＡに同時にアニールさせると、この鋳型から合成されるＤＮＡの第２の鎖は所望のアミノ酸置換のすべてをコードする。この代替方法は、所望の変異種を生成するための変異導入の２つ以上のラウンドを含む。第１のラウンドは単一変異種について説明したものと同じであり、野生型ＤＮＡを鋳型に使用し、第１の所望のアミノ酸置換（複数可）をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールさせ、次いでヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子を生成する。変異導入の第２のラウンドは、変異導入の第１のラウンドにおいて生成された変異ＤＮＡを鋳型として用いる。このため、この鋳型は既に１つ以上の変異を含んでいる。次いで、さらなる所望のアミノ酸置換（複数可）をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールさせると、得られるＤＮＡの鎖は、変異導入の第１および第２のラウンドの両方に由来する変異をコードしている。この得られたＤＮＡを、変異導入の第３のラウンドにおける鋳型等として用いることができる。

カセット変異導入もまた、ＧＨをコードするＤＮＡの置換、欠失、および挿入変異体を調製するための好ましい方法である。この方法は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５によって記述されるものに基づいている。出発材料は、変異させようとするＧＨ ＤＮＡを含むプラスミド（または、他のベクター）である。変異させようとするＧＨ ＤＮＡ中のヌクレオチド（複数可）は確認されており、最適には、確認された変異部位（複数可）の両側に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しているが、しかしながら、これは必須要件ではない。そのような制限部位が存在していない場合、上記のオリゴヌクレオチド媒介の変異導入法を用いてこれら部位を生成し、ＧＨ ＤＮＡ中の好適な位置に導入することができる。プラスミド中に制限部位を導入した後、プラスミドをこれら部位のところで切断して直線化する。この制限部位の間のＤＮＡの配列をコードしているが、所望の変異（複数可）を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドを定法により合成する。この２本の鎖は別々に合成され、次いで標準技術を用いて一緒にハイブリッド形成される。この二本鎖のオリゴヌクレオチドは、カセットと称される。このカセットは直線化したプラスミドの両末端に適合する３′および５′末端を有するように設計され、それがプラスミドに直接連結できるようにする。ここで、このプラスミドはＧＨの変異ＤＮＡ配列を含むことになる。

当然、所望のＧＨ変異体のインビトロでの化学合成等の他の方法を用いて、ＧＨ変異体を生成することができる（Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）Ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐｐ．３−２５４）。

ＧＨ変異体の生成
ＧＨ変異体は、標準組換え技術によって好都合に生成することができる。より具体的には、ＧＨ変異体は、ベクター−宿主細胞系を用いて発現することができる。

ＧＨ ＤＮＡを適切なプラスミドまたはベクターに挿入することができ、その後、それを使用して宿主細胞を形質転換する。原核生物は、ＧＨ変異体を生成するＤＮＡ配列の発現に適している。例えば、大腸菌Ｋ１２系２９４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１４４６）、同様に、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１５３７）、大腸菌ｃ６００およびｃ６００ｈｆｌ、ならびに大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ⁻、γ⁻、原栄養、ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７３２５）、バチルス・スブチリス、およびサルモネラ・チフィリウムまたはセラチア・マルセセンス等の他の腸内細菌、ならびに種々のシュードモナス種等の桿菌が使用され得る。好ましい原核生物は、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）である。原核生物の細胞内で発現されるとき、ＧＨは典型的に、Ｎ末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含有し、グリコシル化されていない。培地または周辺質内に細胞外に発現されるとき、ＧＨはＮ末端メチオニンを含まない。これらの例は勿論、制限ではなく例示として意図される。

原核生物に加えて、酵母培養物、または多細胞生物に由来の細胞等の真核生物が使用されてもよい。原理上は、任意のそのような細胞培養が有効である。しかしながら、脊椎動物細胞における関心対象が最も優れており、培養における脊椎動物細胞の繁殖は、繰り返し可能な手順となっている。そのような有用な宿主細胞株の例には、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、およびＭＤＣＫ細胞株がある。

一般に、宿主細胞に適合する種に由来する複製および制御配列を含むプラスミドベクターが使用される。そのベクターは、通常、複製部位と、形質転換された細胞において表現型選択を提供できるタンパク質をコードする配列と、を保有する。例えば、大腸菌は、大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換され得る（Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９７０）。プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗のための遺伝子を含有し、ゆえに選択の容易な方法を提供する。１つの好ましいベクターは、ｐＢＯ４７５である。このベクターはファージおよび大腸菌の複製起点を含み、それはベクターがそのような宿主間で往復することを可能し、それにより変異導入および発現を促進する。「発現ベクター」とは、好適な宿主においてそのＤＮＡの発現を引き起こすことができる好適な制御配列に動作可能に結合されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を指す。そのような制御配列には、転写を引き起こすプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止を制御する配列が挙げられる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単純に潜在的なゲノム挿入断片であり得る。一旦好適な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムから独立して複製し、機能することができるか、またはいくつかの実例においては、そのゲノム自体に組み込まれる。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、現在のところ、プラスミドが最も一般的にベクターの形態で使用されるため、時々交換可能に使用される。しかしながら、同等の機能果たすもの、および当該技術分野で既知であるか、または既知となる発現ベクターの他の形態の使用が、本開示の範囲内に含まれる。

２つのＤＮＡまたはポリペプチド領域間の関係を説明する際、「動作可能に結合される」とは、それらが互いに機能的に関連することを単純に意味する。例えば、プレ配列は、シグナル配列として機能する場合ペプチドに動作可能に結合され、タンパク質の成熟形態の分泌に関与し、ほぼ確実にシグナル配列の切断に関与する。プロモーターは、配列の転写を制御する場合、コード配列に動作可能に結合され、リボソーム結合部位は、翻訳を許容するように位置する場合、コード配列に動作可能に結合される。

ＧＨ変異体発現ベクターを含む宿主細胞は、細胞成長およびＧＨ変異体の発現に適した条件下で培養される。具体的には、培養培地は、用いられる宿主細胞に適切な栄養素および成長因子を含む。選択された宿主細胞の成長に必要な栄養素および成長因子は、多くの場合、当業者によってよく知られているか、または経験的に容易に決定され得る。例えば、哺乳類宿主細胞の好適な培養状態は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８４）ａｎｄ Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，１９８０に記載される。

加えて、培養状態は、転写、翻訳、および細胞内コンパートメント間のタンパク質輸送を可能にしなければならない。これらのプロセスに影響する要因はよく知られており、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡコピー数；ＲＮＡを安定化する因子；培養培地中に存在する栄養素、栄養補助剤、および転写誘導因子またはリプレッサー；培養中の温度、ｐＨ、および浸透圧；ならびに細胞密度が挙げられる。特定のベクター−宿主細胞系において発現を促進するためのこれらの要因の調節は、当業者の技術水準内である。

ＧＨ変異体の生成において用いられる細胞培養手順は、タンパク質の大または小規模生成のためのいくつかのよく知られた手順のうちのいずれかであり得る。これらには、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養システム、および撹拌層バイオリアクターシステムの使用が挙げられるが、これらに限定されない。ＧＨ変異体は、例えば、バッチ、フェッドバッチ、または連続式工程において生成され得る。

上述のように生成された組換えタンパク質の回収方法はよく知られており、用いられる発現系に応じて異なる。例えば、典型的にそうであるように、発現ベクターがシグナル配列を含む場合、ＧＨ変異体は、培養培地または周辺質から回収される。好都合に、変異体は、完全に処理されたタンパク質（すなわち、分泌シグナル配列を欠乏している）として、細胞周辺腔に分泌される。しかしながら、ＧＨ変異体はまた、細胞内で発現され、細胞可溶化物から回収され得る。

ＧＨ変異体は、宿主細胞または培養培地の成分から変異体を分離することができる任意の方法によって培養培地または細胞可溶化物から精製され得る。典型的に、ＧＨ変異体は、所望に応じてＧＨ変異体のペグ化に、または診断上のまたは治療上の使用に干渉し得る宿主細胞および／または培養培地成分から分離される。

最初のステップとして、培養培地または細胞可溶化物を通常遠心分離するか、または濾過し、細胞残屑を除去する。次いで、上清は典型的に、さらなる精製用に調製物を整えるために、所望の量に濃縮されるか、もしくは希釈されるか、あるいは好適な緩衝剤中に透析濾過される（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）。ＧＨ変異体のさらなる精製は典型的に、未処置の形態からＧＨ変異体の脱アミドされた、および切り抜かれた（ｃｌｉｐｐｅｄ）形態を分離することを含む。

本実施形態の１つの変形において、ＧＨ変異体は、（１）スピニングカップシーケネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を用いて、Ｎ末端もしくはアミノ酸配列間の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、または（２）クーマシーブルー染色を用いて、非還元もしくは還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一に、精製される。

以下の例となる手順のいずれかがＧＨ変異体の精製に用いられ得る：親和クロマトグラフィー；陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥを使用する）；シリカ上でのクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲル濾過（例えば、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−７５を使用する）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外濾過／透析濾過；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；クロマトフォーカシング；および置換クロマトグラフィー。

抱合体
本開示の方法に有用なＧＨ変異体は、１つ以上の化学基に共有結合的に付加され得る（以下「抱合される」）。そのような抱合は、非修飾ＧＨ変異体を上回る実際の分子量を有するＧＨ変異抱合体を生成する。本明細書に使用される場合、「実際の分子量」という用語は、質量分析（例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）によって測定される分子量を指す。ｈＧＨ変異抱合体の実際の分子量は通常、少なくとも約３０ｋＤａ；好ましくは、約３５ｋＤａ〜約５５ｋＤａの範囲内；およびより好ましくは、約４０ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲内である。概して、ｈＧＨ変異抱合体の実際の分子量は、１００ｋＤａを超えない。

ＧＨ変異抱合体での使用に適した化学基は、好ましくは著しく毒性または免疫原性ではない、すなわち、ＧＨ変異抱合体で観察される任意の毒性または免疫原性は、対応する非修飾ＧＨ変異体で観察される任意の毒性または免疫原性を著しく上回らない（すなわち、５０％未満）。典型的には、非修飾ＧＨ変異体に関連付けられる毒性および／または免疫原性を低下させる化学基が選択される。加えて、化学基は、非修飾ＧＨ変異体の貯蔵および使用に適した条件下で、保管および使用され得るＧＨ変異抱合体を生成するように好都合に選択される。例となる化学基には、例えば、糖タンパク質上に天然に存在する炭水化物等の炭水化物、およびポリオール等の非タンパク質系ポリマーが挙げられる。

ポリオールは、例えば、国際公開第９３／００１０９号に記載されるようにリジン残基を含む１つ以上のアミノ酸残基においてＧＨ変異体分子に抱合され得る。用いられるポリオールは、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであってもよく、直鎖または分岐鎖を有し得る。好適なポリオールには、１つ以上のヒドロキシル位で、１〜４個の炭素を有するアルキル基等の化学基で置換されるものが挙げられる。典型的に、ポリオールは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）等のポリ（アルキレングリコール）であり、このため、説明を容易にするために、残りの考察は、用いられるポリオールがＰＥＧであり、ポリオールのＧＨ変異体への抱合の過程が「ペグ化」と呼ばれる、例となる実施形態に関する。しかしながら、当業者は、例えば、ポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマー等の他のポリオールが、ＰＥＧに関して本明細書に記載の抱合の技術を使用して、用いられ得ることを認識する。

ＰＥＧの平均分子量は、約５００〜約３０，０００Ｄａ；好ましくは、約１，０００〜約２５，０００Ｄａ；およびより好ましくは、約４，０００〜約２０，０００Ｄａの範囲であり得る。１つの実施形態において、ペグ化は、約５，０００Ｄａの平均分子量を有するＰＥＧ（以下「ＰＥＧ（５０００）」）を用いて行われる。反応条件は、ＰＥＧ（５０００）の約４〜約６個の分子に抱合されるＧＨ変異体分子の生成を最大化するように調整される。別の実施形態において、ペグ化は、約２０，０００Ｄａの平均分子量を有するＰＥＧ（以下「ＰＥＧ（２０，０００）」）の分子を１個の分子に抱合されるＧＨ分子の生成を最大化するように調整された条件下で、ＰＥＧ（２０，０００）を用いて行われる。本実施形態のある変形において、それぞれ約１０，０００Ｄａの２本の鎖を有する分岐鎖ＰＥＧが用いられる。

