JPH11512298A - ヒト成長ホルモン変異体 - Google Patents

ヒト成長ホルモン変異体

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JPH11512298A JP9512814A JP51281497A JPH11512298A JP H11512298 A JPH11512298 A JP H11512298A JP 9512814 A JP9512814 A JP 9512814A JP 51281497 A JP51281497 A JP 51281497A JP H11512298 A JPH11512298 A JP H11512298A
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Abstract

(57)【要約】 成長ホルモン受容体に対する増大したアフィニティーを持つヒト成長ホルモン変異体を開示する。また、変異体のin vivo半減期を伸ばすと考えられる、ポリ(エチレングリコール)のような一つ以上の化学グループと接合されたヒト成長ホルモン変異体を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト成長ホルモン変異体 本出願は1995年9月21日に査定された出願番号08/537,067の一部継続出願であ り、1995年9月21日に査定された出願番号08/537,068の一部継続出願であり、そ れらの明細書は全体として参考としてここに取り込まれる。 発明の背景 発明の分野 本発明はヒト成長ホルモンの作用剤または拮抗剤としての使用のための特定の 成長ホルモン変異体及びそれらのペグ化形態に関する。 関連分野の説明 ヒト成長ホルモン(hGH)は正常なヒトの成長及び発達の調節の多くの面に関与 している。この22,000ダルトンの下垂体ホルモンは、伸長成長(体形成)、乳汁分 泌、マクロファージの活性化及びインスリン様と糖尿病誘発性効果、その他を含 むたくさんの生物学的効果を示す。Chawla,Annu.Rev.Med.,34:519(1983);Edward s等，Science,239:769(1988);Isaksson等,Annu.Rev.Physiol.,47:483(1985);Tho rnerとVance,J.Clin.Invest.,82:745(1988);HughesとFriesen,Annu.Rev.Physiol .,47:469(1985)。これらの生物学的効果はhGHと特定の細胞受容体間の相互作用 に由来する。子供における成長ホルモンの欠失は小人症を導き、それはここ十年 以上の間にhGHの外因性投与によりうまく治療されている。hGHの遺伝学的及び翻 訳後修飾形態の識別のため(Lewis,Ann.Rev.physiol.,46:33[1984])、hGHが臨床 的に投与される場合それに対する免疫学的応答を特性指摘するため、そしてホル モンの循環濃度を定量するため、hGHの抗原性にも興味が持たれている。 hGHは胎盤ラクトケン、プロラクチン及び成長ホルモンの他の遺伝学的そして 種変異体を含む相同のホルモンのファミリーのメンバーである。Nichol等,Endoc rine Reviews,7:169(1986)。hGHは広い種特異性を示し、クローン化された体形 成受 容体(Leung等,Nature,330:537[1987])またはプロラクチン受容体(Boutin等,Cell ,53:69[1988])のそれぞれに結合する点においてこれらの間では変わっている。h GHに対するクローン化遺伝子は、大腸菌において分泌型で発現されており(Chang 等,Gene,55:189[1987])、そのDNA及びアミノ酸配列が報告されている。Goeddel 等,Nature,281:544(1979);Gray等,Gene,39:247(1985)。ブタ成長ホルモン(pGH) に対する三次元ホールディングパターンが、並みの分解能と精製で報告されてい る。Abdel-Meguid等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:6434(1987)。hGHの受容体と抗 体エピトープが、本出願に対する優先出願及びCunningham等,Science,243:1330- 1336(1989)そしてCunninghamとWells,Science,244:1081-1085(1989)に記述され ているようなホモローグスキャニングミュータジェネシス及びアラニンスキャニ ングミュータジェネシスによって同定されている。 タンパク質-タンパク質界面の分子的詳細を示す多くの数の高分解能構造があ る(レビューとしてArgos,Protein Eng.,2:101-113[1988];Janin等,J.Mol.Biol., 204:155-164[1988];Miller,Protein Eng.,3:77-83[1989];Davies等,Annu.Rev.Bi ochem.,59:439-473[1990]参照)。これらは接触残基を定義するが、それらに対す るエネルギー論は定義せず、どのようにドッキングが生じているかも示さない。 会合と解離に影響する接触残基の役割の包括的な理解は分子的認識プロセスの基 本であり、合理的なタンパク質及び薬剤のデザインに対して特に重要である。 おそらく最もよく特性指摘されているホルモン-受容体複合体は、hGHとその受 容体(hGHbp)の細胞外ドメインの間のものである。レビューとして、WellsとDe V os,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,22:329-351(1993)参照。高分解能構造的 及び突然変異的分析(CunninghamとWells,上記参照;Cunningham等,Science,254:8 21-825[1999])そして構造的分析(De Vos等,Science,255:306-312[1992])により 、hGHの一分子がサイト1及びサイト2と呼ばれるホルモン上の独特の部位を用い て二つの受容体分子と連続的に結合することが示されている。 hGHの自然に生じている突然変異のメンバーが同定されている。これらにはhGH -V[Seeberg,DNA,1:239(1982);米国特許第4,446,235号、第4,670,393号及び第4,6 65,180号]及びhGHの32-46残基の欠失を含む20KhGHが含まれる。Kostyo等,Bioche m.Biophys.Acta,925:314(1987);Lewis等,J.Biol.Chem.,253:2679(1978)。 ある研究者は通常Cys-53とCys-165の間に存在するジスルフィド結合を破壊す るために、hGHの165位のシステインをアラニンに置換することを報告している。 Tokunaga等,Eur.J.Biochem.,153:445(1985)。この単一置換はhGHの三次元構造を 明らかに維持しhGHに対する受容体によって認識されるミュータントを提供した 。 また別の研究者は固体樹脂支持体上でのhGHのin vitro合成を報告している。 この研究者による第一の報告は、hGHに対する不正確な188アミノ酸配列を開示し た。Li等,J.Am.Chem.Soc.,88:2050(1966);米国特許第3,853,832号。第二の報告 は190アミノ酸配列を開示した。米国特許第3,853,833号。この後者の配列もまた 不正確である。特にhGHは68位の後に付加的なグルタミンを持ち、73位はグルタ ミンよりむしろグルタミン酸、106位はアスパラギンよりむしろアスパラギン酸 、108位はアスパラキン酸よりむしろアスパラギンを持つ。 以上に加えて、特定のモノクローナル抗体への結合を改変したハイブリッドイ ンターフェロンが報告されている。Peptides:Structure and Function,Proceedi ngs of the Ninth American Peptide Symposium,Deber等,編(Pierce Chemical C o.,Chicago,Ill.,1985),pp.375-384中のCamble等,"Properties of Interferon- α2 Analogues Produced from Synthetic Genes"。ここで開示されているように 、α-1インターフェロン由来の101-114アミノ酸残基またはγ-インターフェロン 由来の98-114アミノ酸残基をα-2インターフェロンに置換した。α-2インターフ ェロンはNK-2モノクローナル抗体を結合する一方α-1インターフェロンはしない 。α-1とα-2インターフェロンの間の27アミノ酸差異の7がこの領域に位置して いるので、α-2インターフェロンのこの特定の領域が明らかに選択された。伝え るところによればこう得られたハイブリッドはNK-2モノクローナル抗体との活性 を実質的に減少した。抗ウイルス活性をテストすると、該ハイブリッドは野生型 α-2インターフェロンの活性と同等な抗ウイルス活性を示した。これらの領域の 比較的小部分の置換もまた報告された。3から7アラニン残基のクラスターの連続 的な置換もまた提案された。しかしながら一つのアナログ[Ala-30,32,33]IFN-α 2のみが開示された。 ニワトリ卵白リゾチームの小ペプチド断片内のアラニン置換及び2A11または3A 9細胞の刺激に対する該置換の効果もまた報告されている。Allen等,Nature,327: 713-715(1987)。 他の者は結合性質が抗原結合ループ(Jones等,Nature,321:522-525[1986])また はDNA認識ヘリックスを含む二次構造の完全なユニットの置換によって操作し得 ることを報告している。Wharton等,Nature,316:601-605(1985)。 ヒスチジン18及びヒスチジン21を含むhGHのスプライシングを受ける配列を含 むアミノ末端メチオニルウシ成長ホルモン(bGH)の構造が示されている。米国特 許第4,880,910号。付加的なhGH変異体が本出願の優先出願及び1991年6月14日に 提出された共に継続している米国出願番号07/715,300と1991年8月9日に提出され た07/743,614と1992年6月11日印刷されたWO92/09690に記述されている。一つ以 上のアミノ酸でポリ(エチレングリコール)(PEG)に共有結合で付着されたGH部分 を持つhGH変異体もまた開示されており(1993年1月7日に印刷されたWO93/00109) 、それらの中にはPEG分子が41位のリシンに付着しているものもある。 GHと二つの受容体分子の間の1:2複合体二量体を開示するhGH変異体もまた1992 年11月26日に印刷されたWO92/21029に報告されている。その変異体はその天然の 構造において四つの両親媒性αヘリックスを含み連続的な順番で二つの部位を通 じてその受容体と結合するモノマーポリペプチドリガンドである。リガンドがGH である場合、もし一つは野生型ホルモンのN末端約15残基内にあり、もう一つは ヘリックスC内にある少なくとも2の残基でミューテーションが存在したならば、 この変異体はサイト1またはサイト2内に導入されたミューテーションを持ち、サ イト1はサイト1での受容体に対するリガンドのアフィニティーを増大するために ミューテートされる。 一価ファージディスプレー(Bass等,Proteins,8:309-314[1990])がhGHbpに対す るhGH内のサイト1のアフィニティーを改良するために用いられ得ることが以前に 示されている。Lowman等,Biochemistry,30:10832-10838(1991)。結合アフィニテ ィーの適度の改良(野生型hGHより3から8倍タイトな)をそれぞれがサイト1中の四 つの異なるコドンがミューテートされた三つの独立のライブラリーを分類するこ とによって生産された。サイト1に対する結合アフィニティーをわずかに促進さ れ、サイト2を結合する能力をブロックされたhGHミュータントは、単独のサイト 2ミュータントよりよりよいhGH受容体の拮抗剤であった。fuh等,Science,256:16 77-16 80(1992)。さらに先端巨大症のようなGH過多の病気を治療する点で有用性を持ち 得るさらによりよい拮抗剤を得るために、サイト1アフィニティーを改良するこ とが望ましいであろう。 サイト1アフィニティーにおける付加的な改良は、ライブラリー当たりさらに 多くの残基をミューテーションすることによって得られ得る。しかしながら約5 より多いコドンを同時に無作為化する場合、全ての可能な残基の組み合わせを表 すのを確認するのに十分なトランスフォーマントを生産するのは適しなかった。 LowmanとWells,Methods:Companion Methods Enzymol.,3:205-216(1991)。タンパ ク質-タンパク質界面でのミューテーションは通常結合に対して付加的な効果を 示す。Wells,Biochemistry,29:8509-8517(1990)。 アフィニティーにおいてさらにより大きい改良を得ることが望ましい。hGHとb GHのリシン残基が成長ホルモン受容体とのhGHとbGhの相互作用において関与して いることが開示されており、構造-機能関係において特に41,64,70及び115位のリ シンまたはアルキニン残基が関与していることが開示されている。Martal等,FEB S Lett.,180:295-299(1985)。ラジオリセプターアッセイによって減少した活性 を引き起こすために、メチル化、エチル化、グアニジン化及びアセトイミジン化 によってリシン残基が化学的に修飾された。 hGHとhGH変異体のin vivoでの効力をhGH受容体に対するアフィニティーによっ て、及び循環からのクリアランスの割合によって部分的に測定した。特定の他の 治療上のタンパク質のin vivoでの半減期が、タンパク質をPEGと接合することに よって増大されているが、それをここで「ペグ化」という。例えばAbuchowski等,J .Biol.Chem.,252:3582-3586(1977)参照。PEGはエチレン酸化物モノマー当たり3 個の水分子を持つ非免疫原性非電荷ポリマーとして典型的に特性指摘される。PE Gはペグ化タンパク質において増大した流体力学的ボリュームを提供することに よって腎クリアランスを遅らせると考えられている。Maxfield等,Polymer,16:50 5-509(1975)。ある研究では、Katreと共同研究者(Knauf,M.J.等,J.Biol.Chem.,3 63:15064-15070[1988];Goodson,R.J.& Katre,N.V.,Bio/Technology,8:343-346[1 990])は、PEG-インターロイキン-2のin vivoでの半減期が有効な分子量と共に増 大することを示した。加えてペグ化は特定の治療上のタンパク質の免疫原性と毒 性を減 少することが報告されている。Abuchowski等,J.Biol.Chem.,252:3578-3581(1977 )。 発明の概要 本発明は以下の一連のアミノ酸置換を含むヒト成長ホルモン(hGH)変異体を提 供する: H18D,H21N,R167N,K168A,D171S,K172R,E174S,I179T。 また以下の一連のアミノ酸置換を含むヒト成長ホルモン変異体が提供される: H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,K168A,E174A。 これらの置換はサイト1でのhGH受容体に対する結合アフィニティーを増大する。 これら一連のアミノ酸置換を含むhGH変異体は、サイト2でのhGH受容体に対する 結合を破壊する付加的な修飾の不存在下でhGH作用剤として機能する。 G120で異なるアミノ酸の置換は、サイト2結合を破壊する一つの修飾である。 したがってG120でのアミノ酸置換を含むhGH変異体はhGH拮抗剤として機能する。 本発明はG120アミノ酸置換が一連のサイト1アミノ酸置換の一つと結びついてい るhGH変異体を提供する。それゆえ一つの実施態様として、hGH変異体は以下の一 連のアミノ酸置換を含む: H18D,H21N,G120K,R167N,K168A,D171S,K172R,E174S,I179T(以下では「B2036変異 体」という)。 もう一つの実施態様として、hGH変異体は以下の一連のアミノ酸置換を含む: H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,G120K,K168A,E174A(以下では「B2024変異体」 という)。 本発明のさらなる一面として、核酸配列、ベクター、ホスト細胞及びこれらの hGH変異体の発現のためのプロセスが含まれる。 本発明はまたマススペクトロメトリーで測定されるような変異体の分子量(以 下では「真の分子量」という)を少なくとも約40キロダルトンに増大する一つ以上 の化学的グループと接合したhGH変異体を含む。一つの実施態様として、hGH変異 体をポリ(エチレングリコール)(PEG)のような一つ以上のポリオールに接合する 。またPEGに接合したhGH変異体の生産方法も提供される。 本発明のさらなる一面として、本発明の拮抗剤hGH変異体の有効量を患者に投 与 することを含む、患者における成長ホルモン機能を阻害するための方法がある。 図面の簡単な説明 図1Aと1BはBIAcoreTMバイオセンサーに結合した(S237C)hGHbpへのヒト成長ホ ルモン(hGH)または(G120R)hGHの結合に対する反応(図1A)及び速度論(図1B)を表 す。(S237C)hGHbpを1.2ng/mm2に相当する1220RU'sの濃度でチオール-デキストラ ンマトリックス(図1A)に固定化した。結合プロフィール実施例では(図1B)、hGH( 塗りつぶしていない印)または(G120R)hGH(塗りつぶした印)を、会合を追跡し化 学量論を計算する結合ホルモンの限界量を確立するために、飽和濃度(>200nM)で 注入した。飽和後、インジェクターループを解離を追跡するためにバッファーに 切り替えた(矢印で示されている)。 図2Aと2BはBIAcoreTMバイオセンサーに結合した(S201C)hGHbpへのhGH(塗りつ ぶしていない丸印)または(G120R)hGH(塗りつぶした丸印)の結合に対する反応(図 2A)及び速度論(図2B)を表す。(S201C)hGHbpを1480RU's(1.48ng/mm2)の濃度で固 定化した。結合コンディション及びプロフィールは図1Aと1Bのものと類似してい る。 図3はRIA(y軸)またはBIAcoreTMバイオセンサー(x軸)によって得られたデータ からhGHbpとの1:1複合体を形成した場合の、野生型hGHと相関的なhGHのアラニン ミュータントに対して計算された結合の自由エネルギー(ΔΔG(mut-wt))におけ る変化の相互間系を表す。値は表2から得られた。 図4Aと4Bは接触残基でのアラニンミュータントに対するオフーレート(図4A)ま たはオン-レート(図4B)における相対的変化を表す。データは表2から得られた。 図5Aと5Bはアラニン置換における結合アフィニティーの変化と隠れた表面エリ ア(Å2)の間の関係(図5A)またはβ炭素以外の接触側鎖における原子に対するフ ァンデルワールス接触の数(図5B)を表す。塗りつぶした丸印はサイト1で受容体 と水素結合または塩架橋を形成する界面で隠れた残基に対してであり、塗りつぶ していない丸印はそうでない残基に対してである。データは表2からプロットさ れている。 図6A,6B及び6Cはアラニンスキャニングミュータジェネシス、x線結晶構造また はファージディスプレーのそれぞれによって定義された受容体結合エピトープの 比較を表す。 図6AはhGHサイト1機能的エピトープを表す。アラニンスキャニングミュータジ ェネシスにしたがって、受容体結合に関与する残基はhGH(hGHbp)2結晶構造から 由来したhGHの画像モデル上に示されている。de Vos等,上記参照。アラニン置換 (またはK41の場合にはGln置換)の効果は、M14,H21,F54,E56,158,S62,N63及びY16 4を除いてBIAcoreTM速度論測定に基づいて示されている。これらの部位ではBIAc oreTMデータは入手可能ではないかまたは結合に対してごくわずかな効果を示す のみであり、故に示される効果はRIAデータに基づいている。結合自由エネルギ ー(ΔΔG)の変化は-RTln[Kd(Alaミュータント)/Kd(hGH)]として計算された。黒 い球は結合を改変する(ΔΔG=-1から-0.5kcal/モル)アラニン置換を示す。大き いサイズの4個の白い球はそれぞれ+0.5から1.0kcal/モル、+1.0から1.5kcal/モ ル、+1.5から2.0kcal/モルまたは+2.0から2.5kcal/モルまで結合エネルギーを減 少するアラニン置換を表す。 図6BはhGHサイト1構造的エピトープである。大きいサイズの4個の白い球はhGH (hGHbp)2X線結晶構造から計算されたようにアラニン置換による各残基でそれぞ れ-20から0Å2、0から20Å2、20から40Å2または40から60Å2の溶媒接近可能エ リアの変化を示す。 図6Cは無作為化されたファージミドライブラリーにおけるhGH残基の保存を表 す。ファージディスプレーされたhGHライブラリーにおいて一度に4位で無作為化 された残基が示されている:ヘリックス-1[F10,M14,H18,H21];ミニヘリックス-1[ K41,Y42,L45,Q46];Loop-A[F54,E56,I58,R64];ヘリックス-4A[K172,E174,E176,R1 78];ヘリックス-4B[R167,D171,T175,1179]。hGH結合のため分類した後の各位で 見出される野生型hGH残基の画分[ここ及びLowman等,上記参照で報告されるデー タ]は、黒い球のサイズによって示されている。最も小さい黒い球は0-10%保存さ れており、次に大きいものは10-25%保存されており、次に大きいものは25-50%保 存されており、最も大きいものは>50%保存されている。 図7は受容体結合アフィニティーを促進するファージ由来ミューテーションと 組み合わせるためのストラテジーを表す。最もよく選択されたものは野生型に対 するアフィニティーにおける倍化と共に示されている。これらの変異体のそれぞ れ で見出される野生型由来のミューテーションの数もまた示されている(例えば4mu ts.)。ヘリックス-1、ヘリックス-4、ミニヘリックス-1またはヘリックス1とヘ リックス2と連結したループにおけるそれぞれ4つのコドンで無作為化されたライ ブラリーが別々に分類された。Helix-4aで同定された2つのミューテーション(E1 74S/F176S)は他のヘリックス-4部位(Helix-4b;Lowman等,上記参照)での付加的な 無作為化と選択のためのバックグランドとして用いられた。Helix-1とHelix-4b において同定されたミューテーションをBD変異体を生産するために結び付けた;M inihelix-1とLoop-Aにおけるミューテーションを変異体852bを生産するために結 び付けた。最後にこれら二つの変異体由来のミューテーションを変異体852dを生 産するために結び付けた。 図8A,8B及び8CはそれぞれhGH構造的エピトープ、ファージ由来エピトープ及び 発展変異体の間の関係を表す。野生型hGH残基が受容体結合のために分類されたh GH-ファージミドプール(Lowman等,上記参照)において現れた頻度についての自然 対数がx軸に示されている。組み合わせたライブラリー由来のデータは示されな かった。logスケールは隠れた表面エリアとの比較から選択された。野生型残基 が選択されたライブラリーの全てにおいて見出されなかったので、残基M14,H18, K41,Q46,R167およびE174はこのグラフに現れていない。 図8AはhGH-(hGHbp)2のx線構造との比較を表す。受容体-1結合により隠れたhGH 残基の側鎖エリア([フリーhGH]-[hGH-hGHbp複合体]の溶媒接近可能エリア)がプ ロットされている。 図8Bはファージディスプレー及びアラニンスキャニングミュータジェネシスの 結果を表す。hGHにおけるAla置換の機能的効果がln[Kd(Alaミュータント)/Kd(hG H)]としてプロットされている。結合データは速度論データが入手できない場合 を除いて、BIAcoreTMバイオセンサー測定から得られた。これらの非接触残基(F1 0,F54,I58)に対して、ラジオ免疫沈降法アッセイから得られたKdに対する値を用 いた。Cunningham等,1989,上記参照。 図8Cは発展変異体の間の残基の保存を表す。ヒト胎盤ラクトゲン、hGH(20K)及 びhGH-Vと同様に、サル、ブタ、ゾウ、ハムスター、クジラ、アルパカ、キツネ 、ウマ、ヒツジ、ラット、カメ、ニワトリ、ミンク、ウシ、サケ、カエル及びマ ス 由来の成長ホルモンのアミノ酸配列(Genbank,vol.75,1993年2月)を野生型hGHの ものと比較した。プロラクチン発展変異体は含めていなかった。野生型hGH残基 がこれらの変異体の間に現れる頻度の自然対数がプロットされている。 図9はファージ由来ミューテーションの加法を開示する。野生型hGHのものに対 する結合の自由エネルギーの変化が構成要素ミューテーションに対するΔΔGの 和と比較された。示されているポイントは(1)変異体BD vs.[BプラスD];(2)変異 体852b vs.[ミニヘリックス-1プラスループ-A];(3)変異体BF vs.[BプラスF];及 び(4)変異体852d vs.[BDプラス852b]の組み合わせに相当する。エラーバーはエ ラー計算の広がりを用いて標準のズレから見積もった。Bevington,Data Reducti on and Error Analysis for the Physical Sciences,pp.56-65(McGraw-Hill,New York,1969)。示されている直線はy=-0.94+0.60x;R2=0.96である。 図10は実施例Ｖに記述されているような、本発明の拮抗剤hGH変異体(B2036変 異体)を発現するために用いられる例示的なベクターのためのプラスミドマップ を示す。 図11はアカゲザルにおけるインスリン様成長因子-Ｉ(IGF-Ｉ)濃度に対する本 発明の様々な拮抗剤hGH変異体の毎日の皮下注射(0.25mg/kg)の効果を示す。変異 体のペグ化および非ペグ化形態の両者がテストされた。実施例ＸIII参照。 図12はアカゲザルに静脈または皮下に注射されたペグ化拮抗剤hGH変異体(B203 6)調製物の単一投与薬力学を示す。拮抗剤効果はIGF-Ｉ濃度における減少パーセ ントとして測定された。実施例ＸIV参照。 好ましい実施態様の説明 変異体 ヒト成長ホルモン(hGH)のDNA及びアミノ酸配列が報告されている。Goeddel等 ，上記参照;Gray等,上記参照。本発明はアラニンスキャニング方法体系またはフ ァージミド選択法のそれぞれを用いて生産された新しいhGH変異体を記述する。 本発明のhGH変異体は野生型またはmethGHを発現可能ないかなる組換え系におい ても発現し得る。 変異体hGH配列表記は本発明のhGH変異体における現実のアミノ酸置換を定義す る。変異体に対して、置換は野生型残基を表す文字(一文字コードで)、野生型配 列のアミノ酸位置を示す数及び置換されたアミノ酸を示す第二の文字によって示 される。例えばR64KはArg64がLysに変換されたミューテーションを示す。複数の ミューテーションはコンマによって分割された一連の単一のミューテーションに よって示される。 アラニンスキャニングミューテーション 一つの実施態様として、本発明はここでポリペプチドとその受容体の相互作用 に関与するポリペプチド内の一つ以上の活性部位を検出するために、hGHの系統 的な分析を利用する。該分析は組換えDNA法を用いて簡便に実施される。一般的 にhGHをコードするDNAは便宜にホスト内でそれを発現するためにクローン化され 操作される。hGHをコードするDNAはゲノムライブラリー、hGHを発現する細胞内 のmRNAから由来するcDNA、または合成的に構築したDNA配列によって得られ得る 。Maniatis等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor La boratory,N.Y.(1982)。 それから野生型hGHDNAをホスト細胞をトランスフォームするために用いられる 適したプラスミドまたはベクター内に挿入する。原核生物はhGH変異体を生産す るためのDNA配列のクローニング及び発現にとって好ましい。例えば大腸菌B、大 腸菌X1776(ATCC No.31537)、及び大腸菌c600とc600hfl、そして大腸菌W3110(F-, γ-、原栄養株性、ATCC No.27325)、枯草菌のようなバチルス、及びネズミチフ ス菌または霊菌及び様々なシュードモナス種のような他の腸内細菌科と同様に、 大腸菌K12株294(ATCC No.31446)が用いられ得る。好ましい原核生物は大腸菌W31 10(ATCC 27325)である。原核生物の細胞内で発現される場合、hGHは典型的にN末 端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含み、グリコシル化されていない。培 地またはペリプラズム内の細胞外に発現される場合、hGHはN末端メチオニンを含 んでいない。これらの例はもちろん限定することよりもむしろ実例となることを 企図されている。 原核生物に加えて、酵母カルチャーのような真核生物細菌、または多細胞生物 由来の細胞が用いられ得る。原則として、いかなる該細胞カルチャーも実施可能 である。しかしながら興味は哺乳動物細胞において最大であり、カルチャー(組 織カルチャー)における哺乳動物細胞の増殖は再現可能な方法となっている。Tis sue Culture,Academic Press,KruseとPatterson,編者(1973)。該有用なホスト細 胞系の例として、VERO及びHeLa、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、W138、BHK 、COS-7及びMDCK細胞系がある。 一般的にホスト細胞と両立できる種由来の複製およびコントロール配列を含む プラスミドベクターがこれらのホストと連結して用いられる。ベクターはもとも と複製部位を運んでおり、トランスフォームされた細胞において表現型選択を提 供することが可能なタンパク質をコードする配列も同様である。例えば大腸菌は 大腸菌種由来のプラスミドであるpBR322を用いてトランスフォームされ得る。Ma ndel等,J.Mol.Biol.,53:154(1970)。プラスミドpBR322はアンピシリン及びテト ラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでおり、それゆえ選択のための容易な手 段を提供する。一つの好ましいベクターは本出願の優先出願(1989年10月26日に 提出されたU.S.S.N.07/428,066)の実施例1に記述されているpBO475である。