BR112021004488A2 - conjugados de polipeptídeo de interleucina-2 e seus usos - Google Patents

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Abstract

A presente invenção fornece métodos para direcionar células que expressam receptor de interleucina-2 e, em particular, inibir o crescimento de tais células usando uma variante de interleucina-2 (IL-2) conjugada a uma molécula biologicamente ativa que afetará as células que expressam o receptor de interleucina-2.

Description

“CONJUGADOS DE POLIPEPTÍDEO DE INTERLEUCINA-2 E SEUS USOS”
REFERÊNCIA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[001]Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos EUA Nos 62/729.925 e 62/815.964, cada um intitulado “Conjugados de polipeptídeo de interleucina-2 e Seus usos” depositado em 11 de setembro de 2018, e 8 de março de 2019 respectivamente, os conteúdos de cada um dos quais são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002]O pedido instantâneo contém uma Listagem de Sequência que foi submetida em formato ASCII via EFS-Web e é incorporada por meio deste por referência em sua totalidade. A cópia ASCII criada em 11 de setembro de 2019 se chama AMBX_0227_PCT_ST25.txt e tem 27.729 bytes.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003]A presente invenção fornece métodos para modular as atividades biológicas de interleucina-2 e, em particular, modular as interações de receptor específicas usando uma variante de interleucina-2 (IL-2) conjugada a um polímero nas posições nas sequência de aminoácido da proteína de IL-2 que interage com o receptor de interleucina-2.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] O câncer é uma das condições de saúde mais significativas. Nos Estados Unidos, o câncer perde apenas para as doenças cardíacas em mortalidade, respondendo por uma das quatro mortes. É amplamente esperado que a incidência de câncer aumente com o envelhecimento da população dos Estados Unidos, aumentando ainda mais o impacto dessa condição. Os atuais regimes de tratamento do câncer, estabelecidos nas décadas de 1970 e 1980, não mudaram drasticamente.
Esses tratamentos, que incluem quimioterapia, radiação e outras modalidades, incluindo novas terapias direcionadas, mostraram benefício de sobrevida geral limitado quando utilizados em cânceres comuns em estágio mais avançado, uma vez que, entre outras coisas, essas terapias visam principalmente a massa tumoral alvo.
[005]Mais especificamente, o diagnóstico de câncer convencional e as terapias até o momento têm tentado detectar e erradicar seletivamente as células neoplásicas que são amplamente de crescimento rápido (isto é, células que formam a massa tumoral). Os regimes de oncologia padrão tem sido amplamente projetados para administrar a maior dose de irradiação ou um agente quimioterápico sem toxicidade indevida, isto é, muitas vezes denominado como a “dose máxima tolerada” (MTD) ou “nenhum nível de efeito adverso observado” (NOAEL). Muitas quimioterapias convencionais de câncer (por exemplo, agentes alquilantes, como ciclofosfamida, antimetabólitos, como 5-fluorouracila, e alcaloides vegetais, como vincristina) e terapias de irradiação convencionais exercem seus efeitos tóxicos nas células cancerosas, em grande parte interferindo nos mecanismos celulares envolvidos no crescimento celular e na replicação de DNA. Os protocolos de quimioterapia também envolvem frequentemente a administração de uma combinação de agentes quimioterápicos na tentativa de aumentar a eficácia do tratamento. Apesar da disponibilidade de uma grande variedade de agentes quimioterápicos, essas terapias têm muitos inconvenientes. Por exemplo, os agentes quimioterápicos são notoriamente tóxicos devido a efeitos colaterais não específicos em células de crescimento rápido, sejam normais ou malignas; por exemplo, agentes quimioterápicos causam efeitos colaterais significativos e muitas vezes perigosos, incluindo depressão da medula óssea, imunossupressão e desconforto gastrointestinal, etc.
Células Tronco Cancerosas
[006]As células tronco cancerosas compreendem uma subpopulação única (frequentemente 0,1 a 10 % ou mais) de um tumor que, em relação aos 90 % restantes ou mais do tumor (isto é, a massa tumoral), são mais tumorigênicas, relativamente mais lentas crescendo ou quiescente, e muitas vezes relativamente mais quimiorresistente do que o volume tumoral. Dado que as terapias e regimes convencionais foram, em grande parte, concebidos para atacar células de proliferação rápida (isto é, as células cancerosas que constituem a massa tumoral), as células tronco cancerosas que costumam ter crescimento lento podem ser relativamente mais resistentes do que a massa tumoral de crescimento mais rápido às terapias e regimes convencionais. As células tronco cancerosas podem expressar outras características que as tornam relativamente quimiorresistentes, como resistência a múltiplos fármacos e vias anti-apoptóticas. O acima mencionado constituiria uma das principais razões para o fracasso dos regimes de tratamento oncológico padrão para garantir o benefício de longo prazo na maioria dos pacientes com cânceres em estágio avançado, isto é, a falha em direcionar e erradicar adequadamente as células tronco cancerosas. Em alguns casos, uma célula tronco cancerosa é a célula fundadora de um tumor (isto é, é o progenitor das células cancerosas que compõem a massa tumoral).
[007]A IL-2 tem sido usada no tratamento de vários cânceres como carcinoma de células renais e melanoma metastático. A IL-2 comercialmente disponível Aldesleukin® é uma proteína recombinante que não é glicosilada e tem uma alanina- 1 removida e um resíduo substituído de cisteína-125 por serina-125 (Whittington et al., 1993). Embora a IL-2 seja a primeira citocina aprovada pela FDA no tratamento do câncer, foi demonstrado que a IL-2 exibiu efeitos colaterais graves quando usada em altas doses. Isso limitou muito sua aplicação em pacientes potenciais. O mecanismo subjacente dos efeitos colaterais graves foi atribuído à ligação de IL-2 a um de seus receptores, IL-2Rα. Em geral, a IL-2 não só pode formar um complexo heterotrimérico com seus receptores, incluindo IL-2Rα (ou CD25), IL-2Rβ (ou CD122) e IL-2Rγ (ou CD132) quando todos os três receptores estão presentes no tecido, mas também pode formar complexo heterodimérico com IL-2Rβ e IL-2Rγ. Em ambientes clínicos, quando altas doses de IL-2 são usadas, IL-2 começa a se ligar a IL-2αβγ, que é a principal forma de receptor nas células Treg. O efeito supressor das células Treg causa efeitos indesejáveis da aplicação de IL-2 na imunoterapia contra o câncer. Para mitigar os efeitos colaterais da IL-2, muitas abordagens foram empregadas anteriormente. Uma forma de IL-2 foi feita pela Nektar que usa 6 lisinas PEGuiladas para mascarar a região de ligação de IL2Rα na superfície de IL-2 (Charych et al., 2016). Esta forma de IL-2 PEGuilada tem uma meia-vida estendida, compreende uma mistura de formas PEGuiladas simples e múltiplas, contém uma quantidade muito grande de PEG, mas também mostrou efeitos colaterais melhorados. No entanto, os resultados dos estudos de atividade mostraram que a forma eficaz de IL-2 PEGuilada nesta mistura heterogênea de IL-2 6-PEGuilada é a única forma PEGuilada apenas. Portanto, é necessária uma IL-2 PEGuilada mais eficaz com uma composição bem definida homogênea do produto que modula os efeitos colaterais da IL-2.
[008]A capacidade de incorporar aminoácidos não codificados geneticamente em proteínas permite a introdução de grupos funcionais químicos que poderiam fornecer alternativas valiosas para os grupos funcionais de ocorrência natural, como o épsilon -NH2 da lisina, o sulfidril -SH da cisteína , o grupo imino da histidina, etc. Certos grupos funcionais químicos são conhecidos por serem inertes para os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos geneticamente codificados comuns, mas reagem de forma limpa e eficiente para formar ligações estáveis. Os grupos azida e acetileno, por exemplo, são conhecidos na técnica por sofrerem uma reação de cicloadição de Huisgen [3 + 2] em condições aquosas na presença de uma quantidade catalítica de cobre. Consultar, por exemplo, Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem.
67:3057-3064; e, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Ao introduzir uma porção de azida em uma estrutura de proteína, por exemplo, é possível incorporar um grupo funcional que é quimicamente inerte a aminas, sulfidrilas, ácidos carboxílicos, grupos hidroxila encontrados em proteínas, mas que também reage de maneira suave e eficiente com uma porção de acetileno para formar um produto de cicloadição. É importante ressaltar que na ausência da porção de etileno, a azida permanece quimicamente inerte e não reativa na presença de outras cadeias laterais de proteínas e sob condições fisiológicas.
[009]A presente invenção aborda, entre outras coisas, problemas associados com a atividade e produção de conjugados de polipeptídeo de IL-2, e também aborda a produção de polipeptídeos de IL-2 com propriedades biológicas ou farmacológicas aprimoradas, como atividade aprimorada contra tumores e/ou conjugação aprimorada e/ou meia-vida terapêutica aprimorada. Os polipeptídeos de IL-2 da presente invenção direcionam tanto as células Treg conhecidas para expressar os receptores de IL-2 triméricos, (alfa, beta e gama), e células CD8 que expressam principalmente dímeros beta e gama de receptores de IL-2. Os polipeptídeos de IL-2 da presente invenção reduzem a ligação ao receptor alfa de células Treg e promovem a ligação tendenciosa aos dímeros beta e gama de células CD8, desse modo fornecendo aplicação terapêutica aprimorada e prognóstico aprimorado para doenças ou condições em que o receptor de IL-2 alfa é altamente expresso.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[010]A presente invenção se refere a polipeptídeos de interleucina-2 (IL-2) com um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente. A invenção ainda se refere a conjugados de polipeptídeo de IL-2 com um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente. A invenção ainda se refere a conjugados de polipeptídeo de IL-2 em que um polímero solúvel em água, tal como PEG, é conjugado a uma variante de IL-2 através de um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente dentro da variante de IL-2. A invenção ainda se refere a conjugados de polipeptídeo de IL-2 com um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente e uma ou mais substituições de aminoácido natural. A invenção ainda se refere a conjugados de polipeptídeo de
IL-2 com um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente e uma ou mais substituições de aminoácido natural e uma ou mais moléculas de PEG.
[011]A presente invenção fornece métodos de modular as interações de receptor de um polipeptídeo de IL-2 da presente invenção. A presente invenção fornece métodos de inibir ou reduzir a interação de IL-2 PEGuilada com a subunidade de IL2Rα do receptor de IL-2 trimérico usando um polipeptídeo de IL-2 PEGuilada da presente invenção.
[012]Em uma modalidade, o PEG-IL-2 é monopeguilado. Em uma modalidade, o PEG-IL-2 é dipeguilado. Em uma modalidade, o PEG-IL-2 tem mais do que duas (2) moléculas de poli(etileno)glicol ligadas a ele. Uma outra modalidade da presente invenção fornece métodos de usar os polipeptídeos de PEG-IL-2 da presente invenção para modular a atividade de células do sistema imune.
[013]Nesta ou qualquer uma das modalidades da presente invenção, o PEG- IL-2 pode compreender a interleucina-2 humana de comprimento total, madura (sem o peptídeo de sinal), ligada a um polímero de PEG. Nesta ou qualquer uma das modalidades da presente invenção, o PEG-IL-2 pode compreender a interleucina-2 humana de comprimento total, madura (sem o peptídeo de sinal), ligada a um polímero de PEG ou outra molécula biologicamente ativa por uma ligação covalente. Em algumas modalidades, a molécula biologicamente ativa é modificada, como um exemplo não limitativo, a molécula biologicamente ativa pode incluir um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente.
[014]Em conjugados de PEG-IL2, o PEG ou outro polímero solúvel em água pode ser conjugado diretamente à proteína de IL-2 ou à molécula biologicamente ativa ou por meio de um ligante. Os ligantes adequados incluem, por exemplo, ligantes cliváveis e não cliváveis.
[015]A invenção fornece um método para o tratamento de câncer em mamíferos, por exemplo, mamíferos incluindo, mas não se limitando a aqueles com uma ou mais das seguintes condições: tumor sólido, tumor hematológico, câncer de cólon, câncer de ovário, câncer de mama, melanoma, câncer de pulmão, glioblastoma e leucemia, pela administração de uma quantidade eficaz de polipeptídeos de PEG- IL-2. Em algumas modalidades, o câncer é caracterizado por altos níveis de células Treg. Em algumas modalidades, o câncer é caracterizado pela alta expressão do receptor alfa de IL-2. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para o tratamento de um câncer ou condição ou doença pela administração a um sujeito de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um polipeptídeo de IL-2 da invenção. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença hereditária pela administração a um paciente de uma quantidade eficaz de uma composição de IL-2 da invenção. Em algumas modalidades, a condição ou doença é caracterizada por alta expressão do receptor alfa de IL-2. Em algumas modalidades, a condição ou doença é caracterizada por altos níveis de células Treg. Em algumas modalidades, o câncer, condição ou doença é tratada reduzindo, bloqueando ou silenciando a expressão alfa do receptor de IL-2. Em algumas modalidades, o câncer, condição ou doença é tratada reduzindo a ligação do receptor alfa de IL-2 na superfície das células Treg, resultando na redução da proliferação de células Treg no câncer, condição ou doença a ser tratada.
[016]Como usado neste documento, a interleucina 2 ou IL-2 é definida como uma proteína que (a) tem uma sequência de aminoácido substancialmente idêntica a uma sequência conhecida de IL-2, incluindo muteínas de IL-2, uma sequência de IL- 2 madura (isto é, sem uma sequência líder secretora), e IL-2 como divulgado em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, ou 7 deste pedido e (b) tem pelo menos uma atividade biológica que é comum para IL-2 de tipo selvagem ou nativa. Para os fins desta invenção, tanto IL-2 glicosilada (por exemplo, produzido em células eucarióticas tal como levedura ou células CHO) quanto não glicosilada (por exemplo, sintetizado ou produzido quimicamente em E. coli) são equivalentes e podem ser usados permutavelmente.
Também estão incluídos outros mutantes e outros análogos, incluindo IL-2 viral, que retém a atividade biológica de IL-2.
[017]Esta invenção fornece conjugado de polipeptídeos de IL-2 a um ou mais polímeros solúveis em água em que o polipeptídeo de IL-2 PEGuilada é também ligado a um outro fármaco ou molécula biologicamente ativa, e em que o polipeptídeo de IL-2 compreende um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente. A invenção também fornece monômeros e dímeros de polipeptídeos de IL-2. A invenção também fornece trímeros de polipeptídeos de IL-2. A invenção fornece multímeros de polipeptídeos de IL-2. A invenção também fornece dímeros de IL-2 compreendendo um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente. A invenção fornece multímeros de IL-2 compreendendo um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente. A invenção fornece multímeros de IL-2 homogêneos compreendendo um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente, em que cada polipeptídeo de IL-2 tem a mesma sequência de aminoácido. A invenção fornece multímeros de IL-2 heterogêneos, em que pelo menos um dos polipeptídeos de IL-2 compreende pelo menos um aminoácido codificado não naturalmente, em que qualquer ou cada um dos polipeptídeos de IL-2 no multímero pode ter diferentes sequências de aminoácido.
[018]Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IL-2 compreendem um ou mais modificações de pós-tradução. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL- 2 está ligado a um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa. Em algumas modalidades, os monômeros de IL-2 são homogêneos. Em algumas modalidades, os dímeros de IL-2 são homogêneos. Em algumas modalidades, os multímeros de IL-2 são conjugados a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, os multímeros de IL-2 são conjugados a dois polímeros solúveis em água. Em algumas modalidades, os multímeros de IL-2 são conjugados a três polímeros solúveis em água. Em algumas modalidades, os multímeros de IL-2 são conjugados a mais do que três polímeros solúveis em água. Em algumas modalidades, quando o polipeptídeo de IL-2 está ligado a um ligante longo o suficiente para permitir a formação de um dímero. Em algumas modalidades, quando o polipeptídeo de IL-2 está ligado a um ligante longo o suficiente para permitir a formação de um trímero.
Em algumas modalidades, quando o polipeptídeo de IL-2 está ligado a um ligante longo o suficiente para permitir a formação de um multímero. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 está ligado a um polímero bifuncional, ligante bifuncional, ou pelo menos um polipeptídeo de IL-2 adicional. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IL-2 compreendem uma ou mais modificações de pós-tradução. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 está ligado a um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa.
[019]Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma porção de poli(etilenoglicol) (PEG). Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente está ligado ao polímero solúvel em água com um ligante ou está ligado ao polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) é um polímero bifuncional. Em algumas modalidades, o polímero bifuncional está ligado a um segundo polipeptídeo.
Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é IL-2. Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende pelo menos dois aminoácidos ligados a um polímero solúvel em água compreendendo uma porção de poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, pelo menos um aminoácido é um aminoácido codificado não naturalmente.
[020] Em uma modalidade, a IL-2 ou PEG-IL-2 da presente invenção está ligada a um agente terapêutico, tal como um agente imunomodulador. O agente imunomodulador pode ser qualquer agente que exerce um efeito terapêutico em células imunes que pode ser usado como um agente terapêutico para conjugação a uma IL-2, PEG-IL-2 ou variante de IL-2.
[021]Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante das mesmas: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ou adicionado ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 2 ou o aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas biologicamente ativas são diretamente conjugadas à variante de IL-2. Em algumas modalidades, as uma ou mais moléculas biologicamente ativas são conjugadas aos um ou mais aminoácidos codificado de forma não natural no polipeptídeo de IL-2. Em algumas modalidades, a variante de IL-2 da presente invenção está ligada a um ligante. Em algumas modalidades, a variante de IL-2 ligada a um ligante compreende ainda uma molécula biologicamente ativa. Em algumas modalidades da presente invenção, a IL-2 no ligante está ligada a um aminoácido codificado não naturalmente.
[022]Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante dos mesmos: posição 3, 32, 35, 37, 38, 42, 43, 44, 45, 48, 49, 61, 62, 64, 65, 68, 72, 76, e 107, e qualquer combinação das mesmas (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante dos mesmos: antes da posição 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e
107, e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 2, ou o aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante dos mesmos: posição 35, 37, 42, 45, 49,
61 ou 65, e qualquer combinação das mesmas (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades,
um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante dos mesmos: posição 45, 61, e
65, e qualquer combinação das mesmas (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades,
um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante dos mesmos: posição 45, e 65,
e qualquer combinação das mesmas (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 3 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 32 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 35 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 37 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 38 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 41 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 42 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 43 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 44 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 45 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 48 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 49 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 61 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 62 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 64 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 65 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 68 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 72 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 76 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
Em algumas modalidades um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados na posição 107 em IL-2 ou uma variante dos mesmos da invenção.
[023]Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em qualquer posição em uma ou mais das seguintes regiões correspondentes a estruturas secundárias ou aminoácidos específicos em IL- 2 ou uma variante dos mesmos como a seguir: nos sítios de interações hidrofóbicas; em ou em proximidade aos sítios de interação com subunidades de receptor de IL-2 incluindo IL2Rα; dentro de posições de aminoácido 3 ou 35 a 45; dentro dos primeiros 107 aminoácidos N-terminais; dentro de posições de aminoácido 61 a 72; cada um de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de IL-2 ou uma variante dos mesmos: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO: 2, ou o aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de IL-2 ou uma variante dos mesmos: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ou adicionado ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO: 2, ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7.
[024]Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais dessas posições em IL-2 ou uma variante do mesmo está ligada a um fármaco ou outra molécula biologicamente ativa, incluindo mas não se limitando a, posições: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ou adicionado ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7).
[025]Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais dessas posições em IL-2 ou uma variante do mesmo está ligado a um fármaco ou outra molécula biologicamente ativa, incluindo mas não se limitando a, nos sítios de interações hidrofóbicas; em ou em proximidade aos sítios de interação com subunidades de receptor de IL-2 incluindo IL2Rα; dentro de posições de aminoácido 3 ou 35 a 45; dentro dos primeiros 107 aminoácidos N-terminais; dentro de posições de aminoácido 61-72; cada um de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7. Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais dessas posições em IL-2 ou uma variante do mesmo está ligada a um fármaco ou outra molécula biologicamente ativa, incluindo mas não se limitando a, posições: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO: 2, ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7. Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais dessas posições em IL-2 ou uma variante do mesmo está ligada a um fármaco ou outra molécula biologicamente ativa, incluindo mas não se limitando a, posições de IL-2 ou uma variante das mesmas: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,
79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ou adicionado ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO: 2, ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante dos mesmos e está ligado a um fármaco ou outra molécula biologicamente ativa: posição 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 2 ou o aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7).
[026]Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais dessas posições em IL-2 ou uma variante do mesmo está ligada a um ligante, incluindo mas não se limitando a, posições: antes da posição 1 (isto é, no N- terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ou adicionado ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante dos mesmos e ligados a um ligante: posição 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 2 ou o aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7).
[027]Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais dessas posições em IL-2 ou uma variante do mesmo está ligado a um ligante que é ainda mais ligado a um polímero solúvel em água ou uma molécula biologicamente ativa, incluindo mas não se limitando a, posições: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ou adicionado ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante dos mesmos e está ligado a um ligante que é ainda mais ligado a um polímero solúvel em água ou uma molécula biologicamente ativa, incluindo mas não se limitando a, posições: antes da posição 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107, e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 2 ou o aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7).
[028]Em algumas modalidades, o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais dessas posições em IL-2 ou uma variante do mesmo está ligada a um polímero solúvel em água, incluindo mas não se limitando a, posições: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86,
87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ou adicionado ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante dos mesmos e está ligado a um ligante que é ainda mais ligado a um polímero solúvel em água incluindo, mas não se limitando a, posições: 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 2 ou o aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7).
[029]Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a afinidade da IL-2 para uma subunidade de receptor de IL-2 ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a afinidade da IL-2 ou uma variante da mesma para um receptor de IL-2 ou parceiro de ligação incluindo, mas não se limitando a, uma proteína, polipeptídeo, lipídeo, ácido graxo, molécula pequena, ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a estabilidade da IL-2 ao comparar com a estabilidade da IL-2 correspondente sem a substituição, adição ou deleção.
Estabilidade e/ou solubilidade pode ser medida usando vários diferentes ensaios conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica. Tais ensaios incluem, mas não estão se limitando a SE-HPLC e RP-HPLC. Em algumas modalidades, a IL-2 compreende uma substituição, adição ou deleção que modula a imunogenicidade da IL-2 ao comparar com a imunogenicidade da IL-2 correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, a IL-2 compreende uma substituição,
adição ou deleção que modula a meia-vida sérica ou tempo de circulação da IL-2 ao comparar com a meia-vida sérica ou tempo de circulação da IL-2 correspondente sem a substituição, adição ou deleção.
[030]Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a solubilidade aquosa da IL-2 ao comparar com a solubilidade aquosa da IL-2 correspondente ou uma variante da mesma sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a solubilidade da IL-2 ou uma variante da mesma produzida em uma célula hospedeira ao comparar com a solubilidade da IL-2 correspondente ou uma variante da mesma sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a expressão da IL-2 em uma célula hospedeira ou aumenta a síntese in vitro ao comparar com a expressão ou síntese da IL-2 correspondente ou uma variante da mesma sem a substituição, adição ou deleção. A IL-2 ou uma variante da mesma compreendendo essa substituição retém atividade agonista e retém ou melhora níveis de expressão em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a resistência à protease da IL-2 ou uma variante da mesma ao comparar com a resistência à protease da IL-2 correspondente ou uma variante da mesma sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma substituição, adição ou deleção que modula atividade de transdução de sinal do receptor de IL-2 ao comparar com a atividade do receptor após interação com a IL-2 correspondente ou uma variante dos mesmos sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma substituição, adição ou deleção que modula sua ligação a uma outra molécula tal como um receptor ao comparar com a ligação da IL-2 correspondente sem a substituição, adição ou deleção.
[031]Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para tratar uma condição proliferativa, câncer, tumor ou condição pré-cancerosa, como uma displasia, com PEG-IL-2 e pelo menos um agente terapêutico ou diagnóstico adicional. O agente terapêutico adicional pode ser, por exemplo, uma citocina ou antagonista de citocina, tal como IL-12, interferon-alfa ou receptor de fator de crescimento anti-epidérmico, doxorrubicina, epirrubicina, um anti-folato, por exemplo, metotrexato ou fluoruracila, irinotecano, ciclofosfamida, radioterapia, terapia hormonal ou anti-hormonal, por exemplo, androgênio, estrogênio, antiestrogênio, flutamida ou dietilestilbestrol, cirurgia, tamoxifeno, ifosfamida, mitolactol, um agente alquilante, por exemplo, melfalano ou cis-platina, etoposídeo, vinorelbina, vimblastina, vindesina, um glicocorticoide, um antagonista do receptor de histamina, um inibidor da angiogênese, radiação, um sensibilizador de radiação, antraciclina, alcaloide de vinca, taxano, por exemplo, paclitaxel e docetaxel, um inibidor do ciclo celular, por exemplo, um inibidor de quinase dependente de ciclina, um inibidor de ponto de verificação, um fármaco imunimodulador, um fármaco imunoestimulador, um anticorpo monoclonal contra outro antígeno tumoral, um complexo de anticorpo monoclonal e molécula biologicamente ativa, um adjuvante de células T, transplante de medula óssea ou células de apresentação de antígeno, por exemplo, terapia com células dendríticas.
As vacinas podem ser fornecidas, por exemplo, como uma proteína solúvel ou como um ácido nucleico que codifica a proteína (consultar, por exemplo, Le, et al., supra; Greco e Zellefsky (eds.) (2000) Radiotherapy of Prostate Cancer, Harwood Academic, Amsterdam; Shapiro e Recht (2001) New Engl. J. Med. 344: 1997- 2008; Hortobagyi (1998) New Engl. J. Med. 339: 974-984; Catalona (1994) New Engl. J. Med. 331: 996- 1004; Naylor e Hadden (2003) Int. Immunopharmacol. 3: 1205- 1215; The Int. Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group (2004) New Engl. J. Med. 350: 351-360;
Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344: 783-792; Kudelka, et al. (1998) New Engl. J. Med. 338: 991-992; van Netten, et al. (1996) New Engl. J. Med. 334: 920-92).
[032]Também são fornecidos métodos de tratamento da hematopoiese extramedular (HEM) do câncer. EMH é descrito (consultar, por exemplo, Rao, et al.
(2003) Leuk. Lymphoma 44: 715-718; Lane, et al. (2002) J. Cutan. Pathol. 29: 608- 612).
[033]Em algumas modalidades, o PEG-IL-2 ou uma variante do mesmo compreende uma substituição, adição ou deleção que modula ligação do seu receptor ou subunidade de receptor em comparação com o receptor ou atividade de ligação da subunidade de receptor da IL-2 correspondente ou uma variante da mesma sem a substituição, adição ou deleção. Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma substituição, adição ou deleção que inibe sua atividade relacionada ao receptor ou ligação da subunidade de receptor como em comparação com o receptor ou atividade de ligação da subunidade de receptor da IL-2 correspondente ou uma variante da mesma sem a substituição, adição ou deleção.
[034]Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma substituição, adição ou deleção que aumenta a compatibilidade da IL-2 ou variante da mesma com conservantes farmacêuticos (por exemplo, m-cresol, fenol, álcool benzílico) ao comparar com a compatibilidade da IL-2 do tipo selvagem correspondente sem a substituição, adição ou deleção. Esta compatibilidade aumentada permitiria a preparação de um formulação farmacêutica preservada que mantém as propriedades fisioquímicas e atividade biológica da proteína durante o armazenamento.
[035]Em algumas modalidades, uma ou mais ligações projetadas são criadas com um ou mais aminoácidos não naturais. A ligação intramolecular pode ser criada em muitas maneiras incluindo, mas não se limitando a, uma reação entre dois aminoácidos na proteína sob condições adequadas (um ou ambos os aminoácidos podem ser um aminoácido não natural); uma reação com dois aminoácidos, cada um dos quais pode ser naturalmente codificado ou codificado não naturalmente, com um ligante, polímero, ou outra molécula sob condições adequadas; etc.
[036]Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante da mesma pode ser com um ou mais aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante da mesma podem ser com aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, desde que pelo menos uma substituição seja com um aminoácido codificado não naturalmente. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante da mesma podem ser com um ou mais aminoácidos de ocorrência natural, e adicionalmente pelo menos uma substituição é com um aminoácido codificado não naturalmente. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido em IL-2 ou uma variante das mesmas podem ser com qualquer aminoácido de ocorrência natural e pelo menos uma substituição com um aminoácido codificado não naturalmente. Em algumas modalidades, um ou mais natural aminoácidos podem ser substituídos em uma ou mais das seguintes posições de IL-2 ou uma variante dos mesmos: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e qualquer combinação dos mesmos (de SEQ ID NO: 2, ou o aminoácido correspondente posições em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácido natural podem ser em uma ou mais das seguintes posições de IL-2 ou uma variante das mesmas: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131,
132, 133, ou adicionado ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação das mesmas (de SEQ ID NO: 2, ou as posições de aminoácido correspondente em SEQ
ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-
2 ou uma variante da mesma podem ser com pelo menos um aminoácido de ocorrência natural e pelo menos uma substituição com um aminoácido codificado não naturalmente.
Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante da mesma podem ser com pelo menos dois aminoácidos de ocorrência natural e pelo menos uma substituição com um aminoácido codificado não naturalmente.
Em algumas modalidades, os um ou mais aminoácidos de ocorrência natural ou codificados podem ser qualquer um dos 20 aminoácidos comuns incluindo,
mas não se limitando a, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína,
glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
Em algumas modalidades, a pelo menos uma substituição de aminoácido de ocorrência natural pode estar nas seguintes posições de IL-2 ou uma variante da mesma: posição 38, 46 ou 65. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido de ocorrência natural pode estar na posição 38 de IL-2 ou uma variante dos mesmos.
Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 38 de IL-
2 ou uma variante da mesma pode ser selecionada a partir de qualquer um dos 20 aminoácidos naturais comuns incluindo, mas não se limitando a, alanina, arginina,
asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina,
isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano,
tirosina e valina.
Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 38 de IL-2 ou uma variante da mesma pode ser uma substituição de alanina.
Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido de ocorrência natural pode estar na posição 46 de IL-2 ou uma variante da mesma.
Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição
46 de IL-2 ou uma variante da mesma pode ser selecionada a partir de qualquer um dos 20 aminoácidos naturais comuns incluindo, mas não se limitando a, alanina,
arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina,
histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina,
triptofano, tirosina e valina.
Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 46 de IL-2 ou uma variante da mesma pode ser uma leucina ou uma substituição de isoleucina.
Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido de ocorrência natural pode estar na posição 65 de IL-2 ou uma variante da mesma.
Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 65 de IL-2 ou uma variante da mesma pode ser selecionada a partir de qualquer um dos 20 aminoácidos naturais comuns incluindo, mas não se limitando a, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico,
glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina,
treonina, triptofano, tirosina e valina.
Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 65 de IL-2 ou uma variante da mesma pode ser uma substituição de arginina.
Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 38, 46 ou 65 e pelo menos uma substituição com um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante das mesmas: posição 3, 35, 37,
38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107, e qualquer combinação dos mesmos (de SEQ ID NO: 2, ou as posições de aminoácido correspondente em SEQ
ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-
2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 38 e pelo menos uma substituição com um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em uma ou mais das seguintes posições em
IL-2 ou uma variante das mesmas: posição 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62,
64, 65, 68, 72, e 107, e qualquer combinação das mesmas (de SEQ ID NO: 2, ou as posições de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 46 e pelo menos uma substituição com um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante das mesmas:
posição 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107, e qualquer combinação das mesmas (de SEQ ID NO: 2, ou as posições de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 65 e pelo menos uma substituição com um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante das mesmas: posição 3, 35, 37,
38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107, e qualquer combinação dos mesmos (de SEQ ID NO: 2, ou as posições de aminoácido correspondente em SEQ
ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-
2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 38 e/ou 46 e/ou 65 e pelo menos uma substituição com um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante das mesmas: posição 3, 35, 37, 38, 41,
42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107, e qualquer combinação dos mesmos (de
SEQ ID NO: 2, ou as posições de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5,
ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 38 e um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em
IL-2 ou uma variante do mesmo na posição 42 (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades,
as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural nas posições 38 e 46 e um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em IL-2 ou uma variante do mesmo na posição 42 (de SEQ ID NO: 2, ou na posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural nas posições 38 e 65 e um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em IL-2 ou uma variante do mesmo na posição 42 (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural nas posições 38, 46 e 65, e um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em IL-2 ou uma variante do mesmo na posição 42 (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ
ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-
2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 38 e um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em IL-2 ou uma variante do mesmo na posição 45 (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural nas posições 38 e
46 e um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em IL-2 ou uma variante do mesmo na posição 45 (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante das mesmas pode ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural nas posições 38 e 65 e um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em IL-2 ou uma variante do mesmo na posição 45 (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural nas posições 38, 46 e 65, e um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em IL-2 ou uma variante do mesmo na posição 45 (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL- 2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural na posição 38 e um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em IL-2 ou uma variante do mesmo na posição 65 (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7). Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido na IL-2 ou uma variante das mesmas podem ser uma substituição de aminoácido de ocorrência natural nas posições 38 e 46 e um aminoácido codificado não naturalmente incorporado em IL-2 ou uma variante do mesmo na posição 65 (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7).
[037]Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo carbonila, um grupo acetila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alcino.
[038]Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo carbonila. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente tem a estrutura: (CH2)nR1COR2 R3HN COR4 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída, ou arila substituída; R2 é H, uma alquila, arila, alquila substituída, e arila substituída; e R3 é H,
um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação do terminal amino, e R4 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
[039]Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo aminoóxi. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo hidrazida. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo hidrazina. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo semicarbazida.
[040]Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo azida. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente tem a estrutura: (CH2)nR1X(CH2)mN3 R2HN COR3 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída, arila substituída ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 a 10; R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
[041]Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo alcino. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente tem a estrutura: (CH2)nR1X(CH2)mCCH R2HN COR3 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída, ou arila substituída; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 a 10, R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo, ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
[042]Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um agonista de IL-2, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso. Em algumas modalidades, o agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso de IL-2 compreende um aminoácido codificado não naturalmente ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma porção de poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, o agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial ou agonista inverso de IL- 2 compreende um aminoácido codificado não naturalmente e uma ou mais modificações pós-tradução, ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa.
[043]A presente invenção também fornece ácidos nucleicos isolados compreendendo um polinucleotídeo que codifica polipeptídeos de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, ou 7 e a presente invenção fornece ácidos nucleicos isolados compreendendo um polinucleotídeo que hibridiza sob condições severas para os polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, ou 7. A presente invenção também fornece ácidos nucleicos isolados compreendendo um polinucleotídeo que codifica polipeptídeos mostrados como SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, ou 7 em que o polinucleotídeo compreende pelo menos um códon seletor. A presente invenção também fornece ácidos nucleicos isolados compreendendo um polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos mostrados como SEQ ID NOs.: 1, 2, 3, 5, ou 7 com um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente. É prontamente aparente pela pessoa de habilidade comum na técnica que vários diferentes polinucleotídeos podem codificar qualquer polipeptídeo da presente invenção.
[044]Em algumas modalidades, o códon seletor é selecionado a partir do grupo que consiste em um códon âmbar, códon ocre, códon opala, um códon único, um códon raro, um códon de cinco bases e um códon de quatro bases.
[045]A presente invenção também fornece métodos de preparar uma IL-2 ou uma variante da mesma ligada a uma molécula biologicamente ativa. Em algumas modalidades, o método compreende o contato com uma IL-2 isolada ou uma variante da mesma compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente com uma molécula biologicamente ativa compreendendo uma porção que reage com o aminoácido codificado não naturalmente. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente incorporado na IL-2 ou uma variante da mesma é reativo em relação a uma molécula biologicamente ativa que é de outro modo não reativa em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente incorporado na IL-2 é reativo em relação a um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa que é de outro modo não reativa em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns, que estão ligados a uma molécula biologicamente ativa.
[046]Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma ligada ao polímero solúvel em água ou molécula biologicamente ativa é feita reagindo uma IL-2 ou uma variante da mesma compreendendo um aminoácido contendo carbonila com um polímero solúvel em água ou molécula biologicamente ativa compreendendo um grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida. Em algumas modalidades, o grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida está ligado à molécula biologicamente ativa através de uma ligação amida. Em algumas modalidades, o grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida está ligado ao polímero solúvel em água ou molécula biologicamente ativa através de uma ligação de carbamato.
[047]A presente invenção também fornece métodos de preparar um conjugado de IL-2 ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o método compreende o contato com um conjugado isolado de molécula biologicamente ativa de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente com um polímero solúvel em água compreendendo uma porção que reage com o aminoácido codificado não naturalmente. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente incorporado no conjugado de IL-2 é reativo em relação a um polímero solúvel em água que é de outro modo não reativo em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente incorporado no conjugado de IL-2 é reativo em relação a um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa que é de outro modo não reativo em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns.
[048]A presente invenção também fornece métodos de preparar uma IL-2 ou uma variante da mesma ligada a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o método compreende o contato com uma IL-2 isolada ou uma variante da mesma compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente com um polímero solúvel em água compreendendo uma porção que reage com o aminoácido codificado não naturalmente. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente incorporado na IL-2 ou uma variante da mesma é reativo em relação a um polímero solúvel em água que é de outro modo não reativo em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente incorporado na IL-2 é reativo em relação a um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa que é de outro modo não reativo em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns.
[049]Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma ligada ao polímero solúvel em água é feita reagindo uma IL-2 ou uma variante da mesma compreendendo um aminoácido contendo carbonila com uma molécula de poli(etilenoglicol) compreendendo um grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida. Em algumas modalidades, o grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida está ligado à molécula de poli(etilenoglicol) através de uma ligação amida. Em algumas modalidades, o grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida está ligado à molécula de poli(etilenoglicol) através de uma ligação de carbamato.
[050]Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma ligada ao polímero solúvel em água é feita reagindo uma molécula de poli(etilenoglicol) compreendendo um grupo carbonila com um polipeptídeo compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente que compreende um grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida.
[051]Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma ligada ao polímero solúvel em água é feita reagindo uma IL-2 compreendendo um aminoácido contendo alcino com uma molécula de poli(etilenoglicol) compreendendo uma porção de azida. Em algumas modalidades, o grupo azida ou alcino está ligado à molécula de poli(etilenoglicol) através de uma ligação amida.
[052]Em algumas modalidades, a IL-2 ou uma variante da mesma ligada ao polímero solúvel em água é feita reagindo uma IL-2 ou uma variante da mesma compreendendo um aminoácido contendo azida com uma molécula de poli(etilenoglicol) compreendendo uma porção de alcino. Em algumas modalidades, o grupo azida ou alcino está ligado à molécula de poli(etilenoglicol) através de uma ligação amida.
[053]Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) tem um peso molecular entre cerca de 0.1 kDa e cerca de 100 kDa. Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) tem um peso molecular entre 0.1 kDa e 50 kDa. Em algumas modalidades, o poli(etilenoglicol) tem um peso molecular entre 1 kDa e 25 kDa, ou entre 2 e 22 kDa, ou entre 5 kDa e 20 kDa. Por exemplo, o peso molecular do polímero de poli(etilenoglicol) pode ser cerca de 5 kDa, ou cerca de 10 kDa, ou cerca de 20 kDa. Por exemplo, o peso molecular do polímero de poli(etilenoglicol) pode ser 5 kDa ou 10 kDa ou 20 kDa. Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) é um PEG ramificado 2 de 20K. Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) é um PEG de 5K linear. Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) é um PEG de 10K linear. Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) é um PEG de 20K linear. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero de poli(etilenoglicol) é um peso molecular médio. Em certas modalidades, o peso molecular médio é o peso molecular numérico médio (Mn).
O peso molecular médio pode ser determinado ou medido usando análise de GPC ou SEC, SDS/PAGE, RP-HPLC, espectrometria de massa, ou eletroforese capilar. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante dos mesmos: posição 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, ou 107, e qualquer combinação dos mesmos (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) de 20 K linear. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante da mesma: posição 35, 37, 42, 45, 49, 61, ou 65, e qualquer combinação dos mesmos (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) de 20 K linear. Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 65 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) de 20 K linear. Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 61 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) de 20 K linear. Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 49 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) de 20 K linear. Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 45 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) de 20 K linear. Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 42 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) de 20 K linear. Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 37 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) de 20 K linear. Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 35 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) de 20 K linear.
[054]Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) é um polímero ramificado. Em algumas modalidades, cada uma das ramificações do polímero de poli(etilenoglicol) ramificado tem um peso molecular entre 1 kDa e 100 kDa, ou entre 1 kDa e 50 kDa. Em algumas modalidades, cada uma das ramificações do polímero de poli(etilenoglicol) ramificado tem um peso molecular entre 1 kDa e 25 kDa, ou entre 2 e 22 kDa, ou entre 5 kDa e 20 kDa. Por exemplo, o peso molecular de cada uma das ramificações do polímero de poli(etilenoglicol) ramificado pode ser cerca de 5 kDa, ou cerca de 10 kDa, ou cerca de 20 kDa. Por exemplo, o peso molecular de cada uma das ramificações do polímero de poli(etilenoglicol) ramificado pode ser 5 kDa ou 10 kDa ou 20 kDa.
Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) é um PEG ramificado 2 de 20K.
Em algumas modalidades, a molécula de poli(etilenoglicol) é um PEG ramificado 4 de 20 K.
Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero de poli(etilenoglicol) é um peso molecular médio.
Em certas modalidades, o peso molecular médio é o peso molecular numérico médio (Mn). O peso molecular médio pode ser determinado ou medido usando análise de GPC ou SEC, SDS/PAGE, RP-HPLC, espectrometria de massa, ou eletroforese capilar.
Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante da mesma: posição 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68,
72, ou 107, e qualquer combinação dos mesmos (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 2 de 20 K.
Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante da mesma: posição 35, 37, 42, 45, 49, 61 ou 65, e qualquer combinação das mesmas
(de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3,
5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 2 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 65 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID
NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 2 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 61 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID
NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 2 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 49 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID
NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 2 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 45 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID
NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 2 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 42 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID
NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 2 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 37 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID
NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 2 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 35 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID
NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 2 de 20 K.
Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante da mesma: posição 3, 35, 37, 38, 41, 42,
43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, ou 107, e qualquer combinação dos mesmos (de
SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou
7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol)
ramificada 4 de 20 K.
Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante da mesma: posição 35, 37, 42, 45, 49, 61 ou 65, e qualquer combinação das mesmas (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 4 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição
65 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 4 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição
61 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 4 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição
49 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 4 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição
45 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 4 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição
42 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 4 de 20 K.
Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição
37 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 4 de 20 K. Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é incorporado na posição 35 em IL-2 ou uma variante da mesma (de SEQ ID NO: 2, ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7), e a IL-2 ou variante da mesma está ligada a uma molécula de poli(etilenoglicol) ramificada 4 de 20 K.
[055]Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água ligado à IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma porção de polialquileno glicol. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido codificado não naturalmente incorporado na IL-2 compreende um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazida, uma hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alcino. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido codificado não naturalmente incorporado na IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma porção de carbonila e o polímero solúvel em água compreende uma porção de aminoóxi, hidrazida, hidrazina ou semicarbazida. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido codificado não naturalmente incorporado na IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma porção de alcino e o polímero solúvel em água compreende uma porção de azida. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido codificado não naturalmente incorporado na IL-2 ou uma variante da mesma compreende uma porção de azida e o polímero solúvel em água compreende uma porção de alcino.
[056]A presente invenção também fornece composições compreendendo uma IL-2 ou uma variante da mesma compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente e um portador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água.
[057]A presente invenção também fornece células compreendendo um polinucleotídeo que codifica a IL-2 ou variante de IL-2 da mesma compreendendo um códon seletor. Em algumas modalidades, as células compreendem uma sintetase de
RNA ortogonal e/ou um tRNA ortogonal para substituir um aminoácido codificado não naturalmente na IL-2.
[058]A presente invenção também fornece células compreendendo um polinucleotídeo que codifica a IL-2 ou variante da mesma compreendendo um códon seletor. Em algumas modalidades, as células compreendem uma sintetase de RNA ortogonal e/ou um tRNA ortogonal para substituir um aminoácido codificado não naturalmente na IL-2 ou variante da mesma.
[059]A presente invenção também fornece métodos de preparar um PEG-IL- 2, uma IL-2 ou qualquer variante dos mesmos compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente. Em algumas modalidades, os métodos compreendem culturar células compreendendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeos que codificam uma IL-2 uma sintetase de RNA ortogonal e/ou um tRNA ortogonal sob condições para permitir a expressão da IL-2 ou variante da mesma; e purificar a IL-2 ou variante desta a partir das células e/ou meio de cultura.
[060]A presente invenção também fornece métodos de aumentar a meia-vida terapêutica, meia-vida sérica ou tempo de circulação de IL-2 ou uma variante da mesma. A presente invenção também fornece métodos de modular a imunogenicidade de IL-2 ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, os métodos compreendem substituir um aminoácido codificado não naturalmente para qualquer um ou mais aminoácidos em IL-2 de ocorrência natural ou uma variante da mesma e/ou ligação a IL-2 ou uma variante da mesma a um ligante, um polímero, um polímero solúvel em água, ou uma molécula biologicamente ativa. Em uma modalidade da presente invenção, o ligante é longo o suficiente para permitir a flexibilidade e permitir a formação de dímero. Em uma modalidade da invenção, o ligante é pelo menos 3 aminoácidos, ou 18 átomos, em comprimento de modo a permitir a formação de dímero.
[061]A presente invenção também fornece métodos de tratar um paciente em necessidade de tal tratamento com uma quantidade eficaz de um conjugado de PEG- IL-2 ou variante do mesmo da presente invenção. Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um PEG-IL-2 ou variante da mesma compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente e um portador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um PEG-IL-2 ou variante do mesmo compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente e uma substituição de aminoácido natural, e um portador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água.
Em algumas modalidades, o PEG-IL-2 ou variante do mesmo é glicosilado. Em algumas modalidades, o PEG-IL-2 ou variante do mesmo é não glicosilado.
[062]A presente invenção também fornece métodos de tratar um paciente em necessidade de tal tratamento com uma quantidade eficaz de uma IL-2 ou variante de molécula de IL-2 da presente invenção. Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma IL-2 ou variante de molécula de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente e um portador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma IL-2 ou variante da mesma compreendendo um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente e uma ou mais substituições de aminoácido natural, e um portador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o aminoácido natural está ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, a IL-2 é glicosilada. Em algumas modalidades, a IL-2 é não glicosilada. Em algumas modalidades, o paciente em necessidade de tratamento tem um câncer, condição ou doença, mas não se limitando a tal, caracterizado pela alta expressão de receptor de IL-2 alfa. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para tratar um câncer ou condição ou doença administrando a um sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de IL-2 da invenção. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de tratar uma doença hereditária administrando a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de IL-2 da invenção. Os polipeptídeos de IL-2 da invenção são para o uso no tratamento uma doença ou condição em uma célula tendo alta expressão do receptor de IL-2 alfa. Em algumas modalidades, o câncer, condição ou doença é tratado reduzindo, bloqueando ou silenciando a expressão do receptor de IL-2 alfa. Os polipeptídeos de IL-2 ou variantes da invenção são para o uso na fabricação de um medicamento para tratar um câncer, doença ou condição associado com alta expressão do receptor de IL-2 alfa. Os polipeptídeos de IL-2 ou variantes da invenção são para o uso na fabricação de um medicamento para tratar um câncer. Os polipeptídeos de IL-2 ou variantes da invenção são para o uso na fabricação de um medicamento para tratar uma doença hereditária.