市販の、本方法での使用に適したＰＥＧ調製物は、平均分子量に従って売られる不均質調製物である。例えば、ＰＥＧ（５０００）調製物は典型的に、分子量が若干（通常±５００Ｄａ）異なる分子を含む。

生理的に活性な非免疫原性組成物を生成するための、いくつかのホルモンおよび酵素のＰＥＧおよびポリプロピレングリコールへの抱合を開示する、タンパク質をペグ化する様々な方法が記載されてきた（例えば、米国第４，１７９，３３７号を参照されたい）。概して、少なくとも１つの末端ヒドロシキ基を有するＰＥＧは、末端反応基を有する活性化ＰＥＧを形成するように結合剤と反応する。この反応基は、次いで、共有結合を形成するようにタンパク質のα−およびε−アミンと反応し得る。好都合に、ＰＥＧ分子の他の終端は、メトキシ基等の非反応性化学基で「遮断」され、タンパク質分子のＰＥＧ架橋複合体の形成を抑えることができる。

ＧＨ変異体のペグ化のため、活性化ＰＥＧは、部位１結合活性を破壊しない条件下で変異体と反応することができるものである。さらに、抱合体に毒性の連結基を導入する活性化ＰＥＧは通常避けられる。

好適な活性化ＰＥＧは、いくつかの従来の反応によって生成され得る。例えば、ＰＥＧ（Ｍ−ＮＨＳ−ＰＥＧ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、Ｂｕｃｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｅｒｒ，１９８１の方法に従って、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロシキスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応によってＰＥＧ−モノメチルエーテルから調製され得る。

加えて、ＰＥＧ末端ヒドロシキ基は、例えば、臭化チオニルとの反応によってアミノ基に転換され、ＰＥＧ−Ｂｒを形成することができ、その後、ＰＥＧ−ＮＨ_２を形成する過剰なアンモニアとのアミノリシスが続く。ＰＥＧ−ＮＨ_２は、次いで、ウッドウォードの試薬Ｋ等の標準カップリング試薬を使用して対象となるタンパク質に抱合される。さらに、ＰＥＧ末端−ＣＨ_２ＯＨ基は、例えば、ＭｎＯ_２での酸化によってアルデヒド基に転換され得る。そのアルデヒド基は、シアノ水素化ホウ素等の試薬を用いた還元性のアルキル化によってタンパク質に抱合される。

代替として、本発明の方法における使用に適した活性化ＰＥＧは購入することができる。

ＧＨ変異体のペグ化度を調節して、対応する非ペグ化ＧＨ変異体と比べて望ましく上昇したインビボ半減期を提供することができる。ペグ化ＧＨ変異体の半減期は、典型的には、ペグ化度が上昇するのに応じて徐々に増加すると考えられている。より高いペグ化度では、ペグ化ＧＨ変異体の半減期の上昇は、部位１親和性の減少を示す部位１結合の解離定数（Ｋｄ）の上昇によって、部分的に相殺されると考えられている。この親和性の減少は、対応する効力の減少を伴い、５０％の最大効果（ＥＣ５０）を必要とする抱合体の濃度の上昇に反映されると考えられている。部位１結合がＧＨ変異体のＧＨアンタゴニスト活性に必須であるため、上昇したペグ化はＧＨ変異体の効力を減少させる。しかしながら、ペグ化ＧＨ変異体のインビボ効果が、対応する非ペグ化ＧＨ変異体で観察されるものに相当するか、またはより優れていると考えられるように、半減期の上昇は概して効力の減少を相殺する。したがって、当業者は、非ペグ化タンパク質と比較して望ましく上昇した半減期を有するが、インビボで有効である十分な効力を保持する抱合体を生成するための、ＧＨ変異体に対する好適なペグ化度を容易に決定することができる。

通常は、半減期は、少なくとも約５倍、好ましくは、少なくとも約１０倍、より好ましくは、少なくとも約５０倍、さらにより好ましくは、少なくとも約１００倍上昇される。加えて、ペグ化の度合いおよび部位は、Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８に記載されるもの等の平衡結合アッセイで測定される、典型的に約４００ｎＭ以下のＫｄで、好ましくは１５０ｎＭ以下のＫｄで、さらにより好ましくは１００ｎＭ以下のＫｄで、ＰＥＧ−ＧＨ変異抱合体が部位１においてＧＨＲに結合することが可能である。

タンパク質のペグ化の度合いおよび部位は、（１）ペグ化部位の数および反応性（すなわち、第一級アミン）、ならびに（２）ペグ化反応条件によって決定される。例えば、野生型ｈＧＨは、理論上は活性化ＰＥＧとの反応に使用可能な１０個の第一級アミンを含む：Ｎ末端フェニルアラニンのα−アミノ基および９のリジンのε−アミノ基。しかしながら、ｈＧＨおよびｈＧＨ変異体における第一級アミンのいくつかは比較的非反応性であるため、標準的なペグ化反応は典型的に完全に満たないペグ化をもたらす（例えば、野生型ｈＧＨの１分子当たり７から８ＰＥＧ）。

タンパク質のペグ化の部位もまた、様々な第一級アミンの反応性によっていくらか限定される。例えば、所与のｈＧＨ変異体の部位１ホルモン−受容体結合界面における潜在的なリジンは、ＰＥＧに対して比較的非反応性であり得る。このため、変異体分子当たり約４から６のＰＥＧを有するそのような適度にペグ化されたｈＧＨ変異体は、この結合界面における潜在的なペグ化部位の存在にもかかわらず、部位１でＧＨ受容体に結合する能力を保持し得る。１つの実施形態において、ｈＧＨ変異体は、１位のフェニルアラニンと、３８、１２０、１４０、および１５８位でＰＥＧに抱合されるリジンとを含む。

標準的な変異導入技術を使用して、タンパク質中のリジンの数を変化させることができる。このため、アミノ酸置換がリジンを導入するか、または置き換える限り、本開示のＧＨ変異体は、野生型ＧＨを上回るか、または下回る数の潜在的なペグ化部位を含み得る。１つの実施形態において、ｈＧＨ変異体は、９の潜在的なペグ化部位（Ｐｈｅ１、Ｌｙｓ３８、Ｌｙｓ４１、Ｌｙｓ７０、Ｌｙｓ１１５、Ｌｙｓ１２０、Ｌｙｓ１４０、Ｌｙｓ１４５、Ｌｙｓ１５８）を含む。

さらに、リジンを導入するか、または置き換えるアミノ酸置換は、潜在的なペグ化部位の位置を変化させる。例えば、Ｇ１２０のリジンでの置換は、部位２にさらなる潜在的なペグ化部位を提供し、これは、ペグ化されるとこの部位における任意の残りの結合を損なうことが予期される。

活性化ＰＥＧおよびタンパク質の相対濃度、ならびにｐＨ等の反応条件を調整することにより、ペグ化の度合いおよび部位を操作することもできる。所望のペグ化度に好適な条件は、経験的に決定され得る。

治療的製剤で使用するためペグ化ＧＨ変異体を含む組成物は不均質または均質であり得、すなわち、複数、または単一のペグ化ＧＨ変異体を含む。典型的に、本組成物は、ペグ化ＧＨ変異体の１または２つの形態の少なくとも７０％、好ましくは１または２つの形態の少なくとも８０％、さらにより好ましくは、１または２つの形態の少なくとも９０％を含む。

成長ホルモン受容体へのアンチセンス化合物
本開示の方法は、成長ホルモン（ＧＨ）シグナル伝達またはＧＨ／インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）軸、特にＧＨＲおよび／またはＩＧＦ−Ｉの発現を調節する、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）へのアンチセンス化合物の使用に依存する。好ましくは、アンチセンス化合物は、オリゴヌクレオチドである。しかしながら、オリゴヌクレオチド模倣体が挙げられるが、これらに限定されない他のオリゴマーアンチセンス化合物が企図される。

その標的核酸でのアンチセンス化合物のハイブリッド形成は概して、「アンチセンス」と称される。その標的核酸でのアンチセンス化合物のハイブリッド形成は、標的核酸の機能を阻害する。そのような「アンチセンス阻害」は、典型的に、標的核酸が切断されるか、分解されるか、またはさもなければ操作不可能にされるような、標的核酸へのアンチセンス化合物の水素結合に基づくハイブリッド形成に基づく。干渉される標的ＤＮＡの機能には、複製および転写が挙げられる。複製および転写は、例えば、内因性細胞鋳型、ベクター、プラスミド構築物、または他のものに由来し得る。干渉されるＲＮＡの機能は、タンパク質の翻訳の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡ合成の部位から遠い細胞内の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、およびそのＲＮＡに関与し得るか、またはそのＲＮＡよって促進され得るＲＮＡに関与する触媒活性または複合体形成等の機能を含み得る。

本明細書に使用される場合、「ハイブリッド形成」とは、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸の相補的塩基の対合を意味する。塩基対合は典型的に、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間のワトソンクリック、フーグスティーン、または逆フーグスティーン水素結合であり得る、水素結合に関与する。グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）は、３水素結合の形成によって対になる相補的核酸塩基の例である。アデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）は、２水素結合の形成によって対になる相補的核酸塩基の例である。ハイブリッド形成は、様々な環境下で生じ得る。

「ヌクレオシド」は、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常は複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の最も一般的な２つの分類はプリンとピリミジンである。「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合的に結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、リン酸基は糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。

「特異的にハイブリッド形成が可能」および「相補的な」とは、安定した、特定の結合がアンチセンス化合物と標的核酸との間で生じるような、十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物は、特異的にハイブリッド形成が可能であるその標的核酸配列に１００％相補的である必要がないことが理解される。標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合が標的核酸の発現に干渉する場合、アンチセンス化合物は特異的にハイブリッド形成が可能であり、特異的結合が所望される条件下、例えば、治療的処置の場合の生理的条件下で、非標的配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある。

本明細書で使用される場合、「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」または「ストリンジェントな条件」という用語は、アンチセンス化合物が、その標的配列に対してハイブリッド形成するが、他の配列には最小数である条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、状況によって異なる。アンチセンス化合物が標的配列に対してハイブリッド形成するストリンジェントな条件は、アンチセンス化合物の性質および組成物、ならびにそれが研究されるアッセイによって決定される。

本明細書に使用される場合、「相補的である」とは、アンチセンス化合物の核酸塩基と標的核酸との間の正確な対合のための能力を指す。例えば、アンチセンス化合物の所定位置における核酸塩基が、標的核酸の所定位置における核酸塩基と水素結合できる場合、次にアンチセンス化合物と標的核酸との間の水素結合の位置は、相補的位置であると考えられる。アンチセンス化合物は、介在するか、または隣接するセグメントがハイブリッド形成事象に関与しないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリッド形成する場合がある（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。１つの実施形態において、アンチセンス化合物は、標的核酸内の標的領域に対して少なくとも７０％の配列相補性を含む。例えば、２０核酸塩基のうちの１８個が、標的核酸内の標的領域に対して相補的であり、したがって特異的にハイブリッド形成する、アンチセンス化合物は、９０％の相補性を表す。この例において、残りの非相補的核酸塩基は、相補的核酸塩基と集合または散在されてもよく、互いに、または相補的核酸塩基に隣接する必要はない。そのように、標的核酸と完全に相補的である２つの領域が両側に位置する、４個の非相補的核酸塩基を有する、１８個の核酸塩基の長さのアンチセンス化合物は、標的核酸と全体で７７．８％の相補性を有し、したがって、本開示の範囲内にある。標的核酸の領域とのアンチセンスの相補性パーセントは、当該技術分野において既知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所配列検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを使用して日常的に決定され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，１９９７）。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本開示は、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの用途を提供する。

本明細書に使用される場合「阻害する」とは、ＧＨＲ発現における任意の測定可能な減少（例えば、１０％、２０％、５０％、９０％、または１００％）を意味する。

本明細書に使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡもしくはＤＮＡのオリゴマーまたはポリマー、またはその模倣体、キメラ、類似体、および相同体を指す。この用語は、自然発生する核酸塩基類、糖類、および共有ヌクレオシド間（骨格）結合から成るオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する非自然発生部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、所望の特性、例えば、増強された細胞取り込み、標的核酸に対して増強された親和性、およびヌクレアーゼ存在下での増加した安定性等によって、しばしば天然型よりも望ましい。

オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基は、互いに隣接するヌクレオシドを共有結合して、線形ポリマー化合物を形成する。順に、この線形ポリマー化合物のそれぞれの末端をさらに接合して、環状化合物を形成することができるが、一般に線形化合物が好ましい。加えて、線形化合物は内部の核酸塩基相補性を有してよく、したがって、完全または部分的に二本鎖の化合物を生成するような方法で折り畳んでもよい。オリゴヌクレオチドに関して、リン酸基は、一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものと称される。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または骨格は、３´〜５´ホスホジエステル結合である。

本開示の方法において有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドには、例えば、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部分をハイブリッド形成する他のオリゴヌクレオチドが挙げられる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単鎖、二本鎖、環状、またはヘアピンの形態で投与されてもよく、内部もしくは末端バルジまたはループ等の構造要素を含有し得る。一旦投与されると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸の修飾に影響する、１つ以上の酵素または構造タンパク質の作用を引き出し得る。

そのような酵素の１つの非限定的な例は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである、ＲＮＡｓｅ Ｈである。「ＤＮＡ様」の単鎖のアンチセンス化合物が、ＲＮＡｓｅ Ｈを引き出すことは、当該技術分野において既知である。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの活性は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド媒介性阻害の効率を著しく増強させる。同様の役割は、酵素のＲＮａｓｅＩＩＩおよびリボヌクレアーゼＬファミリーにおけるリボヌクレアーゼのような他のリボヌクレアーゼにおいても仮定されている。

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子の導入は、遺伝子またはその関連遺伝子生成物の機能の強力かつ特異的なアンチセンス媒介性の減少を誘発することが示された。この現象は、植物および動物の両方で生じ、ウイルス性防御およびトランスポゾンサイレンシングとの進化的関連を有すると考えられる。

ｄｓＲＮＡが動物において遺伝子サイレンシングをもたらすという最初の証拠は、１９９５年に線虫シノラブディスエレガンスの研究から得られた（Ｇｕｏ ａｎｄ Ｋｅｍｐｈｅｕｓ，１９９５）。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら（１９９８）は、ｄｓＲＮＡの一次干渉効果が転写後であることを示した。以降、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）への暴露によってもたらされる、シノラブディスエレガンスにおいて明らかになった転写後アンチセンス機序は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と指定されている。この用語は、内因性標的ｍＲＮＡレベルの配列特異的減少をもたらす、ｄｓＲＮＡの導入を伴うアンチセンス媒介性遺伝子サイレンシングを意味するように一般化された（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。それが実際に、ＲＮＡｉの強力な誘導因子である、ｄｓＲＮＡのアンチセンス極性の単鎖ＲＮＡオリゴマーであることが示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

当該技術分野において通常の技術を有する者であれば、過度の実験なしに、本開示の方法に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定することができる。

修飾ヌクレオシド間結合（骨格）
本開示の方法において有用なアンチセンス化合物は、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを含む。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を保持するもの、および骨格にリン原子を有しないものを含む。

リン原子をその中に含む修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、通常の３′−５′結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホン酸塩（３′−アルキレンホスホン酸塩、５′−アルキレンホスホン酸塩、およびキラルホスホン酸塩を含む）、ホスフィン酸塩、ホスホロアミド酸（３′−アミノホスホロアミド酸およびアミノアルキルホスホロアミド酸を含む）、チオノホスホロアミド酸、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホン酸塩、およびボラノホスホン酸塩、これらの２′−５′結合類似体、ならびに、その中の１つ以上のヌクレオチド間結合が、３′から３′、５′から５′、または２′から２′への結合である、逆の極性を有するものが挙げられる。

逆の極性を有するオリゴヌクレオチドは、３′最末端ヌクレオチド間結合において、単一の３′から３′への結合、つまり、脱塩基であり得る単一の逆のヌクレオシド残基（核酸塩基が欠失しているか、またはその場所にヒドロキシル基を有する）を含む。様々な塩、混合塩、および遊離酸の形もまた含まれる。

上記リン含有結合の調製法を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、米国第３，６８７，８０８号、米国第４，４６９，８６３号、米国第４，４７６，３０１号、米国第５，０２３，２４３号、米国第５，１７７，１９６号、米国第５，１８８，８９７号、米国第５，２６４，４２３号、米国第５，２７６，０１９号、米国第５，２７８，３０２号、米国第５，２８６，７１７号、米国第５，３２１，１３１号、米国第５，３９９，６７６号、米国第５，４０５，９３９号、米国第５，４５３，４９６号、米国第５，４５５，２３３号、米国第５，４６６，６７７号、米国第５，４７６，９２５号、米国第５，５１９，１２６号、米国第５，５３６，８２１号、米国第５，５４１，３０６号、米国第５，５５０，１１１号、米国第５，５６３，２５３号、米国第５，５７１，７９９号、米国第５，５８７，３６１号、米国第５，１９４，５９９号、米国第５，５６５，５５５号、米国第５，５２７，８９９号、米国第５，７２１，２１８号、米国第５，６７２，６９７号、および米国第５，６２５，０５０号が挙げられる。

リン原子をその中に含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルが混合されたヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子の、もしくは複素環式のヌクレオシド間結合によって形成される骨格が挙げられる。これらは、（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）モルホリノ結合を有するもの、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸塩およびスルホンアミド骨格、アミド骨格、および混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ_２成分部分を有する他のものを含む。

上記オリゴヌクレオチドの調製法を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、米国第５，０３４，５０６号、米国第５，１６６，３１５号、米国第５，１８５，４４４号、米国第５，２１４，１３４号、米国第５，２１６，１４１号、米国第５，２３５，０３３号、米国第５，２６４，５６２号、米国第５，２６４，５６４号、米国第５，４０５，９３８号、米国第５，４３４，２５７号、米国第５，４６６，６７７号、米国第５，４７０，９６７号、米国第５，４８９，６７７号、米国第５，５４１，３０７号、米国第５，５６１，２２５号、米国第５，５９６，０８６号、米国第５，６０２，２４０号、米国第５，６１０，２８９号、米国第５，６０２，２４０号、米国第５，６０８，０４６号、米国第５，６１０，２８９号、米国第５，６１８，７０４号、米国第５，６２３，０７０号、米国第５，６６３，３１２号、米国第５，６３３，３６０号、米国第５，６７７，４３７号、米国第５，７９２，６０８号、米国第５，６４６，２６９号、および米国第５，６７７，４３９号が挙げられる。

修飾糖およびヌクレオシド間結合
本開示の方法に有用なアンチセンス化合物には、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方（すなわち、骨格）が、新規の基と置き換えられる、オリゴヌクレオチド模倣体を含む。核酸塩基単位は、標的核酸とのハイブリッド形成のために維持される。

優れたハイブリッド形成特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置き換えられる。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製法を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、米国第５，５３９，０８２号、米国第５，７１４，３３１号、および米国第５，７１９，２６２号が挙げられる。ＰＮＡ化合物に関するさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１において見出すことができる。

本開示の方法に有用なアンチセンス化合物はまたホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチド、例えば、米国第５，４８９，６７７号の−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−［ここで、天然ホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２−と表される］、ならびに米国第５，６０２，２４０号のアミド骨格も含む。

本開示の方法に有用なアンチセンス化合物はまた、米国第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも含む。

修飾された糖
本開示の方法に有用なアンチセンス化合物は、１つ以上の置換された糖部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。

例には、以下のＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルうちの１つを２′位に含むオリゴヌクレオチドが挙げられ、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換された、または置換されていないＣ_１からＣ_１０のアルキル、またはＣ_２からＣ_１０のアルケニルおよびアルキニルであり得る。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のＯ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、およびＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２のうちの１つを２′位に含み、ｎおよびｍは、１から約１０である。

修飾オリゴヌクレオチドのさらなる例としては、以下のＣ_１からＣ_１０の低級アルキル、置換された低級の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基、および同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを２′位に含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。

１つの実施形態において、修飾は、２′−メトキシエトキシ（２′−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３（２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２′−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、つまり、アルコキシアルコキシ基を含む。さらなる実施形態において、修飾は、２′−ジメチルアミノオキシエトキシ、つまり、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基（２′−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、または２′−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２′−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２′−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、つまり、２′−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２を含む。

他の修飾は、２′−メトキシ（２′−Ｏ−ＣＨ_３）、２′−アミノプロポキシ（２′−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、２′−アリル（２′−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、２′−Ｏ−アリル（２′−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）および２′−フルオロ（２′−Ｆ）を含む。２′−修飾は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位であってよい。１つの実施形態において、２′−アラビノ修飾は２′−Ｆである。

同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３′末端ヌクレオチド上または２′−５′結合オリゴヌクレオチド内の糖の３′位、および５′末端ヌクレオチドの５′位において行われてもよい。

オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖の模倣体を有してもよい。

そのような修飾された糖の構造の調製法を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、米国第４，９８１，９５７号、米国第５，１１８，８００号、米国第５，３１９，０８０号、米国第５，３５９，０４４号、米国第５，３９３，８７８号、米国第５，４４６，１３７号、米国第５，４６６，７８６号、米国第５，５１４，７８５号、米国第５，５１９，１３４号、米国第５，５６７，８１１号、米国第５，５７６，４２７号、米国第５，５９１，７２２号、米国第５，５９７，９０９号、米国第５，６１０，３００号、米国第５，６２７，０５３号、米国第５，６３９，８７３号、米国第５，６４６，２６５号、米国第５，６５８，８７３号、米国第５，６７０，６３３号、米国第５，７９２，７４７号、および米国第５，７００，９２０号が挙げられる。

糖のさらなる修飾には、２′−ヒドロキシル基が、糖環の３′または４′炭素原子に結合され、それによって二環式糖部分を形成する、ロックされた核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。１つの実施形態において、結合は、２′酸素原子および４′炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ_２−）_ｎ基であり、ｎは１または２である。ＬＮＡおよびその調製法は、国際公開第９８／３９３５２号および国際公開第９９／１４２２６号に記載されている。

天然および修飾核酸塩基
本開示の方法に有用なアンチセンス化合物は、核酸塩基修飾または置換を有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書に使用される場合、「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。

修飾核酸塩基には、他の合成および天然核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ハイポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_３）ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（疑似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。

さらなる修飾核酸塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）等のＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３′，２′：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）等の三環式ピリミジンが挙げられる。

修飾核酸塩基にはまた、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンで置き換えられたものが挙げられ得る。さらなる核酸塩基には、米国第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９０）に開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）によって開示されたもの、およびＹ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されたものが挙げられる。

これらの核酸塩基のいくつかは、オリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるのに、特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増大させることを示した。１つの実施形態において、これらの核酸塩基置換は、２′−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と併用される。

上記修飾核酸塩基のいくつか、ならびに他の修飾核酸塩基の調製法を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、米国第３，６８７，８０８号、米国第４，８４５，２０５号、米国第５，１３０，３０２号、米国第５，１３４，０６６号、米国第５，１７５，２７３号、米国第５，３６７，０６６号、米国第５，４３２，２７２号、米国第５，４５７，１８７号、米国第５，４５９，２５５号、米国第５，４８４，９０８号、米国第５，５０２，１７７号、米国第５，５２５，７１１号、米国第５，５５２，５４０号、米国第５，５８７，４６９号、米国第５，５９４，１２１号、米国第５，５９６，０９１号、米国第５，６１４，６１７号、米国第５，６４５，９８５号、米国第５，８３０，６５３号、米国第５，７６３，５８８号、米国第６，００５，０９６号、米国第５，６８１，９４１号、および米国第５，７５０，６９２号が挙げられる。

抱合体
本開示の方法に有用なアンチセンス化合物は、１つ以上の部分または群に抱合され、アンチセンス化合物の活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する。

これらの部分または群は、第一級もしくは二級ヒドロキシル基等の官能基に共有結合され得る。

例となる部分または群には、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する群、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する群が挙げられる。典型的な抱合体群には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が挙げられる。

薬力学的特性を増強する部分または群には、取り込みを向上させ、分解への抵抗力を増強し、および／または標的核酸との配列特異的なハイブリッド形成を強化する群が挙げられる。