この ベクターはファージ及び大腸菌のための複製のオリジンを含んでおり、それらは このベクターを該ホストの間で往復することを可能にし、それによってミュータ ジェネシスと発現を容易にする。「発現ベクター」とは適したホストにおいて上記 DNAの発現に影響することができる適したコントロール配列と実施可能にリンク したDNA配列を含むDNA構築物をいう。該コントロール配列には、転写に影響する ためのプロモーター、場合により該転写をコントロールするためのオペレーター 配列、適したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列及び転写と翻訳の終結を コントロールする配列が含まれる。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または 単純に潜在的なゲノム挿入物であり得る。一度適したホスト内にトランスフォー ムされると、ベクターはホストのゲノムとは独立に複製し機能し得、またはある 場合にはゲノム自身に入り込み得る。現在ではプラスミドが最も一般的に用いら れるベクターの形態であるので、本明細書においては「プラスミド」と「ベクター」 なる語は時々互換的に用いられる。しかしながら本発明は同等の機能を果たし、 本分野で既知であるまたは既知となる該他の形態の発現ベクターも含むことを企 図している。 2つのDNAまたはポリペプチド領域に間の関係を記述する場合に「実施可能にリ ンクしている」とはそれらがお互いに機能的に関与していることを意味する。例 えばもしフル配列がシグナル配列として機能し、タンパク質の成熟型形態の分泌 に関与し、大抵の場合にはシグナル配列の切断を含むのであれば、プレ配列はペ プチドと実施可能にリンクしている。もしプロモーターが配列の転写をコントロ ールするのであれば、プロモーターは配列と実施可能にリンクしている;もしリ ボソーム結合部位が翻訳を許すように位置しているのであれば、リボソーム結合 部位はコード配列と実施可能にリンクしている。 一度hGHがクローン化されると、部位特異的ミュータジェネシス(Carter等,Nuc l.Acids.Res.,13:4331[1986];Zoller等,Nucl.Acids Res.,10:6487[1987])、カセ ットミュータジェネシス(Wells等,Gene,34,315[1985])、制限選択ミュータジェ ネシス(Wells等,Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317:415[1986])または他の既 知の方法が、クローン化hGHDNAに対して、置換されている残基によって定義され るアミノ酸配列の変化のためにコードする変異体DNAを生産するために、実施さ れ得る。適した発現ベクターと実施可能にリンクされた場合、活性ドメイン置換 hGH変異体が得られる。ある場合にはhGH変異体の回収は、hGHの元のまたは変異 体をコードするDNA配列と実施可能にリンクした適したシグナル配列の使用によ って、発現ホストから該分子を発現し分泌させることによって容易にし得る。該 方法は当業者によく知られている。もちろん望ましいhGH変異体のin vitroの化 学的合成のような他の方法も該ポリペプチドを生産するために用いられ得る。Ba rany等,in The Peptides,E.GrossとJ.Meienhofer編,(Academic Press:N.Y.1979) ,vol.2,pp.3-254。 一度異なるGH変異体が生産されるとそれらは受容体と接触され、もし可能であ れば受容体と各変異体の間の相互作用が測定される。活性ドメイン中のどのアミ ノ酸残基が受容体との相互作用に関与しているかを決定するために、これらの活 性が同じ受容体との野生型hGHの活性と比較される。該分析で用いられるアミノ 酸のスキャニングは置換されたものと異なるアミノ酸のいくつかであり得る、す なわち19の他の天然に生じるアミノ酸のいくつかであり得る。 ターゲット受容体は天然のソースから単離され得または本分野で既知の方法に よって組換え法で調製され得る。実例として、受容体はMcFarland等,Science,24 5:494-499(1989)によって記述されている方法によって調製され得る。 受容体と元の及び変異体の間の相互作用はいかなる便宜なin vitroまたはin v ivoアッセイによっても測定され得る。それゆえin vitroアッセイは受容体とhGH の間のいかなる検出可能な相互作用を測定するためにも用いられ得る。該検出は 比色定量変化、放射性活性の変化、可溶性の変化、ゲル電気泳動及び/またはゲ ル排除法等で測定されるような分子量の変化の測定を含み得る。in vivoアッセ イは例えば体重増または電解質バランスにおける変化といった生理学的効果を検 出するアッセイを制限することなく含む。一般的にいかなるin vivoアッセイも 、可変的なパラメーターが興味ある受容体とhGHの間の相互作用における変化を 検出するために存在する限りで用いられ得る。 いくつもの数の分析的な測定が活性を比較するために用いられ得る一方、受容 体の結合のための簡便なものはhGH変異体と受容体の間で形成される複合体の解 離定数Kdであり、それを野生型hGHのKdと比較することである。一般的に置換に よって置換された類似の残基当たりのKdにおいて2倍の増大または減少は、置換 された残基(類)がターゲットとの野生型hGHの相互作用において活性であること を示す。 想像されるまたは既知のアミノ酸残基がアミノ酸分析のスキャニングにかけら れる場合、それらにすぐ近接したアミノ酸残基がスキャンされるべきである。3 残基置換ポリペプチドが作られ得る。一つは想像されるまたは既知の活性アミノ 酸であるN位でスキャニングアミノ酸、好ましくはアラニンを含む。他の2つはN+ 1位とN-1位でスキャニングアミノ酸を含む。もし各置換hGHが受容体に対するKd に対して約2倍より大きい効果を引き起こした場合、スキャニングアミノ酸はN+2 位とN-2位で置換される。少なくとも1つ、好ましくは4つの残基がKdに対して約2 倍より少ない効果をもつ各方向で同定されるかまたは野生型hGHのそれぞれの末 端に到達するまで、これが繰り返される。この方式では特定の受容体との相互作 用に関与する連続的なアミノ酸配列に沿って一つ以上のアミノ酸が同定され得る 。 アミノ酸スキャンによって同定された活性アミノ酸残基は、典型的には受容体 ターゲットと直接的に接触するものである。しかしながら活性アミノ酸はまた、 他の残基またはH2Oのような小分子またはNa+,Ca2+,Mg2+またはZn2+のようなイオ ン種と形成した塩架橋を通じてターゲットと間接的に接触し得る。 ある場合には、一つ以上の残基でのスキャニングアミノ酸の置換が受容体との その活性の分析を実施するのに十分な量の単離を許す濃度で発現されない残基置 換ポリペプチドを引き起こす。該場合には異なるスキャニングアミノ酸、好まし くは等配電子アミノ酸が用いられ得る。 好ましいスキャニングアミノ酸の中には、比較的小さく中性のアミノ酸がある 。該アミノ酸にはアラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。アラ ニンはβ-炭素以外の側鎖を除去し、変異体の主鎖構造を比較的改変しそうにな いので、アラニンはこのグループの中では好ましいスキャニングアミノ酸である 。アラニンは最も共通なアミノ酸であるので、アラニンはまた好ましい。さらに それは隠れた位置とさらされた位置の両方で頻繁に見出される。Creighton,The Ptoteins(W.H.Freeman & Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976)。もしア ラニン置換が十分な量のhGH変異体を生産しなかったら、等配電子アミノ酸を用 い得る。代わりに好ましさがこの順序で減少していく以下のアミノ酸を用い得る :Ser,Asn及びLeu。 一度活性アミノ酸残基が同定されると、等配電子アミノ酸が置換され得る。該 等配電子置換は全ての場合で生じる必要はなく、活性アミノ酸が同定される前に 実施され得る。該等配電子アミノ酸置換はいくつかの置換が引き起こし得る構造 に対する潜在的な破壊効果を最小化するために実施される。等配電子アミノ酸は 以下の表に示されている: 異なる活性ドメイン内の活性アミノ酸残基を検出するために本方法がここで用 いられ得る。一度この同定がなされると、野生型hGHに対する様々な修飾が元のh GHと一つ以上のターゲットの間の相互作用を修飾するためになされ得る。 特にhGHに対しては、本発明の例示は体形成受容体(hGHbp)との活性を決定する 活性ドメインと活性残基が同定される好ましい実施態様である。本発明のこの実 施態様を実施するにおいて、天然で生じているhGHと比較するとhGHbpとの異なる 結合相互作用を持つアミノ酸残基置換hGH変異体を含むhGH変異体が作製または同 定されている。いくつかはhGHbpに対するより高いアフィニティーとラットにお ける体形成のための促進された有効性を持ち得る。他のものはhGHbpとの減少し たアフィニティーを持つ。該hGH変異体はhGH作用剤または拮抗剤として有用であ り、もし該変異体がhGHbpとの実質的な相互作用から遊離しておれば、hGHに対す る他の受容体を刺激するためのより高い有効性を持ち得る。さらに、該変異体は hGHスタンダードまたはトレーサーとしてhGHのためのイムノアッセイにおいて有 用である。ある変異体は抗hGHポリクローナル抗体を含むヒト及びマウス血清と の反応性において有意な減少を持つものを同定し得る。他のものはhGHと同じhGH bpに対す る結合アフィニティーをもつが、成長を刺激する増大した有効性を持つ。 肝臓由来の体形成受容体と相互作用するhGHにとっての活性ドメイン及び残基 を決定する方法が本出願の優先出願(1989年10月26日に提出されたU.S.S.N.07/42 8,066)の図1に概略的に示されており、選択された部分が図2に示されている。 ファージミドディスプレー法 加えて変異体はファージミドディスプレーによって分析し得る。この方法は(a )hGHをコードする第一の遺伝子、天然のまたは野生型ファージコートタンパク質 の少なくとも一部をコードする第二の遺伝子を含み、第一と第二の遺伝子は異種 のものであり、そして第一と第二の遺伝子と実施可能にリンクした転写調節エレ メントを含み、それによって融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を形成し ;(b)第一の遺伝子内の一つ以上の選択された位置でベクターをミューテートしそ れによって関連するプラスミドのファミリーを形成し;(c)プラスミドを用いて適 したホスト細胞をトランスフォームし;(d)ファージコートタンパク質をコードす る遺伝子を持つヘルパーファージを用いてトランスフォームされたホスト細胞に 感染させ;(e)少なくともプラスミドの一部を含み、ホストをトランスフォームで きる組換えファージミド粒子を形成するために適したコンディションの下で、ト ランスフォームされ感染されたホスト細胞を培養し、コンディションを少量のフ ァージミド粒子だけが粒子の表面に融合タンパク質の一コピーより多くをディス プレーするように調節し;(f)少なくともファージミド粒子の一部が受容体分子に 結合するようにファージミド粒子をhGH受容体分子(hGHbp)を用いて接触させ;(g) 結合したファージミド粒子をしていないものと分離する工程より成る。好ましく はさらに本方法はhGHbpに結合する組換えファージミド粒子を用いて適したホス ト細胞をトランスフォームすることと(d)から(g)の工程を一度以上繰り返すこと を含む。 好ましくはこの方法においてプラスミドは転写調節エレメントのきついコント ロールの下にあり、粒子の表面に存在する融合タンパク質の一コピーより多くを ディスプレーするファージミド粒子の量または数が約1%より小さいように培養コ ンディションを調節する。また好ましくは融合タンパク質の一コピー以上をディ スプレーするファージミド粒子の量は融合タンパク質の単一コピーをディスプレ ーするファージミド粒子の量の10%より小さい。最も好ましくはその量は20%より 小さい。 この方法においては典型的には、さらに発現ベクターはポリペプチドの各サブ ユニットをコードするDNAと融合した分泌シグナル配列を含み、転写調節エレメ ントはプロモーター系である。好ましいプロモーター系はlacZ、λPL、tac、T7 ポリメラーゼ、トリプトファン及びアルカリホスファターゼそしてそれらの組み 合わせから選択される。また通常該方法はM13K07,M13R408,M13-VCS及びPhi X 17 4から選択されるヘルパーファージを用いる。好ましいヘルパーファージはM13K0 7であり、好ましいコートタンパク質はM13ファージ遺伝子IIIコートタンパク質 である。好ましいホストは大腸菌であり、大腸菌のプロテアーゼ欠失株である。 本発明の該方法によって選択される新しいhGH変異体が検出されている。ポリペ プチドとファージコートタンパク質をコードする核酸の間に機能的に位置してい る抑制的終止コドンを含むファージミド発現ベクターが構築された。 詳細には、hGH選択の繰り返されるサイクルが複数の選択サイクルのファージ ミド選択によって次第に高いアフィニティー結合のための選択に用いられる。リ ガンドポリペプチドにおける第一の領域またはアミノ酸を含むファージミド選択 の第一周に引き続いて、リガンドポリペプチドの他の領域またはアミノ酸におけ るファージミド選択のさらなる周が実施される。ファージミド選択のサイクルは リガンドポリペプチドの望ましいアフィニティー性質が達成されるまで繰り返さ れる。この工程を説明すると、hGHのファージミド選択はサイクルで実施された 。第一のサイクルでは、hGHのアミノ酸172,174,176及び178がミューテートされ ファージミドが選択され得る。第二のサイクルでは、hGHのアミノ酸167,171,175 及び179がファージミド選択され得る。第三サイクルでは、hGHのアミノ酸10,14, 18及び21がファージミド選択され得る。前のサイクルから任意のアミノ酸変化が 次の選択サイクルの前にポリペプチド内に取り込まれ得る。例えばhGHアミノ酸 置換174(セリン)及び176(チロシン)がhGHのアミノ酸167,171,175及び179のファ ージミド選択の前にhGH内に取り込まれた。 前述したことからhGHの結合ドメインを形成するアミノ酸残基は連続しておら ず、 ポリペプチドの異なるサブユニット上に属し得ることが認められよう。それは結 合ドメインが結合部位で特定の二次構造を形成し、一次構造ではないということ である。それゆえ一般的に、受容体との相互作用する可能性を持つためにポリペ プチドの内側から離れて向けられた部位で特定の二次構造内のアミノ酸をコード するコドンにミューテーションが導入される。hGH受容体への結合を強く調節す るhGHにおける残基の位置(Cunningham等,Science,1990,上記参照)が知られてい る。故にミュータジェネシスに適した代表的な部位はヘリックス-4上の残基172, 174,176及び178を含み、同様に「非順列」二次構造で位置する残基64を含むであろ う。 このファージミドディスプレー法では、一度hGH遺伝子が単離されると、Sambr ook等,Molecular Biology:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Col d Spring Harbor,New York 1989に一般的に記述されているように、それを増幅 のため適したベクター(好ましくはプラスミド)内に挿入し得る。いくつかのタイ プのベクターが入手可能であり本発明を実施するために用いられ得る一方、プラ スミドベクターは比較的容易に構築でき容易に増幅し得るので、プラスミドベク ターはここでの使用に好ましいベクターである。プラスミドベクターは一般的に プロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製のオリジン部位及び当業 者に既知である他の必要な構成要素を含む。 原核生物ベクターで最も共通に用いられるプロモーターはlacZプロモーター系 、アルカリホスファターゼphoAプロモーター、バクテリオファージλPLプロモー ター(lacリプレッサーによって調節されるハイブリッドtrp-lacプロモーター)、 トリプトファンプロモーター及びバクテリオファージT7プロモーターを含む。プ ロモーターについての一般的な記述はSambrook等,上記参照の第17章を参照。こ れらは最も広く用いられているプロモーターである一方で、他の適した微生物プ ロモーターも同様に使用し得る。 ファージミドディスプレーのために本発明を実施する上での好ましいプロモー ターは、融合遺伝子の発現がコントロールされるようにきつく調節され得るもの である。本分野で以前に認識されていなかった問題は、ファージミド粒子の表面 での融合遺伝子の複数のコピーのディスプレーがターゲットにファージミドの複 数点の付着を引き起こすことであると考えられている。ターゲットが「キレート 化」 されるため、融合タンパク質の複数コピーが互いに非常に近接してファージミド 粒子上にディスプレーされる場合、「キレート効果」といわれているこの効果は、 誤った「高アフィニティー」ポリペプチドの選択を引き起こすと考えられる。複数 点での付着が生じると、有効なまたは明らかなKdがディスプレーされた融合タン パク質の各コピーに対する個々のKdの産物と同じくらい高くなり得る。 ファージミド粒子の少量だけ、すなわち約1%より小さい量だけ融合タンパク質 の複数コピーを含むように融合タンパク質の発現をきつく調節することによって 、「キレート効果」を克服し、高アフィニティーポリペプチドの正確な選択を可能 にすることが開示されている。それゆえプロモーターに依存して、融合タンパク 質の単一コピーを含むファージミド粒子の数を最大化し、融合タンパク質の複数 コピーを含むファージミド粒子の数を最小化するために、ホストの培養コンディ ションを調節する。 本発明を実施するために用いられる好ましいプロモーターは、lacZプロモータ ーとphoAプロモーターである。lacZプロモーターはlacリプレッサータンパク質l aciによって調節され、それゆえ融合遺伝子の転写はlacリプレッサータンパク質 の濃度の操作によってコントロールされ得る。説明としてlacZプロモーターを含 むファージミドをlacZプロモーターに対するリプレッサーであるlaciリプレッサ ー遺伝子の単一コピーを含む細胞株内で成育させる。laci遺伝子を含む例示的な 細胞株にはJM101とXL1-ブルーが含まれる。代わりに、ホスト細胞をリプレッサ ーlaciとlacZプロモーターの両者を含むプラスミドを用いてコトランスフォーム し得る。場合により上記方法の両者を同時に用いる、つまりlacZプロモーターを 含むファージミド粒子をlaci遺伝子を含む細胞株内で成長させ、細胞株をlacZと laciの両者を含むプラスミドを用いてコトランスフェクトさせる。 通常遺伝子を発現したいと考えた場合、上記トランスフェクトされたホストに 対してイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)のようなインデューサーを加えるで あろう。しかしながら本発明においては、(a)遺伝子III融合タンパク質の発現を 最小化し、それによってコピー数(すなわちファージミド数当たりの遺伝子III融 合物の数)を最小化するために、及び(b)低濃度でさえIPTGのようなインデューサ ーによって引き起こされるファージミドの貧弱なまたは不適当なパッケージング を避 けるために、この工程は省略される。典型的にはインデューサーを加えないと、 ファージミド粒子当たりの融合タンパク質の数は約0.1である(ファージミド粒子 の数当たりの全部の融合タンパク質の数)。本発明を実施するために用いられる 最も好ましいプロモーターはphoAである。リン酸がプロモーターの活性をダウン レギュレーションするように機能する場合、このプロモーターは細胞内無機リン 酸の濃度によって調節されると考えられる。それゆえ細胞からリン酸を枯渇させ ることによって、プロモーター活性を増大し得る。望ましい結果は2YTまたはLB のようなリン酸リッチ培地内で細胞を成育させることによって達成され、それに よって遺伝子III融合物の発現をコントロールする。 本発明を実施するために用いられるベクターの他の有用な構成要素は、シグナ ル配列である。この配列は典型的には融合タンパク質をコードする遺伝子のすぐ 5'に位置し、それゆえ融合タンパク質のアミノ末端で転写される。しかしながら ある場合には、シグナル配列は分泌されるタンパク質をコードする遺伝子の5'以 外の場所に位置することが示されている。この配列は付着されたタンパク質が細 菌細胞の内膜を通過することを狙っている。シグナル配列をコードするDNAは、 シグナル配列を持つタンパク質をコードする遺伝子由来の制限酵素断片として得 られ得る。適した原核生物シグナル配列は例えばlamBまたはompF(Wong等,Gene,6 8:193[1983])、MalE、PhoA及び他の遺伝子から得られ得る。本発明を実施するた めの好ましい原核生物シグナル配列はChang等,上記参照によって記述されている ような大腸菌熱安定性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列である。 ファージディスプレー法を実施するために用いられるベクターのもう一つの有 用な構成要素は表現型選択遺伝子である。典型的な表現型選択遺伝子は、ホスト 細胞に対して抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードするものである。説明と して、アンピシリン耐性遺伝子(amp)及びテトラサイクリン耐性遺伝子(tet)がこ の目的にために容易に用いられる。 hGHをコードする遺伝子(遺伝子1)と同様に上述の構成要素を含む適したベクタ ーの構築は、Sambrook等,上記参照に記述されているような標準的な組換えDNA法 を用いて調製される。ベクターを形成するために結合されるための単離されたDN A断片は、望ましいベクターの生産のため特異的な順序及び配向で互いに切断さ れ、 調製され及び接合される。 DNAは適したバッファーにおいて適当な制限酵素または酵素類を用いて切断さ れる。一般的に約0.2-1μgのプラスミドまたはDNA断片が約20μlのバッファー溶 液において1-2ユニットの適当な制限酵素と共に用いられる。適当なバッファー 、DNA濃度およびインキュベーション時間と温度は、制限酵素の商品によって特 異的である。いくつかの酵素はより高い温度が必要であるが、一般的に37℃で約 1または2時間のインキュベーション時間で十分である。インキュベーション後、 酵素と他のコンタミネーションをフェノールとクロロホルムの混合物を用いて切 断溶液の抽出によって除去し、DNAをエタノールを用いた沈殿によって水溶性画 分から回収する。 機能的なベクターを形成するためDNA断片を互いにつなぐために、DNA断片の末 端は互いに適合していなければならない。ある場合には末端は制限酵素切断の後 直接的に適合している。しかしながら制限酵素切断によって広く生じる付着末端 をライデーションのために適合させるために平滑末端に最初に変換することは必 要であり得る。末端を平滑にするために、DNAを適したバッファー内で少なくと も15分15℃で10ユニットのDNAポリメラーゼＩ(Klenow)のKlenow断片を用いて、4 種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で処理する。それからDNAをフ ェノール-クロロホルム抽出とエタノール沈殿によって精製する。 切断されたDNA断片はDNAゲル電気泳動を用いてサイズ分離され選択される。DN Aはアガロースまたはポリアクリルアミドマトリックスのそれぞれで電気泳動し 得る。マトリックスの選択は分離されるDNA断片のサイズに依存する。電気泳動 後、DNAを電気溶出によって、Sambrook等,上記参照の6.30-6.33部分に記述され ているように、またはマトリックスとして低溶性アガロースを用いているならア ガロースを溶かしそこからDNAを溶出することによって、マトリックスから溶出 する。 互いにつながれるべきDNA断片(つながれる各断片の末端が適合するように前に 適切な制限酵素で切断されている)は、大体等モルの量で溶液中に置かれる。溶 液はまたATP、リガーゼバッファー及び0.5μgのDNA当たり約10ユニットのT4DNA リガーゼのようなリガーゼを含む。DNA断片がベクター内につながれるのであれ ば、ベクターは適当な制限酵素(類)を用いて切断することによって最初に直線化 される。 それから直線化ベクターをアルカリホスファターゼまたはウシ腸ホスファターゼ を用いて処理される。ホスファターゼ処理はライゲーション工程の間のベクター の自己ライゲーションを避ける。 ライゲーション後、それから挿入された外来遺伝子と共にベクターを適当なホ スト細胞内にトランスフォームする。原核生物が本発明のための好ましいホスト 細胞である。適した原核生物ホスト細胞は大腸菌JM101株、大腸菌K12株294(ATCC ナンバー31,446)、大腸菌W3110株(ATCCナンバー27,325)、大腸菌X1776(ATCCナン バー31,537)、大腸菌XL-1ブルー(Stratagene)及び大腸菌Bを含む;しかしながらH B101,NM522,NM538及びNM539のような多くの他の大腸菌の株及び多くの他の種そ して原核生物の属も同様に用いられ得る。上記挙げた大腸菌に加えて、枯草菌の ようなバチルス、ネズミチフス菌及び霊菌のような他の腸内細菌科、及び様々な シュードモナス種がすべてホストとして用いられ得る。 原核生物細胞のトランスフォーメーションはSambrook等,上記参照の1.82部分 に記述されているような塩化カルシウム法を用いて容易に成し遂げられる。代わ りに電気穿孔法(Neumann等,EMBO J.,1:841[1982])がこれらの細胞をトランスフ ォームするために用いられ得る。トランスフォームされた細胞tetまたはampを持 ち、ベクター上のtet及び/またはamp耐性遺伝子の存在のためそれらが耐性を示 すことによってそれらが抗生物質上の成育によって選択される。 トランスフォームされた細胞の選択後、これらの細胞はカルチャーで成育され 、それからプラスミドDNA(または外来遺伝子が挿入された他のベクター)が単離 される。プラスミドDNAは本分野で既知の方法を用いて単離され得る。2つの適し た方法はSambrook等,上記参照の1.25-1.33部分に記述されているようなDNAのス モールスケール調製及びDNAのラージスケール調製である。単離されたDNAはSamb rook等,上記参照の1.40部分に記述されているような本分野で既知の方法によっ て精製される。それからこの精製されたプラスミドDNAを制限酵素地図および/ま たはDNAシークエンシングによって分析する。DNAシークエンシングはMessing等, Nucleic Acids Res.,9:309(1981)の方法、Maxam等,Meth.Enzymol.,65:499(1980) の方法またはSanger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463-5467(1977)の方法のそ れぞれによって一般的に実施される。 ファージミドディスプレー法はここで融合タンパク質が転写の間生産されるよ うにhGHをコードする遺伝子(遺伝子1)を第二の遺伝子(遺伝子2)に融合すること を企図している。遺伝子2は典型的にはファージのコートタンパク質遺伝子であ り、好ましくはそれはファージM13遺伝子IIIコートタンパク質またはその断片で ある。遺伝子1と2の融合は遺伝子1を含むプラスミドの特定の部位に遺伝子2を挿 入することによって、または遺伝子2を含むプラスミドの特定の部位に遺伝子1を 挿入することによって成し遂げられ得る。 プラスミド内への遺伝子の挿入には、プラスミドが遺伝子を挿入すべき正確な 位置で切断されている必要がある。それゆえこの部分に制限酵素部位が存在して いなければならない(好ましくは制限酵素切断の間プラスミドが単一の位置だけ で切断されるような独特の部位が)。プラスミドは上述のように切断され、ホス ファターゼ処理され、精製される。それから遺伝子を2つのDNAを互いにつなぐこ とによってこの直線化プラスミド内に挿入する。プラスミドの末端が挿入される 遺伝子の末端と適合していたならば、ライゲーションを成し遂げられ得る。制限 酵素がプラスミドを切断し、平滑末端または付着末端を作り出すため挿入される 遺伝子を単離するために用いられるならば、Sambrook等,上記参照の1.68部分に 記述されているようにATPとリガーゼバッファーの存在下で16℃で1-4時間混合物 をインキュベートすることによってT4DNAリガーゼのようなリガーゼを用いてDNA を直接的に互いにつなぎ得る。末端が適合していないならば、それらは最初にDN AポリメラーゼＩのKlenow断片またはバクテリオファージT4DNAポリメラーゼを用 いて平滑にされなければならないが、両酵素共切断されたDNAの突出したシング ルストランド末端をうめるために4つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸を必 要とする。 代わりにヌクレアーゼS1またはマングビーンヌクレアーゼのようなヌクレアー ゼを用いて末端を平滑化しうるが、両酵素ともDNAの突出したシングルストラン ドを切除することによって機能する。それからDNAを上述したようなリガーゼを 用いて再ライゲーションする。ある場合には、コード領域のリーディングフレー ムが改変されるため、挿入される遺伝子の末端を平滑化することは可能でないか もしれない。この問題を克服するために、オリゴヌクレオチドリンカーが用いら れ得る。このリンカーはプラスミドを挿入される遺伝子と連結するための架橋と して 機能する。これらのリンカーは標準的な方法を用いてシングルストランドDNAま たはダブルストランドDNAとして合成的に作出され得る。該リンカーは挿入され る遺伝子の末端と適合する一つの末端を持つ;リンカーは上述したようなライゲ ーション方法を用いて最初にこの遺伝子とつながれる。リンカーの他の末端はラ イゲーションのためのプラスミドと適合するようにデザインされている。リンカ ーをデザインする場合、挿入される遺伝子のリーディングフレームまたはプラス ミドに含まれている遺伝子のリーディングフレームを破壊しないように気を付け なければならない。ある場合には、アミノ酸の一部に対してコードしているよう な、または一つ以上のアミノ酸に対してコードしているようなリンカーをデザイ ンすることが必要となり得る。 遺伝子1と遺伝子2の間に、終止コドンをコードするDNAを挿入し得、該終止コ ドンはUAG(アンバー)、UAA(オーカー)及びUGA(オパール)である。Davis等,Micro biology(HarperとRow:New York,1980),ページ237,245-247及び274。