ES2338431T3 - Variantes de la hormona de crecimiento humano. - Google Patents

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Abstract

Una variante de la hormona del crecimiento humana que comprende el siguiente grupo de sustituciones de aminoácidos: H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T.

Description

Variantes de la hormona de crecimiento humano.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
Esta invención se refiere a ciertas variantes de la hormona del crecimiento, y formas pegiladas de las mismas, para su uso como agonistas o antagonistas de la hormona de crecimiento humana.
Descripción de la técnica relacionada
La hormona del crecimiento humana (hGH) participa en la regulación del crecimiento y el desarrollo humano normal. Esta hormona de la pituitaria de 22.000 dalton manifiesta una multitud de efectos biológicos, incluyendo el crecimiento lineal (somatogénesis), la lactancia, la activación de macrófagos, y los efectos de tipo insulina y diabetogénicos, entre otros. Chawla, Annu. Rev. Med., 34: 519 (1983); Edwards et al, Science, 239: 769 (1988); Isaksson et al, Annu. Rev. Physiol., 47: 483 (1985); Thorner y Vance, J. Clin. Invest., 82: 745 (1988); Hughes y Friesen, Annu. Rev. Physiol., 47: 469 (1985). Estos efectos biológicos derivan de la interacción entre la hGH y receptores celulares específicos. La deficiencia en hormona del crecimiento en niños conduce al enanismo, que ha sido tratado con éxito durante más de una década mediante la administración exógena de hGH. Asimismo existe interés en la antigenicidad de la hGH para distinguir entre las formas de hGH genéticas y las modificadas post-traduccionalmente (Lewis, Ann. Rev. Physiol., 46: 33 (1984)], para caracterizar cualquier respuesta inmunológica a hGH cuando es administrada clínicamente, y para cuantificar los niveles circulantes de la hormona.
La hGH es miembro de una familia de hormonas homólogas que incluyen lactógenos placentarios, prolactinas, y otras variantes genéticas y de la especie de la hormona del crecimiento. Nichol et al, Endocrine Reviews, 7: 169 (1986). La hGH es inusual entre estas ya que manifiesta una amplia especificidad de especie y se une o bien al receptor somatogénico clonado (Leung et al, Nature, 330: 537 [1987]) o bien al de la prolactina (Boutin et al, Cell, 53: 69 [1988]). El gen clonado para la hGH ha sido expresado en una forma secretada en E. coli (Chang et al, Gene, 55: 189 [1987]) y se ha informado sobre sus secuencias de ADN y de aminoácidos. Goedel et al, Nature, 281: 544 (1979); Gray et al, Gene, 39: 247 (1985). El patrón de plegamiento tridimensional para la hormona del crecimiento porcina (pGH) ha sido referido con una resolución y una sutileza moderadas. Abdel-Meguid et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 6434 (1987). Se han identificado los epitopos del receptor y el anticuerpo de hGH mediante mutagénesis de barrido de homólogos y mutagénesis de barrido con alanina como se describe en la solicitud de prioridad de esta solicitud y en Cunningham et al, Science, 243: 1330-1336 (1989) y Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989).
Existen un gran número de estructuras de alta resolución que muestran los detalles moleculares de las interfases proteína-proteína (para revisiones, ver Argos, Protein Eng., 2.: 101-113 [1988]; Janin et al, J. Mol. Biol., 204: 155-164 [1988]; Miller, Protein Eng., 3: 77-83 [1989]; Davies et al, Annu. Rev. Biochem., 59: 439-473). Estas definen los restos en contacto, pero no la energía de los mismos ni muestran cómo se produce el acoplamiento. Un conocimiento comprensivo del papel de los restos en contacto que afectan a la asociación y la disociación es fundamental para los procedimientos de reconocimiento molecular, y es importante desde el punto de vista práctico para el diseño racional de proteínas y fármacos.
Quizás el complejo hormona-receptor mejor caracterizado es aquél entre hGH y el dominio extracelular de su receptor (hGHbp). Para una revisión, ver Wells y De Vos, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 22: 329-351 (1993). Los análisis estructurales de alta resolución y mutacionales (Cunningham y Wells, supra; Cunningham et al, Science, 254: 821-825 [1991]) y los análisis estructurales [De Vos et al, Science, 255: 306-3012 [1992]) han demostrado que una molécula de hGH se une a dos moléculas de receptor sucesivamente utilizando sitios distintos sobre la hormona, denominados Sitios 1 y 2.
Se han identificado numerosos mutantes de origen natural de hGH. Entre estos se incluyen hGH-V [Seeberg, DNA, 1: 239 (1982); Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.446.235, 4.670.393, y 4.665.180] y hGH de 20 K conteniendo una deleción de los restos 32-46 de la hGH. Kostyo et al, Biochem. Biophys. Acta, 925:314 (1987); Lewis et al, J. Biol. Chem., 253: 2679 (1978).
Un investigador ha informado sobre la sustitución de la cisteína de la posición 165 en la hGH por alanina para desorganizar el enlace disulfuro que existe normalmente entre la Cys-53 y la Cys 165. Tokunaga et al, Eur. J. Biochem., 153: 445 (1985). Esta única sustitución producía un mutante que aparentemente conservaba la estructura terciaria de la hGH y era reconocido por los receptores de hGH.
Otro investigador ha informado sobre la síntesis in vitro de hGH en un soporte de resina sólido. El primer informe de este investigador describia una secuencia de 188 aminoácidos incorrecta para hGH. Li et al, J. Am. Chem. Soc., 88:2050 (1966); Patente de los Estados Unidos Núm. 3.853.832. Un segundo informe describía una secuencia de 190 aminoácidos. Patente de los Estados Unidos Núm. 3.853.833. Esta última secuencia también es incorrecta. En particular, la hGH tiene una glutamina adicional tras la posición 68, un ácido glutámico en lugar de glutamina en la posición 73, un ácido aspártico en lugar de asparragina en la posición 106, y una asparragina en lugar de ácido aspártico en la posición 108.
Además de lo anterior, se ha informado sobre interferones híbridos que tienen alterada la unión a un anticuerpo monoclonal concreto. Camble et al, "Properties of Interferon-\alpha2 Analogues Produced form Synthetic Genes" en Peptides: Structure and Function, Proceedings of the Ninth American Peptide Symposium, Deber et al, eds. (Pierce Chemical Co., Chicago, Ill. 1985), págs. 375-384. Como se ha descrito allí, los restos aminoácido 101-114 del interferón \alpha-1 o los restos 98-114 del interferón \gamma fueron sustituidos en el interferón \alpha-2. El interferón \alpha-2 se une al anticuerpo monoclonal NK-2, mientras que el interferón \alpha-1 no. Esta región concreta del interferón \alpha-2 fue elegida aparentemente debido a que 7 de las 27 diferencias de aminoácidos entre el interferón \alpha-1 y el \alpha-2 estaban localizadas en esta región. Se dice que los híbridos así obtenidos tenían sustancialmente reducida la actividad con el anticuerpo monoclonal NK-2. Cuando se sometía a ensayo la actividad antiviral, tales híbridos demostraban actividad antiviral equivalente a la actividad del interferón \alpha-2 de tipo salvaje. También se ha informado sobre sustituciones de secciones más pequeñas en estas regiones. Asimismo se propuso la sustitución sucesiva de agrupaciones de 3 a 7 restos alanina. No obstante, sólo se describió un IFN-\alpha2 análogo [Ala-30,32,33].
Asimismo se ha informado sobre la sustitución de alanina en un fragmento peptídico pequeño de lisozima de clara de huevo de gallina y el efecto de tales sustituciones sobre la estimulación de las células 2A11 o 3A9. Allen et al, Nature, 327: 713-715 (1987).
Otros han informado de que las propiedades de unión pueden ser diseñadas mediante la reposición de unidades completas de estructura secundaria incluyendo bucles de unión al antígeno (Jones et al, Nature, 321: 522-525 o hélices de reconocimiento de ADN. Wharton et al, Nature, 316: 601-605 (1985).
Se ha mostrado la estructura de la hormona de crecimiento bovina (bGH) metionilada en el amino terminal que contiene una secuencia empalmada de hGH incluyendo la histidina 18 y la histidina 21. Patente de los Estados Unidos Núm. 4.880.910. Las variantes de hGH adicionales se describen en las solicitudes de prioridad de esta solicitud y en el documento U.S copendiente con los Núms. de Serie 07/715.300 presentado el 14 de Junio de 1991 y 07/743.614 presentado el 9 de Agosto de 1991, y el documento WO 92/09690 publicado el 11 de Junio de 1992. Asimismo se describen variantes de hGH (documento WO 93/00109 publicado el 7 de Enero de 1993) que tienen el radical de la GH anclado covalentemente a poli(etilenglicol) (PEG) en uno o más aminoácidos, incluyendo aquellos en los que la molécula de PEG está anclada a la lisina de la posición 41.
Asimismo se ha informado sobre variantes de hGH en el documento WO 92/21029 publicado el 26 de Noviembre de 1992, que describe el dímero complejo 1:2 entre GH y dos moléculas de receptor. La variante es un ligando polipeptidico monomérico que comprende en su conformación nativa cuatro hélices alfa anfipáticas y que se une a su receptor a través de dos sitios en orden sucesivo. Esta variante comprende una mutación introducida en el sitio 1 o el sitio 2, siempre que cuando el ligando sea GH, al menos dos restos hayan mutado, cada uno en el extremo N-terminal, aproximadamente 15 restos de la hormona de tipo salvaje y en la hélice C, o el sitio 1 haya mutado con el fin de aumentar la afinidad del ligando por su receptor en el sitio 1.
Se ha demostrado previamente que la presentación en fagos monovalente (Bass et al, Proteins, 8: 309-314 [1990]) puede ser utilizada para mejorar la afinidad del Sitio 1 de hGH por hGHbp. Lowman et al, Biochemistry 30: 10832-10838 (1991). Se produjeron modestas mejoras en la afinidad de unión (3 a 8 veces más fuerte que la hGH de tipo salvaje) clasificando tres genotecas independientes cada una mutada en cuatro codones diferentes en el Sitio 1. Un mutante de hGH con la afinidad de unión por el Sitio 1 ligeramente intensificada y con su capacidad de unión al Sitio 2 bloqueada era mejor antagonista del receptor de hGH que el mutante del Sitio 2 solo. Fuh et al, Science., 256: 1677-1680 (1992). Seria deseable mejorar adicionalmente la afinidad por el Sitio 1 para obtener un antagonista aún mejor que pudiera tener utilidad en el tratamiento de las afecciones por exceso de GH tales como la acromegalia.
Se podrían encontrar mejoras adicionales en la afinidad por el Sitio 1 mutando más restos por genoteca. No obstante, no fue factible generar suficientes transformantes para asegurar que todas las posibles combinaciones de restos estuvieran representadas cuando se aleatorizaban simultáneamente más de aproximadamente cinco codones. Lowman y Wells, Methods: Companion Methods Enzymol., 3 205-216 (1991). Las mutaciones en las interfases proteína-proteína manifiestan normalmente efectos aditivos tras la unión. Wells, Biochemistry, 29: 8509-8517 (1990).
Se desea obtener mejoras en la afinidad mucho mayores. Se ha descrito que los restos lisina de hGH y bGH están implicados en la interacción de hGH y bGH con los receptores somatotrópicos, implicando concretamente la relación estructura-función los restos lisina o arginina de las posiciones 41, 64, 70, y 115. Martal et al, FEBS Lett., 180: 295-299 (1985). Los restos lisina fueron modificados químicamente mediante metilación, etilación, guanidinación, y acetimidinación, dando como resultado una reducción de la actividad mediante análisis de radiorreceptores.
La eficacia in vivo de la hGH y de las variantes de hGH es determinada, en parte, por la afinidad hacia el receptor de hGH y por la velocidad de aclaramiento de la circulación. La vida media in vivo de otras ciertas proteínas terapéuticas ha sido incrementada conjugando las proteínas con PEG, lo que se denomina "pegilación". Véase, v.g., Abuchowski et al, J. Biol. Chem. 252: 3582-3586 (1977). El PEG se caracteriza típicamente como un polímero no cargado no inmunogénico con tres moléculas de agua por monómero de óxido de etileno. Se cree que el PEG ralentiza el aclaramiento renal proporcionando un volumen hidrodinámico incrementado a las proteínas pegiladas. Maxfield et al, Polymer, 16: 505-509 (1975). En un estudio, Katre y colaboradores (Kanuf, M.J. et al, J. Biol. Chem., 363: 15064-15070 [1988]; Goodson, R.J. & Katre, N.V., Bio/Technology, 8 343-346 [1990]) demostraron que la vida media in vivo de PEG-interleuquina-2 aumentaba con el peso molecular eficaz. Además, se ha informado de que la pegilación reduce la inmunogenicidad y la toxicidad de ciertas proteínas terapéuticas. Abuchowski et al, J. Biol. Chem. 252: 3578-3581 (1977).
En el documento WO 92/1029 se describe que las hormonas de crecimiento forman complejos 1:2 con su receptor en los que un primer sitio del ligando, sitio 1, se une a un receptor y un segundo sitio del ligando, sitio 2, se une a un segundo receptor. Este documento describe adicionalmente numerosos restos aminoácido que son relevantes par la unión de la hormona del crecimiento a los receptores.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona una variante de la hormona de crecimiento humana (hGH) incluyendo el siguiente grupo de sustituciones de aminoácidos: H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T.
Estas sustituciones aumentan la afinidad de unión hacia el receptor de hGH del Sitio 1. Una variante de hGH que incluye el grupo de sustituciones de aminoácidos actúa como agonista de hGH en ausencia de una modificación adicional que interrumpe la unión al receptor de hGH en el Sitio 2.
La sustitución de un aminoácido diferente en G120 es una modificación que interrumpe la unión en el Sitio 2. Por consiguiente, una variante de hGH que incluye una sustitución de aminoácido en G120 actúa como antagonista de hGH. La presente invención proporciona variantes de hGH en las que se combina una sustitución del aminoácido G120 con uno de los grupos de sustituciones de aminoácidos del Sitio 1. De este modo, en una realización, una variante de hGH incluye el siguiente grupo de sustituciones de aminoácidos:
H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T (referida en adelante como "variante B2036").
Entre los aspectos adicionales de la invención se incluyen las secuencias de ácido nucleico, los vectores, las células anfitrionas, y los procedimientos para la expresión de estas variantes de hGH.
Asimismo la presente invención también incluye variantes de hGH conjugadas con uno o más grupos químicos que incrementan el peso molecular de la variante, como se determina mediante espectrometría de masas (en adelante "peso molecular real"), hasta al menos aproximadamente 40 kilodaltons. En una realización, una variante de hGH está conjugada con uno o más polioles, tales como poli(etilenglicol) (PEG). Asimismo se proporciona un método para producir una variante de hGH conjugada con PEG.
Un aspecto adicional de la invención es un método para inhibir la acción de la hormona del crecimiento en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de una variante de hGH antagonista de la invención.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A y 1B muestran la reacción (Fig. 1A) y la cinética (Fig. 1B) para la unión de la hormona del crecimiento humana (hGH) o (G120R)hGH al (S237C)hGHbp acoplado al biosensor BIAcore®. El (S237C) hGHbp fue inmovilizado sobre la matriz de tiol-dextrano (Fig. 1A) a un nivel de 1220 RU ("unidades de resonancia" en sus siglas en Inglés), que corresponde a 1,2 ng/mm^{2}. En el ejemplo del perfil de unión (Fig. 1B), hGH (símbolos abiertos) o (G120R)hGH (símbolos rellenos) fue inyectado a concentraciones saturantes (>200 nM) para seguir la asociación y establecer la cantidad limitante de hormona unida de la cual se calculaba la estequiometría. Tras la saturación, el bucle inyector fue conectado al tampón para seguir la disociación (indicada por la flecha).
Las Figuras 2A y 2B muestran la reacción (Fig. 2A) y la cinética (Fig. 2B) para la unión de hGH (símbolos abiertos) o (G120R)hGH (símbolos cerrados) al (S201C)hGHpb acoplado al biosensor BIAcore®. El (S201C)hGHbp fue inmovilizado a un nivel de 1480 RU (1,48 ng/mm^{2}) sobre el biosensor. Las condiciones de la unión y los perfiles son análogos a los de las Figs. 1A y 1B.
La Figura 3 muestra la correlación entre el cambio en la energía libre de la unión (\Delta\DeltaG_{min-wt}) calculado para los mutantes de alanina de hGH en relación con hGH de tipo salvaje cuando se forma un complejo 1:1 con el hGHbp de los datos obtenidos mediante RIA (eje de las y) o el biosensor BIAcore® (eje de las x). Los valores se toman a partir de la Tabla 2.
Las Figuras 4A y 4B muestran el cambio relativo en la velocidad de desconexión (Fig. 4A) o la velocidad de conexión (Fig. 4B) para los mutantes de alanina en los restos del contacto. Se toman los datos de la Tabla 2.
Las Figuras 5A y 5B muestran la relación entre el cambio en la afinidad de unión tras la sustitución de la alanina y el cambio en el área de superficie oculta (\ring{A}^{2}) (Fig. 5A) o el número de contactos de van der Waals (Fig. 5B) para los átomos en las cadenas laterales en contacto más allá del carbono \beta. Los círculos cerrados son para los restos ocultos en la interfase que forman puentes de hidrógeno o puentes salinos con el receptor en el Sitio 1, y los círculos abiertos son para los restos que no. Los datos se trazan a partir de la Tabla 2.
Las Figuras 6A, 6B, y 6C muestran una comparación de los epítopos de unión al receptor definidos por la mutagénesis de barrido con alanina, la estructura cristalina por rayos X, o la presentación en fagos, respectivamente.
La Fig. 6A muestra el epítopo funcional del sitio 1 de hGH. Los restos implicados en la unión al receptor, según la mutagénesis de barrido con alanina, se muestran en un boceto de hGH, derivado de la estructura cristalina de hGH(hGHbp)2 de Vos et al, supra. Los efectos de las sustituciones de alanina (o las sustituciones de Gln en el caso de K41) se muestran basándose en las medidas de la cinética BIAcore®, excepto para los sitios M14, H21, F54, E56, I58, S62, N63, e Y164. En estos sitios, los datos de BIAcore® o bien no eran asequibles o bien indicaban un efecto inapreciable sobre la unión, y por tanto el efecto mostrado se basa en los datos de RIA. El cambio en la energía libre de la unión (\Delta\DeltaG) se calculó como -RT ln [K_{d}(mutante Ala)/K_{d}(hGH)]. Las esferas oscuras muestran las sustituciones de alanina que mejoraban la unión (\Delta\DeltaG = -1 a -0,5 kcal/mol). Las cuatro esferas blancas de tamaño creciente indican las sustituciones de alanina que reducen la energía de unión en +0,5 a 1,0 kcal/mol, +1,0 a 1,5 kcal/mol, +1,5 a 2,0 kcal/mol, o +2,0 a 2,5 kcal/mol, respectivamente.
La Figura 6B es el epítopo estructural del sitio 1 de hGH. Las cuatro esferas blancas de tamaño creciente representan un cambio en el área accesible al disolvente de -20 a 0 \ring{A}^{2}, 0 a 20 \ring{A}^{2}, 20 a 40 \ring{A}^{2}, o 40 a 60\ring{A}^{2}, respectivamente, en cada resto tras la sustitución de alanina, calculado a partir de la estructura cristalina mediante rayos X de hGH(hGHbp)_{2}.
La Fig. 6C indica la conservación de los restos hGH en genotecas de fagémidos aleatorizadas. Los restos fueron aleatorizados, cuatro posiciones de una vez, en genotecas de hGH presentados en fagos como se muestra: hélice 1 [F10, M14, H18, H21]; minihélice 1 [K41, Y42, L45, Q46]; bucle A [F54, E5 6, I58, R64]: hélice 4A [K172, E174, F176, R178]; hélice 4B [R167, D171, T175, I179]. La fracción de restos de hGH de tipo salvaje encontrada en cada posición después de la clasificación para la unión a hGHbp [datos referidos aquí y en Lowman et al, supra] se indica mediante el tamaño de las esferas negras: La esfera negra más pequeña está conservada en un 0-10%, la siguiente más grande está conservada en un 10-25%, la siguientes más grande está conservada en un 25-50%, y la más grande está conservada en >50%.
La Figura 7 muestra la estrategia para combinar mutaciones derivadas de fagos que intensifican la afinidad de unión al receptor. Se muestran los mejores seleccionantes con el incremento del número de veces en la afinidad sobre el tipo salvaje. Asimismo se muestra el número de mutaciones del tipo salvaje encontrado en cada una de estas variantes (v.g., 4 muts.). Se clasificaron por separado las genotecas aleatorizadas en cuatro codones en la hélice 1, la hélice 4, la minihélice 1, o el bucle que conecta las hélices 1 y 2. Se utilizaron dos mutaciones (E174S/F176Y) identificadas en la Hélice 4A como fondo para la aleatorización adicional y la selección de otros sitios de la hélice 4 (Hélice 4b; Lowman et al, supra). Las mutaciones identificadas en la Hélice 1 y en la Hélice 4b fueron combinadas para rendir la variante BD; las mutaciones en la Minihélice 1 y el Bucle A fueron combinadas para rendir la variante 852b. Finalmente, se combinaron las mutaciones de estas dos variantes para rendir la variante 852d.
Las Figuras 8A, 8B y 8C representan la relación entre el epítopo estructural de hGH, el epítopo derivado de fagos, y las variantes evolutivas, respectivamente. El logaritmo natural de la frecuencia con la cual aparecían los restos de hGH de tipo salvaje en las reservas de fagémidos de hGH (Lowman et al, supra) clasificados por la unión al receptor se muestra en el eje de las x. Los datos de las genotecas Combinatorias no están incluidos. Se eligió la escala logarítmica para la comparación con las áreas de superficie ocultas. Los restos M14, H18, K41, Q46, R167, y E174 no aparecen en este gráfico, debido a que no se encontraron restos de tipo salvaje entre ninguno de las genotecas seleccionadas.
La Figura 8A representa una comparación con la estructura de hGH-(hGHbp)_{2} mediante rayos x. El área de la cadena lateral de los restos de hGH ocultos por la unión al receptor 1 (se traza el área accesible al disolvente de: [hGH libre] - [complejo hGH-hGHbp].
La Figura 8B representa los resultados de la presentación en fagos de la mutagénesis de barrido con alanina. El efecto funcional de las sustituciones de Ala en hGH se traza como ln [K_{d} (mutante Ala)/K_{d}(hGH)]. Los datos de la unión se tomaron de las medidas con el biosensor BIAcore®, excepto cuando no se encontraban disponibles los datos cinéticos. Para estos restos no en contacto (F10, F54, I58), se utilizaron los valores para K_{d} obtenidos del análisis de radioinmuno-precipitación. Cunningham et al, 1989, supra.
La Fig. 8C indica la conservación de los restos entre las variantes evolutivas. Las secuencias de aminoácidos (GenBank, vol. 75, Feb. 1993) de las hormonas de crecimiento de mono, cerdo, elefante, hámster, ballena, alpaca, zorro, caballo, oveja, rata, tortuga, pollo, visón, vaca, salmón, rana, y trucha, así como lactógeno placentario humano, hGH (20K), y hGH-V fueron comparadas con la de hGH de tipo salvaje. Las variantes de prolactina evolutivas no estaban incluidas. Se traza el logaritmo natural de la frecuencia con la cual aparecen los restos de hGH de tipo salvaje entre estas variantes.
La Figura 9 describe la aditividad de las mutaciones derivadas de fagos. El cambio (\Delta\DeltaG) en la energía libre de la unión versus la de la hGH de tipo salvaje fue comparada con la suma de \Delta\DeltaG para las mutaciones componentes. Los puntos mostrados corresponden a las combinaciones de (1) variante BD vs. [B más D]; (2) variante 852b vs. [minihélice 1 más bucle A]; (3) variante BF vs. [B más F]; y (4) variante 852d vs. [BD más 852b]. Las barras de error fueron estimadas a partir de las desviaciones típicas utilizando una propagación del cálculo de errores. Bevington, Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences, págs. 56-65 (McGraw-Hill, Nueva York, 1969). La línea mostrada es y = -0, 94 + 0, 60x; R^{2} = 0,96.
La Figura 10 muestra un mapa plasmídico para un vector ilustrativo utilizado para expresar una variante de hGH antagónica de la presente invención (la variante B2036), como se describe en el Ejemplo V.
La Figura 11 muestra el efecto de las inyecciones subcutáneas diarias (0,25 mg/kg) de diversas variantes de hGH antagónicas de la presente invención sobre los niveles del factor de crecimiento I de tipo insulínico (IGF-I) en monos Rhesus. Se sometieron a ensayo tanto las formas pegiladas como no pegiladas de las variantes. Véase el Ejemplo XIII.
La Figura 12 muestra la fármacodinámica de una sola dosis de una preparación de variante de hGH antagónica pegilada (B2036) inyectada intravenosamente o subcutáneamente a monos Rhesus. El efecto antagónico fue medido como el porcentaje de reducción en el nivel de IGF-I. Véase el Ejemplo XIV.
Descripción de las realizaciones preferidas Variantes
Se ha informado sobre las secuencias de ADN y de aminoácidos de la hormona del crecimiento humana (hGH). Goeddel et al, supra; Gray et al, supra. La presente invención describe variantes de hGH novedosas producidas utilizando o bien la metodología de barrido con alanina o bien los métodos de selección de fagémidos. Las variantes de hGH de la presente invención pueden ser expresadas en cualquier sistema recombinante que sea capaz de expresar hGH de tipo salvaje o met.
La notación de la secuencia de hGH variante define las sustituciones de aminoácidos reales de las variantes de hGH de la presente invención. Para una variante, se indican las sustituciones por medio de una letra que representa el resto de tipo salvaje (en el código de una letra), un número que indica la posición del aminoácido en la secuencia de tipo salvaje, y una segunda letra que indica el resto aminoácido sustituido. Por ejemplo, R64K indica una mutación en la que Arg 64 es convertida en Lys. Los mutantes múltiples son indicados por una serie de mutantes individuales separados por comas.
Mutagénesis de Barrido con alanina
En una realización, la presente invención utiliza un análisis sistemático de hGH para determinar uno o más sitios activos en el polipéptido que están implicados en la interacción del polipéptido con su receptor. Semejante análisis se realiza convenientemente utilizando la tecnología del ADN recombinante. En general, la secuencia de ADN que codifica la hGH es clonada y manipulada de manera que pueda ser expresada en un anfitrión conveniente. El ADN que codifica la hGH puede ser obtenido a partir de una genoteca genómica, a partir de ADNc derivado de ARNm en las células que expresan la hGH, o construyendo sintéticamente la secuencia de ADN. Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982).
Después el ADN de hGH de tipo salvaje es insertado en un plásmido o vector apropiado que se utiliza para transformar una célula anfitriona. Se prefieren los procariotas para clonar y expresar secuencias de ADN para producir las variantes de hGH. Por ejemplo, se puede utilizar E. coli K12 cepa 294 (ATCC Núm. 31446), así como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC Núm. 31537), y E. coli c600 y c600hf l, y E. coli W3110 (F^{-}, \gamma^{-}, prototrófica, ATCC Núm. 27325), bacilos tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriáceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcescens, y diversas especies de Pseudomonas. El procariota preferido es E. coli W3110 (ATCC 27325). Cuando se expresa intracelularmente en procariotas, la hGH contiene típicamente una metionina N-terminal o una metionina formilada y no está glicosilada. Cuando se expresa extracelularmente en el medio o el periplasma, la hGH no contiene una metionina N-terminal. Se pretende que estos ejemplos sean, por supuesto, ilustrativos en lugar de limitantes.
Además de los procariotas, se pueden utilizar organismo eucarióticos tales como cultivos de levadura, o células derivadas de organismos multicelulares. En principio, es elaborable cualquiera de tales cultivos celulares. No obstante, el mayor interés se ha puesto en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento repetible. Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973). Los ejemplos de tales líneas celulares útiles son las líneas celulares VERO y HeLa, ovario de Hámster Chino (CHO), W138, BHK, COS-7 y MDCK.
En general, con respecto a estos anfitriónes se utilizan vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicación y control que derivan de especies compatibles con la célula anfitriona. Normalmente el vector porta un sitio de replicación, así como secuencias que codifican proteínas que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo, se puede transformar E. coli utilizando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. Mandel et al, J. Mol. Biol., 53: 154 (1970). El plásmido pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y de este modo proporciona medios fáciles de selección. Un vector preferido es pBO475, descrito en el Ejemplo 1 de una solicitud de prioridad de esta solicitud (U.S.S.N. 07(428.066 presentada el 26 de Octubre de 1.989). Este vector contiene orígenes de replicación para el fago y E. coli que le permiten ser lanzado entre tales anfitriónes, facilitando de ese modo la mutagénesis y la expresión. "Vector de expresión" hace referencia a un constructo de ADN que contiene una secuencia de ADN que está conectada operablemente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión de dicho ADN en un anfitrión adecuado. Entre tales secuencias de control se incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión al ribosoma del ARNm adecuado, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un anfitrión adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del anfitrión, o puede, en algunos casos, integrarse en el propio genoma. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" se utilizan a veces indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada en la actualidad. Sin embargo, se pretende que la invención incluya otras formas de vectores de expresión que presenten funciones equivalentes y que sean, conocidas en la técnica.
"Conectado operablemente" cuando se describe la relación entre dos regiones de ADN o polipeptídicas significa simplemente que están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, una pre-secuencia está conectada operablemente a un péptido si funciona como secuencia señal, participando en la secreción de la forma madura de la proteína, implicando muy probablemente la escisión de la secuencia señal. Un promotor está conectado operablemente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; un sitio de unión al ribosoma está conectado operablemente a una secuencia codificante si está posicionado de manera que permita la traducción.
Una vez que se ha clonado la hGH, se pueden realizar la mutagénesis de sitio específico (Carter et al, Nucl. Acids. Res., 13: 4331 [1986]; Zoller et al, Nucl. Acids. Res., 10: 6487 [1987]), la mutagénesis de la casete (Wells et al, Gene, 34: 315 [1985]), la mutagénesis de selección del sitio de restricción (Wells et al, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 [1986]), u otras técnicas conocidas sobre el ADN de hGH clonado para producir el ADN variante que codifica los cambios en la secuencia de aminoácidos definida por los restos que están siendo sustituidos. Cuando está conectado operablemente a un vector de expresión apropiado, se obtienen variantes de hGH sustituidas en el dominio activo. En algunos casos, la recuperación de la variante de hGH puede ser facilitada expresando y secretando tales moléculas a partir del anfitrión de expresión mediante el uso de una secuencia señal apropiada conectada operablemente a la secuencia de ADN que codifica la hGH parental o variante. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por supuesto, se pueden emplear otros métodos para producir polipéptidos tales como la síntesis química in vitro de la variante de hGH deseada. Barany et al en The Peptides, eds. E. Gross y J. Meienhofer (Academic Press: N.Y. 1979), Vol. 2, págs. 3-254.