[063]A presente invenção também fornece a IL-2 compreendendo uma sequência mostrada em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, ou 7, ou qualquer outra sequência de IL-2, exceto que pelo menos um aminoácido é substituído por um aminoácido codificado não naturalmente. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma porção de poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alcino.
[064]A presente invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo um portador farmaceuticamente aceitável e um PEG-IL-2 ou variante natural dos mesmos compreendendo a sequência mostrada em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, ou 7, ou qualquer outra sequência de IL-2, em que pelo menos um aminoácido é substituído por um aminoácido codificado não naturalmente. A presente invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo um portador farmaceuticamente aceitável e uma IL-2 ou variante natural dos mesmos compreendendo a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, ou 7. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado não naturalmente compreende uma porção de sacarídeo. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água está ligado à IL-2 ou variante natural dos mesmos por meio de uma porção de sacarídeo. Em algumas modalidades, um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa está ligado à IL- 2 ou variante natural dos mesmos por meio de uma porção de sacarídeo.
[065]A presente invenção também fornece uma IL-2 ou variante natural dos mesmos compreendendo um polímero solúvel em água ligado por uma ligação covalente à IL-2 em um único aminoácido. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma porção de poli(etilenoglicol). Em algumas modalidades, o aminoácido covalentemente ligado ao polímero solúvel em água é um aminoácido codificado não naturalmente presente no polipeptídeo.
[066]A presente invenção fornece uma IL-2 ou uma variante da mesma compreendendo pelo menos um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa, em que o dito ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa está ligado ao polipeptídeo através de um grupo funcional de um aminoácido codificado não naturalmente incorporado de forma ribossômica no polipeptídeo. Em algumas modalidades, a IL-2 ou variante da mesma é monopeguilada. A presente invenção também fornece uma IL-2 ou variante da mesma compreendendo um ligante, polímero, ou molécula biologicamente ativa que está ligado a um ou mais aminoácido codificado não naturalmente em que o dito aminoácido codificado não naturalmente é incorporado de forma ribossômica no polipeptídeo nos sítios pré-selecionados.
[067]Incluído dentro do escopo desta invenção é o líder da IL-2, ou variante do mesmo, ou sequência de sinal ligada a uma região de codificação de IL-2, bem como uma sequência de sinal heteróloga ligada a uma região de codificação de IL-2.
O líder heterólogo ou sequência de sinal selecionado deve ser aquele que é reconhecido e processado, por exemplo, pelo sistema de secreção da célula hospedeira para secretar e possivelmente clivada por uma peptidase sinal, pela célula hospedeira. Um método de tratamento de uma condição ou distúrbio com a IL-2 da presente invenção pretende implicar o tratamento com IL-2 ou uma variante desta com ou sem um sinal ou peptídeo líder.
[068]Em uma outra modalidade, a conjugação da IL-2 ou uma variante da mesma compreendendo um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural a uma outra molécula incluindo, mas não se limitando a PEG, fornece substancialmente IL-2 purificada devido à única reação química utilizada para conjugação com o aminoácido não natural. A conjugação de IL-2, ou variante da mesma compreendendo um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente para outra molécula, tal como PEG, pode ser realizada com outras técnicas de purificação realizadas antes ou após a etapa de conjugação para fornecer IL-2 substancialmente pura ou uma variante do mesmo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[069]A Figura 1 - Um modelo que mostra uma vista de um polipeptídeo de IL- 2 com potenciais sítios de interação de receptor marcados com a estrutura de IL-2Rα e sua interface com IL-2.
[070]A Figura 2 - Um mapa de plasmídeo do vetor de expressão para expressão de IL-2 em E. coli é mostrado.
[071]A Figura 3A - Análise Western blot de expressão da proteína de IL-2 em E. coli é mostrada.
[072]A Figura 3B - Título de variantes de IL-2 em E.coli é mostrado.
[073]A Figura 4A - Sensorgrama cinético de ligação e linhas de ajuste de modelo e medições calculadas para tipo selvagem de IL-2 para CD25 são mostrados.
[074]A Figura 4B - Um mapa de plasmídeo do vetor de expressão para expressão de IL-2 em células de mamífero é mostrado.
[075]A Figura 5 - Mostra sequência de DNA genômico de UPF1 e projeto de sítios de gNRA de CRISPR.
[076]A Figura 6 - Verificação de sequência de linhas de célula nocaute de UPF1 é mostrada.
[077]A Figura 7A - Expressão transiente de várias variantes de IL-2 em células de mamífero é mostrada.
[078] A Figura 7B - Análise Western blot de IL-2 de tipo selvagem e variantes de IL-2 produzidas em células de mamífero é mostrada.
[079]A Figura 8 - Ensaio de expansão de CTLL-2 de variante de F42 de IL-2 é mostrado.
[080]A Figura 9 - Triagem de variantes de IL-2 por ensaio de proliferação de CTLL-2 é mostrada.
[081]A Figura 10A - Mostra o sensorgrama cinético de ligação para tipo selvagem de IL-2 e variante de F42.
[082]A Figura 10B - Mostra o sensorgrama cinético de ligação para variantes de K35 e Y45.
[083]A Figura 10C - Mostra o sensorgrama cinético de ligação para variantes de T37 e P65.
[084]A Figura 11 - Ilustração de ensaio de dimerização de receptor de IL-2.
[085]A Figura 12 - Ilustração de ensaio pSTAT5 ex-vivo.
[086]A Figura 13 - Crescimento clonal e propagação de longo prazo de células CTLL-2 na presença de IL-2 glicosilada ou não glicosilada é mostrado.
[087]A Figura 14 - Comparação do título antes e depois da geração de pools estáveis de IL-2 de tipo selvagem correspondente ou suas variantes selecionadas é mostrada.
[088]A Figura 15A - Mostra o título em células de mamífero que expressam variante F42-R38A.
[089]A Figura 15B - Mostra ensaio de ligação de CTLL-2 de variantes de F42- R38A.
[090]A Figura 15C - Mostra os sensorgramas cinéticos de ligação para variantes de F42-R38A.
DEFINIÇÕES
[091]Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos, linhas celulares, construções e reagentes específicos descritos neste documento e, como tal, podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[092]Conforme usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referência no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a uma “IL- 2”, “PEG-IL-2”, “conjugado de PEG-IL-2” e várias formas em maiúsculas, hifenizadas e não hifenizadas é uma referência a uma ou mais dessas proteínas e inclui equivalentes dos mesmos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, e assim por diante.
[093]A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agora descritos.
[094]Todas as publicações e patentes aqui mencionadas são incorporadas neste documento por referência com o propósito de descrever e divulgar, por exemplo, as construções e metodologias que são descritas nas publicações, que podem ser usados em conexão com a invenção presentemente descrita. As publicações discutidas neste documento são fornecidas apenas para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm o direito de antecipar tal divulgação em virtude de invenção anterior ou por qualquer outro motivo.
[095]O termo “substancialmente purificado” se refere a uma IL-2 ou variante da mesma que pode ser substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com a proteína como encontrada em seu ambiente de ocorrência natural, isto é, uma célula nativa, ou célula hospedeira no caso de IL-2 produzida de forma recombinante. A IL-2 que pode ser substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína tendo menos do que cerca de 30 %, menos do que cerca de 25 %, menos do que cerca de 20 %, menos do que cerca de 15 %, menos do que cerca de 10 %, menos do que cerca de 5 %, menos do que cerca de 4 %, menos do que cerca de 3 %, menos do que cerca de 2 %, ou menos do que cerca de 1 % (por peso seco) de proteína contaminante. Quando a IL-2 ou variante da mesma é produzida de forma recombinante pelas células hospedeiras, a proteína pode estar presente em cerca de 30 %, cerca de 25 %, cerca de 20 %, cerca de 15 %, cerca de 10 %, cerca de 5 %, cerca de 4 %, cerca de 3 %, cerca de 2 %, ou cerca de 1% ou menos do peso seco das células. Quando a IL-2 ou variante da mesma é produzida de forma recombinante pelas células hospedeiras, a proteína pode estar presente no meio de cultura em cerca de 5 g/l, cerca de 4 g/l, cerca de 3 g/l, cerca de 2 g/l, cerca de 1 g/l, cerca de 750 mg/l, cerca de 500 mg/l, cerca de 250 mg/l, cerca de 100 mg/l, cerca de 50 mg/l, cerca de 10 mg/l, ou cerca de 1 mg/l ou menos do peso seco das células. Assim, a IL-2 “substancialmente purificada” como produzida pelos métodos da presente invenção pode ter um nível de pureza de pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70%, especificamente, um nível de pureza de pelo menos cerca de 75 %, 80 %, 85 %, e mais especificamente, um nível de pureza de pelo menos cerca de 90%, um nível de pureza de pelo menos cerca de 95 %, um nível de pureza de pelo menos cerca de 99 % ou mais como determinado pelos métodos adequados tais como análise de SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, e eletroforese capilar.
[096]Uma “célula hospedeira recombinante” ou “célula hospedeira” se refere a uma célula que inclui um polinucleotídeo exógeno, independentemente do método usado para inserção, por exemplo, absorção direta, transdução, f-mating ou outros métodos conhecidos na técnica para criar células hospedeiras recombinantes. O polinucleotídeo exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmídeo ou, alternativamente, pode ser integrado no genoma do hospedeiro.
[097]Conforme usado neste documento, o termo “meio” ou “meio” inclui qualquer meio de cultura, solução, suporte sólido, semissólido ou rígido que pode suportar ou conter qualquer célula hospedeira, incluindo células hospedeiras bacterianas, células hospedeiras de levedura, células hospedeiras de inseto, células hospedeiras de plantas, células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras de mamíferos, células CHO, células hospedeiras procarióticas, células hospedeiras de E.
coli ou Pseudomonas e conteúdos celulares. Assim, o termo pode abranger meio no qual a célula hospedeira foi cultivada, por exemplo, meio no qual a IL-2 foi segregada, incluindo meio antes ou depois de uma etapa de proliferação. O termo também pode abranger tampões ou reagentes que contêm lisados de células hospedeiras, tal como no caso em que a IL-2 é produzida intracelularmente e as células hospedeiras são lisadas ou rompidas para liberar a IL-2.
[098]“Agente redutor”, como usado neste documento com respeito ao redobramento de proteínas, é definido como qualquer composto ou material que mantém grupos sulfidrila no estado reduzido e reduz ligações dissulfeto intra ou intermoleculares. Os agentes redutores adequados incluem, mas não estão limitados a ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteína, cisteamina (2- aminoetanotiol) e glutationa reduzida. É prontamente aparente para aquelas pessoas versadas na técnica que uma grande variedade de agentes redutores é adequada para uso nos métodos e composições da presente invenção.
[099]“Agente oxidante”, conforme usado neste documento com respeito ao redobramento de proteínas, é definido como qualquer composto ou material que seja capaz de remover um elétron de um composto sendo oxidado. Os agentes oxidantes adequados incluem, mas não estão limitados a glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado e oxigênio. É prontamente aparente para aquelas pessoas versadas na técnica que uma ampla variedade de agentes oxidantes é adequada para uso nos métodos da presente invenção.
[0100]“Agente desnaturante” ou “desnaturante”, conforme usado neste documento, é definido como qualquer composto ou material que irá causar um desdobramento reversível de uma proteína. A força de um agente desnaturante ou desnaturante será determinada tanto pelas propriedades quanto pela concentração do agente desnaturante ou desnaturante particular. Os agentes desnaturantes ou desnaturantes adequados podem ser caotrópicos, detergentes, solventes orgânicos,
solventes miscíveis em água, fosfolipídeos ou uma combinação de dois ou mais desses agentes. Os caótropos adequados incluem, mas não estão limitados a ureia, guanidina e tiocianato de sódio. Detergentes úteis podem incluir, mas não estão se limitando a, detergentes fortes, como dodecilsulfato de sódio ou éteres de polioxietileno (por exemplo, detergentes Tween ou Triton), Sarkosyl, detergentes não iônicos suaves (por exemplo, digitonina), detergentes catiônicos suaves, como N- ›2,3-(Dioleioxi)-propil-N, N, N-trimetilamônio, detergentes iônicos suaves (por exemplo, colato de sódio ou desoxicolato de sódio) ou detergentes zwitteriônicos incluindo, mas não se limitando a, sulfobetaínas (Zwittergent), 3-(3-sulfato de clolamidopropil)dimetilamônio-1-propano(CHAPS) e sulfonato de 3-(3- clolamidopropil)dimetilamônio-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO). Os solventes orgânicos, miscíveis em água, como acetonitrila, alcanóis inferiores (especialmente alcanóis C2-C4 como etanol ou isopropanol), ou alcandióis inferiores (especialmente alcandióis C2-C4 como etilenoglicol) podem ser usados como desnaturantes. Os fosfolipídeos úteis na presente invenção podem ser fosfolipídeos de ocorrência natural, tais como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina e fosfatidilinositol ou derivados de fosfolipídeos sintéticos ou variantes tais como dihexanoilfosfatidilcolina ou diheptanoilfosfatidilcolina.
[0101]“Redobramento”, conforme usado neste documento descreve qualquer processo, reação ou método que transforma ligação dissulfeto contendo polipeptídeos de um estado incorretamente dobrado ou desdobrado para uma conformação nativa ou adequadamente dobrada em relação às ligações dissulfeto.
[0102]“Co-dobramento”, conforme usado neste documento, se refere especificamente a processos, reações ou métodos de redobramento que empregam pelo menos dois polipeptídeos que interagem entre si e resultam na transformação de polipeptídeos desdobrados ou incorretamente dobrados em polipeptídeos nativos devidamente dobrados.
[0103]Conforme usado neste documento, a “Interleucina-2”, “IL-2” e formas hifenadas e não hifenadas da mesma devem incluir aqueles polipeptídeos e proteínas que têm pelo menos uma atividade biológica de uma IL-2, bem como análogos de IL- 2, muteínas de IL-2, variantes de IL-2, isoformas de IL-2, miméticos de IL-2, fragmentos de IL-2, proteínas híbridas de IL-2, proteínas de fusão, oligômeros e multímeros, homólogos, variantes de padrão de glicosilação, variantes, variantes de splice, e muteínas, independentemente da atividade biológica das mesmas, e ainda independentemente do método de síntese ou fabricação dos mesmos, incluindo, mas não se limitando a, recombinante (seja produzido a partir de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou outra forma de ácido nucleico) , in vitro, in vivo, por microinjeção de moléculas de ácido nucleico, métodos sintéticos, transgênicos e ativados por genes.
O termo “IL-2”, “IL-2”, “variante de IL-2” e “polipeptídeo de IL-2” abrangem IL-2 compreendendo uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos.
[0104]Para sequências de IL-2 que carecem de uma sequência líder e não têm metionina no N terminal, consultar SEQ ID NO: 2 neste documento. Para uma sequência de IL-2 sem uma sequência líder e com uma metionina no N terminal, consultar SEQ ID NOs: 3, 5 ou 7. Em algumas modalidades, a IL-2 ou variantes da mesma da invenção são substancialmente idênticas a SEQ ID NOs: 2, 3, 5, ou 7, ou qualquer outra sequência de uma IL-2. As moléculas de ácido nucleico que codificam IL-2 incluindo IL-2 mutante e outras variantes bem como os métodos para expressar e purificar esses polipeptídeos são bem conhecidos na técnica.
[0105]O termo “IL-2” também inclui os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-fármacos, e pró-fármacos dos sais, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biologicamente ativos, variantes biologicamente ativas e estereoisômeros da IL-2 de ocorrência natural bem como agonista, miméticas, e variantes de antagonista da IL-2 de ocorrência natural e fusões de polipeptídeo dos mesmos.
[0106]Várias referências divulgam a modificação de polipeptídeos por conjugação de polímero ou glicosilação. O termo “IL-2” inclui conjugado de polipeptídeos para um polímero tal como PEG e pode ser composto de uma ou mais derivatizações adicionais de cisteína, lisina, ou outros resíduos. Além disso, a IL-2 pode compreender um ligante ou polímero, em que o aminoácido ao qual o ligante ou polímero está conjugado pode ser um aminoácido não natural de acordo com a presente invenção ou pode ser conjugado a um aminoácido codificado naturalmente utilizando técnicas conhecidas na técnica tal como acoplamento a lisina ou cisteína.
[0107] O termo “polipeptídeo de IL-2” também inclui IL-2 glicosilada, tal como, mas não se limitando a, polipeptídeos glicosilados em qualquer posição de aminoácido, formas glicosiladas ligadas a N ou ligada à O do polipeptídeo. As variantes contendo alterações de nucleotídeo único também são consideradas como variantes biologicamente ativas do polipeptídeo de IL-2. Além disso, variantes de emenda também estão incluídas.
[0108]O termo “IL-2” também inclui heterodímeros de IL-2, homodímeros, heteromultímeros, ou homomultímeros de qualquer uma ou mais IL-2 ou qualquer outro polipeptídeo, proteína, carboidrato, polímero, molécula pequena, ligante, ligante, ou outra molécula biologicamente ativa de qualquer tipo, ligada por meios químicos ou expressadas como uma proteína de fusão, bem como análogos de polipeptídeo contendo, por exemplo, deleções específicas ou outras modificações ainda mantendo atividade biológica.
[0109]“Interleucina-2” ou “IL-2”, conforme usada neste documento, seja conjugada a uma molécula biologicamente ativa, conjugada a um polietilenoglicol, ou em uma forma não conjugada, é uma proteína compreendendo duas subunidades ligadas não covalentemente para formar um homodímero. Conforme usado neste documento, a “Interleucina-2” e “IL-2” pode se referir a IL-2 humana ou camundongo que são também denominadas como “hIL-2” ou “mIL-2”.
[0110]O termo “peguilada IL-2”, “PEGuilada IL-2” ou “PEG-IL-2” é uma molécula de IL-2 tendo uma ou mais moléculas de polietilenoglicol covalentemente ligadas a um ou mais do que um resíduo de aminoácido da proteína de IL-2 por meio de um ligante, de modo que a ligação seja estável. Os termos “IL-2 monopeguilada” e “mono-PEG-IL-2”, significam que uma molécula de polietilenoglicol é covalentemente ligada a um único resíduo de aminoácido em uma subunidade do dímero de IL-2 por meio de um ligante. O peso molecular médio da porção de PEG é preferencialmente entre cerca de 5.000 e cerca de 50.000 daltons. O método ou sítio de ligação de PEG a IL-2 não é crítico, mas preferencialmente a PEGuilação não altera, ou apenas altera minimamente, a atividade da molécula biologicamente ativa. De preferência, o aumento na meia-vida é maior do que qualquer diminuição na atividade biológica.
[0111]Todas as referências a posições de aminoácido em IL-2 descritas neste documento são baseadas na posição em SEQ ID NO: 2, a menos que de outro modo especificado (isto é, quando é estabelecido que a comparação é baseada em SEQ ID NO: 3, 5, ou 7 ou outra IL-2). Aquela pessoa versada na técnica avaliará que posições de aminoácido correspondentes às posições em SEQ ID NO: 2 podem ser prontamente identificadas em qualquer outra IL-2 tal como SEQ ID NOs: 3, 5, ou 7.
Aquela pessoa versada na técnica avaliará que posições de aminoácido correspondentes às posições em SEQ ID NOs: 2, 3, 5, ou 7, ou qualquer outra sequência de IL-2 podem ser prontamente identificadas em qualquer outra molécula de IL-2 tal como fusões de IL-2, variantes, fragmentos, etc. Por exemplo, os programas de alinhamento de sequência tal como BLAST podem ser usados para alinhar e identificar uma posição particular em uma proteína que corresponde a uma posição em SEQ ID NOs: 2, 3, 5, ou 7, ou outra sequência de IL-2. A substituições, deleções ou adições de aminoácidos descritas aqui em referência à SEQ ID NOs: 2, 3, 5, ou 7, ou outra sequência de IL-2 são intencionadas a também se referirem às substituições, deleções ou adições em posições correspondentes em fusões de IL-2,
variantes, fragmentos, etc. descritos aqui ou conhecidos na técnica e são expressamente abrangidos pela presente invenção.
[0112]IL-2 (IL3): Qualquer forma de IL-2 conhecida na técnica pode ser usada nas composições descritas neste documento. Para trabalho experimental, a forma de camundongo de IL-2 é particularmente útil. Aquela pessoa versada na técnica reconhecerá que alguns dos resíduos de aminoácido em IL2 podem ser alteradas sem afetar sua atividade e que essas formas modificadas de IL2 também podem ser ligadas a um portador e usadas nos métodos descritos aqui.
[0113]O termo “IL-2” ou “IL-2” abrange IL-2 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido, adições ou deleções. A IL-2 da presente invenção pode ser composta de modificações com um ou mais aminoácidos naturais em conjunto com uma ou mais modificações de aminoácido não natural. As substituições exemplificativas em uma ampla variedade de posições de aminoácido em polipeptídeos de IL-2 de ocorrência natural foram descritas, incluindo mas não se limitando a substituições que modulam estabilidade farmacêutica, que modulam uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de IL-2, tal como mas não se limitando a, aumento da atividade agonista, aumento da solubilidade do polipeptídeo, diminuição da suscetibilidade da protease, converter o polipeptídeo em um antagonista, etc. e são abrangidos pelo termo “polipeptídeo de IL-2”. Em algumas modalidades, o antagonista de IL-2 compreende um aminoácido codificado não naturalmente ligado a um polímero solúvel em água que está presente em uma região de ligação do receptor da molécula de IL-2.
[0114]Em algumas modalidades, a IL-2 ou variantes da mesma ainda compreendem uma adição, substituição ou deleção que modulam a atividade biológica da IL-2 ou polipeptídeo variante. Em algumas modalidades, a IL-2 ou variantes ainda compreendem uma adição, substituição ou deleção que modulam traços de IL-2 conhecidos e demonstrados através de pesquisas, como tratamento ou alívio em um ou mais sintomas de câncer. As adições, substituições ou deleções podem modular uma ou mais propriedades ou atividades de IL-2 ou variantes. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções podem modular a afinidade para o receptor de IL-2 ou uma ou mais subunidades do receptor, modular a meia-vida circulante, modular a meia-vida terapêutica, modular a estabilidade do polipeptídeo, modular a clivagem por proteases, modular a dose, modular a liberação ou biodisponibilidade, facilitar a purificação ou melhorar ou alterar uma determinada via de administração. Da mesma forma, a IL-2 ou variantes podem compreender sequências de clivagem de protease, grupos reativos, domínios de ligação a anticorpos (incluindo, mas não se limitando a, FLAG ou poli-His) ou outras sequências baseadas em afinidade (incluindo, mas não se limitando a, FLAG, poli-His , GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, mas não se limitando a, biotina) que melhoram a detecção (incluindo, mas não se limitando a, GFP), purificação ou outras características do polipeptídeo.
[0115]O termo “polipeptídeo de IL-2” também abrange homodímeros, heterodímeros, homomultímeros, e heteromultímeros que são ligados incluindo, mas não se limitando aos ligados diretamente por meio de cadeias laterais de aminoácido codificado não naturalmente, nas mesmas ou diferentes cadeias laterais de aminoácido codificado não naturalmente, para cadeias laterais de aminoácido codificadas naturalmente, ou indiretamente por meio de um ligante. Ligantes exemplificativos incluindo, mas não estão limitados a, compostos orgânicos pequenos, polímeros solúveis em água de uma variedade de comprimentos tal como poli(etilenoglicol) ou polidextrano, ou polipeptídeos de vários comprimentos.
[0116]Conforme usado neste documento, o termo “conjugado da invenção”, “conjugado de molécula biologicamente ativa de IL-2” ou “PEG-IL-2” se refere a interleucina-2 ou uma porção, análogo ou derivado desta que se liga ao receptor de interleucina-2 ou subunidade dos mesmos conjugados a uma molécula biologicamente ativa, uma porção dos mesmos ou um análogo dos mesmos. A menos que de outro modo indicado, os termos “composto da invenção” e “composição da invenção” são usados como alternativas para o termo “conjugado da invenção”.
[0117]Conforme usado neste documento, o termo “agente citotóxico” pode ser qualquer agente que exerce um efeito terapêutico em câncer células ou células imunes ativadas que podem ser usadas como o agente terapêutico para o uso em conjunto com uma IL-2, PEG-IL-2 ou variante de IL-2 (Consultar, por exemplo, WO 2004/010957, “Drug Conjugates and their Use for Treating Cancer, An Autoimmune Disease or an Infectious Disease”). Classes de agentes citotóxicos ou imunossupressores para uso com a presente invenção incluem, por exemplo, agentes antitubulina, auristatinas, ligantes de sulco menor de DNA, inibidores de replicação de DNA, agentes alquilantes (por exemplo, complexos de platina, como cis-platina, mono (platina), bis(platina) e complexos tri-nucleares de platina e carboplatina), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabólitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etoposídeos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureias, platinóis, compostos pré-formadores, antimetabolitos de purina, purina sensibilizadores, esteroides, taxanos, inibidores de topoisomerase, alcaloides de vinca ou semelhantes.
[0118]Os agentes citotóxicos ou imunossupressores individuais incluem, por exemplo, um androgênio, antramicina (AMC), asparaginase, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, bussulfano, butionina sulfoximina, camptotecina, carboplatina, carmustina (BSNU, cisplatina), CC-1065, clorambucila colchicina, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinósido, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorrubicina, decarbazina, docetaxel, doxorrubicina, um estrogênio, 5-fluordeoxiuridina, 5-fluorouracil, gramicidina D, hidroxiureia, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalan, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, nitroxicinol, mitiramicina C,
mitramicina, mitroxicina C, mitroxicinolite C, mitroxicinolitoxicina C, procarbizina, estreptozotocina, tenoposídeo, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecano, vinblastina, vincristina, vinorelbina, VP-16 e VM-26.
[0119]Em algumas modalidades típicas, o agente terapêutico é um agente citotóxico. Os agentes citotóxicos adequados incluem, por exemplo, dolastatinas (por exemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), ligantes de sulco menor de DNA (por exemplo, enedinas e lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (por exemplo, paclitaxel e docetaxel), puromicinas, alcaloides de vinca, CC-1065, SN-38, topotecano, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A e B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoide, maitansinoide, mitotransinoide, mitotransinoide, mitotransinoide.
[0120]Um “aminoácido codificado não naturalmente” se refere a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina ou selenocisteína. Outros termos que podem ser usados como sinônimos com o termo “aminoácido codificado não naturalmente” são “aminoácido não natural”, “aminoácido não natural”, “aminoácido de ocorrência não natural”, e várias versões hifenizadas e não hifenizadas dos mesmos. O termo “aminoácido codificado não naturalmente” também inclui, mas não está se limitando a, aminoácidos que ocorrem por modificação (por exemplo, modificações de pós-tradução) de um aminoácido codificado naturalmente (incluindo, mas não se limitando a, os 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina e selenocisteína), mas não são incorporados naturalmente em uma cadeia de polipeptídeo em crescimento pelo complexo de tradução. Exemplos de tais aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não estão limitados a N- acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina e O-fosfotirosina.
[0121]Um “grupo de modificação do terminal amino” se refere a qualquer molécula que pode ser ligada ao terminal amino de um polipeptídeo. Da mesma forma, um “grupo de modificação do terminal carbóxi” se refere a qualquer molécula que pode ser ligada ao terminal carbóxi de um polipeptídeo. Grupos de modificação terminal incluem, mas não estão se limitando a, vários polímeros solúveis em água, peptídeos ou proteínas tais como albumina sérica, ou outras porções que aumentam a meia-vida sérica de peptídeos.
[0122]Os termos “grupo funcional”, “porção ativa”, “grupo de ativação”, “grupo de partida”, “sítio reativo”, “grupo reativo quimicamente” e “porção quimicamente reativa” são usados na técnica e neste documento para se referir a porções ou unidades distintas e definíveis de uma molécula. Os termos são um tanto sinônimos nas técnicas químicas e são usados aqui para indicar as porções de moléculas que desempenham alguma função ou atividade e são reativas com outras moléculas.
[0123]O termo “ligação” ou “ligante” é usado neste documento para se referir a grupos ou ligações que normalmente são formados como resultado de uma reação química e normalmente são ligações covalentes. As ligações hidroliticamente estáveis significam que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com água em valores de pH úteis, incluindo, mas não se limitando a, sob condições fisiológicas por um período de tempo prolongado, talvez até indefinidamente. As ligações hidroliticamente instáveis ou degradáveis significam que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo, por exemplo, sangue. As ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significam que a ligação pode ser degradada por uma ou mais enzimas. Como entendido na técnica, o PEG e polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na estrutura do polímero ou no grupo de ligação entre a estrutura do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula de polímero. Por exemplo, as ligações de éster formadas pela reação de ácidos carboxílicos de PEG ou ácidos carboxílicos de PEG ativados com grupos álcool em um agente biologicamente ativo geralmente hidrolisam sob condições fisiológicas para liberar o agente. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, mas não estão limitadas a, ligações de carbonato; ligações de imina resultaram da reação de uma amina e um aldeído; ligações de éster de fosfato formadas pela reação de um álcool com um grupo fosfato; ligações de hidrazona que são produtos da reação de uma hidrazida e um aldeído; ligações de acetal que são o produto da reação de um aldeído e um álcool; ligações de ortoéster que são o produto da reação de um formato e um álcool; ligações de peptídeos formadas por um grupo amina, incluindo, mas não se limitando a, em uma extremidade de um polímero, tal como PEG, e um grupo carboxila de um peptídeo; e ligações de oligonucleotídeo formadas por um grupo fosforamidita, incluindo, mas não se limitando a, no final de um polímero, e um grupo hidroxila 5’ de um oligonucleotídeo.
[0124]O termo “molécula biologicamente ativa”, “porção biologicamente ativa” ou “agente biologicamente ativo” quando usado neste documento significa qualquer substância que pode afetar quaisquer propriedades físicas ou bioquímicas de um sistema biológico, via, molécula ou interação relacionada a um organismo, incluindo, mas não se limitando a, vírus, bactérias, bacteriófago, transposon, príon, insetos, fungos, plantas, animais e seres humanos. Em particular, conforme usado neste documento, moléculas biologicamente ativas incluem, mas não estão se limitando a, qualquer substância intencionada diagnóstico, cura, mitigação, tratamento ou prevenção de doenças em seres humanos ou outros animais, ou para aumentar o bem-estar físico ou mental de seres humanos ou animais. Exemplos de moléculas biologicamente ativas incluem, mas não estão limitados a, peptídeos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculas pequenas, vacinas, imunógenos, fármacos pesados, fármacos leves, carboidratos, átomos ou moléculas inorgânicas, corantes, lipídios, nucleosídeos, radionuclídeos, oligonucleotídeos, toxóides, moléculas biologicamente ativas, células procarióticas e eucarióticas, vírus, polissacarídeos, ácidos nucleicos e porções dos mesmos obtidos ou derivados de vírus, bactérias, insetos, animais ou qualquer outra célula ou tipo de célula, lipossomas, micropartículas e micelas. As classes de agentes biologicamente ativos que são adequados para uso com a invenção incluem, mas não estão limitados a fármacos, pró-fármacos, radionuclídeos, agentes de imagem, polímeros, antibióticos, fungicidas, resinas de ácido biliar, niacina e/ou estatinas, agentes anti-inflamatórios, agentes antitumorais, agentes cardiovasculares, agentes ansiolíticos, hormônios, fatores de crescimento, agentes esteroidais, moléculas biologicamente ativas derivadas de micróbios e semelhantes.
Os agentes biologicamente ativos também incluem compostos de amida, tais como aqueles descritos na Publicação do Pedido de Patente Número 20080221112, Yamamori et al., Que podem ser administrados antes, após e/ou coadministrados com polipeptídeos de IL-2 da presente invenção.
[0125]Um “polímero bifuncional” se refere a um polímero compreendendo dois grupos funcionais discretos que são capazes de reagir especificamente com outras porções (incluindo, mas não se limitando a, grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalentes ou não covalentes. Um ligante bifuncional tendo um grupo funcional reativo com um grupo em um componente biologicamente ativo particular e outro grupo reativo com um grupo em um segundo componente biológico pode ser usado para formar um conjugado que inclui o primeiro componente biologicamente ativo, o ligante bifuncional e o segundo componente biologicamente ativo. Muitos procedimentos e moléculas de ligação para ligação de vários compostos a peptídeos são conhecidos. Consultar, por exemplo, o Pedido de Patente Europeia Nº 188.256; Patentes U.S. Nos 4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784; 4.680.338; e
4.569.789 que são aqui incorporados por referência. Um “polímero multifuncional” se refere a um polímero que compreende dois ou mais grupos funcionais discretos que são capazes de reagir especificamente com outras porções (incluindo, mas não se limitando a, grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalentes ou não covalentes. Um polímero bifuncional ou polímero multifuncional pode ter qualquer comprimento ou peso molecular desejado e pode ser selecionado para fornecer um espaçamento ou conformação particular desejado entre uma ou mais moléculas ligadas à IL-2 e seu receptor ou IL-2.
[0126]Quando os grupos substituintes são especificados por suas fórmulas químicas convencionais, escritas da esquerda para a direita, eles abrangem igualmente os substituintes quimicamente idênticos que resultariam da escrita da estrutura da direita para a esquerda, por exemplo, a estrutura -CH2O- é equivalente à estrutura -OCH2-.
[0127]O termo “substituintes” inclui, mas não está se limitando a “substituintes não interferentes”. “Substituintes não interferentes” são aqueles grupos que produzem compostos estáveis. Os substituintes ou radicais não interferentes adequados incluem, mas não estão limitados a, halo, alquila C1-C10, alquenila C2-C10, alquinila C2- C10, alcóxi C1-C10, aralquila C1-C12, alcarila C1-C12, cicloalquila C3-C12, cicloalquenila C3-C12, fenila, fenila substituída, toluoil, xilenil, bifenila, alcoxialquila C2-C12, alcoxiarila C2-C12, ariloxialquila C7-C12, oxiarila C7-C12, alquilsulfinila C1-C6, alquilsulfonila C1-C10, --(CH2)m --O--(alquila C1-C10) em que m é de 1 a 8, arila, arila substituída, alcóxi substituído, fluoroalquila, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituído, nitroalquila, --NO2, --CN, --NRC(O)--(alquila C1-C10), --C(O)--(alquila C1-C10), alquila C2-C10 tioalquila, --C(O)O--(alquila C1-C10), --OH, --SO2, =S, --COOH, --NR2, carbonila, --C(O)--(alquila C1-C10)-CF3, --C(O)—CF3, --C(O)NR2, --(arila C1-C10)-S--(arila C6- C10), --C(O)--(arila C1-C10), --(CH2)m --O--(--(CH2)m--O--(alquila C1-C10) em que cada m é de 1 a 8, --C(O)NR2, --C(S)NR2, -- SO2NR2, --NRC(O) NR2, --NRC(S) NR2, sais dos mesmos, e semelhantes. Cada R conforme usado neste documento é H, alquila ou alquila substituída, arila ou arila substituída, aralquila ou alcarila.
O termo “halogênio” inclui flúor, cloro, iodo e bromo.
[0128]O termo “alquila”, por si só ou como parte de outro substituinte, significa, a menos que de outro modo estabelecido, uma cadeia linear ou ramificada, ou radical de hidrocarboneto cíclico, ou combinação dos mesmos, que pode ser completamente saturado, mono- ou poliinsaturado e pode incluir radicais di- e multivalentes, tendo o número de átomos de carbono designados (isto é, C1-C10 significa um a dez carbonos). Exemplos de radicais de hidrocarbonetos saturados incluem, mas não estão limitados a grupos tais como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, t-butila, isobutila, sec-butila, ciclohexila, (ciclohexil)metila, ciclopropilmetila, homólogos e isómeros de, por exemplo, n-pentila, n-hexila, n-heptila, n-octila e semelhantes. Um grupo alquila insaturado é aquele que tem uma ou mais ligações duplas ou ligações triplas. Exemplos de grupos alquila insaturados incluem, mas não estão limitados a, vinila, 2-propenila, crotila, 2-isopentenila, 2-(butadienil), 2,4-pentadienila, 3-(1,4- pentadienila), etinila, 1 - e 3-propinila, 3-butinila e os homólogos e isômeros superiores. O termo “alquila”, a menos que indicado de outra forma, também se destina a incluir aqueles derivados de alquila definidos em mais detalhes abaixo, como “heteroalquila”. Os grupos alquila que são limitados a grupos de hidrocarbonetos são denominados “homoalquila”.
[0129]O termo “alquileno” por si só ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado de um alcano, como exemplificado, mas não limitado, pelas estruturas -CH2CH2- e -CH2CH2CH2CH2-, e inclui ainda aqueles grupos descritos abaixo como “heteroalquileno”. Normalmente, um grupo alquila (ou alquileno) terá de 1 a 24 átomos de carbono, com esses grupos tendo 10 ou menos átomos de carbono sendo uma modalidade particular dos métodos e composições aqui descritos. Uma “alquila inferior” ou “alquileno inferior” é um grupo alquileno ou alquileno de cadeia mais curta, geralmente tendo oito ou menos átomos de carbono.
[0130]Os termos “alcóxi”, “alquilamino” e “alquiltio” (ou tioalcóxi) são usados em seu sentido convencional e se referem aos grupos alquila ligados ao restante da molécula por meio de um átomo de oxigênio, um grupo amino ou um átomo de enxofre, respectivamente.
[0131]O termo “heteroalquila”, por si só ou em combinação com uma outra termo, significa, a menos que de outro modo estabelecido, uma cadeia linear ou ramificada estável, ou radical de hidrocarboneto cíclico, ou combinações dos mesmos, que consiste no número estabelecido de átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em O, N, Si e S, e em que os átomos de nitrogênio e enxofre podem opcionalmente ser oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode opcionalmente ser quaternizado. O(s) heteroátomo(s) O, N e S e Si pode(m) ser colocado(s) em qualquer posição interior do grupo heteroalquila ou na posição em que o grupo alquila está ligado ao restante da molécula. Exemplos incluem, mas não estão se limitando a, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2- CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2,-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, - CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, e -CH=CH-N(CH3)-CH3. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos, tal como, por exemplo, -CH2-NH-OCH3 e - CH2-O-Si(CH3)3. Da mesma forma, o termo “heteroalquileno” por si só ou como parte de um outro substituinte significa um radical divalente derivado de heteroalquila, como exemplificado, mas não limitado por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH- CH2-. Para grupos heteroalquileno, os mesmos ou diferentes heteroátomos podem também ocupar uma ou ambas os terminais da cadeia (incluindo, mas não se limitando a, alquilenooxi, alquilenodioxi, alquilenoamino, alquilenodiamino, aminooxialquileno e semelhantes). Além disso, para grupos de ligação de alquileno e heteroalquileno, nenhuma orientação do grupo de ligação está implícita pela direção em que a fórmula do grupo de ligação é escrita. Por exemplo, a fórmula -C(O)2R’- representa ambos - C(O)2R’- e -R’C(O)2-.
[0132]Os termos “cicloalquila” e “heterocicloalquila”, por si mesmos ou em combinação com outros termos, representam, a menos que de outro modo estabelecido, versões cíclicas de “alquila” e “heteroalquila”, respectivamente. Assim, uma cicloalquila ou heterocicloalquila incluem ligações de anel saturadas,
parcialmente insaturadas e totalmente insaturadas. Adicionalmente, para heterocicloalquila, um heteroátomo pode ocupar a posição em que o heterociclo está ligado ao restante da molécula. Exemplos de cicloalquila incluem, mas não estão se limitando a, ciclopentila, ciclohexila, 1-ciclohexenila, 3-ciclohexenila, cicloheptila e semelhantes. Exemplos de heterocicloalquila incluem, mas não estão se limitando a, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridila), 1-piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4-morfolinila, 3-morfolinila, tetra-hidrofurano-2-ila, tetra-hidrofurano-3-ila, tetrahidrotien-2-ila, tetrahidrotien-3-ila, 1-piperazinila, 2-piperazinila, e semelhantes. Adicionalmente, o termo abrange estruturas de anel bicíclicas e tricíclicas. Da mesma forma, o termo “heterocicloalquileno” por si só ou como parte de um outro substituinte significa um radical divalente derivado de heterocicloalquila, e o termo “cicloalquileno” por si só ou como parte de um outro substituinte significa um radical divalente derivado de cicloalquila.
[0133]Conforme usado neste documento, o termo “polímero solúvel em água” se refere a qualquer polímero que é solúvel em solventes aquosos. A ligação de polímeros solúveis em água a IL-2 pode resultar em alterações incluindo, mas não se limitando a, meia-vida sérica aumentada ou modulada, ou meia-vida terapêutica aumentada ou modulada em relação à forma não modificada, imunogenicidade modulada, características de associação física moduladas tais como agregação e formação de multímero, alteração da ligação ao receptor, alteração da ligação a um ou mais parceiros de ligação e alteração da dimerização ou multimerização do receptor. O polímero solúvel em água pode ou não ter sua própria atividade biológica e pode ser utilizado como um ligante para ligar IL-2 a outras substâncias, incluindo, mas não se limitando a uma ou mais IL-2, ou uma ou mais moléculas biologicamente ativas. Os polímeros adequados incluem, mas não estão limitados a polietilenoglicol, polietilenoglicol propionaldeído, mono C1-C10 alcoxi ou derivados de ariloxi (descritos na Patente US Nº 5.252.714 que é incorporada neste documento por referência),
monometoxi-polietilenoglicol, polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, poliaminoácidos, diviniléter anidrido maleico, N- (2-Hidroxipropil)-metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano incluindo sulfato de dextrano, polipropilenoglicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliolisacáridos polioxietilados, heparina, fragmentos de heparin glicanos, celulose e derivados de celulose, incluindo, mas não se limitando a metilcelulose e carboximetilcelulose, amido e derivados de amido, polipeptídeos, polialquilenoglicol e seus derivados, copolímeros de polialquilenoglicóis e seus derivados, éteres de poliviniletil e alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida e semelhantes, ou suas misturas. Exemplos de tais polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a polietilenoglicol e albumina sérica.
[0134]Conforme usado neste documento, o termo “polialquileno glicol” ou “poli(alceno glicol)” se refere a polietilenoglicol (poli(etilenoglicol)), polipropileno glicol, polibutileno glicol, e derivados dos mesmos. O termo “polialquileno glicol” abrange tanto polímeros lineares quanto ramificados e pesos moleculares médios entre 0.1 kDa e 100 kDa. Outras modalidades exemplificativas são listadas, por exemplo, em catálogos de fornecedores comerciais, como o catálogo da Shearwater Corporation “Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications” (2001).
[0135]O termo “arila” significa, a menos que de outro modo estabelecido, um substituinte de hidrocarboneto poliinsaturado, aromático, que pode ser um único anel ou anéis múltiplos (incluindo, mas não se limitando a, de 1 a 3 anéis) que são fundidos ou ligados covalentemente. O termo “heteroarila” se refere a grupos arila (ou anéis) que contêm de um a quatro heteroátomos selecionado a partir de N, O, e S, em que os átomos de nitrogênio e enxofre são opcionalmente oxidados, e o(s) átomo(s) de nitrogênio são opcionalmente quaternizados. Um grupo heteroarila pode ser ligado ao restante da molécula através de um heteroátomo. Exemplo não limitativos de arila e grupos heteroarila incluem fenila, 1-naftila, 2-naftila, 4-bifenila, 1-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 3-pirazolila, 2-imidazolila, 4-imidazolila, pirazinila, 2-oxazolila, 4-oxazolila,
2-fenil-4-oxazolila, 5-oxazolila, 3-isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila, 2-tiazolila, 4- tiazolila, 5-tiazolila, 2-furila, 3-furila, 2-tienila, 3-tienila, 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 2- pirimidila, 4-pirimidila, 5-benzotiazolila, purinila, 2-benzimidazolila, 5-indolila, 1- isoquinolila, 5-isoquinolila, 2-quinoxalinila, 5-quinoxalinila, 3-quinolila, e 6-quinolila.
Substituintes para cada um dos sistemas de anel arila e heteroarila acima observados são selecionados a partir do grupo de substituintes aceitáveis descritos abaixo.
[0136]Por questões de brevidade, o termo “arila” quando usado em combinação com outros termos (incluindo, mas não se limitando a, ariloxi, ariltioxi, arilalquila) inclui tanto anéis de arila quanto heteroarila como definido acima. Assim, o termo “arilalquila” é significado para incluir aqueles radicais em que um grupo arila está ligado a uma grupo alquila (incluindo mas não se limitando a, benzila, fenetila, piridilmetila e semelhantes), incluindo aqueles grupos alquila em que um átomo de carbono (incluindo, mas não se limitando a, um grupo metileno) foi substituído por, por exemplo, um átomo de oxigênio (incluindo, mas não se limitando a, fenoximetila, 2- piridiloximetila, 3-(1-naftiloxi) propila e semelhantes)).
[0137]Cada um dos termos acima (incluindo, mas não se limitando a, “alquila”, “heteroalquila”, “arila” e “heteroarila”) são significados para incluir tanto as formas substituídas quanto não substituídas do radical indicado. Substituintes exemplificativos para cada tipo de radical são fornecidos abaixo.
[0138]Os substituintes para os radicais alquila e heteroalquila (incluindo aqueles grupos frequentemente denominados como alquileno, alquenila, heteroalquileno, heteroalquenila, alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquenila, e heterocicloalquenila) podem ser uma ou mais de uma variedade de grupos selecionados a partir de, mas não se limitando a: -OR’, =O, =NR’, =N-OR’, - NR’R”, -SR’, -halogênio, -SiR’R”R”’, -OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’, -CONR’R”, - OC(O)NR’R”, -NR”C(O)R’, -NR’-C(O)NR”R”’, -NR”C(O)2R’, -NR- C(NR’R”R’”)=NR”“, -NR-C(NR’R”)=NR’”, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R”, -NRSO2R’, -
CN e -NO2 em um número variando de zero a (2m’+1), onde m’ é o número total de átomos de carbono em um tal radical. R’, R”, R”’ e R”“ cada um independentemente se refere a hidrogênio, heteroalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída incluindo, mas não se limitando a, arila substituída com 1-3 halogênios, alquila substituída ou não substituída, grupos alcóxi ou tioalcóxi, ou grupos arilalquila. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como são cada grupos R’, R”, R’” e R”“ quando mais do que um desses grupos está presente.
Quando R’ e R” são ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5-, 6-, ou 7-membros.
Por exemplo, -NR’R” é significado para incluir, mas não ser limitado a, 1-pirrolidinila e 4-morfolinila. A partir do debate acima de substituintes, uma pessoa versada na técnica entenderá que o termo “alquila” é significado para incluir grupos incluindo átomos de carbono ligados a grupos exceto grupos de hidrogênio, tal como haloalquila (incluindo, mas não se limitando a, -CF3 e -CH2CF3) e acila (incluindo, mas não se limitando a, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, e semelhantes).