野生型ホス ト細胞で発現している終止コドンは遺伝子2タンパク質の付着なく遺伝子1タンパ ク質産物の合成を引き起こす。しかしながらサプレッサーホスト細胞での成育は 融合されたタンパク質の検出可能な量の合成を引き起こす。該サプレッサーホス ト細胞はmRNAの終止コドンの位置にアミノ酸を挿入するように修飾されたtRNAを 含み、それによって融合タンパク質の検出可能な量の生産を引き起こす。該サプ レッサーホスト細胞は大腸菌サプレッサー株のようによく知られており記述され ている。Bullock等,BioTechniques,5:376-379(1987)。融合ポリペプチドをコー ドするmRNA内に該終止コドンを置くためのいかなる許容される方法も用いられ得 る。 抑制可能コドンをhGH遺伝子とファージコートタンパク質の少なくとも一部を コードする第二の遺伝子の間に挿入し得る。代わりに抑制可能終止コドンをポリ ペプチド内の最後のアミノ酸トリプレットまたはファージコートタンパク質内の 第一のアミノ酸を置換することによって融合部位に近接して挿入し得る。抑制可 能コドンを含むファージミドがサプレッサーホスト細胞内で成育する場合、それ はhGHとコートタンパク質を含む融合ポリペプチドの検出可能な生産を引き起こ す。ファージミドが非サプレッサーホスト細胞内で成育する場合、UAG,UAAまた はUGAをコードする挿入された抑制可能トリプレットで終結するため、実質的に ファー ジコートタンパク質に融合していないhGHが合成される。非サプレッサー細胞内 では、ポリペプチドは、融合ファージコートタンパク質が不存在であるがそれに もかかわらずホスト細胞にそれを埋め込むために、ホスト細胞から合成され分泌 される。 hGH遺伝子は一つ以上の選択されたコドンで改変し得る。改変はhGHの非改変配 列または野生型配列と比較するとhGHのアミノ酸配列において変化を引き起こすh GHをコードする遺伝子内の一つ以上の置換、欠失または挿入として定義される。 好ましくは改変は分子の一つ以上の領域内で少なくとも一つのアミノ酸をいかな る他のアミノ酸を用いても置換することによる。改変は本分野で既知の様々な方 法によって提供され得る。これらの方法はオリゴヌクレオチド介在性ミュータジ ェネシス及びカセットミュータジェネシスを制限することなく含む。 オリゴヌクレオチド介在性ミュータジェネシスはhGHの変異体に置換、欠失ま たは挿入を調製するための好ましい方法である。本方法はZoller等,上記参照に よって記述されているように本分野でよく知られている。略記すると、テンプレ ートがhGHの非改変または野生型DNA配列を含むプラスミドのシングルストランド 形態である場合、hGH遺伝子はDNAテンプレートに望ましいミューテーションをコ ードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって改変される。ハ イブリダイゼーション後、テンプレートの完全な第二の相補的ストランドを合成 するためにDNAポリメラーゼを用い、それゆえオリゴヌクレオチドプライマーが 取り込まれhGH遺伝子内で選択された改変がコードされる。 一般的に長さにおいて少なくとも25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが用い られる。より小さいオリゴヌクレオチドも用いられ得るが、最適なオリゴヌクレ オチドはミューテーションをコードするヌクレオチド(類)の各サイドでテンプレ ートと相補的である12から15ヌクレオチドを持つ。これはオリゴヌクレオチドが シングルストランドDNAテンプレート分子に正確にハイブリダイズすることを確 定する。オリゴヌクレオチドはCrea等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:5765(1978) に記述されているもののように本分野で既知の方法を用いて容易に合成される。 DNAテンプレートはバクテリオファージM13ベクター(商業的に入手可能なM13mp 18及びM13mp19ベクターが適している)由来のもの、またはVieiraとMessing,Meth . Enzymol.,153:3-11(1987)に記載されているようなシングルストランドファージ の複製のオリジンを含むベクターのそれぞれであるベクターによってのみ生産さ れ得る。それゆえミューテートされるべきDNAはシングルストランドテンプレー トを生産するためにこれらのベクターの一つ内に挿入されなければならない。シ ングルストランドテンプレートの生産はSambrook等,上記参照の4.21-4.41部分に 記述されている。 野生型DNA配列を改変するため、オリゴヌクレオチドは適したハイブリダイゼ ーションコンディションの下でシングルストランドテンプレートにハイブリダイ ズされる。それからDNAポリメラーゼ酵素、通常はDNAポリメラーゼＩのKlenow断 片を、合成に対するプライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いるテンプレート の相補的ストランドを合成するために加える。それゆえDNAの一つのストランド はhGH遺伝子のミューテートされた形態をコードし、他のストランド(もともとの ストランド)はhGH遺伝子の野生型の非改変配列をコードするようなヘテロ二重鎖 が形成される。それからこのヘテロ二重鎖分子を適したホスト細胞、通常は大腸 菌JM101のような原核生物内にトランスフォームする。細胞が成長した後、それ らをアガロースプレート上にまき、ミューテートされたDNAを含む細菌コロニー を同定するため32-リン酸を用いてラジオラベルされたオリゴヌクレオチドプラ イマーを用いてスクリーニングする。 すぐ前に記述した方法は、プラスミドの両ストランドがミョーテーション(類) を含むホモ二重鎖分子を作出するように修飾し得る。修飾は以下のようになされ る:シングルストランドオリゴヌクレオチドを上述したようなシングルストラン ドテンプレートとアニールさせる。デオキシリボアデノシン(dATP)、デオキシリ ホグアノシン(dGTP)及びデオキシリボチミジン(dTTP)の3種のデオキシリボヌク レオチドの混合物を、dCTP-(aS)と呼ばれるチオ-デオキシリボシトシン(Amersha mから得られ得る)と組み合わせる。この混合物をテンプレート-オリゴヌクレオ チド複合体に加える。この混合物にDNAポリメラーゼを添加すると、ミューテー トされたベースを除くテンプレートに対して相同なDNAのストランドが生産され る。加えてこのDNAの新しいストランドはdCTPの代わりにdCTP-(AS)を含んでおり 、それは制限酵素切断からこのDNAを保護するために役立つ。ダブルストランド ヘテロ二重鎖 のテンプレートストランドに適当な制限酵素を用いてニックを入れた後、テンプ レートストランドをミュータジェナイズされた部位(類)を含む領域を通過してEx oIIIヌクレアーゼまたはもう一つの適当なヌクレアーゼを用いて切断し得る。そ れから部分的にだけシングルストランドである分子を引き離して反応を止める。 それから完全なダブルストランドDNAホモ二重鎖を全ての4種のデオキシリボヌク レオチド三リン酸、ATP及びDNAリガーゼの存在下でポリメラーゼを用いて形成さ せる。それからこのホモ二重鎖分子を上述したように大腸菌JM101のような適し たホスト細胞内にトランスフォームし得る。 置換された一つより多いアミノ酸を持つミュータントをいくつかの方法の一つ で生産し得る。アミノ酸がポリペプチド鎖において互いに近接して位置している ならば、望ましいアミノ酸置換の全てをコードする一つのオリゴヌクレオチドを 用いて同時にミューテートし得る。しかしながらアミノ酸がそれぞれからいくら か離れて位置している場合には(約10アミノ酸より多くによって分離されている) 、望ましい変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを生産することは さらに困難である。その代わりに二つの代わりの方法の一つが用いられ得る。 第一の方法では、置換される各アミノ酸に対して別々のオリゴヌクレオチドを 生産する。それからオリゴヌクレオチドをシングルストランドテンプレートDNA に同時にアニールさせ、テンプレートから合成されるDNAの第二のストランドは 望ましいアミノ酸置換の全てをコードする。代わりの方法は望ましいミューテー ションを生産するためにミュータジェネシスの2周以上を含む。1周目は単一のミ ューテーションのために記述されたようなものである:野生型DNAをテンプレート として用い、第一の望ましいアミノ酸置換(類)をコードするオリゴヌクレオチド をこのテンプレートにアニールさせ、それからヘテロ二重鎖DNA分子を生産する 。ミュータジェネシスの2周目はテンフルートとしてミュータジェネシスの第1周 で生産されたミューテートされたDNAを利用する。それゆえこのテンプレートは 一つ以上のミューテーションを既に含んでいる。それから付加的な望ましいアミ ノ酸置換(類)をコードするオリゴヌクレオチドをこのテンプレートにアニールさ せ、その結果として生じるDNAのストランドはミュータジェネシスの第1周と第2 周の両者由来のミューテーションをコードする。この結果として生じるDNAをミ ュータジェネ シスの第3周においてテンプレートとして用いうる、以下同様である。 カセットミュータジェネシスもまたhGHDNAの置換、欠失及び挿入変異体を調製 するために好ましい方法である。本方法はWells等,Gene,上記参照に記述された ものに基づいている。スタート時の物質はミューテートされるhGH遺伝子を含む プラスミド(または他のベクター)である。ミューテートされるhGH遺伝子のコド ン(類)を同定する。場合により同定されたミューテーション部位(類)の各サイド に独特の制限酵素部位が存在する;しかしながらこれは必要条件ではない。もし 該制限部位が存在しないならば、hGH遺伝子に適当な位置でそれらを導入するた めに、上述したオリゴヌクレオチド介在性ミュータジェネシスを用いて該制限部 位を生産し得る。制限部位をプラスミド内に導入した後に、プラスミドを直線化 するためにこれらの部位で切断する。制限部位間にDNAの配列をコードするが望 ましいミューテーション(類)を含むダブルストランドオリゴヌクレオチドを標準 的な方法を用いて合成する。2つのストランドを別々に合成し、それから標準的 な方法を用いて互いにハイブリダイズさせる。このダブルストランドオリゴヌク レオチドをカセットという。このカセットをそれをプラスミドに直接的につなげ るように、直線化プラスミドの末端と適合する3'と5'末端を持つようにデザイン する。そこでこのプラスミドはhGHのミューテートされたDNA配列を含む。 受容体分子を調製しそれをファージミドと結合するために、精製した受容体を アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々な アクリル酸コポリマー、ヒドロキシアルキルメタクリレートゲル、ポリアクリル 酸、ポリメタクリル酸コポリマー、ナイロン、中性でイオン性キャリアー等のよ うな適したマトリックスに付着させる。マトリックスへの受容体の付着はMeth.E nzymol.,44:(1976)に記述されている方法によって、または本分野で既知の他の 方法によって成し遂げられ得る。 マトリックスへの受容体の付着の後、固定化したターゲットとファージミド粒 子の少なくとも一部の結合に適したコンディションの下でファージミド粒子のラ イブラリーと固定化したターゲットを接触させる。通常はpH、イオン強度、温度 等を含む該コンディションは生理的コンディションをまねる。 固定化した受容体に対して高アフィニティーを持つ結合ファージミド粒子(「バ インダー」)を洗浄によって低アフィニティー(そしてそれによって受容体に結合 していない)を持つものから分離する。バインダーは様々な方法によって固定化 したターゲットから解離し得る。これらの方法には野生型リガンドを用いた競合 的解離、pH及び/またはイオン強度の改変及び本分野で既知の方法が含まれる。 適したホスト細胞をバインダー及びヘルパーファージを用いて感染し、ホスト 細胞をファージミド粒子の増幅に適したコンディションの下で培養する。それか らファージミド粒子を集め、ターゲット分子に対する望ましいアフィニティーを 持つバインダーを選択するまで選択工程を一度以上繰り返す。 場合によりファージミド粒子のライブラリーを一つの特定の受容体より多くと 連続的に接触させ得る。それゆえhGHは一つの天然の受容体より多くを持つ:GH受 容体とプロラクチン受容体である。プロラクチン受容体に優先してGH受容体に対 するhGHの選択性を改変することが望ましいであろう。これは最初に固定化したG H受容体を用いてファージミド粒子のライブラリーを接触させ、溶液中に大変高 濃度のプロラクチン受容体の存在下で結合が生じることを許容し、バインダーを 選択することによって成し遂げられ得る。この場合、GH受容体に対するアフィニ ティーが野生型hGHのものより幾分低い場合でさえ、プロラクチン受容体に対す る低アフィニティーを持つhGHミュータントが治療上の有用性を持つであろう。 hGH変異体の生産 本発明のhGH変異体は標準的な組換え法によって簡便に生産し得る。最も特異 的には、hGH変異体はアラニンスキャニングの議論で上述したようなベクター-ホ スト細胞系を用いて発現し得る。 一つの実施態様として、本発明のファージミドをファージタンパク質の存在し ないhGH変異体を生産するために用いる。例えばpSO643及び誘導体は16C9のよう な非サプレッサー株において簡単に成長させ得る。この場合、アンバーコドン(T AG)が翻訳の終結を導き、遊離のホルモンを生ずる。hGH変異体をホスト細胞から 分泌させ、以下に記述するようにカルチャー培地から単離し得る。 hGH変異体発現ベクターを含むホスト細胞を細胞成長とhGH変異体の発現に適し たコンディションの下で培養する。特にカルチャー培地はホスト細胞が用いるの に適当な栄養素と増殖因子を含む。選択されるホスト細胞の成長に必要とされる 栄養素と増殖因子は、多くの場合よく知られており当業者によって経験的に容易 に決定され得る。哺乳動物ホスト細胞に対する適した培養コンディションは、例 えばMammalian Cell Culture(Mather,J.P.等,編,Plenum Press 1984)及びBarnes とSato,Cell,22:649(1980)に記述されている。 加えて培養コンディションは転写、翻訳及び細胞区画の間でのタンパク質輸送 を許容すべきである。これらのプロセスに影響する因子はよく知られており、例 えばDNA/RNAコピー数;RANを安定化する因子;培地中に存在する栄養素、サプリメ ント及び転写インデューサーまたはリプレッサー;培地の温度、pH及び浸透度;及 び細胞密度が含まれる。特定のベクター-ホスト細胞系において発現を促進する これらの因子の調節は当業者の範囲内にある。 本発明のhGH変異体の生産に用いられる細胞培養法は、タンパク質の大規模ま たは小規模生産のための多くのよく知られた方法のいかなるものであってもよい 。これらには以下のものの使用が制限されることなく含まれる:流動化ベッドバ イオリアクター、空洞ファイバーバイオリアクター、ローラーボトルカルチャー システム及び撹拌タンクバイオリアクターシステム。hGH変異体は例えば、バッ チ、フェドバッチまたは継続的モードプロセスで生産され得る。 上記のように生産された組換えタンパク質の回収法はよく知られており、用い られる発現系に依存して変化する。例えば、もし典型的にはそうであるが、発現 ベクターが単一の配列を含んでいれば、hGH変異体は培地またはペリプラズムか ら回収される。簡便には、変異体は十分にプロセシングされたタンパク質(すな わち分泌シグナル配列を欠いている)としてペリプラズム空間に分泌される。し かしながらhGH変異体は細胞内にも発現し得、細胞溶解物からも回収し得る。 hGH変異体は変異体をホスト細胞の構成要素または培地から分離可能ないかな る方法によっても培地または細胞溶解物から精製し得る。典型的にはhGH変異体 は、もし必要であれば、またはhGH変異体を診断用途にまたは治療用途に用いる ならば、ペグ化に抵触するであろうホスト細胞及び/または培地構成要素から分 離される。 第一の工程として、培地または細胞溶解物は通常細胞破片を除去するため遠心 分離され、濾過される。それから典型的には上清を望ましい量に濃縮または希釈 し、さらなる精製のため調製物のコンディションを整えるために適したバッファ ーにダイアフィルター(diafilter)する。hGH変異体のさらなる精製は典型的には 、完全な形態のものからhGH変異体の脱アミド化形態及び短縮形態を分離するこ とを含む。例えば、完全なhGH変異体は、N末端フェニルアラニンを欠失している des-phe-hGH変異体から分離され得る。 この実施態様の一つのバリエーションとして、hGH変異体は(1)スピニングカッ プシークエンサーを用いて少なくとも15残基のN末端または内部のアミノ酸を得 るのに十分な程度に、(2)Coomassieブルー染色を用いて非還元または還元コンデ ィションの下でのSDS-PAGEによって均質な程度に精製される。 以下の例示的な方法のいかなるものも、hGH変異体の精製に用いられうる:アフ ィニティークロマトグラフィー;アニオン-またはカチオン-交換クロマトグラフ ィー(例えばDEAE SEPHAROSEを用いて);シリカ上でのクロマトグラフィー;メタル キレートクロマトグラフィー;超濾過/ダイアフィルトレーション(ultrafiltrati on/diafiltration);エタノール沈殿;硫酸アンモニウム沈殿;クロマトフォーカシ ング;及び置換クロマトグラフィー。アニオン交換クロマトグラフィー及び疎水 性インターラクションクロマトグラフィーの組み合わせを用いる、hGH変異体(B2 036及びB2024)の精製の例示的なプロトコールは実施例Ｖ及びVIに示されている 。 hGH変異体の修飾 本発明は一つ以上の化学的なグループと共有結合で付着した(以下では「接合し た」という)hGH変異体を提供する。該接合は非修飾hGH変異体より大きい現実の分 子量を持つhGH変異体接合物を生産する。ここで用いられているように、「現実の 分子量」なる語はマススペクトロメトリー(例えばマトリックスアシステッドレー ザー脱着イオン化マススペクトロメトリー)によって測定されるような分子量を いう。hGH変異体接合物の現実の分子量は通常少なくとも約30kDである;好ましく は約35kDから約55kDの範囲である;そしてより好ましくは約40kDから約50kDの範 囲である。一般的にhGH変異体接合物の現実の分子量は100kDを越えない。 本発明のhGH変異体接合物の使用に対して適した化学的グループは、好ましく は有意に毒性ではなく免疫原性ではないものである、すなわちhGH変異体接合物 で観 察されるいかなる毒性または免疫原性も、相当する非修飾hGH変異体より有意に 大きくない(すなわち50%より低い)。典型的には化学的グループは非修飾hGH変異 体に関連する毒性及び/または免疫原性を減少するものから選択される。加えて 、化学的グループは非修飾hGH変異体の貯蔵および使用に適したコンディション の下で、貯蔵され使用され得るhGH変異体接合物を生産するために適宜に選択さ れる。例示的な化学的グループとしては、例えば糖タンパク質で天然に生じてい る炭水化物のような炭水化物、及びポリオールのような非タンパク質性ポリマー が含まれる。 ポリオールは例えばWO93/00109,上記参照に記述されているように、リシン残 基を含む一つ以上のアミノ酸でhGH変異体分子に接合され得る。用いられるポリ オールはいかなる水溶性ポリ(アルキレン酸化物)ポリマーでもあり得るし、直鎖 状または分枝状の鎖を持っていてもよい。適したポリオールには、1と4の間の炭 素を持つアルキル基のような化学的グループで、一つ以上の水酸基の位置が置換 されているようなものも含まれる。典型的にはポリオールはポリ(エチレングリ コール)のようなポリ(アルキレングリコール)であり、それゆえ記述を簡単にす るために、本義論の残りの部分は、用いられるポリオールはPEGであり、hGH変異 体にポリオールを接合する工程を「ペグ化」と呼ぶ例示的な実施態様に関する。し かしながら当業者には、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン- ポリプロピレングリコールコポリマーのような他のポリオールも、PEGに対して ここで記述されている接合に対する方法を用いて使用し得ることは認識される。 PEGの平均的な分子量は約500から約30,000ダルトン(D)の範囲であり得る;好ま しくは約1,000から約20,000Dの範囲である;そしてより好ましくは約4,000から約 20,000Dである。一つの実施態様として、ペグ化は約5,000Dの平均分子量を持つP EGを用いて実施される(以下では「PEG(5000)」という)。以下の記述と実施例VIIの ように、反応コンディションは約4と約6の間のPEG(5000)分子が接合したhGH変異 体分子の生産を最大化するように調節される。もう一つの実施態様では、一分子 のPEG(20,000)が接合したhGH分子の生産を最大化するように調節されたコンディ ションの下で、ペグ化が約20,000の平均分子量を持つPEGを用いて実施される。 実施例VIII参照。この実施態様のバリエーションでは、それぞれ約10,000Dの二 つの鎖を持つ分枝状鎖PEGが用いられる。実施例IX参照。 商業的に入手可能であり、本発明の使用に適したPEG調製物は、平均分子量に したがって販売されている不均質調製物である。例えばPEG(5000)調製物は典型 的には通常±500Dの分子量のわずかに変化している分子を含む。 タンパク質をペグ化するための様々な方法が記述されている。例えば、生理的 に活性な非免疫原性構成物を生産するためにPEG及びポリプロピレングリコール にたくさんのホルモン及び酵素を接合することを開示する米国特許第4,179,337 号(Davis等により提出された)参照。一般的に少なくとも一つの末端水酸基を持 つPEGは、末端反応基を持つ活性化されたPEGを形成するためにカップリング試薬 を用いて反応される。それからこの反応基は共有結合を形成するためにタンパク 質のα-及びε-アミンを用いて反応し得る。適宜に、PEG分子の他方の末端をタ ンパク質分子のPEG架橋複合体の形成を減少するために、メトキシ基のような非 反応性化学グループを用いて「ブロック」し得る。 hGH変異体のペグ化にとって、活性化されたPEGはサイト1結合活性を破壊しな いコンディションの下で変異体と反応し得るものである。hGH変異体にとって、 サイト2結合活性もまた保存されていなければならない。さらに作用剤及び拮抗 剤hGH変異体にとって、接合体に毒性リンキンググループを導入する活性化PEGは 通常避けられる。 適した活性化PEGは、たくさんの適宜な反応によって生産し得る。例えばPEGの N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(M-NHS-PEG)をBuckmannとMerr,Makromol.C hem.,182:1379-1384(1981)の方法にしたがって、N,N'-ジシクロヘキシルカルボ ジイミド(DCC)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を用いた反応によって、PE G-モノメチルエーテル(Union Carbideから商業的に入手可能である)から調製し 得る。 加えて、PEG末端水酸基を例えばPEG-Brを形成するために臭化チオニルを用い た反応、それに引き続くPEG-NH2を形成するために過度のアンモニアを用いたア ミノリシスによって、アミノ基に変換し得る。それからPEG-NH2をWoodward's Re agent Kのような標準的なカップリング試薬を用いて、興味あるタンパク質に接 合する。さらにPEG末端-CH2OH基を例えばMnO2を用いた酸化によって、アルデヒ ド基に変換し得る。アルデヒド基をシアノボロハイドライドのような試薬を用い て還元アルキル化によって、タンパク質に接合する。 代わりに、本発明の使用に適した活性化PEGをたくさんの業者から購入し得る 。例えば、Shearwater Polymers,Inc.(Huntsville,AL)は、メトキシ-PEGのスク シンイミジルカルボネート(「SC-PEG」)及びメトキシ-PEGスクシンイミジルプロピ オネート(「SPA-PEG」;以下ではメトキシブロッキンググループの存在を示すため に「M-SPA-PEG」として示す)に加えて、「SCM-PEG」としてM-NHS-PEGを販売している 。B2036変異体をペグ化するためのM-SPA-PEGの使用は、実施例VII及びVIIIに示 されている。Shearwater Polymersはまた、二つの10,000D鎖を持つ分枝状鎖PEG( 以下では「NHS-PEG2(20,000)」という)も販売しており、その使用は実際例IXに記 述されている。 本発明のhGH変異体のペグ化の程度は、相当する非ペグ化タンパク質と比較し て、望ましく増大されたin vivo半減期(以下では「半減期」という)を提供するよ うに調製され得る。ペグ化hGH変異体の半減期は、ペグ化の程度の増大と共に典 型的には増大すると考えられている。ペグ化野生型hGHの研究において、二つのP EG(5000)を含む野生型hGH接合物は非ペグ化タンパク質より約4倍長い半減期を持 ち、五つのPEG(5000)を含む接合物は約11倍長い半減期を持ち、そして七つのPEG グループを含む接合物は約18倍長い半減期を持つことが出願類によって観察され ている。それらのPEG野生型hGH接合物の現実の分子量は、非ペグ化タンパク質の 22kDに比較すると、それぞれおよそ33,48及び57kDであった。 ペグ化が比較的高い程度では、ペグ化hGH変異体の半減期の増大はサイト1アフ ィニティーの減少を示すサイト1結合に対する解離定数(Kd)の増大によって部分 的に相殺されると考えられる。このアフィニティーの減少は、相当する有効性の 減少によって伴われており、その有効性は50%最大の効果(EC50)に必要とされる 接合物の濃度の増大で反映される。PEG(5000)を用いてペグ化された野生型hGHの 研究では、二つのPEG(5000)グループを含む接合物は非ペグ化タンパク質より細 胞ベース二量体化アッセイにおいて約3倍低い有効性を持ち、五つのPEG(5000)グ ループを含む接合物は約170倍低い有効性を持ち、七つのPEG(5000)を含む接合物 は約1500倍低い有効性を持つ。 サイト1結合は本発明の作用剤及び拮抗剤hGH変異体に対して本質的なものであ るため、増大したペグ化は両タイプのhGH変異体の有効性を減少する。しかしな がら、半減期の増大はペグ化hGH変異体のin vivo効力が相当する非ペグ化タンパ ク 質で観察されるものと比較可能である、またはそれよりもよいと現在では考えら れるために一般的に有効性の減少を補う。したがって、当業者は、非ペグ化タン パク質と比較して望ましい増大した半減期を持ち、未だin vivoで効力のある十 分な有効性を維持した接合物を生産するために、hGH変異体に対するペグ化の適 した程度を容易に決定し得る。 通常半減期は、少なくとも約5倍増大する;好ましくは少なくとも約10倍;より 好ましくは少なくとも約50倍;そして最も好ましくは少なくとも約100倍増大する 。加えてペグ化の程度及び部位は、PEG-hGH変異体接合物がSpencer等,J.Biol.Ch em.,263:7862-7867(1988)に記述されているような平衡結合アッセイによって測 定したところ、典型的には約400nM以下のKdで;好ましくは150nM以下のKdで;そし て最も好ましくは100nM以下のKdでサイト1でhGH受容体を結合することが可能で あるようなものである。 本発明の作用剤PEG-hGH変異体はサイト1と同様にサイト2でも結合可能であり 、それゆえhGH受容体を二量体化する。二量体化能力は例えばCunningham等,Scie nce,254:821-825(1991)の方法にしたがって蛍光のホモクエンチングによって、 またはFuh等,Science,256:1677-1680(1992)及び実施例ＸＩとＸIIに記述されて いるような細胞ベース二量体化アッセイにおいて測定し得る。適宜にFuh等の細 胞ベース二量体化アッセイにおいて測定されるようなペグ化作用剤hGH変異体に 対するEC50は、約100nM以下であり、より好ましくは約50nM以下である。(おそら く利用可能なhGH受容体の画分だけが最大の応答を引き出すために二量体化され ることが必要とされるので、EC50は典型的にはKdより低い。)これらの特徴にあ ったペグ化hGH変異体は少なくとも約40kDの現実の分子量を持つ。接合体の例と しては、1分子のhGH変異体当たり約4から6、そして好ましくは5分子のPEG(5000) を持つ接合物が含まれ、1分子のhGH変異体当たり1分子のPEG(20,000)を持つ接合 物が含まれる。 タンパク質のペグ化の程度及び部位は、(1)ペグ化部位の数及び反応性(すなわ ち第一級アミン)そして(2)ペグ化反応コンディションによって決定される。野生 型hGHは活性化PEGと反応するために理論的には入手可能な10の第一級アミンを含 む:N末端フェニルアラニンのα-アミノ基及び9のリシンのε-アミノ基。しかし ながらhGH及びhGH変異体における第一級アミンのいくつかは比較的非反応性であ り、 標準的なペグ化反応は典型的には完全なペグ化より少ないものを引き起こす(例 えば、野生型hGHの1分子当たり7から8PEG)。 タンパク質のペグ化の部位はまた、様々な第一級アミンの反応性によっていく ぶん拘束される。例えばB2036変異体(K41)のサイト1ホルモン-受容体結合界面に おける潜在的なリシンは、M-SPA-PEG(5000)に対して比較的非反応性である。実 施例Ｘ参照。それゆえ変異体分子当たりおよそ4から6のPEGを持つ、穏やかにペ グ化されたB2036変異体調製物は、サイト1結合界面に潜在的なペグ化部位が存在 しているのにも関わらず、サイト1でhGH受容体を結合する能力を維持している。 標準的なミュータジェネシス法をタンパク質中のリシンの数を改変するために 用い得る。それゆえアミノ酸置換がリシンを導入または除去する範囲に対して、 本発明のhGH変異体は野生型hGHより多いまたは少ない潜在的なペグ化部位の数を 含む。B2036変異体は野生型hGHより一つ少ない9の潜在的なペグ化部位を含み、 一方B2024変異体は10の潜在的な部位を含む。 さらにリシンを導入または除去するアミノ酸置換は潜在的なペグ化部位の位置 を改変する。例えばB2036変異体では、K168A及びK172Rの置換はホルモン受容体 サイト1結合界面でペグ化に有用な部位の数を減少する。G120の異なるアミノ酸 を用いた除去は、サイト2でのhGH結合を妨害し、分子をhGH拮抗剤に変換する。 この位置でのグリシンからリシンへの置換は、この部位でのいかなる残余の結合 をも損なうサイト2での付加的な潜在的なペグ化を提供する。