Una vez que se han producido las diferentes variantes de hGH, se ponen en contacto con el receptor y se determina la interacción, si la hubiera, entre el receptor y cada variante. Estas actividades se comparan con la actividad de la hGH de tipo salvaje con el mismo receptor para determinar cuál de los restos aminoácido del dominio activo están implicados en la interacción con el receptor. El aminoácido de barrido utilizado en semejante análisis puede ser cualquier aminoácido diferente del sustituido, es decir, cualquiera de los 19 aminoácidos de origen natural distintos.
El receptor diana puede ser aislado de las fuentes naturales o preparado mediante métodos recombinantes por medio de procedimientos conocidos en la técnica. A modo de ilustración, el receptor puede ser preparado mediante la técnica descrita por McFarland et al, Science, 245: 494-499 (1989).
La interacción entre el receptor y el parental y la variante puede ser medida mediante cualquier análisis in vitro o in vivo conveniente. Así, los análisis in vitro pueden ser utilizados para determinar cualquier interacción detectable entre un receptor y la hGH. Semejante detección puede incluir la medida de cambios colorimétricos, cambios en la radiactividad, cambios en la solubilidad, cambios en el peso molecular medido mediante electroforesis en gel, y/o métodos de exclusión en gel, etc. Entre los análisis in vivo se incluyen, pero no están limitados a, análisis para detectar los efectos fisiológicos, v.g., ganancia de peso o cambio en el equilibrio de electrolitos. Generalmente, se puede utilizar cualquier análisis in vivo con tal que exista un parámetro variable para detectar un cambio en la interacción entre el receptor y la hGH de interés.
Si bien se puede utilizar cualquier número de medidas analíticas para comparar las actividades, una conveniente para la unión del receptor es la constante de disociación K_{d} del complejo formado entre la variante de hGH y el receptor en comparación con la K_{d} para la hGH de tipo salvaje. Generalmente, un incremento al doble o un descenso a la mitad en la K_{d} por resto análogo sustituido mediante la sustitución indica que el resto o los restos sustituidos son activos en la interacción de la hGH de tipo salvaje con la diana.
Cuando un presunto o conocido resto aminoácido activo es sometido a análisis con el aminoácido de barrido, los restos aminoácido inmediatamente adyacentes a éste deben ser barridos. Se pueden elaborar tres polipéptidos sustituidos con el resto. Uno contiene un aminoácido de barrido, preferiblemente alanina, en la posición N que es el presunto o conocido aminoácido activo. Los otros dos contienen el aminoácido de barrido en la posición N+1 y N-1. Si cada hGH sustituida ocasiona un efecto mayor que aproximadamente el doble sobre la K_{d} para el receptor, el aminoácido de barrido es sustituido en la posición N+2 y N-2. Esto se repite hasta que se han identificado al menos uno, y preferiblemente cuatro restos en cada dirección que tengan un efecto menor de aproximadamente el doble sobre la K_{d} o se haya alcanzado alguno de los extremos de la hGH de tipo salvaje. De esta manera, se pueden identificar uno o más aminoácidos junto con una secuencia de aminoácidos continua que están implicados en la interacción con el receptor concreto.
El resto aminoácido activo identificado por el barrido con aminoácido es típicamente uno que está directamente en contacto con el receptor diana. Sin embargo, los aminoácidos activos también pueden estar indirectamente en contacto con la diana a través de puentes salinos formados con otros restos o moléculas más pequeñas tales como H_{2}O o especies iónicas tales como Na^{+}, Ca^{+2}, Mg^{+2}, o Zn^{+2}.
En algunos casos, la sustitución de un aminoácido de barrido en uno o más restos da como resultado un polipéptido sustituido con los restos que no es expresado a niveles que permitan el aislamiento de cantidades suficientes para llevar a cabo el análisis de su actividad con el receptor. En tales casos, se puede utilizar un aminoácido de barrido diferente, preferiblemente un aminoácido de barrido isostérico.
Entre los aminoácidos de barrido preferidos están los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Entre tales aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina, y cisteína. La alanina es el aminoácido de barrido preferido de este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. Asimismo se prefiere la alanina debido a que es el aminoácido más común. Adicionalmente, se encuentra frecuentemente en posiciones tanto ocultas como expuestas. Creighton, The Proteins (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976). Si la sustitución de la alanina no rinde cantidades adecuadas de variante de hGH, se puede utilizar un aminoácido isostérico. Alternativamente, se pueden utilizar los siguientes aminoácidos en orden decreciente de preferencia: Ser, Asn, y Leu.
Una vez que los restos aminoácido activos están identificados, se pueden sustituir los aminoácidos isostéricos. No es necesario que tales sustituciones isostéricas se produzcan en todos los casos y pueden ser realizadas antes de identificar cualquier aminoácido activo. Semejante sustitución de aminoácidos isostéricos se realiza para minimizar los potenciales efectos desorganizadores de la conformación que algunas sustituciones pueden causar. Los aminoácidos isostéricos se muestran en la siguiente tabla:
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El presente método puede ser utilizado para detectar restos aminoácido activos dentro de diferentes dominios activos. Una vez que se ha realizado esta identificación, se pueden realizar diversas modificaciones en la hGH de tipo salvaje para modificar la interacción entre la hGH parental y una o más de las dianas.
Para la hGH en particular, sirve como ejemplo de la presente invención una realización preferida en la que se identifican los dominios activos y los restos activos que determinan su actividad con su receptor somatogénico (hGHbp). Al llevar a cabo esta realización de la invención, se han elaborado o identificado variantes de hGH, incluyendo variantes de hGH sustituidas con un resto aminoácido que tienen diferentes interacciones de unión con hGHbp en comparación con la hGH de origen natural. Algunas pueden tener una afinidad superior por hGHbp y una potencia intensificada para la somatogénesis en ratas. Otras pueden tener una actividad disminuida con hGHbp. Tales variantes de hGH son útiles como agonistas o antagonistas de hGH y pueden tener una potencia superior para estimular otros receptores de hGH, si tales variantes son liberadas de la interacción sustancial con hGHbp. Adicionalmente, tales variantes son útiles en inmunoanálisis para hGH como patrón o trazador de hGH. Se pueden identificar algunas variantes que tienen una reactividad significativamente disminuida con suero humano y de ratón conteniendo anticuerpos policlonales anti-hGH. Otras tienen la misma afinidad de unión para hGHbp que para hGH pero una potencia incrementada para estimular el crecimiento.
El método para determinar los dominios activos y los restos para la hGH que interaccionan con su receptor somatogénico del hígado se muestra esquemáticamente en la Figura 1, y los segmentos seleccionados se muestran en la Figura 2, de una solicitud de prioridad para esta solicitud (U.S.S.N 07/428.066 presentada el 26 de Octubre de 1989).
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Método de Presentación en Fagémidos
Adicionalmente, las variantes pueden ser analizadas mediante presentación en fagémidos. Este método implica (a) construir un vector de expresión replicable que comprende un primer gen que codifica la hGH, un segundo gen que codifica al menos una porción de una proteína de la envoltura del fago natural o de tipo salvaje donde el primer y el segundo gen son heterólogos, y un elemento regulador de la transcripción conectado operablemente al primer y segundo genes, formando de ese modo una fusión génica que codifica una proteína de fusión; (b) mutar el vector en una o más posiciones seleccionadas dentro del primer gen formando de ese modo una familia de plásmidos relacionados; (c) transformar células anfitrionas adecuadas con los plásmidos; (d) infectar las células anfitrionas transformadas con un fago coadyuvante que tiene un gen que codifica la proteína de la envoltura del fago; (e) cultivar las células anfitrionas infectadas transformadas en condiciones adecuadas para formar partículas de fagémidos recombinantes que contienen al menos una porción del plásmido y capaces de transformar el anfitrión, ajustadas las condiciones de manera que no más de una cantidad minoritaria de partículas de fagémido presenten más de una copia de la proteína de fusión sobre la superficie de la partícula; (f) poner en contacto las partículas de fagémidos con una molécula receptora de hGH (hGHbp) de manera que al menos una porción de las partículas de fagémido se una a la molécula receptora; y (g) separar las partículas de fagémido que se unen de las que no. Preferiblemente, el método comprende adicionalmente transformar células anfitrionas adecuadas con partículas de fagémido recombinantes que se unen a hGHbp y repetir las etapas (d) a (g) una o más veces.
Preferiblemente en este método el plásmido está bajo el estricto control del elemento regulador de la transcripción, y las condiciones de cultivo se ajustan de manera que la cantidad o el número de partículas de fagémido que presentan más de una copia de la proteína de fusión sobre la superficie de la partícula es menor de aproximadamente 1%. Asimismo, preferiblemente, la cantidad de partículas de fagémido que presentan más de una copia de la proteína de fusión es menor de 10% de la cantidad de partículas de fagémido que presentan una única copia de la proteína de fusión. Muy preferiblemente, la cantidad es menor de 20%.
Típicamente en este método, el vector de expresión contiene adicionalmente una secuencia señal secretora fusionada al ADN que codifica cada subunidad del polipéptido y el elemento regulador de la transcripción es un sistema promotor. Los sistemas promotores preferidos se seleccionan entre los promotores lac Z, \lambda_{PL}, tac, polimerasa T7, triptófano, y fosfatasa alcalina y combinaciones de los mismos. Asimismo, normalmente el método emplea un fago coadyuvante seleccionado entre M13K07, M13R408, M13-VCS, y Phi X 174. El fago coadyuvante preferido es M13K07, y la proteína de la envoltura preferida es la proteína de la envoltura del gen III del Fago M13. El anfitrión preferido es E. coli, y las cepas deficientes en proteasa de E. coli. Se han detectado variantes de hGH novedosas seleccionadas mediante el método de la presente invención. Se construyeron vectores de expresión de fagémidos que contenían un codón de terminación suprimible localizado funcionalmente entre los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido y la proteína de la envoltura del fago.
En detalle, se utilizan ciclos repetidos de selección de hGH para seleccionar una afinidad de unión más y más alta mediante selección en el fagémido de múltiples cambios de aminoácido que se seleccionan mediante múltiples ciclos de selección. Tras una primera ronda de selección en el fagémido, que implica una primera región o la selección de aminoácidos en el polipéptido ligando, se realizan rondas adicionales de selección en el fagémido en otras regiones o aminoácidos del polipéptido ligando. Los ciclos de selección en el fagémido se repiten hasta lograr las propiedades de afinidad deseadas del polipéptido ligando. Para ilustrar este procedimiento, se realizó la selección en fagémidos de hGH en ciclos. En el primer ciclo se pueden someter a mutación los aminoácidos 172, 174, 176 y 178 de hGH y se pueden seleccionar en fagémidos. En un segundo ciclo se pueden seleccionar en fagémidos los aminoácidos 167, 171, 175 y 179 de hGH. En un tercer ciclo se pueden seleccionar en fagémidos los aminoácidos 10, 14, 18 y 21 de hGH. Se pueden incorporar los cambios de aminoácidos óptimos de un ciclo previo al polipéptido antes del siguiente ciclo de selección. Por ejemplo, las sustituciones de los aminoácidos de hGH 174 (serina) y 176 (tirosina) fueron incorporadas a la hGH antes de la selección en fagémidos de los aminoácidos 167, 171, 175 y 17 9 de hGH.
A partir de lo anterior se apreciará que los restos aminoácido que forman el dominio de unión de la hGH no están conectados sucesivamente y pueden residir en diferentes subunidades del polipéptido. Esto es, el dominio de unión rastrea la estructura secundaria concreta en el sitio de unión y no la estructura primaria. Así, generalmente, se introducen mutaciones en los codones que codifican los aminoácidos dentro de una estructura secundaria concreta en sitios dirigidos lejos del interior del polipéptido de manera que tienen el potencial de interaccionar con el receptor. La localización de los restos en la hGH que modulan fuertemente su unión al receptor de hGH (Cunningham et al, Science, 1990, supra) es conocida. Por tanto, entre los sitios representativos adecuados para la mutagénesis se podrían incluir los restos 172, 174, 176, y 178 de la hélice 4, así como el resto 64 localizado en una estructura secundaria "no ordenada".
En este método de presentación en fagémidos, una vez que se ha aislado el gen de la hGH, éste puede ser insertado en un vector adecuado (preferiblemente un plásmido) para su amplificación, como describen generalmente Sambrook et al, en Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989. Si bien se encuentran disponibles numerosos tipos de vectores y pueden ser utilizados para poner en práctica esta invención, los vectores plasmídicos son los vectores preferidos para su uso en la presente, ya que pueden ser construidos con relativa facilidad, y pueden ser amplificados fácilmente. Los vectores plasmídicos contienen generalmente una variedad de componentes, incluyendo promotores, secuencias señal, genes de selección fenotípica, origen del sitio de replicación, y otros componentes necesarios como los conocidos por los expertos normales en la técnica.
Entre los promotores utilizados comúnmente en los vectores procarióticos se incluyen el sistema promotor lac Z, el promotor pho A de la fosfatasa alcalina, el promotor del bacteriófago \lambda_{PL} (un promotor sensible a la temperatura), el promotor tac (un promotor trp-lac híbrido que está regulado por el represor lac), el promotor del triptófano, y el promotor del bacteriófago T7. Para las descripciones generales de los promotores, ver la sección 17 de Sambrook et al, supra. Si bien estos son los promotores más comúnmente utilizados, también se pueden utilizar otros promotores microbianos adecuados.
Los promotores preferidos para poner en práctica esta invención para la presentación en fagémidos son aquellos que pueden ser regulados fuertemente de manera que la expresión del gen de fusión pueda ser controlada. Se cree que el problema que no era reconocido en la técnica anterior era que la presentación de múltiples copias de la proteína de fusión sobre la superficie de la partícula de fagémido conducía a un anclaje multipuntual del fagémido con la diana. Se cree que este efecto, referido como "efecto quelato", produce la selección de falsos polipéptidos de "elevada afinidad" cuando se presentan múltiples copias de la proteína de fusión sobre la partícula del fagémido en íntima proximidad entre sí de manera que la diana es "quelada". Cuando se produce un anclaje multipuntual, la K_{d} efectiva o aparente puede ser tan alta como el producto de las K_{d} individuales para cada copia de la proteína de fusión presentada.
Se ha descubierto que regulando fuertemente la expresión de la proteína de fusión de manera que no más de una cantidad minoritaria, es decir, menos de aproximadamente el 1%, de las partículas de fagémido contenga múltiples copias de la proteína de fusión, se supera el "efecto quelato", permitiendo una selección apropiada de los polipéptidos de elevada afinidad. Así, dependiendo del promotor, se ajustan las condiciones de cultivo del anfitrión para maximizar el número de partículas de fagémido que contienen una única copia de la proteína de fusión y minimizar el número de partículas de fagémido que contienen múltiples copias de la proteína de fusión.
Los promotores preferidos utilizados para poner en práctica esta invención son el promotor lac Z y el promotor pho A. El promotor lac Z es regulado por la proteína represora de lac, lac i, y por tanto la transcripción del gen de fusión puede ser controlada mediante manipulación del nivel de proteína represora lac. A modo de ilustración, el fagémido que contiene el promotor lac Z se hace crecer en una cepa celular que contiene una copia del gen represor lac i, un represor para el promotor lac Z. Entre las cepas celulares ilustrativas que contienen el gen lac i se incluyen JM 101 y XL1-blue. En la alternativa, la célula anfitriona puede ser co-transfectada con un plásmido que contiene tanto el represor lac i como el promotor lac Z. Ocasionalmente ambas técnicas anteriores se utilizan simultáneamente, esto es, se hacen crecer partículas de fagémido que contienen el promotor lac Z en cepas celulares que contienen el gen lac i y las cepas celulares son contransfectadas con un plásmido que contiene los genes tanto lac Z como lac i.
Normalmente cuando se desea expresar un gen, al anfitrión transfectado anterior se le podría añadir un inductor tal como isopropiltiogalactósido (IPTG). En la presente invención, sin embargo, esta etapa es omitida para (a) minimizar la expresión de la proteína de fusión del gen III, minimizando de ese modo el número de copias (es decir, el número de fusiones del gen III por número de fagémidos) y para (b) evitar el empaquetamiento escaso o impropio del fagémido causado por inductores tales como IPTG incluso a bajas concentraciones. Típicamente, cuando no se añade inductor, el número de proteínas de fusión por partícula de fagémido es de aproximadamente 0,1 (número de proteínas de fusión en bruto/número de partículas de fagémido). El promotor más preferido utilizado para poner en práctica esta invención es pho A. Se cree que este promotor está regulado por el nivel de fosfato inorgánico en la célula en la que el fosfato actúa regulando a la baja la actividad del promotor. De este modo, agotando el fosfato de las células, se puede incrementar la actividad del promotor. El resultado deseado se logra desarrollando las células en medio enriquecido con fosfato tal como 2YT o LB, controlando de ese modo la expresión de la fusión del gen III.
Otro de los componentes útiles de los vectores utilizados para poner en práctica esta invención es una secuencia señal. Esta secuencia se localiza típicamente inmediatamente 5' con respecto al gen que codifica la proteína de fusión, y por tanto se transcribe en el extremo amino de la proteína de fusión. Sin embargo, en ciertos casos, se ha demostrado que la secuencia señal está localizada en posiciones diferentes de 5' con respecto al gen que codifica la proteína que se va a secretar. Esta secuencia se dirige a la proteína a la cual se ancla a través de la membrana interna de la célula bacteriana. El ADN que codifica la secuencia señal puede ser obtenido como un fragmento de una endonucleasa de restricción de cualquier gen que codifique una proteína que tenga una secuencia señal. Las secuencias señal procarióticas adecuadas pueden ser obtenidas de genes que codifican, por ejemplo, lamB u ompF (Wong et al, Gene, 68: 193 [1983]), MalE, PhoA, y otros genes. Una secuencia señal procariótica preferida para poner en práctica esta invención es la secuencia señal de la enterotoxina II estable al calor de E. coli (STII) descrita por Chang et al, supra.
Otro componente útil de los vectores utilizados para poner en práctica el método de presentación en fagos son los genes de selección fenotípica. Los genes de selección fenotípica típicos son aquellos que codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos a la célula anfitriona. A modo de ilustración, son fácilmente empleados para este propósito el gen de resistencia a la ampicilina (amp) y el gen de resistencia a la tetraciclina (tet).
La construcción de vectores adecuados que comprenden los componentes mencionados antes así como el gen que codifica la hGH (gen 1) se preparan utilizando procedimientos de ADN recombinante normalizados como los descritos por Sambrook et al, supra. Los fragmentos de ADN aislados que se van a combinar para formar el vector son escindidos, adaptados, y ligados juntos en un orden y orientación específicos para generar el vector deseado.
El ADN es escindido utilizando la enzima o las enzimas de restricción apropiadas en un tampón adecuado. En general, se utilizan plásmidos o fragmentos de ADN de aproximadamente 0,2-1 \mug con aproximadamente 1-2 unidades de la enzima de restricción apropiada en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Los tampones apropiados, las concentraciones de ADN, y los tiempos y temperatura de incubación son especificados por los fabricantes de las enzimas de restricción. Generalmente, son adecuados tiempos de incubación de aproximadamente una o dos horas a 37ºC, aunque numerosas enzimas requieren temperaturas más elevadas. Tras la incubación, las enzimas y otros contaminantes se separan mediante extracción de la solución de digestión con una mezcla de fenol y cloroformo, y el ADN es recuperado de la fracción acuosa mediante precipitación con etanol.
Para ligar los fragmentos de ADN juntos para formar un vector funcional, los extremos de los fragmentos de ADN deben ser compatibles entre sí. En algunos casos, los extremos son directamente compatibles tras la digestión con la endonucleasa. No obstante, puede ser necesario convertir primero los extremos cohesivos producidos comúnmente mediante la digestión con endonucleasa en extremos romos para hacerlos compatibles para la ligación. Para volver romos los extremos, el ADN se trata en un tampón adecuado durante al menos 15 minutos a 15ºC con 10 unidades del fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I (Klenow) en presencia de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato. El ADN es purificado después mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación en etanol.
Los fragmentos de ADN escindidos pueden ser separados por tamaños y seleccionados utilizando electroforesis en gel del ADN. El ADN puede ser sometido a electroforesis o bien a través de agarosa o bien de una matriz de poliacrilamida. La selección de la matriz depende del tamaño de los fragmentos de ADN que se van a separar. Tras la electroforesis, el ADN es extraído de la matriz mediante electroelución, o, si se ha utilizado agarosa de bajo punto de fusión como matriz, fundiendo la agarosa y extrayendo el ADN de ella, como se describe en las secciones 6.30-6.33 de Sambrook et al, supra.
Los fragmentos de ADN que se van a ligar juntos (previamente digeridos con las enzimas de restricción apropiadas de manera que los extremos de cada fragmento que se vaya a ligar sean compatibles) se ponen en solución en cantidades aproximadamente equimolares. La solución también contiene ATP, tampón de ligasa, y una ligasa tal como ADN ligasa de T4 a aproximadamente 10 unidades por 0,5 \mug de ADN. Si el fragmento de ADN va a ser ligado en un vector, el vector es linealizado primero cortando con las endonucleasas de restricción apropiadas. El vector linealizado es tratado después con fosfatasa alcalina o fosfatasa intestinal de ternera. El tratamiento con la fosfatasa evita la autoligación del vector durante la etapa de ligación.
Tras la ligación, el vector con el gen foráneo ahora insertado es transformado en una célula anfitriona adecuada. Los procariotas son las células anfitrionas preferidas para esta invención. Entre las células anfitrionas procarióticas adecuadas se incluyen E. coli cepa JM101, E. coli K12 cepa 294 (número ATCC 31.446), E. coli cepa W3110 (número ATCC 27.325), E. coli X1776 (número ATCC 31.537), E. coli XL-1Blue (Stratagene), y E. coli B; no obstante, también se pueden utilizar muchas otras cepas de E. coli, tales como HB101, NM522, NM538, y NM539, y muchas otras especies y géneros de procariotas. Además de las cepas de E. coli enumeradas antes, se pueden utilizar como anfitriónes bacilos tales como Bacillus subtilis, otras enterobacteriáceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcescens, y diversas especies de Pseudomonas.
La transformación de células procariotas es completada fácilmente utilizando el método del cloruro de calcio como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al, supra. Alternativamente, se puede utilizar la electroporación (Neumann et al, EMBO J., 1 841 [1982]) para transformar estas células. Las células transformadas se seleccionan mediante el crecimiento sobre un antibiótico, comúnmente tet o amp, a los cuales se han vuelto resistentes debido a la presencia de genes de resistencia a tet y/o amp en el vector.
Tras la selección de las células transformadas, estas células se hacen crecer en cultivo y el ADN plasmídico (u otro vector con el gen foráneo insertado) es después aislado. El ADN plasmídico puede ser aislado utilizando métodos conocidos en la técnica. Dos métodos adecuados son la preparación a pequeña escala de ADN y la preparación a gran escala de ADN como se describe en las secciones 1.25-1.33 de Sambrook et al, supra. El ADN aislado puede ser purificado mediante métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la sección 1.40 de Sambrook et al, supra. Este ADN plasmídico purificado es analizado después mediante mapeo de restricción y/o secuenciación de ADN. La secuenciación de ADN se realiza generalmente mediante el método de Messing et al, Ácido Nucleicos Res., 9 309 (1981), el método de Maxam et al, Meth. Enzymol. 65: 499 (1980), o el método de Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977).
El presente método de presentación en fagémidos contempla fusionar el gen que codifica la hGH (gen 1) con un segundo gen (gen 2) de manera que se genere una proteína de fusión durante la transcripción. El gen 2 es típicamente un gen de una proteína de la envoltura de un fago, y preferiblemente es la proteína de la envoltura del gen III del fago M13, o un fragmento del mismo. La fusión de los genes 1 y 2 puede ser completada insertando el gen 2 en un sitio concreto de un plásmido que contiene el gen 1, o insertando el gen 1 en un sitio concreto de un plásmido que contiene el gen 2.
La inserción de un gen en un plásmido requiere que el plásmido sea cortado en la localización precisa en la que va a ser insertado el gen. Así, debe haber un sitio para la endonucleasa de restricción en esta localización (preferiblemente un sitio único tal que el plásmido sea cortado sólo en una localización durante la digestión con la endonucleasa de restricción). El plásmido es digerido, tratado con fosfatasa, y purificado como se ha descrito antes. Después el gen es insertado en este plásmido linealizado ligando los dos ADN juntos. La ligación puede ser completada si los extremos del plásmido son compatibles con los extremos del gen a insertar. Si las enzimas de restricción se utilizan para cortar el plásmido y aislar el gen que se va a insertar para crear extremos romos o extremos cohesivos compatibles, los ADN pueden ser ligados juntos directamente con una ligasa tal como la ADN ligasa del bacteriófago T4 incubando la mezcla a 16ºC durante 1-4 horas en presencia de ATP y tampón de ligasa como se describe en la sección 1.68 de Sambrook et al, supra. Si los extremos no son compatibles, se deben hacer primero romos utilizando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I o la ADN polimerasa del bacteriófago T4, ambas las cuales requieren los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato para rellenar los extremos de hebra sencilla sobresalientes del ADN digerido.
Alternativamente, los extremos se pueden volver romos utilizando una nucleasa tal como la nucleasa S1 o la nucleasa de judía mung, ambas las cuales funcionan cortando de nuevo las hebras sencillas sobresalientes del ADN. El ADN es religado después utilizando una ligasa como se ha descrito antes. En algunos casos, puede no ser posible volver romos los extremos del gen que va a ser insertado, ya que el marco de lectura de la región codificante sería alterado. Para superar este problema, se pueden utilizar conectores oligonucleotídicos. Los conectores sirven como puente para conectar el plásmido al gen que va a ser insertado. Estos conectores pueden ser elaborados sintéticamente en forma de ADN de doble hebra o de hebra sencilla utilizando métodos normalizados. Los conectores tienen un extremo que es compatible con los extremos del gen que va a ser insertado; los conectores se ligan primero a este gen utilizando los métodos de ligación descritos antes. El otro extremo de los conectores es diseñado para que sea compatible con el plásmido para la ligación. Al diseñar los conectores, se debe tener cuidado de no destruir el marco de lectura del gen que va a ser insertado o el marco de lectura del gen contenido en el plásmido. En algunos casos, puede ser necesario diseñar los conectores de manera que codifiquen parte de un aminoácido, o de manera que codifiquen uno o más aminoácidos.
Entre el gen 1 y el gen 2, se puede insertar un ADN que codifica un codón de terminación, siendo semejantes codones de terminación UAG (ámbar), UAA (ocre), y UGA (ópalo). Davis et al, Microbiology, (Harper y Row: Nueva York, 1980), páginas 237, 245-247, y 274. El codón de terminación expresado en una célula anfitriona de tipo salvaje da como resultado la síntesis del producto proteico del gen 1 sin la proteína del gen 2 anclada. No obstante, el crecimiento en una célula anfitriona supresora da como resultado la síntesis de cantidades detectables de la proteína fusionada. Tales células anfitrionas supresoras contienen un ARNt modificado para insertar un aminoácido en la posición del codón de terminación del ARNm, dando como resultado de ese modo la producción de cantidades detectables de la proteína de fusión. Tales células anfitrionas supresoras son bien conocidas y descritas, tal como la cepa supresora de E. coli. Bullock et al, BioTechniques, 5: 376-379 (1987). Se puede utilizar cualquier método aceptable para situar un codón de terminación en el ARNm que codifica el polipéptido de fusión.
El codón suprimible puede ser insertado entre el gen hGH y un segundo gen que codifica al menos una porción de una proteína de la envoltura del fago. Alternativamente, el codón de terminación suprimible puede ser insertado adyacente al sitio de la fusión remplazando el último triplete de aminoácidos del polipéptido o el primer aminoácido de la proteína de la envoltura del fago. Cuando el fagémido que contiene el codón suprimible se hace crecer en una célula anfitriona supresora, esto da como resultado la producción detectable de un polipéptido de fusión que contiene la hGH y la proteína de la envoltura. Cuando se hace crecer el fagémido en una célula anfitriona no supresora, la hGH es sintetizada sustancialmente sin fusión a la proteína de la envoltura del fago debido a la terminación en el triplete suprimible insertado que codifica UAG, UAA, o UGA. En la célula no supresora el polipéptido es sintetizado y secretado de la célula anfitriona debido a la ausencia de la proteína de la envoltura del fago fusionada que por otra parte lo anclaba a la célula anfitriona.
El gen hGH puede ser alterado en uno o más codones seleccionados. Una alteración se define como una sustitución, deleción, o inserción de uno o más codones en el gen que codifica la hGH que da como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos de la hGH en comparación con la secuencia no alterada o de tipo salvaje de la hGH. Preferiblemente, las alteraciones son por sustitución de al menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en una o más regiones de la molécula. Las alteraciones pueden ser producidas por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Entre estos métodos se incluyen, pero no están limitados a, mutagénesis mediada por oligonucleótidos y mutagénesis de la casete.
La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es el método preferido para preparar variantes por sustitución, deleción, o inserción de hGH. El mecanismo es bien conocido en la técnica como describen Zoller et al, supra. Brevemente, el gen de la hGH es alterado hibridando un oligonucleótido que codifica la mutación deseada a un molde de ADN, donde el molde es la forma de hebra sencilla del plásmido que contiene la secuencia de ADN no alterada o de tipo salvaje para la hGH. Tras la hibridación, se utiliza una ADN polimerasa para sintetizar una segunda hebra complementaria completa del molde, y de este modo incorpora el cebador oligonucleotídico y codifica la alteración seleccionada en el gen hGH.
Generalmente, se utilizan oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud. Aunque se pueden emplear oligonucleótidos más pequeños, un oligonucleótido óptimo tiene de 12 a 15 nucleótidos que son complementarios al molde a cualquier lado del oligonucleótido o los oligonucleótidos que codifican la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido hibrida apropiadamente con la molécula del molde de ADN de hebra sencilla. Los oligonucleótidos son fácilmente sintetizados utilizando mecanismos conocidos en la técnica tales como los descritos por Crea et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765 (1978).
El molde de ADN sólo puede ser generado por los vectores que derivan de vectores del bacteriófago M13 (son adecuados los vectores M13mp18 y M13mp19 asequibles comercialmente), o aquellos vectores que contienen un origen de replicación del fago de hebra sencilla como describen Vieira y Messing, Meth. Enzymol., 153: 3-11 (1987). Así, el ADN que va a ser mutado debe ser insertado en uno de estos vectores con el fin de generar un molde de hebra sencilla. La producción del molde de hebra sencilla es descrita en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook et al, supra.