[0139]Similar aos substituintes descritos para o radical alquila, os substituintes para os grupos arila e heteroarila são variados e são selecionados a partir de, mas não estão se limitando a: halogênio, -OR’, =O, =NR’, =N-OR’, -NR’R”, -SR’, - halogênio, -SiR’R”R”’, -OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’, -CONR’R”, -OC(O)NR’R”, - NR”C(O)R’, -NR’-C(O)NR”R”’, -NR”C(O)2R’, -NR- C(NR’R”R’”)=NR”“, -NR-C(NR’R”)=NR’”, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R”, -NRSO2R’, - CN e -NO2, -R’, -N3, -CH(Ph)2, fluoro(C1-C4)alcóxi, e fluoro(C1-C4)alquila, em um número variando de zero ao número total de valências abertas no sistema de anel aromático; e onde R’, R”, R”’ e R”“ são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila, heteroalquila, arila e heteroarila. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como são cada grupos R’, R”, R’” e R”“ quando mais do que um desses grupos está presente.
[0140]Conforme usado neste documento, o termo “meia-vida sérica modulada” significa a mudança positiva ou negativa na meia-vida circulante de uma IL-2 modificada em relação à sua forma não modificada. A meia-vida sérica é medida tomando amostras de sangue em vários pontos de tempo após a administração de IL- 2 e determinando a concentração dessa molécula em cada amostra. A correlação da concentração sérica com o tempo permite o cálculo da meia-vida sérica. A meia-vida sérica aumentada desejavelmente tem pelo menos cerca de duas vezes, mas um aumento menor pode ser útil, por exemplo, quando permite um regime de dosagem satisfatório ou evita um efeito tóxico. Em algumas modalidades, o aumento é de pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de cinco vezes, ou pelo menos cerca de dez vezes.
[0141]O termo “meia-vida terapêutica modulada”, tal como utilizado neste documento, significa a mudança positiva ou negativa na meia-vida da quantidade terapeuticamente eficaz de IL-2, em relação à sua forma não modificada. A meia-vida terapêutica é medida medindo as propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas da molécula em vários pontos de tempo após a administração. O aumento da meia-vida terapêutica desejavelmente permite um regime de dosagem benéfico particular, uma dose total benéfica particular, ou evita um efeito indesejado.
Em algumas modalidades, o aumento da meia-vida terapêutica resulta do aumento da potência, aumento ou diminuição da ligação da molécula modificada ao seu alvo, aumento ou diminuição da quebra da molécula por enzimas, como proteases, ou aumento ou diminuição de outro parâmetro ou mecanismo de ação da molécula não modificada ou um aumento ou diminuição na depuração da molécula mediada por receptor.
[0142]O termo “isolado”, quando aplicado a um ácido nucleico ou proteína, denota que o ácido nucleico ou proteína é livre de pelo menos alguns dos componentes celulares com os quais está associado no estado natural, ou que o ácido nucleico ou a proteína foi concentrada a um nível maior do que a concentração de sua produção in vivo ou in vitro. Pode estar em um estado homogêneo. As substâncias isoladas podem estar em um estado seco ou semisseco, ou em solução, incluindo, mas não se limitando a, uma solução aquosa. Pode ser um componente de uma composição farmacêutica que compreende portadores e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis adicionais. A pureza e homogeneidade são normalmente determinadas usando técnicas de química analítica, como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. Em particular, um gene isolado é separado dos quadros de leitura abertos que flanqueiam o gene e codificam uma proteína diferente do gene de interesse. O termo “purificado” denota que um ácido nucleico ou proteína dá origem a substancialmente uma banda em um gel eletroforético. Particularmente, pode significar que o ácido nucleico ou proteína é pelo menos 85 % puro, pelo menos 90 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 99 % ou mais puro.
[0143]O termo “ácido nucleico” se refere a deoxiribonucleotídeos, desoxirribonucleosídeos, ribonucleosídeos, ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos na forma de filamento simples ou duplo. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que especificamente limitado de outra forma, o termo também se refere a análogos de oligonucleotídeos incluindo PNA (ácido peptidonucleico), análogos de DNA usados em tecnologia antessentido
(fosforotioatos, fosforamidatos e semelhantes). A menos que indicado de outra forma, uma sequência de ácido nucleico particular também engloba implicitamente suas variantes modificadas de forma conservativa (incluindo, mas não se limitando a, substituições de códons degenerados) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códons degenerados podem ser alcançadas gerando sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com base mista e/ou resíduos de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91- 98 (1994)).
[0144]Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados permutavelmente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Isto é, uma descrição dirigida a um polipeptídeo se aplica igualmente a uma descrição de um peptídeo e uma descrição de uma proteína e vice-versa. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural, bem como polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos é um aminoácido codificado não naturalmente. Tal como utilizado neste documento, os termos abrangem cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, incluindo proteínas de comprimento total, em que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações de peptídeo covalentes.
[0145]O termo “aminoácido” se refere a aminoácidos de ocorrência natural e não natural, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos codificados naturalmente são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) e pirrolisina e selenocisteína. Os análogos de aminoácidos se referem a compostos que têm a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural, isto é, um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, como homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Esses análogos têm grupos R modificados (tais como norleucina) ou estruturas peptídicas modificadas, mas retêm a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural. A referência a um aminoácido inclui, por exemplo, L-aminoácidos proteogênicos de ocorrência natural; D- aminoácidos, aminoácidos quimicamente modificados, tais como variantes e derivados de aminoácidos; aminoácidos não proteogênicos de ocorrência natural tais como β-alanina, ornitina, etc.; e compostos sintetizados quimicamente com propriedades conhecidas na técnica como sendo características de aminoácidos.
Exemplos de aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos de α-metila (por exemplo, alanina de α-metila), D-aminoácidos, aminoácidos semelhantes a histidina (por exemplo, 2-amino-histidina, β-hidróxi- histidina, homohistidina, α-fluorometil-histidina e α-metil-histidina), aminoácidos tendo um metileno extra na cadeia lateral (aminoácidos “homo”) e aminoácidos nos quais um grupo funcional de ácido carboxílico na cadeia lateral é substituída por um grupo de ácido sulfônico (por exemplo, ácido cisteico). A incorporação de aminoácidos não naturais, incluindo aminoácidos não nativos sintéticos, aminoácidos substituídos ou um ou mais D-aminoácidos nas proteínas da presente invenção pode ser vantajosa de várias maneiras diferentes. Peptídeos contendo D-aminoácido, etc., exibem maior estabilidade in vitro ou in vivo em comparação com contrapartes contendo L- aminoácido. Assim, a construção de peptídeos, etc., incorporando D-aminoácidos pode ser particularmente útil quando é desejada ou necessária uma maior estabilidade intracelular. Mais especificamente, os peptídeos D, etc., são resistentes a peptidases e proteases endógenas, proporcionando assim uma biodisponibilidade melhorada da molécula e tempos de vida prolongados in vivo quando tais propriedades são desejáveis. Além disso, os D-peptídeos, etc., não podem ser processados de forma eficiente para a apresentação restrita de classe II do complexo principal de histocompatibilidade para células T auxiliares e, portanto, são menos propensos a induzir respostas imunes humorais em todo o organismo.
[0146]Os aminoácidos podem ser denominados neste documento por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, da mesma forma, podem ser denominados por seus códigos de uma única letra comumente aceitos.
[0147]“Variantes modificadas de forma conservadora” se aplicam a ambas as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico No que diz respeito a sequências de ácido nucleico particulares, “variantes modificadas de forma conservadora” se referem aos ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Essas variações de ácido nucleico são “variações silenciosas”, que são uma espécie de variações modificadas de forma conservadora. Cada sequência de ácido nucleico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve todas as variações silenciosas possíveis do ácido nucleico. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que normalmente é o único códon para metionina, e TGG, que normalmente é o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.
[0148]Quanto às sequências de aminoácidos, uma pessoa versada na técnica reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais a um ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou sequência de proteína que altera, adiciona ou deleta um único aminoácido ou um pequeno porcentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma “variante modificada de forma conservadora”, em que a alteração resulta na deleção de um aminoácido, adição de um aminoácido ou substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são conhecidas das pessoas versadas na técnica. Essas variantes modificadas conservativamente são adicionais e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos da invenção.
[0149]As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são conhecidas por aquelas pessoas versadas na técnica. Cada um dos oito grupos a seguir contém aminoácidos que são substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M); (consultar, por exemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2ª edição (dezembro de 1993).
[0150]Os termos “idêntica” ou porcentagem de “identidade”, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais. As sequências são “substancialmente idênticas” se tiverem uma porcentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são iguais (isto é, cerca de 60 % de identidade,
cerca de 65 %, cerca de 70 %, cerca de 75 %, cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, ou cerca de 95 % de identidade em uma região especificada), quando comparada e alinhada para correspondência máxima em uma janela de comparação, ou região designada como medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência (ou outros algoritmos disponíveis para pessoas de habilidade comum na técnica) ou por alinhamento manual e inspeção visual. Esta definição também se refere ao complemento de uma sequência de teste. A identidade pode existir ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 50 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou ao longo de uma região que tem 75 a 100 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou, quando não especificado, ao longo de toda a sequência de um polinucleotídeo ou polipeptídeo. Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção, incluindo homólogos de espécies diferentes da humana, pode ser obtido por um processo que compreende as etapas de triagem de uma biblioteca sob condições de hibridização rigorosas com uma sonda marcada tendo uma sequência de polinucleotídeo da invenção ou um fragmento da mesma e isolamento de cDNA de comprimento total e clones genômicos contendo a referida sequência polinucleotídica. Essas técnicas de hibridação são bem conhecidas da pessoa versada na técnica.
[0151]A frase “hibridiza seletivamente (ou especificamente) para” se refere à ligação, duplexação ou hibridização de uma molécula apenas a uma sequência de nucleotídeos particular sob condições de hibridização rigorosas quando essa sequência está presente em uma mistura complexa (incluindo, mas não se limitando a, DNA ou RNA total celular ou de biblioteca).
[0152]A frase “condições de hibridização rigorosas” se refere à hibridização de sequências de DNA, RNA, PNA ou outros imitadores de ácido nucleico, ou combinações dos mesmos sob condições de baixa força iônica e alta temperatura, como é conhecido na técnica. Normalmente, sob condições rigorosas, uma sonda hibridizará com sua subsequência alvo em uma mistura complexa de ácido nucleico (incluindo, mas não se limitando a, total celular ou biblioteca de DNA ou RNA), mas não hibridiza com outras sequências na mistura complexa. As condições restritivas dependem da sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas.
[0153]Conforme usado neste documento, o termo “eucariota” se refere a organismos pertencentes ao domínio filogenético Eucarya, tais como animais (incluindo, mas não se limitando a, mamíferos, insetos, répteis, pássaros, etc.), ciliados, plantas (incluindo, mas não limitado a monocotiledôneas, dicotiledôneas, algas, etc.), fungos, leveduras, flagelados, microsporídios, protistas, etc.
[0154]Conforme usado neste documento, o termo “não eucariota” se refere a organismos não eucarióticos. Por exemplo, um organismo não eucariótico pode pertencer ao domínio filogenético de Eubacteria (incluindo, mas não limitado a, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.), ou o domínio filogênico Archaea (incluindo mas não se limitando a, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tal como Haloferax volcanii e Halobacterium espécie NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, etc.).
[0155]O termo “sujeito”, conforme usado neste documento, se refere a um animal, em algumas modalidades um mamífero, e em outras modalidades um ser humano, que é o objeto de tratamento, observação ou experimento. Um animal pode ser um animal de companhia (por exemplo, cães, gatos e semelhantes), animal de fazenda (por exemplo, vacas, ovelhas, porcos, cavalos e semelhantes) ou um animal de laboratório (por exemplo, ratos, camundongos, porquinhos-da-índia e semelhantes).
[0156]O termo “quantidade eficaz”, tal como utilizado neste documento, se refere à quantidade do polipeptídeo de aminoácido não natural modificado sendo administrado que irá aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas da doença, condição ou distúrbio sendo tratado. As composições contendo o polipeptídeo de aminoácido não natural modificado aqui descrito podem ser administradas para tratamentos profiláticos, intensificadores e/ou terapêuticos.
[0157]Os termos “realçar” ou “realce” significam aumentar ou prolongar em potência ou duração um efeito desejado. Assim, no que diz respeito ao aumento do efeito de agentes terapêuticos, o termo “intensificação” se refere à capacidade de aumentar ou prolongar, seja em potência ou duração, o efeito de outros agentes terapêuticos em um sistema. Uma “quantidade eficaz de intensificação”, tal como utilizada neste documento, se refere a uma quantidade adequada para aumentar o efeito de outro agente terapêutico em um sistema desejado. Quando usado em um paciente, as quantidades eficazes para este uso dependerão da gravidade e do curso da doença, distúrbio ou condição, terapia anterior, estado de saúde do paciente e resposta aos fármacos e do julgamento do médico assistente.
[0158]O termo “modificado”, tal como utilizado neste documento, se refere a quaisquer alterações feitas a um determinado polipeptídeo, como alterações no comprimento do polipeptídeo, a sequência de aminoácidos, estrutura química, modificação co-tradução ou modificação pós-tradução de um polipeptídeo. O termo da forma “(modificado)” significa que os polipeptídeos sendo discutidos são opcionalmente modificados, isto é, os polipeptídeos em discussão podem ser modificados ou não modificados.
[0159]O termo “modificado pós-tradução” se refere a qualquer modificação de um aminoácido natural ou não natural que ocorre a tal aminoácido após ele ter sido incorporado em uma cadeia de polipeptídeo. O termo abrange, apenas a título de exemplo, modificações co-traducionais in vivo, modificações co-traducionais in vitro
(como em um sistema de tradução livre de células), modificações pós-tradução in vivo e modificações pós-tradução in vitro.
[0160]Em aplicações profiláticas, as composições contendo a IL-2 são administradas a um paciente suscetível a ou de outra forma em risco de uma doença, distúrbio ou condição específica. Tal quantidade é definida como uma “quantidade profilaticamente eficaz”. Neste uso, as quantidades precisas também dependem do estado de saúde do paciente, peso e semelhantes. É considerado dentro da habilidade da técnica para alguém determinar tais quantidades profilaticamente eficazes por experimentação de rotina (por exemplo, um ensaio clínico de escalonamento de dose).
[0161]Em aplicações terapêuticas, as composições contendo o polipeptídeo de aminoácido não natural modificado são administradas a um paciente que já sofre de uma doença, condição ou distúrbio, em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos interromper parcialmente os sintomas da doença, distúrbio ou condição.
Tal quantidade é definida como uma “quantidade terapeuticamente eficaz” e dependerá da gravidade e do curso da doença, distúrbio ou condição, terapia anterior, estado de saúde do paciente e resposta aos medicamentos e do julgamento do médico assistente. É considerado dentro da habilidade da técnica para alguém determinar tais quantidades terapeuticamente eficazes por experimentação de rotina (por exemplo, um ensaio clínico de escalonamento de dose).
[0162]O termo “tratar” é usado para se referir a tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos.
[0163]Os polipeptídeos de aminoácidos codificados não naturalmente apresentados neste documento podem incluir compostos marcados isotopicamente com um ou mais átomos substituídos por um átomo tendo uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa normalmente encontrado na Natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos presentes compostos incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, flúor e cloro, tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 35S, 18F, 36Cl, respectivamente.
Certos compostos marcados isotopicamente aqui descritos, por exemplo aqueles nos quais isótopos radioativos tais como 3H e 14 C são incorporados, podem ser úteis em ensaios de distribuição de fármacos e/ou substrato em tecidos. Além disso, a substituição com isótopos como deutério, isto é, 2H, pode proporcionar certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou requisitos de dosagem reduzidos.
[0164]Todos os isômeros, incluindo, mas não se limitando a, diastereômeros, enantiômeros e suas misturas são considerados como parte das composições aqui descritas. Em outras modalidades ou adicionais, os polipeptídeos de aminoácidos codificados não naturalmente são metabolizados após a administração a um organismo com necessidade de produzir um metabólito que é então usado para produzir um efeito desejado, incluindo um efeito terapêutico desejado. Em modalidades adicionais ou adicionais são metabólitos ativos de polipeptídeos de aminoácidos codificados não naturalmente.
[0165]Em algumas situações, os polipeptídeos de aminoácido codificado não naturalmente podem existir como tautômeros. Além disso, os polipeptídeos de aminoácido codificado não naturalmente descritos aqui podem existir em formas não solvatadas, bem como solvatadas, com solventes farmaceuticamente aceitáveis, tais como água, etanol e semelhantes. As formas solvatadas também são consideradas como divulgadas aqui. Aquelas pessoas de habilidade comum na técnica reconhecerão que alguns dos compostos aqui descritos podem existir em várias formas tautoméricas. Todas essas formas tautoméricas são consideradas como parte das composições aqui descritas.
[0166]A menos que de outro modo indicado, são empregados métodos convencionais de espectroscopia de massa, NMR, HPLC, química de proteínas,
bioquímica, técnicas de DNA recombinante e farmacologia, dentro da perícia na técnica.
DESCRIÇÃO DETALHADA I. Introdução
[0167]As moléculas de IL-2 compreendendo pelo menos um aminoácido não natural são fornecidas na invenção. Em certas modalidades da invenção, a IL-2 com pelo menos um aminoácido não natural inclui pelo menos uma modificação pós- tradução. Em uma modalidade, a pelo menos uma modificação pós-tradução compreende a ligação de uma molécula incluindo, mas não se limitando a, um marcador, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água, um derivado de polietilenoglicol, um fotoreticulador, um radionuclídeo, um composto citotóxico, um fármaco, um marcador de afinidade, um marcador de fotoafinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante de metal, um cofator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA, um polinucleotídeo antessentido, um sacarídeo, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucleico inibitório, um biomaterial, uma nanopartícula, um marcador de spin, um fluoróforo, uma porção contendo metal, uma porção radioativa, um novo grupo funcional, um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, uma porção fotoencapsulada, uma porção excitável por radiação actínica, uma porção fotoisomerizável, biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, uma porção que incorpora um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado ao carbono, um agente redox ativo, um aminotioácido, uma porção tóxica, uma porção marcada isotopicamente, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso de elétron, um grupo magnético, um grupo intercalante, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um marcador detectável, uma pequena molécula, um ponto quântico, um nanotransmissor, um radionucleotídeo, um radiotransmissor, um agente de captura de nêutrons ou qualquer combinação dos acima ou qualquer outro composto ou substância desejável, compreendendo um segundo grupo reativo a pelo menos um aminoácido não natural compreendendo um primeiro grupo reativo utilizando metodologia química que é conhecida para uma pessoa versada na técnica para ser adequado para os grupos reativos particulares. Por exemplo, o primeiro grupo reativo é uma porção de alquinila (incluindo, mas não se limitando a, no aminoácido não natural p-propargiloxifenilalanina, onde o grupo propargil também é às vezes referido como uma porção de acetileno) e o segundo grupo reativo é uma porção de azido, e [3 + 2] metodologias de química de cicloadição são utilizadas. Em outro exemplo, o primeiro grupo reativo é a porção de azido (incluindo, mas não se limitando a, no aminoácido não natural p-azido-L-fenilalanina ou pAZ como é às vezes denominado dentro deste relatório descritivo) e o segundo grupo reativo é a porção de alquinila. Em certas modalidades da IL-2 modificada da presente invenção, pelo menos um aminoácido não natural (incluindo, mas não se limitando a, aminoácido não natural contendo um grupo funcional ceto) compreendendo pelo menos uma modificação pós-tradução, é usado onde a pelo menos uma modificação pós-tradução compreende uma porção de sacarídeo. Em certas modalidades, a modificação pós- tradução é feita in vivo em uma célula eucariótica ou em uma célula não eucariótica.
Um ligante, polímero, polímero solúvel em água, ou outra molécula pode ligar a molécula ao polipeptídeo. Em uma modalidade adicional, o ligante ligado à IL-2 é longo o suficiente para permitir a formação de um dímero. A molécula pode também ser ligada diretamente ao polipeptídeo.
[0168]Em certas modalidades, a proteína de IL-2 inclui pelo menos uma modificação pós-tradução que é feita in vivo por uma célula hospedeira, onde a modificação pós-tradução não é normalmente feita por um outro tipo de célula hospedeira. Em certas modalidades, a proteína inclui pelo menos uma modificação pós-tradução que é feita in vivo por uma célula eucariótica, onde a modificação pós- tradução não é normalmente feita por um célula não eucariótica. Exemplos de modificações de pós-tradução incluem, mas não estão se limitando a, glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lipídeo, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação de ligação de glicolipídeo, e semelhantes.
[0169] Em algumas modalidades, a IL-2 compreende um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente para glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lipídeo, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, ou modificação de ligação de glicolipídeo do polipeptídeo. Em algumas modalidades, a IL-2 compreende um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente para glicosilação do polipeptídeo.
Em algumas modalidades, a IL-2 compreende um ou mais aminoácidos codificados naturalmente para glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lipídeo, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, ou modificação de ligação de glicolipídeo do polipeptídeo. Em algumas modalidades, a IL-2, compreende um ou mais aminoácidos codificados naturalmente para glicosilação do polipeptídeo.
[0170]Em algumas modalidades, a IL-2 compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácido codificado não naturalmente que realçam a glicosilação do polipeptídeo. Em algumas modalidades, a IL-2 compreende uma ou mais deleções que realçam a glicosilação do polipeptídeo. Em algumas modalidades, a IL-2 compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácido codificado não naturalmente que realçam a glicosilação em um diferente aminoácido no polipeptídeo. Em algumas modalidades, a IL-2 compreende uma ou mais deleções que realçam a glicosilação em um aminoácido diferente no polipeptídeo. Em algumas modalidades, a IL-2 compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácido codificado não naturalmente que realçam a glicosilação em um aminoácido codificado não naturalmente no polipeptídeo. Em algumas modalidades,
a IL-2 compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácido codificado não naturalmente que realçam a glicosilação em um aminoácido codificado naturalmente no polipeptídeo. Em algumas modalidades, a IL-2 compreende um ou mais adições e/ou substituições de aminoácido codificado naturalmente que realçam a glicosilação em um aminoácido diferente no polipeptídeo. Em algumas modalidades, a IL-2 compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácido codificado não naturalmente que realçam a glicosilação em um aminoácido codificado naturalmente no polipeptídeo. Em algumas modalidades, a IL-2 compreende uma ou mais adições e/ou substituições de aminoácido codificado não naturalmente que realçam a glicosilação em um aminoácido codificado não naturalmente no polipeptídeo.
[0171] Em uma modalidade, a modificação pós-tradução compreende a ligação de um oligossacarídeo a uma asparagina por uma ligação GlcNAc-asparagina (incluindo, mas não se limitando a, onde o oligossacarídeo compreende (GlcNAc- Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc, e semelhantes). Em uma outra modalidade, a modificação pós-tradução compreende a ligação de um oligossacarídeo (incluindo, mas não se limitando a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por uma ligação de GalNAc-serina, uma GalNAc-treonina, uma GlcNAc-serina, ou uma GlcNAc-treonina. Em certas modalidades, uma proteína ou polipeptídeo da invenção pode compreender uma secreção ou sequência de localização, um marcador de epítopo, um marcador de FLAG, um marcador de polihistidina, uma fusão de GST, e/ou semelhantes. Exemplos de sequências de sinal de secreção incluem, mas não estão se limitando a, uma sequência de sinal de secreção procariótica, uma sequência de sinal de secreção eucariótica, uma sequência de sinal de secreção eucariótica 5’- otimizada para expressão bacteriana, uma nova sequência de sinal de secreção, sequência de sinal de secreção de pectato liase, sequência de sinal de secreção de Omp A, e uma sequência de sinal de secreção de fago. Exemplos de sequências de sinal de secreção incluem, mas não estão se limitando a, STII (procariótico), Fd GIII e M13 (fago), Bgl2 (levedura), e a sequência de sinal bla derivado de um transposon.
Qualquer tal sequência pode ser modificada para fornecer um resultado desejado com o polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, substituir uma sequência de sinal com uma sequência de sinal diferente, substituir uma sequência líder com uma sequência líder diferente, etc.
[0172]A proteína ou polipeptídeo de interesse pode conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou dez ou mais não aminoácidos naturais. Os aminoácidos não naturais podem ser os mesmos ou diferentes, por exemplo, pode haver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sítios diferentes na proteína que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos não naturais diferentes. Em certas modalidades, pelo menos um, mas menos do que todos, de um aminoácido particular presente em uma versão de ocorrência natural da proteína é substituído com um aminoácido não natural.
[0173]A presente invenção fornece métodos e composições com base em IL- 2 compreendendo pelo menos um aminoácido codificado não naturalmente. A introdução de pelo menos um aminoácido codificado não naturalmente em IL-2 pode permitir a aplicação de químicas de conjugação que envolvem reações químicas específicas, incluindo, mas não se limitando a, com um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente embora não reaja com os 20 aminoácidos de ocorrência comum. Em algumas modalidades, a IL-2 compreendendo o aminoácido codificado não naturalmente está ligada a um polímero solúvel em água, tal como polietilenoglicol (PEG), por meio da cadeia lateral do aminoácido codificado não naturalmente. Esta invenção fornece um método altamente eficiente para a modificação seletiva de proteínas com derivados de PEG, que envolve a incorporação seletiva de aminoácidos não codificados geneticamente, incluindo mas não se limitando a, aqueles aminoácidos contendo grupos funcionais ou substituintes não encontrados no 20 naturalmente aminoácidos incorporados, incluindo mas não se limitando a uma porção de cetona, uma azida ou acetileno, em proteínas em resposta a um códon seletor e a modificação subsequente desses aminoácidos com um derivado de PEG adequadamente reativo. Uma vez incorporadas, as cadeias laterais de aminoácidos podem então ser modificadas utilizando metodologias químicas conhecidas pelas pessoas versadas na técnica como sendo adequadas para os grupos funcionais particulares ou substituintes presentes no aminoácido codificado não naturalmente.
As metodologias químicas conhecidas de uma ampla variedade são adequadas para uso na presente invenção para incorporar um polímero solúvel em água na proteína.
Tais metodologias incluem, mas não estão limitadas a uma reação de cicloadição de Huisgen (consultar, por exemplo, Padwa, A. em Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, BM, Pergamon, Oxford, páginas 1069 a 1109; e, Huisgen, R.
em 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, páginas 1 a 176) com, incluindo, mas não se limitando a, derivados de acetileno ou azida, respectivamente.
[0174]Como o método de cicloadição de Huisgen [3 + 2] envolve uma cicloadição em vez de uma reação de substituição nucleofílica, as proteínas podem ser modificadas com seletividade extremamente alta. A reação pode ser realizada à temperatura ambiente em condições aquosas com excelente regiosseletividade (1,4 > 1,5) pela adição de quantidades catalíticas de sais de Cu (I) à mistura de reação.
Consultar, por exemplo, Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; e, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599; e WO 03/101972.
Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção através de uma cicloadição [3 + 2] inclui virtualmente qualquer molécula com um grupo funcional adequado ou substituinte incluindo, mas não limitado a um derivado de azido ou acetileno. Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não natural com um grupo acetileno, incluindo, mas não se limitando a, p-propargiloxifenilalanina, ou grupo azido, incluindo, mas não se limitando a p-azido-fenilalanina, respectivamente.
[0175]O anel de cinco-membros que resulta a partir da cicloadição de Huisgen [3 + 2] não é geralmente reversível em ambientes redutores e é estável contra hidrólise por longos períodos em ambientes aquosos. Consequentemente, as características físicas e químicas de uma ampla variedade de substâncias podem ser modificadas em condições aquosas exigentes com os derivados ativos de PEG da presente invenção. Ainda mais importante, porque as porções de azida e acetileno são específicas uma da outra (e não reagem, por exemplo, com qualquer um dos 20 aminoácidos geneticamente codificados comuns), as proteínas podem ser modificadas em um ou mais sítios específicos com alta seletividade.
[0176]A invenção também fornece derivados solúveis em água e hidroliticamente estáveis de derivados de PEG e polímeros hidrofílicos relacionados tendo uma ou mais porções de acetileno ou azida. Os derivados de polímero de PEG que contêm porções de acetileno são altamente seletivos para o acoplamento com porções de azida que foram introduzidas seletivamente em proteínas em resposta a um códon seletor. Da mesma forma, derivados de polímero de PEG que contêm porções de azida são altamente seletivos para o acoplamento com porções de acetileno que foram introduzidas seletivamente em proteínas em resposta a um códon seletor.
[0177]Mais especificamente, as porções azida compreendem, mas não estão limitadas a alquila azidas, arila azidas e derivados dessas azidas. Os derivados das alquila e arila azidas podem incluir outros substituintes, desde que a reatividade específica do acetileno seja mantida. As porções de acetileno compreendem alquila e arila acetilenos e derivados de cada um. Os derivados de alquila e arila acetilenos podem incluir outros substituintes, desde que a reatividade específica da azida seja mantida.
[0178]A presente invenção fornece conjugados de substâncias tendo uma ampla variedade de grupos funcionais, substituintes ou porções, com outras substâncias incluindo, mas não se limitando a um marcador; um corante; um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietilenoglicol; um fotoreticulador; um radionuclídeo; um composto citotóxico; um fármaco; um marcador de afinidade; um marcador de fotoafinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou polipeptídeo análogo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; um cofator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo antessentido; um sacarídeo; um dendrímero solúvel em água; uma ciclodextrina; um ácido ribonucleico inibidor; um biomaterial; uma nanopartícula; um marcador de spin; um fluoróforo, uma porção contendo metal; uma porção radioativa; um novo grupo funcional; um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas; uma porção fotoencapsulada; uma porção excitável por radiação actínica; uma porção fotoisomerizável; biotina; um derivado da biotina; um análogo de biotina; uma porção que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo fotoclivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado ao carbono; um agente redox ativo; um aminotioácido; uma porção tóxica; uma porção marcada isotopicamente; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo denso de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo; um marcador detectável; uma pequena molécula; um ponto quântico; um nanotransmissor; um radionucleotídeo; um radiotransmissor; um agente de captura de nêutrons; ou qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outro composto ou substância desejável. A presente invenção também inclui conjugados de substâncias tendo porções de azida ou acetileno com derivados de polímero de PEG tendo as porções de acetileno ou azida correspondentes. Por exemplo, um polímero de PEG contendo uma porção de azida pode ser acoplado a uma molécula biologicamente ativa em uma posição na proteína que contém um aminoácido não codificado geneticamente com uma funcionalidade de acetileno. A ligação pela qual o PEG e a molécula biologicamente ativa são acoplados inclui, mas não está limitada ao produto de cicloadição Huisgen [3 + 2].
[0179]Está bem estabelecido na técnica que o PEG pode ser usado para modificar as superfícies de biomateriais (consultar, por exemplo, Patente US Nº
6.610.281; Mehvar, R., J. Pharm Sci., 3 (1): 125-136 (2000), que são aqui incorporados por referência). A invenção também inclui biomateriais compreendendo uma superfície com um ou mais sítios de azida ou acetileno reativos e um ou mais dos polímeros contendo azida ou acetileno da invenção acoplados à superfície através da ligação de cicloadição de Huisgen [3 + 2]. Os biomateriais e outras substâncias também podem ser acoplados aos derivados de polímero ativados por azida ou acetileno através de uma ligação diferente da ligação de azida ou acetileno, tal como através de uma ligação compreendendo uma porção de ácido carboxílico, amina, álcool ou tiol, para deixar a porção de azida ou acetileno disponível para reações subsequentes.
[0180]A invenção inclui um método de sintetizar os polímeros contendo azida e acetileno da invenção. No caso do derivado de PEG contendo azida, a azida pode ser ligada diretamente a um átomo de carbono do polímero. Alternativamente, o derivado de PEG contendo azida pode ser preparado ligando um agente de ligação que tem a porção de azida em um terminal a um polímero ativado convencional de modo que o polímero resultante tenha a porção de azida em seu terminal. No caso do derivado de PEG contendo acetileno, o acetileno pode ser ligado diretamente a um átomo de carbono do polímero. Alternativamente, o derivado de PEG contendo acetileno pode ser preparado ligando um agente de ligação que tem a porção acetileno em um terminal a um polímero ativado convencional de modo que o polímero resultante tenha a porção de acetileno em seu terminal.
[0181]Mais especificamente, no caso do derivado de PEG contendo azida, um polímero solúvel em água com pelo menos uma porção de hidroxila ativa sofre uma reação para produzir um polímero substituído com uma porção mais reativa, tal como um mesilato, tresilato, tosilato ou grupo de partida de halogênio. A preparação e utilização de derivados de PEG contendo halogenetos de ácido sulfonilo, átomos de halogéneo e outros grupos de partida são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. O polímero substituído resultante então sofre uma reação para substituir a porção mais reativa por uma porção de azida no terminal do polímero.
Alternativamente, um polímero solúvel em água tendo pelo menos uma porção nucleofílica ou eletrofílica ativa sofre uma reação com um agente de ligação que tem uma azida em um terminal de modo que uma ligação covalente seja formada entre o polímero de PEG e o agente de ligação e a porção de azida são posicionados na extremidade do polímero. Porções nucleofílicas e eletrofílicas, incluindo aminas, tióis, hidrazidas, hidrazinas, álcoois, carboxilatos, aldeídos, cetonas, tioésteres e semelhantes, são conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica.
[0182]Mais especificamente, no caso do derivado de PEG contendo acetileno, um polímero solúvel em água com pelo menos uma porção de hidroxila ativa sofre uma reação para deslocar um halogênio ou outro grupo de partida ativado de um precursor que contém uma porção de acetileno. Alternativamente, um polímero solúvel em água com pelo menos uma porção nucleofílica ou eletrofílica ativa sofre uma reação com um agente de ligação que tem um acetileno em um terminal de modo que uma ligação covalente seja formada entre o polímero de PEG e o agente de ligação e a porção de acetileno é posicionado na extremidade do polímero. O uso de porções de halogênio, grupo de partida ativado, porções nucleofílicas e eletrofílicas no contexto de síntese orgânica e a preparação e uso de derivados de PEG está bem estabelecido para os praticantes na técnica.
[0183] A invenção também fornece um método para a modificação seletiva de proteínas para adicionar outras substâncias à proteína modificada, incluindo, mas não se limitando a polímeros solúveis em água, tais como PEG e derivados de PEG contendo uma porção azida ou acetileno. Os derivados de PEG contendo azida e acetileno podem ser usados para modificar as propriedades de superfícies e moléculas onde a biocompatibilidade, estabilidade, solubilidade e falta de imunogenicidade são importantes, enquanto ao mesmo tempo fornecem um meio mais seletivo de anexar os derivados de PEG às proteínas do que era anteriormente conhecido na técnica.
II. Métodos Gerais de Ácido Nucléico Recombinante para Uso com a Invenção
[0184]Em várias modalidades da presente invenção, os ácidos nucleicos que codificam uma IL-2 de interesse serão isolados, clonados e frequentemente alterados usando métodos recombinantes. Tais modalidades são usadas, incluindo, mas não se limitando a, para a expressão de proteínas ou durante a geração de variantes, derivados, cassetes de expressão ou outras sequências derivadas de uma IL-2. Em algumas modalidades, as sequências que codificam os polipeptídeos da invenção estão operacionalmente ligadas a um promotor heterólogo.
[0185]A sequência de aminoácidos da proteína de IL-2 humana madura é mostrada abaixo na Tabela 1.
Tabela 1- Proteína de IL-2 e sequências de DNA SEQ. Descrição Sequência ID. NO. 1 Sequência de MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL aminoácido - TRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIV IL-2 do tipo LELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT selvagem com sequência líder, (expressão eucariótica) 2 Sequência de APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHL aminoácido - QCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA proteína de IL- TIVEFLNRWITFCQSIISTLT 2 humana madura (expressão eucariótica) 3 Sequência de MPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHL aminoácido - QCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA proteína de IL- TIVEFLNRWITFSQSIISTLT 2 humana madura expressa em E. coli. 4 Sequência de ATGCCGACCAGCAGTAGCACCAAGAAAACTCAGCTGCAGCTGGAGCATCTG DNA - gene CTGCTGGATTTACAGATGATTCTGAATGGCATTAATAATTACAAAAATCCGAAA sintético da IL- CTGACCCGCATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCGAAGAAGGCCACCGAAC 2 humana TGAAGCATCTGCAGTGTTTAGAAGAGGAACTGAAGCCGCTGGAAGAGGTGCT clonado no GAATTTAGCCCAGAGCAAAAACTTCCATCTGCGCCCGCGCGATTTAATTAGC plasmídeo de AATATTAACGTGATTGTGCTGGAACTGAAAGGCAGCGAGACCACCTTTATGT expressão GCGAGTACGCAGATGAGACCGCCACCATCGTGGAATTTTTAAACCGCTGGAT pKG0269. CACCTTCAGCCAGAGTATCATTAGCACTTTAACC (Códon otimizado de E.coli).
5 Sequência de MAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKH aminoácido - LQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA proteína de IL- TIVEFLNRWITFSQSIISTLT 2 humana madura com Alanina N- terminal após o códon de início, ATG, expresso em E. coli. 6 Sequência de ATG GCA CCG ACC AGC AGT AGC ACC AAG AAA AGE CAG CTG CAG CTG DNA - GAG CAT CTG CTG CTG GAT TTA CAG ATG proteína de IL- ATT CTG AAT GGC ATT AAT AAT TAC AAA AAT CCG AAA CTG ACC CGC 2 humana com ATG CTG ACC TTC AAG TTC TAC ATG CCG AAG AAG GCC ACC GAA CTG Alanina N- AAG CAT CTG CAG TGT TTA GAA GAG GAA CTG AAG CCG CTG GAA GAG terminal após GTG CTG AAT TTA GCC CAG AGC AAA AAC TTC CAT CTG CGC CCG CGC o códon de GAT TTA ATT AGC AAT ATT AAC GTG ATT GTG CTG GAA CTG AAA GGC início, ATG. AGC GAG ACC ACC TTT ATG TGC GAG TAC GCA GAT GAG ACC GCC ACC
ATC GTG GAA TTT TTA AAC CGC TGG ATC ACC TTC AGC CAG AGT ATC
ATT AGC AGE TTA ACC 7 Sequência de MTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ aminoácido - CLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATI proteína de IL- VEFLNRWITFSQSIISTLT 2 humana madura com Deleção de Prolina N- terminal após o códon de início, ATG, expresso em E. coli. 8 Sequência de ATG ACC AGC AGT AGC ACC AAG AAA AGE CAG CTG CAG CTG GAG CAT codificação de CTG CTG CTG GAT TTA CAG ATG ATT CTG DNA - AAT GGC ATT AAT AAT TAC AAA AAT CCG AAA CTG ACC CGC ATG CTG proteína de IL- ACC TTC AAG TTC TAC ATG CCG AAG AAG GCC ACC GAA CTG AAG CAT 2 humana com CTG CAG TGT TTA GAA GAG GAA CTG AAG CCG CTG GAA GAG GTG CTG Deleção de AAT TTA GCC CAG AGC AAA AAC TTC CAT CTG CGC CCG CGC GAT TTA Prolina N- ATT AGC AAT ATT AAC GTG ATT GTG CTG GAA CTG AAA GGC AGC GAG terminal após ACC ACC TTT ATG TGC GAG TAC GCA GAT GAG ACC GCC ACC ATC GTG o códon de GAA TTT TTA AAC CGC TGG ATC ACC TTC AGC CAG AGT ATC ATT AGC início, ATG AGE TTA ACC
[0186] Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente pode ser sintetizada na base da sequência de aminoácido do polipeptídeo precursor, incluindo, mas não se limitando a, tendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5 ou 7, e então alterando a sequência de nucleotídeos de modo a efetuar a introdução (isto é, incorporação ou substituição) ou remoção (isto é, deleção ou substituição) do(s) resíduo(s) de aminoácido relevante(s). A sequência de nucleotídeo pode ser convenientemente modificada por mutagénese dirigida ao sítio de acordo com métodos convencionais. Alternativamente, a sequência de nucleotídeos pode ser preparada por síntese química, incluindo, mas não se limitando a, usando um sintetizador de oligonucleotídeos, em que os oligonucleotídeos são projetados com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo desejado e, de preferência, selecionando aqueles códons que são favorecidos na célula hospedeira na qual o polipeptídeo recombinante será produzido. Por exemplo, vários pequenos oligonucleotídeos que codificam para porções do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e montados por PCR, ligação ou reação em cadeia de ligação. Consultar, por exemplo, Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991); Patente U.S.
Nº 6.521.427 que são incorporados por referência aqui.
[0187]Uma Sequência de DNA do gene de IL-2 humano sintético que foi clonado no plasmídeo de expressão pKG0269 é mostrada na Tabela 1, acima, como SEQ ID NO: 4. Esta sequência de DNA foi otimizada para códons de E. coli.
[0188]Esta invenção utiliza técnicas de rotina no campo da genética recombinante. Os textos básicos que revelam os métodos gerais de utilização nesta invenção incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3ª ed.
2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).
[0189]A invenção também se refere a células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras não eucarióticas e organismos para a incorporação in vivo de um aminoácido não natural via pares de tRNA/RS ortogonais. As células hospedeiras são geneticamente modificadas (incluindo, mas não se limitando a, transformadas, transduzidas ou transfectadas) com os polinucleotídeos da invenção ou construções que incluem um polinucleotídeo da invenção, incluindo, mas não se limitando a, um vetor da invenção, que pode ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão.
[0190]Vários métodos bem conhecidos de introdução de ácidos nucleicos alvo em células estão disponíveis, qualquer um dos quais pode ser usado na invenção.
Estes incluem: fusão das células receptoras com protoplastos bacterianos contendo o DNA, eletroporação, bombardeio de projéteis e infecção com vetores virais (discutido mais adiante, abaixo), etc. As células bacterianas podem ser usadas para amplificar o número de plasmídeos contendo construções de DNA deste invenção. As bactérias são cultivadas até a fase log e os plasmídeos dentro das bactérias podem ser isolados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Sambrook). Além disso, os kits estão disponíveis comercialmente para a purificação de plasmídeos de bactérias, (consultar, por exemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™ de Stratagene; e, QIAprep™ de Qiagen).
Os plasmídeos isolados e purificados são então manipulados para produzir outros plasmídeos, usados para transfectar células ou incorporados em vetores relacionados para infectar organismos. Os vetores típicos contêm terminadores de transcrição e tradução, sequências de iniciação de transcrição e tradução e promotores úteis para a regulação da expressão do ácido nucleico alvo particular. Os vetores opcionalmente compreendem cassetes de expressão genérica contendo pelo menos uma sequência terminadora independente, sequências que permitem a replicação da cassete em eucariotas ou procariotas, ou ambos, (incluindo, mas não se limitando a, vetores de transporte) e marcadores de seleção para sistemas procarióticos e eucarióticos. Os vetores são adequados para replicação e integração em procariotas, eucariotos ou ambos. Consultar, Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos supra). Um catálogo de bactérias e bacteriófagos úteis para clonagem é fornecido, por exemplo, pela ATCC, por exemplo, The ATCC Catalog of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds) publicado pela ATCC. Os procedimentos básicos adicionais para sequenciamento, clonagem e outros aspectos da biologia molecular e considerações teóricas subjacentes também são encontrados em Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Além disso, essencialmente qualquer ácido nucléico (e virtualmente qualquer ácido nucléico marcado, seja padrão ou não) pode ser personalizado ou pedido padrão de qualquer uma de uma variedade de fontes comerciais, como a Midland Certified Reagent Company (Midland, TX disponível em World Wide Web em mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponível na World Wide Web em genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponível na World Wide Web em expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitos outros.
CÓDONS SELETORES
[0191]Os códons seletores da invenção expandem a estrutura do códon genético da maquinaria biossintética de proteínas. Por exemplo, um códon seletor inclui, mas não está limitado a um códon único de três bases, um códon sem sentido, como um códon de parada, incluindo, mas não se limitando a, um códon âmbar (UAG), um códon ocre ou um códon opala (UGA), um códon não natural, um códon de quatro ou mais bases, um códon raro ou semelhantes. É prontamente aparente para aquelas pessoas versadas na técnica que há uma grande variedade no número de códons seletores que podem ser introduzidos em um gene ou polinucleotídeo desejado, incluindo, mas não se limitando a, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais em um único polinucleotídeo que codifica pelo menos uma porção da IL-2.
[0192]Em uma modalidade, os métodos envolvem o uso de um códon seletor que é um códon de parada para a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais in vivo. Por exemplo, é produzido um O-tRNA que reconhece o códon de parada, incluindo, mas não se limitando a, UAG, e é aminoacilado por um O-RS com um aminoácido não natural desejado. Este O-tRNA não é reconhecido pelas aminoacil-tRNA sintetases do hospedeiro de ocorrência natural. A mutagênese dirigida ao sítio convencional pode ser usada para introduzir o códon de parada, incluindo, mas não se limitando a, TAG, no sítio de interesse em um polipeptídeo de interesse. Consultar, por exemplo, Sayers, J.R., et al. (1988), 5’-3’ Exonucleases em mutagênese dirigida por oligonucleotídeo à base de fosforotioato. Nucleic Acids Res, 16: 791-802. Quando o O-RS, O-tRNA e o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de interesse são combinados in vivo, o aminoácido não natural é incorporado em resposta ao códon de UAG para dar um polipeptídeo contendo o aminoácido não natural na posição especificada.
[0193]A incorporação de aminoácidos não naturais in vivo pode ser feita sem perturbação significativa da célula hospedeira eucariótica. Por exemplo, porque a eficiência de supressão para o códon de UAG depende da competição entre o O- tRNA, incluindo, mas não se limitando a, o tRNA supressor âmbar e um fator de liberação eucariótico (incluindo, mas não limitado a, eRF) (que se liga a um códon de parada e inicia a liberação do peptídeo em crescimento do ribossomo), a eficiência de supressão pode ser modulada, incluindo, mas não se limitando a, aumentar o nível de expressão de O-tRNA e/ou o tRNA supressor.
[0194]Os aminoácidos não naturais também podem ser codificados com códons raros. Por exemplo, quando a concentração de arginina em uma reação de síntese de proteínas in vitro é reduzida, o códon raro de arginina, AGG, provou ser eficiente para a inserção de Ala por um tRNA sintético acilado com alanina. Consultar, por exemplo, Ma et al., Biochemistry, 32: 7939 (1993). Nesse caso, o tRNA sintético compete com o tRNAArg de ocorrência natural, que existe como uma espécie secundária em Escherichia coli. Alguns organismos não usam todos os códons tripletos. Um códon de AGA não atribuído em Micrococcus luteus foi utilizado para a inserção de aminoácidos em um extrato de transcrição/tradução in vitro. Consultar, por exemplo, Kowal e Oliver, Nucl. Acid. Res., 25: 4685 (1997). Os componentes da presente invenção podem ser gerados para usar esses códons raros in vivo.