薬物動態特性を増強する部分または群には、アンチセンス化合物の取り込み、分布、代謝、または分泌を向上させる群が挙げられる。

代表的な部分または群は、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号および米国第６，２８７，８６０号に開示される。

部分または群には、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分等の脂質部分が挙げられる。

本開示の方法に有用なアンチセンス化合物はまた、活性原薬に抱合されてもよい。

オリゴヌクレオチド薬物抱合体およびその調製法は、米国第０９／３３４，１３０号に記載されている。

そのような抱合体の調製法を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、米国第４，８２８，９７９号、米国第４，９４８，８８２号、米国第５，２１８，１０５号、米国第５，５２５，４６５号、米国第５，５４１，３１３号、米国第５，５４５，７３０号、米国第５，５５２，５３８号、米国第５，５７８，７１７号、米国第５，５８０，７３１号、米国第５，５８０，７３１号、米国第５，５９１，５８４号、米国第５，１０９，１２４号、米国第５，１１８，８０２号、米国第５，１３８，０４５号、米国第５，４１４，０７７号、米国第５，４８６，６０３号、米国第５，５１２，４３９号、米国第５，５７８，７１８号、米国第５，６０８，０４６号、米国第４，５８７，０４４号、米国第４，６０５，７３５号、米国第４，６６７，０２５号、米国第４，７６２，７７９号、米国第４，７８９，７３７号、米国第４，８２４，９４１号、米国第４，８３５，２６３号、米国第４，８７６，３３５号、米国第４，９０４，５８２号、米国第４，９５８，０１３号、米国第５，０８２，８３０号、米国第５，１１２，９６３号、米国第５，２１４，１３６号、米国第５，０８２，８３０号、米国第５，１１２，９６３号、米国第５，２１４，１３６号、米国第５，２４５，０２２号、米国第５，２５４，４６９号、米国第５，２５８，５０６号、米国第５，２６２，５３６号、米国第５，２７２，２５０号、米国第５，２９２，８７３号、米国第５，３１７，０９８号、米国第５，３７１，２４１号、米国第５，３９１，７２３号、米国第５，４１６，２０３号、米国第５，４５１，４６３号、米国第５，５１０，４７５号、米国第５，５１２，６６７号、米国第５，５１４，７８５号、米国第５，５６５，５５２号、米国第５，５６７，８１０号、米国第５，５７４，１４２号、米国第５，５８５，４８１号、米国第５，５８７，３７１号、米国第５，５９５，７２６号、米国第５，５９７，６９６号、米国第５，５９９，９２３号、米国第５，５９９，９２８号、および米国第５，６８８，９４１号が挙げられる。

キメラ化合物
当業者によって理解されるように、所与の化合物のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に前述の修飾のうちの２つ以上が単一のオリゴヌクレオチド内に、またオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ、組み込まれ得る。

本開示の方法に有用なアンチセンス化合物は、キメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」は、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位から成る２つ以上の化学的に異なる領域、つまり、オリゴヌクレオチド化合物の場合における、ヌクレオチドを含む。これらのオリゴヌクレオチドは典型的に、ヌクレアーゼ分解への増大した耐性、増大した細胞取り込み、増大した安定性、および／または標的核酸に対する増大した結合親和性をオリゴヌクレオチドに付加するようにオリゴヌクレオチドが修飾された、少なくとも一つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として働くことができる。例として、ＲＮＡｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの活性は、ＲＮＡ標的の切断を生じ、その結果、遺伝子発現のオリゴヌクレオチドに媒介性阻害の有効性を大いに高める。ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの切断は、同様に、細胞およびウイルスのＲＮＡの両方を切断するＲＮＡｓｅＬ等のエンドリボヌクレアーゼの作用を通じて達成され得る。ＲＮＡ標的の切断は、通常通り、ゲル電気泳動、および必要に応じて、当該技術分野において既知の、関連する核酸ハイブリダイゼーション法によって検出され得る。

本開示の方法に有用なキメラアンチセンス化合物は、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、および／またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成され得る。そのような化合物は、当該技術分野において、ハイブリッドまたはギャップマーとも称されている。

そのようなハイブリッド構造の調製法を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、米国第５，０１３，８３０号、米国第５，１４９，７９７号、米国第５，２２０，００７号、米国第５，２５６，７７５号、米国第５，３６６，８７８号、米国第５，４０３，７１１号、米国第５，４９１，１３３号、米国第５，５６５，３５０号、米国第５，６２３，０６５号、米国第５，６５２，３５５号、米国第５，６５２，３５６号、および米国第５，７００，９２２号が挙げられる。

例となるオリゴヌクレオチド
１つの実施形態において、本アンチセンス化合物は、ＧＨＲ ｍＲＮＡにハイブリッド形成するように設計された第２世代のホスホロチオエート骨格２’−ＭＯＥ−修飾キメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。

例となるオリゴヌクレオチドは、表１に示される。「標的部位」は、そこにオリゴヌクレオチドが結合する、特定の標的配列上の第１（５′最末端）のヌクレオチドの番号を示す。「％ Ｉｎｈｉｂ」は、定量的リアルタイムＰＣＲによるｈＧＨＲｍＲＮＡレベルの阻害効果を示す。データは、ＭＣＦ７細胞がアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療された３つの実験からの平均である。

表１ ２’−ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒト成長ホルモン受容体ｍＲＮＡレベルの阻害

表１におけるすべてのオリゴヌクレオチドは、両側（５′および３′方向）に５ヌクレオチドの「ウイング」が隣接する１０の２′−デオキシヌクレオチドから成る中央の「ギャップ」領域から構成される２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは２′−メトキシエチル（２′−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。すべてのウラシルは、５−メチルウラシル（^ＭｅＵ）である。典型的に、オリゴヌクレオチドは、５−メチルウラシルではなく、２−メトキシエチル修飾チミジンを用いて合成される。すべてのピリミジンは、Ｃ５メチル化される（すなわち、Ｕ、Ｔ、Ｃは、Ｃ５メチル化されている）。

オリゴヌクレオチドは、固相合成および下流処理の２つの異なる操作に分割され得る、複数ステップのプロセスによって合成されてもよい。第１の操作では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列がコンピュータ制御固相合成器によって組み立てられる。続く下流処理では、オリゴヌクレオチド原薬を得るための、脱保護ステップ、調製逆相クロマトグラフ精製、単離および乾燥を含む。オリゴヌクレオチドの化学合成は、ホスホルアミダイト結合化学に続いて酸化硫化を利用し、伸長オリゴマーへの活性化したモノマーの連続結合を含み、その３′−末端は、固相支持体に共有結合される。

脱トリチル反応（反応ａ）
固相合成のそれぞれの周期が、支持体に結合したオリゴヌクレオチドの５′末端ヌクレオシドの酸不安定な５′−Ｏ−４，４′−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基の除去から始まる。これは、酸溶液による処置によって達成される（例えば、トルエン中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ））。脱トリチル反応に続いて、次の反応の準備において、アセトニトリルで洗浄することによって、過剰な試薬を支持体から除去する。

結合（反応ｂ）
鎖の伸長が、活性化因子（例えば、１Ｈ−テトラゾール）の存在下で、支持体に結合したオリゴヌクレオチドの５′−ヒドロキシル基と、特定の塩基位置（例えば、塩基２の場合：ＭＯＥ−^ＭｅＣアミダイト）に対応するホスホルアミダイトの溶液との反応によって達成される。これは、流入するヌクレオチドシントンと支持体に結合したオリゴヌクレオチド鎖との間に亜リン酸トリエステルの形成をもたらす。結合反応後、次の反応の準備において、アセトニトリルで洗浄することによって、過剰な試薬を支持体から除去する。

硫化（反応ｃ）
新たに形成された亜リン酸トリエステル結合が、硫酸転移試薬（例えば、フェニルアセチルジスルフィド）の溶液で処理することによって、対応する［Ｏ，Ｏ，Ｏ）−トリアルキルホスホロチオエートトリエステルに変換される。硫化に続いて、次の反応の準備において、アセトニトリルで洗浄することによって、過剰な試薬を支持体から除去する。

キャッピング（反応ｄ）
任意の指定周期において使用可能なごく一部の５′−ヒドロシキ基は伸長できない。続く周期のいずれかにおけるこれらの基の結合は、所望の生成物から分離することが困難な処理関連不純物（「ＤＭＴ−オン（ｎ−ｌ）−ｍｅｒ」の形成をもたらす。これらの不純物の形成を回避し、精製を促進するために、「キャッピング試薬」（例えば、無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾール／アセトニトリル／ピリジン）は、反応容器の中に導入されて、キャップ配列を生じる。得られた失敗配列（「ＤＭＴ−オフショートマー」）は、逆相ＨＰＬＣ精製によって所望の生成物から分離される。キャッピング反応後、次の反応の準備において、アセトニトリルで洗浄することによって、過剰な試薬を支持体から除去する。

適切な保護ヌクレオシドホスホルアミダイトを使用するこの基本的な４ステップ周期の繰り返しによって、全保護オリゴヌクレオチド配列のアセンブリを可能にする。

骨格脱保護（反応ｅ）
プロセスのアセンブリ部分の完了に続いて、（Ｏ，Ｏ，Ｏ）−トリアルキルホスホロチオエートトリエステルヌクレオチド間結合を保護するシアノエチル基をアセトニトリル中のトリエチルアミン（ＴＥＡ）溶液で処理することによって除去する。このステップの間に生成された試薬およびアクリロニトリルは、カラムをアセトニトリルで洗浄することによって除去される。

支持体および塩基脱保護からの切断（反応ｆ）
環外アミノ基の脱保護および支持体からの粗生成物の切断が、含水水酸化アンモニウムで培養することによって達成される（反応ｆ）。５′−Ｏ−ＤＭＴ保護された粗生成物の精製は、逆相ＨＰＬＣによって達成される。逆相ＨＰＬＣステップは、ＤＭＴ−オフ失敗配列を除去する。溶出プロファイルは、ＵＶ吸収分光法によって監視される。ＤＭＴ−オンオリゴヌクレオチド生成物を含む画分を収集し、分析する。

酸性脱保護（反応ｇ）
５′−Ｏ−ＤＭＴ保護されたオリゴヌクレオチドを含有する逆相ＨＰＬＣ画分は貯蔵され、沈殿タンクに移される。いくつかの合成の精製から得られる生成物は、プロセスのこの段階で組み合わせられる。精製されたＤＭＴ−オンオリゴヌクレオチドは、酸（例えば、酢酸）で処理され、５′末端に結合されたＤＭＴ基を除去する。定めた時間の酸暴露および中和後に、オリゴヌクレオチド原薬を単離し、乾燥する。

最終の酸性脱保護ステップに続いて、溶液は、水酸化ナトリウム水溶液の添加によって中和され、オリゴヌクレオチド原薬は、エタノールを添加することによって溶液から沈殿される。沈殿した物質を反応容器の底に定着させ、容器を傾けてエタノール上清を移す。沈殿した物質を精製水に再溶解し、溶液のｐＨをｐＨ７．２〜７．３の間に調整する。沈殿ステップを繰り返す。沈殿した物質を水に溶解し、０．４５ミクロンフィルターを通して溶液を濾過して、使い捨てのポリプロピレンのトレイに移した後、凍結乾燥機の中に置く。溶液を−５０℃に冷却する。一次乾燥を２５℃で３７時間行う。温度を３００℃まで上昇させ、二次乾燥ステップを５．５時間行う。凍結乾燥プロセスの完了に続いて、原薬を高密度ポリエチレンのボトルに移し、−２００℃で保管した。

標的核酸
特定の核酸に対するアンチセンス化合物の「標的化」は、複数のステップのプロセスであり得る。このプロセスは通常、その機能が変調される標的核酸の同定から始まる。本開示において、標的核酸は、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）をコードする。「標的核酸」という用語は、ＧＨＲをコードするＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ、またはそれらの部分を含む）、およびさらにそのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡを包含する。