Para alterar la secuencia de ADN de tipo salvaje, se hibrida el oligonucleótido al molde de hebra sencilla en condiciones de hibridación adecuadas. Una enzima polimerizadora de ADN, normalmente el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, es añadida después para sintetizar la hebra complementaria del molde utilizando el oligonucleótido como cebador para la síntesis. De ese modo se forma una molécula heterodúplex de manera que una hebra del ADN codifica la forma mutada del gen hGH, y la otra hebra (el molde original) codifica la secuencia no alterada, de tipo salvaje del gen hGH. Esta molécula heterodúplex es transformada después en una célula anfitriona adecuada, normalmente un procariota tal como E. coli JM101. Una vez que las células se han desarrollado, se cultivan en placa sobre placas de agarosa y se rastrean utilizando el cebador oligonucleotídico radiomarcado con Fosfato 32 para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado.
El método descrito inmediatamente antes puede ser modificado de manera que se cree una molécula homodúplex donde ambas hebras del plásmido contengan la mutación o las mutaciones. Las modificaciones son las siguientes: El oligonucleótido de hebra sencilla es recocido con el molde de hebra sencilla descrito antes. Se combina una mezcla de tres desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP), y desoxirribotimidina (dTTP), con una tio-desoxirribocitosina modificada denominada dCTP-(aS) (que puede ser obtenida de Amersham). Esta mezcla es añadida al complejo molde-oligonucleótido. Tras la adición de ADN polimerasa a esta mezcla, se genera una hebra de ADN idéntica al molde excepto por las bases mutadas. Además, esta nueva hebra de ADN contiene dCTP-(AS) en lugar de dCTP, que sirve para protegerla de la digestión con la endonucleasa de restricción. Una vez que se forman los cortes en la hebra molde del heterodúplex de doble hebra con una enzima de restricción apropiada, la hebra molde puede ser digerida con la nucleasa ExoIII u otra nucleasa apropiada pasada la región que contiene el sitio o los sitios que van a ser sometidos a mutagénesis. Después la reacción se detiene para dejar una molécula que sólo es parcialmente de hebra sencilla. Luego se forma un homodúplex de ADN de doble hebra completa utilizando ADN polimerasa en presencia de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato, ATP, y una ADN ligasa. Esta molécula homodúplex puede ser transformada después en una célula anfitriona adecuada tal como E. coli JM101, como se ha descrito antes.
Los mutantes con más de un aminoácido a sustituir pueden ser generados en una de numerosas maneras. Si los aminoácidos están localizados juntos en la cadena polipeptídica, pueden ser mutados simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifique todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Si no obstante, los aminoácidos están localizados a cierta distancia entre sí (separados por más de aproximadamente diez aminoácidos), es más difícil generar un único oligonucleótido que codifique todos los cambios deseados. En lugar de eso, se puede emplear uno de dos métodos alternativos.
En el primer método, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido a ser sustituido. Los oligonucleótidos son después recocidos con el ADN molde de hebra sencilla simultáneamente, y la segunda hebra de ADN es sintetizada a partir del molde que codifica todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. El método alternativo implica dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es como se ha descrito para los mutantes individuales: se utiliza ADN de tipo salvaje para el molde, se recuece un oligonucleótido que codifica la primera sustitución o sustituciones de aminoácidos deseadas con este molde, y después se genera la molécula de ADN heterodúplex. En la segunda ronda de mutagénesis se utiliza el ADN mutado producido en la primera ronda de mutagénesis como molde. Así, este molde ya contiene una o más mutaciones. El oligonucleótido que codifica la sustitución o las sustituciones de aminoácidos deseadas adicionales es recocido después con este molde, y la hebra de ADN resultante codifica ahora las mutaciones de la primera y segunda rondas de mutagénesis. Este ADN resultante puede ser utilizado como molde en una tercera ronda de mutagénesis, y así sucesivamente.
La mutagénesis de casete es también un método preferido para preparar variantes por sustitución, deleción, e inserción de ADN de hGH. El método se basa en el descrito por Wells et al, Gene, supra. La sustancia de partida es el plásmido (u otro vector) que comprende el gen de hGH que va a ser mutado. Se identifican el codón o los codones del gen hGH que va a ser mutado. Optimamente, existe un único sitio para la endonucleasa de restricción a cada lado del sitio o los sitios de mutación identificados; no obstante, esto no es un requerimiento. Si no existen tales sitios de restricción, éstos pueden ser generados utilizando el método de mutagénesis mediada por oligonucleótidos descrito antes para introducirlos en localizaciones apropiadas en el gen hGH. Una vez que se han introducido los sitios de restricción en el plásmido, el plásmido se corta en estos sitios para linealizarlo. Se sintetiza un oligonucleótido de doble hebra que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción pero conteniendo la mutación o las mutaciones deseadas utilizando procedimientos normalizados. Las dos hebras se sintetizan por separado y después se hibridan juntas utilizando técnicas normalizadas. Este oligonucleótido de doble hebra es referido como la casete. Esta casete se diseña para que tenga extremos 3' y 5' que sean compatibles con los extremos del plásmido linealizado, de manera
que pueda ser ligado directamente al plásmido. Ahora este plásmido contiene la secuencia de ADN mutada de la hGH.
Para preparar la molécula receptora y unirla con el fagémido, se ancla el receptor purificado a una matriz adecuada tal como cuentas de agarosa, cuentas de acrilamida, cuentas de vidrio, celulosa, diversos copolímeros acrílicos, geles de metacrilato de hidroxialquilo, poli(ácido acrílico), copolímeros polimetacrílicos, nailon, portadores neutros e iónicos, y similares. El anclaje del receptor a la matriz puede ser completado mediante métodos descritos en Meth. Enzymol., 44: (1976), o mediante otros métodos conocidos en la técnica.
Tras el anclaje del receptor a la matriz, la diana inmovilizada se pone en contacto con el genoteca de partículas de fagémido en condiciones adecuadas para la unión de al menos una porción de las partículas de fagémido con la diana inmovilizada. Normalmente, las condiciones, incluyendo el pH, la fuerza iónica, la temperatura, y similares imitan las condiciones fisiológicas.
Las partículas de fagémido unidas ("aglutinantes") que tienen una elevada afinidad por el receptor inmovilizado se separan de las que tienen una baja afinidad (y por tanto no se unen a la diana) mediante lavado. Los aglutinantes pueden ser disociados de la diana inmovilizada mediante una variedad de métodos. Entre estos métodos se incluyen la disociación competitiva utilizando el ligando de tipo salvaje, la alteración del pH y/o la fuerza iónica, y los métodos conocidos en la técnica.
Las células anfitrionas adecuadas son infectadas con los aglutinantes y el fago coadyuvante, y las células anfitrionas son cultivadas en condiciones adecuadas para la amplificación de las partículas de fagémido. Las partículas de fagémido son recogidas después y el procedimiento de selección se repite una o más veces hasta que se seleccionan los aglutinantes que tienen la afinidad deseada para la molécula diana.
Opcionalmente, el genoteca de partículas de fagémido se puede poner en contacto sucesivamente con más de un receptor inmovilizado para mejorar la selectividad para un receptor concreto. Así, la hGH tiene más de un receptor natural: el receptor de la hGH y el receptor de la prolactina. Puede ser deseable mejorar la selectividad de la hGH hacia el receptor de GH sobre el receptor de la prolactina. Esto se puede lograr poniendo en contacto primero la genoteca de partículas de fagémido con el receptor de GH inmovilizado, permitiendo que se produzca la unión en presencia de una concentración muy elevada de receptor de prolactina en solución, y seleccionando los aglutinantes. En este caso, un mutante de hGH con una baja afinidad por el receptor de prolactina tendría una utilidad terapéutica incluso si la afinidad por el receptor de GH fuera algo inferior a la de la hGH de tipo salvaje.
Producción de Variantes de hGH
Las variantes de hGH de la presente invención pueden ser producidas convenientemente mediante mecanismos recombinantes normalizados. Más específicamente, se puede expresar una variante de hGH utilizando un sistema vector-célula anfitriona, tal como el descrito antes en el estudio del barrido con alanina.
En una realización, se utiliza un fagémido de la presente invención para producir una variante de hGH libre de la proteína del fago. Por ejemplo, se pueden desarrollar simplemente pSO643 y derivados en una cepa no supresora tal como 16C9. En este caso, el codón ámbar (TAG) conduce a la terminación de la traducción, que rinde la hormona libre. La variante de hGH es secretada de la célula anfitriona y puede ser aislada del medio de cultivo como se describe más abajo.
Las células anfitrionas que contienen un vector de expresión de la variante de hGH se cultivan en condiciones adecuadas para el crecimiento celular y para la expresión de la variante de hGH. En particular, el medio de cultivo contiene nutrientes y factores de crecimiento apropiados para la célula anfitriona empleada. Los nutrientes y los factores de crecimiento requeridos para el crecimiento de una célula anfitriona seleccionada son, en muchos casos, bien conocidos o pueden ser fácilmente determinados empíricamente por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo adecuadas para las células anfitrionas de mamífero, por ejemplo, se describen en Mammalian Cell Culture (Mather, J.P. ed., Plenum Press 1984) y Barnes y Sato, Cell, 22: 649 (1980).
Además, las condiciones de cultivo deben permitir la transcripción, la traducción, y el transporte de proteínas entre los compartimentos celulares. Los factores que afectan a estos procedimientos son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, el número de copias de ADN/ARN; los factores que estabilizan el ARN; los nutrientes, los suplementos, y los inductores o represores transcripcionales presentes en el medio de cultivo; la temperatura, el pH, y la osmolalidad del cultivo; y la densidad celular. El ajuste de estos factores para promover la expresión en un sistema vector-célula anfitriona concreto está en el nivel de los expertos en la técnica.
Los procedimientos de cultivo celular empleados en la producción de una variante de hGH de la presente invención pueden ser cualquiera de los numerosos procedimientos bien conocidos para la producción de proteínas a gran o pequeña escala. Entre estos se incluyen, pero no están limitados a, el uso de: un biorreactor de lecho fluidificado, un biorreactor de fibra hueca, un sistema de cultivo de botella giratoria, y un sistema biorreactor de tanque agitado. Se puede producir una variante de hGH, por ejemplo, en un procedimiento en la modalidad de lotes, de alimentación por lotes, o continuo.
Los métodos para la recuperación de proteínas recombinantes producidas como se ha descrito antes son bien conocidos y varían dependiendo del sistema de expresión empleado. Por ejemplo, si, como es típico, el vector de expresión contiene una secuencia señal, la variante de hGH es recuperada del medio de cultivo o del periplasma. Convenientemente, la variante es secretada en el espacio del periplasma como una proteína totalmente madura (es decir, carente de la secuencia señal de secreción). Sin embargo, la variante de hGH también puede ser expresada intracelularmente y recuperada de los productos lisados celulares.
La variante de hGH puede ser purificada del medio de cultivo o del producto lisado celular mediante cualquier método capaz de separar la variante de los componentes de la célula anfitriona o el medio de cultivo. Típicamente la variante de hGH es separada de la célula anfitriona y/o los componentes del medio de cultivo que interferirían en la pegilación, si se desea, o en el uso diagnóstico o terapéutico de la variante de hGH.
Como primera etapa, el medio de cultivo o el producto lisado celular es normalmente centrifugado o filtrado para separar los desechos celulares. El sobrenadante es concentrado después típicamente o diluido a un volumen deseado o diafiltrado en un tampón adecuado para acondicionar la preparación para una purificación adicional. La purificación adicional de la variante de hGH incluye típicamente separar las formas desamidadas y acortadas de la variante de hGH de la forma intacta. Por ejemplo, la variante de hGH intacta puede ser separada de la variante des-phe-hGH, que carece de la fenilalanina N-terminal.
En una variación de esta realización, la variante de hGH es purificada (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna, utilizando un secuenciador de copa giratoria o (2) para homogeneizar mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando la tinción con azul de Coomassie.
Cualquiera de los siguientes procedimientos ilustrativos puede ser empleado para la purificación de una variante de hGH: cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio aniónico o catiónico (utilizando, v.g., DEAE SEPHAROSE); cromatografía sobre sílice; HPLC en fase reversa; filtración en gel (utilizando, v.g., SEPHADEX G-75); cromatografía de interacción hidrófoba; cromatografía metal-quelato; ultrafiltración/diafiltración; precipitación en etanol; precipitación en sulfato de amonio; cromatoenfoque; y cromatografía de desplazamiento. Los protocolos ejemplares para la purificación de variantes de hGH (B2036 y B2024), utilizando una combinación de cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de interacción hidrófoba, se muestran en los Ejemplos V y VI.
Modificación de las Variantes de hGH
La presente invención proporciona variantes de hGH ancladas covalentemente (en adelante "conjugadas") con uno o más grupos químicos. Semejante conjugación produce un producto conjugado de una variante de hGH que tiene un peso molecular real mayor que la variante de hGH no modificada. Según se utiliza aquí, el término "peso molecular real" hace referencia al peso molecular, medido mediante espectrometría de masas (v.g., espectrometría de masas con ionización/desorción por láser asistida por matriz). El peso molecular real del producto conjugado de hGH es normalmente al menos de aproximadamente 30 kD; preferiblemente, en el intervalo de aproximadamente 35 kD a aproximadamente 55 kD; y más preferiblemente, en el intervalo de aproximadamente 40 kD a aproximadamente 50 kD. Generalmente, el peso molecular real del producto conjugado de la variante de hGH no excede de 100 kD.
Los grupos químicos adecuados para su uso en un producto conjugado de una variante de hGH de la presente invención son preferiblemente significativamente no tóxicos o inmunogénicos, es decir, cualquier toxicidad o inmunogenicidad observada con un producto conjugado de una variante de hGH no es significativamente (es decir, menos del 50%) mayor que cualquier toxicidad o inmunogenicidad observada con la correspondiente variante de hGH no modificada. Típicamente, se selecciona un grupo químico que reduce la toxicidad y/o inmunogenicidad asociada con las variante de hGH no modificada. Además, el grupo químico se selecciona convenientemente para producir un producto conjugado de una variante de hGH que pueda ser almacenado y utilizado en condiciones adecuadas para el almacenamiento y utilización de la variante de hGH no modificada. Entre los grupos químicos ilustrativos se incluyen carbohidratos, tales como, por ejemplo, aquellos carbohidratos que se encuentran naturalmente sobre las glicoproteínas y los polímeros no proteicos, tales como polioles.
Un poliol, por ejemplo, puede ser conjugado con una molécula variante de hGH en uno o más restos aminoácido, incluyendo los restos lisina, como se describe en el documento WO 93/00109, supra. El poliol empleado puede ser cualquier polímero de poli(óxido de alquileno) soluble en agua y puede tener una cadena lineal o ramificada. Entre los polioles adecuados se incluyen aquellos sustituidos en una o más posiciones hidroxiladas con un grupo químico, tal como un grupo alquilo que tiene entre uno y cuatro carbonos. Típicamente, el poliol es un poli(alquilenglicol), tal como poli(etilenglicol) (PEG), y por tanto, para facilitar la descripción, el resto del estudio hace referencia a una realización ejemplar donde el poliol empleado es PEG y el procedimiento de conjugación del poliol a una variante de hGH es denominado "pegilación". No obstante, los expertos en la técnica reconocen que otros polioles, tales como, por ejemplo, poli(propilenglicol) y copolímeros de polietileno-polipropilenglicol, pueden ser empleados utilizando las técnicas de conjugación descritas aquí para PEG.
El peso molecular del PEG puede oscilar entre aproximadamente 500 y aproximadamente 30.000 daltons (D); preferiblemente, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 25.000 D; y más preferiblemente, de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 20.000 D. En una realización, la pegilación se lleva a cabo con PEG que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 5.000 D (en adelante "PEG(5000)"). Como se comenta más abajo y en el Ejemplo VII, las condiciones de reacción se ajustan para maximizar la producción de moléculas variantes de hGH conjugadas con entre aproximadamente cuatro y aproximadamente seis moléculas de PEG(5000). En otra realización, la pegilación se lleva a cabo con PEG que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 20.000 D en condiciones ajustadas para maximizar la producción de moléculas de hGH conjugadas con una molécula de PEG(20.000). Véase el Ejemplo VIII. En una variación de esta realización, se emplea un PEG de cadena ramificada que tiene dos cadenas de aproximadamente 10.000 D cada una. Véase el Ejemplo IX.
Las preparaciones de PEG que son asequibles comercialmente, y adecuadas para su uso en la presente invención, son preparaciones no homogéneas que se venden según el peso molecular medio. Por ejemplo, las preparaciones de PEG(5000) contienen típicamente moléculas que varían ligeramente de peso molecular, normalmente \pm500 D.
Se han descrito una variedad de métodos para pegilar proteínas. Véase, v.g., la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.179.337 (expedida a Davis et al), que describe la conjugación de numerosas hormonas y enzimas para PEG y polipropilenglicol para producir composiciones no inmunogénicas fisiológicamente activas. Generalmente, un PEG que tiene al menos un grupo hidroxi terminal se hace reaccionar con un agente de acoplamiento para formar un PEG activado que tiene un grupo reactivo terminal. Id. Este grupo reactivo se puede hacer reaccionar después con las \alpha- y \varepsilon-aminas de las proteínas para formar un enlace covalente. Convenientemente, el otro extremo de la molécula de PEG puede ser "bloqueado" con un grupo químico no reactivo, tal como un grupo metoxi, para reducir la formación de complejos entrecruzados con PEG de moléculas de proteína.
Para la pegilación de una variante de hGH, el PEG activado es aquél que puede reaccionar con la variante en condiciones que no destruyen la actividad de unión del Sitio 1. Para las variantes de hGH agonísticas, la actividad de unión al Sitio 2 también debe ser conservada. Además, para las variantes de hGH agonísticas y antagónicas, normalmente se evitan los PEG activados que introducen un grupo conector tóxico en el producto conjugado.
Los PEG activados adecuados pueden ser producidos mediante numerosas reacciones convencionales. Por ejemplo, se puede preparar un éster de N-hidroxisuccinimida de un PEG (M-NHS-PEG) a partir de monometiléter de PEG (que es asequible comercialmente de Union Carbide) mediante reacción con N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), según el método de Buckmann y Merr, Makromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981).
Además, se puede convertir un grupo hidroxi terminal de PEG en un grupo amino, por ejemplo, mediante reacción con bromuro de tionilo para formar PEG-Br, seguido de aminolisis con amoniaco en exceso para formar PEG-NH_{2}. El PEG-NH2 es conjugado después con la proteína de interés utilizando reactivos de acoplamiento adecuados, tales como el Reactivo K de Woodward. Además, se puede convertir un grupo -CH_{2}OH terminal de PEG en un grupo aldehído, por ejemplo, mediante oxidación con MnO_{2}. El grupo aldehído es conjugado con la proteína mediante alquilación reductiva con un reactivo tal como cianoborohidruro.
Alternativamente, se pueden adquirir PEG activados adecuados para su uso en la presente invención de numerosos proveedores. Por ejemplo, Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL) vende M-NHS-PEG como "SCM-PEG" además de succinimidilcarbonato de metoxi-PEG ("SC-PEG") y succinimidilpropionato de metoxi-PEG ("SPA-PEG"; en adelante referido como "M-SPA-PEG" para indicar la presencia del grupo bloqueador metoxi). El uso de M-SPA-PEG para pegilar la variante B2036 se expone en los Ejemplos VII y VIII. Shearwater Polymers también vende un PEG de cadena ramificada que tiene dos cadenas de 10.000 D (en adelante "NHS-PEG2(2 0.000)", cuyo uso se describe en el Ejemplo IX.
El grado de pegilación de una variante de hGH de la presente invención puede ser ajustado para proporcionar una vida media in vivo deseablemente incrementada (en adelante "vida media"), en comparación con la correspondiente proteína no pegilada. Se cree que la vida media de una variante de hGH pegilada aumenta típicamente con el incremento del grado de pegilación. En estudios de hGH de tipo salvaje pegilada, los Autores de la presente invención han observado que un producto conjugado de hGH de tipo salvaje que contiene dos grupos PEG(5.000) tiene aproximadamente una vida media 4 veces más larga en ratas que la proteína no pegilada, un producto conjugado que contiene 5 grupos PEG(5.000) tiene una vida media 11 veces más larga, y un producto conjugado que contiene siete grupos PEG tiene aproximadamente una vida media 18 veces más larga. Los pesos moleculares reales de esos productos conjugados de PEG-hGH de tipo salvaje fueron aproximadamente 33, 48, y 57 kD, respectivamente, en comparación con los 22 kD de la proteína no pegilada.
A incrementos mayores de pegilación, se cree que el incremento en la vida media de una variante de hGH pegilada es parcialmente compensado por un incremento en la constante de disociación (K_{d}) para la unión al Sitio 1, indicando un descenso en la afinidad por el Sitio 1. Se cree que este descenso en la afinidad está acompañado del correspondiente descenso en la potencia, que se refleja en un incremento en la concentración del producto conjugado requerida para el 50% del efecto máximo (CE_{50}). En estudios de hGH de tipo salvaje pegilada con PEG(5.000), un producto conjugado que contiene dos grupos PEG(5.000) tiene aproximadamente una potencia 3 veces inferior en un análisis de dimerización basado en células que la proteína no pegilada, un producto conjugado que contiene cinco grupos PEG (5.000) tiene aproximadamente una potencia 170 veces inferior, y un producto conjugado que contiene siete grupos PEG tiene aproximadamente una potencia 1.500 veces inferior.
Debido a que la unión al Sitio 1 es esencial para las variantes de hGH agonísticas y antagónicas de la presente invención, un incremento de la pegilación reduce la potencia de ambos tipos de variantes de hGH. No obstante, el incremento de la vida media compensa generalmente la reducción de potencia, de manera que en la actualidad se cree que la eficacia in vivo de las variantes de hGH pegiladas es comparable con, o mejor que, la observada con las correspondientes proteínas no pegiladas. Por consiguiente, un experto en la técnica puede determinar fácilmente un grado adecuado de pegilación para que una variante de hGH forme un producto conjugado que tenga una vida media deseablemente incrementada, en comparación con la proteína no pegilada, conservando aún una potencia suficiente para ser eficaz in vivo.
Normalmente, la vida media se incrementa al menos aproximadamente cinco veces; preferiblemente, al menos aproximadamente 10 veces; más preferiblemente, al menos aproximadamente 50 veces; y muy preferiblemente, al menos aproximadamente 100 veces. Además, el grado y los sitios de pegilación son tales que el producto conjugado de PEG-variante de hGH sea capaz de unirse al receptor de hGH en el Sitio 1, típicamente con una K_{d} de aproximadamente 400 nM o menos; preferiblemente, con una K_{d} de 150 o menos; y más preferiblemente con una K_{d} de 100 nM o menos, medida mediante un análisis de unión en equilibrio, tal como el descrito por Spencer et al, J. Biol. Chem., 263: 7862-7867 (1988).
Los productos conjugados de PEG-variante de hGH agonística son capaces de unirse al Sitio 2 como al Sitio 1, dimerizando de ese modo los receptores de hGH. La capacidad de dimerización puede ser medida, por ejemplo, mediante homoinactivación de fluorescencia, según el método Cunningham et al, Science, 254: 821-825 (1991), o en un análisis de dimerización basado en células, tal como el descrito por Fuh et al, Science, 256: 1677-1680 (1992), y en los Ejemplos XI y XII. Convenientemente, la CE_{50} para las variantes de hGH agonísticas pegiladas, medida en el análisis de dimerización basado en células de Fuh et al, es aproximadamente 100 nM o inferior y más preferiblemente, aproximadamente 50 nM o inferior. (La CE_{50} es típicamente inferior que la K_{d}, presumiblemente debido a que sólo una fracción de los receptores de hGH asequibles necesitan ser dimerizados para lograr una respuesta máxima). Las variantes de hGH pegiladas que satisfacen estos criterios tienen un peso molecular real de al menos aproximadamente 40 kD. Entre los productos conjugados ejemplares se incluyen los productos conjugados que tienen aproximadamente cuatro a seis, y preferiblemente, cinco, moléculas de PEG(5.000) por molécula de variante de hGH y los productos conjugados que tienen una molécula de PEG(20.000) por molécula de variante de hGH.
El grado y los sitios de pegilación de una proteína son determinados mediante (1) el número de reactividades de los sitios de pegilación (es decir, aminas primarias) y (2) las condiciones de la reacción de pegilación. La hGH de tipo salvaje contiene diez aminas primarias que están teóricamente disponibles para reaccionar con un PEG activado; el grupo \alpha-amino de la fenilalanina N-terminal y los grupos \varepsilon-amino de las nueve lisinas. No obstante, debido a que algunas de las aminas primarias de la hGH y las variantes de hGH son relativamente no reactivas, las reacciones de pegilación normalizadas producen típicamente como resultado menos de una pegilación completa (v.g., siete u ocho PEG por molécula para la hGH de tipo salvaje).
Los sitios de pegilación de una proteína también están algo constreñidos por las reactividades de las diversas aminas primarias. Por ejemplo, una lisina potencial en la interfase de unión hormona-receptor Sitio 1 de la variante B2036 (K41) es relativamente no reactiva con M-SPA-PEG(5.000). Véase el Ejemplo X. Así, las preparaciones de la variante B2036 moderadamente pegilada, que tienen del orden de cuatro a seis PEG por molécula variante, conservan la capacidad de unirse al receptor de hGH en el Sitio 1, a pesar de la presencia de un sitio de pegilación potencial en esta interfase de unión.
Se pueden utilizar las técnicas de mutagénesis normalizadas para alterar el número de lisinas en la proteína. Así, en el grado que las sustituciones de aminoácidos introducen o remplazan lisinas, las variantes de hGH de la presente invención pueden contener un número mayor o menor de sitios de pegilación potenciales que la hGH de tipo salvaje. La variante B2036 contiene nueve sitios de pegilación potenciales, uno menos que la hGH de tipo salvaje, mientras que la variante B2024 que no forma parte de esta invención contiene diez sitios potenciales.
Además, las sustituciones de aminoácidos que introducen o remplazan lisinas alteran las localizaciones de los sitios de pegilación potenciales. Por ejemplo, en la variante B2036, las sustituciones K168A y K172R reducen el número de sitios disponibles para la pegilación en la interfase de unión al Sitio 1 hormona-receptor. La reposición de G120 por un aminoácido diferente interrumpe a unión de hGH en el Sitio 2, convirtiendo la molécula en un antagonista de hGH. La sustitución de lisina por glicina en esta posición proporciona un sitio de pegilación potencial adicional en el Sitio 2, que se espera que debilite cualquier unión residual en este sitio. Las reactividades de las aminas primarias en la variante B2036 se muestran en el Ejemplo X.
El grado y los sitios de pegilación también pueden ser manipulados ajustando las condiciones de reacción, tales como las concentraciones relativas de PEG activado y proteína así como el pH. Las condiciones adecuadas para un grado deseado de pegilación pueden ser determinadas empíricamente. En resumen, se crean reacciones de pegilación normalizadas en las cuales se hacen variar los parámetros observados antes. Por ejemplo, las reacciones de pegilación de las variantes de hGH (conteniendo 10 mg/ml de variante de hGH en tampón borato de sodio 0,05 M, pH 8,5) en las que el número de equivalentes de M-NHS-PEG(5.000) por grupo amino libre varía entre uno y tres producen las preparaciones mostradas más abajo:
3
(Según se utiliza con referencia al PEG activado, la frase "equivalente por grupo amino libre" hace referencia a una cantidad molar de PEG activado igual a la cantidad molar de la molécula que va a ser pegilada multiplicada por el número de aminas libres de la molécula). En las preparaciones sometidas a una pegilación limitada (tal como la preparación 1), la proteína es pegilada en la mayoría de los sitios reactivos, mientras, si la pegilación es más intensa (como en la preparación 3), también son pegilados menos sitios reactivos.
La pegilación de las variantes de hGH, tales como B2036, se lleva a cabo mediante cualquier método conveniente. En una realización ejemplar, las variantes de hGH son pegiladas con M-SPA-PEG(5.000). Véase, el Ejemplo VII. En resumen, se añade SPA-PEG(5.000) sólido, con agitación, a una solución acuosa de variante de hGH a la temperatura ambiente. Típicamente, la solución acuosa es tamponada con un tampón que tiene un pK_{a} próximo al pH al cual se va a llevar a cabo la reacción (generalmente aproximadamente pH 4-10). Entre los tampones adecuados para la pegilación a pH 7,5, por ejemplo, se incluyen HEPES, fosfato, borato, Tris-HCl, EPPS, y TES. El pH se controla continuamente y se ajusta si es necesario. La reacción se deja continuar durante aproximadamente una a aproximadamente dos horas.
Los productos de reacción se someten después a cromatografía de interacción hidrófoba para separar las variantes de hGH pegiladas de M-SPA-PEG(5.000) y cualquiera de los complejos de elevado peso molecular de la variante de hGH pegilada. (Los complejos de elevado peso molecular surgen cuando se activa PEG no bloqueado en ambos extremos de la molécula, entrecruzando moléculas de variantes de hGH). Las condiciones durante la cromatografía de interacción hidrófoba son tales que el M-SPA-PEG(5.000) libre fluye a través de la columna, mientras cualquier complejo de variante de hGH pegilada entrecruzado eluye tras las formas deseadas, que contienen una molécula de variante de hGH conjugada con uno o más grupos de PEG. Las condiciones adecuadas varían dependiendo de los tamaños relativos de los complejos entrecruzados versus los productos conjugados deseados y son fácilmente determinados por los expertos en la técnica. El eluyente que contiene los productos conjugados deseados se concentra por ultrafiltración y se somete eliminación de la sal por diafiltración.
Esta preparación representa una mezcla heterogénea de productos conjugados de PEG-variante de hGH que tienen entre tres y seis grupos PEG por molécula de variante de hGH. En una realización, esta mezcla se somete a una etapa de purificación adicional que produce una preparación más homogénea de variantes de hGH pegiladas. Más específicamente, la mezcla es sometida a cromatografía de intercambio catiónico para fraccionar las variantes de hGH pegiladas según el grado de pegilación. Las condiciones son tales que las variantes de hGH más altamente pegiladas que tienen un mayor número de grupos PEG eluyen antes en el gradiente.
De esta manera, es posible obtener una reserva de variantes de hGH pegiladas que contienen principalmente una o dos formas. Según se utiliza aquí más adelante, una "forma" de una variante de hGH pegilada es un producto conjugado de PEG-variante de hGH que contiene un número concreto de grupos PEG. Por consiguiente, diferentes "formas" de variante de hGH pegilada tienen diferentes números de grupos PEG conjugados con la misma variante de hGH. En una realización ilustrativa, se obtiene una reserva de variantes de hGH pegiladas que contiene principalmente dos formas, esto es productos conjugados que tienen 4 o 5 PEG por molécula de variante de hGH (en adelante "preparación de variante de hgH con 4/5 PEG"). Esta reserva puede ser concentrada después, sometida a eliminación de la sal, y formulada para su administración, como se estudia más abajo.