B2036変異体におけ る第一級アミンの反応性は実施例Ｘに示されている。 ペグ化の程度及び部位はまたpHと同様に活性化PEGとタンパク質の相対的濃度 のような、反応コンディションを調節することによって操作し得る。望ましいペ グ化の程度のための適したコンディションは経験的に決定し得る。略記すると、 標準的なペグ化反応は上記したパラメーターを変化させることによって調整され る。例えば遊離アミノ基当たり相当するM-NHS-PEG(5000)の数が1から3に間で変 化するhGH変異体ペグ化反応(0.05Mホウ酸ナトリウムバッファー,pH8.5内に10mg/ mlhGH変異体を含む)は、以下に示される調製物を生産する。 調製物 PEG(5000)分子/hGH変異体分子 1 2,3,4,5 2 3,4,5,6 3 4,5,6,7 (活性化PEGに関して用いられているように、「遊離アミノ基当たり相当する」なる 語は、分子内の遊離アミンの数を掛けられたペグ化される分子のモル量と等しい 活性化PEGのモル量をいう。)制限されたペグ化を受ける調製物(調製物1のような )では、タンパク質は最も反応性の部位でペグ化され、一方もしペグ化がより拡 大されれば(調製物3のような)、比較的小さい反応性の部位もまたペグ化される 。 B2036のようなhGH変異体のペグ化は、いかなる適宜な方法ででも実施される。 例示的な実施態様として、hGH変異体はM-SPA-PEG(5000)を用いてペグ化される。 実施例VII参照。略記すると、個体のSPA-PEG(5000)を室温でhGH変異体の水溶液 に撹拌しながら加える。典型的には、水溶液は反応が実施されるpH(一般的には 約pH4-10)に近いpKaを持つバッファーを用いて緩衝される。pH7.5でペグ化のた めの適したバッファーの例として、例えばHEPES、リン酸、ホウ酸、Tris-HCl、E PPS及びTESが含まれる。pHは継続的にモニターされ、必要であれば調節される。 反応は約1から約2時間継続することが可能である。 それから反応生成物を遊離M-SPA-PEG(5000)及びペグ化hGH変異体の高分子量複 合体からペグ化hGH変異体を分離するため疎水性インターラクションクロマトグ ラフィーにかける。(高分子量複合体は、非ブロック化PEGが分子の両末端で活性 化され、hGH変異体分子と架橋した場合に生ずる。)疎水性インターラクションク ロマトグラフィーの間のコンディションは、遊離M-SPA-PEG(5000)がカラムを流 れる一方、いかなる架橋されたペグ化hGH変異体複合体も一つ以上のPEGグループ に接合された一つのhGH変異体分子を含む望ましい形態の後で溶出するようなも のである。適したコンディションは望ましい接合物に対する架橋された複合体の 相対的サイズに依存して変化し、当業者には容易に決定され得る。望ましい接合 物を含む溶出液を超濾過で濃縮し、ダイアフィルトレーションによって脱塩化す る。 この調製物はhGH変異体分子当たり3から6の間のPEGを含むPEG-hGH変異体接合 物の異種物の混合体を表す。一つの実施態様として、この混合物をペグ化hGH変 異体 のさらなる均質な調製物を生産するために、付加的な精製工程にかける。より特 異的には、混合物をペグ化の範囲にしたがってペグ化hGH変異体を分画するため にカチオン交換クロマトグラフィーにかける。コンディションはPEGグループの より大きな数を持つより高ペグ化されたhGH変異体が勾配で早く溶出するような ものである。 この方式では、主に1または2の形態を含むペグ化hGH変異体のプールを得るこ とが可能である。以下で用いられるように、ペグ化hGH変異体の「形態」とは特定 の数のPEGグループを含むPEG-hGH変異体接合物である。したがって、ペグ化hGH 変異体の異なる「形態」とは、同じhGH変異体に接合されたPEGグループの異なる数 を持つ。例示的な実施態様として、主に二つの形態、すなわちhGH変異体1分子当 たり4または5のPEGを持つ接合物を含むペグ化hGH変異体のプールを得る(以下で は「PEG-4/5-hGH変異体調製物」という)。それからこのプールを濃縮し、脱塩化し 、そして以下に記述するように投与のため処方する。 治療上の処方での使用のためのペグ化hGH変異体を含む構成物は、異種でもあ り同種でもありうる、すなわち単一のPEG-hGH形態を含む。典型的には組成物は 少なくとも70%の1または2のPEG-hGH変異体接合物を含む;好ましくは少なくとも8 0%の1または2の形態;より好ましくは少なくとも90%の1または2の形態を含む。 治療上の処方 治療上の投与のための本発明のhGH変異体の処方は、凍結乾燥塊または水溶液 の形態で、適宜に製薬学的に許容可能なキャリアー、賦形剤または安定剤と望ま しい純度を持ったhGH変異体を混合することによって貯蔵のため調製される(Remi ngton's Phrmaceutical Sciences,第16編,Osol、A.編,[1980])。非経口的処方は 製薬学的に許容可能なキャリアーとユニット投与量の注射形態の(溶液、懸濁液 または乳濁液)hGH変異体を混合することによって調製され得る。製薬学的に許容 可能なキャリアー、賦形剤または安定剤は用いられる投与量および濃度で受容者 に非毒性であり、処方の他の構成要素と両立できる。例えば、処方は好ましくは 酸化剤およびタンパク質に有害な他の既知の化合物を含まない。 適したキャリアーには、リン酸、ホウ酸、HEPES、クエン酸および他の有機酸 を 含むバッファー;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量(約10残基より小さい) ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパ ク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、ア スパラキン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸;グルコース、マンノー ス及びデキストランを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物;EDTAのようなキレ ート試薬;亜鉛、コバルトまたは銅のような二価金属イオン;マンニトールまたは ソルビトールのような糖アルコール;ナトリウムのような塩形成カウンターイオ ン;及び/またはTween、PluronicsまたはPEGのような非イオン性界面活性剤が含 まれる。 本発明の処方は付加的に製薬学的に許容可能なバッファー、アミノ酸、膨張試 薬及び/または非イオン性界面活性剤を含む。これらには例えばバッファー、キ レート試薬、抗酸化剤、防腐剤、共溶媒等が含まれる;これらの特異的な例とし て、トリメチルアミン塩類(Trisバッファー)及びエデト酸二ナトリウムが含まれ 得る。 加えて、WO89/09614に示されているGH処方を用い得、そこではhGH変異体はグ リシン、マンニトール及びリン酸バッファーのようなバッファーを含む構成物に 含まれている。この処方の例示的なバージョンは以下のものである:0.68g/Lグリ シン、18.0g/Lマンニトール、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4。代わりに、hGH変異 体をマンニトール及びグリシンを必ずしも含まず、ポリソルベートまたはポロキ サマーのような0.1から5%(w/v)の非イオン性界面活性剤を含む液体処方に含み得 る。この処方の例示的なバージョンは以下のものである:5mg/mlhGH変異体、8.77 mg/mlNaCl、2.5mg/mlフェノール、2.0mg/mlポリソルベート20及び10mMクエン酸 ナトリウム,pH6.0。 hGH変異体はまた持続放出システムで適宜投与される。持続放出構成物の適し た例として、例えばフィルムまたはマイクロカプセルといった形作られた商品の 形態で半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。持続放出マトリックスはポリ ラクチド(米国特許第3,773,919号、EP58,481)、L-グルタミン酸とガンマ-エチル -L-グルタメートのコポリマー(U.Sidman等,Biopolymers,22,547-556[1983])、ポ リ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(Langer等,J.Biomed.Mater.Res.,15:167 -277[1981];Langer,Chem.Tech.,12:98-105[1982])、エチレンビニルアセテート( Langer等,上記参照)またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP133,988)を含む。持 続 放出hGH変異体構成物はまたリポソームに封入されたhGH変異体をも含む。hGH変 異体を含むリポソームは本質的に既知の方法によって調製される:DE3,218,121;E pstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985);Hwand等,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949; EP142,641;日本国特許出願83-118008;米国特許第4,485,045号と4,544,545号;及 びEP102,324。もともとリポソームは脂質含有量が約30モルパーセントコレステ ロールより大きく、選択される割合は適宜にhGH変異体治療に対して調節される 、小さな(約200-800オングストローム)単層上のタイプである。 hGH変異体はまた局所的投与に対しても処方され得る。適した処方は投与部位 に依存して変化し、本分野で既知のものと異ならない。例えば、hGHは目に投与 するため平衡化した塩溶液内に処方され得る。 治療上の投与に対するhGH変異体の処方は滅菌的である。滅菌は滅菌濾過メン ブレン(例えば0.2ミクロンメンブレン)を通した濾過によって容易に成し遂げら れる。治療上のhGH変異体構成物は一般的に、例えば皮下注射針によって穴をあ けることが可能なストッパーを持った静脈溶液バッグまたはバイアル内に入れら れる。 hGH変異体は通常水溶液としてまたは再構成のための凍結乾燥処方として、封 をされたアンプルまたはバイアルのようなユニットまたは複数投与容器内に貯蔵 される。凍結乾燥処方の例として、5mlバイアルを2mlの滅菌濾過された0.5%(w/v )hGH変異体水溶液で満たし、その結果生じた混合物を凍結乾燥する。融合溶液を 注射のための静菌水等を用いて凍結乾燥hGH変異体を再構成することによって調 製する。 本発明のペグ化hGH変異体の処方はhGh変異体で一般的に上述されたように実施 し得る。 治療上の使用 本発明はhGHの作用剤として機能する変異体及びhGHの拮抗剤として機能する変 異体を含み、後者はサイト2-破壊的ミューテーションを含む。作用剤hGH変異体 は哺乳動物の同化作用または成長を増大するのに有用である。成長とは通常の成 長曲線によって表せられるような幼児、子供及び思春期の間の個体によって経験 さ れる伸長成長の発達の型をいう。それゆえここでいう成長は軟骨細胞によって由 来する身長を生み出す骨板の成長をいい、骨の異なる部分に由来する骨芽細胞の 成長とは区別される。通常の成長パターンの回復は、患者がより満足のいく成長 曲線に近づくことを許容する。GHに比較的耐性であるが同化作用の効果を含む治 療を必要とする患者の例として、ターナー症候群に罹患したもの、GH欠損の子供 、彼らの成長部位が閉じる約2-3年前に通常の成長曲線の遅延または阻止を経験 している子供、つまりショートノーマルな子供と呼ばれている子供、及びGHに応 答するインスリン様増殖因子-Ｉ(IGF-Ｉ)が化学的に(すなわちグルココルチコイ ド治療により)または大人の患者においてGHに応答するIGF-Ｉが天然において減 少しているような天然のコンディションによってブロックされている患者が含ま れる。 免疫疾患もまた本発明の作用剤hGH変異体を用いた治療の影響を受けやすい。「 免疫疾患」なる表現は、その脾臓サイズがあるべきものより小さいため、あるい は脾臓が部分的にのみ機能しているため、あるいは化学療法試薬のような薬剤が 通常の免疫機能を抑制しているため、あるいは動物が機能的にIGF-Ｉ-(またはGH -)欠損しているため、または他の要因のため、動物と同様にヒトの免疫系が通常 より小さい抗原に対する抗体応答をもついかなる病気をも含む。例として、高齢 の患者、化学療法または放射線治療を受けている患者、重い風邪から回復した患 者、手術を受けようとしている患者、AIDSをもつ患者、低ガンマグロブリン血症 、一般的に変化する無ガンマグロブリン血症のような適した必要とされるB細胞 欠損をもつ患者、及び例えばIgA欠損などの選択的な免疫グロブリン欠損、狂犬 病のようなウイルスに感染し、患者の免疫応答より短いインキュベーション時間 をもつ患者、及びディ・ジョージ症候群のような遺伝的疾患をもつ患者が含まれ る。 作用剤hGH変異体は免疫機能を増大することにより哺乳動物の免疫機能を刺激 するように機能し得るが、その増大は抗体介在または細胞介在のためであり、及 び免疫系はhGHを用いて治療されるホストに異種のものであり、またはhGH変異体 を与えられるホストに対してドナーから移植される(骨髄移植のように)。例えば 該刺激は脾臓リンパ球数、脾臓T細胞群数(T細胞、CD4及びCD8)、または脾臓B細 胞数のような脾臓細胞の増大した数から由来する、または胸腺細胞の増大した数 から由来する。免疫系応答に含まれる他の細胞には、ナチュラルキラー細胞、マ クロ ファージ及び好中球が含まれる。加えて該刺激は免疫原に応答する抗体生産の増 大のためでもあり得る。 本発明の作用剤hGH変異体は心機能を刺激するためにも用いられ得る。 B2036及びB2024のような本発明の拮抗剤hGH変異体は、GH機能の阻害が望まし い病気を治療するのに有用である。特に拮抗剤hGHを用いた治療に影響を受けや すいものは、GHの循環レベルの減少またはIGF-ＩのようなGH機能のメディエータ ーの減少が治療上の利益を提供する病気である。該病気には例えば巨大症及び先 端巨大症のようなGH過多の病気が含まれる。巨大症は長い骨の成長がいまだ可能 である思春期前のGH過多から由来する。 先端巨大症は長い骨の成長が止まった思春期後のGH過多から由来する。内部器 官、特に心臓の肥大と同様に、骨の異常成長と軟組織の膨張によって特性指摘さ れる。先端巨大症は典型的にはGHを分泌する下垂体腫瘍によって引き起こされる 。該疾患のホールマークは循環GHとIGF-Ｉの高レベルである。本発明のhGH変異 体はGH機能を阻害することによって有意な治療上の利益を提供すると現在では考 えられている。 拮抗剤hGH変異体はまたGH機能の阻害が治療上の利益を提供する他の病気を治 療するのにも有用である。例として、例えば糖尿病性網膜症及び糖尿病性腎症の ような糖尿病及びその合併症が含まれる。糖尿病性網膜症は網膜の血管を形成す る細胞の増殖、網膜の先端の新しい血管の成長(新生血管形成)、微細動脈瘤の発 達、及び囲んでいる網膜組織内への体液の漏出によって特性指摘される。糖尿病 性腎症の早期のホールマークは腎肥大とハイパーフィルトレーション(hyperfilt ration)である。疾患の進行に伴って、糸球体間質細胞の散乱拡大(それは腎臓の 濾過装置を補強する)が観察され、糸球体間質細胞数の無制限の増大を伴う。 増殖的な新生血管形成を含む糖尿病性網膜症のような目の血管の疾患もまた、 拮抗剤hGH変異体を用いた治療の影響を受けやすい。例として、早産児の網膜症 、鎌状赤血球貧血と関連した網膜症、及び55歳以上の失明の最も一般的な原因で ある年齢関連性斑変質が含まれる。 GHレベルの減少が治療上の利益を提供すると現在では考えられている他の病気 には、成長によってGHまたはGH機能のメディエーター(IGF-Ｉのような)に応答す る悪性腫瘍が含まれる(以下では「GH応答性悪性腫瘍」という)。GH応答性悪性腫瘍 の例として、ウィルムス腫、様々な肉腫(例えば骨肉腫)、及び胸部、大腸、前立 腺及び甲状腺ガンが含まれる。 本発明の拮抗剤hGH変異体は、変異体が結合する受容体を発現している細胞の 成長を阻害する。広い様々な組織が該受容体を発現している。例えばGH受容体mR NAは、通常の胎盤、胸腺、脳、唾液腺、前立腺、骨髄、骨格筋、気管、脊髄、網 膜、リンパ節由来の細胞系で、及びバーキットリンパ腫、結腸直腸のガン腫、肺 ガン腫、リンパ芽球白血病及びメラノーマ由来の細胞系で発現されている。それ ゆえ本発明の拮抗剤hGH変異体は、変異体が結合する受容体を発現しているガン を治療するのに一般的に有用であると現在では考えられている。 本発明の様々な目的のため、作用剤または拮抗剤hGH変異体は、非経口的なも のを含めたいかなる適した方法によってでも哺乳動物に直接的に投与され、局所 的にまたは全身的に投与され得る。特異的な投与経路は例えば、患者の病歴に依 存し、hGH変異体を用いたいかなる認められるまたは予期される副作用をも含む 。非経口的な投与の例としては、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内及び腹膜内投与 が含まれる。 投与は継続的な点滴(例えば浸透性ポンプのようなミニポンプを用いて)、また は例えば静脈内や皮下の手段を用いる注射によってなされる。一つの実施態様と して、hGH変異体は皮下に投与される。投与はまた単一の巨丸剤としてもなされ 得るし、遅放出貯蔵物処方によってもなされ得る。 治療において用いられるhGH変異体構成物は、治療される特異的な病気、個々 の患者の臨床上のコンディション(特にhGH変異体単独を用いた治療の副作用)、h GH変異体構成物の輸送部位、投与方法、投与スケジュール及び他の実施者に既知 の因子を考慮に入れて適した医療上の実践に一致した方式で処方され投与される 。それゆえ、ここで目的に対するhGH変異体の「有効量」(例えば先端巨大症を打ち 消すための拮抗剤の有効量を含む)とは、該考慮によって決定される。 一般論としては、投与量当たり非経口的に投与されるhGH変異体の製薬学的な 有効量は、上記注意したように治療上の裁量を受けるが、患者の体重の約1μg/k g/日から約100mg/kg/日の範囲にある。通常この投与量は約0.01から約10mg/kg/ 日の 間であり、ヒトに対してより一般的には約0.01から約1mg/kg/日の間である。継 続的に与えられる場合には、hGH変異体は一日当たり1から4の注射または例えば ミニポンプを用いて継続的な点滴によって、約1μg/kg/時から約50μg/kg/時の 投与量割合で典型的には投与される。静脈バッグ溶液もまた用いられ得る。適し た投与量を選択する鍵となる因子は、例えば長い骨の成長、抗体生産、脾臓細胞 (splenocyte)数または胸腺細胞数、及び脾臓B細胞などの増加によって作用剤に 対して測定されるもののような、及び例えば血清GH、血清IGF-Ｉおよび腫瘍成長 等の減少によって拮抗剤に対して測定されるもののような、得られた結果である 。 一般的に本発明のペグ化hGH変異体は、上述したいかなる投与経路ででも投与 され得る。しかしながらペグ化hGH変異体は非ペグ化hGH変異体ほど頻繁に投与さ れる必要はないと現在では考えられている。非ペグ化hGH及びhGH変異体は、少な くとも一週間に3回及びしばしば毎日典型的には投与される。しかしながらこれ らのタンパク質のペグ化形態は、およそ三日に1回から一月に1回、または典型的 にはおよそ6-7日に1回から2週間に1回投与され得る。 ここでhGH変異体によって潜在的に治療可能な哺乳動物は、ウシ、ヒツジ及び ブタのような経済的に重要な哺乳動物を含む。ここで好ましい哺乳動物はヒトで ある。 以下の記述は例示として存在し、本発明の範囲を制限するために解釈されるべ きではない。ここで用いられている全ての引用は、参考としてここで明らかに取 り込まれる。 実施例Ｉ hGHのサイト１内の30の接触残基でのアラニン置換物に対する結合の速度論及 びアフィニティーを評価した。固定化された受容体へのホルモンの結合による屈 折指標の変化を測定するために、表面プラズモン共鳴に依存するBIAcoreTMバイ オセンサーと呼ばれるバイオセンサー装置を用いた。本実施例では、アフィニテ ィーが31の側鎖の4分の1より小さいものによって支配され、小パッチにおけるこ れらのクラスターは接触エピトープの近くに存在することが見出された。それゆ え「構造的エピトープ」は「機能的結合エピトープ」よりかなり大きい。 実験プロトコール hGHのサイト1に存在する残基のアラニンミューテーションはCunninghamとWell s,上記参照に記述されている研究から利用され、新たに部位指定ミュータジェネ シスによって作製された。Kunkel等,Methods Enzymol.,154：367-382(1987)。様 々なタンパク質がCunninghamとWells,上記参照に記述されているように生産され 精製された。硫安沈殿の継続時間を1時間に伸長することによって改良された。 hGHbp(WellsとDe Vos,上記参照)がPharmacia BIAcoreTMバイオセンサー上に固 定化され、ホルモンの結合による屈折指標の変化が速度論的測定のため用いられ た。会合定数及び解離定数が器械により提供されるソフトウェアーを用いて計算 された。Karlsson等,J.Immunol.Methods,145：229-240(1991)。hGHbpを遊離チオ ールを経由してhGHbpを固定化することによってセンサーチップ上に別個の配向 で固定化した。これは部位指定ミュータジェネシス(Kunkel等,上記参照)を用い て2の特異的部位の1にシステイン残基を導入することにより(S201CまたはS237C) 成し遂げられた。hGHbpのチオール変異体を大腸菌で発現し均質に精製した。Fuh 等,J.Biol.Chem.,265：3111-3115(1990)。これらのタンパク質をN-エチル-N'-(3 -ジエチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDC)を用いてカルボキシル-デキス トランマトリックスを活性化し、それをN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を用 いて反応させることによってチップ表面に結合させた。NHS-エステルを2-(2-ピ リジニルジチオ)-エタンアミン(PEDA)を用いて反応させた。残存した非反応NHS- エステル基をエタノールアミンの添加によって除去した。hGHbp変異体をおよそ1 000Ru'sが結合されるまで(1.0ng/mm2；BIAcoreTMマニュアル参照)マトリックス と反応させた(50mM酢酸ナトリウム,pH4.5内に50μg/ml)。 結合割合を各hGH変異体の増大していく濃度を注入することによって得られた 結合プロフィールから測定した。5の連続的な希釈(それぞれ2倍)をhGHbpに対す るアフィニティーに依存して200または1000nMホルモンで始めることによって作 製した。20μl/分が最大の流速であった。高塩バッファー(150mMNaCl、10mMリン 酸ナトリウム,pH7.4)を幅広い静電学的効果を避け、生理的イオン強度をまねる ために用いた。非特異的結合を減少するため、0.02%Tween20もまた用いた。4.5M MgCl2を用い て20秒間洗浄することにより、マトリックスを再生した。これに示されるコント ロール実験は全ての結合ホルモンを除去することで十分であり、マトリックスは 結合速度論の有意な変化なく50回より多く再使用可能であった。 解離割合は5μMhGHミュータントを用いてバイオセンサーを飽和し、ホルモン の存在しないバッファーに切り替えることによって測定された。バッファー流速 と再生コンディションは会合プロフィールを測定するために用いられたものと同 様であった。潜在的な差異結合効果を、解離定数を計算するための各解離プロフ ィールの最初の10分だけ用いることによって最小化した。会合定数と解離定数の 両者を、割合の方程式を解くためにPharmacia Kinetics Evaluationソフトウェ アーを用いて決定した。Karlsson等,上記参照。 同じバイオセンサーチップでの会合定数の三重の測定における平均標準偏差は 報告されている値の±4%であった。異なるバイオセンサーチップの間で測定され た値は60%まで変化する。しかしながら野生型のリファレンスがいつも含まれて いたため、ここで報告される相対的値に対する標準誤差は同一のチップで得られ た測定と同様である。hGH及び変異体の濃度はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳 動後のCoomassieブルー染色タンパク質のデンシトメトリーによって測定された 。この方法は±10%の正確性をもって置換とは独立なタンパク質濃度を提供する のと同様に、様々なホルモンの純度と完全性を確認する。CunninghamとWells,上 記参照。それゆえ相関的会合、解離、及びアフィニティー定数における平均累積 誤差は、それぞれ約17%、14%及び21%である。 結果 hGHbpに対するhGHの結合を、hGHbpの変異体、(S237C)hGHbp[hGHbp中のSer237 をCysに変換している]を混合されたジスルフィド結合を経由してBIAcoreTMバイ オセンサー上のチオール誘導化マトリックスに固定化することによって研究した 。図1A。S237C(hGHbp)ミューテーションはhGHに対する結合アフィニティーに影 響せず、単一のチオール特異的蛍光プローブを付着するために用いられ、溶液中 のhGHbpのhGH誘導性二量体化を引き起こした。Cunningham等,1991,上記参照。こ の付着は、もし第一級アミン基を通じたランダムな結合が用いられていれば得ら れるものと 異なるマトリックス上のhGHbpの同型の配向を確実にした。結合反応の間に生じ る屈折指標共鳴ユニット(RUs)の変化から、付着したhGHbpの量がPharmaciaから 供給された較正曲線から計算された(BIAcoreTMバイオセンサーマニュアル参照) 。 過度のhGHが(S237C)hGHbp-マトリックスに加えられた場合、急速な会合と極端 に遅い解離が観察された。図1B。RUの変化から固定化されたhGHbp当たり0.4のhG Hの結合のモル比が計算された。表1参照。これはhGHが溶液中でするように固定 化されたhGHbpを二量体化することを示した。図1A。さらにマトリックス上での 二量体化がサイト2を結合する能力においてブロックされたhGHの非二量体化ミュ ータント、(G120R)hGHのhGHbpへの結合を測定することによって試験された。Fuh 等,1992,上記参照。(G120R)hGHの飽和濃度が加えられると、約2倍量の結合され たホルモンを見出し、それは固定化されたhGHbp当たり0.7(G120R)hGHの計算され た化学量論を持った(表1)。 オン-及びオフ-レートプロフィールの分析は野生型及び(G120R)hGHの両者が同 様の割合で会合することを示した(表1)。しかしながら野生型に対するオフ-レー トは信頼できる解離定数を計算するのがあまりに遅かった。これらのデータは提 案されている連続的な結合メカニズムと一致した;つまり両ホルモンは第一の受 容体に同じ方法で結合し、それ故にほぼ同じオン-レートを持つ。しかしながら 野生型ホルモンは第二の受容体に結合し、それゆえ解離が極端に遅かった。 *ND=検出されなかった。 マトリックス上でのhGHbpの二量体化の複雑化なく、サイト1接触エピトープ単 独でミュータントの結合をより詳細に調査することが望ましかった。hGH(hGHbp)2 複合体のX線構造にしたがって(De Vos等,上記参照)、2のhGHbpがお互いにSer20 1で接触する。それゆえマトリックス上での二量体化はCysを用いてSer201を除去 し、活性化チオールマトリックスに対して単一のチオールを経由してS201C変異 体を付着することによってブロックされた。図2A。実際、飽和レベルのhGHを加 えた場合(図2B)、固定化(S201C)hGHbp当たり0.84hGHの最大の化学量論(表1)が計 算された。(G120R)hGHは(S201C)hGHbp当たり0.94の化学量論をもって結合した。 チオ ール結合の正確な配置によって、マトリックス上のhGHbpが1:1複合体形成または 1:2複合体形成のいずれかを許容するように配向することが可能であった。それ ゆえhGHbpに対してhGHの溶液結合性質は、BIAcoreTMバイオセンサー上で再生産 され得る。(G120R)hGHは(S201C)hGHbp-マトリックス上でhGHと同じ速度論を持ち 、(S237C)hGHbp-マトリックス上で(G120R)hGHのものと同じものを持つ。これら のデータは共に(S201C)hGHbp-マトリックスがサイト1単独に結合するためのhGH の変異体をテストする信頼性のある手段であることを示す。 hGH上の隠れた側鎖をサイト1でhGHbpに結合すると溶媒に対する接近能が変化 する側鎖原子を含むものとして定義した。溶媒接近能をサイト1を介して1のhGHb pに遊離または結合すると、hGHの表面上で1.4オングストロームラジウムプロー ブ(LeeとRichards,J.Mol.Biol.,55:379-400[1971])を回転することによって計算 した。これらの計算のためX線コーディネートセットをhGH(hGHbp)2複合体に対し て用いた。De Vos等,上記参照。この基準により、全てアラニンより長い30の側 鎖が存在し、複合体化の場合同程度に隠れている。表2。 11.4Åプローブに対する接近可能エリアを、野生型ホルモンにおける各側鎖に対 して、及びβ-炭素以外の野生型の隠れた原子に対して(アラニンミューテーショ ンをまねるために)、そしてX線コーディネートを用いてhGHbpとのそれらの相当 する複合体に対して計算した(LeeとRichards,上記参照)。De Vos等,上記参照。 アラニンミューテーションに帰する隠れたエリアの変化は(遊離-結合)wt-(遊離- 結合)Alaの接近可能エリアの差異である。これはアラニン置換により除去された 側鎖の部分であるため、β-炭素以外の隠れたものにのみ該エリアは用いられた 。カッコで示されたものは、一度受容体が結合すると溶媒に接近不可能となるhG H内のβ-炭素以外の原子に対する各側鎖のエリアである。2 ファンデルワールス接触の全数は、hGH(hGHbp)2複合体の調査に基づいて接触側 鎖β-炭素以外のいかなる原子のものであっても4.4Å以内の受容体原子の数であ る。接触距離の80%以上が3.8から4.2Åである。水素結合(h)または塩架橋(s)を 形成する基をhGHとhGHbpの間の互いの3.3Å以内のドナー-アクセプターまたは相 補的電荷ペアによって決定する。例えばH18の次のhN218はhGH上のH18とhGHbpのN 218の間の水素結合を示す。mcは主鎖アミドに対する水素結合を示す。