成長ホルモン受容体をコードするｃＤＮＡは、多くの種からクローン化されてきた。受容体は、細胞外ホルモン結合領域（エクソン２〜７）、単一の膜貫通領域（エクソン８）、および細胞内領域（エクソン９〜１０）から成る。ヒトおよびマウス転写物の両方における、遺伝子の代替の第１のエクソンである、複数の代替の５’非翻訳領域もまた存在する。成長ホルモン受容体は内在性キナーゼドメインを有さないが、細胞内領域は、シグナル伝達プロセスにおける主要な役割を果たす。成長ホルモン結合タンパク質（ＧＨＢＰ）として知られる受容体の切断型は、ＧＨＲの膜貫通および細胞内領域を欠乏しており、血清内に分泌される。切断型タンパク質は、動物種に応じて、２つの異なるプロセスのうちの１つによって生成される。マウスおよびラットにおいて、ＧＨＲ前駆体メッセンジャーＲＮＡの選択的スプライシングは、膜貫通および細胞内領域を（エクソン８Ａでコードされている）非常に短い親水性の尾部で置き換える。（特に）ヒト、ウシ、およびブタにおいて、選択的ＲＮＡスプライシングがないことは明らかであるが、代わりにＧＨＢＰがＧＨＲのタンパク質分解によって生成される。ＧＨＢＰは、循環成長ホルモン（ＧＨ）のレベルを調節するようにみえる。

１つの実施形態において、ＧＨＲは、ＮＭ＿０００１６３．４（配列番号４）またはＮＧ＿０１１６８８（４８５２−３０２９５５）（配列番号５）において示されるヌクレオチド配列を有するヒトＧＨＲ（ｈＧＨＲ）である。

標的化プロセスは、通常、アンチセンス相互作用が生じるように、標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、セグメント、または部位の特定も含み、所望の効果、例えば、発現の阻害が生じるようにする。本明細書に使用される場合、「領域」という用語は、少なくとも１つの同定可能な構造、機能、または特徴を有する標的核酸の一部分として定義される。標的核酸の領域内にセグメントがある。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さい、または下位の部分として定義される。本明細書に使用される場合、「部位」は、標的核酸内の位置を意味する。

「翻訳開始コドン」は典型的に、５′−ＡＵＧ（転写ｍＲＮＡ分子において、対応するＤＮＡ分子では５′−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」とも称される。少数の遺伝子が、ＲＮＡ配列５′−ＧＵＧ、５′−ＵＵＧ、または５′−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５′−ＡＵＡ、５′−ＡＣＧ、および５′−ＣＵＧは、インビボで機能することを示した。したがって、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、それぞれの例における開始アミノ酸が、典型的にメチオニン（真核細胞において）またはホルミルメチオニン（原核細胞において）であるとしても、多くのコドン配列を包含し得る。真核細胞および原核細胞遺伝子が２つ以上の選択的開始コドンを有し得ることも当該技術分野において知られており、それらのいずれか１つが、特定の細胞型もしくは組織において、または特定の条件下で、翻訳開始に選好的に利用されてもよい。本明細書に使用される場合、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」という用語は、そのようなコドンの配列（複数可）に関わらず、例えば、ＧＨＲをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの翻訳を開始するようにインビボで使用されるコドン（複数可）を指す。

「停止コドン」とも称される「翻訳終止コドン」は、３つのＲＮＡ配列：５′−ＵＡＡ、５′−ＵＡＧ、および５′−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ分子において、それぞれ５′−ＴＡＡ、５′−ＴＡＧ、および５′−ＴＧＡ）のうちの１つを有し得る。本明細書に使用される場合、「翻訳終止コドン」および「停止コドン」という用語は、そのようなコドンの配列（複数可）に関わらず、ＧＨＲをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を終了するようにインビボで使用される、コドン（複数可）を指す。

「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５′または３′）に約２５〜約５０個の連続ヌクレオチドを包含する、ｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。同様に、「停止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５′または３′）に約２５〜約５０個の連続ヌクレオチドを包含する、ｍＲＮＡまたは遺伝子の一部分を指す。したがって、「開始コドン領域」または「翻訳開始コドン領域」および「停止コドン領域」または「翻訳終止コドン領域」とは、本アンチセンス化合物によって効果的に標的化され得るすべての領域である。

翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を指すことが当該技術分野において既知である、「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）または「コード領域」もまた、効果的に標的化され得る領域である。１つの実施形態において、遺伝子のＯＲＦの翻訳開始または終止コドンを包含する遺伝子内領域が標的化される。

他の標的領域は、翻訳開始コドンから５′方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野において知られており、したがって、ｍＲＮＡの５′キャップ部位と翻訳開始コドンとの間にヌクレオチド（または遺伝子上で対応するヌクレオチド）を含む５′未翻訳領域（５′ＵＴＲ）と、翻訳終止コドンから３′方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野において知られており、したがって、翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３′末端との間にヌクレオチド（または遺伝子上で対応するヌクレオチド）を含む３′未翻訳領域（３′ＵＴＲ）と、を含む。ｍＲＮＡの５′キャップ部位は、５′−５′三リン酸結合を介してｍＲＮＡの５′−最末端残基に結合されたＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５′キャップ領域は、５′キャップ構造自体、ならびにキャップ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むと考えられる。１つの実施形態において、５′キャップ領域が標的化される。

いくつかの真核ｍＲＮＡ転写物は、直接翻訳されるが、多くは「イントロン」として知られる１つ以上の領域を含み、それが翻訳される前に転写物から切除される。残りの（およびしたがって翻訳された）領域は、「エクソン」として知られ、一緒にスプライスされて、連続したｍＲＮＡ配列を形成する。異なる遺伝子源から２つ（以上）のｍＲＮＡをスプライシングするプロセスを介して産生されるｍＲＮＡ転写物は「融合転写物」として知られる。１つの実施形態において、イントロン、またはスプライス部位、つまりイントロン−エクソン接合部もしくはエクソン−イントロン接合部、あるいは再配列または欠失のための異常な融合接合部が標的化される。

選択的ＲＮＡ転写物は、ＤＮＡの同じゲノム領域から生成され得る。これらの選択的転写物は、概して「変異体」として知られる。

「プレｍＲＮＡ変異体」は、それらの開始または停止位置のいずれかにおいて、同じゲノムＤＮＡから生成される他の転写物とは異なる、同じゲノムＤＮＡから生成された転写物であり、イントロンおよびエクソン配列の両方を含む。スプライシング中に１つ以上のエクソンもしくはイントロン領域、またはそれらの部分を切除するとき、プレｍＲＮＡ変異体は、より小さい「ｍＲＮＡ変異体」を生成する。したがって、ｍＲＮＡ変異体は処理されたプレｍＲＮＡ変異体であり、それぞれ固有のプレｍＲＮＡ変異体は、スプライシングの結果として、固有のｍＲＮＡ変異体を常に生成しなければならない。これらのｍＲＮＡ変異体はまた、「選択的スプライス変異体」としても知られている。プレｍＲＮＡ変異体のスプライシングが生じない場合、その時、プレｍＲＮＡ変異体は、ｍＲＮＡ変異体と同一である。

マウス、ラット、およびサルにおいて、ＧＨＲの溶解性の短縮形態であるＧＨＢＰは、ＧＨＲ一次転写物の選択的スプライシングによって生成される。いくつかの実施形態において、転写物の標的領域がＧＨＲ転写物および短いＧＨＢＰ転写物の両方に存在することが好ましい場合がある。他の実施形態において、ｍＲＮＡの標的領域が、より長いＧＨＲ転写物にのみ存在することが好ましい場合がある。（特に）ヒト、ウシ、およびブタにおいて、選択的ＲＮＡスプライシングがないことは明らかであるが、代わりにより短いＧＨＢＰがＧＨＲのタンパク質分解によって生成される。本発明の文脈において、「ＧＨＲをコードする核酸」とは、ＧＨＢＰをコードする核酸を含むことが理解されよう。

変異体は、転写を開始または停止させる選択的シグナルの使用によって、つまり、選択的開始コドンまたは停止コドンの使用によって生成され得る。選択的開始コドンを使用するプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに由来する変異体は、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的開始変異体」として知られる。選択的停止コドンを使用する転写物は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的停止変異体」として知られる。選択的停止変異体の一つの具体的な型は、「ポリＡ変異体」であり、そこで生成される複数の転写物は、転写機構によって「ポリＡ停止シグナル」のうちの１つの選択的な選別の結果であり、それにより固有のポリＡ部位で停止する転写物を生成する。１つの実施形態において、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ変異体が標的化される。ヒトＧＨＲは、国立バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／および他のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ１０９１２＃ＰＲＯ＿０００００１０９５８によって同定され得る、いくつかの転写変異体を有する。これらの転写物のさらなる選択的配列および天然変異体配列が存在する。

そこにアンチセンス化合物がハイブリッド形成する標的核酸の位置は、「標的セグメント」と称される。本明細書に使用される場合、「標的セグメント」という用語は、そこにアンチセンス化合物が標的化される標的領域の少なくとも８個の核酸塩基部分として定義される。理論に縛られるものではないが、現在、これらの標的セグメントは、ハイブリッド形成のためにアクセス可能な標的核酸の部分を表すと考えられている。

一旦１つ以上の標的領域、セグメント、または部位が同定されると、標的セグメントに対して十分に相補的なアンチセンス化合物、つまり所望の効果を得るために十分に良好にハイブリッド形成し、十分な特異性を有するアンチセンス化合物が選択される。

さらなる実施形態において、本明細書で同定される標的セグメントは、ＧＨＲ遺伝子の発現（およびしたがってＧＨＲの発現）を調節する追加の化合物のスクリーニングに用いられてもよい。「修飾因子」は、ＧＨＲをコードする核酸分子の発現を減少または増加させ、好適な標的セグメントに対して相補的である少なくとも８核酸塩基部分を含む、化合物である。

スクリーニング方法は、ＧＨＲをコードする核酸の標的セグメントを１つ以上の候補修飾因子と接触させるステップと、ＧＨＲをコードする核酸の発現を減少または増加させる１つ以上の候補修飾因子を選択するステップと、を含む。一旦、１つまたは複数の候補修飾因子がＧＨＲをコードする核酸の発現を調節（例えば、減少または増加のいずれか）できることが示されると、次いで修飾因子は、ＧＨＲの機能に関するさらなる調査研究において、あるいは調査、診断、もしくは治療薬として使用するために用いられ得る。

標的セグメントはまた、そのそれぞれの相補的なアンチセンス化合物と組み合わせて、安定化された二本鎖（二重鎖）オリゴヌクレオチドを形成してもよい。

そのような二本鎖のオリゴヌクレオチド部分は、当該技術分野において、標的発現を調節し、翻訳ならびにアンチセンス機序を介してＲＮＡプロセシングを制御することが示された。さらに、二本鎖部分は、化学修飾に供され得る（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｔｉｍｍｏｎｓ ａｎｄ Ｆｉｒｅ，１９９８、Ｔｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｔａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ｂ）。例えば、そのような二本鎖部分は、標的に対する二重鎖のアンチセンス鎖の古典的なハイブリッド形成によって、標的を阻害し、それによって標的の酵素分解を誘起することが示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

例となる標的核酸
例となる標的配列は、表２に示される。

表２ 成長ホルモン受容体中で同定される好ましい標的配列の配列および位置

組成物／製剤
本開示の方法に有用なアンチセンス化合物は、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合、被包、抱合、またはさもなければ関連付けられ、例えば、取り込み、分布、および／または吸収を補助するためのリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所、または他の製剤を生じ得る。

そのような取り込み、分布、および／または吸収を補助する製剤の調製法を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、米国第５，１０８，９２１号、米国第５，３５４，８４４号、米国第５，４１６，０１６号、米国第５，４５９，１２７号、米国第５，５２１，２９１号、米国第５，５４３，１５８号、米国第５，５４７，９３２号、米国第５，５８３，０２０号、米国第５，５９１，７２１号、米国第４，４２６，３３０号、米国第４，５３４，８９９号、米国第５，０１３，５５６号、米国第５，１０８，９２１号、米国第５，２１３，８０４号、米国第５，２２７，１７０号、米国第５，２６４，２２１号、米国第５，３５６，６３３号、米国第５，３９５，６１９号、米国第５，４１６，０１６号、米国第５，４１７，９７８号、米国第５，４６２，８５４号、米国第５，４６９，８５４号、米国第５，５１２，２９５号、米国第５，５２７，５２８号、米国第５，５３４，２５９号、米国第５，５４３，１５２号、米国第５，５５６，９４８号、米国第５，５８０，５７５号、および米国第５，５９５，７５６号が挙げられる。