Una composición que contiene una variante de hGH pegilada para su uso en una formulación terapéutica puede ser heterogénea y homogénea, es decir, conteniendo una única forma de PEG-hGH. Típicamente, la composición contiene al menos el 70% de una o dos formas de productos conjugados de PEG-variante de hGH; preferiblemente, al menos 80% de una o dos formas; y más preferiblemente, al menos 90% de una o dos formas.
Formulaciones Terapéuticas
Las formulaciones de las variantes de hGH de la presente invención para la administración terapéutica se preparan para el almacenamiento mezclando una variante de hGH que tiene el grado de pureza deseado con un portador, excipiente, o estabilizador farmacéuticamente aceptable opcional. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^{a} Edición, Oslo, A., Ed., [1980]) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Las formulaciones parenterales pueden ser preparadas mezclando la variante de hGH en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, o emulsión) con un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores, excipientes, o estabilizadores farmacéuticamente aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empeladas y son compatibles con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación no incluye preferiblemente agentes oxidantes ni otros compuestos conocidos por ser deletéreos para los polipéptidos.
Entre los portadores adecuados se incluyen tampones que contienen fosfato, borato, HEPES, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seralbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparragina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; iones metálicos divalentes tales como cinc, cobalto, o cobre; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, Pluronics, o PEG.
Las formulaciones de la presente invención pueden contener adicionalmente un tampón, aminoácido, agente para conferir volumen, y/o tensioactivo no iónico farmacéuticamente aceptable. Entre estos se incluyen, por ejemplo, tampones, agentes quelantes, antioxidantes, conservantes, co-disolventes, y similares; entre los ejemplos específicos de estos se podrían incluir sales de trimetilamina (tampón Tris) y edetato disódico.
Adicionalmente, se puede emplear la formulación de GH mostrada en el documento WO 89/09614, donde la variante de hGH está contenida en una composición que comprende glicina, manitol, y un tampón, tal como tampón fosfato. Una versión ilustrativa de esta formulación es: 0,68 g/litro de glicina, 18,0 g/litro de manitol, fosfato de sodio 5 mM, pH 7,4. Alternativamente, la variante de hGH puede estar contenida en una formulación líquida que no contiene necesariamente manitol o glicina y comprende de 0,1 al 5% (p/v) de un tensioactivo no iónico, tal como polisorbato, o un poloxámero. Una versión ilustrativa de esta formulación es: 5 mg/ml de variante de hGH, 8,77 mg/ml de NaCl, 2,5 mg/ml de fenol, 2,0 mg/ml de polisorbato 20, y citrato de sodio 10 mM, pH 6,0.
La variante de hGH también es administrada adecuadamente mediante sistemas de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de composiciones de liberación sostenida se incluyen matrices poliméricas semi-permeables en forma de artículos conformados, v.g., películas, o microcápsulas. Entre las matrices de liberación sostenida se incluyen polilactidas (Patente de los Estados Unidos Núm. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (U. Sidman et al, Biopolymers, 22, 547-556 [1983]), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981]; Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982]), vinilacetato de etileno (Langer et al, supra) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Entre las composiciones de variantes de hGH de liberación sostenida también se incluyen la variantes de hGH atrapadas liposomalmente. Los liposomas que contienen variantes de hGH se preparan mediante métodos conocidos per se; documento DE 3.218.121; Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); documentos EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324. Habitualmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms) en los cuales el contenido lipídico es mayor de aproximadamente 30 por ciento en moles de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la óptima terapia con la variante de hGH.
La variante de hGH también puede ser formulada para la administración local. Las formulaciones adecuadas varían dependiendo del sitio de la administración y no difieren de las conocidas en la técnica. Por ejemplo, la hGH puede ser formulada en una solución salina equilibrada para su administración al ojo.
La formulación de variante de hGH para la administración terapéutica es estéril. La esterilidad se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (v.g. membranas de 0,2 micras). Las composiciones de variantes de hGH terapéuticas se colocan generalmente en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial para solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica.
Las variantes de hGH se almacenan habitualmente en recipientes unitarios o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, en forma de solución acuosa o en forma de formulación liofilizada para su reconstitución. Como ejemplo de formulación liofilizada, se llenan viales de 5 ml con 2 ml de solución de variante de hGH acuosa filtrada para su esterilidad al 0,5% (p/v), y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara reconstituyendo la variante de hGH liofilizada utilizando agua bacteriostática para inyectables y similares.
La formulación de variantes de hGH pegiladas de la presente invención se lleva a cabo normalmente como se ha descrito antes para las variantes de hGH en general.
Usos Terapéuticos
En la presente invención se incluyen variantes que actúan como agonistas de hGH y variantes que actúan como antagonistas de hGH, conteniendo las últimas una mutación que interrumpe el Sitio 2. Las variantes de hGH agonísticas son útiles al aumentar el anabolismo o el crecimiento de un mamífero. El crecimiento hace referencia a la dinámica del crecimiento en estatura experimentado por un individuo durante la infancia, la niñez, y la adolescencia como se representa mediante una curva de crecimiento normal. Así, el crecimiento hace referencia en la presente memoria al crecimiento de la placa ósea productora lineal dirigido por los condrocitos, que se distingue del crecimiento de las células osteoblásticas, derivadas de una parte diferente del hueso. La restauración de los patrones de crecimiento normal permitirían al paciente alcanzar una curva de crecimiento más satisfactoria. Entre los ejemplos de los pacientes que son relativamente resistentes a GH pero requieren tratamiento para inducir un efecto anabólico se incluyen aquellos con el Síndrome de Turner, niños carentes de GH, niños que experimentan una ralentización o retraso en su curva de crecimiento normal aproximadamente 2-3 años antes de que su placa de crecimiento se cierre, esto es, los denominados niños normales bajos, y pacientes en los que la respuesta del factor de crecimiento I de tipo insulínico (IGF-I) a GH ha sido bloqueada químicamente (es decir, mediante tratamiento con glucocorticoides) o mediante una afección natural tal como en pacientes adultos en los que la respuesta de IGF-I a GH se ha reducido naturalmente.
Los trastornos inmunitarios también son susceptibles de tratamiento con variantes de hGH agonísticas de la presente invención. La expresión "trastorno inmunitario" incluye cualquier afección en la cual el sistema inmunitario de seres humanos así como de animales tiene una respuesta de anticuerpo a los antígenos menor de lo normal, ya sea debido a que el tamaño de su bazo es más pequeño de lo que debería ser, ya sea porque el bazo es sólo parcialmente funcional, ya sea porque fármacos tales como los agentes quimioterapéuticos están suprimiendo la función inmunitaria normal, ya sea porque el animal es deficiente en funcionalidad de IGF-I (o GH), o debido a cualquier otro factor. Entre los ejemplos se incluyen pacientes de edad avanzada, pacientes que sufren quimioterapia o terapia por radiación, que se recuperan de una enfermedad principal, o que están a punto de sufrir cirugía, pacientes con SIDA, pacientes con deficiencias de células B congénitas o adquiridas tales como hipogammaglobulinemia, agammaglobulinemia variada común, y deficiencias de inmunoglobulinas selectivas, v.g., deficiencia de IgA, pacientes infectados con un virus tal como el virus de la rabia con un tiempo de incubación más corto que la respuesta inmuniteria del paciente, y pacientes con trastornos hereditarios tales como el síndrome de diGeorge.
Una variante de hGH agonística puede actuar estimulando el sistema inmunitario de un mamífero intensificando su función inmunitaria, ya se deba el incremento a una mediación de anticuerpos o a una mediación celular, y ya sea el sistema inmunitario endógeno al anfitrión tratado con la variante de hGH o sea transplantado de un donante al anfitrión receptor al que se ha administrado la variante de hGH (como en los transplantes de médula ósea). Por ejemplo, la estimulación puede resultar de un número incrementado de células esplénicas tal como el número de linfocitos esplénicos, la cantidad de población de células T esplénicas (células T, CD_{4} y CD_{8}), o el número de células B esplénicas, o de un incremento en el número de timocitos. Entre otras células implicadas en la respuesta del sistema inmunitario se incluyen las células asesinas naturales, los macrófagos, y los neutrófilos. Además, la estimulación puede ser debida a un incremento en la producción de anticuerpos en respuesta a un imunógeno.
Las variantes de hGH agonísticas de la presente invención también pueden ser utilizadas para estimular la función cardíaca.
Las variantes de hGH antagónicas de la presente invención, tales como las variantes B2036, son útiles para tratar las afecciones en las que la inhibición de la acción de GH es deseable. Son particularmente susceptibles al tratamiento con variantes de hGH antagónicas las afecciones en las que una reducción de los niveles circulantes de GH o un mediador de la acción de GH, tal como IGF-I, proporciona un beneficio terapéutico. Entre tales afecciones se incluyen afecciones de exceso de GH, tales como por ejemplo, el gigantismo y la acromegalia. El gigantismo resulta de un exceso de GH antes de la pubertad, cuando todavía es posible el crecimiento de los huesos largos.
La acromegalia resulta de un exceso de GH después de la pubertad, cuando los huesos largos se han fusionado. La acromegalia se caracteriza por un sobrecrecimiento óseo e hinchazón de los tejidos blandos así como hipertrofia de los órganos internos, especialmente el corazón. La acromegalia está causada típicamente por un tumor en la pituitaria que secreta la GH. Los rasgos distintivos de la enfermedad son elevados niveles de GH e IGF-I circulantes. En la actualidad se cree que las variantes de hGH antagónicas de la presente invención ofrecen un beneficio terapéutico significativo al inhibir la acción de la GH.
Las variantes hGH antagónicas también son útiles en el tratamiento de otras afecciones en las cuales la inhibición de la acción de la GH proporciona un beneficio terapéutico. Entre los ejemplos se incluyen la diabetes y sus complicaciones, tales como por ejemplo la retinopatía diabética y la nefropatía diabética. La retinopatía diabética se caracteriza por la proliferación de las células que forman los vasos sanguíneos retinales, el crecimiento de nuevos vasos en la parte superior de la retina (neovascularización), desarrollo de microaneurismas, y derrame de fluido en el tejido retiniano circundante. Los primeros rasgos distintivos de la nefropatía diabética son la hipertrofia e hiperfiltración renal. A medida que la enfermedad progresa, se observa un alargamiento difuso de las células mesangiales (que soportan el aparato de filtración del riñón), acompañado de un absoluto incremento en el número de células mesangiales.
También se cree que las enfermedades oculares vasculares que, como la retinopatía diabética, implican una neovascularización proliferativa son suceptibles de tratamiento con variantes de hGH antagónicas. Entre los ejemplos se incluyen la retinopatía de los prematuros, la retinopatía asociada con la anemia falciforme, y la degeneración macular relacionada con la edad, que es la causa más común de pérdida de visión en personas de más de 55.
Entre otras afecciones en las cuales se cree actualmente que la reducción de los niveles de GH proporciona un beneficio terapéutico se incluyen las malignidades que responden a GH, o a un mediador de la acción de GH (tal como IGF-I), mediante el crecimiento (en adelante "malignidades sensibles a GH"). Entre los ejemplos de las malignidades sensibles a GH se incluyen el tumor de Wilm, diversos sarcomas (v.g., sarcoma osteogénico), y cáncer de mama, colon, próstata, y tiroides.
Las variantes de hGH antagónicas de la presente invención inhiben el crecimiento de células que expresan receptores a los cuales se unen las variantes. Una amplia variedad de tejidos expresan tales receptores. Por ejemplo, el ARNm del receptor de GH es expresado en líneas celulares de placenta, timo, cerebro, glándula salivar, próstata, médula ósea, músculo esquelético, tráquea, médula espinal, retina, nódulo linfático normales y linfoma de Burkitt, carcinoma colorrectal, carcinoma de pulmón, leucemia linfoblástica, y melanoma. Así, en la actualidad se cree que las variantes de hGH antagónicas de la presente invención son generalmente útiles en el tratamiento de cánceres que expresan receptores a los que se unen las variantes.
Para los diversos propósitos de esta invención, la variante de hGH agonística o antagónica se administra directamente al mamífero mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo parenteralmente, y puede ser administrada localmente o sistémicamente. La ruta de administración específica depende, v.g., de la historia médica del paciente, incluyendo cualquiera de los efectos secundarios observados o previstos al utilizar la variante de hGH. Entre los ejemplos de la administración parenteral se incluyen la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, e intraperitoneal.
La administración es mediante infusión continua (utilizando, v.g., minibombas tales como bombas osmóticas), o mediante inyección utilizando, v.g., medios intravenosos o subcutáneos. En una realización, la variante de hGH se administra subcutáneamente. La administración también puede ser en forma de bolo individual o mediante formulación de depósito de liberación lenta.
La composición de variante de hGH que se va a utilizar en la terapia se formula y dosifica de una manera coherente con la buena práctica médica, teniendo en cuenta la condición específica que esté siendo tratada, la condición clínica del paciente individual (especialmente los efectos secundarios del tratamiento con variante de hGH sola), el sitio de liberación de la composición de variante de hGH, el método de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad eficaz" de la variante de hGH para los propósitos de la presente (incluyendo una cantidad efectiva como antagonista para contrarrestar, v.g. la acromegalia) es determinada de este modo por medio de semejantes consideraciones.
Como proposición general, la cantidad farmacéuticamente eficaz total de la variante de hGH administrada parenteralmente por dosis está en el intervalo de aproximadamente 1 \mug/kg/día a aproximadamente 100 mg/kg/día de peso corporal del paciente, aunque, como se ha observado antes, está sujeta a discreción terapéutica. Normalmente, esta dosis está entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg/kg/día, y más normalmente para seres humanos entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1 mg/kg/día. Si se administra continuamente, la variante de hGH se administra típicamente a una velocidad de dosificación de aproximadamente 1 \mug/kg/hora a aproximadamente 50 \mug/kg/hora, ya sea mediante una a cuatro inyecciones por día o mediante infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, utilizando una minibomba. Asimismo se puede emplear una solución en bolsa intravenosa. El factor clave en la selección de la dosis apropiada es el resultado obtenido, medido para los agonistas, por ejemplo, mediante incrementos en el crecimiento de los huesos largos, la producción de anticuerpos, el número de esplenocitos o timocitos, y las células B esplénicas, y medido para los antagonistas, por ejemplo, mediante reducción de GH en suero, IGF-I en suero, y crecimiento tumoral, etc.
En general, una variante de hGH pegilada de la presente invención puede ser administrada mediante cualquiera de las rutas de administración descritas antes. Sin embargo, en la actualidad se cree que una variante de hGH pegilada no necesita ser administrada tan frecuentemente como una variante de hGH no pegilada. La hGH y las variantes de hGH no pegiladas son administradas típicamente al menos tres veces por semana a menudo diariamente. No obstante, las formas pegiladas de estas proteínas pueden ser administradas entre aproximadamente una vez cada tres días y aproximadamente una vez al mes, o más típicamente entre aproximadamente una vez cada 6-7 días a una vez cada dos semanas.
Entre los mamíferos potencialmente tratables por medio de las presentes variantes de hGH se incluyen mamíferos de importancia económica tales como animales bovinos, ovinos y porcinos. El mamífero preferido aquí es el ser humano.
Los siguiente se presenta a modo de ejemplo y no se considera una limitación del alcance de la invención. Los siguientes ejemplos, los Ejemplos IV y VI se incluyen únicamente con fines comparativos y no entran dentro del alcance de la invención.
Ejemplo I
Se evaluaron la cinética y la afinidad de unión para las sustituciones de alanina en 30 restos en contacto en el Sitio 1 de hGH. Se utilizó un dispositivo biosensor, denominado biosensor BIAcore®, que cuenta con la resonancia magnética de plasmón para medir los cambios en el índice de refracción tras la unión de la hormona a un receptor inmovilizado. En este ejemplo se encontró que esa afinidad estaba dominada por menos de un cuarto de las 31 cadenas laterales en contacto, y éstas se agrupaban en un pequeño parche cerca del centro del epítopo de contacto. Así, el "epítopo estructural" es considerablemente más grande que el "epítopo de unión funcional".
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Protocolo Experimental
Las mutaciones de alanina de los restos ocultos en el Sitio 1 en la hGH estaban disponibles a partir del trabajo descrito en Cunningham y Wells, supra, o recién elaboradas mediante mutagénesis dirigida al sitio. Kunkel et al, Methods Enzymol., 154: 367-382 (1987). Las proteínas variantes fueron producidas y purificadas como describen Cunningham y Wells, supra. Los rendimientos fueron mejorados prolongando la duración de las precipitaciones con sulfato de amonio a una hora.
El hGHbp (Wells y De Vos, supra) fue inmovilizado sobre el biosensor BIAcore® de Pharmacia y se utilizaron los cambios en el índice de refracción tras la unión de la hormona para las medidas cinéticas. Las constantes de asociación y disociación fueron calculadas utilizando el soporte lógico proporcionado con este aparato. Karlsson et al, J. Immunol. Methods, 145: 229-240 (1991). El hGHbp fue inmovilizado en orientaciones discretas sobre el chip del sensor fijando el hGHbp por medio de un tiol libre. Esto fue completado introduciendo un resto cisteína en uno de los dos sitios específicos (S201C o S237C) utilizando la mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel et al, supra). Las variantes tiólicas de hGHbp fueron expresadas en E. coli y purificadas hasta la homogeneidad. Fuh et al, J. Biol. Chem., 265: 3111-3115 (1990). Estas proteínas fueron acopladas a la superficie del chip activando la matriz de carboxilo-dextrano con N-etil-N'-(3-dietilaminopropil)carbodiimida (EDC) y haciéndola reaccionar con N-hidroxisuccinimida (NHS). El éster de NHS se hizo reaccionar con 2-(2-piridinilditio)-etanamina (PEDA). Los grupos éster de NHS que no habían reaccionado restantes fueron desplazados mediante la adición de etanolamina. Las variantes de hGHbp se hicieron reaccionar con la matriz (a 50 \mug/ml en acetato de sodio 50 mM, pH 4,5) hasta que se acoplaron aproximadamente 1000 RU (1,0 ng/mm^{2}; véase el manual de BIAcore®).
Se midieron las velocidades de asociación a partir de los perfiles de unión obtenidos inyectando concentraciones crecientes de cada variante de hGH. Se realizaron cinco diluciones seriadas (cada una a la mitad) partiendo de hormona 200 o 1.000 nM dependiendo de la afinidad hacia hGHbp. Se aplicó una velocidad de flujo máxima de 20 \mug/min para minimizar los efectos del transporte de masa potencial. Se utilizó tampón con alto contenido de sal (NaCl 150 mM, fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4) para evitar los efectos electrostáticos de gama amplia y para imitar la fuerza iónica fisiológica. También se incluyó Tween 20 al 0,02% para reducir la unión no específica. La matriz fue regenerada lavando durante 20 segundos con MgCl_{2} 4,5 M. Los experimentos de control mostraron que esto era suficiente para eliminar toda la hormona unida, y la matriz pudo ser reutilizada más de 50 veces sin un cambio significativo en la cinética de unión.
Se midieron las velocidades de disociación saturando el biosensor con un mutante de hGH 5 \muM y cambiando a tampón sin hormona. Las velocidades de flujo de tampón y las condiciones de regeneración fueron idénticas a las utilizadas para medir los perfiles de asociación. Los efectos de re-unión potencial fueron minimizados utilizando solamente los 10 minutos iniciales de cada perfil de disociación para el cálculo de la constante de disociación. Las constantes tanto de asociación como de disociación fueron determinadas utilizando el soporte lógico de Pharmacia Kinetics Evaluation para resolver las ecuaciones de la velocidad. Karlsson et al, supra.
La desviación típica media dentro de las determinaciones por triplicado de las constantes de disociación del mismo chip del biosensor fue del \pm4% del valor referido. Los valores determinados entre los diferentes chips del biosensor varían hasta un 60%. Sin embargo, debido a que la referencia de tipo salvaje siempre estaba incluida, los errores estándar para los valores relativos referidos aquí son los mismos que las determinaciones realizadas en el mismo chip. La concentración de hGH y las variantes fue determinada mediante densitometría de las proteínas teñidas con azul de Coomassie tras la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Este método confirma la pureza y la integridad de las variantes de la hormona así como proporciona una concentración de proteína independiente de la sustitución con una precisión de \pm 10%. Cunningham y Wells, supra. Así, los errores cumulativos medios en las constantes de asociación relativa, disociación, y afinidad son de aproximadamente el 17%, el 14%, y el 21%, respectivamente.
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Resultados
La unión de hGH a hGHbp fue estudiada inmovilizando una variante de hGHbp, (S237C)hGHbp [Ser237 es convertida en Cys en hGHbp] a la matriz transformada con tiol sobre el biosensor BIAcore® por medio de un enlace disulfuro mixto. Fig. 1A. La mutación S237(hGHbp) no afecta a la afinidad de unión a hGH y ha sido utilizada para anclar una única sonda fluorescente específica de tiol para seguir la dimerización inducida por hGH de hGHbp en solución. Cunningham et al, 1991, supra. Este anclaje aseguraba la orientación uniforme de hGHbp sobre la matriz a diferencia de la obtenida si se había utilizado el acoplamiento al azar a través de los grupos amino primarios. A partir del cambio en las unidades de resonancia del índice de refracción (RU) que se producían durante la reacción de acoplamiento, se calculó la cantidad de hGHbp anclado de las curvas de calibración suministradas por Pharmacia (véase el manual del biosensor BIAcore®).
Cuando se añadía hGH en exceso a la matriz (s237C)hGHbp, se observaba una rápida asociación y una disociación extremadamente lenta. Fig. 1B. A partir de los cambios en RU, se calculó una razón molar de 0,4 hGH unida por hGHbp inmovilizado. Véase la Tabla 1. Esto indicaba que hGH dimerizaba el hGHbp inmovilizado como lo hacía en solución. Fig. 1A. La dimerización de la matriz fue sometida a ensayo adicionalmente midiendo la unión a hGHbp de un mutante de hGH no dimerizado, (G120R)hGH, cuya capacidad para unirse al Sitio 2 está bloqueada. Fuh et al, 1992, supra. Cuando se añadía un nivel saturante de (G120R)hGH, se encontraba que se unía aproximadamente como mucho el doble de hormona (Fig. 1B), con una estequiometría calculada de 0,7 (G120R)hGH por hGHbp inmovilizado (Tabla 1).
El análisis de los perfiles de la velocidad de conexión y desconexión mostró que tanto el tipo salvaje como (G120R)gH se asocian a velocidades similares (Tabla 1). No obstante, la velocidad de desconexión para el tipo salvaje fue demasiado lenta para calcular una constante de disociación fiable. Estos datos son coherentes con el mecanismo de unión sucesiva propuesto; esto es, ambas hormonas se unían de la misma manera al primer receptor y por tanto tenían casi las mismas velocidades de asociación. No obstante, la hormona de tipo salvaje se unía al segundo receptor y por tanto era extremadamente lenta al disociarse.
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TABLA 1
Constantes cinéticas de unión de tipo salvaje o (G120R)hGH a (S237C)hGHbp o (S201C)hGHbp inmovilizado sobre la matriz tiólica del biosensor BIAcore®. Los perfiles de la velocidad de conexión y la velocidad de desconexión fueron medidos a 25ºC y analizados para hGH y (G120R)hGH; los errores medios estándar para la velocidad de conexión, la velocidad de desconexión, y las afinidades sobre el mismo chip del biosensor son del 17%, el 14%, y el 21% del valor referido. Las estequiometrías de la unión fueron calculadas a partir de los datos de las Figs. 1B y 2B según la siguiente fórmula:
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Se deseaba investigar con mayor detalle la unión de los mutantes en el epítopo de contacto del Sitio 1 solo sin la complicación del hGHbp formando dímeros sobre la matriz. Según la estructura de rayos X del complejo hGH(hGHbp)_{2} (De Vos et al, supra), los dos hGHbp contactan entre sí en la Ser201. Por lo tanto, la dimerización de la matriz era bloqueada remplazando Ser201 por Cys y anclando la variante S201C por medio de su único tiol a la matriz tiólica activada. Fig. 2A. Por supuesto, cuando se añadían niveles saturantes de hGH (Fig. 2B), se calculaba una estequiometría máxima de 0,84 hGH por (S201C)hGHbp inmovilizado (Tabla 1). La (G120R)hGH se unía con una estequiometría de 0,94 por (S201C)hGHbp. Mediante la colocación apropiada del acoplamiento con tiol, era posible orientar el hGHbp sobre la matriz para permitir o bien la formación de un complejo 1:1 o bien la formación de un complejo 1:2. Así, se pueden reproducir las propiedades de unión en solución de la hGH para el hGHbp en el biosensor BIAcore®. La (G120R) hGH tenía virtualmente la misma cinética que la hGH sobre la matriz con (S201C) hGHbp y la misma que (G120R)hGH sobre la matriz con (S237C)hGHbp (Tabla 1). Juntos estos datos indican que la matriz con (S201C)hGHbp es un método fiable de someter a ensayo la unión de las variantes de hGH al Sitio 1 solo.
Una cadena lateral oculta de hGH fue definida como aquella que contiene átomos de la cadena lateral cuya accesibilidad al disolvente cambia cuando está unida a hGHbp en el Sitio 1. Las accesibilidades al disolvente fueron calculadas haciendo rodar una sonda de radio de 1,4 Angstrom (Lee y Richards, J. Mol. Biol., 55: 379-400 [1971]) sobre la superficie de hGH cuando está libre o cuando está unida a un hGHbp a través del Sitio 1. Para estos cálculos se utilizó una serie coordinada de rayos X para el complejo hGH (hGHbp)_{2}. De Vos et al, supra. Mediante este criterio había 30 cadenas laterales, todas más grandes que la alanina, que estaban ocultas hasta cierto punto tras la formación del complejo. Tabla 2.
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TABLA 2
Velocidades de conexión, velocidades de desconexión y afinidades relativas para las sustituciones de alanina en los restos de hGH que están ocultos en diferentes grados en la interfase del Sitio 1. Las medidas de la velocidad se realizan utilizando la matriz con hGHbp(S201C) a 25ºC como se describe en la Tabla 1.
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^{1} El área de superficie accesible a una sonda de 1,4 \ring{A} fue calculada (Lee y Richards, supra) para cada cadena lateral de la hormona de tipo salvaje y para los átomos perdidos de tipo salvaje más allá del carbono \beta (para imitar al mutante de alanina) y para sus correspondientescomplejos con hGHbp utilizando coordenadas de rayos X. De Vos et al, supra. El cambio de área oculta atribuido a la mutación de alanina es la diferencia en el área accesible de (libre-unido)_{nl} - (libre-unido)_{Ala}. La única área utilizada era aquella oculta más allá del carbono \beta debido a que ésta es la porción de la cadena lateral separada tras la sustitución con alanina. Se muestran entre paréntesis el área de cada cadena lateral para los átomos más allá del carbono \beta en la hGH que se vuelven inaccesibles al disolvente una vez que se une el receptor.
^{2} Número total de contactos de Van der Waals es el número de átomos receptores en 4,4 \ring{A} de cualquier átomo más allá del carbono \beta de la cadena lateral en contacto basándose en la inspección del complejo hGH(hGHbp)_{2}. Más de 80% de las distancias de contacto son de 3,8 a 4,2 \ring{A}. Los grupos que forman puentes de hidrógeno (h) o puentes salinos (s) se determinan mediante pares de cargas donador-aceptor o complementarias en 3,3 \ring{A} de cada uno entre sí entre hGH y hGHbp. Por ejemplo, hN218 después de H18 indica un enlace de H entre el H18 de la hGH y el N218 del hGHbp. Mc indica un enlace de H para una cadena de amida principal.
^{3} El cambio relativo en la velocidad de desconexión fue calculado a partir de
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y
para 1/vel. conex. mediante 9
El cambio en la K_{d} del tipo salvaje fue calculado como:
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^{4} Los valores de \Delta\DeltaG fueron calculados como 11 a partir de los datos del biosensor BIAcore® o entre paréntesis a partir de los datos del radioinmunoanálisis que se ha referido previamente. Cunningham y Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3407-3411 (1991).
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La matriz (S201C)hGHbp fue utilizada para medir las afinidades para los mutantes de alanina en los 30 restos ocultos de la interfase del Sitio 1 (Tabla 2). Previamente se utilizó un análisis de radioinmunoprecipitación (RIA) para medir las constantes de unión para muchos de estos mutantes. Cunningham y Wells, 1989 y 1991, supra. Una curva del cambio de energía libre en relación con el tipo salvaje para los mutantes de alanina calculada mediante los datos del RIA versus los datos del biosensor BIAcore® muestra un íntima correlación (R^{2} = 0,94) con una unidad próxima a la pendiente y un corte próximo a cero. Fig. 3. Así, los datos de afinidad adquiridos de la matriz del biosensor concuerdan íntimamente con los medidos en la solución mediante RIA. Esto indica que la matriz no está causando artefactos de unión sistemáticos. El error medio estándar en la constante de afinidad es de aproximadamente 20% cuando se utiliza el biosensor BIAcore® versus aproximadamente el 30% para el RIA. También es posible que se produzca cierta dimerización de hGHbp en el RIA que conduciría a errores sistemáticos en las afinidades; esto se evita utilizando la matriz con (S201C)hGHbp.
De las 30 cadenas ocultas, sólo 7 (L45, P61, R64, K172, T175, F176, y R178) pueden representar aproximadamente 85% del cambio total en la energía libre de la unión resultante de las sustituciones de alanina. Otras seis (P48, E56, Q68, D171, I179, y R183) pueden representar esencialmente el resto (Tabla 2). Otras ocho cadenas ocultas (M14, H21, Q46, S62, N63, Y164, R167, y E186) no tienen esencialmente efecto sobre la afinidad global (causando cada una una reducción de la afinidad de menos de la mitad). Otras tres cadenas laterales ocultas (Q22, D26, y K168) tienen un efecto pequeño pero significativo sobre la afinidad de unión. Cinco cadenas (H18, F25, Q29, E65, y E174) impiden realmente la unión debido a que cuando se convierten en alanina, se intensifica la afinidad de 2 a 5 veces. La suma de las reducciones en la energía libre causada por las sustituciones de alanina (-14,2 kcal/ml) es comparable a la energía libre total de la unión entre hGH y hGHbp (-12,3 kcal/mol) medida mediante el biosensor BIAcore®.
De este modo, un mutante de hGH con cambios en H18, Q22, F2 5, D2 6, Q29, E65, K168, y E174 tiene una afinidad de unión hacia hGHbp incrementada. Se calcula que la variante con restos alanina en todas estas posiciones tiene una afinidad de unión aproximadamente 200 veces superior que la de la hGH de tipo salvaje basándose en la aditividad de los cambios de los aminoácidos individuales. Junto con los datos del presente Ejemplo II, se espera que un Asp en la posición 18 y/o una Ser en la posición 174 en esta combinación mutante también tenga una afinidad de unión significativamente superior hacia hGHbp que la hGH de tipo salvaje.