[0195]Os códons seletores também compreendem códons estendidos, incluindo, mas não se limitando a, quatro ou mais códons de base, tais como, quatro, cinco, seis ou mais códons de base. Exemplos de códons de quatro bases incluem, mas não estão limitados a AGGA, CUAG, UAGA, CCCU e semelhantes. Exemplos de códons de cinco bases incluem, mas não estão limitados a AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC e semelhantes. Uma característica da invenção inclui o uso de códons estendidos com base na supressão de frameshift. Quatro ou mais códons de base podem inserir, incluindo, mas não se limitando a, um ou vários aminoácidos não naturais na mesma proteína. Por exemplo, na presença de O-tRNAs mutados, incluindo, mas não se limitando a, tRNAs supressores de frameshift especiais, com loops de anticódon, por exemplo, com loops de anticódon de pelo menos 8 a 10 nt, o códon de quatro ou mais bases é lido como único aminoácido. Em outras modalidades, os loops de anticódon podem decodificar, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um códon de quatro bases, pelo menos um códon de cinco bases ou pelo menos um códon de seis bases ou mais. Uma vez que existem 256 códons de quatro bases possíveis, vários aminoácidos não naturais podem ser codificados na mesma célula usando um códon de quatro ou mais bases. Consultar, Anderson et al., Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9: 237-244, (2002); Magliery, Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of “Shifty” Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769, (2001).
[0196]Por exemplo, os códons de quatro bases têm sido usados para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas usando métodos biossintéticos in vitro. Consultar, por exemplo, Ma et al., Biochemistry, 32: 7939, (1993); e Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc., 121: 34, (1999). CGGG e AGGU foram usados para incorporar simultaneamente 2-naftilalanina e um derivado de NBD de lisina em estreptavidina in vitro com dois ARNt supressores de frameshift quimicamente acilados. Consultar, por exemplo, Hohsaka et al., J. Am. Chem. Soc., 121: 12194, (1999). Em um estudo in vivo, Moore et al. examinaram a capacidade dos derivados de tRNALeu com anticódons de NCUA para suprimir códons de UAGN (N pode ser U, A, G ou C) e descobriram que o quádruplo UAGA pode ser decodificado por um tRNALeu com um anticódon UCUA com uma eficiência de 13 a 26 % com pouca decodificação no quadro 0 ou -1. Consultar, Moore et al., J. Mol. Biol., 298: 195, (2000). Em uma modalidade, os códons estendidos com base em códons raros ou códons sem sentido podem ser usados na presente invenção, o que pode reduzir a leitura sem sentido e a supressão de frameshift em outros sítios indesejados.
[0197]Para um determinado sistema, um códon seletor também pode incluir um dos códons naturais de três bases, onde o sistema endógeno não usa (ou raramente usa) o códon de base natural. Por exemplo, isso inclui um sistema que não tem um tRNA que reconhece o códon natural de três bases e/ou um sistema onde o códon de três bases é um códon raro.
[0198]Os códons seletores incluem opcionalmente pares de bases não naturais. Esses pares de bases não naturais expandem ainda mais o alfabeto genético existente. Um par de bases extra aumenta o número de códons tripletos de 64 para
125. As propriedades dos pares de bases terceiras incluem emparelhamento de bases estáveis e seletivas, incorporação enzimática eficiente no DNA com alta fidelidade por uma polimerase e a extensão do iniciador continuada eficiente após a síntese do par de bases não natural nascente. As descrições de pares de bases não naturais que podem ser adaptados para métodos e composições incluem, por exemplo, Hirao, et al., Um par de bases não naturais para incorporar análogos de aminoácidos em proteína, Nature Biotechnology, 20: 177-182, (2002). Consultar, também, Wu, Y., et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 14626-14630, (2002). Outras publicações relevantes estão listadas abaixo.
[0199]Para uso in vivo, o nucleosídeo não natural é permeável à membrana e é fosforilado para formar o trifosfato correspondente. Além disso, o aumento da informação genética é estável e não é destruído por enzimas celulares. Esforços anteriores de Benner e outros aproveitaram os padrões de ligações de hidrogênio que são diferentes daqueles em pares canônicos de Watson-Crick, o exemplo mais notável é o par de iso-C:iso-G. Consultar, por exemplo, Switzer et al., J. Am. Chem.
Soc., 111:8322, (1989); e Piccirilli et al., Nature, 343:33, (1990); Kool, Curr. Opin.
Chem. Biol., 4:602, (2000). Em geral, essas bases se emparelham em algum grau com as bases naturais e não podem ser replicadas enzimaticamente. Kool e colegas de trabalho demonstraram que as interações de empacotamento hidrofóbico entre as bases podem substituir as ligações de hidrogênio para conduzir a formação do par de bases. Consultar, Kool, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602, (2000); e Guckian e Kool, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825, (1998). Em um esforço para desenvolver um par de bases não naturais que satisfaça todos os requisitos acima, Schultz, Romesberg e colegas de trabalho sintetizaram e estudaram sistematicamente uma série de bases hidrofóbicas não naturais. Descobriu-se que um autopar PICS: PICS é mais estável do que os pares de bases naturais e pode ser eficientemente incorporado no DNA pelo fragmento Klenow da DNA polimerase I (KF) de Escherichia coli.
Consultar, por exemplo, McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11585-6, (1999); e Ogawa et al., J. Am. Chem. Soc., 122:3274, (2000). Um autopar 3MN: 3MN pode ser sintetizado por KF com eficiência e seletividade suficientes para a função biológica.
Consultar, por exemplo, Ogawa et al., J. Am. Chem. Soc., 122:8803, (2000). No entanto, ambas as bases atuam como um terminador de cadeia para replicação posterior. Uma DNA polimerase mutante foi recentemente desenvolvida e pode ser usada para replicar o autopar de PICS. Além disso, um autopar 7AI pode ser replicado.
Consultar, por exemplo, Tae et al., J. Am. Chem. Soc., 123:7439, (2001). Um novo par de metalobases, Dipic: Py, também foi desenvolvido, o qual forma um par estável ao ligar-se ao Cu (II). Consultar, Meggers et al., J. Am. Chem. Soc., 122:10714, (2000). Como códons estendidos e códons não naturais são intrinsecamente ortogonais aos códons naturais, os métodos da invenção podem tirar vantagem dessa propriedade para gerar tRNAs ortogonais para eles.
[0200]Um sistema de desvio de tradução também pode ser usado para incorporar um aminoácido não natural em um polipeptídeo desejado. Em um sistema de desvio de tradução, uma grande sequência é incorporada a um gene, mas não é traduzida em proteína. A sequência contém uma estrutura que serve como uma pista para induzir o ribossomo a saltar sobre a sequência e retomar a tradução a jusante da inserção.
[0201]Em certas modalidades, a proteína ou polipeptídeo de interesse (ou porção dos mesmos) nos métodos e/ou composições da invenção é codificado por um ácido nucleico. Normalmente, o ácido nucleico compreende pelo menos um códon seletor, pelo menos dois códons seletores, pelo menos três códons seletores, pelo menos quatro códons seletores, pelo menos cinco códons seletores, pelo menos seis códons seletores, pelo menos sete códons seletores, pelo menos oito códons seletores, pelo menos nove códons seletores, dez ou mais códons seletores.
[0202]Os genes que codificam para proteínas ou polipeptídeos de interesse podem ser mutagenizados usando métodos conhecidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica e descritos neste documento para incluir, por exemplo, um ou mais códons seletores para a incorporação de um aminoácido não natural. Por exemplo, um ácido nucleico para uma proteína de interesse é mutagenizado para incluir um ou mais códons seletores, proporcionando a incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais. A invenção inclui qualquer uma dessas variantes, incluindo, mas não se limitando a, versões mutantes de qualquer proteína, por exemplo, incluindo pelo menos um aminoácido não natural. Da mesma forma, a invenção também inclui ácidos nucleicos correspondentes, isto é, qualquer ácido nucleico com um ou mais códons seletores que codificam um ou mais aminoácidos não naturais.
[0203]As moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de interesse, como uma IL-2, podem ser prontamente mutadas para introduzir uma cisteína em qualquer posição desejada do polipeptídeo. A cisteína é amplamente usada para introduzir moléculas reativas, polímeros solúveis em água, proteínas ou uma ampla variedade de outras moléculas em uma proteína de interesse. Os métodos adequados para a incorporação de cisteína em uma posição desejada de um polipeptídeo são conhecidos pelas pessoas de habilidade comum na técnica, tais como aqueles descritos na Patente U.S. Nº 6.608.183, que é incorporada neste documento por referência, e técnicas de mutagênese padrão.
III. Aminoácidos Codificados Não Naturalmente
[0204]Uma grande variedade de aminoácidos codificados não naturalmente é adequada para o uso na presente invenção. Qualquer número de aminoácidos codificados não naturalmente pode ser introduzido em uma IL-2. Em geral, os aminoácidos codificados não naturalmente introduzidos são substancialmente quimicamente inertes em relação aos 20 aminoácidos codificados geneticamente comuns (isto é, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina). Em algumas modalidades, os aminoácidos codificados não naturalmente incluem grupos funcionais de cadeia lateral que reagem de forma eficiente e seletiva com grupos funcionais não encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas não se limitando a, grupos azido, cetona, aldeído e aminoóxi) para formar conjugados estáveis. Por exemplo, uma IL-2 que inclui um aminoácido codificado não naturalmente contendo um grupo azido funcional pode ser reagida com um polímero (incluindo, mas não se limitando a, poli(etilenoglicol) ou, alternativamente, um segundo polipeptídeo contendo uma porção de alcino) para formar um conjugado estável resultante para a reação seletiva dos grupos funcionais de azida e do alcino para formar um produto de cicloadição de Huisgen [3 + 2].
[0205]A estrutura genérica de um alfa-aminoácido é ilustrada como a seguir (Fórmula I):
I
R H2N COOH
[0206]Um aminoácido codificado não naturalmente é normalmente qualquer estrutura tendo a fórmula listada acima em que o grupo R é qualquer substituinte exceto um usado nos vinte aminoácidos naturais, e pode ser adequada para o uso na presente invenção. Como os aminoácidos codificados não naturalmente da invenção diferem normalmente dos aminoácidos naturais apenas na estrutura da cadeia lateral, os aminoácidos codificados não naturalmente formam ligações amida com outros aminoácidos, incluindo, mas não se limitando a, naturais ou codificados de forma não natural, da mesma maneira em que são formados em polipeptídeos de ocorrência natural. No entanto, os aminoácidos codificados não naturalmente têm grupos de cadeias laterais que os distinguem dos aminoácidos naturais. Por exemplo, R opcionalmente compreende um grupo alquil-, aril-, acil-, ceto-, azido-, hidroxil-, hidrazina, ciano-, halo-, hidrazida, alquenila, alquinila, éter, tiol, seleno-, sulfonil-, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldeído, éster, tioácido, hidroxilamina, amino, ou semelhantes ou qualquer combinação dos mesmos.
Outros aminoácidos de ocorrência não natural de interesse que podem ser adequados para o uso na presente invenção incluem, mas não estão se limitando a, aminoácidos compreendendo um reticulador fotoativável, aminoácidos rotulados por spin, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de ligação a metal , aminoácidos contendo metal, aminoácidos radioativos, aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que interagem covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, aminoácidos fotoencapsulados e/ou fotoisomerizáveis, aminoácidos que compreendem biotina ou um análogo de biotina, aminoácidos glicosilados, tais como uma serina substituída com açúcar, outros aminoácidos modificados com carboidratos, aminoácidos contendo ceto, aminoácidos compreendendo polietilenoglicol ou poliéter, aminoácidos substituídos com átomo pesado, aminoácidos quimicamente cliváveis e/ou fotocliváveis, aminoácidos com cadeias laterais alongadas em comparação a aminoácidos naturais, incluindo, mas não se limitando a, poliéteres ou hidrocarbonetos de cadeia longa, incluindo, mas não se limitando a, mais do que cerca de 5 ou mais do que cerca de 10 carbonos, aminoácidos contendo açúcar ligados a carbono, aminoácidos redox ativos, aminoácidos contendo amino tioácido e aminoácidos compreendendo uma ou mais porções tóxicas.
[0207]Os aminoácidos codificados não naturalmente exemplificativos que podem ser adequados para o uso na presente invenção e que são úteis para reações com polímeros solúveis em água incluem, mas não estão se limitando a, aqueles com grupos carbonila, aminoóxi, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida e alcino reativos. Em algumas modalidades, os aminoácidos codificados não naturalmente compreendem uma porção de sacarídeo. Exemplos de tais aminoácidos incluem N- acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L- glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina e O-manosaminil-L- serina. Exemplos de tais aminoácidos também incluem exemplos onde a ligação de N- ou O- de ocorrência natural entre o aminoácido e o sacarídeo é substituída por uma ligação covalente não encontrada comumente na Natureza incluindo, mas não se limitando a, um alceno, uma oxima, um tioéter, uma amida e semelhantes. Exemplos de tais aminoácidos também incluem sacarídeos que não são comumente encontrados em proteínas de ocorrência natural tais como 2-deoxi-glicose, 2- deoxigalactose e semelhantes.
[0208]Muitos dos aminoácidos codificados não naturalmente fornecidos aqui estão disponíveis comercialmente, por exemplo, na Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), Novabiochem (uma divisão da EMD Biosciences, Darmstadt, Alemanha) ou Peptech (Burlington, MA, EUA). Aqueles que não estão comercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizados como fornecido neste documento ou usando métodos padrão conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica. Para técnicas de síntese orgânica, consultar, por exemplo, Organic Chemistry de Fessendon e Fessendon, Segunda Edição, Willard Grant Press, Boston Mass, (1982); Advanced Organic Chemistry por March Third Edition, Wiley and Sons, New York, (1985); e Advanced Organic Chemistry por Carey e Sundberg, Terceira Edição, Partes A e B, Plenum Press, New York, (1990). Consultar, também, Patente U.S. Nos 7.045.337 e
7.083.970, que são incorporados por referência aqui. Além de aminoácidos não naturais que contêm novas cadeias laterais, os aminoácidos não naturais que podem ser adequados para o uso na presente invenção também opcionalmente compreendem estruturas de estrutura modificadas, incluindo, mas não se limitando a, como ilustrada pelas estruturas da Fórmula II e III:
II R Z C YH X
III R R' H2 N C o2H em que Z normalmente compreende OH, NH2, SH, NH-R, ou S-R; X e Y, que podem ser os mesmos ou diferentes, normalmente compreendem S ou O, e R e R', que são opcionalmente os mesmos ou diferentes, são normalmente selecionados a partir da mesma lista de constituintes para o grupo R descrito acima para os aminoácidos não naturais tendo a Fórmula I bem como hidrogênio. Por exemplo, os aminoácidos não naturais da invenção opcionalmente compreendem substituições no grupo amino ou carboxila como ilustrado pelas Fórmulas II e III. Os aminoácidos não naturais deste tipo incluem, mas não estão se limitando a, ácidos α-hidróxi, α- tioácidos, α-aminotiocarboxilatos, incluindo, mas não se limitando a, com cadeias laterais correspondentes aos vinte aminoácidos naturais comuns ou cadeias laterais não naturais. Além disso, as substituições no α-carbono opcionalmente incluem, mas não estão se limitando a, aminoácidos L, D, ou α-α-dissubstituídos tais como D- glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, e semelhantes. Outras alternativas estruturais incluem aminoácidos cíclicos, tais como análogos de prolina bem como análogos de prolina do anel de 3, 4 ,6, 7, 8, e 9 membros, β e ᵞ aminoácidos tais como de β-alanina substituída e ácido ᵞ-amino butírico.
[0209]Muitos aminoácidos não naturais são baseados em aminoácidos naturais, como tirosina, glutamina, fenilalanina e semelhantes, e são adequados para uso na presente invenção. Os análogos de tirosina incluem, mas não estão limitados a, tirosinas para-substituídas, tirosinas orto-substituídas e tirosinas meta-substituídas, onde a tirosina substituída compreende, incluindo, mas não se limitando a, um grupo ceto (incluindo, mas não limitado a, um grupo acetila), um grupo benzoila, um grupo amino, uma hidrazina, uma hidroxiamina, um grupo tiol, um grupo carboxi, um grupo isopropila, um grupo metila, um hidrocarboneto C6-C20 de cadeia linear ou ramificada, um hidrocarboneto saturado ou insaturado, um grupo O-metila, um grupo poliéter, um grupo nitro, um grupo alquinila ou semelhantes. Além disso, os anéis de arila multiplamente substituídos também são contemplados. Os análogos de glutamina que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a derivados de α-hidróxi, derivados de ᵞ-substituído, derivados cíclicos e derivados de glutamina substituídos por amida. Exemplos de análogos de fenilalanina que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, fenilalaninas para-substituídas, fenilalaninas orto-substituídas e fenilalaninas meta-substituídas, onde o substituinte compreende, incluindo, mas não se limitando a, um grupo hidroxi, um grupo metoxi, um grupo metil, um grupo alila, um aldeído, um azido, um iodo, um bromo, um grupo ceto (incluindo, mas não se limitando a, um grupo acetila), um benzoila, um grupo alquinila, ou semelhantes. Exemplos específicos de aminoácidos não naturais que podem ser adequados para o uso na presente invenção incluem, mas não estão se limitando a, um p-acetil-L- fenilalanina, um O-metil-L-tirosina, uma L-3-(2-naftil)alanina, um 3-metil-fenilalanina, um O-4-alil-L- tirosina, um 4-propil-L-tirosina, um tri-O-acetil-GlcNAcβ-serina, um L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, uma isopropil-L-fenilalanina, uma p-azido-L-fenilalanina, uma p- acil-L-fenilalanina, uma p-benzoil-L-fenilalanina, uma L-fosfoserina, uma fosfonoserina, uma fosfonotirosina, uma p-iodo-fenilalanina, uma p-bromofenilalanina, uma p-amino-L-fenilalanina, uma isopropil-L-fenilalanina e uma p-propargiloxi- fenilalanina e semelhantes. Exemplos de estruturas de uma variedade de aminoácidos não naturais que podem ser adequados para uso na presente invenção são fornecidos, por exemplo, no documento WO 2002/085923 intitulado “In vivo incorporation of unnatural amino acids”. Consultar também Kiick et al., Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24, (2002), que é aqui incorporado por referência, para análogos de metionina adicionais. O Pedido Internacional Nº PCT/US06/47822 intitulado “Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides”, que é incorporado por referência neste documento, descreve a alquilação redutiva de porções de uma amina aromática, incluindo, mas não se limitando a , p-amino-fenilalanina e aminação redutora.
[0210]Em uma outra modalidade da presente invenção, os polipeptídeos de IL-2 com um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são covalentemente modificados. As reações químicas seletivas ortogonais às diversas funcionalidades dos sistemas biológicos são reconhecidas como ferramentas importantes na biologia química. Como relativamente novos no repertório da química sintética, essas reações bioortogonais inspiraram novas estratégias para a síntese de bibliotecas de compostos, engenharia de proteínas, proteômica funcional e remodelação química das superfícies celulares. A azida garantiu um papel proeminente como um identificador químico exclusivo para bioconjugação. A ligação de Staudinger tem sido usada com fosfinas para marcar açúcares de azido introduzidos metabolicamente em glicoconjugados celulares. A ligação de Staudinger pode ser realizada em animais vivos sem dano fisiológico; no entanto, a reação de Staudinger não é isenta de riscos.
As fosfinas necessárias são suscetíveis à oxidação do ar e sua otimização para melhorar a solubilidade em água e aumentar a taxa de reação provou ser um desafio sintético.
[0211]O grupo azida tem um modo alternativo de reatividade bio-ortogonal: a cicloadição [3 + 2] com alcinos descrita por Huisgen. Em sua forma clássica, esta reação tem aplicabilidade limitada em sistemas biológicos devido à necessidade de elevadas temperaturas (ou pressões) para taxas de reação razoáveis. Sharpless e seus colegas de trabalho superaram esse obstáculo com o desenvolvimento de uma versão catalisada por cobre (I), denominada “química do clique”, que ocorre prontamente em temperaturas fisiológicas e em ambientes biológicos ricamente funcionalizados. Essa descoberta permitiu a modificação seletiva de partículas de vírus, ácidos nucléicos e proteínas de lisados de tecidos complexos. Infelizmente, o catalisador de cobre obrigatório é tóxico para as células bacterianas e de mamíferos, impedindo assim as aplicações em que as células devem permanecer viáveis. Foi relatado que as cicloadições de Huisgen sem catalisador de alcinos ativados por substituintes que retiram elétrons ocorrem em temperaturas ambientes. No entanto, esses compostos sofrem reação de Michael com nucleófilos biológicos.
[0212]Em uma modalidade, as composições de uma IL-2 que incluem um aminoácido não natural (como p-(propargiloxi)-fenilalanina) são fornecidas. Várias composições compreendendo p-(propargiloxi)-fenilalanina e, incluindo, mas não se limitando a, proteínas e/ou células, também são fornecidas. Em um aspecto, uma composição que inclui o aminoácido não natural p-(propargiloxi)-fenilalanina inclui ainda um tRNA ortogonal. O aminoácido não natural pode ser ligado (incluindo, mas não se limitando a, covalentemente) ao tRNA ortogonal, incluindo, mas não se limitando a, covalentemente ligado ao tRNA ortogonal por meio de uma ligação amino- acila, covalentemente ligada a um 3’OH ou a 2’OH de um açúcar ribose terminal do tRNA ortogonal, etc.
[0213]As porções químicas por meio de aminoácidos não naturais que podem ser incorporados às proteínas oferecem uma variedade de vantagens e manipulações da proteína. Por exemplo, a reatividade única de um grupo ceto funcional permite a modificação seletiva de proteínas com qualquer um de uma série de reagentes contendo hidrazina ou hidroxilamina in vitro e in vivo. Um aminoácido não natural de átomo pesado, por exemplo, pode ser útil para fasear dados de estrutura de raios-X.
A introdução específica do sítio de átomos pesados usando aminoácidos não naturais também fornece seletividade e flexibilidade na escolha de posições para átomos pesados. Os aminoácidos não naturais fotorreativos (incluindo, mas não se limitando a, aminoácidos com cadeias laterais de benzofenona e arilazidas (incluindo, mas não se limitando a, fenilazida), por exemplo, permitem a fotorreticulação in vivo e in vitro eficiente da proteína. Exemplos de aminoácidos não naturais fotorreativos incluem, mas não estão limitados a p-azido-fenilalanina e p-benzoil-fenilalanina. A proteína com os aminoácidos não naturais fotorreativos pode então ser reticulada à vontade por excitação do grupo fotorreativo fornecendo controle temporal. Em um exemplo, o grupo metila de um amino não natural pode ser substituído por um isotopicamente marcado, incluindo, mas não se limitando a, grupo metila, como uma sonda de estrutura e dinâmica local, incluindo, mas não se limitando a, com o uso de ressonância magnética nuclear e espectroscopia vibracional. Os grupos funcionais de alquinila ou azido, por exemplo, permitem a modificação seletiva de proteínas com moléculas por meio de uma reação de cicloadição [3 + 2].
[0214]Um aminoácido não natural incorporado em um polipeptídeo no terminal amino pode ser composto por um grupo R que é qualquer substituinte diferente daquele usado nos vinte aminoácidos naturais e um 2º grupo reativo diferente do grupo NH2 normalmente presente em α-aminoácidos (consultar a Fórmula I). Um aminoácido não natural similar pode ser incorporado no terminal carboxila com um 2º grupo reativo diferente a partir do grupo COOH normalmente presente em α- aminoácidos (consultar a Fórmula I).
[0215]Os aminoácidos não naturais da invenção podem ser selecionados ou projetados para fornecer características adicionais indisponíveis nos vinte aminoácidos naturais. Por exemplo, o aminoácido não natural pode ser opcionalmente projetado ou selecionado para modificar as propriedades biológicas de uma proteína, por exemplo, na qual eles são incorporados. Por exemplo, as seguintes propriedades podem ser opcionalmente modificadas pela inclusão de um aminoácido não natural em uma proteína: toxicidade, biodistribuição, solubilidade, estabilidade, por exemplo, térmica, hidrolítica, oxidativa, resistência à degradação enzimática e semelhantes, facilidade de purificação e processamento, propriedades estruturais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, atividade catalítica, potencial redox, meia-vida, capacidade de reagir com outras moléculas, por exemplo, covalentemente ou não covalentemente e semelhantes.
[0216]Em algumas modalidades, a presente invenção fornece IL-2 ligada a um polímero solúvel em água, por exemplo, um PEG, por uma de ligação oxima.
Muitos tipos de aminoácidos codificados não naturalmente são adequados para formação de ligações de oxima. Estes incluem, mas não estão limitados a aminoácidos codificados não naturalmente contendo um grupo carbonila, dicarbonila ou hidroxilamina. Tais aminoácidos são descritos nas Publicações de Patentes US Nos 2006/0194256, 2006/0217532 e 2006/0217289 e WO 2006/069246 intitulado “Composições contendo, métodos envolvendo e usos de aminoácidos e polipeptídeos não naturais”, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Os aminoácidos codificados não naturalmente também são descritos na Patente U.S. Nº
7.083.970 e Patente U.S. Nº 7.045.337, que são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.
[0217]Algumas modalidades da invenção utilizam polipeptídeos de IL-2 que são substituídos em uma ou mais posições com um aminoácido para- acetilfenilalanina. A síntese de p-acetil-(+/-)-fenilalanina e m-acetil -(+/-)-fenilalanina é descrita em Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), incorporado por referência. Outros aminoácidos contendo carbonila ou dicarbonila podem ser preparados de forma semelhante por uma pessoa versado na técnica. Além disso, as sínteses exemplificativas não limitativas de aminoácidos não naturais que estão incluídas neste documento são apresentadas nas Figuras 4, 24 a 34 e 36 a 39 da Patente U.S. Nº 7.083.970, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[0218]Os aminoácidos com um grupo reativo eletrofílico permitem uma variedade de reações para ligar moléculas por meio de reações de adição nucleofílica, entre outras. Esses grupos reativos eletrofílicos incluem um grupo carbonila (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonila), um grupo semelhante ao carbonila (que tem reatividade semelhante a um grupo carbonila (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonila) e é estruturalmente semelhante a uma carbonila), um grupo carbonila mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo carbonila (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonila) ou um grupo carbonila protegido (que tem reatividade semelhante a um grupo carbonila (incluindo um grupo ceto e um grupo dicarbonila) após a desproteção). Esses aminoácidos incluem aminoácidos com a estrutura da Fórmula (IV): R3 R3 A J
B R R1 R2
N H R4 O (IV), em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)- , -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)- , -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O- , -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, - C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila substituída;
O R'' R'' R'' O S OR'' SR'' O O
N Jé , O , , , , , O , ou - R''
O +N ; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; cada R” é independentemente H, alquila, alquila substituída, ou um grupo de proteção, ou quando mais do que um R” grupo está presente, dois R” opcionalmente formam uma heterocicloalquila; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior ou alquila inferior substituída ou R3 e R4 ou dois grupos R3 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; ou os grupos -A-B-J-R em conjunto formam um bicíclico ou tricíclico cicloalquila ou heterocicloalquila compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo, um grupo dicarbonila, grupo dicarbonila protegido, incluindo, um grupo dicarbonila protegido ou grupo dicarbonila mascarado, incluindo, um grupo dicarbonila mascarado; ou o grupo -J-R em conjunto forma uma cicloalquila ou heterocicloalquila monocíclica ou bicíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo, um grupo dicarbonila, grupo carbonila protegido, incluindo, um grupo dicarbonila protegido ou grupo carbonila mascarado, incluindo, um grupo dicarbonila mascarado; com a condição de que quando A é fenileno e cada R3 é H, B está presente; e que quando A é -(CH2)4- e cada R3 é H, B não é -NHC(O)(CH2CH2)-; e que quando A e B estão ausentes e cada R3 é H, R é não metila.
[0219]Além disso, tendo a estrutura da Fórmula (V) estão incluídos:
O A
B R R1 R2
N
H O (V), em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)- , -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)- , -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O- , -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, - C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e
R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; com a condição de que quando A é fenileno, B está presente; e que quando A é -(CH2)4-, B não é -NHC(O)(CH2CH2)-; e que quando A e B estão ausentes, R não é metila.
[0220]Além disso, os aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (VI) estão incluídos: Ra Ra B R
O Ra Ra R1 R2
N
H O (VI), em que: B é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)- , -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)- , -N(R’)CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)- , -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, - C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e
R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2 ou 3, - C(O)N(R’)2, -OR’, e -S(O)kR’, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída.
[0221]Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:
O O H O N N N O
OH OH H2N H 2N O , H2N COOH , O ,
O O O O H O S N N H
OH O H2N OH OH H2N H2N O , H2N COOH , O , O , e
O
OH H2N O , em que tais compostos são opcionalmente grupo amino protegido, carboxila protegida ou um sal dos mesmos. Além disso, qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais pode ser incorporado em um polipeptídeo de aminoácido não natural.
[0222]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (VII) estão incluídos:
O (CRa)n
B R R1 R2
N
H O (VII) em que B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior,
alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)- , -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)- , -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O- , -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, - C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2 ou 3, - C(O)N(R’)2, -OR’, e -S(O)kR’, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; e n é 0 a 8; com a condição de que quando A é -(CH2)4-, B não é -NHC(O)(CH2CH2).
[0223]Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:
O O O O O O O O S NH O S O
OH OH OH OH OH OH OH H2N H2N H2N H2N H2N H2N H2N O , O , O , O , O , O , O ,
O O O O O O O O O S NH O
OH OH OH OH OH OH H2N H2N H2N H2N H2N H2N O , O , O , O , O , O ,
O O O O S HN
OH OH OH H2N H2N H2N O , O , e O , em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegida, opcionalmente amino protegido e carboxila protegida ou um sal dos mesmos. Além disso, esses aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais pode ser incorporado em um polipeptídeo de aminoácido não natural.
[0224]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (VIII) estão incluídos:
O A
B O R1 R2
N
H O (VIII), em que A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)- , -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)- , -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-
, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, - C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo.
Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (IX) estão incluídos: Ra Ra B O
O Ra Ra R1 R2
N
H O (IX), B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)- , -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)- , -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O- , -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, - C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída;
R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; em que cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR’, e -S(O)kR’, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída.
[0225]Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:
O O O O O O O O
OH OH OH OH H2N H2N H2N H2N O , O , O , O ,
O O O O O H O O S O N O O
OH OH OH OH H2N H2N H2N H2N O , O , O ,e O , em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegida, opcionalmente amino protegido e carboxila protegida ou um sal dos mesmos. Além disso, esses aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais pode ser incorporado em um polipeptídeo de aminoácido não natural.
[0226]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (X) estão incluídos:
O (CRa)n
B O R1 R2
N
H O (X), em que B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)- , -C(O)N(R’)-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)CO-(alquileno ou alquileno substituído)- , -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)- , -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2 ou 3, - C(O)N(R’)2, -OR’, e -S(O)kR’, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; e n é 0 a 8.
[0227]Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:
O O O O O O O O O O O O O S NH O
OH OH OH OH OH OH H2N H2N H2N H2N H2N H2N O , O , O , O , O , O ,
O O O O
OH OH H2N H2N O ,e O , em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegida, opcionalmente amino protegido e carboxila protegida ou um sal dos mesmos. Além disso, esses aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais pode ser incorporado em um polipeptídeo de aminoácido não natural.
[0228]Além de estruturas de monocarbonila, os aminoácidos não naturais descritos neste documento podem incluir grupos tais como dicarbonila, semelhantes a dicarbonila, dicarbonila mascarada e grupos dicarbonila protegidos.
[0229]Por exemplo, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XI) estão incluídos:
O A R
B R1 R2 O
N
H O (XI), em que A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)- , -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)- , -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O- , -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, -
C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo.
[0230]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XII) estão incluídos:
O Ra Ra B
R
O Ra Ra R1 R2
N
H O (XII), B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)- , -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)- , -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O- , -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, - C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída;
R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; em que cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR’, e -S(O)kR’, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída.
[0231]Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:
O O H N
O O H2N COOH H2N COOH e , em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegida, opcionalmente amino protegido e carboxila protegida ou um sal dos mesmos. Além disso, esses aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais pode ser incorporado em um polipeptídeo de aminoácido não natural.
[0232]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XIII) estão incluídos:
O (CRa)n R
B R1 R2 O
N
H O (XIII), em que B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-
(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)- , -C(O)N(R’)-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)CO-(alquileno ou alquileno substituído)- , -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)- , -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR’, e - S(O)kR’, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída; e n é 0 a 8.
[0233]Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:
O O O O O O O O O O O S NH O O O O O S NH
OH OH OH OH OH OH OH H2N H2N H2N H2N H2N H2N H2N O , O , O , O , O , O , O ,
O O O O O O O O O O O O O O S NH O O
OH OH OH OH OH OH H2N H2N H2N H2N H2N H2N O , O , O , O , O , O ,
O O O O S HN O O O
OH OH OH H2N H2N H2N O , O ,e O , em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegida, opcionalmente amino protegido e carboxila protegida ou um sal dos mesmos. Além disso, esses aminoácidos não naturais e qualquer um dos seguintes aminoácidos não naturais pode ser incorporado em um polipeptídeo de aminoácido não natural.
[0234]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XIV) estão incluídos:
O O X 1
A L R R 1H N C (O )R 2 (XIV); em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X1 é C, S ou S(O); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída.
[0235]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XIV-A) estão incluídos:
O O C
A L R R 1H N C (O )R 2 (XIV-A) em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída.
[0236]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XIV-B) estão incluídos:
O O O S
A L R R 1H N C (O )R 2 (XIV-B) em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior,
heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída.
[0237]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XV) estão incluídos:
O O X1
A R (C R 8R 9)n R 1H N C (O )R 2 (XV); em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X1 é C, S ou S(O); e n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, alcóxi, alquilaamina, halogênio, alquila, arila ou qualquer R8 e R9 podem em conjunto formar =O ou uma cicloalquila ou qualquer um dos grupos R8 adjacentes podem em conjunto formar uma cicloalquila.
[0238]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XV-A) estão incluídos:
O O C
A R (C R 8R 9 )n R 1H N C (O )R 2 (XV-A) em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, alcóxi, alquilaamina, halogênio, alquila, arila ou qualquer R8 e R9 podem em conjunto formar =O ou uma cicloalquila ou qualquer um dos grupos R8 adjacentes podem em conjunto formar uma cicloalquila.
[0239]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XV-B) estão incluídos:
O O O S
A R (C R 8R 9)n R 1H N C (O )R 2 (XV-B) em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, alcóxi, alquilaamina, halogênio, alquila, arila ou qualquer R8 e R9 pode em conjunto formam =O ou uma cicloalquila ou qualquer um dos grupos R8 adjacentes pode em conjunto formar uma cicloalquila.
[0240]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XVI) estão incluídos:
O O X 1
A N L R R' R 1H N C (O )R 2 (XVI); em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; X1 é C, S ou S(O); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída.
[0241]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XVI-A) estão incluídos:
O O C
A N L R R' R 1H N C (O )R 2 (XVI-A) em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída.
[0242]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XVI-B) estão incluídos:
O O O S
A N L R R' R 1H N C (O )R 2 (XVI-B) em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída.
[0243]Além disso, os aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XVII) estão incluídos:
R O R3
M O R3 A T3
R R1 R2
N
H O (XVII), em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído; (b) (b) (b) R3 C C (b) C C (b) C O (b) (a) R4 R4 (a) R4 (a) R4 M é -C(R3)-, , , , (b) (b) (b) (b) R3 R3 (b) R3 C C (b) O C (b) S C (b) C C (b) C S (b) R3 R4 R4 (a) R4 (a) (a) (a) (a) , , , ou , onde (a) indica ligação ao grupo A e (b) indica ligação ao respectivos grupos carbonila, R3 e R4 são independentemente escolhidos a partir de H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; R é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; T3 é uma ligação, C(R)(R), O ou S, e R é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo.
[0244]Além disso, os aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XVIII) estão incluídos:
R O Ra
M O Ra T3 Ra R Ra R1 R2
N
H O (XVIII), em que: (b) (b) (b) R3 C C (b) C C (b) C O (b) (a) R4 R4 (a) R4 (a) R4 M é -C(R3)-, , , , (b) (b) (b) (b) R3 R3 (b) R3 C C (b) O C (b) S C (b) C C (b) C S (b) R3 R4 R4 (a) R4 (a) (a) (a) (a) , , , ou , onde (a) indica ligação ao grupo A e (b) indica ligação aos respectivos grupos carbonila, R3 e R4 são independentemente escolhidos a partir de H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; R é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; T3 é uma ligação, C(R)(R), O ou S, e R é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 é opcional, e quando presente, é H, um grupo de proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo de proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2 ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR’, e - S(O)kR’, onde cada R’ é independentemente H, alquila ou alquila substituída.
[0245]Além disso, os aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XIX) estão incluídos:
R O
O T3
R R1 R2
N
H O (XIX), em que: R é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; e T3 é O ou S.
[0246]Além disso, os aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XX) estão incluídos:
R O O
R R1 R2
N
H O (XX), em que: R é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída.
[0247]Além disso, os seguintes aminoácidos tendo estruturas da Fórmula (XXI) estão incluídos:
O O
O O R1 R2 R1 R2
N N
H H O ,e O .
[0248]Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não natural é quimicamente modificado para gerar um grupo funcional carbonila ou dicarbonila reativo. Por exemplo, uma funcionalidade de aldeído útil para reações de conjugação pode ser gerada a partir de uma funcionalidade com grupos amino e hidroxila adjacentes. Quando a molécula biologicamente ativa é um polipeptídeo, por exemplo, uma serina ou treonina N-terminal (que pode estar normalmente presente ou pode ser exposta por meio de digestão química ou enzimática) pode ser usada para gerar uma funcionalidade de aldeído sob condições de clivagem oxidativa moderada usando periodato. Consultar, por exemplo, Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug.
Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). No entanto, os métodos conhecidos na técnica são ao aminoácido no N terminal do peptídeo ou proteína.
[0249]Na presente invenção, um aminoácido não natural contendo grupos hidroxila e amino adjacentes, pode ser incorporado ao polipeptídeo como uma funcionalidade de aldeído “mascarada”. Por exemplo, 5-hidroxilisina carrega um grupo hidroxila adjacente à amina epsilon. As condições de reação para gerar o aldeído normalmente envolvem a adição de excesso molar de metaperiodato de sódio sob condições suaves para evitar a oxidação em outros sítios dentro do polipeptídeo. O pH da reação de oxidação é normalmente cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de cerca de 1,5 molar em excesso de metaperiodato de sódio a uma solução tamponada do polipeptídeo, seguido por incubação por cerca de 10 minutos no escuro. Consultar, por exemplo, Patente U.S. Nº 6.423.685.
[0250]A funcionalidade carbonila ou dicarbonila pode ser reagida seletivamente com um reagente contendo hidroxilamina sob condições suaves em solução aquosa para formar a ligação oxima correspondente que é estável sob condições fisiológicas. Consultar, por exemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. e Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995).
Além disso, a reatividade única do grupo carbonila ou dicarbonila permite a modificação seletiva na presença de outras cadeias laterais de aminoácidos.
Consultar, por exemplo, Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997).
A. Grupos Reativos de Carbonila
[0251]Os aminoácidos com um grupo reativo de carbonila permitem uma variedade de reações para moléculas de ligação (incluindo, mas não se limitando a, PEG ou outras moléculas solúveis em água) por meio de adição nucleofílica ou reações de condensação de aldol entre outros.
[0252]Os aminoácidos contendo carbonila exemplificativos podem ser representados como a seguir: (CH2)nR1COR2 R3HN COR4 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituída; R2 é H, alquila, arila, alquila substituída, e arila substituída; e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal amino, e R4 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenila e R2 é uma alquila simples (isto é, metila, etila ou propila) e a porção de cetona está posicionada na posição para em relação à cadeia lateral de alquila. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenila e R2 é uma alquila simples (isto é, metila, etila ou propila) e a porção de cetona está posicionada na posição meta em relação à cadeia lateral de alquila.
[0253]A síntese de p-acetil-(+/-)-fenilalanina e m-acetil-(+/-)-fenilalanina é descrita em Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), que é incorporado por referência aqui. Outros aminoácidos contendo carbonila podem ser da mesma forma preparados por uma pessoa de habilidade comum na técnica.
[0254]Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente é quimicamente modificado para gerar um grupo funcional de carbonila reativo. Por exemplo, uma funcionalidade de aldeído útil para reações de conjugação pode ser gerada a partir de uma funcionalidade com grupos amino e hidroxila adjacentes. Quando a molécula biologicamente ativa é um polipeptídeo, por exemplo, uma serina ou treonina N-terminal (que pode estar normalmente presente ou pode ser exposta por meio de digestão química ou enzimática) pode ser usada para gerar uma funcionalidade de aldeído sob condições de clivagem oxidativa moderada usando periodato. Consultar, por exemplo, Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug.
Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). No entanto, os métodos conhecidos na técnica são restritos ao aminoácido no N-terminal do peptídeo ou proteína.
[0255]Na presente invenção, um aminoácido codificado não naturalmente com grupos hidroxila e amino adjacentes, pode ser incorporado no polipeptídeo como uma funcionalidade de aldeído “mascarada”. Por exemplo, 5-hidroxilisina carrega um grupo hidroxila adjacente à amina epsilon. As condições de reação para gerar o aldeído normalmente envolvem a adição de excesso molar de metaperiodato de sódio sob condições suaves para evitar a oxidação em outros sítios dentro do polipeptídeo.
O pH da reação de oxidação é normalmente cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de cerca de 1,5 molar em excesso de metaperiodato de sódio a uma solução tamponada do polipeptídeo, seguido por incubação por cerca de 10 minutos no escuro. Consultar, por exemplo, Patente U.S. Nº 6.423.685, que é incorporado por referência aqui.
[0256]A funcionalidade de carbonila pode ser reagida seletivamente com um reagente contendo hidrazina-, hidrazida-, hidroxilamina- ou semicarbazida sob condições suaves em solução aquosa para formar as ligações hidrazona, oxima ou semicarbazona correspondentes, respectivamente, que são estáveis sob condições fisiológicas. Consultar, por exemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. e Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Além disso, a reatividade única do grupo carbonila permite a modificação seletiva na presença das outras cadeias laterais de aminoácidos. Consultar, por exemplo, Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997).
B. Grupos Reativos de Hidrazina, Hidrazida ou Semicarbazida
[0257]Os aminoácidos codificados não naturalmente contendo um grupo nucleofílico, tais como uma hidrazina, hidrazida ou semicarbazida, permitem a reação com uma variedade de grupos eletrofílicos para formar conjugados (incluindo, mas não se limitando a, com PEG ou outros polímeros solúveis em água).
[0258]Os aminoácidos contendo hidrazina, hidrazida ou semicarbazida exemplificativos podem ser representados como segue: (CH2)nR1X-C(O)-NH-HN2 R2HN COR3 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituída ou não está presente; X, é O, N ou S ou não está presente; R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
[0259]Em algumas modalidades, n é 4, R1 é não está presente, e X é N. Em algumas modalidades, n é 2, R1 não está presente, e X não está presente. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenila, X é O, e o átomo de oxigênio está posicionado para para o grupo alfático no anel arila.
[0260]Os aminoácidos contendo hidrazida, hidrazina e semicarbazida estão disponíveis em fontes comerciais. Por exemplo, L-glutamato-ᵞ-hidrazida é disponível de Sigma Chemical (St. Louis, MO). Outros aminoácidos não disponíveis comercialmente podem ser preparados por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Consultar, por exemplo, Pat. U.S. Nº 6.281.211, que é incorporado por referência aqui.
[0261]Os polipeptídeos contendo aminoácidos codificados não naturalmente que possuem as funcionalidades hidrazida, hidrazina ou semicarbazida podem ser reagidos de forma eficiente e seletiva com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química semelhante. Consultar, por exemplo, Shao, J. e Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). A reatividade única dos grupos funcionais hidrazida, hidrazina e semicarbazida os torna significativamente mais reativos em relação aos aldeídos, cetonas e outros grupos eletrofílicos em comparação com os grupos nucleofílicos presentes nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas não se limitando a, o grupo hidroxila da serina ou treonina ou os grupos amino de lisina e o N-terminal).
C. Aminoácidos Contendo Aminooxi
[0262]Os aminoácidos codificados não naturalmente contendo um grupo aminoóxi (também chamado de uma hidroxilamina) permitem a reação com uma variedade de grupos eletrofílicos para formar conjugados (incluindo, mas não se limitando a, com PEG ou outros polímeros solúveis em água). Como as hidrazinas, hidrazidas e semicarbazidas, a nucleofilicidade aumentada do grupo aminooxi permite que ele reaja de forma eficiente e seletiva com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química semelhante.
Consultar, por exemplo, Shao, J. e Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang e C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001). Enquanto o resultado da reação com um grupo hidrazina é a hidrazona correspondente, no entanto, uma oxima resulta geralmente da reação de um grupo aminooxi com um grupo contendo carbonila, como uma cetona.
[0263]Os aminoácidos exemplificativos contendo grupos aminooxi podem ser representados como a seguir: (CH2)nR1-X-(CH2)m-Y-O-NH2 R2HN COR3 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituída ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 a 10; Y = C(O) ou não está presente; R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal carbóxi. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenila, X é O, m é 1, e Y está presente. Em algumas modalidades, n é 2, R1 e X não estão presentes, m é 0, e Y não está presente.
[0264]Os aminoácidos contendo aminooxi podem ser preparados a partir de precursores de aminoácidos prontamente disponíveis (homoserina, serina e treonina).
Consultar, por exemplo, M. Carrasco e R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003). Certos aminoácidos contendo aminooxi, tais como ácido L-2-amino-4- (aminooxi) butírico), foram isolados de fontes naturais (Rosenthal, G., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997). Outro aminooxi que contenham aminoácidos podem ser preparados por uma pessoa de habilidade comum na técnica.
D. Grupos Reativos de Azida e Alcino
[0265]A reatividade única de grupos funcionais azida e alcino os torna extremamente úteis para a modificação seletiva de polipeptídeos e outras moléculas biológicas. As azidas orgânicas, particularmente as azidas alfáticas, e alcinos são geralmente estáveis em relação às condições químicas reativas comuns. Em particular, ambos os grupos funcionais azida e alcino são inertes em relação às cadeias laterais (isto é, grupos R) dos 20 aminoácidos comuns encontrados em polipeptídeos de ocorrência natural. Quando colocados em estreita proximidade, no entanto, a natureza “carregada por mola” dos grupos azida e alcino é revelada e eles reagem seletivamente e eficientemente por meio da reação de cicloadição de Huisgen [3 + 2] para gerar o triazol correspondente. Consultar, por exemplo, Chin J., et al., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002).
[0266]Porque a reação de cicloadição de Huisgen envolve uma reação de cicloadição seletiva (consultar, por exemplo, Padwa, A., em Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, ed. Trost, BM, (1991), páginas 1069-1109; Huisgen, R. em 1,3- DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, ed. Padwa, A., (1984), páginas 1-176) em vez de uma substituição nucleofílica, a incorporação de aminoácidos codificados não naturalmente com azida e lado contendo cadeias de alcino permitem que os polipeptídeos resultantes sejam modificados seletivamente na posição do aminoácido codificado de forma não natural. A reação de cicloadição envolvendo azida ou IL-2 contendo alcino pode ser realizada à temperatura ambiente sob condições aquosas pela adição de Cu (II) (incluindo, mas não se limitando a, na forma de uma quantidade catalítica de CuSO4) na presença de um agente redutor para reduzir Cu (II) a Cu (I), in situ, em quantidade catalítica. Consultar, por exemplo, Wang, Q., et al., J. Am.
Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67: 3057- 3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599 (2002). Os agentes redutores exemplificativos incluem, incluindo, mas não se limitando a, ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe2+, Co2+, e um potencial elétrico aplicado.
[0267]Em alguns casos, onde uma reação de cicloadição de Huisgen [3 + 2] entre uma azida e um alcino é desejada, a IL-2 compreende um aminoácido codificado não naturalmente compreendendo uma porção de alcino e o polímero solúvel em água a ser ligado ao aminoácido compreende uma porção de azida. Alternativamente, a reação inversa (isto é, com a porção de azida no aminoácido e a porção de alcino presente no polímero solúvel em água) também pode ser realizada.
[0268]O grupo funcional azida também pode reagir seletivamente com um polímero solúvel em água contendo um éster de arila e apropriadamente funcionalizado com uma porção de arila fosfina para gerar uma ligação amida. O grupo arila fosfina reduz a azida in situ e a amina resultante reage de forma eficiente com uma ligação de éster proximal para gerar a amida correspondente. Consultar, por exemplo, E. Saxon e C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). O aminoácido contendo azida pode ser uma alquila azida (incluindo, mas não se limitando a, ácido 2-amino-6-azido-1-hexanóico) ou uma arila azida (p-azido-fenilalanina).
[0269]Os polímeros solúveis em água exemplificativos contendo um éster arílico e uma porção de fosfina podem ser representados como a seguir:
O X W R
O PPh2 em que X pode ser O, N, S ou não estar presente, Ph é fenila, W é um polímero solúvel em água e R pode ser H, grupos de alquila, arila, alquila substituídos e arila substituída. Os grupos R exemplificativos incluem, mas não estão limitados a -CH2, - C(CH3) 3, -OR’, -NR’R”, -SR’, -halogênio, -C(O)R’, -CONR’R”, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R”, -CN e -NO2. R’, R”, R”’ e R”“ cada um independentemente se refere a hidrogênio, heteroalquila substituído ou não substituído, arila substituída ou não substituída, incluindo, mas não se limitando a, arila substituída com 1-3 halogênios, alquila substituída ou não substituída, grupos alcóxi ou tioalcóxi ou grupos arilalquila.
Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como são cada grupos R’, R”, R’” e R”“ quando mais do que um destes grupos está presente. Quando R’ e R” são ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5-, 6- ou 7-membros. Por exemplo, -NR’R” é significado para incluir, mas não ser limitado a, 1-pirrolidinila e 4-morfolinila. A partir do debate acima de substituintes, uma pessoa versada na técnica entenderá que o termo “alquila” é significado para incluir grupos incluindo, átomos de carbono ligados a grupos exceto grupos de hidrogênio, tais como haloalquila (incluindo, mas não se limitando a, -CF3 e -CH2CF3) e acila (incluindo, mas não se limitando a, -C(O)CH3, - C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, e semelhantes).
[0270]O grupo funcional azida também pode reagir seletivamente com um polímero solúvel em água contendo um tioéster e apropriadamente funcionalizado com uma porção de arila fosfina para gerar uma ligação amida. O grupo arila fosfina reduz a azida in situ e a amina resultante reage de forma eficiente com a ligação tioéster para gerar a amida correspondente. Os polímeros solúveis em água exemplificativos contendo um tioéster e uma porção de fosfina podem ser representados como a seguir:
S X Ph2P(H2C)n W
O em que n é 1-10; X pode ser O, N, S ou não estar presente, Ph é fenila, e W é um polímero solúvel em água.
[0271]Os aminoácidos contendo alcino exemplificativos podem ser representados como a seguir: (CH2)nR1X(CH2)mCCH R2HN COR3 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituída ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 a 10, R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal carbóxi. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenila, X não está presente, m é 0 e a porção de acetileno está posicionada na posição para em relação à cadeia lateral de alquila. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenila, X é O, m é 1 e o grupo propargiloxi está posicionado na posição para em relação à cadeia lateral de alquila (isto é, O-propargil-tirosina). Em algumas modalidades, n é 1, R1 e X não estão presentes e m é 0 (isto é, proparilaglicina).
[0272]Os aminoácidos contendo alcino estão comercialmente disponíveis.
Por exemplo, a propargilglicina é comercialmente disponível de Peptech (Burlington, MA). Alternativamente, os aminoácidos contendo alcino podem ser preparados de acordo com os métodos padrão. Por exemplo, a p-propargiloxifenilalanina pode ser sintetizada, por exemplo, como descrito em Deiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003), e 4-alquinil-L-fenilalanina pode ser sintetizada como descrito em Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Outros aminoácidos contendo alcino podem ser preparados por uma pessoa de habilidade comum na técnica.
[0273]Os aminoácidos exemplificativos contendo azida podem ser representados como a seguir: (CH2)nR1X(CH2)mN3 R2HN COR3 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída, arila substituída ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 a 10; R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenila, X não está presente, m é 0 e a porção de azida está posicionada para para a cadeia lateral de alquila. Em algumas modalidades, n é 0-4 e R1 e X não estão presentes, e m = 0. Em algumas modalidades, n é 1, R1 é fenila, X é O, m é 2 e a porção de β-azidoetoxi está posicionada na posição para em relação à cadeia lateral de alquila.
[0274]Os aminoácidos contendo azida são disponíveis de fontes comerciais.
Por exemplo, a 4-azidofenilalanina pode ser obtida de Chem-Impex International, Inc.
(Wood Dale, IL). Para aqueles aminoácidos contendo azida que não são comercialmente disponíveis, o grupo azida pode ser preparado relativamente prontamente usando os métodos padrão conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica, incluindo, mas não se limitando a, por meio de deslocamento de um grupo de partida adequado (incluindo, mas não se limitando a, haleto, mesilato, tosilato) ou por meio de abertura de um lactona adequadamente protegida. Consultar, por exemplo, Advanced Organic Chemistry de March (Terceira Edição, 1985, Wiley and Sons, New York).
E. Grupos Reativos de Aminotiol
[0275]A reatividade única dos grupos funcionais de aminotiol beta- substituídos os torna extremamente úteis para a modificação seletiva de polipeptídeos e outras moléculas biológicas que contêm grupos aldeído por meio da formação da tiazolidina. Consultar, por exemplo, J. Shao e J. Tam, J. Am. Chem. Soc., 117 (14) 3893-3899, (1995). Em algumas modalidades, os aminoácidos de aminotiol beta- substituídos podem ser incorporados em polipeptídeos de IL-2 e, em seguida, reagir com polímeros solúveis em água compreendendo uma funcionalidade de aldeído. Em algumas modalidades, um polímero solúvel em água, conjugado de fármaco ou outra carga útil pode ser acoplado a uma IL-2 compreendendo um aminoácido de aminotiol beta-substituído por meio da formação da tiazolidina.
F. Grupos Reativos Adicionais
[0276]Os grupos reativos adicionais e aminoácidos codificados não naturalmente, incluindo, mas não se limitando a para-amino-fenilalanina, que pode ser incorporado em polipeptídeos de IL-2 da invenção são descritos nos seguintes Pedidos de Patente que são todos incorporados por referência em sua totalidade neste documento: Publicação de Patente U.S. Nº 2006/0194256, Publicação de Patente U.S. Nº 2006/0217532, Publicação de Patente U.S. Nº 2006/0217289, Patente Provisória U.S. Nº 60/755.338; Patente Provisória U.S. Nº 60/755.711;
Patente Provisória U.S. Nº 60/755.018; Pedido de Patente Internacional Nº PCT/US06/49397; WO 2006/069246; Patente Provisória U.S. Nº 60/743.041; Patente Provisória U.S. Nº 60/743.040; Pedido de Patente Internacional Nº PCT/US06/47822; Patente Provisória U.S. Nº 60/882.819; Patente Provisória U.S. Nº 60/882.500; e Patente Provisória U.S. Nº 60/870.594. Estes pedidos também discutem grupos reativos que podem estar presente em PEG ou outros polímeros, incluindo, mas não se limitando a, grupos hidroxilamina (aminoóxi) para conjugação.
POLIPEPTÍDEOS COM AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS
[0277]A incorporação de um aminoácido não natural pode ser feita para uma variedade de propósitos, incluindo, mas não se limitando a, modular a interação de uma proteína com seu receptor ou uma ou mais subunidades de seu receptor, adaptando mudanças na estrutura da proteína e/ou função, mudança de tamanho, acidez, nucleofilicidade, ligação de hidrogênio, hidrofobicidade, acessibilidade de sítios alvo de protease, direcionamento a uma porção (incluindo, mas não se limitando a, para uma matriz de proteína), adição de uma molécula biologicamente ativa, anexação de um polímero, anexação de um radionuclídeo, modulando a meia-vida sérica, modulando a penetração no tecido (por exemplo, tumores), modulando o transporte ativo, modulando a especificidade ou distribuição de células ou órgãos, modulando a imunogenicidade, modulando a resistência à protease, etc. As proteínas que incluem um aminoácido não natural podem ter aumentado ou mesmo propriedades catalíticas ou biofísicas inteiramente novas. Por exemplo, as seguintes propriedades são opcionalmente modificadas pela inclusão de um aminoácido não natural em uma proteína: ligação ao receptor, toxicidade, biodistribuição, propriedades estruturais, propriedades espectroscópicas, propriedades químicas e/ou fotoquímicas, capacidade catalítica, meia-vida (incluindo, mas não limitado a meia-vida sérica), capacidade de reagir com outras moléculas, incluindo, mas não se limitando a, covalentemente ou não covalentemente e semelhantes. As composições incluindo proteínas que incluem pelo menos um aminoácido não natural são úteis para, incluindo, mas não se limitando a, novas terapêuticas, diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriais, proteínas de ligação (incluindo, mas não se limitando a, anticorpos) e incluindo, mas não se limitando a para o estudo da estrutura e função da proteína. Consultar, por exemplo, Dougherty, Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4: 645-652, (2000).
[0278]Em um aspecto da invenção, uma composição inclui pelo menos uma proteína com pelo menos um, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez ou mais aminoácidos não naturais. Os aminoácidos não naturais podem ser os mesmos ou diferentes, incluindo, mas não se limitando a, pode haver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais sítios diferentes na proteína que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais aminoácidos não naturais diferentes. Em um outro aspecto, uma composição inclui uma proteína com pelo menos um, mas menos do que todos, de um aminoácido particular presente na proteína é substituído com o aminoácido não natural. Para uma dada proteína com mais do que um aminoácido não natural, os aminoácidos não naturais podem ser idênticos ou diferentes (incluindo, mas não se limitando a, a proteína pode incluir dois ou mais diferentes tipos de aminoácidos não naturais ou pode incluir dois dos mesmos aminoácidos não naturais). Para uma dada proteína com mais do que dois aminoácidos não naturais, os aminoácidos não naturais podem ser os mesmos, diferentes ou uma combinação de um múltiplo aminoácido não natural do mesmo tipo com pelo menos um aminoácido diferente não natural.
[0279]As proteínas ou polipeptídeos de interesse com pelo menos um aminoácido não natural são uma característica da invenção. A invenção também inclui polipeptídeos ou proteínas com pelo menos um aminoácido não natural produzido usando as composições e métodos da invenção. Um excipiente (incluindo, mas não se limitando a, um excipiente farmaceuticamente aceitável) pode também estar presente com a proteína.
[0280]Ao produzir as proteínas ou polipeptídeos de interesse com pelo menos um aminoácido não natural em célula eucarióticas, proteínas ou polipeptídeos normalmente irão incluir modificações de pós-tradução eucarióticas. Em certas modalidades, uma proteína inclui pelo menos um aminoácido não natural e pelo menos uma modificação pós-tradução que é feita in vivo por uma célula eucariótica, onde a modificação pós-tradução não é feita por um célula procariótica. Por exemplo, a modificação pós-tradução inclui, incluindo, mas não se limitando a, acetilação, acilação, modificação de lipídeo, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação de ligação de glicolipídeo, glicosilação e semelhantes.
[0281]Uma vantagem de um aminoácido não natural é que ele apresenta porções químicas adicionais que podem ser usadas para adicionar moléculas adicionais. Estas modificações podem ser feitas in vivo em uma célula eucariótica ou não eucariótica, ou in vitro. Assim, em certas modalidades, a modificação pós- tradução é por meio do aminoácido não natural. Por exemplo, a modificação pós- tradução pode ser por meio de uma reação nucleofílica-eletrofílica. A maioria das reações atualmente usadas para a modificação seletiva de proteínas envolve a formação de ligações covalentes entre parceiros de reação nucleofílicos e eletrofílicos, incluindo, mas não se limitando à reação de α-halocetonas com cadeias laterais de histidina ou cisteína. A seletividade nestes casos é determinada pelo número e acessibilidade dos resíduos nucleofílicos na proteína. Nas proteínas da invenção, outras reações mais seletivas podem ser utilizadas, tais como a reação de um cetoaminoácido não natural com hidrazidas ou compostos aminooxi, in vitro e in vivo.
Consultar, por exemplo, Cornish, et al., J. Am. Chem. Soc., 118:8150-8151, (1996); Mahal, et al., Science, 276:1125-1128, (1997); Wang, et al., Science 292:498-500,
(2001); Chin, et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027, (2002); Chin, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., 99:11020-11024, (2002); Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 100:56-61, (2003); Zhang, et al., Biochemistry, 42:6735-6746, (2003); e, Chin, et al., Science, 301:964-7, (2003), todos os quais são aqui incorporados por referência. Isso permite a marcação seletiva de virtualmente qualquer proteína com uma série de reagentes, incluindo fluoróforos, agentes de reticulação, derivados de sacarídeos e moléculas citotóxicas. Consultar, Patente U.S. Nº 6.927.042 intitulada “Glycoprotein synthesis”, que é incorporada neste documento por referência. As modificações pós-tradução, incluindo, mas não se limitando a, através de um aminoácido azido, também podem ser feitas através da ligação de Staudinger (incluindo, mas não se limitando a, com reagentes de triarilfosfina). Consultar, por exemplo, Kiick et al., Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, (2002).
IV. Geração In vivo de IL-2 Compreendendo Aminoácidos Codificados Não Naturalmente
[0282]Os polipeptídeos de IL-2 da invenção podem ser gerados in vivo usando tRNA modificado e sintetases de tRNA para adicionar ou substituir aminoácidos que não são codificados em sistemas de ocorrência natural.
[0283]Os métodos para gerar tRNAs e tRNA sintetases que usam aminoácidos que não são codificados em sistemas de ocorrência natural são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 7.045.337 e 7.083.970, que são incorporadas neste documento por referência. Esses métodos envolvem a geração de um mecanismo de tradução que funciona independentemente das sintetases e tRNAs endógenos ao sistema de tradução (e, portanto, às vezes são chamados de “ortogonais”). Normalmente, o sistema de tradução compreende um tRNA ortogonal (O-tRNA) e uma aminoacil tRNA sintetase ortogonal (O-RS). Normalmente, o O-RS aminoacila preferencialmente o O-tRNA com pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural no sistema de tradução e o O-tRNA reconhece pelo menos um códon seletor que não é reconhecido por outros tRNAs no sistema. O sistema de tradução insere assim o aminoácido codificado não naturalmente em uma proteína produzida no sistema, em resposta a um códon seletor codificado, “substituindo” assim um aminoácido em uma posição no polipeptídeo codificado.
[0284]Uma grande variedade de tRNAs ortogonais e aminoacil tRNA sintetases foram descritos na técnica para inserir aminoácidos sintéticos particulares em polipeptídeos e são geralmente adequados para uso na presente invenção. Por exemplo, O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetases ceto-específicas são descritas em Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003) e Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22):6735-6746 (2003). O-RS exemplificativo, ou porções do mesmo, são codificados por sequências polinucleotídicas e incluem sequências de aminoácidos divulgadas nas Patentes U.S. Nos 7.045.337 e 7.083.970, cada uma aqui incorporada por referência. As moléculas de O-tRNA correspondentes para uso com os O-RSs também são descritas nas Patentes U.S. Nos 7.045.337 e 7.083.970 que são incorporadas neste documento por referência. Exemplos adicionais de pares de O- tRNA/aminoacil-tRNA sintetase são descritos em WO 2005/007870, WO 2005/007624; e WO 2005/019415.
[0285]Um exemplo de um sistema de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetase específico de azida é descrito em Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026- 9027 (2002). As sequências O-RS exemplificativas para p-azido-L-Phe incluem, mas não estão limitadas a sequências de nucleotídeos SEQ ID NOs: 14-16 e 29-32 e sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 46-48 e 61-64 como divulgado na Patente US Nº 7.083.970 que é aqui incorporada por referência. As sequências de O-tRNA exemplares adequadas para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitadas a sequências de nucleotídeos SEQ ID NOs: 1-3, conforme divulgado na Patente U.S. Nº 7.083.970, que é incorporada neste documento por referência. Outros exemplos de pares de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetase específicos para determinados aminoácidos codificados não naturalmente são descritos na Patente U.S. Nº 7.045.337, que é aqui incorporada por referência. O-RS e O-tRNA que incorporam aminoácidos contendo ceto e azida em S. cerevisiae são descritos em Chin, J. W., et al., Science 301:964-967 (2003).
[0286]Vários outros pares ortogonais foram relatados. Glutaminil (consultar, por exemplo, Liu, DR e Schultz, PG (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4780-4785), aspartilo (consultar, por exemplo, Pastrnak, M., et al., (2000) Helv. Chim. Acta 83: 2277-2286) e tirosil (consultar, por exemplo, Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem.
(Tóquio, Jpn.) 124: 1065-1068; e, Kowal, AK, et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 2268-2273) sistemas derivados de tRNAs e sintetases de S. cerevisiae foram descritos para a incorporação potencial de aminoácidos não naturais em E. coli.
Sistemas derivados de E. coli glutaminil (consultar, por exemplo, Kowal, AK, et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 2268-2273) e tirosil (consultar, por exemplo, Edwards, H. e Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 1633-1641) sintetases foram descritas para utilização em S. cerevisiae. O sistema tirosil de E. coli tem sido utilizado para a incorporação de 3-iodo-L-tirosina in vivo, em células de mamíferos. Consultar, Sakamoto, K., et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30: 4692-4699.
[0287]O uso de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetases envolve a seleção de um códon específico que codifica o aminoácido codificado não naturalmente (um códon seletor). Embora qualquer códon possa ser usado, é geralmente desejável selecionar um códon que raramente ou nunca é usado na célula na qual a O-tRNA/aminoacil- tRNA sintetase é expressa. Por exemplo, os códons exemplares incluem códons sem sentido, como códons de parada (âmbar, ocre e opala), códons de quatro ou mais bases e outros códons naturais de três bases que raramente ou não são usados.
[0288]Os códons seletores específicos podem ser introduzidos em posições apropriadas na sequência de codificação de IL-2 usando métodos de mutagênese conhecidos na técnica (incluindo, mas não se limitando a, mutagênese específica de sítio, mutagênese de cassete, mutagênese de seleção de restrição, etc.).
V. Localização de Aminoácidos de Ocorrência Não Natural em IL-2
[0289]A presente invenção contempla a incorporação de um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural em IL-2. Um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural podem ser incorporados em uma posição particular que não perturbe a atividade do polipeptídeo. Isso pode ser conseguido fazendo substituições “conservativas”, incluindo, mas não se limitando a, substituição de aminoácidos hidrofóbicos por aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos volumosos por aminoácidos volumosos, aminoácidos hidrofílicos por aminoácidos hidrofílicos e/ou inserção de aminoácidos não naturalmente aminoácido que ocorre em um local que não é necessário para a atividade.
[0290]Uma variedade de abordagens bioquímicas e estruturais podem ser empregadas para selecionar os sítios desejados para substituição com um aminoácido codificado não naturalmente dentro da IL-2. É prontamente aparente pela pessoa de habilidade comum na técnica que qualquer posição da cadeia de polipeptídeo é adequada para seleção para incorporar um aminoácido codificado não naturalmente e a seleção pode ser baseada em um projeto racional ou por seleção aleatória para qualquer ou nenhuma finalidade desejada. A seleção dos sítios desejados pode ser para a produção de uma molécula de IL-2 com qualquer propriedade ou atividade desejada, incluindo, mas não se limitando a, modular a ligação do receptor ou ligação a uma ou mais subunidades do seu receptor, agonistas, superagonistas, agonistas inversos, antagonistas, moduladores de ligação ao receptor, moduladores da atividade do receptor, formação de dímero ou multímero, nenhuma alteração na atividade ou propriedade em comparação com a molécula nativa, ou manipulação de qualquer propriedade física ou química do polipeptídeo, como solubilidade, agregação ou estabilidade. Por exemplo, as localizações no polipeptídeo necessárias para a atividade biológica de IL-2 podem ser identificadas usando análise de mutação pontual, varredura de alanina, mutagênese de saturação e triagem para atividade biológica ou métodos de varredura homóloga conhecidos na técnica. Outros métodos podem ser usados para identificar resíduos para modificação de IL-2 incluem, mas não estão limitados a, perfil de sequência (Bowie e Eisenberg, Science 253 (5016): 164-70, (1991)), seleções de biblioteca de rotâmero (Dahiyat e Mayo, Protein Sci 5 (5): 895-903 (1996); Dahiyat e Mayo, Science 278 (5335): 82-7 (1997); Desjarlais e Handel, Protein Science 4: 2006-2018 (1995); Harbury et al, PNAS USA 92 (18): 8408-8412 (1995); Kono et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 19: 244-255 (1994); Hellinga e Richards, PNAS USA 91: 5803-5807 (1994); e potenciais de pares de resíduos (Jones, Protein Science 3: 567-574, (1994)) e projeto racional usando a tecnologia Protein Projeto Automation®. (Consultar as Patentes U.S. Nos 6.188.965; 6.269.312; 6.403.312; WO98/47089, que são incorporadas por referência). Os resíduos diferentes daqueles identificados como críticos para a atividade biológica por alanina ou mutagênese de varredura homóloga podem ser bons candidatos para substituição por um aminoácido codificado não naturalmente dependendo da atividade desejada procurada para o polipeptídeo.
Alternativamente, os sítios identificados como críticos para a atividade biológica também podem ser bons candidatos para substituição por um aminoácido codificado não naturalmente, novamente dependendo da atividade desejada procurada para o polipeptídeo. Outra alternativa seria simplesmente fazer substituições em série em cada posição na cadeia de polipeptídeo com um aminoácido codificado não naturalmente e observar o efeito nas atividades do polipeptídeo. É prontamente aparente pela pessoa de habilidade comum na técnica que qualquer significa, técnica ou método para selecionar uma posição para substituição com um aminoácido não natural em qualquer polipeptídeo é adequado para o uso na presente invenção.
[0291]A estrutura e a atividade de mutantes de polipeptídeos de IL-2 que contêm deleções também podem ser examinadas para determinar regiões da proteína que são provavelmente tolerantes à substituição por um aminoácido codificado não naturalmente. De maneira semelhante, a digestão com protease e anticorpos monoclonais podem ser usados para identificar regiões de IL-2 que são responsáveis pela ligação ao receptor de IL-2. Uma vez que os resíduos que são provavelmente intolerantes à substituição por aminoácidos codificados não naturalmente foram eliminados, o impacto das substituições propostas em cada uma das posições restantes pode ser examinado. Assim, Aquelas pessoas de habilidade comum na técnica pode prontamente identificar posições de aminoácido que pode ser substituído por aminoácidos codificados não naturalmente.
[0292]Uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhece que tal análise de IL-2 permite a determinação de quais resíduos de aminoácidos estão expostos na superfície em comparação com os resíduos de aminoácidos que estão enterrados dentro da estrutura terciária da proteína. Portanto, é uma modalidade da presente invenção substituir um aminoácido codificado não naturalmente por um aminoácido que é um resíduo exposto à superfície.
[0293]Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 ou adicionados ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação dos mesmos (SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 3, 5 ou 7).
[0294]Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em IL-2 ou uma variante da mesma: antes da posição 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107, e qualquer combinação das mesmas (SEQ ID NO: 2 ou o aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5 ou 7).
[0295]Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em qualquer posição em uma ou mais das seguintes regiões correspondentes a estruturas secundárias ou aminoácidos específicos em IL- 2 ou uma variante da mesma como a seguir: nos sítios de interações hidrofóbicas; em ou em proximidade aos sítios de interação com subunidades de receptor de IL-2 incluindo, IL2Rα; dentro de posições de aminoácido 3 ou 35 a 45; dentro dos primeiros 107 aminoácidos N-terminais; dentro de posições de aminoácido 61 a 72; cada um de SEQ ID NO: 2 ou a posição de aminoácido correspondente em SEQ ID NOs: 3, 5 ou
7. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de IL-2 ou uma variante da mesma: antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 3, 5 ou 7. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições de IL-2 ou uma variante da mesma: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,
124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 ou adicionado ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOs: 3, 5 ou 7.
[0296]Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 é um agonista e o aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais destas regiões está ligada a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a: 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IL-2 é um agonista e o aminoácido de ocorrência não natural em um ou mais destas regiões está ligado a um polímero solúvel em água, incluindo, mas não se limitando a: em proximidade to 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107.
[0297]Uma grande variedade de aminoácidos codificados não naturalmente pode ser substituída no lugar de ou incorporada em uma dada posição em IL-2. Em geral, um aminoácido codificado não naturalmente particular é selecionado para incorporação com base em um exame da estrutura cristalina tridimensional de um polipeptídeo de IL-2 ou outro membro da família IL-2 com seu receptor, uma preferência por substituições conservativas (isto é, aminoácidos à base de arila codificados não naturalmente, como p-acetilfenilalanina ou O-propargiltirosina substituindo Phe, Tyr ou Trp), e a química de conjugação específica que se deseja introduzir na IL-2 (por exemplo, a introdução de 4-azidofenilalanina se alguém deseja efetuar uma cicloadição de Huisgen [3 + 2] com um polímero solúvel em água com uma porção de alcino ou uma formação de ligação amida com um polímero solúvel em água que contém um éster de arila que, por sua vez, incorpora uma porção de fosfina).
[0298]Em uma modalidade, o método inclui ainda incorporar na proteína o aminoácido não natural, em que o aminoácido não natural compreende um primeiro grupo reativo; e o contato da proteína com uma molécula (incluindo, mas não se limitando a, um marcador, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água,
um derivado de polietilenoglicol, um fotoreticulador, um radionuclídeo, um composto citotóxico, um fármaco, uma afinidade marcador, um marcador de fotoafinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante de metal, um cofator, um ácido graxo, um carboidrato, um polinucleotídeo, um DNA, um RNA , um polinucleotídeo antessentido, um sacarídeo, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucleico inibitório, um biomaterial, uma nanopartícula, um marcador de spin, um fluoróforo, uma porção contendo metal, uma porção radioativa,
um novo grupo funcional, um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, uma porção fotoencapsulada, uma porção excitável por radiação actínica, uma porção fotoisomerizável, biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, uma porção que incorpora um átomo pesado, um cloro quimicamente grupo disponível, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada,
um açúcar ligado a carbono, um agente redox ativo, um aminotioácido, uma porção tóxica, uma porção marcada isotopicamente, uma sonda biofísica, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo denso de elétrons, um grupo magnético, um grupo intercalante, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um marcador detectável, uma pequena molécula, um ponto quântico, um nanotransmissor, um radionucleotídeo, um radiotransmissor, uma captura de nêutrons agente, ou qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outro composto ou substância desejável) que compreende um segundo grupo reativo.
O primeiro grupo reativo reage com o segundo grupo reativo para anexar a molécula ao aminoácido não natural por meio de uma cicloadição [3 +
2]. Em uma modalidade, o primeiro grupo reativo é uma alquinila ou porção de azido e o segundo grupo reativo é uma porção de azido ou alquinila.
Por exemplo, o primeiro grupo reativo é a porção de alquinila (incluindo, mas não se limitando a, no aminoácido não natural p-propargiloxifenilalanina) e o segundo grupo reativo é a porção de azido.
Em outro exemplo, o primeiro grupo reativo é a porção de azido (incluindo, mas não se limitando a, no aminoácido não natural p-azido-L-fenilalanina) e o segundo grupo reativo é a porção de alquinila.
[0299]Em alguns casos, a(s) substituição(s) de aminoácidos codificados não naturalmente serão combinadas com outras adições, substituições ou deleções na IL- 2 para afetar outras características biológicas do polipeptídeo de IL-2. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade (incluindo, mas não se limitando a, resistência à degradação proteolítica) da IL-2 ou aumentar a afinidade da IL-2 para seu receptor. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade farmacêutica da IL-2. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a atividade da IL-2 para a inibição tumoral e/ou redução tumoral. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade (incluindo, mas não se limitando a, quando expressa em E. coli ou outras células hospedeiras) da IL-2 ou variantes. Em algumas modalidades, as adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade de IL-2 após a expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, os sítios são selecionados para substituição com um aminoácido codificado naturalmente ou não natural, além de outro sítio para incorporação de um aminoácido não natural que resulta no aumento da solubilidade do polipeptídeo após a expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IL-2 compreendem outra adição, substituição ou deleção que modula a afinidade para o receptor de IL-2, proteínas de ligação ou ligante associado, modula a transdução de sinal após a ligação ao receptor de IL-2, modula a meia-vida em circulação, modula a liberação ou biodisponibilidade, facilita a purificação ou melhora ou altera uma determinada via de administração. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IL- 2 compreendem uma adição, substituição ou deleção que aumenta a afinidade da variante de IL-2 para seu receptor. Em algumas modalidades, a IL-2 compreende uma adição, substituição ou exclusão que aumenta a afinidade da variante de IL-2 para IL- 2-R1 e/ou IL-2-R2. Da mesma forma, os polipeptídeos de IL-2 podem compreender sequências de clivagem química ou enzimática, sequências de clivagem de protease, grupos reativos, domínios de ligação a anticorpos (incluindo, mas não se limitando a, FLAG ou poli-His) ou outras sequências baseadas em afinidade (incluindo, mas não se limitando a, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, mas não se limitando a, biotina) que melhoram a detecção (incluindo, mas não se limitando a, GFP), purificação, transporte através de tecidos ou membranas celulares, liberação de pró-fármaco ou ativação, redução do tamanho de IL-2 ou outras características do polipeptídeo.
[0300]Em algumas modalidades, a substituição de um aminoácido codificado não naturalmente gera uma antagonista de IL-2. Em algumas modalidades, um aminoácido codificado não naturalmente é substituído ou adicionado em uma região envolvida com a ligação ao receptor. Em algumas modalidades, os antagonistas de IL-2 compreendem pelo menos uma substituição que faz com que a IL-2 atue como um antagonista. Em algumas modalidades, o antagonista de IL-2 compreende um aminoácido codificado não naturalmente ligado a um polímero solúvel em água que está presente em uma região de ligação ao receptor da molécula de IL-22.
[0301]Em alguns casos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos são substituídos com um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente. Em alguns casos, a IL-2 ainda inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente para aminoácidos de ocorrência natural. Por exemplo, em algumas modalidades, um ou mais resíduos em IL-2 são substituídos com um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente. Em alguns casos, os um ou mais resíduos codificados não naturalmente estão ligados a um ou mais PEGs lineares ou ramificados de peso molecular inferior, aumentando assim a afinidade de ligação e meia-vida sérica comparável em relação às espécies ligadas a um único PEG de peso molecular mais alto.
VI. Expressão em Não Eucariotas e Eucariotas
[0302]Para obter a expressão de alto nível de um polinucleotídeo de IL-2 clonado, um tipicamente subclona polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de IL-2 da invenção em um vetor de expressão que contém um promotor forte para direcionar a transcrição, um terminador de transcrição/tradução e se para um ácido nucleico que codifica uma proteína, um sítio de ligação ao ribossomo para a iniciação da tradução. Promotores bacterianos adequados são conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica e descritos, por exemplo, em Sambrook et al. e Ausubel et al.
[0303]Os sistemas de expressão bacteriana para expressar IL-2 da invenção estão disponíveis em, incluindo, mas não se limitando a, E. coli, Bacillus sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida e Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543- 545 (1983)). Kits para tais sistemas de expressão estão disponíveis comercialmente.
Os sistemas de expressão eucariótica para células de mamíferos, leveduras e células de insetos são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e também estão disponíveis comercialmente. Nos casos em que tRNAs ortogonais e aminoacil tRNA sintetases (descritos acima) são usados para expressar os polipeptídeos de IL-2 da invenção, as células hospedeiras para expressão são selecionadas com base em sua capacidade de usar os componentes ortogonais. As células hospedeiras exemplificativas incluem bactérias Gram-positivas (incluindo, mas não se limitando a B. brevis, B. subtilis ou Streptomyces) e bactérias Gram-negativas (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), bem como leveduras e outras células eucarióticas. As células que compreendem pares O- tRNA/O-RS podem ser usadas como aqui descrito.
[0304]Uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica da presente invenção fornece a capacidade para sintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Em um aspecto, a composição opcionalmente inclui, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos 10 microgramas, pelo menos 50 microgramas, pelo menos 75 microgramas, pelo menos 100 microgramas, pelo menos 200 microgramas, pelo menos 250 microgramas, pelo menos 500 microgramas, pelo menos 1 miligrama, pelo menos 10 miligramas, pelo menos 100 miligramas, pelo menos um grama ou mais da proteína que compreende um aminoácido não natural ou uma quantidade que pode ser obtida com métodos de produção de proteína in vivo (detalhes em produção e purificação de proteína recombinante são fornecidas aqui). Em um outro aspecto, a proteína está opcionalmente presente na composição em uma concentração de, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos 10 microgramas de proteína por litro, pelo menos 50 microgramas de proteína por litro, pelo menos 75 microgramas de proteína por litro, pelo menos 100 microgramas de proteína por litro, pelo menos 200 microgramas de proteína por litro, pelo menos 250 microgramas de proteína por litro, pelo menos 500 microgramas de proteína por litro, pelo menos 1 miligrama de proteína por litro ou pelo menos 10 miligramas de proteína por litro ou mais, em, incluindo, mas não se limitando a, um lisado celular, um tampão, um tampão farmacêutico ou outra suspensão líquida (incluindo, mas não se limitando a, em um volume de, incluindo, mas não limitado a, em qualquer lugar de cerca de 1 nl a cerca de 100 l ou mais). A produção de grandes quantidades (incluindo, mas não se limitando a, maior do que normalmente possível com outros métodos, incluindo, mas não se limitando a, tradução in vitro) de uma proteína em uma célula eucariótica incluindo pelo menos um aminoácido não natural é uma característica do invenção.
[0305]Uma célula hospedeira eucariótica ou célula hospedeira não eucariótica da presente invenção fornece a capacidade para biossintetizar proteínas que compreendem aminoácidos não naturais em grandes quantidades úteis. Por exemplo, as proteínas compreendendo um aminoácido não natural podem ser produzidas em uma concentração de, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos 10 µg/litro, pelo menos 50 µg/litro, pelo menos 75 µg/litro, pelo menos 100 µg/litro, pelo menos 200 µg/litro, pelo menos 250 µg/litro ou pelo menos 500 µg/litro, pelo menos 1 mg/litro, pelo menos 2 mg/litro, pelo menos 3 mg/litro, pelo menos 4 mg/litro, pelo menos 5 mg/litro, pelo menos 6 mg/litro, pelo menos 7 mg/litro, pelo menos 8 mg/litro, pelo menos 9 mg/litro, pelo menos 10 mg/litro, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro ou mais de proteína em um extrato celular, lisado celular, meio de cultura, um tampão e/ou semelhantes.
[0306]Vários vetores adequados para a expressão de IL-2 estão disponíveis comercialmente. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos incluem, mas não estão limitados a vetores que compreendem sequências de controle de expressão de SV40, vírus do papiloma bovino, adenovírus e citomegalovírus. Tais vetores incluem pCDNA3.1 (+) \ Hyg (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) e pCI-neo (Stratagene, La Jolla, Califórnia, EUA). Plasmídeos bacterianos, como plasmídeos de E. coli, incluindo pBR322, pET3a e pET12a, plasmídeos de faixa mais ampla de hospedeiros, como RP4, DNAs de fago, por exemplo, os numerosos derivados de fago lambda, por exemplo, NM989, e outros fagos de DNA, tais como M13 e fagos de DNA de cadeia simples filamentosos podem ser usados. O plasmídeo de 2 µ e derivados do mesmo, o vetor POT1 (Pat. U.S. Nº 4.931.373 que é incorporado por referência), o vetor pJSO37 descrito em (Okkels, Ann. New York Aced. Sci. 782, 202 207, 1996) e pPICZ A, B ou C (Invitrogen) podem ser usados com células hospedeiras de levedura. Para células de inseto, os vetores incluem, mas não estão limitados a pVL941, pBG311 (Cate et al., “Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian
Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells”, Cell, 45, páginas 685 98 (1986), pBluebac 4.5 e pMelbac (Invitrogen, Carlsbad, CA).
[0307]A sequência de nucleotídeo que codifica uma IL-2 ou uma variante da mesma pode ou não incluir também uma sequência que codifica um peptídeo sinal. O peptídeo de sinal está presente quando o polipeptídeo vai ser segregado pelas células nas quais é expresso. Esse peptídeo sinal pode ser qualquer sequência. O peptídeo sinal pode ser procariótico ou eucariótico. Coloma, M (1992) J. Imm. Métodos 152: 89 104 descrevem um peptídeo sinal para uso em células de mamíferos (peptídeo sinal de cadeia leve kappa de Ig murina). Outros peptídeos de sinal incluem, mas não estão limitados ao peptídeo de sinal do α-fator de S. cerevisiae (Patente US Nº 4.870.008 que é aqui incorporada por referência), o peptídeo de sinal de amilase salivar de camundongo (O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, páginas 643-646), um peptídeo sinal de carboxipeptidase modificado (LA Valls et al., Cell 48, 1987, páginas 887-897), o peptídeo de sinal BAR1 de levedura (WO 87/02670, que é incorporado por aqui referência), e o peptídeo de sinal de protease aspártica de levedura 3 (YAP3) (cf. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, páginas 127-137).
[0308]Exemplos de células hospedeiras de mamíferos adequadas são conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica. Essas células hospedeiras podem ser células de ovário de hamster chinês (CHO), (por exemplo, CHO-K1; ATCC CCL-61), células de macaco verde (COS) (por exemplo, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de camundongo (por exemplo, NS/O), linhas de células de rim de hamster bebê (BHK) (por exemplo, ATCC CRL-1632 ou ATCC CCL- 10) e células humanas (por exemplo, HEK 293 (ATCC CRL-1573)), bem como células vegetais em cultura de tecidos. Estas linhas de células e outras estão disponíveis em depósitos públicos, tais como American Type Culture Collection, Rockville, Md. Para proporcionar glicosilação melhorada do polipeptídeo de IL-2, uma célula hospedeira de mamífero pode ser modificada para expressar sialiltransferase, por exemplo, 1,6-
sialiltransferase, por exemplo, como descrito em Pat. U.S. Nº 5.047.335, que é incorporado por referência aqui.
[0309]Os métodos para a introdução de DNA exógeno em células hospedeiras de mamíferos incluem, mas não estão limitados a transfecção mediada por fosfato de cálcio, eletroporação, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipossoma, vetores virais e os métodos de transfecção descritos por Life Technologies Ltd, Paisley, UK usando Lipofectamin 2000 e Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA usando FuGENE 6. Estes métodos são bem conhecidos na técnica e são descritos por Ausbel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, EUA. O cultivo de células de mamíferos pode ser realizado de acordo com métodos estabelecidos, e. como divulgado em (Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc. Totowa, N.J., USA e Harrison Mass. e Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997).
I. E. coli, espécies de Pseudomonas e outros procariotas As técnicas de expressão bacteriana são conhecidas pela pessoa de habilidade comum na técnica.
Uma grande variedade de vetores está disponível para o uso em hospedeiros bacterianos. Os vetores podem ser de cópia única ou vetores de baixa ou alta cópia múltipla. Os vetores podem servir para clonagem e/ou expressão. Em vista da ampla literatura sobre vetores, disponibilidade comercial de muitos vetores e mesmo manuais que descrevem vetores e seus mapas de restrição e características, nenhuma discussão extensa é necessária aqui. Como é bem conhecido, os vetores normalmente envolvem marcadores que permitem a seleção, marcadores esses que podem fornecer para resistência, prototrofia ou imunidade ao agente citotóxico.
Frequentemente, uma pluralidade de marcadores está presente, os quais fornecem características diferentes.
[0310]Um promotor bacteriano é qualquer sequência de DNA capaz de se ligar à RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição a jusante (3’) de uma sequência de codificação (por exemplo, gene estrutural) em mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição que é normalmente colocada próxima da extremidade 5’ da sequência de codificação. Esta região de iniciação da transcrição inclui tipicamente um sítio de ligação da RNA polimerase e um sítio de iniciação da transcrição. Um promotor bacteriano também pode ter um segundo domínio denominado operador, que pode se sobrepor a um sítio de ligação da RNA polimerase adjacente no qual a síntese de RNA começa. O operador permite a transcrição regulada negativamente (induzível), pois uma proteína repressora de gene pode se ligar ao operador e, assim, inibir a transcrição de um gene específico. A expressão constitutiva pode ocorrer na ausência de elementos reguladores negativos, como o operador. Além disso, a regulação positiva pode ser alcançada por uma sequência de ligação da proteína ativadora do gene, que, se presente, é geralmente próxima (5 ') à sequência de ligação da RNA polimerase. Um exemplo de uma proteína ativadora de gene é a proteína ativadora catabólita (CAP), que ajuda a iniciar a transcrição do operon lac em Escherichia coli (E. coli), (Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18: 173). A expressão regulada pode, portanto, ser positiva ou negativa, aumentando ou reduzindo a transcrição.
[0311]As sequências que codificam enzimas da via metabólica fornecem sequências promotoras particularmente úteis. Os exemplos incluem sequências promotoras derivadas de enzimas de metabolização de açúcar, tais como galactose, lactose (lac), (Chang et al., NATURE (1977) 198: 1056) e maltose. Exemplos adicionais incluem sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas, tais como triptofano (trp), (Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8: 4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9: 731 ; Patente US Nº 4.738.921; Publicações EP Nos 036 776 e 121 775, que são aqui incorporadas por referência). O sistema promotor de β-galactosidase (bla) (Weissmann (1981) “The cloning of interferon and other errors”.
Em Interferon 3 (Ed. I. Gresser), bacteriófago lambda PL (Shimatake et al., NATURE (1981) 292:128) e sistemas promotores T5 (Patente US Nº 4.689.406, que são aqui incorporados por referência), também fornecem sequências promotoras úteis. Os métodos preferidos da presente invenção utilizam promotores fortes, tais como o promotor T7 para induzir polipeptídeos de IL-2 em níveis elevados. Os exemplos de tais vectores são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e incluem a série pET29 de Novagen e os vectores pPOP descritos em WO99/05297, que é aqui incorporado por referência. Tais sistemas de expressão produzem altos níveis de polipeptídeos de IL-2 no hospedeiro sem comprometer a viabilidade da célula hospedeira ou os parâmetros de crescimento. pET19 (Novagen) é outro vetor conhecido na técnica.
[0312]Além disso, os promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores bacterianos. Por exemplo, as sequências de ativação da transcrição de um promotor bacteriano ou bacteriófago podem ser unidas às sequências do operon de outro promotor bacteriano ou bacteriófago, criando um promotor híbrido sintético (Patente US 4.551.433, que é aqui incorporada por referência). Por exemplo, o promotor tac é um promotor híbrido trp-lac compreendendo tanto o promotor trp quanto as sequências do operon lac que é regulado pelo repressor lac (Amann et al., GENE (1983) 25: 167; de Boer et al., PROC NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21). Além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores de ocorrência natural de origem não bacteriana que têm a capacidade de se ligar à polimerase de RNA bacteriana e iniciar a transcrição. Um promotor que ocorre naturalmente de origem não bacteriana também pode ser acoplado a uma polimerase de RNA compatível para produzir altos níveis de expressão de alguns genes em procariotas. O sistema promotor/polimerase de RNA do bacteriófago T7 é um exemplo de um sistema promotor acoplado (Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986)
189: 113; Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82: 1074). Além disso, um promotor híbrido também pode ser composto por um promotor de bacteriófago e uma região operadora de E. coli (EP Pub. Nº 267 851).
[0313]Além de uma sequência promotora funcional, um sítio de ligação ao ribossomo eficiente também é útil para a expressão de genes estranhos em procariotas. Em E. coli, o sítio de ligação ao ribossomo é chamado de sequência Shine-Dalgarno (SD) e inclui um códon de iniciação (ATG) e uma sequência de 3 a 9 nucleotídeos de comprimento localizada 3 a 11 nucleotídeos a montante do códon de iniciação (Shine et al ., NATURE (1975) 254: 34). A sequência SD é pensada para promover a ligação de mRNA ao ribossomo pelo emparelhamento de bases entre a sequência SD e o 3’ e de E. coli 16S rRNA (Steitz et al. “Sinais genéticos e sequências de nucleotídeos em RNA mensageiro”, Em Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. RF Goldberger, 1979)). Para expressar genes eucarióticos e genes procarióticos com sítio de ligação ao ribossomo fraco (Sambrook et al.
“Expression of cloned genes in Escherichia coli”, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).
[0314]O termo “hospedeiro bacteriano” ou “célula hospedeira bacteriana” refere-se a uma bactéria que pode ser, ou foi, usada como um recipiente para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui a progênie da célula hospedeira bacteriana original que foi transfectada. Entende-se que a progênie de uma única célula parental pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complemento de DNA genômico ou total ao progenitor original, devido a mutação acidental ou deliberada. A progênie da célula parental que é suficientemente semelhante à parental para ser caracterizada pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de IL-2, está incluída na progênie pretendida por esta definição.
[0315]A seleção de bactérias hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos de IL-2 é conhecida pela pessoa de habilidade comum na técnica. Na seleção de hospedeiros bacterianos para expressão, os hospedeiros adequados podem incluir aqueles que apresentam, inter alia, boa capacidade de formação de corpos de inclusão, baixa atividade proteolítica e robustez geral. Os hospedeiros bacterianos estão geralmente disponíveis a partir de uma variedade de fontes, incluindo, mas não se limitando a, Bacterial Genetic Stock Center, Departamento de Biofísica e Física Médica, Universidade da Califórnia (Berkeley, CA); e American Type Culture Collection (“ATCC”) (Manassas, VA). A fermentação industrial/farmacêutica geralmente usa bactérias derivadas de cepas K (por exemplo, W3110) ou de bactérias derivadas de cepas B (por exemplo, BL21). Essas cepas são particularmente úteis porque seus parâmetros de crescimento são extremamente conhecidos e robustos.
Além disso, essas cepas são não patogênicas, o que é comercialmente importante por razões de segurança e ambientais. Outros exemplos de hospedeiros de E. coli adequados incluem, mas não estão limitados a cepas de BL21, DH10B ou seus derivados. Em outra modalidade dos métodos da presente invenção, o hospedeiro de E. coli é uma cepa sem protease incluindo, mas não se limitando a, OMP- e LON-. A cepa de célula hospedeira pode ser uma espécie de Pseudomonas, incluindo, mas não se limitando a, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas putida. Pseudomonas fluorescens biovar 1, designada cepa MB101, é conhecida por ser útil para a produção recombinante e está disponível para processos de produção de proteínas terapêuticas. Exemplos de um sistema de expressão de Pseudomonas incluem o sistema disponível na The Dow Chemical Company como uma cepa hospedeira (Midland, MI disponível na World Wide Web em dow.com).