アンチセンス化合物は、薬学的に許容される担体中で投与され得る。「薬学的に許容される担体」という用語は、対象、特に哺乳動物、およびより具体的にはヒトに投与されるとき、アレルギー、毒性、または他の有害反応を生じない分子実体を指す。薬学的に許容される担体は、固体または液体であり得る。薬学的に許容される担体の有用な例には、本開示の活性剤の活性に影響しない希釈剤、溶媒、界面活性剤、賦形剤、懸濁剤、緩衝剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、乳化剤、吸収剤、分散媒質、コーティング剤、安定剤、保護コロイド、接着剤、増粘剤、チキソトロピー剤、浸透剤、封鎖剤、等張剤、および吸収遅延剤が挙げられるが、これらに限定されない

アンチセンス化合物は、薬学的に許容される塩、エステル、もしくはエステルの塩、または投与時に生物活性代謝物を（直接または間接的に）提供することができる任意の他の化合物であり得る。

本明細書に使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、投与時に親化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒物学的効果を付与しない、アンチセンス化合物の生理学的および薬学的に許容される塩を指す。薬学的に許容される塩およびその使用の好適な例は、米国第６，２８７，８６０号においてさらに記載される。

アンチセンス化合物は、プロドラッグもしくはプロドラッグの薬学的に許容される塩、または他の生物学的同等物であり得る。

本明細書に使用される場合、「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素もしくは他の化学物質の作用、および／または状態によって、投与されると活性化状態（すなわち、薬剤）に変換される不活性化状態で調製される治療薬を指す。具体的には、アンチセンス化合物のプロドラッグ形態は、国際公開第９３／２４５１０号、国際公開第９４／２６７６４号、および米国第５，７７０，７１３号において開示される方法に従って、ＳＡＴＥ［（Ｓアセチル−２−チオエチル）リン酸塩］誘導体として調製される。

治療的投与のための成長ホルモン（ＧＨ）変異体の製剤は、所望の純度を有するＧＨ変異体を任意に薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓｌｏ，Ａ（ｅｄｉｔｏｒ）（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で貯蔵用に調製される。非経口製剤が、単位投与注入形態（溶液、懸濁物、またはエマルジョン）のＧＨ変異体と薬学的に許容される担体を混合することによって、調製され得る。薬学的に許容される担体は、用いられる投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分に適合する。例えば、製剤は好ましくは、酸化剤およびポリペプチドに有害であると知られている他の化合物を含まない。好適な担体には、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、および他の有機酸を含有する緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；亜鉛、コバルト、もしくは銅等の二価金属イオン；マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；および／またはツイーン、プルロニック、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。

加えて、ＧＨ変異体がグリシン、マンニトール、およびリン酸塩緩衝剤等の緩衝剤を含む組成物中に含まれる国際公開第８９／０９６１４号に示されるＧＨ製剤が用いられてもよい。この製剤の一例は、０．６８ｇ／Ｌ グリシン、１８．０ｇ／Ｌ マンニトール、５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４である。代替として、ＧＨ変異体は液体製剤中に含まれてもよく、必ずしもマンニトールまたはグリシンを含有せず、ポリソルベートまたはポロクサマー等の０．１〜５％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤を含む。この製剤の一例は、５ｍｇ／ｍｌ ＧＨ変異体、８．７７ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ フェノール、２．０ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０、および１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０である。

ＧＨ変異体はまた、持続放出系によって好適に投与される。持続放出組成物の好適な例には、造形品、例えば、フィルムもしくはマイクロカプセルの形態の半透性のポリマーマトリクスが挙げられる。持続放出マトリクスには、ポリ乳酸（米国第３，７７３，９１９号；欧州第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）、ポリ（２−ヒドロシキエチルメタクリル酸塩）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１；Ｌａｎｇｅｒ，１９８２）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロシキ酪酸（欧州第１３３，９８８号）が挙げられる。持続放出ＧＨ変異体組成物はまた、リポソーム封入のＧＨ変異体を含む。ＧＨ変異体を含むリポソームは、当該技術分野で既知の方法で調製される（ＤＥ第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８０；欧州第５２，３２２号；欧州第３６，６７６号；欧州第８８，０４６号；欧州第１４３，９４９号；欧州第１４２，６４１号；日本国第８３−１１８００８号；米国第４，４８５，０４５号；米国第４，５４４，５４５号；および欧州第１０２，３２４号を参照されたい）。通常、リポソームは、その脂質含有量が約３０モルパーセントコレステロールを上回る小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型のものであり、その選択される比率はＧＨ変異体療法に最適に調整される。

ＧＨ変異体はまた、局所投与用に製剤化され得る。好適な製剤は、投与の部位に応じて異なり、当該技術分野で知られているものと変わりはない。例えば、ＧＨは、眼への投与用に平衡塩類溶液中に製剤化されてもよい。

治療的投与のためのＧＨ変異体製剤は、滅菌されている。滅菌は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通した濾過によって容易に達成される。治療的ＧＨ変異体組成物は概して、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに入れられる。ＧＨ変異体は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液として、または再構成するための凍結乾燥製剤として貯蔵される。凍結乾燥製剤化の一例として、５ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した０．５％（ｗ／ｖ）ＧＨ変異体水溶液２ｍｌを充填し、その得られた混合物を凍結乾燥する。

凍結乾燥したＧＨ変異体を、注射用の静菌水等を用いて再構成することにより注入溶液を調製する。

ペグ化ＧＨ変異体の製剤化は、概して、ＧＨ変異体に関して上述されたように行われる。

投与
本開示の方法は、対象におけるインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）レベルを低下させる、拮抗活性を有する成長ホルモン（ＧＨ）変異体と成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）を標的化するオリゴヌクレオチドとの併用の予想外の相乗作用に依存する。

本開示の特定の実施形態において、ＧＨ変異体およびオリゴヌクレオチドは同時に投与される。ＧＨ変異体およびオリゴヌクレオチドは、両成分の混合物を含む組成物の形態で投与され得る。代替として、ＧＨ変異体およびオリゴヌクレオチドは、別々の組成物において投与され得る。

１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、全身的に投与される。本明細書に使用される場合、「全身性投与」とは、経腸または非経口のいずれかの投与経路である。

本明細書に使用される場合、「経腸」とは、胃腸管のすべての部分を含む投与の任意の形態を指し、例えば、錠剤、カプセル、もしくはドロップ形態でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの経口投与；胃栄養管、十二指腸栄養管、もしくは胃瘻造設術；ならびに、例えば、坐薬もしくは浣腸形態でのアンチセンス化合物の直腸投与を含む。

本明細書に使用される場合、「非経口」とは、注射または注入による投与を含む。例としては、静脈内（静脈の中）、動脈内（動脈の中）、筋肉内（筋肉の内）、心臓内（心臓の中）、皮下（皮膚の下）、骨内注入（骨髄の中）、皮内（皮膚自体の中）、髄腔内（脊柱管の中）、腹腔内（腹腔の中に注入または注射）、膀胱内（膀胱の中に注入）、経皮（正常な皮膚を通じて拡散）、経粘膜（粘膜を通じて拡散）、吸入が挙げられる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単回用量として、あるいは定期的に、例えば、毎日、２日、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日毎に１回、週１回、週２回、週３回、または２週間毎、３週間毎、もしくは４週間毎に、反復用量として投与され得る。

本治療において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、治療される特定の状態、個々の患者の臨床状態、オリゴヌクレオチドの送達の部位、投与方法、投与のスケジュール、ならびに施術者に知らされている他の要因を考慮して、適正な医療行為と一致する方法で製剤化され、投与される。本明細書における目的のためのオリゴヌクレオチドの「有効量」は、したがってそのような状態によって決定される。本文脈における「有効量」は、投与の条件下で、ＧＨＲ発現を阻害するのに十分なアンチセンスオリゴヌクレオチドの任意の用量を指す。

例として、２５〜３４００、より好ましくは５０〜１６００ｍｇオリゴヌクレオチドの用量が、対象に投与され得る。１５０〜４００ｍｇの用量、例えば２５０ｍｇの用量が、ヒトにおいて特に企図される。１つの実施形態において、１日当たり２５０ｍｇの用量が、３週間にわたって６回、１、３、５、７、１４、および２１日目に投与される。別の実施形態において、２５０ｍｇの用量が週１回または２週に１回投与される。

ＧＨ変異体は、例えば、（例えば、浸透圧ポンプ等のミニポンプを使用して）連続注入によって、または例えば、静脈内もしくは皮下の方法を使用する注射によって、投与され得る。１つの実施形態において、ＧＨ変異体は、皮下に投与される。投与はまた、単一ボーラスとして、または徐放出デポー製剤によるものであり得る。

本治療において使用されるＧＨ変異体組成物は、治療される特定の状態、個々の患者の臨床状態、ＧＨ変異体組成物の送達の部位、投与方法、投与のスケジュール、ならびに施術者に知らされている他の要因を考慮して、適正な医療行為と一致する方法で製剤化され、投与される。本明細書における目的のためのＧＨ変異体の「有効量」（反作用、例えば先端巨大症へのアンタゴニスト有効量を含む）は、したがってそのような状態によって決定される。本文脈における「有効量」は、投与の条件下で、ＧＨ結合を拮抗するのに十分なＧＨ変異体の任意の用量を指す。

一般命題として、１用量当たりの非経口で投与されるＧＨ変異体の総薬学的有効量は、患者の体重の約１μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上で述べたように、これは治療的裁量の対象である。通常、この用量は約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日であり、より通常に、ヒトに対しては約０．０１〜約１μｇ／ｋｇ／日である。連続的に与えられる場合、ＧＨ変異体は典型的に、１日当たり１〜４回の注射よって、または例えば、ミニポンプを使用する連続皮下注入のいずれかによって、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で投与される。静脈内用バッグ溶液がまた用いられてもよい。適切な用量の選択における主要な要因は、例えば、血清ＧＨ、血清インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、および腫瘍成長等の低下によって、アンタゴニストに対して測定される、得られた結果である。

一般に、ペグ化ＧＨ変異体は、上述の投与経路のうちのいずれかによって投与され得る。しかしながら、現在、ペグ化ＧＨ変異体は非ペグ化ＧＨ変異体ほど頻繁に投与される必要がないと考えられている。非ペグ化ＧＨおよびＧＨ変異体は典型的に、少なくとも１週間に３回、およびしばしば毎日投与される。これらのタンパク質のペグ化形態は、３日間毎に約１回〜１か月に約１回、またはより典型的に、６〜７日毎に約１回〜２週間毎に１回、投与され得る。しかしながら、ペグ化ＧＨ変異体ソマバートは典型的に、５〜８０ｍｇの範囲の用量で毎日、またはより典型的には、初日の４０ｍｇの負荷量の後、１日当たり１０〜３０ｍｇ投与される。３０ｍｇ／日のソマバートは、先端巨大症に対して承認された１日用量のレジメンの最高値である。一部の先端巨大症患者において、および癌において、より高い１日用量が望まれる。

ＧＨ変異体は、単回用量として、あるいは定期的に、例えば、毎日、２日、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日毎に１回、週１回、週２回、週３回、または２週間毎、３週間毎、もしくは４週間毎に反復用量として投与され得る。

本開示の１つの実施形態において、ＧＨ変異体はソマバートであり、オリゴヌクレオチドはＡＴＬ１１０３（配列番号１９）であり、それらの化合物は順次投与される。１つの実施形態において、ＡＴＬ１１０３オリゴヌクレオチドが１、３、５、７、１４、および２１日目に２５０ｍｇ／日の用量で、ならびにその後（５〜１２週において）は週に１回、最初に投与され、続いてＧＨ変異体ソマバートが３０ｍｇ／日で同じ日に投与される。代替として、ＡＴＬ１１０３オリゴヌクレオチドは、週１回または２回（８〜１２週において）２５０ｍｇの用量で、週１回または２回または３回の３０ｍｇのソマバート用量と一緒に投与されてもよい。