3 オフ-レートの相対的変化は以下から計算された: 及び 野生型からのKdの変化は以下のように計算された: 4ΔΔG値は、BIAcoreTMバイオセンサーから以前に報告されているラジオイムノ アッセイデータからカッコに入れて以下のような公式: から計算された。CunninghamとWells,上記参照;CunninghanとWells,Proc.Natl.A cad.Sci.USA,88:3407-3411(1991)。 (S201C)hGHbp-マトリックスをサイト1界面の30の隠れた残基でのアラニンミュ ータントに対するアフィニティーを測定するために用いた(表2)。多くのこれら のミュータントに対する結合定数を測定するためにラジオイムノ沈降アッセイ(R IA) を以前に用いた。CunninghamとWells,1989と1991,上記参照。BIAcoreTMバイオセ ンサーデータに対するRIAデータによって計算されたアラニンミュータントに対 する野生型と比較した自由エネルギーの変化のプロットは、均一性に近いスロー プとゼロに近い切片をもつ整った相関関係(R2=0.94)を示す。図3。それゆえバイ オセンサーマトリックスで得られたアフィニティーデータはRIAによって溶液中 で測定されたものと非常に適合する。これはマトリックスが規則的な結合アーテ ィファクトを引き起こさないことを示す。 アフィニティー定数の平均標準誤差はRIAでは約30%であるのに対してBIAcoreT M バイオセンサーを用いると約20%である。hGHbpの二量体化のある物はRIAで生じ 得、それはアフィニティーにおける規則的な誤差を導く;これは(S201C)hGHbp-マ トリックスを用いて避けられる。 30の隠れた側鎖のうち7のみ(L45,P61,R64,K172,T175,F176及びR178)がアラニ ン置換から引き起こされた結合自由エネルギーの全変化の約85%を説明できる。 他の6(P48,E56,Q68,D171,1179及びR183)は本質的に残りの部分を説明できる(表2 )。隠れた側鎖の他の8(M14,H21,Q46,S62,N63,Y164,R167及びE186)は、全アフィ ニティーに対して本質的に全く影響がない(それぞれはアフィニティーにおいて2 倍より小さい減少を引き起こす)。隠れた残基の他の3(Q22,D26及びK168)は、結 合アフィニティーに対して小さいが有意な影響を持つ。5の側鎖(H18,F25,Q29,E6 5及びE174)は、アラニンに変換した場合2から5倍のアフィニティーの促進がある ので、現実に結合を妨害している。アラニン置換によって引き起こされる自由エ ネルギーの減少の合計(-14.2kcal/ml)は、BIAcoreTMセンサーによって測定され たhGHとhGHbpの間の結合の全自由エネルギー(-12.3kcal/ml)に匹敵する。 それゆえH18,Q22,F25,D26,Q29,E65,K168及びE174での変化を持ったhGHミュー タントはhGHbpに対する結合アフィニティーを増大している。これらの位置で全 てのアラニン残基を持つ変異体は、個々のアミノ酸変化の加法に基づいて野生型 hGHのものの約200倍大きい結合アフィニティーをもつと計算される。ここで実施 例IIのデータを統合すると、この組み合わせのミュータントの18位でのAsp及び/ または174位でのSerもまた野生型hGHよりhGHbpに対して有意に大きな結合アフィ ニティーをもつと期待される。 オフ-レート効果はオン-レート効果よりはるかに大きい(表2;図4)。それゆえ 、アフィニティーに最も影響する同じ7残基はオフ-レートでの増大のほとんどを 説明する(25倍まで)。3のArg側鎖(R64,R167及びR178)のAlaへの変換は、オン-レ ートでの最大の減少を生み出すが高々約2倍である。2のGlu側鎖(E65及びE174)の Alaへの変換は、オン-レートでの最大の増大を引き起こす(ほぼ2倍の改良)。こ れは静電気的相互作用が受容体へホルモンを導くもっとも重要な側鎖の決定因子 であることを示す。 オン-レートに最も影響する側鎖は全てがオフ-レートに最も影響するものと同 じであるわけではない。図4。例えばR167Aはオン-レートでは最大の減少を引き 起こすが、オフ-レートでは埋め合わせ可能な減少を起こすのみである。アフィ ニティーを支配する側鎖でのアラニンミューテーションの多く(P61A,K172A,T175 A及びF176A)は、現実に会合レートには何の影響もない。これらの実験から、各 ミューテーションの加法から由来する、野生型hGHよりGH受容体に対する200倍よ り大きい結合アフィニティーをもつ好ましい組み合わせは、H18A,Q22A,F25A,D26 A,Q29A,E65A,K168A,E174Aをもつ。 結論 該データは界面のわずかな一連の隠れた側鎖だけが結合において機能的に重要 であることを示す。いかなる理論に限定されることなく、これは分析方法のアー ティファクトではないと考えられる。第一に、hGH・hGHbp複合体の構造が解決さ れ、サイト1で隠れている残基がhGH(hGHbp)2複合体でhGHに対するサイト1でみら れるものと実際に同一である。De Vos等,上記参照。それゆえ構造的エピトープ が機能的エピトープよりずっと小さいという事実は、1:2複合体に対して1:1で結 合するという接触差異のためではない(それは接触エピトープを定義するために 用いられるコーディネートセットである)。 第二に、ミューテーション実験による側鎖の機能的重要性の分析は、構造的な 妨害または異常な立体的、静電気的、または疎水性相互作用を強要することによ ってミュータントタンパク質が効果を過大視する予告をもつ。アラニンを用いた 側鎖の規則的な置換は、構造をほとんど破壊しない。Wells,Methods in Enzymol ., 202:390-411(1991)。アラニンミューテーションは付加的な好ましくないまたは 好ましい相互作用を創り得る新しい原子を導入することなく原子を除去するので 、判断するのが最も簡単である。アラニン置換により引き起こされる全ての破壊 効果の合計(-14.3kcal/モル)は、全結合自由エネルギー(-12.3kcal/モル)を劇的 に過大視することはない。これは該効果が個々の結合決定因子に局在し、全タン パク質構造または結合の態様を著しく変化することはないことを示す。多数の接 触残基が与えられると、単一のアラニン置換が複合体における結合の態様を変化 することもありそうになくなり、それは結合に付加的な効果を持つ二つのアラニ ン置換の数によって証明され、該部位が独立に機能することを示す。 ホルモン内で隠れており、さらに受容体が結合する場合には隠れていない、ア フィニティーに影響するアラニンミューテーションのいくつかもまた同定されて いる。CunninghamとWells,1989,上記参照。例えば、P5A,L6A,F10A及びV185Aはそ れぞれ2から4倍アフィニティーを破壊する。これらの側鎖のそれぞれはサイト1 エピトープを支配するが結合には直接的には関与しないヘリックス1とヘリック ス4の間の接触を形成する。同様に、F54及び158はアフィニティーを破壊するが 第二のミニヘリックスに位置するループ領域に隠れている。このミニヘリックス はR64及び他の重要な結合決定因子を含む。それゆえ結合に対するマイナーな効 果が構造的エピトープではないがその近傍でのアラニンミューテーションに由来 する。しかしながらサイト1構造的エピトープから離れた試験された残基の大部 分が、アラニンに置換された場合結合に対して検出可能な効果を持たない。Cunn inghamとWells,1989,上記参照。 アラニンスキャニングデータは結合エネルキーの約85%を説明する界面で隠れ た30の側鎖の7のみを示す。残りの全ては事実上6の他の側鎖によって説明され得 る。ある残基は結合に対して重要であり、他のものはそうでない理由を説明し得 る構造的なパラメーターの数を相関させることが試みられている。該残基は構造 的エピトープの中央近くの小さな領域で結合クラスター(大抵ヘリックス4の末端 に向けられている)に対して重要であると見出されている。機能的に「無効な」接 触残基は、ヘリックス1の中央でヘリックス4の始まりの、周縁近くに存在しがち である。これはhPRL受容体に対するhGHの結合と(CunninghamとWells,1991,上記 参照)、(Z n+2・hGH)2貯蔵複合体の形成に重要な残基である。Cunningham等,Science,253:54 5-548(1990)。それゆえこのエリアはhGH受容体に対する結合における役割がほと んど明らかでない一方、他の重要な機能を持っている。 他の規則的構造的相関関係は作り出すのがより困難である。ChothiaとJanin,N ature,256:705-708(1975)は隠れた表面エリアの変化は一般的に2のタンパク質間 の会合の自由エネルギーと相関していることを見出した。アラニンミュータント のそれぞれに対して複合体の形成を生じる隠れた表面エリアの変化は、hGHとア ラニンミュータントの間の遊離及び結合相での接触能の差異から計算された。表 2。しかしながら側鎖をアラニンに変換した場合に結合の自由エネルギーの変化 に対する結合の隠れた表面エリアの変化のプロットは、大変小さな相関関係しか 与えない。図5A。ある場合には、接触能の変化に対する負の値が得られた。これ はアラニンミュータント内の失われた側鎖が界面で空洞を形成し、それゆえさら なる表面エリアが複合体形成でカバーされ得るためである。隠れた側鎖を定義す る基準であるβ-炭素以外の原子に対する結合に生じる側鎖接触能の変化もまた 計算された(表2の第2列のカッコを参照)。さらに自由エネルギーの変化に対する これらの値のプロットはよりよい相関関係を与えない。側鎖がアラニンに変換さ れた場合のアフィニティーの変化に対するβ-炭素以外のhGHの原子によって形成 されるファンデルワールス接触の数のプロットも、よい相関関係を示さない。相 関関係は静電気学的相互作用の可能な側鎖を別々に考慮することによっても改良 されない。 HortonとLewis,Protein Science,1:169-181(1992)は、隠れた表面エリアと接 触側鎖に対する原子溶媒和パラメーターの機能的なスケーリング(EisenbergとMc Lachlan,Nature,319:199-203[1986])に基づいて、半経験的な方法を用いて15の 異なるタンパク質-タンパク質ペアに対するアフィニティーを予測することがで きた。それゆえこれらの測定された原子溶媒和パラメーターは個々のアラニン置 換から由来する自由エネルギー変化を彼らがいかによく予測し得るかを示すため に評価された。ほとんど相関関係はなかった。それゆえ隠れた表面エリア、ファ ンデルワールス接触の数、及び測定された原子溶媒和計算値は一般的な結合アフ ィニティーに対する相関関係には有用である一方、それらはこのエピトープ内の 個々の 側鎖の役割の予測には貧弱である。 概して静電気学的相互作用に対するエネルギー論は、酵素-基質複合体のミュ ータジェネシスから得られる見積もり値よりかなり弱い。チロシル-tRNAシンテ ターゼのミューテーションの分析から、電荷した水素結合ペアの破壊に対する自 由エネルギーの損失は3.5-5kcal/モルであり、中性の水素結合ペアに対しては0. 5-1.5kcal/モルである。Fersht等,Nature,314:235-238(1985)。hGH由来の7の側 鎖がhGHbpと水素結合を形成している(H18,Q46,S62,K168,E174,T175及びR178)。 これらの5は電荷水素結合であり(Q46,K168,E174,T175,R178)、しかしそれらをア ラニンに変換した場合結合自由エネルギーの変化はそれぞれわずかに+0.1,-0.2, -0.9,+2.0及び+2.0kcal/モルであり、平均値は+0.6kcal/モルを与える。2の中性 水素結合側鎖(H18及びS62)をミューテートすることに対するアフィニティーの変 化はそれぞれわずかに-0.5及び+0.1である。3の他の側鎖はhGHbpと塩架橋を形成 し(R64,R167及びD171)、しかしこれらはそれぞれわずかに+1.6,+0.3,及び+0.8kc al/モルの減少を引き起こすのみである。これらの値は+1.8から+2.3kcal/モルの 範囲であるサブチリシンでの2の作製された塩架橋に対して見積もられたものよ り小さい。Wells等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:1219-1223(1987)。それゆえ接 触の強さはhGH-hGHbp界面で広く変化し、相互作用は小分子結合部位のものと比 較した場合かなり弱い。 タンパク質内部のミューテーションの研究から、各隠れたメチレン基が全ホー ルディングエネルギーに対して-1.0から-1.5kcal/モルの貢献をすることが見積 もられている(最近のレビューとしてShortle,Quart.Rev.Biophys.,25:205-250(1 992)及びそれの参考文献参照)。hGH内の疎水性側鎖の数をアラニンに変換するこ とは、これらの研究から期待されるであろうよりずっと弱い効果を引き起こした 。例えば疎水性側鎖でのミョーテーションで見られる最大の効果はL45A,K172A( 脂肪族部分のみ受容体と接触する),F176A及びI179Aに対してであり、それらはそ れぞれ+1.2,+2.0,+1.9及び+0.8kcal/モルのアフィニティーにおける減少を引き 起こす。さらに複合体形成に際してより高くまたは匹敵するほどに隠れた他のい くつかの疎水性基は、アラニンにミューテートされた場合ほとんど何の効果も持 たない。 要約すると、hGH:受容体複合体の1:2の著しい性質が見出されている、すなわ ち サイト1で隠れたhGH由来のわずかな一連の側鎖のみが、アラニンに置換した場合 結合アフィニティーに影響する。それゆえアラニンスキャニングミュータジェネ シスで定義された機能的エピトープは、隠れた残基またはファンデルワールス接 触によって定義される構造的エピトープよりかなり小さい。サイト1エピトープ 内ではないが近傍のいくつかの残基は、アラニンに置換した場合、たとえ間接的 な効果によってでも結合アフィニティーに穏やかに影響する。最後に、ほとんど の機能的に重要な側鎖は、受容体に対するホルモンのオフ-レートを調節するが 、オン-レートはしない。 実施例II 目的 hGHのサイト1のどの程度のアフィニティーが促進されるのかを決定することが 望ましかった。また、hGHのどの側鎖が結合アフィニティー--アラニンスキャニ ングミュータジェネシスによって同定されるようなアフィニティーを調節するも の、接触するために結晶学によって同定されるもの、または両者--を促進するた めにミューテートされるべきかを決定することも望ましかった。最後にもしミュ ーテーションが実質的にアフィニティーを促進し得た場合、それらがミューテー トされたホルモンのオン-レートまたはオフ-レートのいずれに影響することによ ってそれをなしたかを知ることが望ましかった。 概要 hGHの非常に高アフィニティー変異体を、合計で約106タンパク質変異体をファ ージミド粒子に一価的にディスプレーしている5の別々のライブラリーから分類 されたhGHのアフィニティー促進ミュータントを組み合わせることによって生産 した。サイト1結合部位の全部で20の異なる残基がミューテートされた。アフィ ニティーにおいてほんのわずかな増大のみが各ミュータントの側鎖から寄与され たが、これらは結合の自由エネルギーの加法の増大を生み出した。このアプロー チによって、野生型hGHより400倍もタイトに受容体を結合する15の置換をもつ一 つのhGH変異体が生産された。 物質と方法 (ａ)一般的方法 制限酵素、ポリヌクレオチドキナーゼ、T7DNAポリメラーゼ及びT4DNAリガーゼ をGibco-BRLまたはNew England Biolabsから得て、製品の説明書にしたがって用 いた。Lowman等,上記参照、およびLowmanとWells,上記参照に記述されているよ うに、ランダムオリゴヌクレオチドカセットをリン酸化し、アニールしそして構 成物につないだ。Sequenase(登録商標)酵素をUnited States Biochemicalから購 入し、シングルストランドシークエンシングのため製品の説明書にしたがって用 いた。Sanger等,上記参照。 hGHのいくつかの部位特異的ミュータントを、シングルストランドテンプレー トを用いてオリゴヌクレオチドディレクテッドミュータジェネシスにより構築し た。Kunkel等,Methods Enzymol.,204:125-139(1991)。M13遺伝子IIIのカルボキ シ末端ドメインに融合した野生型hGHをコードするプラスミドphGHam-g3(Lowman 等,上記参照)を、カセットミュータジェネシスに対する元となるベクターを構築 するために用いた。一価hGHディスプレーファージミド粒子をエレクトロトラン スフォームした大腸菌XLI-ブルー細胞(Stratagene)によって調製し、M13K07ヘル パーファージを加えた。VieiraとMessing,上記参照。 可溶性ホルモンをコードするDNA分子を大腸菌において発現し(Chang等,上記参 照)、浸透性ショックを受けた細胞から硫安沈殿し(Olson等,Nature,293:408[198 1])、Coomassie染色されたSDS-PAGEゲルのレーザーデンシトメトリーによって定 量した。Cunningham等,上記参照。さらにいくつかの変異体をMono-Qカラム(Phar macia-LKB Biotechnology,Inc.)においてイオン交換クロマトグラフィーによっ て精製した。 (ｂ)hGHファージミドライブラリーの調製 hGHのMinihelix-1(41-46残基)のミュータジェネシスのため、phGHam-g3におい て存在するAatII部位を、オリゴヌクレオチド#718(5'-GCC ACC TGA TGT CTA AGA AAC-3')(SEQ.ID NO.1)を用いて破壊した。独特なSfiＩとAatII部位をオリゴヌ ク レオチド#782(5'-TTT GAA GAG GCC TAT ATG GCC AAG GAA CAG AAG-3')(SEQ.ID N 0.2)と#821(5'-CAG AAC CCC CAT TGA CGT CCC TCT GTT TC-3')(SEQ.ID NO.3)を それぞれ用いてpH0779を創るためにphGHam-g3内に導入した。後者のオリゴヌク レオチドはまた+2フレームシフトと49残基の後にTGAストップコドンを導入した 。ランダムなカセットを相補的オリゴヌクレオチド＃822(5'-TC CCG AAG GAG CA G NNS NNS TCG TTC NNS NNS AAC CCG CAG ACG T-3')(SEQ,ID NO.4)と＃823(5'-C TG CGG GTT SNN SNN GAA CGA SNN SNN CTG CTC CTT CGG GAT AT-3')(SEQ.ID NO. 5)から構築した。元となるDNA(pH0779)を制限酵素SfiＩとAatIIで切断し、大き い断片を精製しカセットとつないだ。ライゲーション生産物を、LowmanとWells, 上記参照に記述されているように、2の等量でファージミド調製物に対してXL1- ブルー細胞内にエレクトロトランスフォームし、1×106の独立なトランスフォー マントをそれぞれ生産した。 Loop-A(54-64残基)ライブラリーを構築するために、phGHam-g3に存在するAatI I部位をオリゴヌクレオチド＃718を用いて破壊した。独特なAatIIとBstEII制限 部位をオリゴヌクレオチド＃719(5'-AAC CCC CAG ACG TCC CTC TGT-3')(SEQ.ID NO.6)と＃720(5'-GAA ACA CAA CAG TAA AGG TAA CCT AGA GCT GCT-3)(SEQ.ID NO .7)を用いてpH0709を構築するためにhGH遺伝子に導入した。後者のオリゴヌクレ オチドはまた+1フレームシフトと69残基の後にストップコドンを導入した。加え て独特なEcoRＩ部位を、以前のライブラリー(LowmanとWells,上記参照)由来の考 え得るコンタミネーティングクローンに対して制限選択を許容するために、オリ ゴヌクレオチド＃536(5'-CGT CTT CAA GAG TTC AAC TTC TCC-3')(SEQ.ID NO.8) を用いて破壊した。ランダムカセットを相補的オリゴヌクレオチド＃803(5'-pCC CTC TGT NNS TCA NNS TCT NNS CCG ACA CCC AGT AAT NNS GAG GAA ACA CAA CAG AAG A-3')(SEQ.ID NO.9)と＃804(5'-pGTT ACT CTT CTG TTG TGT TTC CTC SNN A TT ACT GGG TGT CGG SNN AGA SNN TGA SNN ACA GAG GGA CGT-3')(SEQ.ID NO.10) から構築した。元となるDNA(pH0709)を制限酵素AatIIとBstEIIを用いて切断し、 大きい断片を精製しカセットにつないだ。ライゲーション生産物を、2の等量で ファージミド調製物に対してXL1-ブルー細胞内にエレクトロトランスフォームし 、1.6×106と1.0×106の独立なトランスフォーマントを生産した。 (ｃ)hGHファージミドライブラリープール由来の組み合わせhGHライブラリー Helix-1とHelix-4bプール由来のDNA(0,2または4周から選択された;Lowman等, 上記参照)を精製し、制限酵素AccＩとBstＸＩを用いて切断した。それから各Hel ix-1プール(F10,M14,H18及びH21でランダムにミューテートされた)を精製し、3 の組み合わせライブラリー707A(非選択Helix-1プールとHelix-4bプール)、707B( 2度選択されたHelix-1プールと2度選択されたHelix4bプール)、707C(4度選択さ れたHelix-1プールと4度選択されたHelix4bプール)を生産するために、各Helix- 4bプール(E174S,F176YバックグランドでR167,D171,T175,I179でランダムにミュ ーテートされた)由来の小さな断片とつないだ。二重のライゲーションもまた、 ベクターDNAの10分の1から2分の1を用いて作製し、707D,707E及び707Fとしてデ ザインし、それらはそれぞれ0-,2-及び4-周のスタートライブラリーに相当した 。これらの変異体プールはまた早期のhGH-ファージミド-結合選択で得られたE17 4S,F176Yミューテーションを含んだ。Lowman等,上記参照。ライゲーション産物p H0707A-Fをプロセッシングし、XL1-ブルー細胞内にエレクトロトランスフォーム した。コロニー形成ユニット(CFU)に基づいて、各プールから得られた独立のト ランスフォーマントの数は以下のようであった:pH0707Aからは2.4×106、pH0707 Bからは1.8×106、pH0707Cからは1.6×106、pH0707Dからは8×105、pH0707Eから は3×105、及びpH0707Fからは4×105。hGH-ファージミド粒子を調製し、Lowman 等,上記参照に記述されているように2から7サイクル以上のhGHbp結合に対して選 択した。 hGHのいくつかの変異体をHelix-1及びHelix-4bライブラリーから単離した変異 体を組み合わせることによって構築した。元となる変異体は各ライブラリー由来 の3の最も強い結合であった:A=H10,G14,N18,N21;B=A10,W14,D18,N21;C=F10,S14, F18,L21;D=N167,S171,S174,Y176,T179;E=E167,S171,S174,Y176,1179;F=N167,N17 1,S174,Y176,T179。hGH-ファージミドDNAを精製し、制限酵素EcoRＩとBstＸＩで 切断した。それから各Helix-4b変異体由来の大きい断片を精製し、Helix-1とHel ix4bの両者でミューテーションを持つ組み合わせ変異体を生産するために、各He lix-1由来の小さい断片につないだ。これらの変異体を、Helix-1(A,BまたはC)及 びHelix-4B(D,EまたはF)ミューテーションのそれぞれのペアの組み合わせを示す 、 AD,AE,AF,BD,BE,BF,CD,CE,CFとしてデザインした。 一連の5のオリゴヌクレオチドを、変異体BDにおけるファージ由来ミューテー ションのいくつかを相当する野生型残基に戻すために用いた:D18H,N21Hに対して ＃797(5'-CTG CGT GCT CAC CGT CTT CAC CAG TTG GCC TTT G-3')(SEQ.ID NO.11) ;Y176Fに対して＃798(5'-GTC AGC ACA TTG CTG CGC ACC-3')(SEQ.ID NO.12);A10 F,W14Mに対して＃799(5'-CTC TCG CGG CTC TTC GAC AAC GCG ATG CTG CGT GCT-3 ')(SEQ.ID NO.13);N167R,S171Dに対して＃800(5'-TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG GTC AGC-3')(SEQ.ID NO.14);T179Iに対して＃801(5'-CTG CGC ATC GTG CAG TGC)(SEQ.ID NO.15);A10Fに対して＃875(5'-CTC TCG AGG CTC TTC GAC AAC GCG TGG-3')(SEQ.ID NO.16)。 hGH変異体852dをテンプレートとしてBD及び以下のオリゴヌクレオチドを用い て構築した:F54Pを付加することに対して＃843(5'-CAG ACC TCC CTC TGT CCC TC A GAG TCT ATT CCG-3')(SEQ.ID NO.17);R64Kに対して＃844(5'-ACA CCC TCC AAC AAG GAG GAA ACA CAA CAG-3')(SEQ.ID NO.18);K41I,Y42H,L45W,Q46Wに対して＃ 846(5'-CCA AAG GAA CAG ATT CAT TCA TTC TGG TGG AAC CCC CAG ACC TCC-3')(S EQ.ID NO.19)。変異体852bをテンプレートphGHam-g3で同じオリゴヌクレオチド を用いて構築した。 (ｄ)ラジオ免疫沈降アッセイ hGHbpに対する平衡化結合アフィニティーを125IラベルhGH、ラベル変異体BDま たはラベル変異体852dとの競合により、結合バッファー:50mMTris,pH7.5、10mMM gCl2、0.1％ウシ血清アルブミン、0.02％アジ化ナトリウムにおいてhGH変異体を アッセイすることにより測定した。Lowman等,J.Biol.Chem.,266:10982-10988(19 91)。hGH-hGHbp複合体の免疫沈降を、MAb5と示されるモノクローナル抗体を用い て実施した。Barnard等,Endocrinology,115:1805-1813(1984)。解離定数をスキ ャッチャード分析により得た。CunninghamとWells,1989,上記参照。変異体BDと8 52dは、もしヨウ素で処理されるとホルモン-受容体界面を乱し得るF176Yを含む 。しかしながらヨウ素化BDは結合に対して125IラベルBDと競合する非ラベルBDか ら区別がつかなかった(つけられなかった)。 (ｅ)速度論アッセイ 固定化されたhGHbpへのhGH変異体結合に対する会合及び解離レート定数を、Ph armacia BIAcoreTMバイオセンサーを用いて表面プラズモン共鳴(SPR)の測定によ り得た。このシステムでは、hGHbpをバイオセンサーチップに付着したデキスト ランマトリックスに共有結合で結合する。一定の流速でこの表面を通過する液相 でホルモンを一定の濃度で維持する。この装置はバイオセンサー近傍の屈折指標 の変化のためSPRシグナルの変化を感受することにより、リアルタイムでマトリ ックス上に結合したタンパク質の量を測定する。LofasとJohnsson,J.Chem.Soc.C hem.Commun.,21:1526-1528(1990)。 hGHbp(S201C)の変異体をマトリックス上の第二の受容体をブロックするため固 定化種として用いた(実施例Ｉ参照)。hGHbp(S201C)を減少し、10mM酢酸ナトリウ ム(pH5.0)を用いて、デキストラン層のEDC/NHS活性化を経て、及び2-(2-ピリジ ニルジチオ)エタンアミン塩酸(PDEA)(活性化チオール)化学を経て、バイオセン サーチップに結合した。試薬と手順はPharmacia Biosensorから得た。結合と溶 出工程を0.05％Tween-20を含むPBSバッファー(pH7.4)で3-20μL/分の流速で実施 した。 マトリックスに結合したhGHbpの密度は絶対的なKオン及びKオフには影響するが、 野生型hGHに対して2倍までは相対的Kオン及びKオフには影響しない。それゆえ異なる バイオセンサーチップを用いた場合、野生型hGHに対する速度論パラメーターは 、その速度論パラメーターが異なるバイオセンサーチップで測定され得る異なる 変異体と比較することにより野生型hGHに対する速度論パラメーターが標準化さ れるために決定された。そのように得られた相対的速度論値は、異なるフロー細 胞でも一致し、計算されたアフィニティー測定値はラジオ免疫沈降アッセイの結 果とよく相関した。解離レート定数を時間に対するln(Ro/Rt)をプロットするこ とにより得た;会合レート定数をホルモン濃度に対する[R1に対する(dRt/dt)の傾 斜]をプロットすることにより得(Karlsson等,上記参照)、またはBIAcoreTMバイ オセンサー速度論評価ソフトウェアー(Pharmacia Biosensor)を用いてホルモン 濃度に対するln(dRt/dt)を測定することにより得た。平衡化解離定数、Kd'sをKオ フ /Kオンとして計算した。Kオンに対するδオンとKオフに対するδオフという標準偏差を、2 以上の一連の2 倍または3倍の希釈(Kオン)または2以上の濃縮(≧5μM)ホルモンサンプル(Kオフ)を用 いて測定することから得た。計算されたKd'sにおける結果としての誤差(ε[K]) を、K=f(Kオン,Kオフ)の全誘導体を用いて以下の公式にしたがって見積もった:(議論 についてはBevington,上記参照を参照) ε[K]=[(δK/δKオフ)2(d[Kオフ])2+(δK/δKオン)2(d[Kオフ])2]1/2 （1） ε[K]=[(Kオン)-2(δオフ)2+(Kオフ)2(Kオン)-4(δオン)2]1/2 （2） 結果 (ａ)hGH-受容体結合機能的エピトープ内の残基 hGH(hGHbp)2複合体の構造的分析(de Vos等,上記参照)により、第一の受容体が 結合する場合にある程度隠れている状態にあるhGHのサイト1における30以上の側 鎖が同定された(図6B)。これらのほとんどは構造的解明の前にアラニンミュータ ントとして試験されたが(CunninghamとWells,1989,上記参照;1991,上記参照)、 第一のミニヘリックス(Minihelix-1)における4残基(K41,Y42,L45及びQ46)は評価 されていなかった。