[0316]Uma vez que uma cepa de célula hospedeira recombinante foi estabelecida (isto é, a construção de expressão foi introduzida na célula hospedeira e as células hospedeiras com a construção de expressão adequada são isoladas), a cepa de célula hospedeira recombinante é cultivada em condições apropriadas para a produção de Polipeptídeos de IL-2. Como será evidente para uma pessoa versada na técnica, o método de cultura da cepa de célula hospedeira recombinante será dependente da natureza da construção de expressão utilizada e da identidade da célula hospedeira. As cepas hospedeiras recombinantes são normalmente cultivadas usando métodos que são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. As células hospedeiras recombinantes são tipicamente cultivadas em meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos e, opcionalmente, contendo vitaminas, aminoácidos, fatores de crescimento e outros suplementos de cultura proteica conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica. Os meios líquidos para cultura de células hospedeiras podem conter opcionalmente antibióticos ou antifúngicos para prevenir o crescimento de microrganismos indesejáveis e/ou compostos incluindo, mas não se limitando a, antibióticos para selecionar células hospedeiras contendo o vetor de expressão.
[0317]As células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas em lotes ou formatos contínuos, com coleta de células (no caso em que o polipeptídeo de IL-2 se acumula intracelularmente) ou coleta de sobrenadante de cultura em lotes ou formatos contínuos. Para a produção em células hospedeiras procarióticas, a cultura em lote e a colheita de células são preferidas.
[0318]Os polipeptídeos de IL-2 da presente invenção são normalmente purificados após a expressão em sistemas recombinantes. O polipeptídeo de IL-2 pode ser purificado a partir de células hospedeiras ou meio de cultura por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Os polipeptídeos de IL-2 produzidos em células hospedeiras bacterianas podem ser fracamente solúveis ou insolúveis (na forma de corpos de inclusão). Em uma modalidade da presente invenção, as substituições de aminoácidos podem ser prontamente feitas no polipeptídeo de IL-2 que são selecionadas com o propósito de aumentar a solubilidade da proteína produzida de forma recombinante utilizando os métodos aqui divulgados, bem como aqueles conhecidos na técnica. No caso da proteína insolúvel, a proteína pode ser coletada dos lisados da célula hospedeira por centrifugação e pode ainda ser seguida pela homogeneização das células. No caso de proteína fracamente solúvel, compostos incluindo, mas não se limitando a, polietileno imina (PEI) podem ser adicionados para induzir a precipitação de proteína parcialmente solúvel. A proteína precipitada pode então ser convenientemente recolhida por centrifugação. As células hospedeiras recombinantes podem ser rompidas ou homogeneizadas para liberar os corpos de inclusão de dentro das células usando uma variedade de métodos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. A interrupção ou homogeneização da célula hospedeira pode ser realizada usando técnicas bem conhecidas, incluindo, mas não se limitando a, interrupção da célula enzimática, sonicação, homogeneização de dounce ou interrupção da liberação de alta pressão. Em uma modalidade do método da presente invenção, a técnica de liberação de alta pressão é usada para romper as células hospedeiras de E. coli para liberar os corpos de inclusão dos polipeptídeos de IL-2. Ao lidar com corpos de inclusão de polipeptídeo de IL-2, pode ser vantajoso minimizar o tempo de homogeneização nas repetições, a fim de maximizar o rendimento de corpos de inclusão sem perda devido a fatores como solubilização, cisalhamento mecânico ou proteólise.
[0319]O polipeptídeo de IL-2 insolúvel ou precipitado pode então ser solubilizado usando qualquer um de uma série de agentes de solubilização adequados conhecidos na técnica. O polipeptídeo de IL-2 pode ser solubilizado com ureia ou cloridrato de guanidina. O volume do polipeptídeo de IL-2 solubilizado deve ser minimizado para que grandes lotes possam ser produzidos usando tamanhos de lote convenientemente gerenciáveis. Este fator pode ser significativo em um ambiente comercial de grande escala, onde o hospedeiro recombinante pode ser cultivado em lotes de milhares de litros de volume. Além disso, ao fabricar polipeptídeo de IL-2 em um ambiente comercial em grande escala, em particular para usos farmacêuticos humanos, a prevenção de produtos químicos que podem danificar a máquina e o recipiente, ou o próprio produto de proteína, deve ser evitada, se possível. Foi demonstrado no método da presente invenção que o agente desnaturante mais suave ureia pode ser usado para solubilizar os corpos de inclusão do polipeptídeo de IL-2 em vez do agente desnaturante mais áspero cloridrato de guanidina. O uso de ureia reduz significativamente o risco de danos ao equipamento de aço inoxidável utilizado no processo de fabricação e purificação do polipeptídeo de IL-2 enquanto solubiliza eficientemente os corpos de inclusão do polipeptídeo de IL-2.
[0320] No caso da proteína de IL-2 solúvel, a IL-2 pode ser secretada no espaço periplasmático ou no meio de cultura. Além disso, a IL-2 solúvel pode estar presente no citoplasma das células hospedeiras. Pode ser desejável concentrar a IL- 2 solúvel antes de realizar as etapas de purificação. Podem ser utilizadas técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas na técnica para concentrar IL-2 solúvel a partir de, por exemplo, lisados celulares ou meio de cultura. Além disso, as técnicas convencionais conhecidas pelas pessoas versadas na técnica podem ser utilizadas para destruir células hospedeiras e libertar IL-2 solúvel do citoplasma ou espaço periplasmático das células hospedeiras.
[0321]Em geral, é ocasionalmente desejável desnaturar e reduzir polipeptídeos expressos e, em seguida, fazer com que os polipeptídeos se dobrem novamente na conformação preferida. Por exemplo, guanidina, ureia, DTT, DTE e/ou uma chaperonina podem ser adicionados a um produto de tradução de interesse. Os métodos de redução, desnaturação e renaturação de proteínas são conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica (consultar, as referências acima, e Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman e Pastan (1993) Bioconjug.
Chem., 4: 581-585; e Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270). Debinski, et al., por exemplo, descreve a desnaturação e redução das proteínas do corpo de inclusão em guanidina-DTE. As proteínas podem ser redobradas em um tampão redox contendo, incluindo, mas não se limitando a, glutationa oxidada e L-arginina. Os reagentes de redobramento podem ser fluidos ou de outra forma movidos para contato com um ou mais polipeptídeos ou outro produto de expressão, ou vice-versa.
[0322]No caso de produção procariótica de polipeptídeo de IL-2, o polipeptídeo de IL-2 assim produzido pode ser dobrado incorretamente e, portanto, não tem ou tem atividade biológica reduzida. A bioatividade da proteína pode ser restaurada por “redobramento”. Em geral, o polipeptídeo de IL-2 mal dobrado é redobrado por solubilização (onde o polipeptídeo de IL-2 também é insolúvel), desdobramento e redução da cadeia polipeptídica usando, por exemplo, um ou mais agentes caotrópicos (por exemplo, ureia e/ou guanidina) e um agente redutor capaz de reduzir as ligações dissulfeto (por exemplo, ditiotreitol, DTT ou 2-mercaptoetanol, 2-ME). A uma concentração moderada de caotrópico, um agente oxidante é então adicionado (por exemplo, oxigênio, cistina ou cistamina), o que permite a reforma de ligações dissulfeto. O polipeptídeo de IL-2 pode ser redobrado utilizando métodos padrão conhecidos na técnica, tal como os descritos em Pat. U.S. Nos 4.511.502,
4.511.503, e 4.512.922, que são incorporados por referência aqui. O polipeptídeo de IL-2 pode também ser co-dobrado com outras proteínas para formar heterodímeros ou heteromultímeros.
[0323]Após o redobramento, a IL-2 pode ser posteriormente purificada. A purificação de IL-2 pode ser realizada usando uma variedade de técnicas conhecidas pela pessoa de habilidade comum na técnica, incluindo, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa, cromatografia de afinidade e semelhantes ou qualquer combinação dos mesmos. A purificação adicional também pode incluir uma etapa de secagem ou precipitação da proteína purificada.
[0324]Após a purificação, a IL-2 pode ser trocada por diferentes tampões e/ou concentrada por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, diafiltração e diálise. A IL-2 que é fornecida como uma única proteína purificada pode estar sujeita a agregação e precipitação.
[0325]A IL-2 purificada pode ser pelo menos 90 % pura (conforme medido por cromatografia líquida de alta performance de fase reversa, RP-HPLC ou eletroforese em gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio, SDS-PAGE) ou pelo menos 95 % pura, ou pelo menos 96 % puro, ou pelo menos 97 % puro, ou pelo menos 98 % puro, ou pelo menos 99 % ou mais puro. Independentemente do valor numérico exato da pureza da IL-2, a IL-2 é suficientemente pura para uso como produto farmacêutico ou para processamento posterior, como conjugação com um polímero solúvel em água, como PEG.
[0326]Certas moléculas de IL-2 podem ser usadas como agentes terapêuticos na ausência de outros ingredientes ativos ou proteínas (exceto portadores e estabilizadores, albumina sérica e semelhantes), ou podem ser complexadas com outra proteína ou um polímero.
[0327]Previamente, foi demonstrado que aminoácidos não naturais podem ser incorporados especificamente em sítio em proteínas in vitro pela adição de tRNAs supressores quimicamente aminoacilados a reações de síntese de proteínas programadas com um gene contendo uma mutação âmbar sem sentido desejada.
Usando essas abordagens, pode-se substituir uma série de vinte aminoácidos comuns por homólogos estruturais próximos, por exemplo, fluorofenilalanina por fenilalanina, usando cepas auxotrópicas para um aminoácido particular. Consultar, por exemplo, Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site- specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M.W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-
natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N.
Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins, Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992); and, Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995).
[0328]Por exemplo, um tRNA supressor foi preparado que reconheceu o códon de parada UAG e foi quimicamente aminoacilado com um aminoácido não natural. A mutagênese dirigida ao sítio convencional foi usada para introduzir o códon de parada TAG, no sítio de interesse no gene da proteína. Consultar, por exemplo, Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-oriented mutagenis, Nucleic Acids Res, 16 (3): 791-802 (1988).
Quando o tRNA supressor acilado e o gene mutante foram combinados em um sistema de transcrição/tradução in vitro, o aminoácido não natural foi incorporado em resposta ao códon UAG que deu uma proteína contendo aquele aminoácido na posição especificada. Experimentos usando [3H]-Phe e experimentos com α- hidroxiácidos demonstraram que apenas o aminoácido desejado é incorporado na posição especificada pelo códon UAG e que este aminoácido não é incorporado em qualquer outro sítio na proteína. Consultar, por exemplo, Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Estrutural Biology 10(6):425-432; e, Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992).
[0329]Um tRNA pode ser aminoacilado com um aminoácido desejado por qualquer método ou técnica, incluindo, mas não se limitando a, aminoacilação química ou enzimática.
[0330]A aminoacilação pode ser realizada por aminoacil tRNA sintetases ou por outras moléculas enzimáticas, incluindo, mas não se limitando a, ribozimas. O termo “ribozima” é intercambiável com “RNA catalítico”. Cech e coworkers (Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221- 226) demonstraram a presença de RNAs de ocorrência natural que podem atuar como catalisadores (ribozimas). No entanto, embora esses catalisadores de RNA naturais só tenham demonstrado agir em substratos de ácido ribonucleico para clivagem e splicing, o recente desenvolvimento da evolução artificial de ribozimas expandiu o repertório de catálise para várias reações químicas. Estudos identificaram moléculas de RNA que podem catalisar aminoacil-RNA ligações em seus próprios (2’) 3’- terminais (Illangakekare et al., 1995 Science 267: 643-647), e uma molécula de RNA que pode transferir um aminoácido de uma molécula de RNA para outra (Lohse et al., 1996, Nature 381: 442-444).
[0331]A Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0228593, que é incorporada neste documento por referência, descreve métodos para construir ribozimas e seu uso na aminoacilação de tRNAs com aminoácidos codificados naturalmente e codificados não naturalmente. As formas imobilizadas de substrato de moléculas enzimáticas que podem aminoacilar tRNAs, incluindo, mas não se limitando a, ribozimas, podem permitir a purificação por afinidade eficiente dos produtos aminoacilados. Exemplos de substratos adequados incluem agarose, sepharose e contas magnéticas. A produção e o uso de uma forma imobilizada de substrato de ribozima para aminoacilação são descritos em Chemistry and Biology 2003, 10: 1077- 1084 e na Publicação do Pedido de Patente U.S. 2003/0228593, que são aqui incorporados por referência.
[0332]Os métodos de aminoacilação química incluem, mas não estão limitados a aqueles introduzidos por Hecht e colaboradores (Hecht, SM Acc. Chem.
Res. 1992, 25, 545; Heckler, TG; Roesser, JR; Xu, C .; Chang, P. ; Hecht, SM Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, SM; Alford, BL; Kuroda, Y .; Kitano, SJ Biol.
Chem. 1978, 253, 4517) e por Schultz, Chamberlin, Dougherty e outros (Cornish, VW
; Mendel, D .; Schultz, PG Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, SA; Ellman, JA; Schultz, PGJ Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, CJ; Anthony-Cahill, SJ; Griffith, MC; Schultz, PG Science 1989, 244, 182; Bain, JD; Glabe, CG; Dix, TA; Chamberlin, ARJ Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013; Bain , JD et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, JP; Lester, HA; Dougherty, DA Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al.
J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, MW et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, ME et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsa Ka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34), que são aqui incorporados por referência, para evitar o uso de sintetases na aminoacilação. Tais métodos ou outros métodos de aminoacilação química podem ser usados para aminoacilar moléculas de ARNt.
[0333]Os métodos para a geração de RNA catalítico podem envolver a geração de pools separados de sequências de ribozimas aleatórias, realização de evolução direcionada nos pools, triagem dos pools para atividade de aminoacilação desejável e seleção de sequências dessas ribozimas exibindo atividade de aminoacilação desejada.
[0334]Sistemas de tradução reconstituídos também podem ser usados.
Misturas de fatores de tradução purificados também foram usadas com sucesso para traduzir mRNA em proteína, bem como combinações de lisados ou lisados suplementados com fatores de tradução purificados, como fator de iniciação-1 (SE-1), SE-2, SE-3 (α ou β), fator de alongamento T (EF-Tu), ou fatores de terminação. Os sistemas livres de células também podem ser sistemas de transcrição/tradução acoplados em que o DNA é introduzido no sistema, transcrito em mRNA e o mRNA traduzido como descrito em Current Protocols in Molecular Biology (FM Ausubel et al.
Editores, Wiley Interscience, 1993), que é aqui especificamente incorporado por referência. O RNA transcrito no sistema de transcrição eucariótico pode estar na forma de RNA heteronuclear (hnRNA) ou caps de extremidade 5’(7-metil guanosina) e mRNA maduro de cauda poli A da extremidade 3’, o que pode ser uma vantagem em certos sistemas de tradução. Por exemplo, os mRNAs tampados são traduzidos com alta eficiência no sistema de lisado de reticulócitos.
IX. Polímeros Macromoleculares Acoplados a Polipeptídeos de IL-2
[0335]Várias modificações aos polipeptídeos de aminoácidos não naturais aqui descritos podem ser efetuadas usando as composições, métodos, técnicas e estratégias aqui descritas. Estas modificações incluem a incorporação de funcionalidade adicional no componente de aminoácido não natural do polipeptídeo, incluindo, mas não se limitando a, um marcador; um corante; um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietilenoglicol; um fotoreticulador; um radionuclídeo; um composto citotóxico; um fármaco; um marcador de afinidade; um marcador de fotoafinidade; um composto reativo; uma resina; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou polipeptídeo análogo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelante de metal; cofator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo antessentido; um sacarídeo; um dendrímero solúvel em água; uma ciclodextrina; um ácido ribonucleico inibidor; um biomaterial; uma nanopartícula; um marcador de spin; um fluoróforo, um fluoróforo, uma porção contendo metal; uma porção radioativa; um novo grupo funcional; um grupo que interage covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas; uma porção fotoencapsulada; uma porção excitável por radiação actínica; uma porção fotoisomerizável; biotina; um derivado da biotina; um análogo de biotina; uma porção que incorpora um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo fotoclivável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado ao carbono; um agente redox ativo; um aminotioácido; uma porção tóxica; uma porção marcada isotopicamente; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimioluminescente; um grupo denso de elétrons; um grupo magnético; um grupo intercalado; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo; um rótulo detectável; uma pequena molécula; um ponto quântico; um nanotransmissor; um radionucleotídeo; um radiotransmissor; um agente de captura de nêutrons; ou qualquer combinação dos anteriores, ou qualquer outro composto ou substância desejável. Como um exemplo ilustrativo e não limitativo das composições, métodos, técnicas e estratégias aqui descritas, a seguinte descrição se concentrará na adição de polímeros macromoleculares ao polipeptídeo de aminoácido não natural com o entendimento de que as composições, métodos, técnicas e estratégias descritas para isso também são aplicáveis (com modificações apropriadas, se necessário e para as quais uma pessoa versada na técnica poderia fazer com as divulgações aqui) para adicionar outras funcionalidades, incluindo, mas não se limitando àquelas listadas acima.
[0336]Uma grande variedade de polímeros macromoleculares e outras moléculas podem ser ligados a polipeptídeos de IL-2 da presente invenção para modular as propriedades biológicas do polipeptídeo de IL-2 e/ou fornecer novas propriedades biológicas para a molécula de IL-2. Estes polímeros macromoleculares podem ser ligados ao polipeptídeo de IL-2 através de um aminoácido codificado naturalmente, através de um aminoácido codificado não naturalmente, ou qualquer substituinte funcional de um aminoácido natural ou não natural, ou qualquer substituinte ou grupo funcional adicionado a um aminoácido natural ou não natural. O peso molecular do polímero pode ser de uma ampla faixa, incluindo, mas não se limitando a, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode ser entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, mas não se limitando a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da,
35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero é entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000
Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero é entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero é entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero é entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero é entre cerca de 10.000 Da e cerca de
40.000 Da.
[0337]A presente invenção fornece preparações substancialmente homogêneas de conjugados de polímero:proteína. “Substancialmente homogêneo” conforme usado neste documento significa que preparações substancialmente homogêneas de conjugados de polímero: proteína. “Substancialmente homogêneo” como aqui utilizado significa que as moléculas de conjugado de polímero: proteína são observadas como sendo mais da metade da proteína total. O conjugado de polímero: proteína tem atividade biológica e as presentes preparações de “substancialmente homogêneas” de polipeptídeo de IL-2 PEGuilada aqui fornecidas são aquelas que são homogêneas o suficiente para exibir as vantagens de uma preparação homogênea, por exemplo, facilidade na aplicação clínica na previsibilidade de lote a lote farmacocinética.
[0338]Pode-se também escolher preparar uma mistura de moléculas de polímero: conjugado de proteína, e a vantagem aqui fornecida é que se pode selecionar a proporção de monopolímero: conjugado de proteína para incluir na mistura. Assim, se desejado, pode-se preparar uma mistura de várias proteínas com vários números de porções de polímero anexadas (isto é, di-, tri-, tetra-, etc.) e combinar os ditos conjugados com o conjugado monopolímero: proteína preparado usando os métodos da presente invenção, e têm uma mistura com uma proporção predeterminada de conjugados monopolímero: proteína.
[0339]O polímero selecionado pode ser água-solúvel de modo que a proteína à qual está ligado não precipite em um ambiente aquoso, como um ambiente fisiológico. O polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Para uso terapêutico da preparação do produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável.
[0340]Exemplos de polímeros incluem mas não estão se limitando a éteres polialquílicos e análogos dos mesmos tampados com alcóxi (por exemplo, polioxietileno glicol, polioxietileno/propileno glicol, e análogos dos mesmos tampados com metóxi ou etóxi, especialmente polioxietileno glicol, o último é também conhecido como polietilenoglicol ou PEG); polivinilpirrolidonas; éteres polivinilalquílicos; polioxazolinas, polialquil oxazolinas e polihidroxialquil oxazolinas; poliacrilamidas, polialquil acrilamidas, e polihidroxialquil acrilamidas (por exemplo, polihidroxipropilmetacrilamida e derivados dos mesmos); polihidroxialquil acrilatos; ácidos polisiálicos e análogos dos mesmos; sequências de peptídeos hidrofílicos; polissacarídeos e derivados dos mesmos, incluindo dextrano e derivados de dextrano, por exemplo, carboximetildextrano, sulfatos de dextrano, aminodextrano; celulose e derivados dos mesmos, por exemplo, carboximetilcelulose, hidroxialquilceluloses; quitina e derivados dos mesmos, por exemplo, quitosano, succinilquitosano, carboximetilquitina, carboximetilquitosano; ácido hialurônico e derivados dos mesmos; amidos; alginatos; sulfato de condroitina; albumina; pululano e carboximetil pululano; poliaminoácidos e derivados dos mesmos, por exemplo, ácidos poliglutâmicos, polilisinas, ácidos poliaspárticos, poliaspartamidas; copolímeros de anidrido maleico, tais como: copolímero de anidrido maleico de estireno, copolímero de anidrido maleico de éter diviniletílico; álcoois polivinílicos; seus copolímeros; seus terpolímeros; misturas dos mesmos; e derivados do anterior.
[0341]A proporção de moléculas de polietilenoglicol para moléculas de proteína irá variar, assim como suas concentrações na mistura de reação. Em geral, a proporção ótima (em termos de eficiência da reação em que há excesso mínimo de proteína ou polímero não reagido) pode ser determinada pelo peso molecular do polietilenoglicol selecionado e pelo número de grupos reativos disponíveis,
disponíveis. No que se refere ao peso molecular, tipicamente quanto maior for o peso molecular do polímero, menor será o número de moléculas de polímero que podem ser ligadas à proteína. Da mesma forma, a ramificação do polímero deve ser levada em consideração ao otimizar esses parâmetros. Geralmente, quanto maior for o peso molecular (ou quanto mais ramificações), maior será a razão de polímero:proteína.
[0342]Conforme usado neste documento, e quando contemplando conjugados de polipeptídeo de PEG: IL-2, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade que dá o benefício desejado a um paciente. A quantidade varia de um indivíduo para outro e depende de uma série de fatores, incluindo a condição física geral do paciente e a causa subjacente da condição a ser tratada. A quantidade de polipeptídeo de IL-2 usada para terapia dá uma taxa de alteração aceitável e mantém a resposta desejada a um nível benéfico. Uma quantidade terapeuticamente eficaz das presentes composições pode ser facilmente determinada por uma pessoa versada na técnica usando materiais e procedimentos disponíveis ao público.
[0343]O polímero solúvel em água pode ser qualquer forma estrutural incluindo, mas não se limitando a, linear, bifurcada ou ramificada. Normalmente, o polímero solúvel em água é um poli(alquilenoglicol), tal como poli(etilenoglicol) (PEG), mas outros polímeros solúveis em água também podem ser empregados. A título de exemplo, o PEG é usado para descrever certas modalidades desta invenção.
[0344]PEG é um polímero solúvel em água bem conhecido que está disponível comercialmente ou pode ser preparado por polimerização de etilenoglicol por abertura de anel de acordo com métodos conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica (Sandler e Karo, Polímero Síntese, Academic Press, New York, Vol. 3, páginas 138-161). O termo “PEG” é usado amplamente para abranger qualquer molécula de polietilenoglicol, sem consideração ao tamanho ou à modificação em uma extremidade do PEG, e pode ser representado como ligado ao polipeptídeo de IL-2 pela fórmula: XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y onde n é 2 a 10.000 e X é H ou uma modificação terminal, incluindo, mas não se limitando a, uma alquila C1-4, um grupo de proteção ou um grupo funcional terminal.
[0345]Em alguns casos, um PEG usado na invenção termina em uma extremidade com hidroxi ou metoxi, isto é, X é H ou CH3 (“metoxi PEG”). Alternativamente, o PEG pode terminar com um grupo reativo, formando assim um polímero bifuncional. Os grupos reativos típicos podem incluir aqueles grupos reativos que são comumente usados para reagir com os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas não se limitando a, grupos maleimida, carbonatos ativados (incluindo, mas não se limitando a, éster p-nitrofenílico), ésteres ativados (incluindo, mas não se limitando a, N-hidroxisuccinimida, éster p-nitrofenil) e aldeídos), bem como grupos funcionais que são inertes para os 20 aminoácidos comuns, mas que reagem especificamente com grupos funcionais complementares presentes em aminoácidos codificados não naturalmente ácidos (incluindo, mas não se limitando a, grupos azida, grupos alcino). É observado que a outra extremidade do PEG, que é mostrada na fórmula anterior por Y, irá ligar-se direta ou indiretamente a um polipeptídeo de IL-2 através de um aminoácido de ocorrência natural ou aminoácido codificado não naturalmente. Por exemplo, Y pode ser uma ligação amida, carbamato ou ureia a um grupo amina (incluindo, mas não se limitando a, a epsilon amina de lisina ou o N-terminal) do polipeptídeo. Alternativamente, Y pode ser uma ligação maleimida a um grupo tiol (incluindo, mas não se limitando a, o grupo tiol da cisteína). Alternativamente, Y pode ser uma ligação a um resíduo não comumente acessível através dos 20 aminoácidos comuns. Por exemplo, um grupo azida no PEG pode reagir com um grupo alcino no polipeptídeo de IL-2 para formar um produto de cicloadição Huisgen [3 + 2]. Alternativamente, um grupo alcino no PEG pode ser reagido com um grupo azida presente em um aminoácido codificado não naturalmente para formar um produto semelhante. Em algumas modalidades, um nucleófilo forte (incluindo, mas não limitado a hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) pode ser reagido com um grupo aldeído ou cetona presente em um aminoácido codificado não naturalmente para formar uma hidrazona, oxima ou semicarbazona, como aplicável, que em alguns casos pode ser ainda mais reduzido por tratamento com um agente redutor apropriado. Alternativamente, o nucleófilo forte pode ser incorporado no polipeptídeo de IL-2 por meio de um aminoácido codificado não naturalmente e usado para reagir preferencialmente com uma grupo cetona ou aldeído presente no polímero solúvel em água.
[0346]Qualquer massa molecular para um PEG pode ser usada como praticamente desejado, incluindo, mas não se limitando a, de cerca de 100 Daltons (Da) a 100.000 Da ou mais como desejado (incluindo, mas não se limitando a, às vezes 0,1 a 50 kDa ou 10 a 40 kDa). O peso molecular de PEG pode ser de uma ampla faixa, incluindo, mas não se limitando a, entre cerca de 100 Da e cerca de
100.000 Da ou mais. PEG pode ser entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, mas não se limitando a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da,
80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da,
45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da,
10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da,
2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, PEG é entre cerca de 100 Da e cerca de
50.000 Da. Em algumas modalidades, PEG é entre cerca de 100 Da e cerca de
40.000 Da. Em algumas modalidades, PEG é entre cerca de 1.000 Da e cerca de
40.000 Da. Em algumas modalidades, PEG é entre cerca de 5.000 Da e cerca de
40.000 Da. Em algumas modalidades, PEG é entre cerca de 10.000 Da e cerca de
40.000 Da. PEGs de cadeia ramificada, incluindo, mas não se limitando a, moléculas de PEG com cada cadeia tendo um MW variando de 1 a 100 kDa (incluindo, mas não se limitando a, 1 a 50 kDa ou 5 a 20 kDa), também podem ser usados. O peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada pode ser, incluindo, mas não se limitando a, entre cerca de 1.000 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada pode ser entre cerca de 1.000 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, mas não se limitando a, 100.000 Da, 95.000 Da,
90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da,
55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da,
20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da,
4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, e 1.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada é entre cerca de 1.000 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia of the PEG de cadeia ramificada é entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada é entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do PEG de cadeia ramificada é entre cerca de 5.000 Da e cerca de 20.000 Da. Uma ampla faixa de moléculas de PEG é descrita em, incluindo, mas não se limitando a, o catálogo da Shearwater Polymers, Inc., catálogo da Nektar Therapeutics, aqui incorporado por referência.
[0347]Geralmente, pelo menos um terminal da molécula de PEG está disponível para reação com o aminoácido codificado não naturalmente. Por exemplo, derivados de PEG portando porções de alcino e azida para reação com cadeias laterais de aminoácidos podem ser usados para ligar PEG a aminoácidos codificados não naturalmente como descrito aqui. Se o aminoácido codificado não naturalmente compreende uma azida, então o PEG irá tipicamente conter uma porção de alcino para efetuar a formação do produto de cicloadição [3 + 2] ou uma espécie de PEG ativada (isto é, éster, carbonato) contendo um grupo fosfina para efetuar a formação da ligação amida. Alternativamente, se o aminoácido codificado não naturalmente compreende um alcino, então o PEG conterá tipicamente uma porção de azida para efetuar a formação do produto de cicloadição de Huisgen [3 + 2]. Se o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo carbonila, o PEG compreenderá tipicamente um nucleófilo potente (incluindo, mas não se limitando a, uma funcionalidade hidrazida, hidrazina, hidroxilamina ou semicarbazida) a fim de efetuar a formação da hidrazona, oxima, correspondente e ligações de semicarbazona, respectivamente. Em outras alternativas, um reverso da orientação dos grupos reativos descritos acima pode ser usado, isto é, uma porção de azida no aminoácido codificado não naturalmente pode ser reagida com um derivado de PEG contendo um alcino.
[0348]Em algumas modalidades, o polipeptídeo de variante de IL-2 com um derivado de PEG contém uma funcionalidade química que é reativa com a funcionalidade química presente na cadeia lateral do aminoácido codificado não naturalmente.
[0349]A invenção fornece em algumas modalidades derivados de polímero contendo azida e acetileno compreendendo uma estrutura de polímero solúvel em água com um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da. A estrutura de polímero do polímero solúvel em água pode ser poli(etilenoglicol). No entanto, deve ser entendido que uma grande variedade de polímeros solúveis em água incluindo, mas não se limitando a poli(etileno)glicol e outros polímeros relacionados, incluindo, poli(dextran) e poli(propileno glicol), são também adequados para uso na prática desta invenção e que o uso do termo PEG ou poli (etilenoglicol) se destina a abranger e incluir todas essas moléculas. O termo PEG inclui, mas não está limitado a, poli (etilenoglicol) em qualquer uma de suas formas, incluindo PEG bifuncional, PEG multiarmado, PEG derivatizado, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendente (isto é, PEG ou polímeros relacionados com um ou mais grupos funcionais pendentes à estrutura do polímero), ou PEG com ligações degradáveis no mesmo.
[0350]O PEG é normalmente transparente, incolor, inodoro, solúvel em água, estável ao calor, inerte a muitos agentes químicos, não hidrolisa ou se deteriora e geralmente não é tóxico. O poli (etilenoglicol) é considerado biocompatível, o que significa que o PEG é capaz de coexistir com tecidos vivos ou organismos sem causar danos. Mais especificamente, o PEG é substancialmente não imunogênico, o que significa que o PEG não tende a produzir uma resposta imune no corpo. Quando ligado a uma molécula com alguma função desejável no corpo, como um agente biologicamente ativo, o PEG tende a mascarar o agente e pode reduzir ou eliminar qualquer resposta imune de modo que um organismo possa tolerar a presença do agente. Os conjugados de PEG tendem a não produzir uma resposta imune substancial ou causar coagulação ou outros efeitos indesejáveis. PEG tendo a fórmula -- CH2CH2O--(CH2CH2O)n -- CH2CH2--, onde n é de cerca de 3 a cerca de 4000, normalmente de cerca de 20 a cerca de 2000, é adequado para o uso na presente invenção. O PEG tendo um peso molecular de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da são em algumas modalidades da presente invenção particularmente úteis como a estrutura de polímero. O peso molecular de PEG pode ser de uma ampla faixa, incluindo, mas não se limitando a, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular de PEG pode ser entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, mas não se limitando a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da,
80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da,
45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da,
10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da,
2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG é entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG é entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG é entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG é entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de PEG é entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da.
[0351]A estrutura do polímero pode ser linear ou ramificada. As estruturas de polímero ramificados são geralmente conhecidos na técnica. Normalmente, um polímero ramificado tem uma porção do núcleo da ramificação central e uma pluralidade de cadeias de polímero lineares ligadas ao núcleo da ramificação central.
O PEG é comumente usado em formas ramificadas que podem ser preparadas por adição de óxido de etileno a vários polióis, tais como glicerol, oligômeros de glicerol, pentaeritritol e sorbitol. A porção da ramificação central também pode ser derivada de vários aminoácidos, como a lisina. O poli(etilenoglicol) ramificado pode ser representado na forma geral como R(-PEG-OH) m em que R é derivado de uma porção central, tal como glicerol, oligômeros de glicerol ou pentaeritritol e m representa o número de braços. As moléculas de PEG com múltiplos braços, tais como aquelas descritas em Pat. U.S. Nos 5.932.462; 5.643.575; 5.229.490; 4.289.872; Pedido de Pat. U.S. 2003/0143596; WO 96/21469; e WO 93/21259, cada um dos quais é incorporado por referência aqui na sua totalidade, também pode ser usado como a estrutura de polímero.
[0352]O PEG ramificado também pode estar na forma de um PEG bifurcado representado por PEG(--YCHZ2)n, onde Y é um grupo de ligação e Z é um grupo terminal ativado ligado a CH por uma cadeia de átomos de comprimento definido.
[0353]Ainda outra forma ramificada, o PEG pendente, tem grupos reativos, como carboxila, ao longo da estrutura de PEG, em vez de no final das cadeias de PEG.
[0354]Além dessas formas de PEG, o polímero também pode ser preparado com ligações fracas ou degradáveis na estrutura. Por exemplo, o PEG pode ser preparado com ligações éster na estrutura do polímero que estão sujeitas a hidrólise.
Conforme mostrado abaixo, esta hidrólise resulta na clivagem do polímero em fragmentos de baixo peso molecular: -PEG-CO2-PEG-+H2O  PEG-CO2H+HO-PEG-
[0355]É entendido por Aquelas pessoas de habilidade comum na técnica que o termo poli(etilenoglicol) ou PEG representa ou inclui todas as formas conhecidas na técnica incluindo, mas não se limitando àquelas divulgadas neste documento.
[0356]Muitos outros polímeros também são adequados para uso na presente invenção. Em algumas modalidades, as estruturas de polímeros que são solúveis em água, com de 2 a cerca de 300 terminais, são particularmente úteis na invenção.
Exemplos de polímeros adequados incluem, mas não estão limitados a outros poli(alquilenoglicóis), tais como poli(propilenoglicol) (“PPG”), copolímeros dos mesmos (incluindo, mas não se limitando a copolímeros de etilenoglicol e propilenoglicol), terpolímeros destes, misturas dos mesmos e semelhantes. Embora o peso molecular de cada cadeia da estrutura do polímero possa variar, está normalmente na faixa de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, frequentemente de cerca de 6.000 Da a cerca de 80.000 Da. O peso molecular de cada cadeia do estrutura de polímero pode ser entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, mas não se limitando a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da,
80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da,
45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da,
10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da,
2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, e 100 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do estrutura de polímero é entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do estrutura de polímero é entre cerca de 100 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do estrutura de polímero é entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do estrutura de polímero é entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular de cada cadeia do estrutura de polímero é entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da.
[0357]Aquelas pessoas de habilidade comum na técnica reconhecerão que a lista anterior para estruturas substancialmente solúveis em água não é de forma alguma exaustiva e é meramente ilustrativa, e que todos os materiais poliméricos com as qualidades descritas acima são contemplados como sendo adequados para uso em a presente invenção.
[0358]Em algumas modalidades da presente invenção os derivados de polímero são “multifuncionais”, o que significa que a estrutura do polímero tem pelo menos dois terminais, e possivelmente cerca de 300 terminais, funcionalizados ou ativados com um grupo funcional. Derivados de polímeros multifuncionais incluem, mas não estão limitados a polímeros lineares tendo dois terminais, cada terminal sendo ligado a um grupo funcional que pode ser o mesmo ou diferente.
[0359]Em uma modalidade, o derivado de polímero tem a estrutura: X—A—POLI— B—N=N=N em que: N=N=N é uma porção de azida; B é uma porção de ligação, que pode estar presente ou ausente; POLI é um polímero não antigênico solúvel em água; A é uma porção de ligação, que pode estar presente ou ausente e que pode ser a mesma como B ou diferente; e X é um segundo grupo funcional.
[0360]Exemplos de uma porção de ligação para A e B incluem, mas não estão se limitando a, um grupo alquila multifuncionalizado contendo até 18 e pode conter entre 1 a 10 átomos de carbono. Um heteroátomo, como nitrogênio, oxigênio ou enxofre, pode ser incluído na cadeia alquila. A cadeia alquila também pode ser ramificada em um heteroátomo. Outros exemplos de uma porção de ligação para A e B incluem, mas não estão limitados a um grupo arila multifuncionalizado, contendo até 10 e pode conter 5 a 6 átomos de carbono. O grupo arila pode ser substituído por um ou mais átomos de carbono, átomos de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem aqueles grupos de ligação descritos em Pat. U.S. Nos 5.932.462; 5.643.575; e Publicação de Pedido de Pat. U.S.
2003/0143596, cada uma das quais é aqui incorporada por referência. Aquelas pessoas de habilidade comum na técnica reconhecerão que a lista anterior para porções de ligação não é de forma alguma exaustiva e é meramente ilustrativa, e que todas as porções de ligação com as qualidades descritas acima são contempladas como adequadas para uso na presente invenção.
[0361]Exemplos de grupos funcionais adequados para uso como X incluem, mas não estão limitados a, hidroxila, hidroxila protegida, alcoxila, éster ativo, como ésteres de N-hidroxisuccinimidila e ésteres de 1-benzotriazolila, carbonato ativo, tal como carbonatos de N-hidroxisuccinimidila e carbonatos de 1-benzotriazolil, acetal, aldeído, hidratos de aldeído, alquenila, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alceno, cetona e azida. Como é entendido por aquelas pessoas de habilidade comum na técnica, a porção X selecionada deve ser compatível com o grupo azida de modo que a reação com o grupo azida não ocorra. Os derivados de polímero contendo azida podem ser homobifuncionais, o que significa que o segundo grupo funcional (isto é, X) também é uma porção de azida, ou heterobifuncional, o que significa que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente.
[0362]O termo “protegido” refere-se à presença de um grupo ou porção de proteção que evita a reação do grupo funcional quimicamente reativo sob certas condições de reação. O grupo de proteção irá variar dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo sendo protegido. Por exemplo, se o grupo quimicamente reativo é uma amina ou uma hidrazida, o grupo de proteção pode ser selecionado do grupo de terc-butiloxicarbonil (t-Boc) e 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc). Se o grupo quimicamente reativo for um tiol, o grupo protetor pode ser ortopiridildissulfeto. Se o grupo quimicamente reativo for um ácido carboxílico, como ácido butanóico ou propiônico, ou um grupo hidroxila, o grupo protetor pode ser benzila ou um grupo alquila, como metila, etila ou terc-butila. Outros grupos de proteção conhecidos na técnica também podem ser usados na presente invenção.
[0363]Exemplos específicos de grupos funcionais terminais na literatura incluem, mas não estão limitados a carbonato de N-succinimidila (consultar por exemplo, Pat. U.S. Nos 5.281.698, 5.468.478), amina (consultar, por exemplo, Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polim. J.
19:1177 (1983)), hidrazida (Consultar, por exemplo, Andresz et al. Makromol. Chem.
179:301 (1978)), succinimidil propionato e butanoato de succinimidila (consultar, por exemplo, Olson et al. em Poli(etilenoglicol) Chemistry & Biological Applications, páginas 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997; consultar também Pat. U.S. Nº 5.672.662), succinimidil succinato (Consultar, por exemplo, Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7: 175 (1984) e Joppich et al. Makromol.
Chem. 180: 1381 (1979), éster succinimidil (consultar, por exemplo, Patente US . Nº
4.670.417), carbonato de benzotriazol (consultar, por exemplo, Patente US Nº
5.650.234), éter glicidílico (consultar, por exemplo, Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13: 354 (1991), oxicarbonilimidazol
(consultar, por exemplo, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131: 25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1: 251 (1985)), carbonato de p-nitrofenil (consultar, por exemplo, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); e Sartore et al., Appl. Biochem . Biotech., 27:45 (1991)), aldeído (consultar, por exemplo, Harris et al.
J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22: 341 (1984), Patente US Nº 5.824.784, Patente US Nº
5.252.714), maleimida (consultar, por exemplo, Goodson et al. Biotechnology (NY) 8: 343 (1990), Romani et al. Em Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), e Kogan, Synthetic Comm. 22: 2417 (1992)), dissulfeto de ortopiridila (consultar, por exemplo, Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4: 314 (1993)), acrilol (consultar, por exemplo, Sawhney et al., Macromolecules, 26: 581 (1993)), vinilsulfona (consultar, por exemplo, Patente US Nº 5.900.461). Todas as referências e patentes acima são incorporadas aqui por referência.
[0364]Em certas modalidades da presente invenção, os derivados de polímeros da invenção compreendem uma estrutura de polímero tendo a estrutura: X—CH2CH2O--(CH2CH2O)n --CH2CH2 -N=N=N em que: X é um grupo funcional como descrito acima; e n é cerca de 20 a cerca de 4000.
Em uma outra modalidade, os derivados de polímeros da invenção compreendem uma estrutura de polímero tendo a estrutura: X—CH2CH2O--(CH2CH2O)n --CH2CH2 - O-(CH2)m-W-N=N=N em que: W é uma porção ligante alifática ou aromática compreendendo entre 1 a 10 átomos de carbono; n é cerca de 20 a cerca de 4000; e X é um grupo funcional como descrito acima. m é entre 1 e 10.
[0365]Os derivados de PEG contendo azida da invenção podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica e/ou divulgados aqui. Em um método, mostrado abaixo, uma estrutura de polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, a estrutura de polímero tendo um primeiro terminal ligado a um primeiro grupo funcional e um segundo terminal ligado a um grupo de partida adequado , reage com um ânion azida (que pode ser emparelhado com qualquer um de uma série de contra-íons adequados, incluindo sódio, potássio, terc-butilamônio e assim por diante). O grupo de partida sofre um deslocamento nucleofílico e é substituído pela porção azida, proporcionando o polímero PEG contendo azida desejado.
X-PEG-L + N3-  X-PEG- N3
[0366]Como mostrado, uma estrutura de polímero adequada para uso na presente invenção tem a fórmula X-PEG-L, em que PEG é poli(etilenoglicol) e X é um grupo funcional que não reage com grupos azida e L é um grupo de partida adequado.
Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não estão limitados a hidroxila, hidroxila protegida, acetal, alquenila, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, maleimida, ditiopiridina e vinilpiridina, e cetona. Exemplos de grupos de partida adequados incluem, mas não estão limitados a cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato e tosilato.
[0367]Em um outro método para a preparação dos derivados de polímero contendo azida da presente invenção, um agente de ligação com uma funcionalidade de azida é colocado em contato com uma estrutura de polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, em que o agente de ligação possui uma funcionalidade química que irá reagir seletivamente com uma funcionalidade química no polímero de PEG, para formar um produto derivado de polímero contendo azida, em que a azida é separada da estrutura do polímero por um grupo de ligação.
[0368]Um esquema de reação exemplificativo é mostrado abaixo: X-PEG-M + N-ligante-N=N=N  PG-X-PEG-ligante-N=N=N em que: PEG é poli(etilenoglicol) e X é um grupo de cobertura tal como alcóxi ou um grupo funcional como descrito acima; e M é um grupo funcional que é não reativo com a funcionalidade azida, mas que reagirá de forma eficiente e seletiva com o grupo funcional N.
[0369]Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não estão limitados a M sendo um ácido carboxílico, carbonato ou éster ativo se N for uma amina; Sendo M uma cetona se N for uma hidrazida ou porção de aminooxi; M sendo um grupo de partida se N for um nucleófilo.
[0370]A purificação do produto bruto pode ser realizada por métodos conhecidos, incluindo, mas não estão limitados a precipitação do produto seguida por cromatografia, se necessário.
[0371]Um exemplo mais específico é mostrado abaixo no caso do PEG diamina, em que uma das aminas é protegida por uma porção do grupo de proteção, tal como terc-butil-Boc e a PEG diamina mono-protegida resultante é reagida com uma porção de ligação que carrega a funcionalidade azida: BocHN-PEG-NH2 + HO2C-(CH2)3-N=N=N
[0372]Neste caso, o grupo amina pode ser acoplado ao grupo de ácido carboxílico usando uma variedade de agentes de ativação, tais como cloreto de tionila ou reagentes de carbodiimida e N-hidroxissuccinimida ou N-hidroxibenzotriazol para criar uma ligação amida entre o derivado de monoamina PEG e a porção ligante carregando azida. Após a formação bem-sucedida da ligação amida, o derivado contendo azida N-terc-butil-Boc-protegido resultante pode ser usado diretamente para modificar moléculas bioativas ou pode ser mais elaborado para instalar outros grupos funcionais úteis. Por exemplo, o grupo N-t-Boc pode ser hidrolisado por tratamento com ácido forte para gerar um ômega-amino-PEG-azida. A amina resultante pode ser usada como um cabo sintético para instalar outra funcionalidade útil, como grupos maleimida, dissulfetos ativados, ésteres ativados e assim por diante, para a criação de reagentes heterobifuncionais valiosos.
[0373]Derivados heterobifuncionais são particularmente úteis quando se deseja anexar moléculas diferentes a cada terminal do polímero. Por exemplo, o PEG ômega-N-amino-N-azida permitiria a ligação de uma molécula com um grupo eletrofílico ativado, como um aldeído, cetona, éster ativado, carbonato ativado e assim por diante, a um terminal do PEG e uma molécula tendo um grupo acetileno para o outro terminal do PEG.
[0374]Em uma outra modalidade da invenção, o derivado de polímero tem a estrutura: X—A—POLI— B—CC-R em que: R pode ser H ou um grupo alquila, alceno, alcóxi ou arila ou arila substituído; B é uma porção de ligação, que pode estar presente ou ausente; POLI é um polímero não antigênico solúvel em água; A é uma porção de ligação, que pode estar presente ou ausente e que pode ser a mesma como B ou diferente; e X é um segundo grupo funcional.
[0375]Exemplos de uma porção de ligação para A e B incluem, mas não estão se limitando a, um grupo alquila multifuncionalizado contendo até 18 e pode conter entre 1 a 10 átomos de carbono. Um heteroátomo, como nitrogênio, oxigênio ou enxofre, pode ser incluído na cadeia alquila. A cadeia alquila também pode ser ramificada em um heteroátomo. Outros exemplos de uma porção de ligação para A e
B incluem, mas não estão limitados a um grupo arila multifuncionalizado, contendo até 10 e pode conter 5 a 6 átomos de carbono. O grupo arila pode ser substituído por um ou mais átomos de carbono, átomos de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem aqueles grupos de ligação descritos em Pat. U.S. Nos 5.932.462 e 5.643.575 e Publicação de Pedido de Pat. U.S.