Los efectos de la velocidad de desconexión son muy superiores a los efectos de la velocidad de conexión (Tabla 2; Fig. 4). De este modo, los mismos siete restos que más afectan a la afinidad representan la mayor parte del incremento en la velocidad de desconexión (hasta 25 veces). La conversión de las tres cadenas laterales Arg (R64, R167, y R178) en Ala producía las mayores reducciones en la velocidad de conexión, pero sólo aproximadamente a la mitad. La conversión de dos cadenas laterales Glu (E65 y E174) en Ala también causaba los mayores incrementos en la velocidad de conexión (casi mejoraba el doble). Esto indica que las interacciones electrostáticas son los determinantes más importantes de la cadena lateral al guiar la hormona al receptor.
Las cadenas laterales que más afectan a la velocidad de conexión no son las mismas que las que más afectan a la velocidad de desconexión. Fig. 4. Por ejemplo, R167A ocasiona el mayor descenso en la velocidad de conexión pero conduce a un descenso compensatorio de la velocidad de desconexión. Muchas de las mutaciones de alanina en las cadenas laterales que dominan la afinidad (P61A, K172A, T17 5A, y F176A) no tienen virtualmente efecto sobre la velocidad de asociación. La combinación mutante preferida de estos experimentos, que tiene una afinidad de unión aproximadamente 200 veces mayor hacia el receptor de GH que la hGH de tipo salvaje, resultante de la aditividad de cada mutación, tiene la secuencia H18A, Q22A, F2 5A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A.
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Conclusión
Los datos indican que sólo un pequeño grupo de las cadenas ocultas en la interfase son funcionalmente cruciales en la unión. Sin estar limitado a ninguna teoría, se cree que esto no es un artefacto del método de análisis. Primero, se ha resuelto la estructura del complejo hGH.hGHbp y los restos ocultos en el Sitio 1 son virtualmente idénticos a los observados en el Sitio 1 para hGH en el complejo hGH(hGHbp)_{2}. De Vos et al, supra. Por tanto, el hecho de que el epítopo estructural sea mucho más pequeño que el epítopo funcional no se debe a la diferencias de contacto en la unión en el complejo 1:1 versus el 1:2 (que es el grupo coordinado utilizado para definir el epítopo de contacto).
Segundo, el análisis de la importancia funcional de cualquier cadena lateral mediante el estudio mutacional tiene la advertencia de que la proteína mutante puede exagerar el efecto imponiendo una alteración estructural o una interacción estérica, electrostática, o hidrofóbica inusual. Las reposiciones sistemáticas de las cadenas laterales por alanina son menos desorganizadoras para la estructura. Wells, Methods in Enzymol., 202: 390-411 (1991). La mutación de alanina es la más simple de interpretar debido a que elimina átomos sin introducir otros nuevos que puedan crear interacciones adicionales desfavorables o favorables. La suma de todos los efectos desorganizadores causados por las sustituciones de alanina (-14,3 kcal/mol) no exagera espectacularmente la energía libre de la unión total (-12,3 kcal/mol). Esto indica que los efectos están localizados para los determinantes de unión individuales y no cambian groseramente la estructura global de la proteína o el modo de unión. Dado el gran número de restos en contacto, también es poco probable que las sustituciones de alanina individuales cambien el modo de unión en el complejo, que es evidenciado por el número de sustituciones de alanina doble que tienen efectos aditivos sobre la unión, indicando que los sitios actúan independientemente.
Asimismo se identifican algunas mutaciones de alanina que afectan a la afinidad que están ocultas en la hormona y no se ocultan más cuando se une el receptor. Cunningham y Wells, 1989, supra. Por ejemplo, P5A, L6A, F10A, y V185A alteran cada uno la afinidad de 2 a 4 veces. Cada una de estas cadenas laterales establece contactos entre la hélice 1 y la hélice 4 que dominan el epítopo del Sitio 1 pero no están directamente implicadas en la unión. De un modo similar, F54 e I58 alteran la afinidad y están ocultos en la región bucle que sitúa la segunda mini-hélice. Esta mini-hélice contiene R64 y otros determinantes de la unión importantes. De este modo, algunos efectos minoritarios de la unión pueden resultar de perturbaciones estructurales que se propagan desde las mutaciones de alanina cerca pero no en el epítopo estructural. No obstante, la inmensa mayoría de los restos sometidos a ensayo lejos del epítopo estructural del Sitio 1 no tienen un efecto detectable sobre la unión cuando se convierten en alanina. Cunningham y Wells, 1989, supra.
Los datos de barrido con alanina muestran que sólo siete de las 30 cadenas laterales ocultas en la interfase representan aproximadamente 85% de la energía de unión. Virtualmente todo el resto puede estar representado por otras seis cadenas laterales. Se ha intentado correlacionar numerosos parámetros estructurales que pueden explicar por qué algunos restos son críticos para la unión y otros no. Se ha encontrado que los restos son importantes para unir la agrupación en una pequeña región cerca del centro del epítopo estructural (en su mayor parte hacia el extremo de la hélice 4). Los restos en contacto funcionalmente "nulos" tienden a estar cerca de la periferia, en el centro de la hélice 1 y al principio de la hélice 4. Esta es una región que es crítica para la unión de hGH al receptor hPRL (Cunningham y Wells, 1991, supra) y para formar un complejo de almacenamiento (Zn^{2+}.hGH)_{2}. Cunningham et al, Science, 253: 545-548 (1990). De este modo, si bien esta área tiene un pequeño papel aparente en la unión al receptor de hGH, tiene otras funciones importantes.
Otras correlaciones estructurales sistemáticas son más difíciles de realizar. Chothia y Janin, Nature, 256: 705-708 (1975) encontraron que un cambio en el área de la superficie oculta se correspondía generalmente con la energía libre de la asociación entre dos proteínas. El cambio en el área de superficie oculta que se produciría tras la formación del complejo para cada uno de los mutantes de alanina fue calculado a partir de la diferencia en la accesibilidad en los estados libre y unido entre hGH y el mutante de alanina. Tabla 2. No obstante, un gráfico del cambio en el área de superficie oculta tras la unión versus el cambio en la energía libre de la unión cuando la cadena lateral es convertida en alanina ocasiona una correlación muy escasa. Fig. 5A. En algunos casos se obtenían valores negativos para el cambio de accesibilidad. Esto se debe a que la cadena lateral que se pierde en el mutante de alanina crea una cavidad en la interfase, y por tanto más área de superficie estaría cubierta tras la formación del complejo. Asimismo se calculó el cambio de accesibilidad en la cadena lateral que se produce tras la unión para los átomos más allá del carbono beta que era el criterio para definir las cadenas laterales ocultas (véase valor entre paréntesis en la columna 2 de la Tabla 2). Ni siquiera un gráfico de estos valores versus el cambio en la energía libre ocasiona una mejor correlación. Un gráfico del número de contactos de van der Waals realizado por los átomos de hGH más allá del carbono beta versus el cambio en la afinidad cuando la cadena lateral es convertida en alanina (Fig. 5B) no muestra tampoco una buena correlación. Tampoco mejora
la correlación al considerar por separado las cadenas laterales que son susceptibles de interacciones electrostáticas.
Horton y Lewis, Protein Science, 1 169-181 (1992) fueron capaces de predecir las afinidades para 15 pares proteína-proteína diferentes utilizando un método semiempírico basado en el área de superficie oculta y la variación proporcional funcional de los parámetros de solvatación atómica (Eisenberg y McLachlan, Nature, 319: 199-203 [1986]) para las cadenas laterales en contacto. Por lo tanto, estos parámetros de solvatación atómica variados proporcionalmente fueron evaluados para ver lo bien que pueden predecir los cambios de energía libre resultantes de las sustituciones de alanina individuales. Había una pequeña correlación. De este modo, mientras el área de superficie oculta, el número de contactos de van der Waals, y los cálculos de solvatación atómica variados proporcionalmente son correlaciones útiles para la afinidad de unión general, son poco predictivas del papel de las cadenas laterales individuales en este epítopo.
Como media, la energía para las interacciones electrostáticas son considerablemente más débiles que las estimaciones realizadas a partir de la mutagénesis de los complejos enzima-sustrato. A partir del análisis mutacional de la tirosil-ARNt sintetasa, se estimó que la pérdida de energía libre para romper un par de enlaces de hidrógeno cargados es de 3,5-5 kcal/mol y para un par de enlaces de hidrógeno neutros es de 0,5-1,5 kcal/mol. Ferscht et al, Nature, 314: 235-238 (1985). Siete cadenas laterales de la hGH forman enlaces de hidrógeno con hGHbp (H18, Q46, S62, K168, E174, T175, y R178). Cinco de estos son enlaces de H cargados (Q46, K168, E174, T175, R178), con todo el cambio en la energía libre de unión cuando son convertidos en alanina es solamente de +0,1, -0,2, -0,9, +2,0, y +2,0 kcal/mol, respectivamente, dando un valor medio de +0,6 kcal/mol. El cambio en la afinidad para mutar las dos cadenas laterales con enlaces de H neutros (H18 y S62) es solamente de -0,5 y +0,1, respectivamente. Otras tres cadenas laterales forman puentes salinos con hGHbp (R64, R167, y D171), con todo estos ocasionan reducciones de solamente +1,6, +0,3, y +0,8 kcal/mol, respectivamente. Estos valores son menores que los estimados para dos puentes salinos diseñados en la subtilisina que oscilan entre +1,8 y +2,3 kcal/mol. Wells et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1219-1223 (1987). De este modo, la resistencia de los contactos varía ampliamente en la interfase hGH-hGHbp y las interacciones son considerablemente más débiles cuando se comparan con las de los sitios de unión de una molécula pequeña.
A partir de estudios mutacionales de los interiores de las proteínas se ha estimado que cada grupo metileno oculto contribuye de -1,0 a -1,5 kcal/mol a la energía libre global del plegamiento (para una revisión reciente ver Shortle, Cuart. Rev. Biophys., 25: 205-250 (1992), y las referencias de la misma). La conversión de numerosas cadenas laterales hidrófobas de hGH en alanina causaba efectos que eran mucho más débiles de lo que cabría esperar a partir de estos estudios. Por ejemplo, los mayores efectos observados para las mutaciones en las cadenas laterales hidrófobas son para L45A, K172A (sólo la porción alifática establece contacto con el receptor), F176A, e I179A, que ocasiona reducciones en la afinidad de +1,2, +2,0, +1,9, y +0,8 kcal/mol, respectivamente. Por otra parte, otros numerosos grupos hidrófobos que están más ocultos o comparablemente ocultos tras la formación del complejo (F26, Y42, Y164) casi no tienen efecto cuando son mutados a alanina.
En resumen, se ha descubierto un rasgo sorprendente del complejo hGH: receptor 1:2, es decir, que sólo un pequeño grupo de las cadenas laterales de hGH que están ocultas en el Sitio 1 afectan a la afinidad de unión cuando se convierten en alanina. Por tanto, el epítopo funcional definido por la mutagénesis de barrido con alanina es considerablemente más pequeño que el epítopo estructural definido por los restos ocultos o los contactos de van der Waals. Algunos restos que están cerca pero no en el epítopo del Sitio 1 pueden afectar modestamente a la afinidad de unión cuando se convierten en alanina, presumiblemente mediante efectos indirectos. Finalmente, la mayoría de las cadenas laterales funcionalmente importantes modulan la velocidad de desconexión, no la velocidad de conexión, de la hormona al receptor.
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Ejemplo II Propósito
Se deseaba examinar hasta qué grado se podía intensificar la afinidad del Sitio 1 de la hGH. Asimismo se deseaba determinar qué cadenas laterales de la hGH debían ser mutadas para intensificar la afinidad de unión - - aquellas que modulan la afinidad identificada por la mutagénesis de barrido con alanina, aquellas identificadas mediante cristalografía por hacer contacto, o ambas. Finalmente, si las mutaciones puede intensificar sustancialmente la afinidad, se deseaba aprender si lo hacían afectando a la velocidad de conexión o a la velocidad de desconexión de la hormona mutada.
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Resumen
Se produjeron variantes de afinidad muy elevada de hGH combinando los mutantes de afinidad intensificada de hGH que se clasificaban en cinco genotecas separadas en las cuales se presentaban monovalentemente un total de aproximadamente 10^{6} variantes de proteína sobre partículas de fagémidos. Los 20 restos diferentes del sitio de unión al Sitio 1 fueron mutados todos a la vez. Aunque sólo pequeños incrementos en la afinidad fueron aportados a partir de cada cadena lateral mutante, estos produjeron incrementos aditivos en la energía libre de la unión. Mediante este enfoque, se produjo una variante de hGH que tenía 15 sustituciones que se unían al receptor aproximadamente 400 veces más íntimamente que la hGH de tipo salvaje.
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Materiales y Métodos a) Procedimientos Generales
Se obtuvieron enzimas de restricción, polinucleótido quinasa, ADN polimerasa de T_{7}, y ADN ligasa de T_{4} de Gibco-BRL o New England Biolabs y se utilizaron según las directrices de los fabricantes. Se fosforilaron casetes de oligonucleótidos aleatorizadas, se recocieron, y se ligaron en constructos como describen Lowman et al supra, y Lowman y Wells, supra. Se adquirió enzima de la marca Sequenase® de United States Biochemical y se utilizó según las directrices del fabricante para la secuenciación de hebra sencilla. Sanger et al, supra.
Se construyeron algunos mutantes de hGH de sitio específico mediante mutagénesis dirigida al oligonucleótido, utilizando un molde de hebra sencilla. Kunkel et al, Methods Enzymol., 204: 125-139 (1991). El plásmido phGHam-g3, que codificaba la hGH de tipo salvaje fusionada al dominio carboxi-terminal del gen III de M13 (Lowman et al, supra), fue utilizado para construir vectores parentales para la mutagénesis de la casete. Se prepararon partículas de fagémidos que presentaban la hGH monovalente (Lowman y Wells, supra) mediante electrotransformación de células XL1-Blue de E. coli (Stratagene), y adición del fago coadyuvante M13K07. Vieira y Messing, supra.
Las moléculas de ADN que codificaban las hormonas solubles fueron expresadas en E. coli (Chang et al, supra), precipitadas con sulfato de amonio de los sobrenadantes de células sometidas a choque osmótico (Olson et al, Nature, 293: 408 [1981]), y cuantificadas mediante densitometría con láser de geles de SDS-PAGE con tinción de Coomassie. Cunningham et al, supra. Algunas variantes fueron purificadas adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico sobre una columna Mono-Q (Pharmacia-LKB Biotechnology, Inc.).
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(b) Preparación de genotecas de hGH-fagémidos
Para la mutagénesis de la Minihélice-1 (restos 41-46) de hGH, se destruyó el sitio AatII existente en phGHam-g3 utilizando el oligonucleótido Núm. 718 (5'-GCC ACC TGA TGT CTA AGA AAC-3') (SEQ ID NUM. 1). Se introdujeron sitios SfiI y AatII únicos en phGHam-g3 para crear pH0779, utilizando los oligonucleótidos Núm. 782 (5'-TTT GAA GAG GCC TAT ATG GCC AAG GAA CAG AAG-3') (SEQ ID NUM: 2) y Núm. 821 (5'-CAG AAC CCC CAT TGA CGT CCC TCT GTT TC-3') (SEQ ID NUM: 3), respectivamente. El último oligonucleótido también introducía un desplazamiento del marco +2 y un codón de terminación TGA tras el resto 49. Se construyó una casete aleatorizada a partir de los oligonucléotidos complementarios Núm. 822 (5'-TC CCG AAG GAG CAG NNS NNS TCG TTC NNS NNS AAC CCG CAG ACG T-3') (SEQ ID NUM: 4) y Núm. 823 (5'-CTG CGG GTT SNN SNN GAA CGA SNN SNN CTG CTC CTT CGG GAT AT-3') (SEQ ID NUM: 5). El ADN parental (pH0779) fue digerido con las enzimas de restricción SfiI y AatII, y el fragmento grande fue purificado y ligado con la casete. Los productos de la ligación fueron electro-transformados en células XL1-Blue para la preparación de fagémidos en dos alícuotas, rindiendo 1 x 10^{6} transformantes independientes cada uno, como describen Lowman y Wells, supra.
Para construir la genoteca de Bucles-A (restos 54-64) de hGH, el sitio AatII existente en phGHam-g3 fue destruido utilizando el oligonucleótido Núm. 718. Se introdujeron sitios de restricción AatII y BstEII únicos en el gen de hGH para construir pH0709, utilizando los oligonucleótidos Núm. 719 (5'-AAC CCC CAG ACG TCC CTC TGT-3') (SEQ ID NUM: 6) y Núm. 72 0 (5'-GAA ACA CAA CAG TAA AGG TAA CCT AGA GCT GCT-3') (SEQ ID NUM: 7). El último oligonucleótido también introducía un desplazamiento del marco +1 y un codón de terminación TAA tras el resto 69. Además, se destruyó el sitio EcoRI único utilizando el oligonucleótido Núm. 536 (5'-CGT CTT CAA GAG TTC AAC TTC TCC-3') (SEQ ID NUM: 8), para permitir la selección de la restricción frente a posibles clones contaminantes de genotecas previas (Lowman y Wells, supra). Se construyó una casete aleatorizada a partir de los oligonucléotidos complementarios Núm. 803 (5'-pCC CTC TGT NNS TCA NNS TCT NNS CCG ACA CCC AGT AAT NNS GAG GAA ACA CAA CAG AAG A-3') (SEQ ID NUM: 9) y Núm. 804 (5'-pGTT ACT CTT CTG TTG TGT TTC CTC SNN ATT ACT GGG TGT CGG SNN AGA SNN TGA SNN ACA GAG GGA CGT-3') (SEQ ID NUM: 10). El ADN parental (pH0709) fue digerido con las enzimas de restricción AatII y BstEII, y el fragmento grande fue purificado y ligado con la casete. Los productos de la ligación fueron electro-transformados en células XL1-Blue para la preparación de fagémidos en dos alícuotas, rindiendo 1,6 x 10^{6} y 1,0 x 10^{6} transformantes independientes.
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(c) Genotecas de hGH combinatorias a partir de reservas de genotecas de hGH-fagémidos
El ADN de las reservas de Hélice 1 y Hélice 4b (seleccionadas para 0, 2, o 4 rondas; Lowman et al, supra) fue purificado y digerido con las enzimas de restricción AccI y BstXI. El fragmento grande de cada reserva de la Hélice 1 (mutada al azar en F10, M14, H18, y H21) fue purificado después y ligado con el fragmento pequeño de cada reserva de la Hélice 4 (mutada al azar en R167, D171, T175, I179, en último término E174S,F176Y) para rendir las tres genotecas combinatorias 707A (reservas de la Hélice 1 y de la Hélice 4b no seleccionadas), 707B (reserva de la Hélice 1 seleccionada dos veces con la reserva de la Hélice 4b seleccionada dos veces), y 707C (reserva de la Hélice 1 seleccionada 4 veces con la reserva de la Hélice 4b seleccionada 4 veces). Las ligaciones por duplicado también fueron ajustadas con un décimo a un medio de ADN vector y designadas 707D, 707E, y 707F, correspondiendo a las genotecas de partida de 0, 2, y 4 rondas, respectivamente. Todas estas reservas de variantes también contenían las mutaciones E174S,F176Y obtenidas en las primeras selecciones de unión de hGH-fagémidos. Lowman et al, supra. Los productos de la ligación pH0707A-F fueron tratados y electro-transformados en células XL1-Blue. El número de transformantes independientes obtenidos de cada reserva, basados en las unidades formadoras de colonias (CFU), fue el siguiente: 2,4 x 10^{6} de pH0707A, 1,8x10^{6} de pH0707B, 1,6x10^{6} de pH07 07C, 8x10^{5} de pH0707D, 3x10^{5} de pH0707E, y 4x10^{5} de pH0707F. Las partículas de hGH-fagémido fueron preparadas y seleccionadas en cuanto a la unión a hGHbp a lo largo de 2 a 7 ciclos como describen Lowman et al, supra.
Se construyeron numerosas variantes de hGH combinando variantes aisladas de genotecas de la Hélice 1 y de la Hélice 4b. Las variantes parentales fueron las tres que se unían más íntimamente de cada genoteca: A = H10, G14, N18, N21; B = A10, W14, D18, N21; C = F10, S14, F18, L21; D = N167, S171, S174, Y176, T179; E = E167, S171, S174, I176, I179; F = N167, N171, S174, Y176, T179. El ADN del hGH-fagémido fue purificado y digerido con las enzimas de restricción EcoRI y BstXI. El fragmento grande de cada variante de Hélice 4b fue purificado y ligado después con el fragmento pequeño de cada variante de la Hélice 1 para rendir las variantes combinadas con mutaciones tanto en la Hélice 1 como en la Hélice 4b. Estas variantes fueron denominadas AD, AE, AF, BD, BE, BF, CD, CE, CF para indicar las respectivas combinaciones por pares de las mutaciones de la Hélice 1 (A, B, o C) y la Hélice 4b (D, E, o F).
Se utilizó una serie de cinco oligonucleótidos para invertir numerosas mutaciones derivadas de fagos en la variante BD al correspondiente resto de tipo salvaje: Núm. 7 97 (5'-CTG CGT GCT CAC CGT CTT CAC CAG TTG GCC TTT G-3') (SEQ ID NUM: 11) para D18H,N21H; Núm. 798 (5'-GTC AGC ACA TTC CTG CGC ACC-3') (SEQ ID NUM: 12) para Y176F; Núm. 799 (5'-CTC TCG CGG CTC TTC GAC AA CGG ATG CTG CGT GCT-3') (SEQ ID NUM: 13) para A10F,W14M; Núm. 800 (5'-TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG GTC AGC-3') (SEQ ID NUM: 14) para N167R, S171D; Núm. 801 (5'-CTG CGC ATC GTG CAG TGC-3') (SEQ ID NUM: 15) para T179I; Núm. 875 (5'-CTC TCG AGG CTC TTC GAC AAC GCG TGG-3') (SEQ ID NUM: 16) para A10F.
La variante de hGH 852d fue construida utilizando BD como molde y los siguientes oligonucleótidos: Núm. 843 (5'-CAG ACC TCC CTC TGT CCC TCA GAG TCT ATT CCG-3') SEQ ID NUM: 17) para añadir F54P; Núm. 844 (5'-ACA CCC TCC AAC AAG GAG GAA ACA CAA CAG-3') (SEQ ID NUM: 18) para R64K; Núm. 84 6 (5'-CCA AAG GAA CAG ATT CAT TCA TTC TGG TGG AAC CCC CAG ACC TCC-3') (SEQ ID NUM: 19) para K41I,Y42H,L45W,Q46W. La variante 852b fue construida utilizando los mismos oligonucleótidos con el phGHam-g3 molde.
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(d) Análisis de radioinmunoprecipitación
La afinidad de unión en equilibrio para hGHbp fue determinada analizando las variantes de hGH en competencia con hGH marcada con I^{125}, la variante BD marcada, o la variante 852d marcada, en tampón de unión: Tris 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, seralbúmina bovina al 0,1%, azida de sodio al 0,02%. Lowman et al, J. Biol. Chem., 266: 10982-10988 (1991). La inmunoprecipitación del complejo hGH-hGHbp se llevó a cabo utilizando un anticuerpo monoclonal denominado MAb5. Barnard et al, Endocrinology, 115: 1805-1813 (1984). Se obtuvieron las constantes de disociación mediante análisis de Scatchard. Cunningham y Wells, 1989, supra. Las variantes BD y 852d contienen F176Y, que si se yodara podría perturbar la interfase hormona-receptor. No obstante, la BD yodada (frío) no era distinguible de BD no marcada en la competencia con BD-I^{125} por la unión.
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(e) Análisis cinéticos
Se obtuvieron las constantes de la velocidad de conexión y desconexión para las variantes de hGH que se unían a hGHbp inmovilizado mediante la medida de la resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando un biosensor BIAcore® de Pharmacia. En este sistema, hGHbp es acoplado covalentemente a una matriz de dextrano anclada a un chip biosensor. La hormona es mantenida a concentración constante en una fase líquida que pasa sobre esta superficie a una velocidad de flujo constante. El aparato mide la masa de proteína que se une a la matriz en tiempo real percibiendo el cambio en la señal de SPR debido al cambio del índice de refracción cerca de la superficie del biosensor. Lofás y Johnsson, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 21: 1526-1528 (1990).
Se utilizó una variante de hGHbp(S201C) como especie inmovilizada debido a que la unión de un segundo receptor sobre la matriz era bloqueada (véase el Ejemplo I). La hGHbp(S201C) fue reducida y acoplada al chip biosensor por medio de la activación EDC/NHS de la capa de dextrano y la química del hidrocloruro de 2-(2-piridinilditio)etanamina (PDEA) (tiol activado) a un nivel de 1.000-2.000 RU, utilizando acetato de sodio 10 mM (pH 5,0); los reactivos y procedimientos fueron obtenidos de Pharmacia Biosensor. Las etapas de unión y elución fueron llevadas a cabo a una velocidad de flujo de 3-20 \mul/min en tampón PBS (pH 7,4) conteniendo Tween-20 al 0,05%.
La densidad de hGHbp acoplado a la matriz afecta a los valores de K_{conex} y K_{desconex} absolutos pero no relativos hasta dos veces los de la hGH de tipo salvaje. De este modo, cuando se utilizaban diferentes chips biosensores se determinaron los parámetros cinéticos para la hGH de tipo salvaje de manera que éstos pudieran ser normalizados para comparar diferentes mutantes cuyos parámetros cinéticos pueden haber sido medidos en diferentes chips biosensores. Los valores cinéticos relativos así obtenidos fueron coherentes sobre diferentes células de flujo, y las medidas de afinidad calculadas se correspondieron bien con los resultados del análisis de radio-inmunoprecipitación. Las constantes de la velocidad de disociación fueron obtenidas trazando ln(R_{0}/R_{t}) vs t; las constantes de la velocidad de asociación fueron obtenidas trazando [Pendiente de (dR_{t}/dt) vs. R_{t}] frente a la concentración de hormona (Karlsson et al, supra), o trazando ln(dR_{t}/dt) frente a la concentración de hormona utilizando el soporte lógico de evaluación cinética con biosensor BIAcore® (Pharmacia Biosensor). Las constantes de disociación en equilibrio, K_{d}, fueron calculadas como k_{desconex}/k_{conex}. Las desviaciones típicas,\sigma_{conex} para k_{conex} y \sigma_{desconex} para k_{desconex}, fueron obtenidas a partir de las medidas con 2 o más series de diluciones a la mitad o a la tercera parte (k_{conex}) o con 2 o más muestras de hormona concentradas (\geq5 \muM) (k_{desconex}). Los errores resultantes (\varepsilon[K]) en las K_{d} calculadas fueron estimados según las siguientes fórmulas utilizando la derivada total de K = f (k_{conex}, K_{desconex}): (para un estudio, véase Bevington, supra)
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Resultados (a) Restos en el epítopo funcional de la unión hGH-receptor
El análisis estructural del complejo hGH(hGHbp)_{2} (de Vos et al, supra) identificó más de 30 cadenas laterales en el Sitio 1 de hGH que experimentaban cierto grado de enterramiento cuando se une el primer receptor (Fig. 6B). Aunque la mayoría de estos fueron sometidos a ensayo como mutantes de alanina antes de la elucidación estructural (Cunningham y Wells, 1989, supra; 1991, supra), no se evaluaron cuatro restos (K41, Y42, L45 y Q46) de la primera minihélice (Minihélice 1). Por lo tanto, estos restos fueron convertidos individualmente en alanina y los efectos sobre la afinidad de unión fueron medidos o bien mediante desplazamiento competitivo con hGH-[I^{125}] e inmunoprecipitación (Cunningham y Wells, 1989, supra) o utilizando el biosensor BIAcore® de Pharmacia. Ambos métodos produjeron medidas de afinidad comparables, como se muestra en el Ejemplo I.
Las cadenas laterales de Y42 y Q46 se ocultaron tras la unión al receptor, con todo las reposiciones de alanina causaron una reducción en la afinidad de menos de la mitad (Tabla 3). Leu 45 establece menos contactos con el receptor que Y42 o Q4 6, con todo el mutante L45A ocasiona una reducción de la afinidad de 10 veces. Lys41 establece un puente salino con la Glu127 del receptor. El ADN que codifica el mutante K41A no se expresó suficientemente bien para obtener el material para la medida de la afinidad; sin embargo, el ADN que codifica una variante más conservativa, K41Q, se expresó suficientemente bien. Esta variante tenía una afinidad 2,6 veces inferior que la hGH de tipo salvaje. De este modo, la región de la Minihélice 1 es claramente parte del epítopo funcional en el Sitio 1 de hGH (Fig. 6A). Con estos datos y los del Ejemplo I, se han medido los efectos para al menos una reposición (en su mayor parte alaninas) en los restos cuyas cadenas laterales quedaban ocultas cuando el primer receptor se unía al Sitio 1.
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TABLA 3
Afinidades de unión al receptor de los mutantes de alanina de hGH en un fondo de tipo salvaje, medidas mediante BIAcore® (*) o mediante RIA (no marcado) y normalizadas con respecto al valor de RIA para hGH de tipo salvaje medido por Cunningham et al, 1989, supra. Las mutaciones con alanina o glutamina fueron realizadas para someter a ensayo las contribuciones de las cadenas laterales en la región de la Minihélice 1 de la hGH de tipo salvaje. Como comparación con el epítopo estructural, también se muestra el número de contactos de van der Waals con el receptor, derivado de la estructura cristalina del complejo hGH(hGHbp)_{2}.
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(b) Diseño y análisis de genotecas de mutantes al azar
Se clasificaron cinco genotecas separadas en las cuales se habían aleatorizado cuatro restos dentro del epítopo estructural y/o funcional del Sitio 1 (Fig. 7). Restringiendo cada genoteca a 4 codones al azar se permitió el muestreo de la mayor parte de las posibles variantes (aproximadamente 2x10^{5} secuencias de proteínas generadas a partir de aproximadamente 1x10^{6} secuencias de ADN) dentro de los límites del tamaño de la genoteca (media de aproximadamente 1x 10^{7} transformantes independientes).