５〜１２週の後、治療は、所望の標的ＩＧＦ−Ｉレベルを達成するために、同じか、または増加もしく低下した用量のソマバートを用いて、および同じか、または増加もしく低下した用量のＡＴＬ１１０３を用いて、ならびに同じか、または増加もしく低下した投薬頻度で、継続され得る（周期２）。５〜１２週間後のソマバート用量の修正は、約５〜１０ｍｇの増加であってもよく、約１〜４週間監視し、ＩＧＦ−Ｉレベルを評価する。５〜１２週間後のＡＴＬ１１０３用量の修正は、約２５または５０ｍｇの増加であってもよく、約１〜８週間監視し、ＩＧＦ−Ｉレベルを評価する。標的ＩＧＦ−Ｉ正規化が達成される場合、周期２が継続されてもよく、または患者毎の一患者におけるＩＧＦ−Ｉ正規化を達成するために、新たな周期が、投薬のさらなる最適化のために開始される。

別の実施形態において、癌または網膜症治療のために２１日治療周期が反復され得る。ＡＴＬ１１０３オリゴヌクレオチドが１、３、５、７、１４、および２１日目に２５０ｍｇ／日の用量で最初に投与され、続いてＧＨ変異体ソマバートが３０ｍｇ／日で同じ日に投与される。代替として、反復周期において、ＡＴＬ１１０３オリゴヌクレオチド投薬は週１回または２回、２５０ｍｇで、同じ日に週１回もしくは２回、３０ｍｇのソマバート用量、または、同じ日に週１回、８０ｍｇのソマバートと一緒に行われてもよい。代替として、治療は異なる日であってもよい。

５〜１２週の後、治療は、所望の標的ＩＧＦ−Ｉレベルおよび癌または網膜症における治療成果を達成するために、同じか、または増加もしく低下した用量のソマバートを用いて、および同じか、または増加もしく低下した用量のＡＴＬ１１０３を用いて継続され（周期２）、同じか、または増加もしく低下した投薬頻度で管理され得る。５〜１２週間後のソマバート用量の修正は、約５〜１０ｍｇの増加であってもよく、約１〜４週間監視し、ＩＧＦ−Ｉレベルを評価する。５〜１２週間後のＡＴＬ１１０３用量の修正は、約２５または５０ｍｇの増加であってもよく、約１〜８週間監視し、ＩＧＦ−Ｉレベルを評価する。標的ＩＧＦ−Ｉ正規化が達成される場合、周期２が継続されてもよく、または患者毎の一患者におけるＩＧＦ−Ｉ正規化を達成するために、新たな周期が、投薬のさらなる最適化のために開始される。

別の実施形態において、ＡＴＬ１１０３薬物は、１００、２００、２５０、３００、３５０、もしくは４００ｍｇ／日の用量で週１回または２回投薬され得、ソマバートは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、もしくは８０ｍｇ／日で毎日、１日おき、または週１回または２回投薬され得る。

別の実施形態において、患者が、最初にＡＴＬ１１０３、次いでソマバートである、週１回の代替投薬レジメンにあるように、ＡＴＬ１１０３オリゴヌクレオチドが上記の用量のうちの１つで１週おきに１回最初に投与され、続いてＧＨ変異体ソマバートが、代替の週に投与される。同様の実施形態において、患者は、数日おいて、または１日おいて最初にＡＴＬ１１０３、次いでソマバートである、週２回の投薬レジメンにある。ソマバートが最初に与えられてもよく、次いでＡＴＬ１１０３の投薬が続いてもよい。ソマバートおよびＡＴＬ１１０３を混合物中で組み合わせ、同じ日に与えてもよい。例えば、事前充填注射器の溶液中のＡＴＬ１１０３を凍結乾燥されたソマバートに添加し、ソマバートを溶液中に再構成し、ＡＴＬ１１０３およびソマバートの混合物を対象に投与してもよい。

実施例
ＧＨＲ標的化薬物ＡＴＬ１１０３の第１相試験。
第１相試験の第一目的は、ＡＴＬ１１０３の安全性、認容性、薬物動態（ｐＫ）を評価することであった。

第１相試験は、１８〜４５歳の健常な成人男性対象におけるＡＴＬ１１０３の単回漸増用量および複数回用量の無作為化プラセボ対照二重盲検試験であった。試験の単回漸増投与ステージにおいて、２４対象に、２５ｍｇで開始し、７５、２５０、および４００ｍｇに漸増するか、またはプラセボの単一の注射である、４つの用量レベルのＡＴＬ１１０３を投与した。複数回用量ステージは、１、３、５、７、１４、および２１日目に投与された、２５０ｍｇのＡＴＬ１１０３の６回の皮下投与を受けた８対象、ならびにプラセボを受けた４対象の１２対象において行われた。３５日目まで対象を監視した。

重要なことに、本試験において重篤な有害事象は報告されなかった。複数回用量群において２対象が安全性とは関係のない理由により、試験から離脱した。すべての有害事象は、「軽度〜中度」と報告された。注射部位反応が、本試験において報告された全有害事象の大半を示した。複数回用量ステージにおいて有害事象として報告された肝臓酵素ＡＬＴの上昇が１つ存在した。重要なことには、この対象におけるＡＬＴレベルは投薬期の間に正常に戻り、本安全性パラメーター上の薬物の残留または累積効果がなかったことを示唆する。

本試験の第二目的は、試験対象の血中のＩＧＦ−ＩレベルにおけるＡＴＬ１１０３の薬力学効果のデータを得ることであった。上昇した血清ＩＧＦ−Ｉのレベルの正常への低下は、成長障害である先端巨大症の治療における治療上のエンドポイントであり、ＩＧＦ−Ｉの効果の低下は、糖尿病性網膜症、腎症、および特定の形態の癌の治療における潜在的役割を有する。

統計解析計画において定義されるように、血清ＩＧＦ−Ｉ上のＡＴＬ１１０３の効果をＩＧＦ−Ｉレベル対ベースライン（起点）における変化として評価し、治療（ＡＴＬ１１０３）を受けた対象について判定した。ＩＧＦ−Ｉの投薬前ベースラインレベルを投薬の開始前に記録し、次いで、監視期間の終了まで週間隔で測定した。この治療群は１４日目から２８日目にＩＧＦ−Ｉレベルにおける低下の傾向を示し、２１日目に有意な効果（ｐ＝０．０３４ 片側ｔ検定）を有し、ＩＧＦ−Ｉレベル対ベースラインにおいて平均７％の低下を有した。

本試験の他の試験的目的では、成長ホルモン結合タンパク質（ＧＨＢＰ）、インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体の酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）、および成長ホルモン（ＧＨ）のレベルにおける、ならびにインビボ分裂促進性およびアポトーシス性パラメーターの薬物の作用機序およびより広範囲な薬理学的特性を調査した。

特に、ＡＴＬ１１０３は、２１日目に１６％（ｐ＝０．００７）および最後の投与から１週間後の２８日目に１９％（ｐ＜０．０５）のＧＨＢＰの減少における著しい効果を有した。循環ＧＨＢＰはＧＨＲからの切断によって生成されるため、循環ＧＨＢＰレベルの減少はＧＨＲ発現が減少されることを示す。ＡＴＬ１１０３はまた、ＩＧＦＢＰ−３およびＡＬＳも著しく減少させ、その両方は、ＩＧＦ−Ｉ上でのその効果およびそれらがＧＨによって制御されるという事実と一致する。ＧＨレベルにおける効果はなかった。具体的な試験詳細および結果は表３〜６に要約される。

表３ ＡＴＬ１１０３第１相臨床試験の概要

表４ 薬物動態パラメーター（平均±標準偏差）の概要

表５ ステージＢにおけるＡＴＬ１１０３で治療された対象の血清ＩＧＦ−Ｉレベル

表６ ステージＢにおけるＡＴＬ１１０３対象の試験的ＰＤアセスメント

実施例２： 血清ＩＧＦ−Ｉの減少を必要とする対象におけるものを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびソマバートの同時投与。
ＡＴＬ１１０３は、１日当たり２５０ｍｇで、３週間にわたって６回、１、３、５、７、１４、および２１日目に皮下投与されるものである。

ソマバートは、１日目または２４日目に開始して７日間、１日当たり２０ｍｇで皮下に投薬される。

理論に制限されるものではないが、ＡＴＬ１１０３は、各投与の後、血液から除去され、その長い組織半減期により肝臓および他の臓器中に蓄積する。ＡＴＬ１１０３は、肝実質細胞および他の肝細胞ならびに他の臓器の細胞表面上でＧＨＲタンパク質を減少するように働き、細胞表面ＧＨＲタンパク質から切断される血中ＧＨＲ（ＧＨＢＰ）の結果として得られる溶解型を減少させる。

対照群： 健常者または血清ＩＧＦ−Ｉの減少を必要とする対象に、ソマバートは同様の７または２４日の期間に単独で投与されるものであり、またはＡＴＬ１１０３は同様の２１日の期間に投与されるものである。

薬力学および薬理作用効果は、同様のアッセイならびに、例えば血清ＩＧＦ−ＩおよびＧＨに有用である追加のアッセイを用いて実施例１に記載のように評価される。

治療は、所望の標的血清ＩＧＦ−Ｉレベル、および任意にＧＨレベルを実現するために、同じか、または増加もしくは低下した用量のソマバート、および同じか、または増加もしくは低下した用量のＡＴＬ１１０３を用いて継続され、同じか、または増加もしくは低下した投与頻度で投与される。

実施例３： 先端巨大症の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびソマバートの同時投与。
１５先端巨大症患者の群に、ＡＴＬ１１０３を実施例１に記載のように、およびさらなる６週間、週１回投与で、ならびに２４日目に開始して６週間、（ｉ）３０ｍｇのソマバートを週１回、または（ｉｉ）８０ｍｇのソマバートを週１回のいずれかで投薬する。

対照群： ＡＴＬ１１０３またはソマバートは、それぞれ同様の９週の期間または６週の期間に単独で、先端巨大症の患者に投与されるものである。血清ＩＧＦ−Ｉが１６％および３１％減少され、患者の１２．５％および２６．７％が、それぞれ３０および８０ｍｇの用量で６週間、ソマバートを単独で投与されたとき、血清ＩＧＦ−Ｉレベルに対して正規化されたことが以前に示された。ソマバートの週１回投与は、先端巨大症患者へ毎日投与し、多数の先端巨大症患者の血清ＩＧＦ−Ｉを正規化するために中断された。

治療は、所望の標的血清ＩＧＦ−Ｉレベルを実現するために、同じか、または増加もしくは低下した用量のソマバート、および同じか、または増加もしくは低下した用量のＡＴＬ１１０３を用いて継続され、同じか、または増加もしくは低下した投与頻度で投与される。

実施例４： 先端巨大症の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびソマバートの同時投与。
１５先端巨大症患者の群に、１３週間、２００ｍｇのＡＴＬ１１０３を週１回投与で、および１３週間、ＡＴＬ１１０３と同じ日に（ｉ）３０ｍｇのソマバートを週１回、または（ｉｉ）８０ｍｇのソマバートを週１回のいずれかで投薬する。

対照群： ＡＴＬ１１０３またはソマバートは、同様の１３週の期間に単独で先端巨大症の患者に投与されるものである。

治療は、所望の標的血清ＩＧＦ−Ｉレベルを実現するために、同じか、または増加もしくは低下した用量のソマバート、および同じか、または増加もしくは低下した用量のＡＴＬ１１０３を用いて継続され、同じか、または増加もしくは低下した投与頻度で投与される。

実施例５： 先端巨大症の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびソマバートの同時投与
１５先端巨大症患者の群に、１３週間、２００ｍｇのＡＴＬ１１０３を週１回または２回投与で、ならびに１３週間、ＡＴＬ１１０３と同じ日に（ｉ）３０ｍｇのソマバートを週１回、または（ｉｉ）３０ｍｇのソマバートを週２回のいずれかで投薬する。

対照群： ＡＴＬ１１０３またはソマバートは、同様の１３週の期間に単独で先端巨大症の患者に投与されるものである。

治療は、所望の標的血清ＩＧＦ−Ｉレベルを実現するために、同じか、または増加もしくは低下した用量のソマバート、および同じか、または増加もしくは低下した用量のＡＴＬ１１０３を用いて継続され、同じか、または増加もしくは低下した投与頻度で投与される。