2003/0143596, cada um dos quais é incorporado por referência aqui. Aquelas pessoas de habilidade comum na técnica reconhecerão que a lista anterior para partes de ligação não é de forma alguma exaustiva e se destina a ser meramente ilustrativa, e que uma grande variedade de partes de ligação com as qualidades descritas acima é contemplada como úteis no presente invenção.
[0376]Exemplos de grupos funcionais adequados para uso como X incluem hidroxila, hidroxila protegida, alcoxila, éster ativo, como ésteres de N- hidroxisuccinimidila e ésteres 1-benzotriazolila, carbonato ativo, como carbonatos de N-hidroxisuccinimidila e carbonatos de 1-benzotriazolila, acetal, aldeído, hidratos de aldeído, alquenila, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos e tresilato, alceno, cetona e acetileno. Como seria entendido, a porção X selecionada deve ser compatível com o grupo acetileno de modo que a reação com o grupo acetileno não ocorra. Os derivados de polímero contendo acetileno podem ser homobifuncionais, o que significa que o segundo grupo funcional (isto é, X) também é uma porção de acetileno, ou heterobifuncional, o que significa que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente.
[0377]Em uma outra modalidade da presente invenção, os derivados de polímeros compreendem uma estrutura de polímero tendo a estrutura: X—CH2CH2O--(CH2CH2O)n --CH2CH2 - O-(CH2)m-CCH em que: X é um grupo funcional como descrito acima; n é cerca de 20 a cerca de 4.000; e m é entre 1 e 10.
Exemplos específicos de cada um dos polímeros PEG heterobifuncionais são mostrados abaixo.
[0378]Os derivados de PEG contendo acetileno da invenção podem ser preparados usando métodos conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica e/ou divulgados aqui. Em um método, uma estrutura de polímero solúvel em água tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, a estrutura de polímero tendo um primeiro terminal ligado a um primeiro grupo funcional e um segundo terminal ligado a um grupo nucleofílico adequado, é reagido com um composto que possui uma funcionalidade de acetileno e um grupo de partida que é adequado para a reação com o grupo nucleofílico no PEG. Quando o polímero PEG com a porção nucleofílica e a molécula com o grupo de partida são combinados, o grupo de partida sofre um deslocamento nucleofílico e é substituído pela porção nucleofílica, proporcionando o polímero contendo acetileno desejado. X-PEG-Nu + L-A-C  X-PEG-Nu-A-CCR’
[0379]Como mostrado, uma estrutura de polímero preferida para uso na reação tem a fórmula X-PEG-Nu, em que PEG é poli(etilenoglicol), Nu é uma porção nucleofílica e X é um grupo funcional que não reage com Nu, L ou a funcionalidade acetileno.
[0380]Exemplos de Nu incluem, mas não estão se limitando a, grupos amina, alcoxi, ariloxi, sulfidrila, imino, carboxilato, hidrazida, aminoxi que reagiriam principalmente por meio de um mecanismo do tipo SN2. Exemplos adicionais de grupos Nu incluem aqueles grupos funcionais que reagiriam principalmente por meio de uma reação de adição nucleofílica. Exemplos de grupos L incluem cloreto, brometo,
iodeto, mesilato, tresilato e tosilato e outros grupos que devem sofrer deslocamento nucleofílico, bem como cetonas, aldeídos, tioésteres, olefinas, grupos carbonil alfa- beta insaturados, carbonatos e outros grupos eletrofílicos esperados sofrem adição por nucleófilos.
[0381]Em uma outra modalidade da presente invenção, A é um ligante alifático entre 1 a 10 átomos de carbono ou um anel de arila substituída entre 6 a 14 átomos de carbono. X é um grupo funcional que não reage com grupos azida e L é um grupo de partida adequado
[0382]Em um outro método para preparação dos derivados de polímero contendo acetileno da invenção, um polímero de PEG com um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, tendo um grupo funcional protegido ou um agente de cobertura em um terminal e um grupo de partida adequado no outro terminal é contatado por um ânion acetileno.
[0383]Um esquema de reação exemplificativo é mostrado abaixo: X-PEG-L + -CCR’  X-PEG-CCR’ em que: PEG é poli(etilenoglicol) e X é um grupo de cobertura tal como alcóxi ou um grupo funcional como descrito acima; e R’ é H, um grupo alquila, alcóxi, arila ou ariloxi ou um grupo alquila substituída, alcoxila, arila ou ariloxi.
[0384]No exemplo acima, o grupo de partida L deve ser suficientemente reativo para sofrer deslocamento do tipo SN2 quando em contato com uma concentração suficiente do ânion acetileno. As condições de reação necessárias para realizar o deslocamento SN2 de grupos de partida por ânions de acetileno são conhecidas pela pessoa de habilidade comum na técnica.
[0385]A purificação do produto bruto pode geralmente ser realizada por métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não estão limitados a precipitação do produto seguida por cromatografia, se necessário.
[0386]Os polímeros solúveis em água podem ser ligados aos polipeptídeos de IL-2 da invenção. Os polímeros solúveis em água podem ser ligados através de um aminoácido codificado não naturalmente incorporado no polipeptídeo de IL-2 ou qualquer grupo funcional ou substituinte de um aminoácido codificado não naturalmente ou codificado naturalmente, ou qualquer grupo funcional ou substituinte adicionado a um aminoácido codificado não naturalmente ou codificado naturalmente.
Alternativamente, os polímeros solúveis em água são ligados a um polipeptídeo de IL- 2 incorporando um aminoácido codificado não naturalmente por meio de um aminoácido de ocorrência natural (incluindo, mas não se limitando a, cisteína, lisina ou o grupo amina do resíduo N-terminal) Em alguns casos, os polipeptídeos de IL-2 da invenção compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos não naturais, em que um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente estão ligados a polímero(s) solúvel(s) em água (incluindo, mas não se limitando a, PEG e/ou oligossacarídeos). Em alguns casos, os polipeptídeos de IL-2 da invenção compreendem ainda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos codificados naturalmente ligados a polímeros solúveis em água. Em alguns casos, os polipeptídeos de IL-2 da invenção compreendem um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente ligados a polímeros solúveis em água e um ou mais aminoácidos de ocorrência natural ligados a polímeros solúveis em água. Em algumas modalidades, os polímeros solúveis em água usados na presente invenção aumentam a meia-vida sérica do polipeptídeo de IL-2 em relação à forma não conjugada.
[0387]O número de polímeros solúveis em água ligado a um polipeptídeo de IL-2 (isto é, a extensão de PEGuilação ou glicosilação) da presente invenção pode ser ajustado para fornecer uma alteração farmacológica (incluindo, mas não se limitando a, aumentada ou diminuída), característica farmacocinética ou farmacodinâmica, como meia-vida in vivo. Em algumas modalidades, a meia-vida de IL-2 é aumentada em pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por cento, 2 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 35 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou pelo menos cerca de 100 vezes em relação a um polipeptídeo não modificado.
Derivados de PEG contendo um grupo nucleofílico forte (isto é, hidrazida, hidrazina, hidroxilamina ou semicarbazida)
[0388]Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente contendo carbonila é modificado com um derivado de PEG que contém uma porção terminal de hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou semicarbazida que está ligada diretamente a estrutura de PEG.
[0389]Em algumas modalidades, o derivado de PEG do terminal de hidroxilamina terá a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1.000 (isto é, peso molecular médio é entre 5 a 40 kDa).
[0390]Em algumas modalidades, o derivado de PEG contendo hidrazina ou hidrazida terá a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1.000 e X é opcionalmente um grupo carbonila (C = O) que pode estar presente ou ausente.
[0391]Em algumas modalidades, o derivado de PEG contendo semicarbazida terá a estrutura:
RO-(CH2CH2O)n -O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1.000.
[0392]Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido contendo carbonila é modificado com um derivado de PEG que contém uma porção terminal de hidroxilamina, hidrazida, hidrazina ou semicarbazida que está ligada à estrutura de PEG por meio de uma ligação amida.
[0393]Em algumas modalidades, the hidroxilamina-terminal derivados de PEG têm a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1.000 (isto é, peso molecular médio é entre 5 a 40 kDa).
[0394]Em algumas modalidades, os derivados de PEG do terminal de hidroxilamina têm a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10, n é 100 a 1.000 e X é opcionalmente um grupo carbonila (C = O) que pode estar presente ou ausente.
[0395]Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo semicarbazida têm a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1.000.
[0396]Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido contendo carbonila é modificada com um derivado de PEG ramificado que contém uma porção terminal de hidrazina, hidroxilamina,
hidrazida ou semicarbazida, com cada cadeia do PEG ramificado tendo um MW variando de 10 a 40 kDa e, pode ser de 5 a 20 kDa.
[0397]Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente é modificado com um derivado de PEG tendo uma estrutura ramificada. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado de PEG do terminal de hidrazina ou hidrazida terá a seguinte estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1.000, e X é opcionalmente um grupo carbonila (C = O) que pode estar presente ou ausente.
[0398]Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo um grupo semicarbazida terão a estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH- NH2 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), X é opcionalmente NH, O, S, C(O) ou não está presente, m é 2 a 10 e n é 100 a 1.000.
[0399]Em algumas modalidades, os derivados de PEG contendo um grupo hidroxilamina terão a estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), X é opcionalmente NH, O, S, C(O) ou não está presente, m é 2 a 10 e n é 100 a 1.000.
[0400]O grau e os sítios em que os polímeros solúveis em água estão ligados ao polipeptídeo de IL-2 podem modular a ligação do polipeptídeo de IL-2 ao receptor de IL-2. Em algumas modalidades, as ligações são arranjadas de modo que o polipeptídeo de IL-2 se ligue ao receptor de IL-2 com um Kd de cerca de 400 nM ou inferior, com um Kd de 150 nM ou inferior e, em alguns casos, com um Kd de 100 nM ou inferior, conforme medido por um ensaio de ligação de equilíbrio, tal como o descrito em Spencer et al., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988).
[0401]Métodos e química para ativação de polímeros, bem como para conjugação de peptídeos, são descritos na literatura e são conhecidos na técnica. Os métodos comumente usados para ativação de polímeros incluem, mas não estão limitados à ativação de grupos funcionais com brometo de cianogênio, periodato, glutaraldeído, biepóxidos, epicloridrina, divinilsulfona, carbodiimida, haletos de sulfonila, triclorotriazina, etc. (consultar, R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, MARCEL DEKKER, NY; SS WONG, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC PRESS, BOCA RATON; GT HERMANSON ET AL., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUESED, ACADEMIC PRESS, NY; DUNN, RL, ET AL., EDS. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS SYMPOSIUM SERIES VOL. 469, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, WASHINGTON, DC 1991).
[0402]Várias revisões e monografias sobre a funcionalização e conjugação de PEG estão disponíveis. Consultar, por exemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem.
6: 150-165 (1995).
[0403]Métodos para ativação de polímeros também podem ser encontrados em WO 94/17039, Patente US Nº 5.324.844, WO 94/18247, WO 94/04193, Pat. U.S.
Nº 5.219.564, Patente U.S. Nº 5.122.614, WO 90/13540, Patente U.S. Nº 5.281.698, e WO 93/15189, e para a conjugação entre polímeros ativados e enzimas incluindo, mas não se limitando a Fator VIII de Coagulação (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molécula transportadora de oxigênio (Pat. US Nº 4.412.989), ribonuclease e superóxido dismutase (Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11:141-52 (1985)).
Todas as referências e patentes citadas são aqui incorporadas por referência.
[0404]A PEGuilação (isto é, adição de qualquer polímero solúvel em água) de polipeptídeos de IL-2 contendo um aminoácido codificado não naturalmente, tal como p-azido-L-fenilalanina, é realizada por qualquer método conveniente. Por exemplo, o polipeptídeo de IL-2 é PEGuilado com um derivado de mPEG terminado em alcino. Resumidamente, um excesso de mPEG(5000)-O-CH2-CCH é adicionado, com agitação, a uma solução aquosa de polipeptídeo de IL-2 contendo p-azido-L-Phe à temperatura ambiente. Tipicamente, a solução aquosa é tamponada com um tampão tendo um pKa próximo ao pH no qual a reação deve ser realizada (geralmente cerca de pH 4 a 10). Exemplos de tampões adequados para PEGuilação em pH 7,5, por exemplo, incluem, mas não estão limitados a HEPES, fosfato, borato, TRIS-HCl, EPPS e TES. O pH é monitorado continuamente e ajustado, se necessário. A reação é tipicamente deixada continuar por cerca de 1 a 48 horas.
[0405]Os produtos da reação são subsequentemente submetidos a cromatografia de interação hidrofóbica para separar as variantes do polipeptídeo de IL-2 PEGuilada de mPEG(5000)-O-CH2-CCH livre e quaisquer complexos de alto peso molecular do polipeptídeo de IL-2 PEGuilada que pode se formar quando o PEG desbloqueado é ativado em ambas as extremidades da molécula, desse modo reticulando moléculas variantes do polipeptídeo de IL-2. As condições durante a cromatografia de interação hidrofóbica são tais que mPEG(5000)-O-CH2-CCH livre flui através da coluna, enquanto quaisquer complexos de variante do polipeptídeo de IL-2 reticulado eluem após as formas desejadas, que contêm um polipeptídeo de IL-2 molécula variante conjugada a um ou mais grupos PEG. As condições adequadas variam dependendo dos tamanhos relativos dos complexos reticulados versus os conjugados desejados e são prontamente determinados por aquelas pessoas de habilidade comum na técnica. O eluente contendo os conjugados desejados é concentrado por ultrafiltração e dessalinizado por diafiltração.
[0406]PEG-IL-2 substancialmente purificado pode ser produzido usando os métodos de eluição descritos acima, onde o PEG-IL-2 produzido tem um nível de pureza de pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70 %, especificamente, um nível de pureza de pelo menos cerca de 75 %, 80 %, 85 %, e mais especificamente, um nível de pureza de pelo menos cerca de 90 %, um nível de pureza de pelo menos cerca de 95 %, um nível de pureza de pelo menos cerca de 99 % ou maior como determinado pelos métodos adequados tal como análise de SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, e eletroforese capilar. Se necessário, o polipeptídeo de IL-2 PEGuilada obtido da cromatografia hidrofóbica pode ser purificado adicionalmente por um ou mais procedimentos conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica incluindo, mas não estão se limitando a, cromatografia de troca aniônica ou catiônica (usando, incluindo, mas não se limitando a, DEAE SEPHAROSE); cromatografia em sílica; HPLC de fase reversa; filtração em gel (usando, incluindo, mas não se limitando a, SEPHADEX G-75); cromatografia de interação hidrofóbica; cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de quelato de metal; ultrafiltração/diafiltração; precipitação com etanol; precipitação de sulfato de amônio; cromatofocagem; cromatografia de deslocamento; procedimentos eletroforéticos (incluindo, mas não se limitando a focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (incluindo, mas não se limitando a precipitação de sulfato de amônio) ou extração. O peso molecular aparente pode ser estimado por GPC por comparação com padrões de proteína globular (Preneta, AZ em PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306). A pureza do conjugado de IL-2-PEG pode ser avaliada por degradação proteolítica (incluindo, mas não se limitando a, clivagem por tripsina) seguida por análise de espectrometria de massa. Pepinsky RB., Et al., J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297 (3): 1059-66 (2001).
[0407]Um polímero solúvel em água ligado a um aminoácido de um polipeptídeo de IL-2 da invenção pode ser ainda derivatizado ou substituído sem limitação.
Derivados de PEG contendo Azida
[0408]Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IL-2 é modificado com um derivado de PEG que contém uma porção de azida que reagirá com uma porção de alcino presente na cadeia lateral do aminoácido codificado não naturalmente. Em geral, os derivados de PEG terão um peso molecular médio variando de 1 a 100 kDa e, em algumas modalidades, de 10 a 40 kDa.
[0409]Em algumas modalidades, o derivado de PEG de terminal azida terá a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1.000 (isto é, peso molecular médio é entre 5 a 40 kDa).
[0410]Em uma outra modalidade, o derivado de PEG de terminal azida terá a estrutura: RO-(CH2CH2O)n -O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10, p é 2 a 10 e n é 100 a 1.000 (isto é, peso molecular médio é entre 5 a 40 kDa).
[0411]Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido contendo alcino é modificada com um derivado de PEG ramificado que contém uma porção de azida terminal, com cada cadeia do PEG ramificado tendo um MW variando de 10 a 40 kDa e pode ser de 5 a 20 kDa. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado de PEG de terminal alcino terá a seguinte estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3 onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10, p é 2 a 10, e n é 100 a 1.000, e X é opcionalmente um O, N, S ou grupo carbonila (C = O), em cada caso que pode estar presente ou ausente.
Derivados de PEG Contendo Alcino
[0412]Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IL-2 é modificado com um derivado de PEG que contém uma porção de alcino que reagirá com uma porção de azida presente na cadeia lateral do aminoácido codificado não naturalmente.
[0413]Em algumas modalidades, o derivado de PEG de terminal alcino terá a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-CCH onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1.000 (isto é, peso molecular médio é entre 5 a 40 kDa).
[0414]Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente contendo um alcino é modificado com um derivado de PEG que contém uma azida terminal ou porção de alcino terminal que está ligada à estrutura de PEG por meio de uma ligação amida.
[0415]Em algumas modalidades, o derivado de PEG de terminal alcino terá a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n -O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-CCH onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10, p é 2 a 10 e n é 100 a 1.000.
[0416]Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido contendo azida é modificada com um derivado de
PEG ramificado que contém uma porção de alcino terminal, com cada cadeia do PEG ramificado tendo um MW variando de 10 a 40 kDa e pode ser de 5 a 20 kDa. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado de PEG de terminal alcino terá a seguinte estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)p CCH onde R é uma alquila simples (metila, etila, propila, etc.), m é 2 a 10, p é 2 a 10, e n é 100 a 1.000, e X é opcionalmente um O, N, S ou grupo carbonila (C = O) ou não está presente.
Derivados de PEG Contendo Fosfina
[0417]Em uma outra modalidade da invenção, um polipeptídeo de IL-2 é modificado com um derivado de PEG que contém um grupo funcional ativado (incluindo, mas não se limitando a, éster, carbonato) compreendendo ainda um grupo aril fosfina que irá reagir com uma porção de azida presente na cadeia lateral do aminoácido codificado de forma não natural. Em geral, os derivados de PEG terão um peso molecular médio variando de 1 a 100 kDa e, em algumas modalidades, de 10 a 40 kDa.
[0418]Em algumas modalidades, o derivado de PEG terá a estrutura:
S X Ph2P(H2C)n W
O em que n é 1 a 10; X pode ser O, N, S ou não está presente, Ph é fenila, e W é um polímero solúvel em água.
[0419]Em algumas modalidades, o derivado de PEG terá a estrutura:
O X W R
O PPh2 em que X pode ser O, N, S ou não está presente, Ph é fenila, W é um polímero solúvel em água e R pode ser H, grupos alquila, arila, alquila substituída e arila substituída. Os grupos R exemplificativos incluem, mas não estão se limitando a - CH2, -C(CH3)3, -OR’, -NR’R”, -SR’, -halogênio, -C(O)R’, -CONR’R”, -S(O)2R’, -
S(O)2NR’R”, -CN e -NO2. R’, R”, R”’ e R”“ cada independentemente refere-se hidrogênio, heteroalquila substituído ou não substituído, arila substituída ou não substituída, incluindo, mas não se limitando a, arila substituída com 1-3 halogênios, alquila substituída ou não substituída, grupos alcóxi ou tioalcóxi ou grupos arilalquila.
Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado como são cada grupos R’, R”, R’” e R”“ quando mais do que um desses grupos está presente. Quando R’ e R” são ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5-, 6- ou 7-membros. Por exemplo, -NR’R” é significado para incluir, mas não ser limitado a, 1-pirrolidinila e 4-morfolinila. A partir do debate acima de substituintes, uma pessoa versada na técnica entenderá que o termo “alquila” é significado para incluir grupos incluindo, átomos de carbono ligados a grupos exceto grupos de hidrogênio, tal como haloalquila (incluindo, mas não se limitando a, -CF3 e -CH2CF3) e acila (incluindo, mas não se limitando a, -C(O)CH3, - C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, e semelhantes).
Outros Derivados de PEG e Técnicas Gerais de PEGuilação
[0420]Outros exemplos de moléculas de PEG que podem ser ligados a polipeptídeos IL-2, bem como métodos de PEGuilação incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em, por exemplo, Publicação de Patente U.S. Nº 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0021763; Patente U.S. Nº
6.646.110; 5.824.778; 5.476.653; 5.219.564; 5.629.384; 5.736.625; 4.902.502;
5.281.698; 5.122.614; 5.473.034; 5.516.673; 5.382.657; 6.552.167; 6.610.281;
6.515.100; 6.461.603; 6.436.386; 6.214.966; 5.990.237; 5.900.461; 5.739.208;
5.672.662; 5.446.090; 5.808.096; 5.612.460; 5.324.844; 5.252.714; 6.420.339;
6.201.072; 6.451.346; 6.306.821; 5.559.213; 5.747.646; 5.834.594; 5.849.860;
5.980.948; 6.004.573; 6.129.912; WO 97/32607, EP 229.108, EP 402.378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 e EP 154 316, que são incorporados por referência aqui. Qualquer uma das moléculas de PEG aqui descritas pode ser usada em qualquer forma, incluindo, mas não se limitando a, cadeia simples, cadeia ramificada, cadeia multibraço, funcional simples, bifuncional, multifuncional ou qualquer combinação dos mesmos.
[0421]O polímero adicional e derivados de PEG, incluindo, mas não se limitando a, derivados de hidroxilamina (aminooxi) PEG, são descritos nos seguintes pedidos de patente que são todos incorporados por referência em sua totalidade aqui: Publicação de Patente US Nº 2006/0194256, Publicação de Patente US Nº 2006/0217532, Publicação de Patente U.S. Nº 2006/0217289, Patente Provisória U.S.
Nº 60/755.338; Patente Provisória U.S. Nº 60/755.711; Patente provisória U.S. Nº 60/755.018; Pedido de Patente Internacional Nº PCT/US06/49397; WO 2006/069246; Patente Provisória U.S. Nº 60/743.041; Patente provisória U.S. Nº 60/743.040; Pedido de Patente Internacional Nº PCT/US06/47822; Patente Provisória U.S. Nº 60/882.819; Patente Provisória U.S. Nº 60/882.500; e Patente Provisória U.S. Nº 60/870.594.
X. Glicosilação de Polipeptídeos de IL-2
[0422]A invenção inclui polipeptídeos de IL-2 que incorporam um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente contendo resíduos de sacarídeo. Os resíduos de sacarídeo podem ser naturais (incluindo, mas não se limitando a, N-
acetilglucosamina) ou não naturais (incluindo, mas não se limitando a, 3- fluorogalactose). Os sacarídeos podem ser ligados aos aminoácidos codificados não naturalmente por uma ligação glicosídica ligada a N ou O (incluindo, mas não se limitando a, N-acetilgalactose-L-serina) ou uma ligação não natural (incluindo, mas não se limitando a, uma oxima ou o correspondente glicosídeo ligado a C ou S).
[0423]As porções de sacarídeo (incluindo, mas não se limitando a, glicosil) podem ser adicionadas a polipeptídeos de IL-2 in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente contendo carbonil é modificado com um sacarídeo derivatizado com um grupo aminooxi para gerar o polipeptídeo glicosilado correspondente ligado através de uma ligação oxima. Uma vez ligado ao aminoácido codificado não naturalmente, o sacarídeo pode ser posteriormente elaborado por tratamento com glicosiltransferases e outras enzimas para gerar um oligossacarídeo ligado ao polipeptídeo de IL-2. Consultar, por exemplo, H. Liu, et al. J. Am. Chem.
Soc. 125: 1702-1703 (2003).
[0424]Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente contendo carbonila é modificado diretamente com um glicano com estrutura definida preparado como um derivado de aminooxi. Uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhecerá que outras funcionalidades, incluindo azida, alcino, hidrazida, hidrazina e semicarbazida, podem ser usadas para ligar o sacarídeo ao aminoácido codificado não naturalmente.
Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente contendo azida ou alquinila pode então ser modificado por, incluindo, mas não limitado a uma reação de cicloadição de Huisgen [3 + 2] com, incluindo, mas não limitado a derivados de alcinila ou azida, respectivamente. Este método permite que as proteínas sejam modificadas com uma seletividade extremamente alta.
XI. Dímeros e Multímeros de IL-2
[0425]A presente invenção também fornece combinações de IL-2 e análogos de IL-2, tais como homodímeros, heterodímeros, homomultímeros ou heteromultímeros (isto é, trímeros, tetrâmeros, etc.) onde a IL-2 contendo um ou mais codificados não naturalmente os aminoácidos estão ligados a outra variante de IL-2 desta ou a qualquer outro polipeptídeo que não seja a variante de IL-2 desta, diretamente à estrutura do polipeptídeo ou por meio de um ligante. Devido ao seu peso molecular aumentado em comparação com os monômeros, os conjugados de dímero ou multímero de IL-2 podem exibir propriedades novas ou desejáveis, incluindo, mas não se limitando a, diferentes propriedades farmacológicas, farmacocinéticas, farmacodinâmicas, meia-vida terapêutica modulada ou meia-vida plasmática modulada relativa à IL-2 monomérica. Em algumas modalidades, os dímeros de IL-2 da invenção irão modular a transdução de sinal do receptor de IL-2.
Em outras modalidades, os dímeros ou multímeros de IL-2 da presente invenção irão atuar como um antagonista, agonista ou modulador do receptor de IL-2.
[0426]Em algumas modalidades, uma ou mais das moléculas de IL-2 presentes em um dímero ou multímero contendo IL-2 compreende um aminoácido codificado não naturalmente ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de IL-2 são ligados diretamente, incluindo, mas não se limitando a, através de uma ligação amida Asn-Lys ou ligação dissulfeto Cys-Cys. Em algumas modalidades, os polipeptídeos IL-2 e/ou a molécula não IL-2 ligada compreenderão diferentes aminoácidos codificados não naturalmente para facilitar a dimerização, incluindo, mas não se limitando a, um alcino em um aminoácido codificado não naturalmente ácido de um primeiro polipeptídeo de IL-2 e uma azida em um segundo aminoácido codificado não naturalmente de uma segunda molécula serão conjugados através de uma cicloadição de Huisgen [3 + 2]. Alternativamente, IL-2 e/ou a molécula não IL-2 ligada compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente contendo cetona podem ser conjugados a um segundo polipeptídeo compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente contendo hidroxilamina e os polipeptídeos são reagiu através da formação da oxima correspondente.
[0427]Alternativamente, os dois polipeptídeos de IL-2, e/ou a molécula não IL- 2 ligada, são ligados por meio de um ligante. Qualquer ligante hetero- ou homo- bifuncional pode ser usado para ligar as duas moléculas e/ou as moléculas não IL-2 ligadas, que podem ter a mesma sequência primária ou uma sequência primária diferente. Em alguns casos, o ligante usado para amarrar a IL-2 e/ou as moléculas não IL-2 ligadas em conjunto podem ser um reagente de PEG bifuncional. O ligante pode ter uma ampla faixa de peso molecular ou comprimento molecular. Ligantes de peso molecular maior ou menor podem ser usados para fornecer uma relação espacial desejada ou conformação entre IL-2 e a entidade ligada ou entre IL-2 e seu receptor, ou entre a entidade ligada e seu parceiro de ligação, se houver. Os ligantes com comprimento molecular mais longo ou mais curto também podem ser usados para fornecer um espaço ou flexibilidade desejada entre IL-2 e a entidade ligada, ou entre a entidade ligada e seu parceiro de ligação, se houver.
[0428]Em algumas modalidades, a invenção fornece ligantes bifuncionais solúveis em água que têm uma estrutura em haltere que inclui: a) uma azida, um alcino, uma hidrazina, uma hidrazida, uma hidroxilamina ou uma porção contendo carbonil em pelo menos um primeira extremidade de uma estrutura de polímero; e b) pelo menos um segundo grupo funcional em uma segunda extremidade da estrutura do polímero. O segundo grupo funcional pode ser igual ou diferente do primeiro grupo funcional. O segundo grupo funcional, em algumas modalidades, não é reativo com o primeiro grupo funcional. A invenção fornece, em algumas modalidades, compostos solúveis em água que compreendem pelo menos um braço de uma estrutura molecular ramificada. Por exemplo, a estrutura molecular ramificada pode ser dendrítica.
[0429]Em algumas modalidades, a invenção fornece multímeros compreendendo um ou mais polipeptídeo de IL-2, formados por reações com polímeros ativados solúveis em água que têm a estrutura: R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X em que n é de cerca de 5 a 3.000, m é 2 a 10, X pode ser um azida, um alcino, uma hidrazina, uma hidrazida, um grupo aminoóxi, um hidroxilamina, um acetila ou porção contendo carbonil, e R é um grupo de cobertura, um grupo funcional ou um grupo de saída que pode ser igual ou diferente de X. R pode ser, por exemplo, um grupo funcional selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxila, hidroxila protegida, alcoxila, éster de N-hidroxisuccinimidila, éster de 1-benzotriazolila, carbonato de N de hidroxisuccinimidila, carbonato de 1-benzotriazolila, acetal, aldeído, aldeído hidratos, alquenila, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos e tresilato, alceno e cetona.
XII. Medição da Atividade do Polipeptídeo de IL-2 e Afinidade do Polipeptídeo de IL-2 para o Receptor de IL-2
[0430]A atividade do polipeptídeo de IL-2 pode ser determinada usando ensaios padrão ou conhecidos in vitro ou in vivo. O PEG-IL-2 pode ser analisado quanto à atividade biológica por métodos adequados conhecidos na técnica. Tais ensaios incluem, mas não estão limitados à ativação de genes responsivos a IL-2, ensaios de ligação ao receptor, ensaios de atividade antiviral, ensaios de inibição de efeito citopático, ensaios antiproliferativos, ensaios imunomoduladores e ensaios que monitoram a indução de moléculas de MHC.
[0431]Os polipeptídeos PEG-IL-2 podem ser analisados quanto à sua capacidade de ativar as vias de transdução de sinal sensíveis à IL-2. Um exemplo é o ensaio do elemento de resposta estimulada por interferon (ISRE). As células que expressam constitutivamente o receptor de IL-2 são transfectadas transitoriamente com um vetor ISRE-luciferase (pISRE-luc, Clontech). Após a transfecção, as células são tratadas com um polipeptídeo de IL-2. Uma série de concentrações de proteína, por exemplo de 0,0001 a 10 ng/mL, são testadas para gerar uma curva de dose- resposta. Se o polipeptídeo de IL-2 se liga e ativa o receptor de IL-2, a cascata de transdução de sinal resultante induz a expressão da luciferase. A luminescência pode ser medida de várias maneiras, por exemplo, usando um leitor de microplaca TopCountTM ou FusionTM e o Steady-GloR Luciferase Assay System (Promega).
[0432]Os polipeptídeos de IL-2 podem ser analisados quanto à sua capacidade de se ligarem ao receptor de IL-2. Para um polipeptídeos de IL-2 não PEGuilado ou PEGuilado compreendendo um aminoácido não natural, a afinidade de IL-2 para o seu receptor pode ser medida usando um biossensor BIAcore™ (Pharmacia). Os ensaios de ligação adequados incluem, mas não estão limitados a ensaios BIAcore (Pearce et al., Biochemistry 38:81-89 (1999)) e ensaios AlphaScreenTM (PerkinElmer).
[0433]Independentemente de quais métodos são usados para criar os polipeptídeos de IL-2, os polipeptídeos de IL-2 estão sujeitos a ensaios de atividade biológica. Em geral, o teste de atividade biológica deve fornecer análise para o resultado desejado, como aumento ou diminuição da atividade biológica (em comparação com IL-2 modificada), atividade biológica diferente (em comparação com IL-2 modificada), análise de afinidade do receptor ou parceiro de ligação, alterações conformacionais ou estruturais da própria IL-2 ou de seu receptor (em comparação com a IL-2 modificada) ou análise de meia-vida sérica.
XIII. Medição de Potência, Meia-vida Funcional in vivo e Parâmetros Farmacocinéticos
[0434]Um aspecto importante da invenção é a meia-vida biológica prolongada que é obtida pela construção do polipeptídeo de IL-2 com ou sem conjugação do polipeptídeo a uma porção de polímero solúvel em água. A rápida diminuição pós- administração das concentrações séricas do polipeptídeo de IL-2 tornou importante avaliar as respostas biológicas ao tratamento com polipeptídeo de IL-2 conjugado e não conjugado e suas variantes. O polipeptídeo de IL-2 conjugado e não conjugado e as suas variantes da presente invenção podem ter semividas séricas prolongadas também após administração, por exemplo, administração subcutânea ou i.v., tornando possível a medição, por exemplo, Método ELISA ou por um ensaio de triagem primária. Kits ELISA ou RIA de fontes comerciais podem ser usados, como Invitrogen (Carlsbad, CA). A medição da meia-vida biológica in vivo é realizada como aqui descrito.
[0435]A potência e a meia-vida funcional in vivo de um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural podem ser determinadas de acordo com protocolos conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica.
[0436]Os parâmetros farmacocinéticos para um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente podem ser avaliados em ratos machos Sprague-Dawley normais (N = 5 animais por grupo de tratamento). Os animais receberão uma dose única de 25 µg/rato iv ou 50 µg/rato sc, e aproximadamente 5 a 7 amostras de sangue serão coletadas de acordo com um curso de tempo predefinido, geralmente cobrindo cerca de 6 horas para um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente não conjugado a um polímero solúvel em água e cerca de 4 dias para um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente e conjugado a um polímero solúvel em água. Os dados farmacocinéticos para IL-2 sem um aminoácido codificado não naturalmente podem ser comparados diretamente com os dados obtidos para polipeptídeos de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente.
XIV.Administração e Composições Farmacêuticas
[0437]Os polipeptídeos ou proteínas da invenção (incluindo, mas não se limitando a, IL-2, sintetases, proteínas compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais, etc.) são opcionalmente empregados para usos terapêuticos, incluindo, mas não se limitando a, em combinação com um portador farmacêutico adequado. Tais composições, por exemplo, compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto e um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Tal portador ou excipiente inclui, mas não está limitado a solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol e/ou combinações dos mesmos. A formulação é feita de acordo com o modo de administração. Em geral, os métodos de administração de proteínas são conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica e podem ser aplicados à administração dos polipeptídeos da invenção. As composições podem estar em uma forma solúvel em água, como estando presentes como sais farmaceuticamente aceitáveis, que se destina a incluir sais de adição de ácido e base.
[0438]As composições terapêuticas que compreendem um ou mais polipeptídeos da invenção são opcionalmente testadas em um ou mais modelos animais adequados de doença in vitro e/ou in vivo, para confirmar a eficácia, metabolismo do tecido e para estimar as dosagens, de acordo com os métodos conhecidos pela pessoa de habilidade comum na técnica. Em particular, as dosagens podem ser inicialmente determinadas pela atividade, estabilidade ou outras medidas adequadas de não naturais aqui para homólogos de aminoácidos naturais (incluindo, mas não se limitando a, comparação de um polipeptídeo de IL-2 modificado para incluir um ou mais aminoácidos não naturais a um polipeptídeo de IL-2 de aminoácido natural e comparação com um polipeptídeo de IL-2 modificada para incluir um ou mais aminoácidos não naturais para um tratamento de IL-2 atualmente disponível, isto é, em um ensaio relevante.
[0439]A administração é por qualquer uma das vias normalmente usadas para introduzir uma molécula em contato final com o sangue ou células de tecido. Os polipeptídeos de aminoácidos não naturais da invenção são administrados de qualquer maneira adequada, opcionalmente com um ou mais portadores farmaceuticamente aceitáveis. Os métodos adequados de administração de tais polipeptídeos no contexto da presente invenção a um paciente estão disponíveis e, embora mais de uma via possa ser usada para administrar uma composição particular, uma via particular pode muitas vezes fornecer uma ação ou reação mais imediata e mais eficaz do que outra via.
[0440]Os portadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular a ser administrada, bem como pelo método particular usado para administrar a composição. Consequentemente, existe uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas da presente invenção.
[0441]Os polipeptídeos de IL-2 da invenção podem ser administrados por qualquer via convencional adequada para proteínas ou peptídeos, incluindo, mas não se limitando a parentéricamente, por exemplo, injeções incluindo, mas não se limitando a, por via subcutânea ou intravenosa ou qualquer outra forma de injeções ou infusões. As composições polipeptídicas podem ser administradas por uma série de vias incluindo, mas não se limitando a meios orais, intravenosos, intraperitoneais, intramusculares, transdérmicos, subcutâneos, tópicos, sublinguais ou retais. As composições compreendendo polipeptídeos de aminoácidos não naturais, modificados ou não modificados, também podem ser administradas por meio de lipossomas. Essas vias de administração e formulações apropriadas são geralmente conhecidas pelas pessoas versadas na técnica. O polipeptídeo de IL-2 pode ser utilizado sozinho ou em combinação com outros componentes adequados, como um portador farmacêutico. O polipeptídeo de IL-2 pode ser utilizado em combinação com outros agentes ou terapêuticos.
[0442]O polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido não natural, sozinho ou em combinação com outros componentes adequados, também pode ser feito em formulações de aerossol (isto é, eles podem ser “nebulizados”) para serem administrados por inalação. As formulações de aerossol podem ser colocadas em propulsores pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e semelhantes.
[0443]As formulações adequadas para administração parentérica, tais como, por exemplo, por vias intra-articulares (nas articulações), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e subcutânea, incluem soluções de injeção estéril isotônica aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. As formulações de IL-2 podem ser apresentadas em recipientes vedados de dose unitária ou multidose, como ampolas e frascos.
[0444]A administração parentérica e a administração intravenosa são os métodos de administração preferidos. Em particular, as vias de administração já em uso para terapêuticas homólogas de aminoácidos naturais (incluindo, mas não se limitando a, aquelas tipicamente usadas para EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, por exemplo, IL-2, interleucinas, anticorpos, FGFs, e/ou qualquer outra proteína distribuída farmaceuticamente), juntamente com as formulações em uso atual, fornecem as vias de administração e formulação preferidas para os polipeptídeos da invenção.
[0445]A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, é suficiente para ter uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo, ou outra atividade apropriada, dependendo da aplicação. A dose é determinada pela eficácia do vetor ou formulação particular e pela atividade, estabilidade ou meia-vida sérica do polipeptídeo de aminoácido não natural empregado e a condição do paciente, bem como o peso corporal ou área de superfície do paciente a ser tratado.
O tamanho da dose também é determinado pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que acompanham a administração de um determinado vetor, formulação ou semelhante em um determinado paciente.
[0446]Na determinação da quantidade eficaz do vetor ou formulação a ser administrada no tratamento ou profilaxia da doença (incluindo, mas não se limitando a, neutropenia, anemia aplástica, neutropenia cíclica, neutropenia idiopática, síndrome de Chdiak-Higashi, lúpus eritematoso sistêmico (LES), leucemia, síndrome mielodisplásica e mielofibrose ou semelhantes), o médico avalia os níveis plasmáticos circulantes, toxicidades da formulação, progressão da doença e/ou quando relevante, a produção de anticorpos polipeptídeos de aminoácidos não naturais.
[0447]A dose administrada, por exemplo, a um paciente de 70 quilogramas, está tipicamente na faixa equivalente às dosagens de proteínas terapêuticas usadas atualmente, ajustadas para a atividade alterada ou meia-vida sérica da composição relevante. Os vetores ou formulações farmacêuticas desta invenção podem suplementar as condições de tratamento por qualquer terapia convencional conhecida, incluindo administração de anticorpos, administração de vacinas, administração de agentes citotóxicos, polipeptídeos de aminoácidos naturais, ácidos nucleicos, análogos de nucleotídeos, modificadores de resposta biológica e semelhantes.
[0448]Para administração, as formulações da presente invenção são administradas a uma taxa determinada pelo LD-50 ou ED-50 da formulação relevante e/ou observação de quaisquer efeitos colaterais dos polipeptídeos de aminoácidos não naturais em várias concentrações, incluindo, mas não se limitando a, conforme aplicado à massa e à saúde geral do paciente. A administração pode ser realizada em doses únicas ou divididas.
[0449]Se um paciente submetido à infusão de uma formulação desenvolver febre, calafrios ou dores musculares, ele receberá a dose apropriada de aspirina, ibuprofeno, paracetamol ou outro medicamento para controlar a dor/febre. Os pacientes que apresentarem reações à infusão, como febre, dores musculares e calafrios, são medicados com a medicação pré-anestésica 30 minutos antes das futuras infusões com aspirina, paracetamol ou, incluindo, mas não se limitando a, difenidramina. A meperidina é usada para calafrios e dores musculares mais graves que não respondem rapidamente aos antipiréticos e anti-histamínicos. A infusão de células é retardada ou interrompida dependendo da gravidade da reação.
[0450] Os polipeptídeos de IL-2 humana da invenção podem ser administrados diretamente a um sujeito mamífero. A administração é por qualquer uma das vias normalmente utilizadas para a introdução do polipeptídeo de IL-2 a um sujeito. As composições do polipeptídeo de IL-2 de acordo com as modalidades da presente invenção incluem aquelas adequadas para oral, retal, tópica, inalação (incluindo, mas não se limitando a, por meio de um aerossol), bucal (incluindo, mas não se limitando a, sublingual), vaginal, parentérica (incluindo, mas não se limitando a, subcutâneo, intramuscular, intradérmico, intra-articular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intra-arterial ou intravenoso), tópico (isto é, superfícies cutâneas e mucosas, incluindo superfícies das vias aéreas), pulmonar, intraocular, intranasal, e administração transdérmica, embora a via mais adequada em qualquer caso dependa da natureza e gravidade da condição a ser tratada. A administração pode ser local ou sistêmica. As formulações de compostos podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou multidose, como ampolas e frascos. Os polipeptídeos de IL-2 da invenção podem ser preparados numa mistura numa forma injetável de dosagem unitária (incluindo, mas não se limitando a, solução, suspensão ou emulsão) com um portador farmaceuticamente aceitável. Os polipeptídeos de IL-2 da invenção também podem ser administrados por infusão contínua (usando, incluindo, mas não se limitando a, minibombas, tais como bombas osmóticas), bolus único ou formulações de depósito de liberação lenta.
[0451]As formulações adequadas para administração incluem soluções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotônicas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes.
Soluções e suspensões podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo descrito anteriormente.
[0452]A liofilização é uma técnica comumente empregada para apresentar proteínas que serve para remover água da preparação de proteína de interesse. A desidratação por congelamento, ou liofilização, é um processo pelo qual o material a ser seco é primeiro congelado e, em seguida, o gelo ou solvente congelado é removido por sublimação em um ambiente de vácuo. Um excipiente pode ser incluído em formulações pré-liofilizadas para aumentar a estabilidade durante o processo de liofilização e/ou para melhorar a estabilidade do produto liofilizado durante o armazenamento. Pikal, M. Biopharm. 3 (9) 26-30 (1990) e Arakawa et al. Pharm. Res.
8(3):285-291 (1991).
[0453]A secagem por pulverização de produtos farmacêuticos também é conhecida pela pessoa de habilidade comum na técnica. Por exemplo, consultar Broadhead, J. et al., “The Spray Drying of Pharmaceuticals”, em Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 e 12), 1169-1206 (1992). Além de produtos farmacêuticos de pequenas moléculas, uma variedade de materiais biológicos foi seca por pulverização e incluem: enzimas, soros, plasma, microrganismos e leveduras. A secagem por pulverização é uma técnica útil porque pode converter uma preparação farmacêutica líquida em um pó fino, sem poeira ou aglomerado em um processo de uma etapa. A técnica básica compreende as seguintes quatro etapas: a) atomização da solução de alimentação em um pulverizador; b) contato do ar com pulverizador; c) secagem do pulverizador; e d) separação do produto seco do ar de secagem. As Patentes U.S. Nos 6.235.710 e
6.001.800, que são aqui incorporadas por referência, descrevem a preparação de eritropoietina recombinante por secagem por pulverização.
[0454]As composições e formulações farmacêuticas da invenção podem compreender um portador, excipiente ou estabilizador farmaceuticamente aceitável.
Os portadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular a ser administrada, bem como pelo método particular usado para administrar a composição. Consequentemente, existe uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas (incluindo portadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais) da presente invenção (consultar, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17ª ed.
1985)).
[0455]Os portadores adequados incluem, mas não estão limitados a, tampões contendo succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, imidazol, acetato, bicarbonato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo, mas não se limitando a, ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular incluindo, mas não se limitando a aqueles com menos de cerca de 10 resíduos; proteínas, incluindo, mas não se limitando a, albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos incluindo, mas não se limitando a, polivinilpirrolidona; aminoácidos incluindo, mas não se limitando a, glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina ou derivados de histidina, metionina, glutamato ou lisina; monossacarídeos,
dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo, mas não se limitando a, trealose,
sacarose, glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes incluindo, mas não se limitando a, EDTA e edentato dissódico; íons de metal divalente incluindo, mas não se limitando a, zinco, cobalto ou cobre; álcoois de açúcar incluindo, mas não se limitando a, manitol ou sorbitol; contra-íons formadores de sal incluindo, mas não se limitando a, cloreto de sódio e sódio; cargas, tais como celulose microcristalina,
lactose, milho e outros amidos; agentes de ligação; adoçantes e outros agentes aromatizantes; agentes corantes; e/ou tensoativos não iônicos, incluindo, mas não se limitando a Tween™ (incluindo, mas não se limitando a, Tween 80 (polissorbato 80) e
Tween 20 (polissorbato 20), Pluronics™ e outros ácidos plurônicos, incluindo, mas não se limitando a, ácido plurônico F68 (poloxâmero 188), ou PEG.
Os tensoativos adequados incluem, por exemplo, mas não estão limitados a poliéteres com base em poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno), isto é, (PEO-PPO-
PEO), ou poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), isto é, (PPO-PEO-PPO), ou uma combinação dos mesmos.
PEO-PPO-PEO e PPO-PEO-
PPO estão comercialmente disponíveis sob os nomes comerciais PluronicsTM, R-
PluronicsTM, TetronicsTM e R-TetronicsTM (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.)
E são ainda descritos em Patente U.S.
Nº 4.820.352 aqui incorporada em sua totalidade por referência.
Outros polímeros em bloco de etileno/polipropileno podem ser tensoativos adequados.
Um tensoativo ou uma combinação de tensoativos pode ser usado para estabilizar a IL-2 PEGuilada contra uma ou mais tensões, incluindo,
mas não se limitando a, tensão que resulta da agitação.
Alguns dos itens acima podem ser denominados como “agentes de volume”. Alguns também podem ser chamados de “modificadores de tonicidade”. Os conservantes antimicrobianos também podem ser aplicados para estabilidade do produto e eficácia antimicrobiana; conservantes adequados incluem, mas não estão limitados a álcool benzílico, cloreto de benzalcônio, metacresol, metil/propil parabeno, cresol e fenol ou uma combinação dos mesmos. A Patente U.S. Nº 7.144.574, que é incorporada neste documento por referência, descreve materiais adicionais que podem ser adequados em composições e formulações farmacêuticas da invenção e outras preparações de entrega.