それゆえこれらの残基をアラニンに変換し、結合アフィニテ ィーにおける効果を[125I]-hGHを用いた競合的置換及び免疫沈降(CunninghamとW ells,1989,上記参照)によってまたはPharmaciaから得たBIAcoreTMバイオセンサ ーを用いてそれぞれで測定した。両方法とも実施例Ｉで示されているように比較 可能なアフィニティー測定値を与えた。 Y42とQ46の側鎖は受容体結合において高く隠れるようになったが、アラニン置 換はアフィニティーにおいて2倍の減少より少ないものを引き起こした(表3)。Le u45はY42またはQ46より受容体に対して少ししか接触しないが、L45Aミュータン トはアフィニティーにおいて10倍の減少を引き起こした。Lys41は受容体のGlu12 7と塩架橋を形成する。K41AミュータントをコードするDNAはアフィニティー測定 のための物質を得るためにはあまり十分には発現しなかった;しかしながらより 保存的な変異体、K41QをコードするDNAは十分によく発現した。この変異体は野 生型hGHの2.6倍低いのアフィニティーを持った。それゆえMinihelix-1領域はhGH サイト1内の機能的エピトープの明確な一部である(図6A)。これらのデータと実 施例Ｉよ り、第一の受容体がサイト1に結合した場合に側鎖が隠れるようになる残基での 少なくとも一つの置換(大抵アラニン)に対して効果を測定していた。 (ｂ)ランダムミュータントライブラリーのデザインと分析 構造的及び/または機能的サイト1エピトープ内の4残基を無作為化した5の別々 のライブラリーを分類した(図7)。4のランダムコドンに各ライブラリーを制限す ることは、ライブラリーサイズ(平均約1×107の独立のトランスフォーマント)内 にほとんどの考え得る変異体(約1×106DNA配列から生産される約2×105タンパク 質配列)のサンプリングを許容した。 以前に、K172,E174,F176及びR178残基が無作為化され一価ファージミド粒子に ディスプレーされた一つのライブラリー(Helix-4aと呼ばれる)を生産した。Lowm an等,Biochemistry,上記参照。結合選択の2サイクル後、最もタイトな結合ミュ ータント(E174S,F176Y)は、野生型hGHの約5倍高いアフィニティーを持った。こ れらの2のミュータントをE174S,F176YバックグランドでR167,D171,T175及び1179 がランダムにミューテートされた第二のライブラリー(Helix-4bと呼ばれる)内に 固定した。選択の6周後、野生型hGHより約8倍タイトに結合する5のミュータント を単離した。別々のライブラリー(Helix-1と呼ばれる)において、F10,M14,H18及 びH21残基をランダムにミューテートした。選択の4周後、野生型hGHより3倍タイ トに結合する4のミュータント(F10A,M14W,H18D,H21N)を単離した。 ここで、ファージ選択研究をループ結合ヘリックス1及び2に拡大した。Minihe lix-1内の4の接触残基(K41,Y42,L45及びQ46)を無作為化し、結合選択の2から7周 後代表的なクローンをシークエンスした(表4)。スタートのライブラリー内の残 基の頻度から期待されるものと比較して、いくつかの残基は与えられた位置で高 く過剰に代表された。例えばクローンの約35％がQ46Wミューテーションを含んだ 。これはライブラリー内のTrpに対してランダムな機会の生ずるより大きい7.6標 準偏差ユニットであった。これは期待されるコドンの偏りとサンプリング統計を 説明するので、コンセンサス配列を確立するために選択物のプールを記録するよ い方法である。この基準によって、K41Rに対して穏やかな好み、Y42RまたはY42Q に対してわずかな好み、L45WまたはL45に対して強い好み、Q46Wに対してより強 い好みがあった。 第二のライブラリー(Loop-Aと呼ばれる)をF54,E56,I58及びR64をランダムにミ ューテートして構築した。アラニン置換は、側鎖に依存するアフィニティーにお ける4から20倍の減少を引き起こした(図6A)。R64は受容体と直接的に接触するた った一つの残基であるという事実にも関わらず(図6B)、全ての位置が通常野生型 由来の異なるものである特定の残基に対する強い指向性を変化する温和性を示し た。R64Kが最も好ましかった(クローンの81%で見出される);R64K単独では結合ア フィニティーにおいて3倍の改良を引き起こす。Cunningham等,Science,247:1461 -1465(1990)。今後好ましさの順番はF54P>I58T>E56DまたはE56Wとなった。 これらのミュータントに対する結合アフィニティーを、hGHの最後と遺伝子III ドメインの最初でアンバーコドンで翻訳を終結する非サプレッサーホストにおい て遊離ホルモンを発現することによって分析した。Lowman等,Biochemistry,上記 参照。Minihelix-1ライブラリー由来の結合選択の3から7周の間でテストされた 事実上全てのクローンが、野生型hGHより強いアフィニティーを持った(表5)。最 高のものはK41I,Y42H,L45W,Q46Wであり、それは野生型hGHのアフィニティーの4. 5倍の改良となった。このDNA配列は、百万のクローンにおいて一つの頻度でラン ダムに生じることが期待され、それはアフィニティー選択の能力を示す。同様の 結果は、 最高の単離物がF54P,R64K及びF54P,E56D,I58T,R64KであるLoop-Aライブラリーか らも得られ、それらは野生型hGHを約5倍改良した。 (ｃ)付加的要素を用いたアフィニティーの改善 付加的要素にしたがって、タンパク質の非相互作用部分でのミューテーション が、結合の自由エネルギーの単純な付加的変化を生み出すために組み合わされる べきである(Wells,1990,上記参照)。それゆえファージディスプレーライブラリ ーから単離された置換と組み合わせることによってサイト-1を通じたhGH結合を 改良するため調査された(図7)。Helix-1ライブラリー由来のhGHの3の最もタイト な結 合変異体(A=F10H,M14G,H18N,H21N,B=F10A,M14W,H18D,H21N,C=M14S,H18F,H21L)を Helix-4bライブラリーで見出された3の最もタイトな結合変異体(D=R167N,D171S, E174S,F176Y,I179T,E=R167E,D171S,E174S,F176Y,F=R167N,D171N,E174S,F176Y,I1 79T)のそれぞれに接合した。全ての構築物を変異体Aを含むものを除いて野生型h GHの産出量に近づけた産出量で得た。変異体A及び組換え体AD,AE,AFは、非還元S DS-PAGEではダイマー(約44kDaのMW)、還元の場合にはモノマー(約22kDaのMW)で 移動した。これらのタンパク質は付加的なCys残基を含んでいないが、それらが 最初に非共有結合ダイマーを形成するのであれば、ジスルフィド交換が生じ得た 。実際hGHはヘリックス1及び4での残基に関与する弱いダイマー複合体を形成す ることが知られている。Cunningham等,Science,253,1991上記参照。それにもか かわらず、これらのタンパク質はジスルフィドダイマーを形成したので、それら をさらに追求しなかった。変異体Cもまたジスルフィドダイマー形態で優勢に生 産される;しかしながらCD,CE,CF組換え体は有意な量のダイマーを形成しなかっ た。 分析された全ての組換え体が元となる構成要素以上のアフィニティーにおける 累積的な増大を示した(表6)。BD変異体は最も強いアフィニティーを持ち、それ は野生型hGHの30倍タイトであった。Minihelix-1ライブラリー由来の最もタイト な結合変異体(K41I,Y42H,L45W,Q46W)と、Loop-Aライブラリー由来の最もタイト な形態の一つ(F54P,R64K)をヘキサミュータントhGH852bを生産するために組み合 わせ、hGH852bのアフィニティーは野生型hGHの約40倍であった。これをhGH変異 体852dを生産するためにBD組換え体に入れ込み、852dは野生型hGHより約400倍タ イトに結合した。単純な加法を仮定すると、この変異体は個々の構成要素による アフィニティーの改良の産物から由来して、hGHより約600倍タイトに結合するで あろう;この計算値は本結果に合理的に近い。852d変異体は無作為化された20残 基の5だけが野生型として維持されている(E56,I58,K172,T175,R178)。 (ｄ)hGHの組み合わせライブラリー 独立に分類されたライブラリー由来の組み合わせミュータントで見出された単 純な付加にもかかわらず、複雑な付加がある近傍の置換に対して観察されている (例えばF176YはE174Sと相互作用する)。Lowman等,Biochemistry,上記参照。ヘリ ックス1からミューテートされたいくつかの側鎖は(F10,M14,H18,H21)、ヘリック ス4でミューテートされたもの(R167,D171,T175及びI179)と潜在的に接触し得る 。それゆえHelix1とHelix4bライブラリー(Huse等,Science,246:1275-1281[1989] ;Clackson等,Nature,352:624-628[1991])から由来する分類ミュータントに対す る組み合わせアプローチを調査した。独立の結合選択を0,2または4サイクルでHe lix-1とHelix-4bで実施した。Helix-1プール由来のDNAを同じ周数に対するhGHbp への結合によって分類されたHelix-4b由来のDNAと共につないだ。それから3の組 み合わせライブラリーを付加的な2から7サイクルに分類し、68の代表的なクロー ンをシークエンスした(表7)。 全般的に、これら3の組み合わせ分類のいずれかから単離された最高アフィニ ティー変異体は、Helix-1とHelix-4bライブラリーの独立の分類によって以前に 単離されたものと似ていた。Lowman等,Biochemistry,上記参照。例えばHelix-1 ライブラリーから以前に単離された最高アフィニティーミュータントはF10A,M14 W,H18D,H21N(Helix-1.B)及びF10H,M14G,H18N,H21N(Helix-1.A)であった;これら は野生型hGHよりそれぞれ約3.3倍及び2.4倍タイトに結合した。Helix1.A配列を 組み合わせライブラリーA由来のクローンの60%で回収し、組み合わせライブラリ ーBを分類した早期の周で単離されたクローンの13%で回収した。Helix-1.B配列 は組み合わせ ライブラリーBを分類した後期の周で支配的であった。これらのほとんどは異な るDNA配列を持ち、通常ヘリックス4で選択されたミュータントと異なるので、独 立のクローンである。 同様の結果はヘリックス4での選択物でも得られた。Helix-4bライブラリーを 独立に分類すると、R167N,D171SまたはN,T175(保存的)及びI179Tを含む配列数が 得られた。Lowman等,上記参照。これらは組み合わせライブラリーA,B及びCで選 択される傾向にあるものと同じ残基であった。実際以前に単離された最高のミュ ータントの一つ(R167N,D171S,T175,I179T)は、組み合わせ分類で共通に単離され 、特に後期の周で支配的であった。 組み合わせ手段によって分類されたいくつかの配列は、2の独立のライブラリ ーから選択されたものと全く異なった;しかしこれは統計学的な理由が生じ得る 。例えばHelix-1及びHelix-4bライブラリーは約106の異なるDNA配列を含み、も し(前選択なく)組み合わせられると、1012のあり得る組み合わせを含み得る。ト ランスフォーミング効率は-107の独立のクローン以下のサンプリングサイズが限 界である。それゆえ同じ配列の選択はこれらのライブラリーで生じ得る配列の高 多様性に顕著に与えられ、選択されたアフィニティーに穏やかな改良を与えられ る。 これらの単離物の数に対するアフィニティーを測定した(表7)。全てが野生型h GHと比較すると結合アフィニティー(2から29倍)を改良した。ほとんどがE174S,F 176Yに改良され、スタートクローンの全てにおいてそれらは存在し、野生型hGH のアフィニティーに対して5.6倍の増大を引き起こした。Lowman等,Biochemistry ,上記参照。最高アフィニティー変異体は分類の後期の周から一般的に単離され 、そのプールにおいて高く豊富である。例えば試験された最高アフィニティーミ ュータントはクローン717B.1であり、それは組み合わせライブラリーBの分類の7 周後に単離された。この単離物はそのプールで第3に代表的なクローンであった 。特筆すべきは、D171Sの代わりにそれは保存的置換、D171Aを含むことを除いて 、このクローンはBD変異体と同一である(表6)。驚くべきではないが、717B.1とB D変異体は匹敵するアフィニティーで結合する(それぞれ12pM及び10pM)。これら のデータは組み合わせストラテジー及び付加的ストラテジーは、アフィニティー の成功した最適化のための匹敵する溶液を産することを示す。 (ｅ)アフィニティー成熟における個々の側鎖の改良の試験 結合アフィニティーに対するファージ改良残基のいくつかの寄与を野生型hGH にそれらを導入することによって、またはアフィニティー成熟BD変異体における 野生型残基にそれらを戻すことによって評価した(表8)。K41I,Y42H,L45W,Q46W変 異体は、野生型hGHの4.5倍タイトに結合した。hGHにおける単一のミュータント のそれそれはアフィニティーにおいて1.7から2.5倍の減少を引き起こした。これ らはこの部位でのミューテーションの組み合わせがアフィニティー改良に対して 重大であることを示す。これらの残基はミニヘリックス-1の一表面で近接した位 置で存在する。 BD変異体での置換によって引き起こされるアフィニティー改良を、個々的なま たはペア(残基が近接している場合には)のそれぞれで置換を野生型に戻すようミ ューテートすることによって試験した(表8)。これにより、9の置換のうち7が結 合における大変わずかな改良のみに寄与していることが示された(1.1から1.7倍) 。最も支配的な効果であるF176Yでさえ、結合における4.6倍の改良を与えるのみ である。それにもかかわらず、F10A,M14W,H18D,H21N,R167N,D171S,F176Y,I179T というオクタミュータントでのこれらの効果の産物は、野生型hGHに対してアフ ィニティーにおいて16倍の改良を予想する。これは付加的なE174Sを含むBD変異 体に対して測定された34倍の増大に比較される。 (ｆ)結合の速度論に対するアフィニティー成熟の効果 実施例Ｉでは、受容体結合に際してサイト1で隠れるようになるhGH内の残基で 生産されるアラニンミュータントに対する結合の速度論を測定するために、BIAc oreTMバイオセンサー装置を用いた。ここで選択されるアフィニティー改良に対 する分子ベースのよりよい理解のため、hGHbpに対する結合の速度論を測定する ためにBIAcoreTMバイオセンサーを用いた(表9)。一般的に野生型hGH由来のアフ ィニティーが増大するにつれて、オフ-レートはオン-レートのわずかな変化と共 に減少した。実際最高アフィニティーミュータント、852dに対する野生型由来の 作用では、オフ-レートにおいて>60倍の減少があるが、オン-レートでは4倍の増 加があるに過ぎなかった。(オフ-レートはあまりに遅くて正確には測定できなか ったが、もしRIAとオン-レートによって測定されたKdから計算すると、オフ-レ ートは野生型hGHより100倍遅いであろう。)hGH結合部位はhGHのホモローグ、ヒ ト胎盤ラクトゲン(hPL)内に以前に挿入された。これはhGHとは15%だけ配列にお いて差異があり、〜2000倍弱く結合する。Lowman等,J.Biol.Chem.,上記参照。挿 入されたhPL変異体は、hGHと同様の結合に対する速度論的パラメーターをもつ( 表9)。アフィニティー成熟hGH変異体と同様に、この変異体は野生型hPLと相対的 にオン-レート(約10倍)と比較してオフ-レート(〜100倍)でより大きい改良を示 す。オフ-レートがファージ選択物の間で最も影響されるという事実は、分類が 平衡に近づけるコンディションの元で実施されたことを示す。 結論 受容体と接触する位置にあるため、またはアラニンに変換された場合結合アフ ィニティーに影響するため、重要であると考えられるhGHの領域をランダムにミ ューテートした。それゆえ、これらのライブラリー由来の平均的なランダムなミ ュータントは野生型hGH由来の結合アフィニティーを劇的に減少すべきである。 しかし選択の2,3の周のみの後では、単離物は野生型と同等及びしばしばより高 いアフィニティーで結合した。単離されたクローンは通常野生型とは異なるコン センサス配列を示した(表4)。 アフィニティーにおける大変小さな改良なら、これらのライブラリーにおいて 急速におよびほとんど限定的に集中して導かれた。例えばR64Kミュータントは単 独で野生型hGHの約3倍タイトにのみ結合する(Cunningham等,1990,上記参照)。し かし結合選択のちようど3周後、R64Kはライブラリーで支配的となった(表5)。同 様にI179Tはアフィニティーにおいて1.7倍の改良のみに寄与した(表8)。しかし ながらLowmanとWells,上記参照のHelix-4bライブラリーにおいて別々に分類され 、 またはHelix1においてミュータントと共に組み合わされて分類されると(表4と7) 、I179Tはほとんど限定的に選択されることが見出された。アフィニティーにお けるこれらの些細な改良に対する強い選択は、プールにおける最高のアフィニテ ィー変異体を回収するための本方法の能力を強調する。 全ての変異体がファージにディスプレーされるわけではない(WellsとLowman,C urrent Opinion in Struct.Biol.,2:597-604[1992])。これは、誤ってホールデ ィングされ、不安定なミュータントがプロテアーゼにより切断され、凝集し、ま たは分泌あるいはファージ上での集合をブロックされるかのいずれかのためであ る。特定のDNAに対する強い偏向があるようには思われないが、hGHミュータント に対する選択が以前に注目されていたCys-含有ミュータントに対する明確な選択 がある(LowmanとWells,上記参照)。同時にミューテートされるコドンの数は故意 に4に限定したが(約106DNA配列)、これはファージミドのスタートプール(約107 の独立のトランスフォーマント)においてそれぞれを代表させるよい機会であろ うためである。 第一の受容体によってサイト1で隠れるようになる側鎖の半分より少ないもの が、アラニンに変換されると結合アフィニティーに有意に影響する[実施例1、図 1A]。ミニヘリックス-1接触残基はこの良い例を提供する(表3)。Y42とQ46側鎖は より大きいファンデルワールス接触をなし、K41とL45の組み合わせより単独でよ り隠れるようになる。しかしY42AとQ46AはK41とL45でのミューテーションと比較 して結合に対してほとんど影響をもたない。 これらの研究は、側鎖が受容体と接触する範囲によっては相関関係は容易には 評価されないことを示す。これを評価するもう一つの方法は、野生型残基が受容 体によって隠されている範囲と、結合選択の後野生型残基の保存性を相関するこ とである。図8Aに示されているように、全般的にファージミドライブラリー由来 の野生型残基の保存性と本質的に相関関係はない(R2=0.022)。これはまた図6Bと 図6Cを比較することによっても明らかである。しかしながら3の最も保存的な側 鎖(T175,R178,L45)は全て受容体との実質的な接触をなす。 アラニンスキャニングミュータジェネシスによって評価されたようなアフィニ ティーにおける減少と、ファージ分類に引き続く側鎖の保存性との間に穏当な相 関関係(R2=0.71)がある(図8B;図6Bと図6Cを比較)。おおよその直線一致性は(y=3 .9+1.0x)にみられる。もし組み合わせライブラリー由来のデータを含めば、R167 が加えられ、相関関係は0.65に下降する。保存性に対する機能的な重要性につい ての傾向は、構造を考慮に入れる以上に無作為化される選択される残基に対する 構造的情報を考慮することを主張する。 これらのデータは、アラニンスキャニングミュータジェネシスによって決定さ れた機能性が結合選択の後配列保存性によって決定されたものと同様であること を示す。しかしながら天然の変異体成長ホルモンの間の与えられた残基の保存性 の頻度と、ファージ-ディスプレーライブラリー由来の結合選択に引き続く保存 性の間に何の相関関係もない(R2=0.005)(図8C)。天然では、成長ホルモンに対す る機能的な選択圧がin vitro結合選択によるものと一致していない。 界面であれホルモン自体であれ、機能的に重要で高く隠された部位で選択され た残基の多くが野生型残基または近いホモローグで維持されている傾向にある。 例えば過度のファージ分類の後で野生型のように最も保存されている5の残基の 全て(E56,158,K172,T175及びR178)が、複合体において完全に隠されている;それ らのアラニンへの置換はアフィニティーにおいて4から60倍の減少を引き起こし た(CunninghamとWells,1989,上記参照)。これらの部位での置換が許容されると 、それらは典型的には野生型残基と同等であった。例えば最高アフィニティー選 択物は56位でAspまたはGluを、58位でベータ-分枝状残基を、172位でLysまたはA rgを、175位でThrまたはSerを、178位でLysまたはArgを含んだ(表5;Lowman等,Bi ochemistry,上記参照)。 受容体結合において高く隠されるようになる機能的に重要な残基のもう一つの グループがある(K41,L45,R64,D171及びI179)。これらを無作為化した場合、野生 型残基と性質において同等な傾向にある改良された置換が見出される。例えばK4 1はしばしばArgに置換される;L45はおおきな疎水性側鎖をもつものに置換される ;R64はLysに最も頻繁に置換される;D171は場合によりAsnに、時々Serに置換され る;I179は通常β-分枝状残基に置換される(表4,5及び7;Lowman等,Biochemistry, 上記参照)。それゆえ改良は界面で隠された機能的に重要な残基でなされ得る-- それらは等配電子側鎖に向けられてまたは同等な化学的性質の一つである傾向に あ る。 無作為化された残基の2は(H18及びE174)、アラニンに変換された場合結合アフ ィニティーを促進し、複合体の中に完全に隠れた。これらはほとんどいつも野生 型残基よりも小さいものに分類された。例えばH18に対する好ましい置換はAspま たはAsnであり、E174に対してはAla,SerまたはThrであった。Lowman等,Biochemi stry,上記参照。障害決定基と呼ばれるこれらの位置でのパッキングはエネルギ ー的に好ましくない。 もう一つのクラスの残基(H21,Y42,Q46及びR167)は界面で高く隠れているが、 アラニンに置換した場合結合アフィニティーにほとんど、または全く影響を持た ない。これらの残基はまれに野生型残基に戻って分類される。例えばH21はAsnに 分類される傾向があった;Y42はしばしばArgまたはGlnとして戻った;Q46はTrpを 好み、R167はしばしばAsnに分類された(表4,5及び7;Lowman等,Biochemistry,上 記参照)。これらの隠れた残基で見出されるコンセンサスにもかかわらず、それ らからなされるアフィニティーの増大は大変小さかった(表8)。それゆえ機能的 に不活性な接触残基からアフィニティーにおける改良を得るのはより困難と思わ れた。 残基のおおきなグループ(F10,M14及びF54)はホールディングされたホルモンの 中で現実に隠れており、アラニンに置換された場合おそらく間接的な構造的影響 によって、2から4倍まで結合アフィニティーに影響する。驚くべきことに、コン センサス分類に示される根本的な置換はここで許容された(表4,5及び7;Lowman等 、Biochemistry,上記参照)。例えばF54PはLoop-Aライブラリーにおけるほとんど 唯一の溶液であった。Phe54はホルモンにおいて84％隠れており、受容体との接 触をなすものから10Å離れている。ダブルミュータント(F54P,R64K)が4.8倍まで 結合を改良し(表5)、R64Kミュータント単独では〜3の因子まで結合を増大する(C unningham等,1991,上記参照)という事実にもとづいて、F54Pミュータントは約1. 6倍の因子によってアフィニティーを増大すると見積もられる。残基10及び14は 共に変化する傾向があり、それはヘリックス1でのそれらの近接した位置を仮定 すれば驚くべきことではない。一般的に選択物におけるこれら2の側鎖の容量の 合計は、F10プラスM14以下になる傾向があった。これはそれらのタイトにパック された配列に一致する。 機能的及び構造的なデータを組み合わせることによってこれらのミュータント の一般的な性質を合理化することは可能であるが、分類を通じて混入する異常な ミュータントがいつも存在する。例えばI179はβ-分枝状側鎖(特にIleまたはThr )によってほとんどいつも保存的に置換されるが、I179Sもまた出現した(表7)。 同様にL45は大きな側鎖(LeuまたはTrp)によってほとんどいつも置換されるがL45 Aもまた見出された(表5)。もしそれらが倍にすることが可能であるとすれば、該 変異体は結合アフィニティーを改良できないまたは弱めさえし得るのだが、バッ クグランドのレベルまで選択の多くの周を通じて許容されると期待できよう。 これらの研究は一価ファージディスプレーを用いた結合界面のアフィニティー 成熟に対するガイドラインを示す。アフィニティーの効率的な最適化に対する出 発点は、関連した界面の完全なアラニンスキャンである。誰もが5または6のコド ン以上を徹底的に探求することは容易にはできない(LowmanとWells,上記参照); それゆえライブラリーはアフィニティーを改良することを望み得る残基に焦点を 絞る必要がある。コドン選択を限定することもまた可能である(例えばArkinとYo uvan,Bio/Technology,10:297-300[1992]参照)が、これは有用な置換であり得る かどうかについての仮定をなす。もし仮定的に構造的界面の詳細な知識を持つな らば、なすことに更に理由がある。 アフィニティーにおける最も明確な改良が生じる残基は、最も結合に影響する アラニンスキャニングミュータジェネシスによって示されるものであった。例え ば、アフィニティーにおける最大の改良はR64K,E174S及びF176Yから由来した。E 174Aはアフィニティーを増大することがわかったが、R64A及びF176Aはアフィニ ティーにおける大きな減少を引き起こした。それゆえファージ分類において最も 高く保存された残基はアラニンスキャニングミュータジェネシスによって最も重 要であるものであるにもかかわらず、見出された変異体を未だ改良した。 機能的データは構造的データより最適化のための目標となる残基についてさら に重要となり得る。例えば受容体と接触しない(F10,M14及びF54)が、アラニンに 置換されると結合に影響するいくつかの残基は、ランダムにミューテートされる とアフィニティーの増大を生み出した。さらに受容体と接触するが、アラニンス キャニングミュータジェネシスによってほとんど機能的な有意性を持たないいく つかの残基(Y42,Q46)は、ファージミューテーションがポイントミューテーショ ンとして調べられた場合、アフィニティーを改良しない(表8)。 理想的には、共なる変化を許容するために、同じミュータジェネシス工程で互 いに接触し得る残基を無作為化するべきである。残基が接触部分に十分近い場合 、共なる変化はHelix-1,Minihelix-1及びHelix4aライブラリーで見られた。組み 合わせ手段によるライブラリーの分類は、ミューテーションが複合体に付加的影 響を導き得る状況では特に有用である。例えばもし側鎖置換が大きな構造的変化 を引き起こしたなら、それらは抗体における順応性のあるループであり得るので 、組み合わせ分類はミュータントH鎖およびL鎖の最高の組み合わせに対してラン ダムに探求することによって改良を許容しうるであろう。Huse等,上記参照;Clac kson等,上記参照;Collet等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10026-10030(1992)。 それにもかかわらず、hGHにおける改良はライブラリー間及びライブラリー内 の両者の単純な付加的影響によって生ずる傾向があり、側鎖が接触し得る場合で さえそうである。実際にこれは高アフィニティー変異体を得るために多くの残基 を独立に無作為化し得、それらを末端に組み合わせ得ることを意味する。基本的 にはそれは、側鎖間の相互作用は、結合受容体の自由エネルギーに対して、近傍 のものであれしばしばほとんど影響を持たず、または有意な影響なく埋め合わせ 得ることを示す。LowmanとWells,J.Mol.Biol.,234:564-578(1993)もまた参照し 、それは全体として参考としてここに取り込まれる。 実施例III B2036変異体 さらにGH変異体ポリペプチドをポリペプチドにおける置換残基の数を限定する ことによって潜在的な免疫原性を減少するが、サイト1での増大した結合アフィ ニティーを維持する目的を持って構築した。この実験の第2の目的は、分子内に 存在する、特に受容体とのGHの結合において重要な部位に存在するリシン残基の 数を限定し、それによってポリエチレングリコールを用いて修飾する(「ペグ化す る」)ために変異体をよりよい候補にし、一方でその受容体に対する変異体の増大 したアフィニティーを保護することであった。 それゆえ「スーパーミュータント」852dの生産のために上述したデータを用いて 、さらなる変異体B2036を上述した方法を用いて構築した。852dは以下の置換を 持つ:F10A,M14W,H18D,H21N,K41I,Y42H,L45W,Q46W,F54P,R64K,R167N,D171S,E174S ,F176Y,I179T。 対照的にここで構築された変異体(B2036)は以下の置換をもつ:H18D,H21N,G120 K,R167N,K168A,D171S,K172R,E174S,I179T。 120位での他の置換も許容されるが、G120K置換をよりよい拮抗剤候補を生産す るために加えた。拮抗剤を生産するためにいかなるアミノ酸もG120で置換し得る ;より好ましくは置換はリシン、アルキニン、トリプトファン、チロシン、フェ ニルアラニンまたはグルタミン酸である。R64K置換はペグ化からサイト1結合残 基を保護するために省略した。同様にK168A及びK128R置換をホルモン-受容体サ イト1結合界面でペグ化に有用な部位の数を減少するためにB2036に加えた。対照 的に、G120K置換はペグ化のために付加的なリシンを入手し、一方で効果的なサ イト2ブロックを生じる。 