Previamente, se produjo una genoteca (denominada Hélice 4a) en la cual los restos K172, E174, F176 y R178 fueron aleatorizados y presentados sobre partículas de fagémidos monovalentes. Lowman et al, Biochemistry, supra. Tras 3 ciclos de selección de la unión, el mutante que se unía más fuertemente (E174S, F176Y) tenía una afinidad aproximadamente 5 veces superior que la hGH de tipo salvaje. Estos dos mutantes fueron fijados en una segunda genoteca (denominada Hélice 4b) en la cual R167, D171, T175, e I179 eran mutados al azar en un fondo de E174S, F176Y. Después de 6 rondas de selección se aisló un pentamutante (R167D, D171S, E174S, F176Y, I179T) que se unía aproximadamente 8 veces más fuerte que la hGH de tipo salvaje. En una genoteca separada (denominada Hélice 1) se mutaron al azar los restos F10, M14, H18 y H21. Después de dos rondas de selección se aisló un tetramutante (F10A,M14W, H18D, H21N) que se unía 3 veces más fuerte que la hGH de tipo salvaje.
Aquí, los estudios de selección de fagos se ampliaron a las hélices que conectan los bucles 1 y 2. Los cuatro restos en contacto en la Minihélice 1 (K41, Y42, L45 y Q46) fueron aleatorizados y los clones representativos fueron secuenciados después de 2 a 7 rondas de selección de la unión (Tabla 4). Algunos restos estaban altamente sobre-representados en las posiciones dadas en comparación con lo que se esperaba a partir de la frecuencia de esos restos en la genoteca de partida. Por ejemplo, aproximadamente el 35% de los clones contenían una mutación Q46W. Esto estaba 7,6 unidades de desviación típica por encima de la aparición casual al azar para Trp en la genoteca. Este es un buen modo de puntuar la reserva de "seleccionantes" para establecer una secuencia consenso debido a que representa la predisposición al codón esperado y la estadística de muestreo. Por medio de estos criterios hubo una leve preferencia por K41R, una ligera preferencia por Y42R o Y42Q, una fuerte preferencia por L45W o L45 y una preferencia más fuerte por Q46W.
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TABLA 4
Restos consenso identificados tras la clasificación de genotecas de hGH-fagémidos. Se muestran los restos de más frecuente aparición de las genotecas presentadas en fagos, basadas en la representación fraccionaria (P_{f}) entre todos los clones secuenciados después de 2 a 7 rondas de selección de la unión. Las frecuencias esperadas (P_{c}) fueron calculadas a partir del número de codones NNS para cada aminoácido teóricamente en la genoteca de partida. Las desviaciones típicas (\sigma_{n}) fueron calculadas como \sigma_{n} = [P_{c}(1-P_{c})/n]^{1n}. Sólo se muestran los restos para los cuales la fracción encontrada excedía la fracción esperada en al menos 2\sigma_{n} (es decir, [(P_{f}-P_{c})/\sigma_{n}] \geq 2). Para la genoteca de la Minihélice 1, n = 17 secuencias; genoteca de Bucle A, n = 26; Genoteca combinatoria (Hélice 1), n = 68; Genoteca combinatoria (Hélice 4b), n = 56.
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Se construyó una segunda genoteca (denominada Bucle A) en la cual F54, E56, I58 y R64 fueron mutados al azar. Las reposiciones con alanina ocasionaron una reducción de la afinidad de 4 a 20 veces dependiendo de la cadena lateral (Fig. 6A). A pesar del hecho de que R64 es el único de estos restos que establece contacto directo con el receptor (Fig. 6B), todas las posiciones mostraron una preferencia de moderada a muy fuerte por un resto concreto que era normalmente diferente del de tipo salvaje. R64K fue el más preferido (encontrado en el 81% de los clones); se sabe que R64K sólo causa una mejora de \sim3 veces en la afinidad de unión. Cunningham et al, Science, 247: 1461-1465 (1990). Después de esto el orden de preferencia fue F54P > I58T > E56D o E56W.
Las afinidades de unión para muchos de estos mutantes fueron analizadas expresando la hormona libre en un anfitrión no supresor que termina la traducción en el codón ámbar al final de la hGH y al principio del dominio del gen III. Lowman et al, Biochemistry, supra. Virtualmente, cada clon sometido a ensayo, entre 3 y 7 rondas de selección de la unión a partir de la genoteca de la Minihélice 1, tuvo afinidades mayores que la hGH de tipo salvaje (Tabla 5). El mejor fue K41I, Y42H, L45W, Q46W, que había mejorado 4,5 veces la afinidad sobre la hGH de tipo salvaje. Se espera que esta secuencia de ADN se produzca al azar a una frecuencia de uno en un millón de clones, lo que demuestra el poder de la selección de afinidad. Se obtuvieron resultados similares a partir de la genoteca del Bucle A siendo los mejores productos aislados F54P, R64K y F54P, E56D, I58T, R64K, que han mejorado aproximadamente 5 veces sobre la hGH de tipo salvaje.
TABLA 5
Datos de unión para clones de hGH individuales mutados en (A) la Minihélice 1 o (B) el Bucle A. Las constantes de afinidad fueron medidas mediante unión competitiva a hGHbp versus hGH marcada con I^{125}. La afinidad de la hGH de tipo salvaje es la de Cunningham y Wells, 1989, supra. Las veces que se incrementaba la afinidad sobre la de hGH para unirse a hGHbp se muestra como la proporción de K_{d}(hGH)/K_{d}(Mutante). Algunos clones no fueron analizados (ND). Se supusieron afinidades idénticas para variantes equivalentes (^{\dagger}). Se indican los clones con mutaciones (E65V^{\ddagger}; S57Y^{1}; N47Y^{q}; P48S*) espúreas.
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(c) Mejora de la afinidad utilizando principios de aditividad
Según los principios de aditividad, las mutaciones en las partes que no interaccionan de una proteína deben combinarse para producir simples cambios aditivos en la energía libre de la unión (Wells, 1990, supra). Por lo tanto, se pretendía mejorar la unión de hGH a través del Sitio 1 combinando las sustituciones aisladas de genotecas de presentación en fagos (Fig. 7). Las tres variantes de unión más fuertes de hGH de la genoteca de la Hélice 1 (A = F10H, M14G, H18N, H21N, B = F10A, M14W, H18D, H21N, y C = M14S, H18F, H21L) fueron ensambladas a cada una de las tres variantes de unión más fuertes encontradas en la genoteca de la Hélice 4b (D = R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T, E = R167E, D171S, E174S, F176Y, y F = R167N, D171N, E174S, F176Y, I179T). Todos los constructos fueron obtenidos en rendimientos que se aproximaban al de la hGH de tipo salvaje excepto para aquellas que contenían la variante A. La variante A y los recombinantes AD, AE, AF migraron en forma de dímeros (PM aproximadamente 44 kDa) en SDS-PAGE no reductor y en forma de monómeros (PM aproximadamente 22 kDa) cuando se reducían. Aunque estas proteínas no contenían un resto Cys adicional, se podía producir el intercambio de disulfuro si formaban primero dímeros no covalentes. De hecho, hGH es conocida por formar un complejo dimérico débil que implica restos en las hélices 1 y 4. Cunningham et al, Science, 253, 1991, supra. Sin embargo, debido a que estas proteínas formaban dímeros de disulfuro no prosiguieron adicionalmente. La variante C también es producida predominantemente en forma de dímero de disulfuro; no obstante, los recombinantes CD, CE, CF no formaron una cantidad significativa de dímero.
Todos los recombinantes analizados mostraron aumentos significativos en la afinidad sobre los componentes parenterales (Tabla 6). La variante BD tuvo la mayor afinidad, que fue 30 veces más fuerte que la del hGH de tipo salvaje. La variante de unión más fuerte de la genoteca de la Minihélice 1 (K41I, Y42H, L45W, Q46W) y una de las más fuertes de la genoteca del Bucle A (F54P, R64K) fueron combinadas para producir el hexamutante, hGH 852b, cuya afinidad fue aproximadamente 40 veces más fuerte que la de la hGH de tipo salvaje. Esta se colocó junto con la BD recombinante para rendir la variante de hGH, 852d, que se une aproximadamente 400 veces más fuerte que la hGH de tipo salvaje. Suponiendo una aditividad simple, se esperaba que esta variante se uniría aproximadamente 600 veces más fuerte que la hGH del producto de las mejoras de afinidad por los componentes individuales; este valor calculado está razonablemente próximo al resultado. La variante 852d conservaba como tipo salvaje solo cinco de los 20 restos aleatorizados (E56, I58, K172, T175, R178).
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TABLA 6
Constantes de unión en equilibrio de las variantes de hGH recombinadas. Las constantes de unión fueron medidas mediante desplazamiento competitivo de hGH de tipo salvaje marcada con I^{125}, BD, o 852d, utilizando hGHbp y MAb5 (Cunningham y Wells, 1989, supra). Las veces que se incrementaba la afinidad de unión se expresan como K_{d}(hGH)/K_{d}(variante). Algunas afinidades (^{\dagger}) son las de Lowman et al, Biochemistry, supra. Las variantes de la hélice 1 son B = (F10A, M14W, H18D, H21N), y C = (M14S, H18F, H21L). Las variantes de la Hélice 4 son D = (R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T), E = (R167E, D171S, E174S, F176Y), Y F = (R167N, D171N, E174S, F176Y, I179T). BD, BF, CD, CE, CF representan combinaciones de estas mutaciones. 852b = (K41I, Y42H, L45W, Q46WF54P, R64K), y 852d = BD + 852b.
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(d) Genotecas combinatorias de hGH
A pesar de la simple aditividad encontrada en los mutantes por combinación de las genotecas clasificadas independientemente, se ha observado la aditividad del complejo para algunas sustituciones próximas (v.g., F176Y que interacciona con E174S). Lowman et al, Biochemistry, supra. Algunas cadenas laterales mutadas a partir de la hélice 1 (F10, M14, H18, H21) pueden establecer contacto potencialmente con aquellas mutadas en la hélice 4 (R167, D171, T175, e I179). Por lo tanto, se ha investigado un enfoque combinatorio para los mutantes de la clasificación derivados de las genotecas de la Hélice 1 y de la Hélice 4b (Huse et al, Science, 246: 1275-1281 [1989]; Clackson et al, Nature, 352: 624-628 [1991]). Se llevaron a cabo selecciones de unión independientes sobre las genotecas de la Hélice 1 y de la Hélice 4b para 0, 2, o 4 ciclos. El ADN de la reserva de la Hélice 1 fue ligado con el ADN del genoteca de la Hélice 4b que se había clasificado en cuanto a la unión a hGHbp durante el mismo número de rondas. Las tres genotecas combinatorias fueron clasificadas después 2 a 7 ciclos más y se secuenciaron 68 clones representativos (Tabla 7).
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TABLA 7
Variantes de hGH de la selección de unión hormona-fagémido de las genotecas combinatorias. Todas las variantes contienen (E174S,F176Y), excepto aquellas con la secuencia de la Hélice 4 de tipo salvaje (-), que no eran recombinantes. Los genotecas 707A, 707B y 707E, o 707C fueron clasificadas durante 2 a 7 ciclos para la unión a hGHbp (véase el texto). Los números citados en P indican la aparición fraccionaria entre los clones secuenciados. Los números citados en Núm. designan cada producto aislado independiente (v.g., pH0714A.1 es la primera secuencia). Algunas afinidades son las de Lowman et al, Biochemistry., supra; se supone que las variantes equivalentes tienen afinidades idénticas (^{\dagger}). Numerosas variantes aparecían como >10% de dímeros de disulfuro (^{\ddagger}). Un clon contenía un codón ámbar (TAG = Gln en las cepas SupE), el codón (^{\NAK}), uno contenía una mutación espuria, E174N (^{q}), y uno (º) contenía dos mutaciones espurias (L15R, K168R). Algunas variantes no fueron expresadas (NE) o no fueron analizadas (ND).
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Sobretodo, las variantes de afinidad más elevada aisladas de cualquiera de estas tres clases combinatorias se asemejaban a las aisladas previamente mediante la clasificación independiente de las genotecas de la Hélice 1 y la Hélice 4b. Lowman et al, Biochemistry., supra. Por ejemplo, los mutantes de afinidad más elevada aislados previamente de la genoteca de la Hélice 1 fueron F10A, M14W ,H18D, H21N (Hélice 1.B) y F10H, M14G, H18N, H21N (Hélice 1.A); estos se unían aproximadamente 3,3 veces y 2,4 veces más fuerte que la hGH de tipo salvaje, respectivamente. La secuencia de la Hélice 1.A fue recuperada en 60% de los clones de la Genoteca Combinatoria A, y en 13% de los clones aislados en las primeras rondas de clasificación de la Genoteca Combinatoria B. La secuencia de la Hélice 1.B predominaba en las ultimas rondas de clasificación del Genoteca Combinatorio B. La mayor parte de estos eran clones independientes (no hermanos o contaminantes), debido a que tenían diferentes secuencias de ADN y normalmente diferían en los mutantes seleccionados en la hélice 4.
Se obtuvieron resultados similares con los seleccionantes de la hélice 4. Cuando la genoteca de la Hélice 4b se clasificaba independientemente, se obtenían numerosas secuencias que contenían R167N, D171S o N, T175 (conservada), e I179T. Lowman et al, Biochemistry, supra. Estos eran los mismos restos que tendían a ser seleccionados en los Genotecas Combinatorias A, B y C. De hecho, uno de los mejores mutantes aislados previamente (R167N,D171S,T175,I179T) fue aislado comúnmente mediante clasificación combinatoria y predominó especialmente en las últimas rondas.
Algunas secuencias clasificadas mediante métodos combinatorios fueron muy diferentes de la seleccionada de las dos genotecas independientes; pero esto se podía producir por razones estadísticas. Por ejemplo, las genotecas de la Hélice 1 y de la Hélice 4b contienen aproximadamente 10^{6} secuencias de ADN diferentes, y si se combinan (sin pre-selección) podrían contener 10^{12} combinaciones posibles. Las eficacias de transformación limitan el tamaño del muestreo a menos de o igual a -10^{7} clones independientes. De este modo, la selección de las mismas secuencias es notable dada la elevada diversidad de secuencias posibles en estas genotecas y las ligeras mejoras de afinidad que se están seleccionando.
Se midieron las afinidades para varios de estos productos aislados (Tabla 7). Todos tuvieron una afinidad de unión mejorada (2 a 29 veces) en comparación con la hGH de tipo salvaje. La mayoría experimentó mejora sobre E174S,F176Y, que estaba presente en todos los clones de partida, e independientemente ocasionó un incremento de 5, 6 veces en la afinidad sobre la de la hGH de tipo salvaje. Lowman et al, Biochemistry., supra. Las variantes de afinidad más elevada fueron aisladas generalmente de las últimas rondas de clasificación y fueron muy abundantes en esas reservas. Por ejemplo, el mutante de más alta afinidad sometido a ensayo fue el clon 717B.1, que fue aislado después de siete rondas de clasificación de la Genoteca Combinatoria B. Este producto aislado representó un tercio de los clones de esa reserva. Notablemente, este clon es idéntico a la variante BD (Tabla 6), excepto que en lugar de D172S contenía la sustitución conservativa, D171A. No sorprendentemente, las variantes 717B.1 y BD se unieron con afinidades comparables (12 pM y 10 pM, respectivamente). Estos datos indican que las estrategias combinatoria y aditiva rinden soluciones comparables para la optimización exitosa de la afinidad.
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(e) Ensayo de la importancia de las cadenas laterales individuales en la maduración de la por afinidad
La contribución de algunos de los restos mejorados por el fago a la afinidad de unión fue evaluada introduciéndolos en la hGH de tipo salvaje, o convirtiéndolos de nuevo en el resto de tipo salvaje en la variante BD madurada por afinidad (Tabla 8). La variante K41I, Y42H, L45W, Q46W se unía 4,5 veces más fuerte que la hGH de tipo salvaje. Cada uno de los mutantes individuales en la hGH ocasionó reducciones de 1,7 a 2,5 veces en la afinidad. Esto indica que la combinación de mutaciones en este sitio es crítica para las mejoras de la afinidad. Estos restos descansan en posiciones adyacentes sobre una cara de la minihélice 1.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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TABLA 8
Ensayo de las contribuciones de las cadenas laterales individuales identificadas mediante presentación en fagos. Se midieron las afinidades de unión al receptor de las variantes mediante BIAcore® (*) o mediante RIA (no marcado) y se normalizaron al valor del RIA para hGH como determinaron Cunningham y Wells, 1989, supra. Se realizaron mutaciones puntuales para someter a ensayo las contribuciones de las cadenas laterales individuales encontradas tras la clasificación de fagos. Las veces que disminuye la afinidad se expresa como K_{d}(revertiente)/K_{d} (parental), donde parental es el fondo utilizado para la mutagénesis.
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Las mejoras en la afinidad causadas por las sustituciones en la variante BD fueron sometidas a ensayo haciéndolas mutar de nuevo al resto del tipo salvaje ya sea individualmente o por pares (cuando los restos eran adyacentes) (Tabla 8). Esto demostró que siete de las nueve sustituciones contribuyen sólo sutilmente a las mejoras en la unión (1,1 a 1,7 veces). Incluso el efecto más dominante, F176Y, confiere una mejora de sólo 4,6 veces en la unión. Sin embargo, el producto de estos efectos en el octamutante, F10A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171S, F176Y, I179T, pronosticó un aumento de 16 veces en la afinidad versus la hGH de tipo salvaje. Esto se compara con la intensificación de 34 veces medida para la variante BD que contiene además E174S.
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(f) Efectos de la maduración por afinidad sobre la cinética de unión
En el Ejemplo I, se utilizó el dispositivo biosensor BIAcore® para medir la cinética de unión para los mutantes de alanina producidos en restos de la hGH que quedaban ocultos en el Sitio 1 tras la unión al receptor. Para una mejor comprensión de la base molecular para las mejoras de la afinidad seleccionadas aquí, se utilizó el biosensor BIAcore® para medir su cinética de unión a hGHbp (Tabla 9). En general, a medida que la afinidad de la hGH de tipo salvaje incrementaba, la velocidad de desconexión disminuía con un pequeño cambio en la velocidad de conexión. De hecho, al ir desde el tipo salvaje al mutante de afinidad más elevada, 852d, había un descenso de > 60 veces en la velocidad de desconexión y sólo un incremento de 4 veces en la velocidad de conexión. (La velocidad de desconexión era demasiado lenta para medirla exactamente, pero si se calculaba a partir de la K_{d} medida mediante el RIA y la velocidad de conexión, la velocidad de desconexión sería 100 veces más lenta que la de la hGH de tipo salvaje). El sitio de unión de la hGH había sido reclutado previamente en un homólogo de la hGH, el lactógeno placentario humano (hPL). Este difiere en la secuencia en un 15% de la hGH y se une \sim2.000 veces más débilmente. Lowman et al, J. Biol. Chem., supra. La variante de hPL reclutada tiene parámetros cinéticos para la unión que son similares a los de la hGH (Tabla 9). Como la variante de hGH madurada por afinidad, este mutante muestra mejoras en la velocidad de desconexión mucho mayores (\sim100 veces) en comparación con la velocidad de conexión (aproximadamente 10 veces) en relación con el hPL de tipo salvaje. El hecho de que la velocidad de desconexión resulte muy afectada entre los seleccionantes del fago indica que la clasificación se realizó en condiciones que se aproximaban al equilibrio.
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TABLA 9
Cinética de unión de las variantes de hGH. Se llevaron a cabo medidas con el biosensor BIAcore® con hGHbp(S201C) en tampón PBS + Tween-20 al 0,05%. La K_{d} del biosensor BIAcore® se calcula a partir de K_{desconex}/K_{conex}, excepto para hPL, para el cual se midieron K_{conex} y K_{d} y se calculó la K_{desconex} (\dagger). La proporción de las K_{d} indica las veces que se incrementa la afinidad de unión vs. hGH wt según los datos del biosensor BIAcore®. Las combinaciones de los mutantes en la hGH se designan mediante números Romanos. El hPL (0274) contiene V4I, D56E, M64R, E174A, M179I.
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Conclusión
Se sometieron a mutación al azar las regiones de hGH que se pensaba que eran importantes o bien debido a que estaban en contacto con el receptor o bien debido a que cuando se convertían en alanina afectaban a la afinidad de unión. De este modo, un mutante al azar promedio de estas genotecas debía tener espectacularmente reducida su afinidad de unión a partir de la hGH de tipo salvaje. Con todo, después sólo de una pocas rondas de selección, los productos aislados se unían con una afinidad similar y a menudo superior que la hGH de tipo salvaje. Los clones aislados mostraban normalmente secuencias consenso que eran diferentes de las de tipo salvaje (Tabla 4).
Las mejoras muy pequeñas en la afinidad condujeron a una convergencia rápida y casi exclusiva en estas genotecas. Por ejemplo, el mutante R64K se une separadamente sólo aproximadamente 3 veces más fuerte que la hGH de tipo salvaje (Cunningham et al, 1990, supra). Con todo justo después de tres ciclos de selección de unión R64K dominaba la genoteca (Tabla 5). De un modo similar, I179T contribuyó sólo a una mejora de 1,7 veces en la afinidad (Tabla 8). No obstante, cuando se clasificó por separado en el genoteca de la Hélice 4b de Lowman y Wells, supra, o combinatoriamente con los mutantes de la Hélice 1 (Tablas 4 y 7) se encontró que I179T era seleccionada casi exclusivamente. La fuerte selección para estas mejoras sutiles en la afinidad enfatiza el poder de esta técnica para rescatar las variantes de más alta afinidad de la reserva.
No todas las variantes son presentadas sobre fagos (véase Wells y Lowman, Current Opinion in Struct. Biol., 2: 597-604 [1992]). Esto se debe a que los mutantes que están plegados erróneamente o son inestables pueden ser digeridos por las proteasas, agregados, o se puede bloquear su secreción o su ensamblaje sobre el fago. Aunque no parece haber una tendencia fuerte frente a secuencias concretas de ADN, existe una clara selección frente a los mutantes que contienen Cys, cuya selección ha sido observada previamente para los mutantes de hGH (Lowman y Wells, supra). El número de codones mutados simultáneamente fue limitado deliberadamente a cuatro (aproximadamente 10^{6} secuencias de ADN) de manera que hubiera una buena oportunidad de tener cada uno representado en la reserva de fagémidos de partida (aproximadamente 10^{7} transformantes independientes).
Menos de la mitad de las cadenas laterales que se quedaban ocultas en el Sitio 1 por el primer receptor afectaban significativamente a la afinidad de unión cuando se convertían en alanina [Ejemplo I, Fig. 1A]. Los restos en contacto de la minihélice 1 proporcionan un buen ejemplo de esto (Tabla 3). Las cadenas laterales Y42 y Q46 establecían más contactos de van der Waals y experimentaban más enterramiento solas que K41 y L45 combinadas. Con todo, Y42A y Q46A casi no tienen efecto en la unión en comparación con las mutaciones en K41 y L45.
Estos estudios indican que la funcionalidad no es fácilmente evaluada por el grado en el cual la cadena lateral establece contacto con el receptor. Otro modo de evaluar esto es correlacionar la conservación de los restos de tipo salvaje tras la selección de la unión con el grado en el cual son ocultados por el receptor. Como se muestra en la Fig. 8A, sobretodo no existe esencialmente correlación (R^{2} = 0,022) con la conservación de los restos de tipo salvaje de las genotecas de fagémidos. Esto también resulta evidente al comparar la Fig. 6B y la Fig. 6C. Sin embargo, las tres cadenas laterales más conservadas (T175, R178, L45) tienen todas un contacto sustancial con el receptor.
Existe una correlación razonable (R^{2} = 0,71) entre la reducción de afinidad evaluada mediante la mutagénesis de barrido con alanina y la conservación de las cadenas laterales tras la clasificación en fagos (Fig. 8B; comparar la Fig. 6A y la Fig. 6C). Se observa una correspondencia lineal grosera (y = 3,9 + 1,0 x). Si se incluyen los datos de las Genotecas combinatorias, se añade R167, y la correlación cae a 0,65. La tendencia de la importancia funcional versus la conservación aboga por considerar la información funcional para seleccionar los restos que se van a aleatorizar sobre las consideraciones de la estructura (Fig. 8A).
Estos datos indican que la funcionalidad determinada por la mutagénesis de barrido con alanina es similar a la determinada mediante la conservación de la secuencia tras la selección de la unión. Sin embargo, no existe correlación (R^{2} = 0,005) entre la frecuencia de la conservación de los restos dados entre las hormonas del crecimiento variantes naturales y la conservación tras la selección de la unión de las genotecas de presentación en fagos (Fig. 8C). En la naturaleza los impedimentos funcionales sobre la hormona del crecimiento no son fijos como lo son mediante la selección de la unión in vitro.
Muchos de los restos seleccionados en sitios funcionalmente importantes y muy ocultos, ya sea en la interfase o en la propia hormona, tienden a ser conservados como el resto de tipo salvaje o un homólogo próximo. Por ejemplo, los cinco restos que están más conservados como el tipo salvaje tras la extensa clasificación en fagos (E56, I58, K172, T175, y R178) están completamente ocultos en el complejo; su conversión en alanina ocasionó reducciones de 4 a 60 veces en la afinidad (Cunningham y Wells, 1989, supra). Cuando las sustituciones eran toleradas en estas posiciones eran típicamente similares al resto de tipo salvaje. Por ejemplo, los seleccionantes de afinidad más elevada contenían o bien Asp o bien Glu en la posición 56, restos beta-ramificados en la posición 58, Lys o Arg en la 172, Thr o Ser en la 175, y Lys o Arg en la 178 (Tabla 5; Lowman et al, Biochemistry, supra).
Existe otro grupo de restos funcionalmente importantes que se quedan muy ocultos tras la unión al receptor (K41, L45, R64, D171 e I179). Cuando estos se aleatorizaban, se encontraban sustitutos mejores que tendían a tener un carácter similar al del resto de tipo salvaje. Por ejemplo, K41 era remplazado a menudo por Arg; L45 era sustituido por grandes cadenas laterales hidrófobas; R64 era sustituido muy frecuentemente por Lys; D171 era remplazado óptimamente por Asn y a veces Ser; I179 era sustituido normalmente por restos \beta-ramificados (Tablas 4, 5 y 7; Lowman et al, Biochemistry, supra). De este modo, se pueden realizar mejoras en restos funcionalmente importantes ocultos en la interfase -- tienden a estar cerca de una cadena lateral isostérica o una de carácter químico similar.
Dos de los restos que fueron aleatorizados (H18 y E174) presentaban una afinidad de unión mejorada cuando se convertían en alanina y estaban completamente ocultos en el complejo. Estos casi siempre escogían algo más pequeño que el resto de tipo salvaje. Por ejemplo, la sustitución preferida para H18 era Asp o Asn, y para E174 era Ala, Ser o Thr. Lowman et al, Biochemistry, supra. El empaquetamiento en estas posiciones, denominadas determinantes del impedimento, es energéticamente desfavorable.
Otra clase de restos (H21, Y42, Q46 y R167) están muy ocultos en la interfase pero no tienen efecto o tienen un efecto pequeño sobre la afinidad de unión cuando se convierten en alanina. Estos restos raramente volvían a escoger el resto de tipo salvaje. Por ejemplo, H21 tendía a escoger Asn; Y42 a menudo volvía a Arg o Gln; Q46 prefería Trp, y R167 a menudo escogía Asn (Tablas 4, 5, y 7; Lowman et al, Biochemistry, supra). A pesar del consenso encontrado en estos restos ocultos las mejoras de la afinidad realizadas a partir de los mismos fueron muy pequeñas (Tabla 8). Así, parecía más difícil obtener mejoras en la afinidad a partir de los restos en contacto que cuando eran funcionalmente inertes.
El último grupo de restos (F10, M14, y F54) están virtualmente ocultos en la hormona plegada y afectan a la afinidad de unión en 2 a 4 veces cuando se convierten en alanina, presumiblemente por efectos estructurales indirectos. Sorprendentemente, se toleraban aquí sustituciones de radicales que muestran una selección consenso (Tablas 4, 5, y 7; Lowman et al, Biochemistry, supra). Por ejemplo, F54P era casi la única solución en la genoteca del Bucle A. Phe 54 está oculto en 84% en la hormona y a 10 \ring{A} de establecer contacto con el receptor. Se estima que el mutante F54P intensifica la afinidad en un factor de aproximadamente 1,6 veces basándose en el hecho de que el doble mutante (F54P,R64K) tiene una unión mejorada 4,8 veces (Tabla 5), y el mutante R64K solo intensifica la unión en un factor de \sim3 (Cunningham et al, supra). Los restos 10 y 14 tienden a variar simultáneamente, lo cual no es sorprendente dadas sus posiciones adyacentes a lo largo de la hélice 1. En general, la suma de los volúmenes de estas dos cadenas laterales en los seleccionantes tendió a ser igual o más pequeña que F10 más M14. Esto coincide con su disposición íntimamente empaquetada.
Si bien es posible racionalizar los rasgos generales de estos mutantes combinando los datos funcionales y estructurales, siempre hay mutantes inusuales que superan la selección. Por ejemplo, I179 era remplazado casi siempre conservativamente por una cadena lateral \beta-ramificada (especialmente Ile o Thr), pero también aparecía I179S (Tabla 7). De un modo similar, L45 era reemplazado casi siempre por una cadena lateral grande (Leu o Trp), pero también se encontraba L45A (Tabla 5). Siempre que eran susceptibles de plegarse, se podía esperar que tales variantes persistieran a lo largo de muchas rondas de selección a un nivel de fondo, incluso aunque puedan fracasar al mejorar o puedan incluso debilitar la afinidad de unión.
Estos estudios indican pautas para la maduración de la afinidad de la interfase de la unión utilizando la presentación en fagos monovalentes. Un punto de partida hacia la optimización eficaz de la afinidad es el completo barrido con alanina de la interfase relevante. No se pueden investigar fácilmente más de 5 o 6 codones exhaustivamente (Lowman y Wells, supra); por lo tanto, la genoteca necesita ser enfocada a restos en los que se pueda esperar que mejore la afinidad. Asimismo es posible limitar las elecciones de los codones (ver, v.g., Arkin y Youvan, Bio/Technology, 10: 297-300 [1992]), pero esto realiza suposiciones a cerca de cuáles pueden ser o no sustituciones útiles. Esto es más razonable de realizar si se tiene un conocimiento detallado de la interfase estructural a priori.
Los restos en los que se producían las mejoras de afinidad más obvias fueron aquellos que se demostraba que más afectaban a la unión mediante la mutagénesis de barrido con alanina. Por ejemplo, las mayores mejoras en la afinidad provenían de R64K, E174S, y F176Y. Se sabe que E174A intensifica la afinidad, pero R64A y F176A ocasionaban grandes reducciones en la afinidad. De este modo, a pesar del hecho de que los restos más altamente conservados en la clasificación de fagos eran aquellos que eran más importantes por la mutagénesis de barrido con alanina, todavía quedaban por encontrar variantes mejoradas.
Los datos funcionales pueden ser más importantes para redireccionar los restos para la optimización que los datos estructurales. Por ejemplo, numerosos restos que no están en contacto con el receptor (F10, M14, y F54), pero afectaban a la unión cuando se convertían en alanina, producían intensificaciones de la afinidad cuando eran mutados al azar. Por otra parte, algunos restos en contacto con el receptor, pero de escasa significación funcional por la mutagénesis de barrido con alanina (Y42, Q46), fracasaron al mejorar la afinidad cuando se examinaron las mutaciones en fagos como mutaciones puntuales (Tabla 8).