実施例６： 糖尿病性網膜症の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびソマバートの同時投与
糖尿病性網膜症を有する１５患者の群に、１３週間、２００ｍｇのＡＴＬ１１０３を週１回または２回投与で、ならびに１３週間、ＡＴＬ１１０３と同じ日に（ｉ）３０ｍｇのソマバートを週１回、または（ｉｉ）３０ｍｇのソマバートを週２回のいずれかで投薬する。

対照群： ＡＴＬ１１０３またはソマバートは、同様の１３週の期間に単独で糖尿病性網膜症患者に投与されるものである。

治療は、所望の標的ＩＧＦ−Ｉレベルおよび任意にＧＨレベル、ならびに網膜症における結果を実現するために、同じか、または増加もしくは低下した用量のソマバート、および同じか、または増加もしくは低下した用量のＡＴＬ１１０３を用いて継続され、同じか、または増加もしくは低下した投与頻度で投与される。

実施例７： 癌の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびソマバートの同時投与。
増加したＩＧＦ−Ｉに関連付けられる癌を有する１５患者の群に、１３週間、２００ｍｇのＡＴＬ１１０３を週１回または２回投与で、ならびに１３週間、（ｉ）３０ｍｇのソマバートを週１回、もしくは（ｉｉ）３０ｍｇのソマバートを週２回、または（ｉｉｉ）８０ｍｇを週１回、もしくは（ｉｖ）８０ｍｇのソマバートを週２回のいずれかで投薬する。

対照群： ＡＴＬ１１０３またはソマバートは、患者標準的薬剤で同様の１３週の期間に癌患者に単独で投与されるものである。

治療は、所望の標的ＩＧＦ−Ｉレベルおよび任意にＧＨレベル、ならびに癌における結果を実現するために、同じか、または増加もしくは低下した用量のソマバート、および同じか、または増加もしくは低下した用量のＡＴＬ１１０３を用いて継続され、同じか、または増加もしくは低下した投与頻度で投与される。

実施例８： 先端巨大症の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびソマバートの同時投与
ソマバートは、先端巨大症患者が、その治療に現在使用されている用量、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍｇ／日、またはそれ以上で皮下投与される。

ＡＴＬ１１０３は、１日当たり２５０ｍｇで、３週間にわたって６回、１、３、５、７、１４、および２１日目に皮下投与されるものである。

薬力学および薬理作用効果は、同様のアッセイならびに、例えば血清ＩＧＦ−ＩおよびＧＨに有用である追加のアッセイを用いて実施例１に記載のように評価される。

治療は、所望の標的血清ＩＧＦ−Ｉ、および任意に、ＧＨレベルを実現するために、同じか、または増加もしくは低下した用量のソマバート、および同じか、または増加もしくは低下した用量のＡＴＬ１１０３を用いて継続され、同じか、または増加もしくは低下した投与頻度で投与される。

実施例９： 先端巨大症の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびソマバートの同時投与。
ソマバートは、先端巨大症患者が、その治療に現在使用されている用量、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍｇ／日、またはそれ以上で皮下投与される。

ＡＴＬ１１０３は、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００ｍｇで、３週間にわたって週１回または２回、あるいは約１２００〜１８００ｍｇの累積用量まで、皮下投与される。

薬力学および薬理作用効果は、同様のアッセイならびに、例えば血清ＩＧＦ−ＩおよびＧＨに有用である追加のアッセイを用いて実施例１に記載のように評価される。

治療は、所望の標的血清ＩＧＦ−Ｉ、および任意に、ＧＨレベルを実現するために、同じか、または増加もしくは低下した用量のソマバート、および同じか、または増加もしくは低下した用量のＡＴＬ１１０３を用いて継続され、同じか、または増加もしくは低下した投与頻度で投与される。

実施例１０：先端巨大症の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびソマバートの同時投与
ソマバートは、先端巨大症患者が、その治療に現在使用されている用量、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍｇ／日、またはそれ以上で皮下投与される。

ＡＴＬ１１０３は、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００ｍｇで、４週間にわたって週１回または２回、または６週間にわたって週１回または２回、または８週間にわたって週１回または２回、または１２週間にわたって週１回または２回、皮下投与される。

薬力学および薬理作用効果は、同様のアッセイならびに、例えば血清ＩＧＦ−ＩおよびＧＨに有用である追加のアッセイを用いて実施例１に記載のように評価される。

治療は、所望の標的血清ＩＧＦ−Ｉ、および任意に、ＧＨレベルを実現するために、同じか、または増加もしくは低下した用量のソマバート、および同じか、または増加もしくは低下した用量のＡＴＬ１１０３を用いて継続され、同じか、または増加もしくは低下した投与頻度で投与される。

当業者であれば、広範に説明される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変形および／または修正が特定の実施形態に示されるように本発明に加えられてもよいことを理解する。したがって、本実施形態は、あらゆる点で説明するものであり、限定するものと見なされるべきではない。

本明細書で論じられ、かつ／または参照されるすべての出版物は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に包含される文献、行為、材料、デバイス、品物等のいずれの考察も、単に本発明に前後関係を提供するためである。本出願のそれぞれの特許請求の主張の優先日前に存在したため、これらの事柄のいずれかもしくはすべてが先行技術の基礎の一部を形成するか、または本発明の関連分野で共通の一般的知識であったと承認するもと見なされるべきではない。

参考文献
Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３−４１０
Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，Ｃｅｌｌ（１９８０）２２：６４９
Ｂｕｃｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｅｒｒ，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８１）１８２：１３７９−１３８４
Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８６）１３：４３３１
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：５１３３−５１４０
Ｃｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：５７６５
Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：８２１−８２５
ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５５：３０６−３１２
Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００１ａ）４１１：４９４−４９８
Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（２００１ｂ）１５：１８８−２００
Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１）３０：６１３
Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８５）８２：３６８８−３６９２
Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９１：８０６−８１１
Ｇｉｕｓｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ（２０１１）１４：１２５−１３３
Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８１：５４４
Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ （１９８５）３９：２４７
Ｇｕｏ ａｎｄ Ｋｅｍｐｈｅｕｓ，Ｃｅｌｌ（１９９５）８１：６１１−６２０
Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７：４０３０−４０３４
Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ（１９８１）１５：１６７−２７７
Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．（１９８２）１２：９８−１０５
Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９９５）７８：４８６−５０４
Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７０）５３：１５４
Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９８）９５：１５５０２−１５５０７
Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４，１４９７−１５００
Ｐｕｔｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０１０）６３：３１１−３１７
Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（１９８３）２２：５４７−５５６
Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：７８６２−７８６７
Ｔａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８２：４３０−４３１
Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９５：６９４−６９７
Ｔｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（２００１）２６３：１０２−１１２
Ｔｉｍｍｏｎｓ ａｎｄ Ｆｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９５：８５４
Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９９９）１３：３１９１−３１９７
Ｕｌｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）２２２：８６５−８
Ｕｌｔｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９３）２３１：１１３３−３６
Ｕｌｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）２３６：２８６−９９
ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ（２００１）３５８：１７５４−１７５９
Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）
Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５３：３−１１
Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８５）３４：３１５
Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ（１９８６）３１７：４１５
Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（１９９７）７：６４９−６５６
Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，（１９８７）１０：６４８７

Claims (35)

1. インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）レベルの上昇によって引き起こされる、および／またはそれに関連付けられる疾患の治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を阻害するように、前記ＧＨＲをコードする核酸を標的化する８〜８０個の核酸塩基の長さのオリゴヌクレオチドと組み合わせて成長ホルモン（ＧＨ）拮抗活性を有するＧＨ変異体を投与することを含み、それにより前記対象における前記ＩＧＦ−Ｉのレベルを低下させる、方法。
2. 前記疾患が、先端巨大症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、または前立腺、骨髄腫、肺、乳、もしくは結腸癌等のＩＧＦ−Ｉ陽性癌である、請求項１に記載の方法。
3. 対象におけるインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のレベルを低下させる方法であって、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の発現を阻害するように、前記ＧＨＲをコードする核酸を標的化する８〜８０個の核酸塩基の長さのオリゴヌクレオチドと組み合わせて、成長ホルモン（ＧＨ）拮抗活性を有するＧＨ変異体を投与することを含み、それにより前記対象における前記ＩＧＦ−Ｉのレベルを低下させる、方法。
4. 前記ＧＨ変異体が、アミノ酸Ｇｌｙ１２０が欠失しているか、またはあるアミノ酸で置換されているヒトＧＨ変異体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記アミノ酸Ｇｌｙ１２０が、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、およびＬｅｕから成る群から選択されるアミノ酸で置換される、請求項４に記載の方法。
6. 前記アミノ酸Ｇｌｙ１２０が、Ｌｙｓで置換される、請求項４に記載の方法。
7. 前記ヒトＧＨ変異体が、以下の組のアミノ酸置換をさらに含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法：
   Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔ。
8. 前記核酸が、ヒトＧＨＲをコードする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記核酸が、配列番号４または配列番号５で示される、請求項８に記載の方法。
10. 前記オリゴヌクレオチドが、１２〜５０個の核酸塩基の長さである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記オリゴヌクレオチドが、１５〜３０個の核酸塩基の長さである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記オリゴヌクレオチドが、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記オリゴヌクレオチドが、キメラオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記オリゴヌクレオチドが、前記ＧＨＲをコードする核酸と少なくとも７０％の相補性を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記オリゴヌクレオチドが、前記ＧＨＲをコードする核酸と少なくとも８０％の相補性を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記オリゴヌクレオチドが、前記ＧＨＲをコードする核酸と少なくとも９０％の相補性を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記オリゴヌクレオチドが、前記ＧＨＲをコードする核酸と少なくとも９５％の相補性を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９、８０、または８１の少なくとも８個の連続した核酸塩基部分を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９、８０、または８１の核酸塩基配列から成る、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６の核酸塩基配列から成る、請求項２１に記載の方法。
23. 前記オリゴヌクレオチドが、成長ホルモン受容体をコードする領域と特異的にハイブリッド形成し、前記領域が、翻訳開始コドン、終止コドン、コード領域、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、イントロン：エクソン接合部、またはエクソン：イントロン接合部を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記領域が、配列番号８４〜１５４から選択される配列の少なくとも８個の連続した核酸塩基部分を含む、請求項２２に記載の方法。
25. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４のヌクレオチド２６０〜３３９、３３２〜３５１、および３４４〜４２３から成る群から選択される配列番号４の領域に相補性である少なくとも８個の連続した核酸塩基部分を含む、請求項８〜１９のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記オリゴヌクレオチドが、ＧＨＲおよび／または成長ホルモン結合タンパク質（ＧＨＢＰ）の発現を少なくとも１５％阻害する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの２′−Ｏ−メトキシエチル糖部分を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項２７に記載の方法。
30. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの５−メチルシトシンを含む、請求項２７に記載の方法。
31. 前記オリゴヌクレオチドが２０個の結合されたヌクレオシドから成り、前記オリゴヌクレオチドが配列番号６の核酸塩基から成り、前記オリゴヌクレオチドが、１０デオキシヌクレオチドの領域の５’末端および３’末端の両方で５つの２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドと隣接した前記１０デオキシヌクレオチドの領域から成り、前記オリゴヌクレオチド中の各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、前記オリゴヌクレオチド中の各シトシンが、５−メチルシトシンである、請求項２７に記載の方法。
32. インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のレベルの上昇によって引き起こされる、および／またはそれに関連付けられる疾患の治療または予防のための薬物の製造における、成長ホルモン（ＧＨ）変異体ならびに成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）をコードする核酸を標的化する８〜８０個の核酸塩基の長さのオリゴヌクレオチドの使用。
33. 前記疾患が、先端巨大症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、または前立腺、骨髄腫、肺、乳、もしくは結腸癌等のＩＧＦ−Ｉ陽性癌である、請求項３２に記載の使用。
34. 対象におけるインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のレベルを低下するための薬物の製造における、成長ホルモン（ＧＨ）変異体ならびに成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）をコードする核酸を標的化する８〜８０個の核酸塩基の長さのオリゴヌクレオチドの使用。
35. 前記ＧＨ変異体が、請求項４〜７に記載の特徴のうちのいずれか１つをさらに特徴とし、前記ＧＨＲが請求項８もしくは請求項９に記載の特徴のうちのいずれか１つをさらに特徴とし、ならびに／または前記オリゴヌクレオチドが請求項１０〜３１に記載の特徴のうちのいずれか１つをさらに特徴とする、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の使用。