852dにおける残りの置換はヒトにおける変異体の潜在的な抗原性を減少するた めに、B2036の構築から省略した。アフィニティーにおけるある減少は852dとの 比較で予想されるが、受容体に対するB2036の予想されるアフィニティーは野生 型より未だ実質的に大きく、拮抗剤としての使用に望ましい。 B2036は120残基でグリシンをさらにもとに戻し得、それによって852dと比較し てヒトにおける抗原性を減少していると予想される作用剤としての使用に対する 候補を生産することが期待される。同様に、サイト1界面内のリシン残基の数が「 スーパーミュータント」と比較して減少しているので、該候補はより最適にペグ 化し得るであろう。 実施例IV B2024変異体 さらにGH変異体ポリペプチドをポリペプチドにおける置換残基の数を限定する ことによって潜在的な免疫原性を減少するが、サイト1での増大した結合アフィ ニティーを維持する目的を持って構築した。この実験の第2の目的は、分子内に 存在する、特に受容体とのGHの結合において重要な部位に存在するリシン残基の 数を限定し、それによってポリエチレングリコールを用いて修飾する(「ペグ化す る」)ために変異体をよりよい候補にし、一方でその受容体に対する変異体の増大 したアフィニティーを保護することであった。 それゆえ、野生型成長ホルモンより成長ホルモン受容体からの遅い「オフ-レー ト」を持つ成長ホルモン受容体を生産するために、アラニンミューテーションを 部位特異的ミュータジェネシスと組み合わせた。変異体B2024はそれゆえ以下の 配列を持つ:H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,K168A,E174A,G120K。 120位での他の置換も許容されるが、G120K置換をよりよい拮抗剤候補を生産す るために加えた。拮抗剤を生産するためにいかなるアミノ酸もG120で置換し得る ;より好ましくは置換はリシン、アルギニン、トリプトファン、チロシン、フェ ニルアラニンまたはグルタミン酸である。 B2024は120残基でグリシンをさらにもとに戻し得、それによってヒトにおける 抗原性を減少していると予想される作用剤としての使用に対する候補を生産する ことが期待される。同様に、サイト1界面内のリシン残基の数が「スーパーミュー タント」と比較して減少しているので、該候補は852dと比較してより最適にペグ 化し得るであろう。 実施例Ｖ B2036変異体の生産 B2036変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがって生産した。 方法 (ａ)発現ベクターとホスト細胞 大腸菌においてB2036変異体の発現のため用いられるベクターはpMY233であっ た(図10)。プラスミドpMY223はよく特性指摘されたプラスミドpBR322が元になっ ており、hGH生産プラスミドpHGH4RとB2036コード配列がhGHコード配列に置き変 わっていることを除いて同様である(Chang等,Gene,55:189-196[1987])。pMY223 はテトラサイクリン系抗生物質耐性をコードするが、pBR322とは異なりβ-ラク タム系抗生物質(ペニシリン、アンピシリン等)に感受性である。 pMY223によってコードされるB2036変異体と野生型ヒト成長ホルモン配列の間 のアミノ酸差異は、これらの部位でのコドンに沿って表10に示されている。 B2036変異体をPstＩ-EcoRＩ制限部位内にクローン化された1106-bp発現カセッ トから発現する。発現カセットは23残基の熱安定性エンテロトキシン(STII)シグ ナルペプチドにフレーム内で融合したB2036変異体コード配列の単一コピーを含 む(Picken等,Infection and Immunity,42:269-275[1986])。B2036変異体の転写 は大腸菌phoAプロモーターによって向けられている(Chang等,Gene,44:121-125[1 986])。翻訳開始部位はSTIIシャイン-ダルガルノ配列によって提供される。翻訳 はSTIIシグナルペプチドで始まり、それは細胞膜を通過してペリプラズム空間へ のB2036のトランスロケーションに向けられる。それからSTIIシグナルペプチド を大腸菌リーダーペプチダーゼによって除去する。成熟タンパク質はペリプラズ ムで正しい構造にホールディングし、両ジスルフィド結合が形成される。 プラスミドpMY223はプラスミドpB2036とpHGH4R由来の断片の三方向ライゲーシ ョンによって構築された。より特異的には、B2036変異体コード配列を含むpB203 6の565ベースペア(bp)NsiＩ-PvuII断片が、NsiＩ-BamHＩバックボーンとpHGH4R の405bpPvuII-BamHＩ断片にライゲートされた。 プラスミドpB2036はphGHam-g3(その構築はLowman等,Biochemistry,30:10832-1 0838[1991]に記述されている)としても知られているプラスミドpSO643から由来 し、それは実施例IIに記述されているファージディスプレー研究で用いられるス タートプラスミドであった。pB2036はB2036コード配列がhGHコード配列と置き換 わっている点でpSO643とは異なる。 B2036変異体の発現のためのホスト細胞は、大腸菌33B6であり、それは大腸菌W 3110の誘導体である(Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology,2:1190-1219[Washington,D.C.:American Society for M icrobiology,1987]参照)。33B6の完全な遺伝子型は、ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF -lac)169 deoC2 degP41(ΔPstＩ-Kan')IN(rrnD-rrnE)1 ilvG2096(ValR)である。 33B6の誘導体は以下に記述する。 スタート株、大腸菌W3110はF-とラムダ-耐性である大腸菌K-12の誘導体である 。rrnDとrrnEの間の染色体の逆位を帯びることが示されている。 fhuA遺伝子(以前にtonAと示されていた)を、fhuA遺伝子内へのTn10の挿入に引 き続き、Tn10の不正確な摘出によってW3110から欠失した。結果として得た株1A2 はバクテリオファージT1,T5及びΦ80に耐性である。 2の欠失ミュータントphoAΔE15とΔ(argF-lac)169を、proC遺伝子内にリンク したTn5挿入物と共にP1コトランスダクションによって1A2内に同時に導入した。 トランスポゾンの正確な摘出はproC遺伝子を復帰した。phoAΔE15ミューテーシ ョンはアルカリホスファターゼ発現を除去し、Δ(argF-lac)169ミューテーショ ンはこの株、7C1のLac-表現型を与える。 deoC2ミュータントはデオキシリボースリン酸アルドラーゼを除去したものだ が、それをP1コトランスダクションによって導入した。deoCローカスは一般的に スレオニン生合成ローカスにリンクしている。スレオニン栄養要求体をTn10挿入 と不正確な摘出によって作った。それからスレオニン栄養要求体をdeoC2ミュー タントで成育したP1ファージを用いてスレオニンプロトトロフィーに変換した。 deoC2ミュータントの存在は結果として生じた株、16C9が炭素源として0.2％チミ ジン上では成育できないことによって確認した。 ペリプラズムのプロテアーゼに対する遺伝子にミューテーションをもつdegP41 (ΔPstＩ-Kan')をトランスダクションによって導入した。このミュータントはde gP遺伝子の一部分をカナマイシン耐性遺伝子で置換することによってin vitroで 構築された。これはトランスポゾンではないが、カナマイシン耐性を用いて欠失 株の選択が可能である。結果として生じた株が23E3である。 ilvG2096(Val')ミューテーションをホモゲノタイゼーション(homogenotizatio n)によって導入した。このミューテーションは野生型K-12にバリンに対する感受 性を引き起こすフレームシフトを繰り返す。23E3株をilvG2096(Val')マーカーと アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドを用いてトランスフォームした。同時 にプラスミドを失いilvG2096(Val')ローカスを得た33B6株をバリン耐性からアン ピシリン感受性クローンをスクリーニングすることによって同定した。最終株、 33B6のの重要な性質は、l1ファージに耐性であり、リン酸が枯渇した場合(それ は産物合成を誘導するために用いられるコンディションである)、アルカリホス ファターゼを過剰生産せず、プロテアーゼを欠きそしてバリン毒性に感受性でな いというものである。 (ｂ)発酵 B2036変異体の発現のためのpMY223ベクターを含む33B6細胞(以下では「33B6/pM Y223細胞」という)の懸濁液を以下のように生産した。 1000-L発酵に必要とされるアミノ酸を以下の構成成分を無菌的に混ぜることに よって調製した: 3.2kg酵母抽出物; 24kg HY-CASE AMINO(Quest,Int'l,Hoffman Estates,IL); 50g メチオニン; 135L 脱イオン水。 以下の構成成分を3-5mMO2/L-分で流出可能な1000-L発酵槽に移した: 1.0L FERMAX ADJUVANT 27気泡防止剤(OSI Specialties Group,Witco Corp.,So uth Charleston,WV); 1820.0g リン酸ナトリウム二塩基酸; 910.0g リン酸ナトリウム一塩基酸二水和物; 3500.0g 硫酸アンモニウム; 700.0g クエン酸ナトリウム二水和物; 1050.0g 塩化カリウム; 700.0L 脱イオン水。 発酵槽を121℃で30分撹拌した。冷却後、以下のものを撹拌された発酵槽内に無 菌的に移した: 50kg 上記したアミノ酸栄養物; 7.7L 1M硫酸マグネシウム; 350ml 2.7％塩化鉄(III); 350ml 微量元素溶液; 2L 5mg/mlテトラサイクリンアルコール; 1L 50％グルコース。 3と5mMO2/L-分の間を供給するために十分な空気混和と撹拌で、発酵槽を37℃ で稼動し、pHをおよそpH7.3で維持した(すなわち7.0と7.5の間)。 33B6/pMY223細胞を、光学濃度(OD)が15の600nmで8-L材料として発酵槽に無菌 的 に移した。カルチャーの要求に合うように十分なグルコースを与え(しかし発酵 槽内のグルコース蓄積を避けて)、空気飽和の30％以上に溶解酸素を維持して発 酵槽を稼動させた。pHを15N水酸化アンモニウムまたは24％硫酸を用いてコント ロールし、FERMAX ADJUVANT 27を気泡のコントロールのため用いた。カルチャー がODが600nmで20に到達したら、アミノ酸栄養物を約0.06kg/分で与え始めた。 接種後およそ32時間で、カルチャーを60℃で30秒の熱殺菌によって不活性化し た。それから細胞懸濁液を遠心分離によって回収し、顆粒に凍結した。 (ｃ)細胞抽出物と純化 発酵回収物由来の凍結顆粒(以下では「細胞ペレット」という)を使用の前-60℃ 以下で貯蔵した。kg細胞ペレット当たり5Lの抽出バッファー(室温で6M尿素、0.0 2M Tris,pH7.65)を、被覆された抽出タンクに撹拌しながらゆっくりと加えた。 気泡形成を最小化した。ペレットの全てが溶液中にあるまで懸濁液を4℃で混ぜ た。pHを8.0に調節し、溶液を抽出物を形成するため4℃で2時間混ぜた。抽出物 のリットル当たり3Lの水と10mlの5％ポリエチレンイミン(PEI)を撹拌しながら加 えた。 抽出物をAlfa Laval AX213継続フロー遠心機を通過させて純化した。懸濁液を 維持するために抽出物を継続的に撹拌し、遠心機内におよそ20リットル/分(LMP) の速度で与えた。上清を被覆回収タンクにおいて集め、温度を4℃に維持するよ うにセットした。抽出物が遠心機内で完全に与えられたら、およそ75Lの精製水( 4℃)を遠心機から純化された大腸菌抽出物を回収するために遠心機内に与えた。 (ｄ)アニオン交換クロマトグラフィーＩ 純化した大腸菌抽出物をDEAE TRISACRYL LS PLUS(容量=0.36L/kg細胞ペースト )のカラムを4℃で稼動して精製した。流す前に平衡化バッファー(0.05MTris-HCl ,pH8.0,4℃)で洗浄して平衡化した。それからカラムを純化した大腸菌抽出物と 共に注入し、溶離剤のUV吸収がベースラインになるまたはそれに近づくまで、少 なくとも3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した。カラムを溶出バッファー( 3M尿素、プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン 、それぞれ18mM,pH5.0)で溶出した。カラムの注入、洗浄及び溶出を本実施例に おけ る全てのクロマトグラフィー工程についての標準的な流速で実施した。UV吸収溶 離物の画分を集め、SDS-PAGEによって分析した。B2036変異体を含む画分をプー ルした。 (ｅ)アニオン交換クロマトグラフィーII DEAE TRISACRYL LS PLUSプールをpH調節し、DEAE SEPHAROSE FAST FLOW(容量= 1.47L/kg細胞ペースト)のカラムで精製した。DEAE TRISACRYL LS PLUSプールのp Hを2％水酸化ナトリウムを用いて4℃で約7.2に調節した。平衡化バッファー(0.0 5MTris-HCl,pH8.0,4℃)で洗浄し平衡化した。それからカラムをpH調節プールと 共に注入し、溶離剤のUV吸収がベースラインになるまたはそれに近づくまで、少 なくとも3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した。カラムを溶出バッファー( 3M尿素、プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン 、それぞれ18mM,pH5.0)で溶出し、UV吸収溶離物の画分を集め、SDS-PAGEによっ て分析した。B2036変異体を含む画分をプールした。 (ｆ)Q SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィー DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをpH調節し、さらにQ SEPHAROSE FAST FLOW( 容量=0.43L/kg細胞ペースト)のカラムを4℃で稼動して精製した。DEAE SEPHAROS E FAST FLOWプールのpHを2％水酸化ナトリウムを用いて4℃で約7.2に調節した。 平衡化バッファー(0.05HTris-HCl,pH8.0)で平衡化し、pH調節プールと共に注入 した。カラムを1カラム容量の平衡化バッファーで洗浄し、0.05MNaCl、0.05MTri s,pH8.0でスタートし0.20MNaCl、0.05MTris,pH8.0で終了する直線勾配を用い、 各バッファー3カラム容量を用いて溶出した。画分を集め、SDS-PAGEによって分 析し、B2036変異体を含む画分をプールした。 (ｇ)PHENYL TOYOPEARL 650Mクロマトグラフィー コンディションを整えた後、Q SEPHAROSE FAST FLOWプールをPHENYL TOYOPEAR L 650Mカラム(容量=0.50L/kg細胞ペースト)を室温で稼動してさらに精製した。Q SEPHAROSE FAST FLOWプールを調節バッファー(1.2M硫酸ナトリウム、0.05MTris , pH7.2)を用いて、Q SEPHAROSEプールの容量の1.5倍に等しい調節バッファーの容 量を加え、約15分結果として生じた溶液を攪拌することによって整えた。それか ら溶液を室温に移した。カラムを0.22μインレットフィルターを通して3カラム 容量の平衡化バッファー(0.75M硫酸ナトリウム、0.05MTris,pH7.2)を用いて平衡 化した。それから完全に調節されたプールを0.3μ Pall Profileインレットフィ ルターを通してカラムに注入した。0.75M硫酸ナトリウム、50mMTris,pH7.2でス タートし、50mMTris,pH7.5で終了する直線勾配を用いてカラムを溶出した。各バ ッファー3カラム容量を用いた。画分を集め、SDS-PAGEによって分析し、B2036変 異体を含む画分をプールした。 (ｈ)SEPHADEX G-25クロマトグラフィー 0.05MTrisバッファー内にB2036変異体を交換することによって、PHENYL TOYOP EARLプールにおける塩を減少するためSEPHADEX G-25カラムを用いた。カラムは4 ℃で稼動した。注入の容量をカラムの全層容量の最大30％に制限した。カラムを 3カラム容量の平衡化バッファー(0.05MTris,pH7.2)を用いて平衡化し、それから PHENYL TOYOPEARLプールと共に注入した。カラムを0.05MTris,pH7.2を用いて溶 出した。280nmでのODが増大し始めたら、OD280がベースライン近くに落ちるまで プールを回収した。 (ｉ)DEAE SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィー SEPHADEX G-25プールをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0.04L/gタンパ ク質)を4℃で稼動させてさらに精製した。カラムを最低3カラム容量の平衡化バ ッファー(0.05MTris,pH8.0)を用いて平衡化した。それからカラムをSEPHADEX G- 25プールと共に注入した。カラムに対する注入リミットは樹脂のリットル当たり 2gタンパク質であった。カラムをおよそ10カラム容量の溶出バッファー(2M尿素 プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン、各17mM ,pH5.0)を用いて溶出した。溶離物の280nmでのODが0.1の値に到達したら、OD280 が0.5の値以下に下がるまで画分を集めた。該画分をSDS-PAGEによって分析し、B 2036変異体を含む画分をプールした。 (ｊ)Q SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィーによる濃縮 DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをQ SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0.07L /タンパク質のg)を4℃で稼動させて濃縮した。カラムを少なくとも4カラム容量 の0.1MHEPES,pH7.7を用いて平衡化した。完全なDEAE SEPHAROSE FAST FLOWプー ルをカラムに注入し、カラムを少なくとも4カラム容量のバッファーで洗浄した 。カラムをおよそ2カラム容量の溶出バッファー(0.1MHEPES、0.22MNaCl,pH7.7) を用いて溶出した。溶離物の280nmのODが2.0を越えたら、OD280が2.0以下に落ち るまでプールを集めた。 結果 B2036変異体はホスト細胞不純物及びCoomassieブルー染色を用いたSDS-PAGEに よって決定されるような変異体のいかなる既知の有意な減損形態から本質的に遊 離した。 実施例VI B2024変異体の生産 B2024変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがって生産した。 方法 (ａ)発現ベクター及びホスト細胞 pMY216はB2036コード配列の代わりにB2024コード配列を含む点を除いて、pMY2 23(実施例Ｖに記述されている)と同様にプラスミドpMY216を用いて大腸菌33B6で B2024変異体を発現した。 (ｂ)発酵 B2024変異体の発現のためのpMY216ベクターを含む33B6細胞(以下では「33B6/pM Y216細胞」という)の懸濁液を以下のように生産した。 以下の構成成分を3-6mMO2/L-分で流出可能な60-L発酵槽に移した: 60.0ml FERMAX ADJUVANT 27気泡防止剤(OSI Specialties Group,Witco Corp., South Charleston,WV); 156.0g リン酸ナトリウム二塩基酸; 78.0g リン酸ナトリウム一塩基酸二水和物; 300.0g 硫酸アンモニウム; 60.0g クエン酸ナトリウム二水和物; 90.0g 塩化カリウム; 36.0L 脱イオン水。 発酵槽を121℃で30分撹拌した。冷却後、以下のものを撹拌された発酵槽内に無 菌的に移した: 600.0ml 1M硫酸マグネシウム; 60.0ml 2.7％塩化鉄(III); 60.0ml 微量元素溶液; 120.0ml 5mg/mlテトラサイクリンアルコール; 90ml 50％グルコース; 6.0L 10％NZ Amine A(Quest,Int'l,Hoffman Estates,IL); 48L 脱イオン水。 3と6mMO2/L-分の間を供給するために十分な空気混和と撹拌で、発酵槽を37℃ で稼動し、pHをおよそpH7.0で維持した(すなわち6.8と7.2の間)。 33B6/pMY216細胞を、光学濃度(OD)が4の600nmで1-L材料として発酵槽に無菌的 に移した。できるだけ長く空気飽和の0％に溶解酸素を維持して、カルチャーの 要求に合うように十分なグルコースを与え、しかし発酵槽内のグルコース蓄積を 避けて、発酵槽を稼動させた。形成されたいかなる酢酸も短時間(通常30分より 短いが2時間を超えることはない)で再消費されるようにグルコースを与えた。pH を47g/LのL-ロイシンを含む12N水酸化アンモニウムまたは24％硫酸を用いてコン トロールし、FERMAX ADJUVANT 27を気泡のコントロールのため用いた。 接種後およそ40時間で、カルチャーを60℃で30秒の熱殺菌によって不活性化し た。それから細胞ペーストを遠心分離によって回収し凍結した。 (ｃ)細胞抽出物と純化 発酵回収物由来の凍結細胞ペーストを使用の前-60℃以下で貯蔵した。細胞ペ ーストを4℃でオーバーナイトで溶解した。kg細胞ペレット当たり5Lの抽出バッ ファー(4℃で6M尿素、0.02MTris,pH8.5)を細胞ペーストに加えた。細胞を撹拌し 気泡形成を最小化しながら、ULTRATURREXホモゲナイザー(Tekmar,Cincinnati,OH )を用いてバッファーにおいてホモゲナイズした。温度を4℃に維持し、細胞の全 てが懸濁液中にあるまで懸濁液を混ぜた。pHをおよそ8.1に調節した。溶液を抽 出物を形成するため4℃で2時間混ぜた。抽出物のリットル当たり1Lの水と20mlの 5％PEIを撹拌しながら加えた。 抽出物をAlfa Laval BTPX205継続フロー遠心機を通過させて純化した。懸濁液 を維持するために抽出物を継続的に撹拌し、遠心機内におよそ2LPMの速度で与え た。上清を4℃で受容タンクにおいて集めた。全抽出物が遠心機内で与えられた ら、およそ5-10Lの精製水(4℃)を遠心機から純化された大腸菌抽出物を置き換え るために遠心機内に与えた。純化した抽出物を、伝導度が2.0mSより小さく測定 されるまで精製水(4℃)を用いて希釈した。 (ｄ)アニオン交換クロマトグラフィー 純化した大腸菌抽出物をDEAE TRISACRYL LS PLUS(容量=0.50L/kg細胞ペースト )のカラムと、連続的なDEAE SEPHAROSE FAST FLOW(容量=2.6L/kg細胞ペースト) のカラムで4℃で稼動して精製した。流す前に平衡化バッファー(0.02MTris-HCl, pH8.5,4℃)で洗浄して平衡化した。それからDEAE TRISACRYL LS PLUSカラムを純 化した大腸菌抽出物と共に注入した。カラムを溶離剤のUV吸収がベースラインに なるまたはそれに近づくまで、少なくとも3カラム容量の平衡化バッファーで洗 浄した。それからDEAE TRISACRYL LS PLUSカラムをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカ ラムから取り外した。B2024変異体は、pH勾配溶出バッファー(3M尿素、プラスME S、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン、及びグリシルグリシン、それぞれ10mM ,pH5.0)で、DEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラムから溶出した。カラムの注入、洗 浄及び溶出を本実施例における全てのクロマトグラフィー工程についての標準的 な流速で実施した。溶離物の光学濃度と画分のSDS-PAGE分析に基づいて、B2024 変異体を 含む画分を集めた。 (ｅ)Q SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィー DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをpH調節し、さらにQ SEPHAROSE FAST FLOW( 容量=0.67L/kg細胞ペースト)のカラムを4℃で稼動して精製した。DEAE SEPHAROS E FAST FLOWプールのpHを2％水酸化ナトリウムを用いて4℃でpH8.5に調節した。 平衡化バッファー(0.02MTris-HCl,pH8.5,)で平衡化し、pH調節プールと共に注入 し、0.02MTris,pH8.5でスタートし0.10MNaCl、0.08MMES,pH6.5で終了する直線勾 配を用い、各バッファー2.5カラム容量を用いて溶出した。画分を集め、SDS-PAG Eによって分析し、B2024変異体を含む画分をプールした。 (ｆ)PHENYL TOYOPEARL 650Mクロマトグラフィー コンディションを整えた後、Q SEPHAROSE FAST FLOWプールをPHENYL TOYOPEAR L 650Mカラム(容量=0.20L/kg細胞ペースト)を室温で稼動してさらに精製した。Q SEPHAROSE FAST FLOWプールを調節バッファー(2M硫酸アンモニウム、0.04MTris ,pH7.2)を用いて、Q SEPHAROSEプールの容量に等しい調節バッファーの容量を加 え、均一になるまで結果として生じた溶液を撹拌することによって整えた。それ から溶液を室温に移した。カラムを2から3カラム容量の平衡化バッファー(1.0M 硫酸アンモニウム、0.02MTris,pH7.2)を用いて平衡化した。それから完全に調節 されたプールをカラムに注入し、1M硫酸アンモニウム、20mMTris,pH7.2でスター トし、精製水で終了する直線勾配を用いてカラムを溶出した。各バッファー4カ ラム容量を用いた。画分を集め、SDS-PAGEによって分析し、B2024変異体を含む 画分をプールした。 (ｇ)SEPHADEX G-25クロマトグラフィー 0.02MTrisバッファー内にB2024変異体を交換することによって、PHENYL TOYOP EARLプールにおける塩を減少するためSEPHADEX G-25カラムを用いた。カラムは4 ℃で稼動した。注入の容量をカラムの全層容量の最大30％に制限した。カラムを 3カラム容量の平衡化バッファー(0.02MTris,pH8.0)を用いて平衡化し、それから PHENYL TOYOPEARLプールと共に注入した。カラムを0.02MTris,pH8.0を用いて溶 出した。280nmでのODがおよそ0.2に増大したら、OD280が0.2以下に落ちるまでプ ールを回収した。 (ｈ)DEAE SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィー SEPHADEX G-25プールをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0.04L/gタンパ ク質)を4℃で稼動させてさらに精製した。カラムを最低3カラム容量の平衡化バ ッファー(0.02MTris,pH8.0)を用いて平衡化した。G-25プールを洗浄のため等量 の水を用いて希釈し、結果として生じた溶液を均一になるまで混ぜ、それからカ ラムに注入した。カラムをおよそ10カラム容量の溶出バッファー(2M尿素プラスM ES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン、各10mM,pH5.0) を用いて溶出した。溶離物の280nmでのODが0.1の値に到達したら、OD280が0.5の 値以下に下がるまで画分を集めた。該画分をSDS-PAGEによって分析し、B2024変 異体を含む画分をプールした。 (ｉ)DEAE SEPHAROSE FAST FLOWクロマトグラフィーによる濃縮 DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0. 06L/タンパク質のg)を4℃で稼動させて濃縮した。カラムを少なくとも4カラム容 量の0.02MTris,pH8.0を用いて平衡化した。完全なDEAE SEPHAROSE FAST FLOWプ ールをカラムに注入し、カラムを少なくとも2カラム容量の0.02MMESバッファー, pH6.5で洗浄した。カラムをおよそ2カラム容量の0.1MNaCl、0.02MMES,pH6.5で、 引き続き2カラム容量の0.15MNaCl、0.02MMES,pH6.5を用いて溶出した。溶離物の 280nmのODが2.0を越えたら、OD280が2.0以下に落ちるまでプールを集めた。 結果 B2024変異体はホスト細胞不純物及びCoomassieブルー染色を用いたSDS-PAGEに よって決定されるような変異体のいかなる既知の有意な減損形態から本質的に遊 離した。 実施例VII PEG(5000)を用いたB2036変異体のペグ化 M-SPA-PEG(5000)をB2036hGH変異体をペグ化するために用いた。B2036変異体の ペグ化を以下のプロトコールにしたがって実施し、それはまた野生型hGH及びB20 24変異体のような他の変異体のペグ化にも適している。 方法 (ａ)ペグ化反応 実施例IVで示されたように生産された精製B2036変異体をM-SPA-PEG(5000)(She arwater Polymers,Inc.,Huntsville,AL)と反応させたが、それはB2036変異体調 製物に固体として加えられた。該反応は一定の撹拌と共に室温で実施することが 可能であった。略記すると、B2036変異体調製物を0.1MHEPES,pH7.7を用いて最終 タンパク質濃度が10mgB2036変異体/mlになるように希釈し、室温での実施を可能 にした。室温溶液のpHは約7.5であった。固体のM-SPA-PEG(5000)を攪拌しながら 20g/Lの濃度にするために調製物に加えた。pHを7.5±0.1に維持した。反応はM-S PA-PEG(5000)の添加後2時間以内に完成した。 (ｂ)疎水性インターラクション(PHENYL TOYOPEARL 650M)クロマトグラフィー ペグ化B2036変異体調製物を条件を整え、それからPHENYL TOYOPEARL 650Mカラ ム(容量=0.13L/gB2036変異体)を室温で稼動して精製した。ペグ化B2036変異体調 製物の容量に等しい容量のクエン酸コンディショニング溶液(0.8Mクエン酸ナト リウム、0.05MTris,pH7.7)を加え、室温で約15分結果として生じた溶液を撹拌す ることによって、ペグ化B2036変異体調製物の条件を整えた。少なくとも1カラム 容量の平衡化バッファー(0.40Mクエン酸ナトリウム、0.05MTris,pH7.5)を用いて 室温でカラムを平衡化した。それから整えられたペグ化B2036変異体調製物をカ ラムに注入した。0.40Mクエン酸ナトリウム、50mMTris,pH7.5でスタートし、50m MTris,pH7.5で終了する4カラム容量直線勾配を用いてカラムを溶出した。カラム 注入、洗浄及び溶出は本実施例の全てのクロマトグラフィー工程で通常の流速で 実施した。画分を集め、SDS-PAGEで分析し、PEG-B2036変異体接合物を含む画分 をプール した。 (ｃ)超濾過/ダイアフィルトレーション PHENYL TOYOPEARLプールをおよそ3倍に濃縮し、それから10kDの再生産セルロ ースメンブレン(Millipore,Bedford,MA)を装備した超濾過システムを用いて、6 容量の0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0に対してダイアフィルターした。 濃縮の第一工程はPHENYL TOYOPEARLプールを用いた濾過オープンモードでの全 リサイクルであった。リサイクルは与えられた濃度の3％より小さく濾過器中のP EG-B2036変異体の濃度を減少することを目的として約15分実施された。PHENYL T OYOPEARLプールの現実の濃縮は、UFモードで始められた(すなわちリサイクルタ ンクに向けられた残余物、及び排出物に向けられた濾過物で)。最初のリサイク ルからUFモードへの移動は、フィードポンプ閉鎖及びフィードレートの変化また は残余物圧の変化を除いて、自動的になされた。濃縮は残余物容量における3倍 の減少が達成されるまで続いた。濃縮されたPHENYL TOYOPEARLプールを、DFモー ドで0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0の6容量に対してダイアフィルターした(すなわ ち、リサイクルタンクに向けられた残余物、排出物に向けられた濾過物、及びリ サイクルタンクに移動したバッファーで)。UFモードからDFモードへの移動は、 フィードポンプ閉鎖を除いて自動的になされた。 PHENYL TOYOPEARLプールをダイアフィルター及び濃縮後、低圧ドロップ(ΔP) リサイクルを濾過を閉じたモードで全リサイクルにおいて実施した。残余物バル ブはこの工程の間十分に開いた。フィードレートを5PSI圧ドロップを与えるよう に維持した。再循環を少なくとも10分なした。それから生産物移動モードをプー ルタンク内に超濾過系の内容物を移動するために用いた。移動は2工程でなした 。第一の工程はメンブレンユニットでの単離と共に、バルブを通過したリサイク ルタンク内の残余物の排出に関与した。第二の工程では、生産物をシステムから 押し出し、プールタンクに入れるために低圧流の不活性ガスを用いて、超濾過装 備が完全に空にされた。 (ｄ)カチオン交換(S SEPHAROSE FAST FLOW)クロマトグラフィー さらにペグ化B2036変異体を、7gタンパク質/L樹脂を超えずに注入したS SEPHA ROSE FAST FLOWカラムでのカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。 カラムを少なくとも3カラム容量の0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0を用いて室温で 平衡化した。それから完全なPEG-B2036変異体UF/DFプールをカラムに注入し、カ ラムを0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0でスタートし、0.25MNaCl、0.025M酢酸ナト リウム,pH4.0で終了する7カラム容量の直線勾配を用いて溶出した。280nmでのOD が増加し始めた後、画分を集めSDS-PAGEとマススペクトロメトリーで分析した。 (ｅ)超濾過/ダイアフィルトレーション S SEPHAROSE FAST FLOWプールを10kDの再生産セルロースメンブレン(Millipor e,Bedford,MA)を装備した超濾過システムを用いて、およそ10g/Lに濃縮した。濃 度、低圧ドロップリサイクル及び生産物移動工程は、残余物容量において7倍の 減少が達成されるように上記「超濾過/ダイアフィルトレーション」部分に記述さ れているように実施した。 (ｆ)SEPHADEX G-25クロマトグラフィー 4℃で稼動させるSEPHADEX G-25カラムを、処方バッファー(18.0g/Lマンニトー ル、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4)内にPEG-B2036変異体調製物 を交換するために用いた。注入の容量はカラムの全層容量の25％に制限した。洗 浄のためカラムを1カラム容量の精製水を用いて洗い、次いで少なくとも1.5カラ ム容量の処方バッファーを用いて平衡化した。それから完全なPEG-B2036変異体U Fプールをカラムに注入し、カラムを処方バッファーを用いて溶出した。280nmで のODが0.5を超えたら、OD280がおよそ0.5以下に落ちるまで画分を集めた。それ からSEPHADEX G-25プールを5.0mg/mlの濃度に処方バッファーを用いて希釈した 。 結果 hGH変異体当たりのPEGの化学量論をVESTECレーザー脱着イオン化マススペクト ロメーター(PerSeptive Biosystems,Inc.,Framingham,MA)によって評価した。そ の結果は調製物が4及び5のPEG基を含む主要な接合物(PEG-4/5-B2036)を含むこと を示した。 実施例VIII PEG(20,000)を用いたB2036変異体のペグ化 B2036変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがってPEG(20,000)を用いて ペグ化した。 実施例Ｖに記述されたように精製されたB2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10 カラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)を用いて、0.05Mリン酸ナトリウム,pH7.5内に バッファー交換した。それからB2036変異体溶液を10mg/mlのタンパク質濃度に希 釈した。60mgのM-SPA-PEG(20,000)(Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,AL) を、チューブに計り取り、6mlのB2036変異体溶液を加えた。反応を室温で75分イ ンキュベートした。反応混合物をG-25 SEPHADEX PD-10カラムを用いて25mM酢酸 ナトリウム,pH4.0内にバッファー交換した。 結果として生じたPEG(20,000)-B2036変異体溶液を、カラムが平衡化するまで2 5mM酢酸ナトリウム,pH4.0を用いて洗ったSP SEPHAROSE HPカラム(Pharmacia)に アプライした。カラムを室温で4.1mg/ml樹脂の濃度でPEG(20,000)-B2036変異体 溶液と共に注入した。 それから25mM酢酸ナトリウム,pH4.0から25mM酢酸ナトリウム,pH4.0中に0.5M塩 化ナトリウムまでよりなる直線勾配の5カラム容量の各バッファーを用いて溶出 した。画分を集め、Daiichiゲル(Owl Scientific,Cambridge,MA)を前もって注い だ2-15％ポリアクリルアミドを用いてSDSゲル電気泳動によって分析した。各B20 36分子に接合した単一のPEG(20,000)分子を持つPEG(20,000)-B2036形態を含む画 分をプールし、CENTRIPREP 10濃縮器(Amicon,Inc.,Beverly,MA)を用いて超濾過 によって濃縮した。CENTRIPREP 10濃縮器をSORVALL RT6000B遠心機(Dupont Inst ruments,Newtown,CT)において16℃で8,000rpmで遠心した。残余物を除去し、CEN TRICON 10濃縮器(Amicon,Inc)を用いてさらに濃縮した。濃縮機をSORVALL RC-5B 遠心機で16℃で6500rpmで遠心した。 それから濃縮したPEG(20,000)-B2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10カラムを 用いて室温で処方バッファー(18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン 酸ナトリウム,pH7.4)内にバッファー交換した。 実施例IX Y-PEGを用いたB2036変異体のペグ化 B2036変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがって2の10,000D鎖を持つ 分枝状鎖PEG(PEG2(20,000))を用いてペグ化した。 実施例Ｖに記述されたように精製されたB2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10 カラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)を用いて、0.05Mリン酸ナトリウム,pH7.5内に バッファー交換した。それからB2036変異体溶液を10mg/mlのタンパク質濃度に希 釈した。100mgのNHS-PEG2(20,000)(Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,AL) を、チューブに計り取り、4mlのB2036変異体溶液を加えた。反応を室温で90分イ ンキュベートした。反応混合物をG-25 SEPHADEX PD-10カラムを用いて25mM酢酸 ナトリウム,pH4.0内にバッファー交換した。 結果として生じたPEG2(20,000)-B2036変異体溶液を、カラムが平衡化するまで 25mM酢酸ナトリウム,pH4.0を用いて洗ったSP SEPHAROSE HPカラム(Pharmacia)に アプライした。カラムを室温で2.75mg/ml樹脂の濃度でPEG2(20,000)-B2036変異 体溶液と共に注入した。 それから25mM酢酸ナトリウム,pH4.0から25mM酢酸ナトリウム,pH4.0中に0.5M塩 化ナトリウムまでよりなる直線勾配の5カラム容量の各バッファーを用いて溶出 した。画分を集め、Daiichiゲル(Owl Scientific,Cambridge,MA)を前もって注い だ2-15％ポリアクリルアミドを用いてSDSゲル電気泳動によって分析した。各B20 36分子に接合した単一のPEG2(20,000)分子を持つPEG2(20,000)-B2036形態を含む 画分をプールし、CENTRICON 10濃縮器(Amicon,Inc.,Beverly,MA)を用いて超濾過 によって濃縮した。濃縮機をSORVALL RC-5B遠心機で16℃で6500rpmで遠心した(D upont Instrument,Newtown,CT)。 濃縮したPEG2(20,000)-B2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10カラムを用いて 室温で処方バッファー(18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナト リウム,pH7.4)内にバッファー交換した。 実施例Ｘ PEG-4/5-B2036のペグ化部位 実施例Ｖ及びVIIに記述されたように生産されたPEG-4/5-B2036変異体調製物の PEG修飾の部位を、トリプシンマッピングによって分析した。精製されたPEG-4/5 -B2036変異体サンプル(1MCaCl2、0.1M酢酸ナトリウム、10mMTris,pH8.8内に1mg/ ml)を、Kohr,W.J.等,Anal.Biochem.,122:348-359(1982)に記述されたように1:40 (トリプシン:PEG-4/5-B2036変異体)のタンパク質重量比で、ウシトリプシン(Wor thington Biochemical Corp.,Freehold,NJ)と共にインキュベートした。トリプ シンを時間0で加え、切断の4時間で再び加えた。37℃で8時間のインキュベーシ ョン後、リン酸をpH2になるように加えることによって切断を止め、サンプルを4 ℃で貯蔵した。 切断サンプル(100μg)を、0.1％トリフルオロ酢酸水溶液において、15×0.46c m C-18カラム(5-μmビーズ、100-Åポアサイズ;NUCLEOSIL,Alltech Associates, Deerfield,IL)に注入し、40℃で0.4ml/分の流速で120分0から60％のアセトニト リル勾配を用いて溶出した。トリプシン処理ペプチドの溶出物を214nmの吸光度 でモニターした。 トリプシン処理ペプチドへのPEG基の接合を、非ペグ化タンパク質のトリプシ ン切断から生産されたクロマトグラムと比較して、クロマトグラム上での相当す るピークのサイズの減少によって検出した。その結果は、最も反応性があるもの からより少ないものへの第一級アミンの反応性の順序(元のペプチドの修飾パー セントとして測定された)は: F1>K145,K140,K38,K158>K120,K70 であった。相当するトリプシン処理ペプチドの修飾変異体が検出されなかったこ とに基づいて、K41及びK115は非反応性であると決定された。B2036変異体中の16 8と172残基は、この位置でのリシンが異なるアミノ酸に置換されているため、PE Gと反応できなかった。最も反応性の残基はサイト1では存在しなかった。実際野 生型hGHに存在する3のサイト1リシン(K41,K168及びK172)は、非反応性(K41)また はB2036には存在しない(K168及びK172)。それゆえB2036変異体のペグ化はサイト 1結合を直接的にはブロックしない。 実施例ＸＩ ペグ化B2036の作用剤活性の細胞ベースアッセイ 実施例Ｖ及びVIIに記述されているように生産されたPEG-4/5-B2036変異体調製 物をFuh,G.等、Science,256:1677-1680(1992)とColosi,P.等,J.Biol.Chem.,268: 12617-12629(1993)に記述されている細胞ベース二量体化アッセイにおいて活性 をテストした。このアッセイで用いられる細胞を生産するために、フルレングス のhGH受容体を、hGHの存在下で増殖を誘導できるプレミエロイド細胞系、FDC-P1 (Colosi,P.等,J.Biol.Chem.,268:12617-12629[1993])内に安定にトランスフェク トした。10％胎児ウシ血清と2-5nMhGHを含むRPMI培地において細胞を維持した。 細胞を4時間hGHのない培地で取り込みを抑え、それからhGH変異体の増大してい く濃度と共に37℃で10時間インキュベートした。細胞に4時間「+H]チミジンのパ ルスを与え、溶解し、そしてニトロセルロースフィルターに結合した放射性活性 の量によってDNA合成を分析した。Fuh,G.等,Science,256:1677-1680(1992)。B20 36とPEG-4/5-B2036の両者とも、0.001から1.0μg/mlのhGH変異体の範囲のいかな る濃度でも細胞増殖を刺激しなかった。 実施例ＸII ペグ化B2036の拮抗剤活性の細胞ベースアッセイ 拮抗剤活性をテストするためにデザインされた研究において、実施例Ｖ及びVI Iに記述されたように生産された非ペグ化B2036及びPEG-4/5-B2036変異体調製物 を、11ng/ml組換えhGH及び増大していく濃度の変異体(104細胞/0.2ml全アッセイ 容量)と共にインキュベートした。組換えhGH刺激細胞増殖の50％をブロックする のに必要とされる変異体の濃度、すなわち50％最大阻害濃度(IC50)を、両変異体 について計算した。非ペグ化B2036のIC50は0.19μg/mlであり、一方PEG-4/5-B20 36のIC50は13.01μg/mlであった。 別の実験では、PEG-4/5-B2036変異体調製物の拮抗剤活性をPEG(20,000)-B2036 変異体及びPEG2(20,000)-B2036変異体のものと比較するアッセイを繰り返した(5 ×103細胞/0.15ml全アッセイ容量)。これらのペグ化変異体を実施例VII、VIII及 びIX のそれぞれに記述されているように生産した。各ペグ化変異体のIC50を表11に示 す。 実施例ＸIII hGH変異体のin vivo拮抗剤活性 IGF-Ｉレベルでの拮抗剤hGH変異体の毎日の注射の効果をアカゲザルにおいて 研究した。テストされたhGH変異体は、G120K置換を含む変異体とB2036及びB2024 変異体であった。加えてPEG(5000)の4から5の分子を持つこれらの変異体のペグ 化形態をテストした。18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナト リウム，pH7.4に処方された0.25mg/kghGH変異体調製物の毎日の投与量を、治療 グループ当たり2の若いオスアカゲザルに皮下に注射した。Amer.J.Primatology, 11:53-62(1986)に記述されているように、IGF-Ｉレベルをイムノアッセイによっ て測定した。 その結果が図11に示されている。hGHで治療された全てのサルについて投与後7 日でIGF-Ｉレベルの減少が観察され、PEG-4/5-B2036で治療されたサルでは最も 有意な減少が観察された。14日後、IGF-ＩレベルはG120K及びB2024変異体で治療 されたサルでは治療前レベルに戻った。IGH-Ｉレベルの減少は、G120K及びB2024 変異体のペグ化形態と、非ペグ化B2036変異体で治療されたサルでは観察された 。PEG-4/5-B2036変異体調製物で治療されたサルの14日のIGF-Ｉレベルは、7日後 のものと同じであった。21日のIGF-Ｉレベルは全ての治療グループで7日のIGF- Ｉレベルとほとんど同じであった。 実施例ＸIV PEG-4/5-B2036変異体調製物のin vivo拮抗剤活性: 単一投与量薬力学 IGH-ＩレベルにおけるPEG-4/5-B2036変異体調製物の単一注射の効果をアカゲ ザルにおいて研究した。実施例Ｖ及びVIIに記述したように生産され、18.0g/Lマ ンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4に処方された1mg/kg のPEG-4/5-B2036変異体の単一投与量を、若いオスアカゲザルに静脈内または皮 下のそれぞれで注射した。偽薬は皮下に投与された0.5ml処方バッファーであっ た。IGF-Ｉレベルを実施例ＸIIIのように測定した。 その結果が図12に示されている。投与経路に関わらず、PEG-4/5-B2036変異体 調製物で治療された全てのサルのIGF-Ｉレベルが投与後1日で減少し、投与後4日 まで減少が引き続き、7日間の研究を通じて低く維持されていた。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１２月４日 【補正内容】 請求の範囲 1．以下の一連のアミノ酸置換: H18D,H21N,R167K,K168A,D171S,K172R,E174S,I179T を含むヒト成長ホルモン変異体。 2．さらにG120での置換を含む請求項1のヒト成長ホルモン変異体。 3．置換がアルギニン、リシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン 及びグルタミン酸よりなるグループから選択される請求項2のヒト成長ホルモン 変異体。 4．ヒト成長ホルモン変異体が、該変異体の現実の分子量を40と約100キロダルト ンの間に増大させる一つ以上の化学的グループに接合されている請求項1のヒト 成長ホルモン変異体。 5．上記化学的グループがポリ(エチレングリコール)である請求項4のヒト成長ホ ルモン変異体。 6．請求項1のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸配列。 7．請求項2のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸配列。 8．請求項6の核酸配列を含むベクター。 9．請求項7の核酸配列を含むベクター。 10．請求項8のベクターを含むホスト細胞。 11．請求項9のベクターを含むホスト細胞。 12．請求項10のホスト細胞を培養し、カルチャーからヒト成長ホルモン変異体を 回収することを含むヒト成長ホルモン変異体の生産工程。 13．請求項11のホスト細胞を培養し、カルチャーからヒト成長ホルモン変異体を 回収することを含むヒト成長ホルモン変異体の生産工程。 14．患者に有効量の請求項2のヒト成長ホルモン変異体を投与することを含む、 患者における成長ホルモン機能の阻害法。 15．患者が先端巨大症に罹患している請求項14の方法。 16．患者がヒト成長ホルモンを結合する受容体を発現している腫瘍細胞を含む腫 瘍を持つ請求項14の方法。 17．患者が糖尿病性網膜症に罹患している請求項14の方法。 18．上記ヒト成長ホルモン変異体が約4と約6分子の間のポリ(エチレングリコー ル)と接合している請求項5のヒト成長ホルモン変異体を含む構成物。 19．以下の一連のアミノ酸置換: H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,K168A,E174A,G120 を含むヒト成長ホルモン変異体。 20．G120での置換がアルギニン、リシン、トリプトファン、チロシン、フェニル アラニン及びグルタミン酸よりなるグループから選択される請求項19のヒト成長 ホルモン変異体。 21．ヒト成長ホルモン変異体が、該変異体の現実の分子量を約40と約100キロダ ルトンの間に増大させる一つ以上の化学的グループに接合されている請求項19の ヒト成長ホルモン変異体。 22．上記化学的グループがポリ(エチレングリコール)である請求項21のヒト成長 ホルモン変異体。 23．請求項19のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸配列。 24．請求項23の核酸配列を含むベクター。 25．請求項24のベクターを含むホスト細胞。 26．請求項25のホスト細胞を培養し、カルチャーからヒト成長ホルモン変異体を 回収することを含むヒト成長ホルモン変異体の生産工程。 27．患者に有効量の請求項19のヒト成長ホルモン変異体を投与することを含む、 患者における成長ホルモン機能の阻害法。 28．患者が先端巨大症に罹患している請求項27の方法。 29．患者がヒト成長ホルモンを結合する受容体を発現している腫瘍細胞を含む腫 瘍を持つ請求項27の方法。 30．患者が糖尿病性網膜症に罹患している請求項27の方法。 31．上記ヒト成長ホルモン変異体が約4と約6分子の間のポリ(エチレングリコー ル)と接合している請求項22のヒト成長ホルモン変異体を含む構成物。 32．(ａ)請求項1のヒト成長ホルモン変異体のペグ化; (ｂ)カチオン交換クロマトグラフィーカラムへのペグ化ヒト成長ホルモンの アプライ;及び (ｃ)ペグ化ヒト成長ホルモンの溶出 を含むペグ化ヒト成長ホルモンの生産法。 33．(ａ)請求項19のヒト成長ホルモン変異体のペグ化; (ｂ)カチオン交換クロマトグラフィーカラムへのペグ化ヒト成長ホルモンの アプライ;及び (ｃ)ペグ化ヒト成長ホルモンの溶出 を含むペグ化ヒト成長ホルモンの生産法。 34．G120での置換がリシンである請求項3のヒト成長ホルモン変異体。 35．上記ヒト成長ホルモン変異体がポリ(エチレングリコール)と接合している請 求項34のヒト成長ホルモン変異体。 36．G120での置換がリシンである請求項20のヒト成長ホルモン変異体。 37．上記ヒト成長ホルモン変異体がポリ(エチレングリコール)と接合している請 求項36のヒト成長ホルモン変異体。 38．請求項34または36のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸配列。 39．請求項38の核酸配列を含むベクター。 40．請求項39のベクターを含むホスト細胞。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/27 Ｃ０７Ｋ 1/107 Ｃ０７Ｋ 1/107 14/61 14/61 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/36 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウェルズ，ジェイムズ エー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010 バーリンゲーム コロンブス アヴェニ ュ 1342 (72)発明者 クラーク，ロス ジー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94044 パシフィカ アーシュラ アヴェニュ 711 (72)発明者 オルソン，ケネス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010 バーリンゲーム ヒルサイド ドライヴ 3036 (72)発明者 フー，ジェルマン ジー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94044 パシフィカ アマポーラ アヴェニュ 149

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1．以下の一連のアミノ酸置換: H18D,H21N,R167K,K168A,D171S,K172R,E174S,I179T を含むヒト成長ホルモン変異体。 2．さらにG120での置換を含む請求項1のヒト成長ホルモン変異体。 3．置換がアルキニン、リシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン 及びグルタミン酸よりなるグループから選択される請求項2のヒト成長ホルモン 変異体。 4．ヒト成長ホルモン変異体が、該変異体の現実の分子量を約40と約100キロダル トンの間に増大させる一つ以上の化学的グループに接合されている請求項1のヒ ト成長ホルモン変異体。 5．上記化学的グループがポリ(エチレングリコール)である請求項4のヒト成長ホ ルモン変異体。 6．請求項1のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸配列。 7．請求項2のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸配列。 8．請求項6の核酸配列を含むベクター。 9．請求項7の核酸配列を含むベクター。 10．請求項8のベクターを含むホスト細胞。 11．請求項9のベクターを含むホスト細胞。 12．請求項10のホスト細胞を培養し、カルチャーからヒト成長ホルモン変異体を 回収することを含むヒト成長ホルモン変異体の生産工程。 13．請求項11のホスト細胞を培養し、カルチャーからヒト成長ホルモン変異体を 回収することを含むヒト成長ホルモン変異体の生産工程。 14．患者に有効量の請求項2のヒト成長ホルモン変異体を投与することを含む、 患者における成長ホルモン機能の阻害法。 15．患者が先端巨大症に罹患している請求項14の方法。 16．患者がヒト成長ホルモンを結合する受容体を発現している腫瘍細胞を含む腫 瘍を持つ請求項14の方法。 17．患者が糖尿病性網膜症に罹患している請求項14の方法。 18．上記ヒト成長ホルモン変異体が約4と約6分子の間のポリ(エチレングリコー ル)と接合している請求項5のヒト成長ホルモン変異体を含む構成物。 19．以下の一連のアミノ酸置換: H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,K168A,E174A を含むヒト成長ホルモン変異体。 20．さらにG120での置換を含む請求項19のヒト成長ホルモン変異体。 21．置換がアルギニン、リシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン 及びグルタミン酸よりなるグループから選択される請求項20のヒト成長ホルモン 変異体。 22．ヒト成長ホルモン変異体が、該変異体の現実の分子量を約40と約100キロダ ルトンの間に増大させる一つ以上の化学的グループに接合されている請求項19の ヒト成長ホルモン変異体。 23．上記化学的グループがポリ(エチレングリコール)である請求項22のヒト成長 ホルモン変異体。 24．請求項19のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸配列。 25．請求項20のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸配列。 26．請求項24の核酸配列を含むベクター。 27．請求項25の核酸配列を含むベクター。 28．請求項26のベクターを含むホスト細胞。 29．請求項27のベクターを含むホスト細胞。 30．請求項28のホスト細胞を培養し、カルチャーからヒト成長ホルモン変異体を 回収することを含むヒト成長ホルモン変異体の生産工程。 31．請求項29のホスト細胞を培養し、カルチャーからヒト成長ホルモン変異体を 回収することを含むヒト成長ホルモン変異体の生産工程。 32．患者に有効量の請求項20のヒト成長ホルモン変異体を投与することを含む、 患者における成長ホルモン機能の阻害法。 33．患者が先端巨大症に罹患している請求項32の方法。 34．患者がヒト成長ホルモンを結合する受容体を発現している腫瘍細胞を含む腫 瘍を持つ請求項32の方法。 35．患者が糖尿病性網膜症に罹患している請求項32の方法。 36．上記ヒト成長ホルモン変異体が約4と約6分子の間のポリ(エチレングリコー ル)と接合している請求項23のヒト成長ホルモン変異体を含む構成物。 37．(ａ)請求項1のヒト成長ホルモン変異体のペグ化; (ｂ)カチオン交換クロマトグラフィーカラムへのペグ化ヒト成長ホルモンの アプライ;及び (ｃ)ペグ化ヒト成長ホルモンの溶出 を含むペグ化ヒト成長ホルモンの生産法。 38．(ａ)請求項19のヒト成長ホルモン変異体のペグ化; (ｂ)カチオン交換クロマトグラフィーカラムへのペグ化ヒト成長ホルモンの アプライ;及び (ｃ)ペグ化ヒト成長ホルモンの溶出 を含むペグ化ヒト成長ホルモンの生産法。
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