Idealmente, se podrían aleatorizar restos que pudieran contactar entre sí en la misma etapa de mutagénesis de manera que se permitiera que variaran simultáneamente. Se observó una variación simultánea en las genotecas de la Hélice 1, la Minihélice 1, y la Hélice 4a cuando los restos estaban suficientemente próximos para interaccionar. La clasificación de genotecas por medios combinatorios es especialmente útil en situaciones en las que las mutaciones pueden conducir a efectos aditivos complejos. Por ejemplo, si las reposiciones de cadenas laterales ocasionan grandes cambios conformacionales, como pueden en los bucles flexibles en los anticuerpos, la clasificación combinatoria permitiría mejoras mediante la búsqueda al azar de las mejores combinaciones de cadenas pesadas y ligeras mutantes. Huse et al, supra; Clackson et al, supra; Collet et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10026-10030 (1992).
Sin embargo, las mejoras en la hGH tendían a producirse mediante simples efectos aditivos tanto entre las genotecas como dentro de las genotecas e incluso cuando las cadenas laterales podían interaccionar. Prácticamente, esto significa que se pueden aleatorizar muchos restos independientemente y combinarlos en el extremo para obtener variantes de elevada afinidad. Fundamentalmente, esto indica que las interacciones entre cadenas laterales, incluso las colindantes, a menudo tienen un efecto pequeño, o pueden ser compensadas sin efecto significativo, sobre la energía libre del receptor de la unión. Véase también, Lowman y Wells, J. Mol. Biol., 234: 564-578 (1993).
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Ejemplo III La variante B2036
Se construyó un polipéptido de GH variante adicional con la intención de reducir la inmunogenicidad potencial limitando el número de restos sustituidos en el polipéptido, manteniendo todavía la afinidad de unión intensificada en el Sitio 1. Un segundo objetivo de este experimento fue limitar el número de restos lisina que aparecían en la molécula, especialmente los que aparecían en sitios importantes en la unión de la GH a su receptor, haciendo de ese modo de la variante un mejor candidato para la modificación con polietilenglicol ("pegilación"), a la vez que conservaba la afinidad intensificada de la variante para su receptor.
Así, utilizando los datos descritos antes para la generación del "supermutante" 852d, se construyó una variante adicional, B2036, utilizando las técnicas descritas antes. 852d tiene las siguientes sustituciones:
F10A, M14W, H18D, H21N, K41I, Y42H, L45W, Q46W, F54P, R64K, R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T.
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En contraste, la variante construida (82036) aquí tiene las siguientes sustituciones:
H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I17 9T.
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La sustitución G120K fue añadida para generar un mejor candidato antagonista, aunque son aceptables otras sustituciones en esa posición. Cualquier aminoácido puede ser sustituido en G120 para generar un antagonista; más preferiblemente, la sustitución es lisina, arginina, triptófano, tirosina, fenilalanina, o glutamato. La sustitución R64K fue omitida con el fin de proteger los restos de la unión del sitio I de la pegilación. De un modo similar, las sustituciones K168A y K172R fueron añadidas a B2036 para reducir el número de sitios disponibles para la pegilación en la interfase de la unión hormona-sitio I del receptor. En contraste, la sustitución G120K hace asequible una lisina adicional para la pegilación a la vez que proporciona un bloqueo eficaz del sitio 2.
El resto de las sustituciones en 852d fueron omitidas de la construcción de B2036 para reducir la posible antigenicidad de la variante en seres humanos. Aunque se esperaba una cierta reducción de la afinidad en comparación con 852d, la afinidad esperada de B2036 para su receptor todavía es sustancialmente mayor que la del tipo salvaje y es deseable para su uso como antagonista.
Se esperaba que B2036 pudiera ser modificado adicionalmente restaurando la glicina del resto 120, generando de ese modo un candidato para su uso como agonista que se esperaba que tuviera una antigenicidad reducida en seres humanos en comparación con 852d. De un modo similar, semejante candidato sería pegilado más óptimamente, ya que el número de restos lisina en la interfase del sitio I disminuye en comparación con el "supermutante".
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Ejemplo IV Comparativo
La variante B2034
Se construyó un polipéptido de GH variante adicional con la intención de reducir la inmunogenicidad potencial limitando el número de restos sustituidos en el polipéptido, conservando aún la afinidad de unión intensificada en el sitio 1. Un segundo objetivo de este experimento fue limitar el número de restos lisina existentes en la molécula, especialmente existentes en sitios importantes en la unión de la GH a su receptor, haciendo de ese modo de la variante un mejor candidato para la modificación con polietilenglicol ("pegilación"), a la vez que conservaba la afinidad intensificada de la variante para su receptor.
Así, se combinaron las mutaciones de alanina mediante mutagénesis dirigida al sitio para producir una variante de la hormona de crecimiento que tuviera una "velocidad de desconexión" más lenta del receptor de la hormona del crecimiento que la hormona del crecimiento de tipo salvaje. La variante B2024 tiene por tanto la siguiente secuencia:
H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A, G120K.
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La sustitución G120K fue añadida para generar un mejor candidato antagonista, aunque son aceptables otras sustituciones en ese sitio. Cualquier aminoácido puede ser sustituido en G120 para generar un antagonista; más preferiblemente, la sustitución es lisina, arginina, triptófano, tirosina, fenilalanina, o glutamato.
Se esperaba que B2024 pudiera ser modificado adicionalmente restaurando la glicina del resto 120, generando de ese modo un candidato para su uso como agonista que se esperaba que tuviera una antigenicidad reducida en humanos. De un modo similar, semejante candidato sería pegilado más óptimamente en comparación con 852d, ya que el número de restos lisina en la interfase del sitio I disminuye en comparación con el "supermutante".
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Ejemplo V Producción de la Variante B2036
La variante B2036 fue producida según el siguiente protocolo ejemplar.
Métodos (a) Vector de Expresión y Células Anfitrionas
El vector utilizado para la expresión de la variante B2036 en E. coli fue pMY233 (Fig. 10). El plásmido pMY223 está basado en el plásmido bien caracterizado pBR322 y es similar al plásmido de producción de hGH pHGH4R (Chang et al, Gene, 55: 189-196 [1987]), excepto que la secuencia codificante de B2036 remplaza la secuencia codificante de hGH. pMY223 codifica la resistencia a los antibióticos de tetraciclina, pero a diferencia de pBR322 es sensible a los antibióticos \beta-lactámicos (penicilina, ampicilina, etc).
Las diferencias de aminoácidos entre la variante B2036 codificada por pMY223 y la secuencia de la hormona de crecimiento humana de tipo salvaje se muestran en la Tabla 10, junto con los codones en estos sitios.
TABLA 10 Diferencias en la secuencia entre la variante B2036 codificada por pMY223 y hGH de tipo salvaje
28
La variante B2036 es expresada a partir de una casete de expresión de 1106 pb clonada en el sitio de restricción PstI-EcoRI. La casete de expresión contiene una única copia de la secuencia codificante de la variante B2036 fusionada en marco al péptido señal de la enterotoxina estable al calor (STII) de 23 restos (Pickem et al, Infection and Immunity, 42: 269-275 [1986]). La transcripción de la variante 82036 está dirigida por el promotor phoA de E. coli (Chang et al, Gene, 44: 121-125 [1986]). Se proporciona un sitio de inicio de la traducción por medio de la secuencia de Shine-Dalgarno STII. La traducción comienza con el péptido señal STII, que dirige la translocación de la variante B2036 a través de la membrana citoplásmica al espacio periplásmico. El péptido señal STII es separado después por la peptidasa líder de E. coli. La proteína madura se pliega en su conformación correcta en el periplasma y se forman ambos enlaces disulfuro.
Se construyó el plásmido pMY223 mediante una ligación de tres vías de fragmentos de los plásmidos pB2036 y pHGH4R. Más específicamente, un fragmento NsiI-PvuI de 565 pares de bases (pb) de pB2036 conteniendo la secuencia codificante de la variante B2036 fue ligado a la cadena principal NsiI-BamHI y el fragmento PvuII-BamHI de 4 05 pb de pHGH4R.
El plásmido pB2036 derivaba del plásmido pS0643, también conocido como phGHam-g3 (cuya construcción es descrita por Lowman et al, Biochemistry., 30: 10832-10838 [1991]), que era el plásmido de partida empleado en los estudios de presentación en fagos descritos en el Ejemplo II. PB2036 difiere de pS0643 en que la secuencia codificante de B2036 remplaza la secuencia codificante de hGH.
La célula anfitriona para la expresión de la variante B2036 fue E. coli 33B6, que es un derivado de E. coli W3110 (véase Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2: 1190-1219 [Washington, D.C.: American Society for Micorbiology, 1987]). El genotipo completo de 33B6 es \DeltafhuA phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac) 169 deoC2 degP41 (\DeltaPstI-Kan^{r}) IN (rrnD-rrnE)l ilvG2096(Val^{R}). La derivación de 33B6 se describe más abajo.
La cepa de partida, E. coli W3110, es un derivado de E. coli K-12 que es F^{-} y resistente a lambda. Se ha demostrado que porta una inversión del cromosoma entre rrnD y rrnE.
El gen fhuA (previamente designado tonA) fue suprimido de W3110 mediante una escisión imprecisa de Tn10 tras su inserción en el gen fhuA. La cepa resultante, 1A2, es resistente a los bacteriófagos T1, T5, y \diameter80.
Dos mutaciones por deleción, phoA\DeltaE15 y \Delta(argF-lac)169, fueron introducidas simultáneamente en 1A2 mediante transducción simultánea con P1 con una inserción Tn5 conectada en el gen proC. La escisión de precisión del transposón restauró el gen proC. La mutación phoA\DeltaE15 elimina la expresión de la fosfatasa alcalina, y la mutación \Delta(arF-lac)169 es responsable del fenotipo lac^{-} de esta cepa, 7C1.
La mutación deoC2, que eliminaba la expresión de la desoxirribosa fosfato aldolasa, fue introducida mediante transducción simultánea con P1. El locus deoC está genéticamente unido al locus biosintético de la treonina. Se creó un auxótrofo para la treonina mediante inserción de Tn10 y escisión imprecisa. El auxótrofo para la treonina fue transducido después para la prototrofia para la treonina con el fago P1 desarrollado sobre un mutante deoC2. La presencia de la mutación deoC2 fue confirmada mediante la incapacidad de la cepa resultante, 16C9, para crecer sobre timidina al 0,2% como fuente de carbono.
Se introdujo degP41(\DeltaPstI-Kan^{r}), una mutación en el gen para una proteasa periplásmica, mediante transducción. Esta mutación fue construida in vitro remplazando una sección del gen degP por un gen de resistencia a la kanamicina. Este no es un transposón, pero permite la selección de la deleción utilizando la resistencia a la kanamicina. La cepa resultante es 23E3.
Se introdujo la mutación ilvG2096(Val^{r}) mediante homogenotización. Esta mutación repara un desplazamiento del marco que hace que K-12 de tipo salvaje sea sensible a la valina. La cepa 23E3 fue transformada con el plásmido pAH29, conteniendo el marcador ilvG2096(Val^{r}) y un gen de resistencia a la ampicilina. La cepa 33B6, que había perdido espontáneamente el plásmido y había adquirido el locus ilvG2096(Val^{r}), fue identificada rastreando los clones sensibles a la ampicilina en cuanto a la resistencia a valina. Las características importantes de la cepa final, 33B6, son que es resistente al fago 11, no sobreproduce fosfatasa alcalina cuando se agota el fosfato (que es la condición utilizada para inducir síntesis de producto), carece de proteasa, y no es susceptible a la toxicidad por valina.
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(b) Fermentación
Se produjo una suspensión de células 33B6 que contenían el vector pMY223 (en adelante "células 33B6/pMY223") para expresar la variante B2036, como sigue.
Se preparó un aprovisionamiento de aminoácidos para la fermentación de 1.000 litros mezclando asépticamente los siguientes componentes:
3,2 kg de extracto de levadura;
24 kg de HY-CASE AMINO (Quest, Int'l, Hoffman Estates, IL);
50 g de Metionina;
agua desionizada hasta 135 litros.
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Los siguientes componentes fueron transferidos a un fermentador de 1.000 L capaz de liberar 3-5 mM O_{2}/litro-min:
1,0 litros de agente antiespuma FERMAX ADJUVANT 27 (OSI Specialties Group, Witco Corp., South Charleston, WV);
1.820,0 g de Fosfato de sodio dibásico;
910,0 g de Fosfato de sodio monobásico dihidratado;
3.500,0 g de Sulfato de amonio;
700,0 g de Citrato de sodio dihidratado;
1.050,0 g de Cloruro de potasio;
700,0 litros de Agua desionizada.
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El fermentador fue esterilizado a 121ºC durante 30 minutos. Después de enfriar, se transfirieron asépticamente a un fermentador esterilizado, los siguientes:
50 kg del aprovisionamiento de aminoácidos descrito antes;
7,7 L de Sulfato de magnesio 1M;
350 ml de Cloruro férrico al 2,7%;
350 ml de Solución de elementos vestigiales;
2 litros de Alcohol de tetraciclina de 5 mg/ml;
1 litro de Glucosa al 50%.
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El fermentador se hizo funcionar a 37ºC y se mantuvo el pH a un pH de aproximadamente 7,3 (es decir, entre 7,0 y 7,5) con aireación y agitación suficiente para proporcionar entre 3 y 5 mM O_{2}/litro-min.
Se transfirieron asépticamente las células 33B6/pMY223 al fermentador en forma de un inóculo de 8 litros con una densidad óptica (DO) a 600 nm de 15. El fermentador se hizo funcionar, introduciendo suficiente glucosa para satisfacer la demanda del cultivo (pero evitando la acumulación de glucosa en el fermentador) y manteniendo el oxígeno disuelto al 30% o más de saturación de aire. El pH se controló utilizando hidróxido de amonio 15 N o ácido sulfúrico al 24%, y se utilizó FERMAX ADJUVANT 27 para controlar la formación de espuma. Cuando el cultivo alcanzó una DO a 600 nm de 20, comenzó el aprovisionamiento de aminoácidos a aproximadamente 0,06 kg/minuto.
Aproximadamente 32 horas después de la inoculación, el cultivo se inactivó mediante destrucción con calor a 60ºC durante 30 segundos. Después se recogió una suspensión celular mediante centrifugación y se congeló en gránulos.
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(c) Extracción y Aclaramiento Celular
Los gránulos congelados de la cosecha de fermentación (en adelante "sedimento celular") fueron almacenados a -60ºC o menos antes de su uso. Se añadieron 5 litros de tampón de extracción (urea 6 M, Tris 0,02 M, pH 7,65, a la temperatura ambiente) por kg de sedimento celular a un tanque de extracción encamisado. El sedimento celular se añadió lentamente al tampón de extracción, con agitación. Se minimizó la formación de espuma. La suspensión se mezcló a 4ºC hasta que todo el sedimento estuvo en solución. El pH se ajustó a 8,0 y la solución se mezcló a 4ºC durante 2 horas para formar un extracto. Se añadieron 3 litros de agua por litro de extracto y 10 ml de polietilenimina al 5% (PEI), pH 8,0, por litro de extracto, con agitación.
El extracto fue aclarado haciéndolo pasar a través de una centrífuga de flujo continuo Alfa Laval AX213. El extracto fue agitado continuamente para mantener la suspensión e introducido a una velocidad de aproximadamente 20 litros por minuto (LPM) en la centrífuga. El sobrenadante fue recogido en un tanque receptor encamisado, ajustado para mantener la temperatura a 4ºC. Cuando el extracto completo hubo sido introducido a través de la centrífuga, se introdujeron aproximadamente 75 litros de agua purificada (4ºC), a través de la centrífuga para recuperar el extracto de E. coli aclarado de la centrífuga.
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(d) Cromatografía de Intercambio Aniónico I
El extracto de E. coli aclarado fue purificado sobre una columna de DEAE TRISACRYIL LS PLUS (volumen = 0,36 litros/kg de pasta celular), que funcionaba a 4ºC. Antes de la carga, la columna fue lavada y equilibrada con tampón de equilibrado (Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, 4ºC). La columna fue cargada después con el extracto de E. coli aclarado y lavada al menos con tres veces el volumen de la columna de tampón de equilibrado hasta que la absorbancia de UV del eluyente estuvo en la línea base o cerca de ella. La columna se hizo eluir con tampón de elución (urea 3M, más MES, MOPS, Tris-HCl, TEA-HCl, glicina y glicilglicina, cada uno 18 mM, pH 5,0). La carga, lavado, y elución de la columna se llevaron a cabo a una velocidad de flujo nominal para todas las etapas de la cromatografía en este ejemplo. Se recogieron las fracciones del eluyente que absorbía UV y se analizaron mediante SDS-PAGE. Se reunieron las fracciones que contenían la variante B2036.
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(e) Cromatografía de Intercambio Aniónico II
Se ajustó el pH de la reserva DEAE TRISACRYL LS PLUS y se purificó sobre una columna de DEAE SEPHAROSE FAST FLOW (volumen = 1,47 litros/kg de pasta celular). El pH de la reserva de DEAE TRISACRYL LS PLUS fue ajustado a aproximadamente 7,2 con hidróxido de sodio al 2% a 4ºC. La columna fue lavada y equilibrada con tampón de equilibrado (Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, 4ºC). Después la columna fue cargada con la reserva con el pH ajustado y lavada al menos con tres veces el volumen de la columna de tampón de equilibrado hasta que la absorbancia UV del eluyente estuvo en la línea base o cerca de ella. La columna se hizo eluir con tampón de elución (urea 3M, más MES, MOPS, Tris-HCl, TEA-HCl, glicina y glicilglicina, cada uno a 18 mM, pH 5,0), y se recogieron las fracciones del eluyente que absorbía UV y se analizaron mediante SDS-PAGE. Se reunieron aquellas fracciones que contenían la variante B2036.
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(f) Cromatografía Q SEPHAROSE FAST FLOW
Se ajustó el pH de la reserva DEAE SEPHAROSE FAST FLOW y adicionalmente se purificó sobre una columna Q SEPHAROSE FAST FLOW (volumen = 0,43 litros/kg de pasta celular), que funcionaba a 4ºC. El pH de la reserva Q SEPHAROSE FAST FLOW se ajustó a 7,2 con hidróxido de sodio al 2% a 4ºC. La columna se equilibró con tampón de equilibrado (Tris 0,05 M, pH 8,0) y se cargó con la reserva con el pH ajustado. La columna se lavó con una vez el volumen de la columna de tampón de equilibrado y se hizo eluir con un gradiente lineal que comenzaba con NaCl 0,05 M, Tris 0,05 M, pH 8,0 y terminaba con NaCl 0,20 M, Tris 0,05 M, pH 8,0, utilizando tres veces el volumen de la columna de cada tampón. Las fracciones fueron recogidas y analizadas mediante SDS PAGE, y se reunieron aquellas fracciones que contenían la variante B2036.
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(g) Cromatografía PHENYL TOYOPEARL 650 M
Tras el acondicionamiento, la reserva Q SEPAHROSE FAST FLOW fue purificada adicionalmente sobre una columna PHENYL TOYOPEARL 650M (volumen = 0,50 litros/g de pasta celular), que funcionaba a la temperatura ambiente. La reserva Q SEPHAROSE FAST FLOW fue acondicionada con tampón de acondicionamiento (sulfato de sodio 1,2 M, Tris 0,05 M, pH 7,2) añadiendo un volumen de tampón de acondicionamiento equivalente a 1,5 veces el volumen de la reserva Q SEPHAROSE y agitando la solución resultante durante aproximadamente 15 minutos. Después la solución se llevó a la temperatura ambiente. La columna se equilibró con tres veces el volumen de la columna de tampón de equilibrado (sulfato de sodio 0,75 M, Tris 0,05 M, pH 7,2) a través de un filtro de entrada de 0,22 \mu. La reserva acondicionada completa fue cargada después sobre la columna a través de un filtro de entrada Pall Profile de 0,3 \mu. Después la columna se hizo eluir con un gradiente lineal que comenzaba con sulfato de sodio 0,75 M, Tris 50 mM, pH 7,2 y terminaba con Tris 50 mM, pH 7,5. Se utilizó tres veces el volumen de la columna de cada tampón. Las fracciones se recogieron y se analizaron mediante SDS-PAGE, y se reunieron las fracciones que contenían la variante B2036.
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(h) Cromatografía SEPHADEX G-25
Se utilizó una columna SEPHADEX G-25 para reducir la sal en la reserva PHENYL TOYOPEARL cambiando la variante B2036 por tampón Tris 0,05 M. La columna se hizo funcionar a 4ºC. El volumen de la carga se restringió a un máximo del 30% del volumen del lecho total de la columna. La columna se equilibró con tres veces el volumen de la columna de tampón de equilibrado (Tris 0,05 M, pH 7,2) y después se cargó con la reserva PHENYL TOYOPEARL. La columna se hizo eluir con Tris 0,05 M, pH 7,2. Cuando la DO a 280 nm empezó a incrementarse, se recogió la reserva hasta que la DO a 280 nm cayó cerca de la línea base.
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(i) Cromatografía DEAE SEPHAROSE FAST FLOW
La reserva SEPHADEX G-25 se purificó adicionalmente sobre una columna DEAE SEPHAROSE FAST FLOW (volumen = 0,04 litros/g de proteína), funcionando a 4ºC. La columna fue equilibrada con un volumen mínimo de tres veces el volumen de la columna de tampón de equilibrado (Tris 0,05 M, pH 8,0). Después la columna se cargó con la reserva SEPHADEX G-25. El límite de carga para la columna fue de 25 g de proteína por litro de resina. La columna se hizo eluir con aproximadamente diez veces el volumen de la columna de tampón de elución (urea 2 M más MES, MOPS, Tris-HCl, TEA-HCl, glicina, y glicilglicina, cada una 17 mM, pH 5,0). Cuando la DO a 280 nm del eluyente alcanzó un valor de 0,1, las fracciones se recogieron hasta que la DO a 280 cayó por debajo del valor de 0,5. Las fracciones fueron analizadas mediante SDS-PAGE, y se recogieron las fracciones que contenían la variante B2036.
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(j) Concentración mediante Cromatografía Q SEPHAROSE FAST FLOW
La reserva de DEAE SEPHAROSE FAST FLOW se concentró sobre una columna Q SEPHAROSE FAST FLOW (volumen = 0,07 litros/g de proteína), funcionando a 4ºC. La columna se equilibró con al menos cuatro veces el volumen de la columna de tampón HEPES 0,1 M, pH 7,7. La reserva DEAE SEPHAROSE FAST FLOW se cargó sobre la columna, y la columna se lavó con al menos cuatro veces el volumen de la columna de tampón. La columna se hizo eluir con aproximadamente dos veces el volumen de la columna de tampón de elución (HEPES 0,1 M, NaCl 0,22 M, pH 7,7). Cuando la DO a 280 nm del eluyente excedió de 2,0, la reserva se recogió hasta que la DO a 280 cayó por debajo de 2,0.
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Resultados
La variante B2036 estaba esencialmente libre de impurezas de la célula anfitriona y cualquiera de las formas degradadas significativas conocidas de la variante como se determinó mediante SDS-PAGE utilizando la tinción con azul de Coomassie.
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Ejemplo VI Comparativo
Producción de la Variante B2024
La variante B2024 fue producida según el siguiente protocolo ilustrativo.
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Métodos (a) Vector de Expresión y Células Anfitrionas
La variante B2024 fue expresada en E. coli 33B6 utilizando el plásmido pMY216, que es el mismo que pMY223 (descrito en el Ejemplo V), excepto que pMY216 contiene la secuencia codificante de B2024 en lugar de la secuencia codificante de B2036.
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(b) Fermentación
Se produjo una suspensión de células 33B6 que contenían el vector pMY223 (en adelante "células 33B6/pMY216") para expresar la variante B2024 como sigue.
Los siguientes componentes se transfirieron a un fermentador de 60 litros capaz de liberar 3-6 mM O_{2}/litro-min:
60,0 ml de agente antiespuma FERMAX ADJUVANT 27 (OSI Specialties Group, Witco Corp., South Charleston, WV);
156,0 g de Fosfato de sodio dibásico;
78,0 g de Fosfato de sodio monobásico dihidratado;
300,0 g de Sulfato de amonio;
60,0 g de Citrato de sodio dihidratado;
90,0 g de Cloruro de potasio;
36,0 litros de Agua desionizada.
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El fermentador fue esterilizado a 121ºC durante 30 minutos. Después de enfriar, se transfirió asépticamente a un fermentador esterilizado, lo siguiente:
600,0 ml de Sulfato de magnesio 1M;
60,0 ml de Cloruro férrico al 2,7%;
60,0 ml de Solución de elementos vestigiales;
120,0 ml de Alcohol de tetraciclina de 5 mg/ml;
90 ml de Glucosa al 50%;
6,0 litros de NZ amina A al 10% (Quest, Int'l, Hoffman Estates, IL);
Agua desionizada hasta 48 litros.
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El fermentador se hizo funcionar a 37ºC y se mantuvo el pH a un pH de aproximadamente 7,0 (es decir, entre 6,8 y 7,2) con aireación y agitación suficiente para proporcionar entre 3 y 6 mM O_{2}/litro-min.
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Se transfirieron asépticamente las células 33B6/pMY216 al fermentador en forma de un inóculo de 1 litro con una densidad óptica (DO) a 600 nm de 4. El fermentador se hizo funcionar, manteniendo el oxígeno disuelto al 0% de saturación de aire durante tanto tiempo como fuera posible e introduciendo suficiente glucosa para satisfacer la demanda del cultivo, pero evitando la acumulación de glucosa en el fermentador. La glucosa se introdujo de manera que cualquier acetato formado fuera consumido de nuevo en un corto espacio de tiempo (normalmente menos de media hora, pero no más de dos horas). El pH se controló utilizando hidróxido de amonio 12 N conteniendo 47 g/litro de L-leucina o ácido sulfúrico al 24%, y se utilizó FERMAX ADJUVANT 27 para controlar la formación de espuma.
Aproximadamente 40 horas después de la inoculación, el cultivo se inactivó mediante destrucción con calor a 60ºC durante 30 segundos. Después se recogió una pasta celular mediante centrifugación y se congeló.
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(c) Extracción y Aclaramiento Celular
La pasta celular congelada de la cosecha de fermentación fue almacenada a -60ºC o menos antes de su uso. La pasta celular fue descongelada durante la noche a 4ºC. Se añadieron 5 litros de tampón de extracción (urea 6 M, Tris 0,02 M, pH 8,5, a 4ºC) por kg de pasta celular a la pasta celular. Las células se homogeneizaron en el tampón utilizando un homogeneizador ULTRATURREX (Tekmar, Cincinnati, OH) con agitación, minimizando la formación de espuma. La temperatura se mantuvo a 4ºC, y la suspensión se mezcló hasta que todas las células estuvieron en suspensión. El pH se ajustó a aproximadamente 8,1. La solución se mezcló a 4ºC durante 2 horas para formar un extracto. Se añadieron 1 litro de agua por litro de extracto y 20 ml de PEI al 5%, pH 8,0, por litro de extracto, con agitación.
El extracto fue aclarado haciéndolo pasar a través de una centrífuga de flujo continuo Alfa Laval BTPX205. El extracto fue agitado continuamente para mantener la suspensión e introducido a una velocidad de aproximadamente 2 LPM en la centrífuga. El sobrenadante fue recogido en un tanque receptor a 4ºC. Cuando el extracto completo hubo sido introducido a través de la centrífuga, se introdujeron aproximadamente 5-10 litros de agua purificada (4ºC), a través de la centrífuga para desplazar el extracto de E. coli aclarado de la centrífuga. El extracto aclarado se diluyó con agua purificada (4ºC) hasta que la conductividad medida fue menor de 2,0 mS.
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(d) Cromatografía de Intercambio Aniónico
El extracto de E. coli aclarado fue purificado sobre una columna de DEAE TRISACRYIL LS PLUS (volumen = 0,50 litros/kg de pasta celular) en serie con una columna DEAE SEPHAROSE FAST FLOW (volumen = 2,6 litros/kg de pasta celular) funcionando ambas a 4ºC. Antes de la carga, las columnas fueron lavadas y equilibradas con tampón de equilibrado (Tris-HCl 0,02 M, pH 8,5, 4ºC). La columna DEAE TRISACRYL LS PLUS fue cargada después con el extracto de E. coli aclarado. Las columnas fueron lavadas al menos con tres veces el volumen de la columna de tampón de equilibrado hasta que la absorbancia UV del eluyente estuvo en la línea base o cerca de ella. La columna DEAE TRISACRYL LS PLUS fue desconectada después de la columna DEAE SEPHAROSE FAST FLOW. La variante B2024 se hizo eluir de la columna DEAE SEPHAROSE FAST FLOW con un tampón de elución en gradiente de pH (urea 3M, más MES, MOPS, Tris-HCl, TEA-HCl, glicina y glicilglicina, cada una 10 mM, pH 5,0). La carga, lavado, y elución de la columna se llevaron a cabo a una velocidad de flujo nominal para todas las etapas de la cromatografía en este ejemplo. Se recogieron las fracciones que contenían la variante B2024, basándose en la absorbancia óptica de la elución y en el análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones.
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(e) Cromatografía Q SEPHAROSE FAST FLOW
Se ajustó el pH de la reserva DEAE SEPHAROSE FAST FLOW y adicionalmente se purificó sobre una columna Q SEPHAROSE FAST FLOW (volumen = 0,67 litros/kg de pasta celular), que funcionaba a 4ºC. El pH de la reserva Q SEPHAROSE FAST FLOW se ajustó a 8,5 con hidróxido de sodio al 2% a 4ºC. La columna se equilibró con tampón de equilibrado (Tris 0,02 M, pH 8,5), se cargó con la reserva con el pH ajustado, y se hizo eluir con un gradiente lineal que comenzó con Tris 0,02 M, pH 8,5 y terminó en NaCl 0,10 M, MES 0,08 M, pH 6,5, utilizando 2,5 veces el volumen de la columna de cada tampón. Las fracciones fueron recogidas y analizadas mediante SDS-PAGE, y se reunieron aquellas fracciones que contenían la variante B2024.
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(f) Cromatografía PHENYL TOYOPEARL 650 M
Tras el acondicionamiento, la reserva Q SEPAHROSE FAST FLOW fue purificada adicionalmente sobre una columna PHENYL TOYOPEARL 650M (volumen = 0,20 litros/kg de pasta celular), que funcionaba a la temperatura ambiente. La reserva Q SEPHAROSE FAST FLOW fue acondicionada con tampón de acondicionamiento (sulfato de sodio 2 M, Tris 0,04 M, pH 7,2) añadiendo un volumen de tampón de acondicionamiento equivalente al volumen de la reserva Q SEPHAROSE y agitando la solución resultante hasta su uniformidad. La columna se equilibró con dos a tres veces el volumen de la columna de tampón de equilibrado (sulfato de amonio 1,0 M, Tris 0,02 M, pH 7,2). La reserva acondicionada completa fue cargada después sobre la columna, y la columna se hizo eluir con un gradiente lineal que comenzó con sulfato de amonio 1 M, Tris 20 mM, pH 7,2 y terminó con agua purificada. Se utilizaron cuatro veces el volumen de la columna de cada tampón. Las fracciones se recogieron y se analizaron mediante SDS-PAGE, y se reunieron las fracciones que contenían la variante B2024.
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(g) Cromatografía SEPHADEX G-25
Se utilizó una columna SEPHADEX G-25 para reducir la sal en la reserva de PHENYL TOYOPEARL intercambiando la variante B2024 por tampón Tris 0,02 M. La columna se hizo funcionar a 4ºC. El volumen de la carga se restringió a un máximo del 30% del volumen del lecho total de la columna. La columna se equilibró con tres veces el volumen de la columna de tampón de equilibrado (Tris 0,02 M, pH 8,0) y después se cargó con la reserva PHENYL TOYOPEARL. La columna se hizo eluir con Tris 0,02 M, pH 8,0. Cuando la DO a 280 nm se incrementó aproximadamente hasta 0,2, se recogió la reserva hasta que la DO a 280 nm cayó por debajo de 0,2.
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(h) Cromatografía DEAE SEPHAROSE FAST FLOW
La reserva de SEPHADEX G-25 se purificó adicionalmente sobre una columna DEAE SEPHAROSE FAST FLOW (volumen = 0,04 litros/g de proteína), funcionando a 4ºC. La columna fue equilibrada con un volumen mínimo de tres veces el volumen de la columna de tampón de equilibrado (Tris 0,02 M, pH 8,0). La reserva G-25 se diluyó con un volumen igual de agua para la irrigación, y la solución resultante se mezcló hasta la uniformidad. La columna se hizo eluir con aproximadamente diez veces el volumen de la columna de tampón de elución (urea 2 M más MES, MOPS, Tris-HCl, TEA-HCl, glicina, y glicilglicina, cada una 10 mM, pH 5,0). Cuando la DO a 280 nm del eluyente alcanzó un valor de 0,1, las fracciones se recogieron hasta que la DO a 280 cayó por debajo del valor de 0,5. Las fracciones fueron analizadas mediante SDS-PAGE, y se recogieron las fracciones que contenían la variante B2024.
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(i) Concentración mediante Cromatografía DEAE SEPHAROSE FAST FLOW
La reserva de DEAE SEPHAROSE FAST FLOW se concentró sobre una columna DEAE SEPHAROSE FAST FLOW (volumen = 0,06 litros/g de proteína), funcionando a 4ºC. La columna se equilibró con al menos cuatro veces el volumen de la columna de tampón Tris 0,02 M, pH 8,0. La reserva DEAE SEPHAROSE FAST FLOW completa se cargó sobre la columna, y la columna se lavó con al menos dos veces el volumen de la columna de tampón MES 0,02 M, pH 6,5. La columna se hizo eluir con aproximadamente dos veces el volumen de la columna de NaCl 0,1 M, MES 0,02 M, pH 6,5, seguido de dos veces el volumen de la columna de NaCl 0,15 M, MES 0,02 M, pH 6,5. Cuando la DO a 280 nm del eluyente excedió de 2,0, la reserva se recogió hasta que la DO a 280 cayó por debajo de 2,0.
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Resultados
La variante B2024 estaba esencialmente libre de impurezas de la célula anfitriona y cualquiera de las formas degradadas significativas conocidas de la variante como se determinó mediante SDS-PAGE utilizando la tinción con azul de Coomassie.
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Ejemplo VII Pegilación de la Variante B2036 con PEG(5000)
Se utilizó M-SPA-PEG(5000) para pegilar la variante de hGH B2036. La pegilación de la variante B2036 se llevó a cabo según el siguiente protocolo, que también es adecuado para la pegilación de la hGH de tipo salvaje y de otras variantes de hGH, tales como la variante B2024.
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Métodos (a) Reacción de Pegilación
Se hizo reaccionar la variante B2036 purificada, producida como se ha expuesto en el Ejemplo IV, con M-SPA-PEG(5000) (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL), que se añadió en forma de un sólido a la preparación de la variante B2036. Se dejó que la reacción prosiguiera a la temperatura ambiente con agitación constante. Brevemente, la preparación de la variante B2036 se diluyó con HEPES 0,1 M, pH 7,7, a una concentración de proteína final de 10 mg de variante B2036/ml y se dejó volver a la temperatura ambiente. El pH de la solución a la temperatura ambiente fue de aproximadamente 7,5. El M-SPA-PEG(5000) sólido se añadió a la preparación, con agitación, a una concentración de 20 g/litro. El pH se mantuvo a 7,5 \pm 0,1. La reacción se completó a las dos horas de la adición de M-SPA-PEG(5000).
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(b) Cromatografía de Interacción Hidrófoba (PHENYL TOYOPEARL 650M)
La preparación de la variante B2036 pegilada fue acondicionada y después purificada sobre una columna PHENYL TOYOPEARL 650M (volumen = 0,13 litro/g variante B2036), que funcionaba a la temperatura ambiente. La preparación de la variante B2036 pegilada fue acondicionada añadiendo un volumen de solución acondicionadora de citrato (citrato de sodio 0,8 M, Tris 0,05 M, pH 7,7) equivalente al volumen de la preparación de la variante B2036 pegilada y agitando la solución resultante durante aproximadamente 15 minutos a la temperatura ambiente. La columna se equilibró a la temperatura ambiente con al menos una vez el volumen de la columna de tampón de equilibrado (citrato de sodio 0,40 M, Tris 0,05 M, pH 7,5). La preparación de la variante B2036 pegilada acondicionada se cargó después en la columna. La columna se hizo eluir con cuatro veces el volumen de la columna de un gradiente lineal que comenzaba en citrato de sodio 0,40 M, Tris 50 mM, pH 7,5, y terminaba con Tris 50 mM, pH 7,5. La carga, lavado y elución de la columna se llevaron a cabo a una velocidad de flujo nominal para todas las etapas de la cromatografía en este ejemplo. Las fracciones fueron recogidas y analizadas mediante SDS-PAGE, y se recogieron aquellas fracciones que contenían el producto conjugado PEG-variante B2036.
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(c) Ultrafiltración/Diafiltración
Se concentró la reserva de PHENYL TOYOPEARL aproximadamente tres veces y después se sometió a diafiltración frente a seis volúmenes de acetato de sodio 0,025 M, pH 4,0, utilizando un sistema de ultrafiltración equipado con una membrana de celulosa regenerada de 10 kD (Millipore, Bedford, MA).
La primera etapa de la concentración fue un reciclaje total con el modo abierto al producto filtrado utilizando la reserva PHENYL TOYOPEARL. El reciclaje se realizó durante aproximadamente 15 minutos, con el objetivo de reducir la concentración de PEG-variante B2036 en el producto filtrado a menos de 3% de la concentración de alimentación. La concentración real de la reserva de PHENYL TOYOPEARL se inició con el modo de UF (es decir, con el producto retenido dirigido a un tanque de reciclaje, y el producto filtrado dirigido al colector). La transición desde el reciclaje inicial al modo de UF se realizó automáticamente sin una parada de la bomba de alimentación, y sin cambio alguno en la velocidad de alimentación o en la presión del producto retenido. La concentración continuó hasta que se hubo alcanzado una reducción de tres veces en el volumen del producto retenido. La reserva de PHENYL TOYOPEARL concentrada fue sometida a diafiltración frente a seis volúmenes de acetato de sodio 0,025 M, pH 4,0, en el modo DF (es decir, con el producto retenido dirigido al tanque de reciclaje, el producto filtrado dirigido al colector, y el tampón transferido al tanque de reciclaje). Se realiza una transición desde el modo UF al modo DF automáticamente sin una parada en la bomba de alimentación.
Una vez que la reserva de Phenyl Toyopearl se hubo diafiltrado y concentrado, se realizó un reciclaje mediante una ligera caída de presión (\DeltaP) en un reciclaje total con el modo cerrado al producto filtrado. La válvula del producto retenido se abrió completamente durante esta etapa. La velocidad de alimentación se mantuvo para dar una caída de presión de 0,36 kg\cdotcm^{2}. La recirculación se realizó durante al menos 10 minutos. El modo de transferencia del producto fue utilizado después para transferir los contenidos del sistema de ultrafiltración al tanque de reserva. La transferencia se realizó en dos etapas. La primera etapa implicó vaciar el producto retenido en el tanque de reciclaje a través de una válvula, con la unidad de membrana aislada. En la segunda etapa, el bastidor de ultrafiltración se vació completamente, utilizando una corriente a baja presión de gas inerte para empujar el producto fuera del sistema y al tanque de reserva.
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(d) Cromatografía de Intercambio Catiónico (S SEPHAROSE FAST FLOW)
La variante B2036 pegilada fue purificada adicionalmente mediante cromatografía de intercambio catiónico sobre una columna S SEPHAROSE FAST FLOW, cargando no más de 7 g de proteína/litro de resina. La columna fue equilibrada a la temperatura ambiente con al menos tres veces el volumen de la columna de acetato de sodio 0, 025 M, pH 4,0. La reserva de PEG-variante B2036 UF/DF completa fue cargada después sobre la columna, y la columna se hizo eluir con siete veces el volumen de la columna con un gradiente lineal que comenzaba con acetato de sodio 0, 025 M, pH 4,0, y terminaba con NaCl 0,25 M, acetato de sodio 0,025 M, pH 4,0. Una vez que la DO a 280 nm empezó a aumentar, las fracciones fueron recogidas y analizadas mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas. Se reunieron aquellas fracciones que contenían el producto conjugado PEG-hGH conteniendo de cuatro a cinco grupos PEG.
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(e) Ultrafiltración/Diafiltración
Se concentró la reserva S SEPHAROSE FAST FLOW a aproximadamente 10 g/litro utilizando un sistema de ultrafiltración equipado con una membrana de celulosa regenerada de 10 kD (Millipore, Bedford, MA). Las etapas de concentración, reciclaje mediante ligera caída de presión, y transferencia del producto se realizaron como se describe en la sección de "Ultrafiltración/Diafiltración" anterior para lograr una reducción de siete veces en el volumen del producto retenido.
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(f) Cromatografía SEPHADEX G-25
Se utilizó una columna SEPHADEX G-25, que funcionaba a 4ºC para intercambiar la preparación de PEG-variante B2036 en el tampón de formulación (18,0 g/litro manitol, 0,068 g/litro glicina, fosfato de sodio 5 mM, pH 7,4). El volumen de la carga fue restringido al 25% del volumen total del lecho de la columna. La columna se lavó con una vez el volumen de la columna de agua purificada para la irrigación, seguido de equilibrado con al menos 1,5 veces el volumen de la columna de tampón de formulación. La reserva de UF de PEG-variante B2036 completa se cargó después sobre la columna, y la columna se hizo eluir con tampón de formulación. Cuando la DO a 280 excedió de 0,5, las fracciones fuero recogidas hasta que la DO a 280 cayó por debajo de aproximadamente 0,5. La reserva de SEPHADEX G-25 fue diluida después con tampón de formulación hasta una concentración de 5,0 mg/ml.
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Resultados
Las estequiometrías de PEG por la variante de hGH fueron evaluadas mediante espectrometría de masas en un espectrómetro de masas de ionización por desorción láser VESTEC (PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA). Los resultados indicaron que la preparación contenía principalmente productos conjugados que contenían cuatro y cinco grupos PEG (PEG-4/5-B2036).
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Ejemplo VIII Pegilación de la Variante B2036 con PEG(20.000)
La variante B2036 fue pegilada con PEG(20.000) según el siguiente protocolo ejemplar.
Se cambió el tampón de la variante B2036, purificada como se describe en el Ejemplo V por fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,5, utilizando una columna G-25 SEPHADEX PD-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ). La solución de variante B2036 fue diluida después hasta una concentración de proteína de 10 mg/ml. Se pesaron 60 mg de M-SPA-PEG(20.000) (Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, AL) en un tubo, y se añadieron 6 ml de solución de variante B2036. La reacción se incubó a la temperatura ambiente durante 75 minutos. Se cambió el tampón de la mezcla de reacción por acetato de sodio 25 mM, pH 4,0, utilizando una columna G-25 SEPHADEX PD 10.
La solución de PEG(20.000)-variante B2036 resultante fue aplicada a una columna SP SEPHAROSE HP (Pharmacia) que había sido lavada con acetato de sodio 25 mM, pH 4,0, hasta que la columna se hubo equilibrado. Se cargó la columna con la solución de PEG(20.000)-variante B2036 a una concentración de 4,1 mg/ml de resina a la temperatura ambiente. Después la columna se hizo eluir con un gradiente lineal que constaba de acetato de sodio 25 mM, pH 4,0, a cloruro de sodio 0,5 M en acetato de sodio 25 mM, pH 4,0, utilizando cinco veces el volumen de la columna de cada tampón. Las fracciones fueron recogidas y analizadas mediante electroforesis en gel SDS, utilizando geles Daiichi en los que se había vertido previamente poliacrilamida al 2-15% (Owl Scientific, Cambridge, MA). Las fracciones que contenían una forma PEG(20.000)-B2036 que tenía una única molécula de PEG(20.000) conjugada con cada molécula de B2036 fueron reunidas y concentradas mediante ultrafiltración utilizando un concentrador CENTIPREP 10 (Amicon, Inc., Beverly, MA). El concentrador CENTIPREP 10 fue centrifugado a 8.000 rpm en una centrífuga SORVALL RT6000B (Dupont Instruments, Newton, CT) a 16ºC. El producto retenido fue separado y concentrado adicionalmente utilizando un concentrador CENTRICON 10 (Amicon, Inc). El concentrador fue centrifugado a 6.500 rpm en una centrífuga SORVALL RC-5B a 16ºC.
Después se cambió el tampón de PEG(20.000)-variante B2036 concentrado por tampón de formulación (18,0 g/litro manitol, 0,68 g/litro glicina, fosfato de sodio 5 mM, pH 7,4) utilizando una columna G-25 SEPHADEX PD-10 a la temperatura ambiente.
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Ejemplo IX Pegilación de la Variante B2036 con Y-PEG
La variante B2036 fue pegilada con PEG de cadena ramificada que tenía dos cadenas de 10.000 D (PEG2(20.000)) según el siguiente protocolo ejemplar.
Se cambió el tampón de la variante B2036, purificada como se describe en el Ejemplo V, por fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,5, utilizando una columna G-25 SEPHADEX PD-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ). La solución de B2036 fue diluida después hasta una concentración de proteína de 10 mg/ml. Se pesaron 100 mg de NHS-PEG2(20.000) (Shearwater Polymers, Inc.) en un tubo, y se añadieron 4 ml de solución de B2036. La reacción se incubó a la temperatura ambiente durante 90 minutos. Se cambió el tampón de la mezcla de reacción por acetato de sodio 25 mM, pH 4,0, utilizando una columna G-25 SEPHADEX PD 10.
La solución de PEG2(20.000)-variante B2036 resultante se aplicó a una columna SP SEPHAROSE HP (Pharmacia) que había sido lavada con acetato de sodio 25 mM, pH 4,0, hasta que la columna se hubo equilibrado. La columna se cargó con la solución de PEG (20.000)-variante B2036 a una concentración de 2,75 mg/ml de resina a la temperatura ambiente. La columna se hizo eluir después con un gradiente lineal que constaba de acetato de sodio 25 mM, pH 4,0, a cloruro de sodio 0,5 M en acetato de sodio 25 mM, pH 4,0, utilizando cinco veces el volumen de la columna de cada tampón. Las fracciones fueron recogidas y analizadas mediante electroforesis en gel SDS, utilizando geles Daiichi en los que se había vertido previamente poliacrilamida al 2-15% (Owl Scientific, Cambridge, MA). Las fracciones que contenían una forma PEG2(20.000)-B2036 que tenía una única molécula de PEG2(20.000) conjugada a cada molécula de B2036 fueron reunidas y concentradas mediante ultrafiltración utilizando un concentrador CENTRICON 10 (Amicon, Inc., Beverly, MA). El concentrador fue centrifugado a 6.500 rpm en una centrífuga SORVALL RC-5B a 16ºC (Dupont Instruments, Newton, CT).
Se cambió el tampón de PEG2(20.000)-B2036 concentrado por tampón de formulación (18,0 g/litro manitol, 0,68 g/litro de glicina, fosfato de sodio 5 mM, pH 7,4) utilizando una columna G-25 SEPHADEX a la temperatura ambiente.
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Ejemplo X Sitios de Pegilación en PEG-4/5-B2036
Los sitios de modificación con PEG de una preparación de PEG-4/5-variante B2036 producida como se ha descrito en los Ejemplos V y VII fueron analizados mediante mapeo con tripsina. Las muestras de PEG-4/5-variante B2036 purificadas (1 mg/ml en CaCl_{2} 1 M, acetato de sodio 0,1 M, Tris 10 mM, pH 8,8) fueron incubadas con tripsina bovina (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) a una proporción en peso de proteína de 1:40 (tripsina:PEG-4/5-variante B2036) como describen Kohr, W.J. et al Anal. Biochem., 122: 348-359 (1982). La tripsina fue añadida a tiempo 0 y de nuevo a las cuatro horas de digestión. Tras incubar durante ocho horas a 37ºC, se detuvo la digestión añadiendo ácido fosfórico a pH 2, y se almacenaron las muestras a 4ºC.
Las muestras digeridas (100 \mug) fueron cargadas en una columna C-18 de 15 x 0,46 cm (cuentas de 5 \mum, tamaño de poro 100 \ring{A}; NUCLEOSIL, Alltech Associates, Deerfield, IL) en ácido trifluoroacético acuoso al 0,1% y se hicieron eluir con un gradiente de acetonitrilo de 0 al 60% a lo largo de 120 minutos a una velocidad de flujo de 0,4 ml/min a 40ºC. La elución de los péptidos sometidos a tratamiento con tripsina fue controlada mediante la absorbancia a 214 nm.
La conjugación de un grupo PEG a un péptido sometido a tratamiento con tripsina fue detectada mediante la reducción del tamaño del correspondiente pico en un cromatograma, en comparación con el cromatograma producido a partir de una digestión con tripsina de la proteína no pegilada. Los resultados indicaron que el orden de reactividad de las aminas primarias (medido como el porcentaje de modificación de los péptidos primarios), de más reactivas a menos reactivas es:
F1 > K145, K140, K38, K158 > K120, K70.
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Se determinó que K41 y K115 no eran reactivas, basándose en el fracaso al detectar versiones modificadas de los correspondientes péptidos sometidos a tratamiento con tripsina. Los restos 168 y 172 de la variante B2036 no fueron capaces de reaccionar con PEG debido a que las lisinas de estas posiciones estaban remplazadas por diferentes aminoácidos. Ninguno de los restos más reactivos están en el Sitio 1. De hecho, las tres lisinas del Sitio 1 presentes en la hGH de tipo salvaje (K41, K168 y K172) no son reactivas (K41) o están ausentes de B2036 (K168 y K172). Por tanto, la pegilación de la variante B2036 no bloquea directamente la unión en el Sitio 1.
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Ejemplo XI Análisis Basado en Células de la Actividad Agonística de B2036 Pegilada
Se sometió a ensayo una preparación de PEG-4/5-variante B2036 producida como se describe en los Ejemplo V y VII en cuanto a la actividad en el análisis de dimerización basado en células descrito por Fuh, G. Y col., Science, 256: 1677-1680 (1992) y Colosi, P. Y col., J. Biol. Chem., 268: 12627-12629 (1993). Para producir las células empleadas en este análisis, el receptor de hGH completo fue transfectado establemente en una línea celular premieloide, FDC-P1 (Colosi, P. Y col., J. Biol. Chem., 268, 12617-12629 [1993]), que puede ser inducida a proliferar después en presencia de hGH. Las células fueron mantenidas en medio RPMI con suero de ternera fetal al 10% y hGH 2-5 nM. Las células fueron sometidas a ayuno durante cuatro horas en medio sin hGH, y después incubadas con concentraciones crecientes de variante hGH durante 10 horas a 37ºC. Se aplicó a las células un pulso de timidina[H^{3}] durante cuatro horas, se sometieron a lisis, y se analizó la síntesis de ADN mediante la cantidad de radiactividad unida a los filtros de nitrocelulosa. Fuh, G. Y col., Science, 256: 1677-1680 (1992). Ni B2036 ni PEG-4/5-B2036 estimularon la proliferación celular a cualquier concentración que oscilara entre 0,001 y 1,0 \mug/ml de variante de hGH.
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Ejemplo XII Análisis Basado en Células de la Actividad Antagónica de B2036 Pegilada
En un estudio diseñado para someter a ensayo la actividad antagónica, la variante B2036 no pegilada y la preparación de PEG-4/5-B2036, producida como se describe en los Ejemplos V y VII, fueron incubadas con 11 ng/ml de hGH recombinante y concentraciones crecientes de variante (10^{4} células/0,2 ml de volumen de análisis total). La concentración de variante requerida para bloquear 50% de la proliferación celular estimulada por hGH recombinante, es decir la concentración inhibidora semi-máxima (CI_{50}), fue calculada para ambas variantes. La CI_{50} para B2036 no pegilada fue de 0,19 \mug/ml, mientras la CI_{50} para PEG-4/5-B2036 fue de 13,01 \mug/ml.
En un experimento separado, se repitió el análisis (5 x 10^{3} células/0,15 ml de volumen de análisis total) para comparar la actividad antagónica de una preparación de PEG-4/5-variante B2036 con la de PEG(20.000)-variante B2036 y PEG2(20.000)-variante B2036. Estas variantes pegiladas fueron producidas como se describe en los Ejemplos VII, VIII, y IX, respectivamente. La CI_{50} para cada variante pegilada se expone en la Tabla 11.
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TABLA 11
29 
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Ejemplo XIII Actividad Antagónica In Vivo de las Variantes de hGH
Se estudió el efecto de inyecciones diarias de variantes de hGH antagónicas sobre los niveles de IGF en monos Rhesus. Las variantes de hGH sometidas a ensayo fueron una variante que contenía una sustitución G120K y las variantes B2036 y B2024. Además, se sometieron a ensayo las formas pegiladas de estas variantes, que tenían de cuatro a cinco moléculas de PEG(5.000). Se inyectaron subcutáneamente dosis diarias de 0,25 mg/kg de preparación de variante de hGH, formulada en 18,0 g/litro de manitol, 0,68 g/litro de glicina, fosfato de sodio 5 mM, pH 7,4, en dos monos Rhesus macho adolescentes por grupo de tratamiento. Se determinaron los niveles de IGF-1 mediante inmunoanálisis, como se describe en Amer. J. Primatology, 11: 53-62 (1986).
Los resultados se muestran en la Fig. 11. Se observaron descensos en el nivel de IGF-I a los siete días de la administración para todos los monos tratados con una variante de hGH, observándose el descenso más significativo en los monos tratados con PEG-4/5-B2036. A los 14 días, los niveles de IGF-I habían regresado a los niveles previos al tratamiento en monos tratados con la variante G120K y la variante B2024. Se observaron niveles de IGF-I reducidos en los monos tratados con las formas pegiladas de G120K y B2024 y con la variante no pegilada de B2036. Los niveles de IGF-I a los 14 días para los monos tratados con la preparación de PEG-4/5-variante B2036 fueron los mismos que el día siete. Los niveles de IGF-I el día 21 eran aproximadamente los mismos que los niveles de IGF-I el día siete para todos los grupos de tratamiento.
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Ejemplo XIV Actividad Antagónica In Vivo de la Preparación de PEG-4/5-Variante B2036: Farmacodinámica de Una Única Dosis
Se estudió el efecto de una única inyección de preparación de PEG-4/5-variante B2036 sobre los niveles de IGF-I en monos Rhesus. Se inyectó intravenosamente o subcutáneamente una única dosis de 1 mg/kg de preparación de PEG-4/5-variante B2036, producida como se describe en los Ejemplos V y VII y formulada en 18,0 g/litro de manitol, 0,68 g/litro de glicina, fosfato de sodio 5 mM, pH 7,4 a monos Rhesus macho adolescentes. El placebo consistió en 0,5 ml de tampón de formulación administrados subcutáneamente. Los niveles de IGF-I fueron determinados como en el Ejemplo XIII.
Los resultados se muestran en la Fig. 12. Con independencia de la ruta de administración, los niveles de IGF-I de todos los monos tratados con la preparación de PEG-4/5-variante B2036 se redujeron un día después de la administración, continuaron disminuyendo hasta cuatro días después de la administración, y permanecieron bajos durante todo el estudio de siete días.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Brian C. Cunningham
\hskip3.9cm
Henry B. Lowman 
\hskip3.9cm
James A. Wells 
\hskip3.9cm
Ross G. Clark 
\hskip3.9cm
Kenneth Olson 
\hskip3.9cm
Germaine G. Fuh 
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Variantes de la Hormona del Crecimiento Humana
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO SE SECUENCIAS: 19
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(iv)
DIRECCIONES DE CORRESPONDENCIA:
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(A)
DESTINATARIO: Skjerven, Morrill, MacPherson, Franklin & Friel
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(B)
CALLE: 25 Metro Drive, Suite 700
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(C)
CIUDAD: San José
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(D)
ESTADO: California
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(E)
PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 95110
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE CON EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: 3.5 pulgadas, disco flexible 1.44 Mb
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-OOS/MS-DOS
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(D)
SOPORTE LÓGICO: WinPatin (Genentech)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: M-2693-15P US
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-Sept-1996
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
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(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/537067
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-Sept-1995
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/537068
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-Sept-1995
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Emily M. Haliday
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 38.903
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: M-2693-15P US
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 408/453-9200
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 408/453-7979
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TÉLEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCACCTGAT GTCTAAGAAA C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTGAAGAGG CCTATATGGC CAAGGAACAG AAG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOCY: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAOAACCCCC ATTGACGTCC CTCTGTTTC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCCCAACGA GCAGNNSNNS TCGTTCNNSN NSAACCCGCA GACGT 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCGGGTTS NNSNNGAACG ASNNSNNCTC CTCCTTCGGG ATAT 
\hfill
44 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACCCCCAGA CGTCCCTCTG T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAACACAAC AGTAAAGGTA ACCTAGAGCT GCT 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
STRANDBDNESS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTCTTCAAG AGTTCAACTT CTCC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
STRANDRDNESS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
1000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
101 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCGTGCTC ACCCTCTTCA CCAGTTGGCC TTTG 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCACCACAT TCCTGCGCAC C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
STRAHDBDHESS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCTCGCGGC TCTTCCACAA CCCGATCCTG CGTGCT 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACTGCTTCA GGAAGGACAT GGACAACGTC AGC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCCCCATCG TCCAGTCC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCTCGAGGC TCTTCCACAA CGCGTGG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SMANDEDMESS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGACCTCCC TCTGTCCCTC AGAGTCTATT CCG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACACCCTCCA ACAAGRAGGA AACACAACAC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido Nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CUALIDAD DE LA HEBRA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAAAGCAAC AGATTCATTC ATTCTGGTGG AACCCCCAGA CCTCC 
\hfill
45

Claims (21)

1. Una variante de la hormona del crecimiento humana que comprende el siguiente grupo de sustituciones de aminoácidos: H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T.
2. La variante de la hormona del crecimiento humana de la reivindicación 1, donde la variante de la hormona del crecimiento humana está conjugada con uno o más grupos químicos que incrementan el peso molecular real de la variante de la hormona del crecimiento humana hasta entre 30 y aproximadamente 100 kilodaltons.
3. La variante de la hormona del crecimiento humana de la reivindicación 2, donde dicho grupo químico es poli(etilenglicol).
4. La variante de la hormona del crecimiento humana de la reivindicación 3, donde el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio de entre 500 y aproximadamente 30.000 daltons.
5. La variante de la hormona del crecimiento humana de la reivindicación 4, donde el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio de aproximadamente 5.000 daltons.
6. La variante de la hormona del crecimiento humana de la reivindicación 4, donde el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular medio de aproximadamente 20.000 daltons.
7. La variante de la hormona del crecimiento humana de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde dicha variante de la hormona del crecimiento humana está conjugada con entre aproximadamente cuatro y aproximadamente seis moléculas de poli(etilenglicol).
8. El uso de la variante de la hormona del crecimiento humana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es una variante agonística de la hormona de crecimiento humana, en la fabricación de un medicamento para incrementar el anabolismo o el crecimiento en un paciente.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicho paciente padece síndrome de Turner, deficiencia de hormona de crecimiento (GH), crecimiento lento o retardado, respuesta de IgF-1 a GH químicamente o naturalmente reducida, o trastornos inmunitarios incluyendo envejecimiento, quimioterapia o terapia con radiación, recuperación de una enfermedad principal, preparación para cirugía, SIDA, deficiencias congénitas y adquiridas de células B.
10. La variante de la hormona de crecimiento humana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene una sustitución de aminoácido adicional en G120 que interrumpe la unión del sitio 2 a un receptor de la hormona de crecimiento.
11. El uso de la variante de la hormona de crecimiento humana de la reivindicación 10, en la fabricación de un medicamento para inhibir la acción de la hormona de crecimiento en un paciente.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, donde el paciente tiene acromegalia, gigantismo, diabetes y sus complicaciones incluyendo retinopatía diabética y nefropatía diabética, enfermedades oculares vasculares que implican neovascularización proliferativa y malignidades sensibles a GH.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, donde el paciente tiene un tumor de Wilm, sarcomas que incluyen sarcoma osteogénico, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, linfoma de Burkitt, carcinoma de pulmón, carcinoma colorrectal, leucemia linfoblástica y melanoma.
14. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de la hormona de crecimiento humana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 10.
15. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 14.
16. Una célula anfitriona aislada que comprende el vector de la reivindicación 15.
17. Un procedimiento para preparar una variante de la hormona de crecimiento humana que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 16 y recuperar la variante de la hormona de crecimiento humana del cultivo.
18. Un método para producir una variante de la hormona del crecimiento humana pegilada, que comprende:
(a)
pegilar la variante de la hormona del crecimiento humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 10;
(b)
aplicar la variante de la hormona del crecimiento humana pegilada a una columna de cromatografía de intercambio catiónico; y
(c)
eluir la variante de la hormona del crecimiento humana pegilada.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una variante de la hormona del crecimiento humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 10.
20. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, que comprende también un portador, excipiente o estabilizador farmacéutico.
21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, donde dicho portador farmacéutico puede ser seleccionado entre glicina, manitol y fosfato.
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