[0456]Os polipeptídeos de IL-2 da invenção, incluindo aqueles ligados a polímeros solúveis em água, como PEG, também podem ser administrados por ou como parte de sistemas de liberação sustentada. As composições de liberação sustentada incluem, incluindo, mas não se limitando a, matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, incluindo, mas não se limitando a, filmes ou microcápsulas. As matrizes de liberação sustentada incluem materiais biocompatíveis, tais como poli(2-hidroxietil metacrilato) (Langer et al., J. Biomed.
Mater. Res., 15: 267-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), etileno vinil acetato (Langer et al., Supra) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988), polilactídeos (ácido polilático) (Patente US Nº 3.773.919; EP 58.481), poliglicólido (polímero de ácido glicólico), polilactídeo co-glicolídeo (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico) polianidridos, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L- glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli(orto)ésteres, polipeptídeos, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, fosfolipídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos, tais como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleotídeos, polivinilpropileno, polivinilpirrolidona e silicone. As composições de liberação sustentada também incluem um composto retido em lipossomas mesmo contendo o composto são preparados por métodos conhecidos per se: DE 3.218.121; Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S. A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; Patente U.S. Nº 4.619.794; EP 143.949; Patente U.S. Nº 5.021.234; Pedido de Pat. Japonesa. 83-118008; Patente U.S. Nos 4.485.045 e 4.544.545; e EP 102.324. Todas as referências e patentes citadas são aqui incorporadas por referência.
[0457]Os polipeptídeos de IL-2 aprisionados em lipossomas podem ser preparados por métodos descritos em, por exemplo, DE 3.218.121; Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; Patente U.S. Nº 4.619.794; EP 143.949; Patente U.S. Nº 5.021.234; Pedido de Pat. Japonesa 83-118008; Patente U.S. Nos 4.485.045 e 4.544.545; e EP 102.324. A composição e o tamanho dos lipossomas são bem conhecidos ou podem ser facilmente determinados empiricamente por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Alguns exemplos de lipossomas como descrito em, por exemplo, Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D e Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998); Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, em Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118 (2002); Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003). Todas as referências e patentes citadas são incorporadas por referência neste documento.
[0458]A dose administrada a um paciente no contexto da presente invenção deve ser suficiente para causar uma resposta benéfica no sujeito ao longo do tempo.
Geralmente, a quantidade total farmaceuticamente eficaz do polipeptídeo de IL-2 da presente invenção administrado por via parentérica por dose está na faixa de cerca de 0,01 μg/kg/dia a cerca de 100 μg/kg, ou cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, do peso corporal do paciente, embora isso esteja sujeito a critério terapêutico. Em aspectos específicos desta modalidade, o conjugado pode ser administrado em uma dose em uma faixa de mais de 4 μ/kg por dia a cerca de 20 μg/kg por dia.
Em ainda outros aspectos, o conjugado pode ser administrado em uma dose em uma faixa de mais de 4 μg/kg por dia a cerca de 9 μg/kg por dia.
Em ainda outros aspectos, o conjugado pode ser administrado em uma dose em uma faixa de cerca de 4 μg/kg por dia a cerca de 12,5 μg/kg por dia.
Em um aspecto específico, o conjugado pode ser administrado em ou abaixo de uma dose que é a dose máxima tolerada sem toxicidade indevida.
Além disso, o conjugado pode ser administrado pelo menos duas vezes por semana ou o conjugado pode ser administrado pelo menos três vezes por semana,
pelo menos quatro vezes por semana, pelo menos cinco vezes por semana, pelo menos seis vezes por semana ou sete vezes uma semana.
Em um aspecto específico,
onde o conjugado é administrado mais de uma vez, o conjugado pode ser administrado a uma dose superior a 4 μg/kg por dia de cada vez.
Em particular, o conjugado pode ser administrado durante um período de duas semanas ou mais.
Em certos aspectos, o crescimento de células que expressam o receptor de interleucina-
2 pode ser inibido em pelo menos 50 %, pelo menos 65 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos
99 % em comparação com uma amostra de referência, isto é, uma amostra de células não contatada com um conjugado da invenção.
Em um aspecto específico desta modalidade, o conjugado pode ser administrado a uma dose de cerca de 5,3 μg/kg por dia, ou a uma dose de cerca de 7,1 μg/kg por dia, ou a uma dose de cerca de 9,4 μg/kg por dia , ou a uma dose de cerca de 12,5 μg/kg por dia.
A frequência da dosagem também está sujeita a critério terapêutico e pode ser mais ou menos frequente do que os produtos de polipeptídeo de IL-2 comercialmente disponíveis aprovados para uso em humanos.
Geralmente, um polipeptídeo de IL-2, polipeptídeo de IL-2 PEGuilada,
polipeptídeo de IL-2 conjugado ou polipeptídeo de IL-2 conjugado PEGuilado da invenção pode ser administrado por qualquer uma das vias de administração descritas acima.
XV. Usos Terapêuticos de Polipeptídeos de IL-2 da Invenção
[0459]Os polipeptídeos de IL-2 da invenção são úteis para o tratamento de uma ampla gama de distúrbios. A invenção também inclui um método de tratamento de um mamífero que está em risco de, está tendo e/ou teve um câncer responsivo a IL-2, estimulação de células T CD8+ e/ou formulações de IL-2. A administração de polipeptídeos de IL-2 pode resultar em um efeito de curto prazo, isto é. um efeito benéfico imediato em vários parâmetros clínicos observados e isso pode 12 ou 24 horas após a administração e, por outro lado, também pode resultar em um efeito de longo prazo, uma desaceleração benéfica da progressão do crescimento do tumor, redução no tamanho do tumor e/ou níveis aumentados de células T CD8 + circulantes e os polipeptídeos de IL-2 da presente invenção podem ser administrados por qualquer meio conhecido pelas pessoas versadas na técnica e podem ser administrados de forma benéfica por meio de infusão, por exemplo por injecção arterial, intraperitoneal ou intravenosa e/ou infusão numa dosagem que seja suficiente para obter o efeito farmacológico desejado.
[0460] A dosagem do polipeptídeo de IL-2 pode variar de 10 a 200 mg, ou 40-80 mg do polipeptídeo de IL-2 por kg de peso corporal por tratamento. Por exemplo, a dosagem de polipeptídeo de IL-2 que é administrado pode ser de cerca de 20 a 100 mg de polipeptídeo de IL-2 por kg de peso corporal administrado como uma injecção em bolus e/ou como uma infusão durante um período de tempo clinicamente necessário, e. por um período que varia de alguns minutos a várias horas, por ex. até 24 horas. Se necessário, a administração do polipeptídeo de IL-2 pode ser repetida uma ou várias vezes. A administração do polipeptídeo de IL-2 pode ser combinada com a administração de outros agentes farmacêuticos, tais como agentes quimioterapêuticos. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para profilaxia e/ou tratamento de câncer, compreendendo a administração a um sujeito em necessidade de uma quantidade eficaz de polipeptídeo de IL-2.
[0461]As quantidades médias de IL-2 podem variar e, em particular, devem ser baseadas nas recomendações e prescrição de um médico qualificado. A quantidade exata de IL-2 é uma questão de preferência sujeita a fatores como o tipo exato de condição a ser tratada, a condição do paciente a ser tratado, bem como os outros ingredientes da composição. A invenção também fornece a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de outro agente ativo. A quantidade a ser administrada pode ser facilmente determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica com base na terapia com IL-2.
EXEMPLOS
[0462]Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada.
[0463]Exemplo 1 - Determinação das posições dos resíduos em IL-2 a serem mutados no códon de parada âmbar para incorporar aminoácidos não naturais.
[0464]A IL-2 tem sido usada no tratamento de vários cânceres, como carcinoma de células renais e melanoma metastático. A IL-2 Aldesleukin® disponível comercialmente é uma proteína recombinante que não é glicosilada e tem uma alanina-1 removida e um resíduo substituído cisteína-125 por serina-125 (Whittington et al., Drugs, 46 (3): páginas 446-514 (1993)). Embora a IL-2 seja a primeira citocina aprovada pela FDA no tratamento do câncer, foi demonstrado que a IL-2 exibiu efeitos colaterais graves quando usada em altas doses. Isso limitou muito sua aplicação em pacientes potenciais. O mecanismo subjacente dos efeitos colaterais graves foi atribuído à ligação de IL-2 a um de seus receptores, IL-2Rα. Em geral, a IL-2 não só pode formar um complexo heterotrimérico com seus receptores, incluindo, IL-2Rα (ou CD25), IL-2Rβ (ou CD122) e IL-2Rγ (ou CD132) quando todos os três receptores estão presentes no tecido , mas também pode formar complexo heterodimérico com IL-2Rβ e IL-2Rγ. Em ambientes clínicos, quando altas doses de IL-2 são usadas, IL-2 começa a se ligar a IL-2αβγ, que é a principal forma de receptor nas células Treg. O efeito supressor das células Treg causa efeitos indesejáveis da aplicação de IL-2 na imunoterapia contra o câncer. Para mitigar os efeitos colaterais da IL-2, muitas abordagens foram empregadas anteriormente. Um dos principais avanços é a invenção da Nektar que usa 6 lisinas PEGuiladas para mascarar a região de ligação de IL2Rα na superfície de IL-2 (Charych et al., Clin Cancer Res, 22 (3): páginas 680- 90 (2016)). A IL-2 PEGuilada não apenas tem uma meia-vida estendida, mas também mostrou efeitos colaterais drasticamente reduzidos. No entanto, os resultados dos estudos de atividade mostraram que a forma eficaz de IL-2 PEGuilada nesta mistura heterogênea de IL-2 6-PEGuilada é a única forma PEGuilada apenas. Portanto, é necessário IL-2 PEGuilada mais eficaz com um produto homogêneo.
[0465]No pedido atual, os aminoácidos não naturais incorporados fornecem sítios de conjugação únicos a serem usados na PEGuilação de IL-2. As muteínas de IL-2 PEGuiladas resultantes têm um produto homogêneo em vez de IL-2 6-PEGuilada previamente heterogêneo de Nektar.
[0466]Os sítios a serem usados na geração de muteínas de IL-2 podem ser escolhidos por meio da análise da estrutura cristalina existente de IL-2 e seus receptores heterotriméricos. Especificamente, a estrutura de IL-2Rα e sua interface com IL-2 foram investigadas em detalhes (Figura 1). A interface foi dividida em duas regiões compreendendo um centro hidrofóbico e uma região polarizada. O centro hidrofóbico é formado entre os resíduos de IL-2Rα Leu-2α, Met-25α, Leu-42α, e Tyr- 43α e resíduos de IL-2 Phe-42IL-2. Phe-44IL-2. Tyr-45IL-2. Pro-65IL-2. e Leu-72IL-2. A região polarizada é formada entre IL-2Rα e IL-2 cinco pares iônicos incluindo, Lys-38α/Glu- 61IL-2. Arg-36α/Glu-62IL-2. Glu-1α/Lys-35IL-2. Asp-6α/Arg-38IL-2. e Glu-29α/Lys-43IL-2. Além disso, o mapeamento eletrostático sugeriu que alguns outros resíduos podem desempenhar um papel na mediação da interação entre IL-2Rα e IL-2. Estes resíduos são Thr-37IL-2. Thre-41IL-2. Lys-64IL-2. Glu-68IL-2. e Tyr-107IL-2. Portanto, os sítios que podem ser usados são Phe-42IL-2. Phe-44IL-2. Tyr-45IL-2. Pro-65IL-2. Leu-72IL-2. Glu-61IL-
2. Glu-62IL-2. Lys-35IL-2. Arg-38IL-2. Lys-43IL-2. Thr-37IL-2. Thr-3IL-2. Lys-64IL-2. Glu-68IL-2. e Tyr-107IL-2. Uma lista de sequências de proteínas usadas para produzir muteínas com aminoácidos não naturais está listada na Tabela 2 abaixo: Tabela 2. Sequências de proteína de IL-2 com sítios potenciais a serem usados na PEGuilação SEQ Posição Sequências de proteínas com aminoácidos não naturais ID. de incorporados NO resíduos 9 F42 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLT*U
KFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRD LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 10 F44 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFK *UYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRD
LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 11 Y45 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFK F*UMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRD
LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 12 P65 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFK FYMPKKATELKHLQCLEEELK*ULEEVLNLAQSKNFHLRPRD
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STLT 13 L72 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFK FYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN*UAQSKNFHLRPRD
LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 14 E61 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFK FYMPKKATELKHLQCLE*UELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRD
LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 15 E62 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFK FYMPKKATELKHLQCLEE*ULKPLEUVLNLAQSKNFHLRPRD
LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 16 K35 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNP*ULTRMLTF
KFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRD LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 17 R38 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLT*UMLTF
KFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRD LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 18 K43 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTF*
UFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRD LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 19 T37 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKL*URMLTF
KFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRD LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 20 T3 AP*USSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTF
KFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRD LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 21 K64 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFK FYMPKKATELKHLQCLEEEL*UPLEEVLNLAQSKNFHLRPRD
LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 22 E68 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFK FYMPKKATELKHLQCLEEELKPLE*UVLNLAQSKNFHLRPRD
LISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII
STLT 23 Y107 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFK
FYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLI SNINVIVLELKGSETTFMCE*UADETATIVEFLNRWITFCQSIIS
TLT *U: aminoácido não natural Exemplo 2: Sistema de expressão de IL-2 humana
[0467]Esta seção descreve métodos de expressão usados para polipeptídeos de IL-2 compreendendo um aminoácido não natural. As células hospedeiras são transformadas com construtos para tRNA ortogonal, aminoacil tRNA sintetase ortogonal e um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de IL-2 como em SEQ ID NOs: 4, 6 ou 8, ou um polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, 7 e 9 a 23, compreendendo um códon seletor.
[0468] Construção de vetor de expressão de E. coli e verificação de sequência: Este exemplo detalha a clonagem e expressão de IL-2 humana (hIL-2) incluindo um aminoácido codificado não naturalmente em E. coli. Todos os plasmídeos de expressão de IL-2 humana foram construídos por método de clonagem baseado em recombinação usando o kit de Conjunto Gibson (New England Biolabs (NEB), Ipswich, MA) ou usando o kit de mutagênese QuikChange (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) na cepa de clonagem de E. coli NEB5α (New England Biolabs, MA) como descrito abaixo. O plasmídeo de expressão de E. coli é mostrado na Figura 2.
[0469]Conjunto de Gibson: Os iniciadores para amplificar vários genes de interesse (GOIs) contendo fragmentos de doadores tinham sequência de sobreposição de cerca de 18 a 24 pares de bases (pb) em seus terminais 5’ com as sequências do vetor aceitador para recombinação homóloga e foram sintetizados na Integrated DNA Technologies (IDT) (San Diego, CA). Os fragmentos de PCR foram amplificados usando mistura de polimerase de DNA de alta fidelidade, Pfu Ultra II
Hotstart PCR Master Mix (Cat. No: 600852, Agilent Technologies). Os produtos de PCR foram digeridos com a enzima de restrição Dpn1 (NEB # R0176L) por 2 horas a 37 °C para remover o fundo do plasmídeo seguido por purificação de coluna usando o kit de purificação de coluna Qiagen PCR (Qiagen, Valencia, CA; # 28104) e quantificado por Nanodrop (ThermoFisher, Carlsbad, CA). Os vetores aceitadores foram linearizados por digestão com enzimas de restrição únicas (NEB, MA) dentro do vetor por 3 a 5 horas nas temperaturas recomendadas pelo fornecedor, coluna de PCR purificada e quantificada. Os insertos do doador e os vetores aceitadores apropriadamente preparados foram misturados a uma razão molar de 3:1, incubados a 50 °C por 15 min, usando o kit de conjunto Gibson (NEB # E2611S) e, em seguida, usados para transformação na cepa NEB5α de E. coli (NEB # 2987.
[0470]Os recombinantes foram recuperados por plaqueamento da mistura do conjunto Gibson em placas de ágar LB contendo antibióticos apropriados. No dia seguinte, 4 a 6 colônias simples bem isoladas foram inoculadas em 5 mL de meio LB + 50 µg/mL de sulfato de canamicina (Sigma, St Louis, MO; cat # K0254) e cultivadas durante a noite a 37 °C. Os plasmídeos recombinantes foram isolados usando Kit de mini-preparação de DNA de plasmídeo Qiagen (Qiagen # 27104) e verificado por sequenciação de DNA (Eton Biosciences, San Diego, CA). A região GOI completa mais as sequências de 100 pb a montante e 100 pb a jusante foram verificadas usando iniciadores de sequenciação específicos de gene.
[0471]Mutagênese QuickChange (QCM): Todas as variantes âmbar contendo códon de parada TAG foram criados usando Kit de mutagênese direcionada ao sítio QuickChange Lightning (Agilent Technologies # 201519). Todos os oligonucleotídeos QCM foram projetados usando o QuickChange Web Portal (Agilent Technologies) e solicitados à IDT (San Diego, CA). A mistura de PCR QCM continha 5 µl de tampão 10 x, 2,5 µl de dNTP Mix, 1 µl (100 ng) de molde de plasmídeo, 1 µl de mistura de oligo (concentração de 10 uM cada), 1 µl de enzima QuickChange Lightning, 2,5 µl de solução Quick e 37 µl de água destilada (DW). O DNA foi amplificado pelo programa de PCR recomendado pelo kit para apenas 18 ciclos.
[0472]Após a conclusão da reação de PCR, a mistura foi digerida com a enzima DpnI fornecida com o kit (Agilent Technologies) por 2 a 3 horas a 37 °C e executada em um gel para verificar a presença de produto de PCR amplificado.
Posteriormente, 2,5 a 5 µl de produto de PCR foram transformados na cepa E.coli NEB5α. Os plasmídeos recombinantes de 4 a 6 colônias foram então isolados e a sequência verificada como descrito na seção de conjunto de Gibson acima.
[0473]Construção e verificação de cepa de expressão (AXID): Para preparar cepas de produção de AXID, células hospedeiras de E. coli W3110B60 quimicamente competentes foram transformadas com DNA de plasmídeo de sequência verificada (50 ng), as células recombinantes foram selecionadas em 2xYT + 1 % de placas de ágar de glicose contendo 50 µg/mL de sulfato de canamicina (Sigma, cat # K0254) e incubadas durante a noite a 37 °C. Uma única colônia da placa de transformação fresca foi então propagada três vezes em 2xYT + 1 % de placas de ágar de glicose contendo 50 µg/mL de sulfato de canamicina por estrias triplas sequenciais e incubação durante a noite a 37 °C. Finalmente, uma única colônia da placa de terceira linha foi inoculada em 20 mL de Super Broth (Fisher-OptigrowTM, # BP1432-10B1) contendo 50 µg/mL de sulfato de canamicina (Sigma, cat # K0254) e incubada durante a noite a 37 °C e 250 rpm. A cultura crescida durante a noite foi então diluída com glicerol para uma concentração final de glicerol de 20 % (p/v) (KIC, Ref # 67790- GL99UK). Esta suspensão de células foi então dispensada em alíquotas de 1 mL em vários criotubos e congelada a -80 °C como frascos de cepas de produção de AXID.
[0474]Após a geração de frascos de glicerol das cepas de produção de AXID, conforme descrito acima, elas foram validadas por sequenciamento de DNA e caracterização fenotípica de marcadores de resistência a antibióticos. Para confirmar que o frasco da cepa de produção de AXID tinha o plasmídeo correto no hospedeiro de produção, a sequência do plasmídeo foi verificada. Vinte mL de LB contendo 50 µg/mL de sulfato de canamicina foram inoculados com uma punção de um frasco de glicerol do clone AXID e cultivados a 37 °C, 250 rpm durante a noite. O DNA de plasmídeo foi isolado usando Kit de Mini-preparação Qiagen (#27104) e a presença de GOI ORF intacta no plasmídeo isolado foi confirmada por sequenciação de DNA (Eton Biosciences, CA).
[0475]Para verificar ainda mais o genótipo da cepa das cepas de produção de AXID, as células do mesmo frasco foram semeadas em quatro placas separadas de LB: LB contendo 50 µg/mL de sulfato de canamicina, LB contendo 15 µg/mL de tetraciclina, LB contendo 34 µg/mL de Cloranfenicol e LB contendo 75 µg/mL de Trimetoprim. Eles foram então verificados quanto ao crescimento positivo em todas essas placas, como esperado com o genótipo da cepa da cepa hospedeira de produção W3110B60.
[0476]Sistema de expressão: s sequências de DNA otimizadas por códons de aminoácidos e E. coli que codificam hIL-2 são mostradas nas Tabelas 1 e 2. Um sistema de tradução introduzido que compreende um tRNA ortogonal (O-tRNA) e uma aminoacil tRNA sintetase ortogonal (O-RS) é usado para expressar hIL-2 contendo um aminoácido codificado de forma não natural (consultar mapa de plasmídeo pKG0269; Figura 2). O O-RS aminoacila preferencialmente o O-tRNA com um aminoácido codificado de forma não natural. Por sua vez, o sistema de tradução insere o aminoácido codificado de forma não natural em variantes de IL-2 ou IL-2, em resposta a um códon seletor codificado. Sequências de O-RS e O-tRNA adequadas são descritas em WO2006/068802 intitulado “Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof” e WO2007/021297 intitulado “Compositions of tRNA and Uses Thereof”, que são incorporados por referência em sua totalidade neste documento.
[0477]A transformação de E. coli com plasmídeos contendo a sequência polinucleotídica variante de IL-2 modificada e o par de aminoacil tRNA sintetase/tRNA ortogonal (específico para o aminoácido codificado não naturalmente desejado) permite a incorporação específica do sítio de não aminoácido codificado naturalmente no polipeptídeo de IL-2. A expressão de polipeptídeos variantes de IL-2 está sob o controle do promotor T7 e induzida pela adição de arabinose no meio (consultar o mapa de plasmídeo pKG0269; Figura 2).
[0478]Supressão com para-acetil-fenilalanina (pAF): Os plasmídeos para a expressão de polipeptídeos de IL-2 são transformados em células W3110B60 de E.
coli. Para-acetil-fenilalanina (pAF) é adicionada às células, e a expressão da proteína é induzida pela adição de arabinose. A análise SDS-PAGE da expressão do polipeptídeo de IL-2 é realizada, os polipeptídeos de IL-2 são observados. As pistas são executadas para comparação entre o polipeptídeo de IL-2 de tipo selvagem original; e para os polipeptídeos de IL-2 substituídos com pAF, uma IL-2 com, por exemplo, uma substituição para-acetilfenilalanina feita em um determinado resíduo de aminoácido. A expressão da polimerase T7 está sob controle de um promotor de bacteriófago T7 indutível por arabinose. Para-acetil-fenilalanina (pAF) é adicionada às células, e a expressão da proteína é induzida pela adição de arabinose (0,2 % final).
As culturas são incubadas por algumas horas (3 a 5 horas) a 37 °C.
[0479]Construções adicionais para aumentar a expressão de hIL-2 em E. coli: Para aumentar a produção de hIL-2 em E. coli, os seguintes parâmetros de expressão podem ser otimizados além da otimização da sequência de DNA com base no uso do códon de E. coli aqui relatado: Testar diferentes promotores além do promotor do bacteriófago T7, tais como arabinose B (araB), pTrc e promotores do bacteriófago T5; Estabilização de mRNA de hIL-2; Seleção de diferentes cepas hospedeiras de E. coli além da cepa padrão W3110B60; Otimização dos parâmetros do processo de produção como temperatura, meio de cultura, concentração do indutor etc.; Otimização de elementos de controle da transcrição e tradução, como códons de partida e parada, sítio de ligação ao ribossomo (RBS), terminadores da transcrição, etc; Otimização do número de cópias do plasmídeo e da estabilidade do plasmídeo; Otimização da região de iniciação translacional (TIR).
[0480]Exemplo 3 - Este exemplo detalha o teste de expressão em frasco de agitação de E. coli e a fermentação de alta densidade celular.
[0481]Teste de expressão em frasco agitado: A cepa de produção de AXID conforme descrito acima foi usada para testar a expressão de hIL-2 em experimentos em frasco agitado. Resumidamente, um inóculo do frasco de glicerol AXID foi colocado em 5 mL de meio Super Broth (Fisher-OptigrowTM, # BP1432-10B1) contendo 50 μg/mL de sulfato de canamicina (Sigma, MO) e cultivado durante a noite a 37 °C com agitação. A cultura noturna foi diluída 1:100 em meio Super Broth (Fisher-OptigrowTM, # BP1432-10B1) contendo 50 μg/mL de sulfato de canamicina (Sigma, MO) e cultivada a 37 °C com agitação. Quando a densidade da cultura atingiu uma OD600 de 0,6 a 0,8, ela foi induzida com 0,2 % de arabinose e pAF adicionado seguido pela colheita após várias horas (geralmente 3 a 5 horas) de produção. Uma alíquota das células colhidas foi retirada e analisada por SDS-PAGE. A expressão ótima de hIL-2 foi padronizada pela variação da temperatura, duração da indução e concentração do indutor. A imunotransferência de extratos brutos com anticorpos monoclonais padrão contra hIL-2 confirmou ainda a expressão de hIL-2, (Figura 3A) de acordo com o seguinte ensaio Western usado para analisar a expressão de hIL2: Os sedimentos celulares coletados foram normalizados para OD600 de 5 e dissolvidos na quantidade calculada de solução B-PER (ThermoFisher) com lisozima (100 µg/ml) e DNase 1 (1 U/ml). As pelotas foram misturadas agitando em vórtice 2 a 5 minutos a alta velocidade e incubando a mistura a 37 °C, 250 rpm. As amostras foram misturadas com o tampão de amostra (4 X) e o agente redutor de amostra (10 x), fornecidos pelo fabricante, ajustando a concentração final para 1 x. Total de 20 µl de amostras foi carregado em um gel de poliacrilamida pré-moldado (ThermoFisher) junto com o padrão hIL2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) e a separação por eletroforese realizada em tampão MES 1 x (ThermoFisher). As amostras de proteína foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando aparelho iBlot e pilhas de transferência de gel. A hIL2 foi capturada pelo antígeno de cabra anti-IL-2 humana (R&D Systems) e detectada por anticorpo secundário IgG anti-cabra conjugado com HRP (R&D Systems) com substrato colorimétrico opti 4CN (Bio-Rad, Hercules, CA)).
[0482]Fermentações de alta densidade celular: O processo de fermentação para a produção de hIL-2 consiste em duas etapas: (i) preparação do inóculo e (ii) produção do fermentador. O inóculo é iniciado a partir de um único frasco de glicerol, descongelado, diluído 1:1000 (v/v) em 50 mL de meio de semente definido em um frasco Erlenmeyer com defletor de 250 mL e incubado a 37 °C e 250 rpm. Antes de usar, o fermentador é limpo e autoclavado. Uma quantidade especificada de meio basal é adicionada ao fermentador e esterilizada a vapor. Quantidades especificadas de solução de sulfato de canamicina, meio de alimentação e antiespumante P2000 são adicionados ao meio basal antes da inoculação. Todas as soluções adicionadas ao fermentador após a autoclavagem são filtradas por 0,2 µm ou autoclavadas antes da adição asséptica.
[0483]O fermentador é misturado com 4 L de meio quimicamente definido que utiliza glicerol como fonte de carbono. A cultura de semente é adicionada ao fermentador para uma OD600nm inicial de 0,05. O oxigênio dissolvido é mantido a 30 % de saturação de ar usando agitação de 480 a 1200 rpm e enriquecimento de oxigênio com uma pressão de cabeça de 6 psig e fluxo de ar de 5 slpm. A temperatura e o pH são controlados a 37 °C e 7,0, respectivamente. Quando a cultura atinge uma OD600nm de 35 ± 5, a alimentação começa a uma taxa de 0,25 mL/L/min.
Consequentemente, L-Ala-pAcF, (também denominado como L-Ala-pAF), dipeptídeo é adicionado a 0,4 g/L. Quinze minutos após a adição do dipeptídeo, a cultura é induzida com L-arabinose em uma concentração final de 2 g/L. A cultura é colhida 6 horas após a indução.
[0484]Análise de título de fase reversa-HPLC: 1,0 mL de amostras de fermentação de E. coli (pasta de células) foram primeiro secas e pesadas para determinar a massa para preparação da amostra. O Reagente de Bioprocessamento de Lisonase (EMD Millipore #71230) e o Reagente de Benzonase Nuclease (EMD Millipore # 70664) foram cada um diluídos 1:500 em Reagente de extração de proteína BugBuster (EMD Millipore # 70584) e usado para lise química da pasta celular. 1,0 mL da mistura Bugbuster-Lisonase-Benzonase foi adicionada a 1,0 mL de pasta de células secas e a mistura resultante foi agitada vigorosamente em vórtice. A mistura foi então colocada num agitador Eppendorf Thermomixer R durante 20 minutos a 22 °C com agitação a 1000 rpm. Após a incubação, o lisado celular foi centrifugado a
16.050 rcf por 5 minutos para sedimentar os resíduos celulares. Uma alíquota de 200 µL do sobrenadante do lisado celular foi então filtrada através de um filtro centrífugo de PVDF de 0,22 µm (EMD Millipore # UFC30GVNB) a 16.050 rcf por 1 minuto. O produto filtrado foi então analisado por cromatografia de fase reversa para determinar a quantidade de hIL2 presente nas amostras de fermentação. Uma coluna de fase reversa de 4,6 x 150 mm Zorbax 300SB-C3 (Agilent # 863973-909) cheia com partículas de 3,5 µm foi usada para separar hIL2 dos contaminantes de proteína da célula hospedeira. A fase móvel A foi usada para ligar hIL2 contendo 0,1 % de trifluoroacético em água. A fase móvel B contendo 0,1 % de ácido trifluoroacético em acetonitrila foi usada para eluir hIL2 da coluna. A quantidade de hIL2 na amostra foi determinada comparando a contagem de área observada a partir de um volume de injeção fixo com a equação de linha obtida a partir de uma curva padrão gerada usando hIL2 purificada. Várias das variantes de IL-2 âmbar testadas, como exemplificado na Figura 3B, mostraram expressão de alto título variando de cerca de 65 a 150 mg/L, em fermentação de E. coli de alta densidade celular.
[0485]Exemplo 4 - Este exemplo detalha a preparação de corpos de inclusão, redobramento, purificação e PEGuilação.
[0486]Preparação de corpos de inclusão e solubilização: As pastas celulares colhidas da fermentação de alta densidade celular são ressuspensas por mistura para um sólido final de 10 % em corpo de inclusão (IB) com Tampão I a 4 °C (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; Triton X-100 a 1 %; 4 °C). As células são lisadas passando o material ressuspenso por um microfluidizador um total de duas vezes. As amostras são então centrifugadas (14.000 g; 15 minutos; 4 °C), e os sobrenadantes são decantados. Os sedimentos do corpo de inclusão são lavados por ressuspensão em um volume adicional de tampão IB I (50 mM Tris pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; Triton X-100 a 1 %; 4 °C), e os materiais ressuspensos são passou pelo microfluidizador um total de duas vezes. As amostras são então centrifugadas (14.000 g; 15 minutos; 4 °C), e os sobrenadantes são decantados. Os sedimentos de corpos de inclusão são cada um ressuspensos em um volume de tampão II (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; 4 °C). As amostras são centrifugadas (14.000 g; 15 minutos; 4 °C), e os sobrenadantes são decantados. Os sedimentos do corpo de inclusão são ressuspensos em ½ volume de tampão II (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; 4 °C). Os corpos de inclusão são então divididos em alíquotas em recipientes apropriados. As amostras são centrifugadas (14.000 g; 15 minutos; 4 °C) e os sobrenadantes decantados. Os corpos de inclusão foram solubilizados ou armazenados a -80 °C até o uso posterior.
[0487]Os corpos de inclusão são solubilizados a uma concentração final entre 10 a 15 mg/mL em tampão de solubilização (Tris 20 mM, pH 8,0; Guanidina 8 M; β- ME 10 mM). Os corpos de inclusão solubilizados são então incubados à temperatura ambiente sob mistura constante durante 1 hora ou até totalmente solubilizados. As amostras são então centrifugadas (10.000 g; 20 minutos; 4 °C) para remover qualquer material não solubilizado. A concentração de proteína de cada amostra é então ajustada por diluição com tampão de solubilização adicional se a concentração de proteína for alta.
[0488]Redobramento e purificação: O redobramento é realizado diluindo as amostras para uma concentração final de proteína de 0,5 mg/mL em Tris 20 mM, pH 8,0; 60 % de sacarose; 4 °C. O redobramento é permitido por 5 dias a 4 °C. O material redobrado é diluído 1:1 com Milli-Q H2O. O material é filtrado através de um filtro PES de 0,22 µm e carregado em uma coluna Blue Sepharose FF (GE Healthcare) equilibrada em Tris 20 mM, pH 8,0; NaCl 0,15 M (tampão A). Em fluxo ascendente, a coluna é lavada com 5 volumes de coluna de tampão B a 30 % (Tris 20 mM, pH 8,0; NaCl 2 M; 50 % de etilenoglicol). Os polipeptídeos de IL-2 são eluídos por lavagem da coluna com 10 volumes de coluna de tampão B 100 %.
[0489]PEGuilação e purificação pós-PEGuilação: O pool de IL-2 é retirado e diluído 10X com água Milli-Q. O pH de cada amostra é ajustado para 4,0 com ácido acético glacial a 50 %. As amostras são concentradas até ~ 1,0 mg/mL. PEG ativado em excesso molar de 1:12 (PEG de hidroxilamina) é adicionado a cada amostra. As amostras são então incubadas a 27 °C por 48 a 72 horas. As amostras são retiradas e diluídas 8 a 10 vezes com água (< 8 m/S) e carregadas sobre uma coluna SP HP (GE Healthcare) equilibrada em Tampão A (NaAc50 mM, pH 6,0; NaCl 50 mM; Zwittergent 3 a 14 a 0,05 %). Os polipeptídeos de IL-2 são eluídos com 5 volumes de coluna de tampão B (NaAc 50 mM, pH 6,0; NaCl 500 mM; Zwittergent 3 a 14 a 0,05 %. As porções de IL-2 são reunidas e corridas em uma coluna de dimensionamento Superdex 200 equilibrada em tampão de armazenamento de IL-2 (NaAc 20 mM, pH
5,0; NaCl 150 mM; Zwittergent 3 a 14 a 0,05 %). O material PEGuilado é coletado e armazenado a 4 °C.
[0490]Exemplo 5 - Este exemplo detalha a purificação de IL-2 de E. coli e sistemas de expressão de mamíferos. Este Exemplo também descreve PEGuilação, conjugação específica de sítio e Processo de Purificação de PEG-IL-2.
[0491]Preparação a partir de Preparação de corpos de inclusão de E. coli: os corpos de inclusão de IL-2 foram isolados através de uma série de etapas de lavagem.
A pasta de células congeladas foi ressuspensa em tampão de lavagem I (Tris 50 mM, pH 8,0; triton X-100 a 1 %; Ureia 1 M, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM) a uma concentração de 10 % (P/V) e homogeneizada a 4 °C seguida de centrifugação (15.000 g, 30 minutos, 4 °C). O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento do corpo de inclusão foi ressuspenso em tampão de lavagem II (Tris 50 mM, pH 8,0; triton X-100 a 1 %; ureia 1 M, EDTA 5 mM). Os corpos de inclusão ressuspensos foram centrifugados a 15.000 g durante 30 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento do corpo de inclusão foi ressuspenso em tampão de lavagem III (Tris 50 mM, pH 8,0; desoxicolato de sódio, EDTA 5 mM). Os corpos de inclusão ressuspensos foram centrifugados a
15.000 g durante 30 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e o sedimento de corpo de inclusão foi ressuspenso em água seguido por centrifugação a 15.000 g por 30 minutos a 4 °C. Os corpos de inclusão lavados foram armazenados a -80 °C até o uso posterior.
[0492]Redobrar: os corpos de inclusão de IL-2 foram solubilizados por ressuspensão em água e ajuste do pH da mistura para pH 12,2. O material insolúvel foi removido por centrifugação (12.000 g, 15 minutos). A IL-2 solubilizada foi redobrada ajustando o pH para pH 8,8 ± 0,2. A formação adequada da ligação dissulfeto foi facilitada pela adição de cistina 50 µM à reação de redobramento. A reação de redobramento foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 16 a 22 horas.
Os contaminantes da célula hospedeira foram precipitados ajustando a reação de redobramento para pH 6,8 com ácido clorídrico. O precipitado foi removido por centrifugação (12.000 g, 15 minutos) e o sobrenadante clarificado foi ajustado para pH 7,8 com hidróxido de sódio e 0,22 μm filtrado.
[0493]Purificação da coluna: A IL-2 redobrada foi carregada sobre uma coluna Capto Adhere Impres (GE Healthcare) equilibrada em tampão A (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,8). Após o carregamento, a coluna foi lavada com tampão A (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,8) e a IL-2 foi eluída da coluna usando um gradiente de pH linear para tampão B 100 % (fosfato de sódio 20 mM, ácido cítrico 20 mM, pH 4,0) durante 20 volumes de coluna. As porções contendo IL-2 foram coletadas, o pH foi ajustado para 4,0 com ácido acético a 10 % e, em seguida, o tampão foi trocado por acetato de sódio 20 mM, trealose 2,5 %, pH 4,0. A IL-2 foi concentrada para 1 a 10 mg/mL, 0,22 µM filtrada e armazenada a -80 °C.
[0494]Purificação de IL-2 a partir do Sistema de Expressão Eucariótico: O meio de cultura celular contendo IL-2 marcada com His foi ajustado para pH 7,8 com hidróxido de sódio e carregado em uma coluna Ni Excel (GE Healthcare) equilibrada em fosfato de sódio 20 mM, pH 7,8. Após o carregamento, a coluna foi lavada com tampão A (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,8) seguido por tampão de lavagem B (fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 1,0 M, imidazol 30 mM, pH 7,8) para remover contaminantes da célula hospedeira. A IL-2 foi eluída da coluna com tampão de eluição (fosfato de sódio 10 mM, imidazol 300 mM, pH 7,8) e a fração contendo IL-2 foi reunida. O material reunido com IL-2 foi carregado em uma coluna Capto Adhere Impres (GE Healthcare) equilibrada em tampão A (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,8).
Após o carregamento, a coluna foi lavada com tampão A (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,8) e a IL-2 foi eluída da coluna usando um gradiente de pH linear para tampão B 100 % (fosfato de sódio 20 mM, ácido cítrico 20 mM, pH 4,0) durante 20 volumes de coluna.
As frações contendo IL-2 foram coletadas, o pH foi ajustado para 4,0 com ácido acético a 10 % e o tampão trocado por acetato de sódio 20 mM, trealose 2,5 %, pH
4,0. A IL-2 foi concentrada para 1 a 10 mg/mL, 0,22 µM filtrada e armazenada a -80 ° C até uso posterior.
[0495]Conjugação específica do sítio e purificação de PEG-IL-2: variantes de IL-2 contendo aminoácido não natural (nnAA), para-acetil fenilalanina foram trocados por tampão de conjugação (acetato de sódio 20 mM, pH 4,0) e concentrados para 1 a 10 mg/mL. Um final de hidrazida acética 100 mM foi adicionado às reações seguido por um excesso molar de 10 de PEG funcionalizado com aminooxi. As reações de conjugação foram incubadas durante 18 a 20 horas a 25 a 30 °C. Após a conjugação, a IL-2 PEGuilada foi diluída 1:10 com acetato de sódio 20 mM, pH 5,0 e carregada em uma coluna Capto SP Impres. Após o carregamento, a coluna foi lavada com tampão A (acetato de sódio 20 mM, pH 5,0) e a IL-2 PEGuilada foi eluída da coluna usando um gradiente linear para tampão B 100 % (acetato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 1,0 M, pH 5,0) mais de 20 volumes de coluna. As frações contendo IL-2 PEGuilada foram coletadas e o tampão trocado por fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 100 mM, trealose 2,5 %, pH 7,0. A IL-2 foi concentrada para 1 a 2 mg/mL, 0,22 µM filtrada e armazenada a -80 °C até uso posterior.
[0496]Ensaio de ligação de IL-2/CD-25 por interferometria de bicamada: Os experimentos de cinética de ligação de multi-concentração de IL-2/CD25 foram realizados em um instrumento Octet RED96 (PALL/ForteBio) a 30 °C. Biossensores de captura de Fc anti-humano (PALL/ForteBio, cat # 18-5063) foram carregados com proteína de fusão CD25-Fc purificada em 1X HBS-P + Buffer (GE Healthcare, cat # BR-1008-27). Níveis de imobilização entre 0,8 nm e 1,0 nm foram alcançados. Os biossensores carregados foram lavados com tampão 1X HBS-P + para remover qualquer proteína não ligada antes de medir a cinética de associação e dissociação.
Para monitoramento da fase de associação, as amostras de analito de IL-2 foram diluídas com tampão 1X HBS-P + e transferidas para placas de 96 poços totalmente pretas (Greiner Bio-One, cat # 655209). As amostras de IL-2 ligaram-se a biossensores carregados com CD25-Fc durante 60 segundos. A fase de dissociação foi registrada em poços de uma placa de 96 poços preto sólido contendo tampão 1X HBS-P + por 90 segundos. Os dados foram referenciados usando uma subtração de branco de buffer paralelo, e a linha de base foi alinhada ao eixo y e suavizada por um filtro Savitzky-Golay no software de análise de dados Octet versão 10.0 (PALL/ForteBio). Os sensorgramas cinéticos processados foram ajustados globalmente usando o modelo de Langmuir que descreve uma estequiometria de ligação 1:1 (Figura 4A).
[0497]Exemplo 6 - Este exemplo detalha a clonagem e a expressão de uma IL-2 incluindo um aminoácido codificado não naturalmente no sistema de mamífero.
Este exemplo também descreve métodos para avaliar a atividade biológica de IL-2 modificada.
[0498]Preparação de variantes de IL-2 em células de mamíferos. A IL-2 humana natural é uma proteína glicosilada que tem glicosilação ligada à O em Thr-3 (Conradt et al., Eur J Biochem, 153 (2): páginas 255-61 (1985)). Embora tenha sido demonstrado que a IL-2 não glicosilada tem atividades semelhantes à IL-2 glicosilada, a IL-2 humana glicosilada demonstrou ter melhor atividade em termos de crescimento clonal e propagação a longo prazo de células T humanas ativadas. Existem também alguns relatórios sugerindo que a IL-2 natural tem atividades específicas mais elevadas. É também sugerido que a expressão de IL 2 em células de mamíferos tem vantagens sobre a sua expressão em E. coli (Kim et al., J Microbiol Biotechnol, 14 (4), 810-815 (2004)). Na presente invenção, a IL-2 de tipo selvagem e as suas várias muteínas concebidas acima, Tabelas 1 e 2, respectivamente, podem ser produzidas em células CHO (como descrito nos Exemplos aqui apresentados).
[0499]Para produzir muteínas de IL-2 que contêm aminoácidos não naturais na posição desejada, cada muteína é produzida em um pool estável ou linha celular estável que é derivada de linhas celulares de plataforma transfectadas que contêm um par de tRNA/tRNA sintetase ortogonal projetado Tian et al., Proc Natl Acad Sci USA, 111 (5): páginas 1766-71 (2014)) e PCT/2018US/035764: cada um aqui incorporado por referência na sua totalidade. Resumidamente, as células CHOK1 foram projetadas para serem linha(s) de células de plataforma que expressam estavelmente tRNA sintetase (O-RS) ortogonal proprietária e seu tRNA supressor de âmbar cognato (O-tRNA) para incorporação eficiente de um aminoácido não natural, por exemplo, pAF, em proteínas terapêuticas, tais como IL-2, por exemplo, em células CHO. A linha de células de plataforma foi então pré-adaptada para crescimento em suspensão para rápida progressão em biorreatores. A linha de células de plataforma foi bem caracterizada e evoluiu com eficiência aprimorada de incorporação de aminoácidos não naturais e eficiência de seleção de clones. A linha de células de plataforma é usada como células parentais para produzir proteínas terapêuticas incorporadas com aminoácidos não naturais por expressão transitória rápida e eficiente com título superior a 100 mg/L para uso em pesquisa em estágio inicial. A transfecção transitória e a geração de pool estável são conduzidas para avaliar a expressão de moléculas candidatas e fornecer material para ensaio funcional para identificar a molécula principal. As linhas de células de produção são geradas para produzir proteínas de IL-2 incorporadas com aminoácidos não naturais por transfecção de códon sem sentido âmbar contendo o gene de interesse no sistema de expressão de GS na linha de células de plataforma. A estratégia de desenvolvimento de linha celular estável é implementada para obter linha celular de produção com 5 a 10 PCD em 3 a 4 meses e 20 a 30 PCD em 6 meses usando a linha celular de plataforma como células parentais.
[0500]Na presente invenção, o cDNA da IL-2 humana (NM_000586.3) com suas sequências de peptídeos de sinal natural foi sintetizado e clonado em um vetor de expressão de mamífero contendo marcador de seleção GS (Figura 4B). Como mostrado na Tabela 1, o cDNA da IL-2 humana de tipo selvagem clonado mantém suas sequências de DNA originais de cada aminoácido sem quaisquer mutações. Em contraste, durante a geração de variantes de IL-2, (Tabela 2), cada uma das 15 muteínas tem uma posição única que foi mutada em um códon de parada âmbar (TAG), que pode ser suprimido e expresso em células modificadas para produzir nnAA contendo proteínas.
[0501]Estabelecimento de células CHO projetadas para serem utilizadas para a expressão de variantes de IL-2. As células CHO projetadas foram derivadas de nocaute de gene de células de plataforma proprietárias previamente estabelecidas (PCT/2018US/035764, incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Resumidamente, uma ferramenta de localização de alvos baseada na web, CRISPy, foi usada para identificar rapidamente sequências alvo de gRNA de preferência nos exões iniciais com zero fora do alvo nas células CHO-K1. Os gRNAs foram clonados no vetor de expressão de mamífero pGNCV que coexpressa com a versão otimizada por códons CHO de Cas9. Uma linha de células de produção foi transfectada com vetor de expressão de proteína para gerar um pool de células seguido por clonagem para identificar isolados de células individuais com o nocaute de gene. A frequência indel (inserção/exclusão) de resultados compostos de vários projetos foi de 30 a 90 % e 50 a 80 % para o pool de células e isolados de células individuais, respectivamente. CRISPR foi usado para nocautear o gene alvo em células CHO. Especificamente, para aumentar a estabilidade do mRNA de IL-2, o gene UPF1 foi eliminado usando a tecnologia CRISPR. Os gRNAs usados no nocaute são mostrados na Figura 5. Após a triagem de 192 clones, duas linhas de células UPF1- KO foram obtidas e verificadas por sequenciamento para ter nocaute UPF1 (Figura 6).
As linhas de células UPF1-KO obtidas foram então usadas para expressar transitoriamente variantes de IL-2.
[0502]Expressão transitória de IL-2 em células CHO manipuladas. As variantes de IL-2 foram expressas transitoriamente em linhas de células UPF1-KO obtidas como divulgado no Exemplo acima. A transfecção foi feita com eletroporação usando o kit Amaxa para células em suspensão (Lonza). 6 µg de plasmídeo preparado como divulgado no Exemplo acima, foram transfectados em 2 x 106 células CHO manipuladas. Após a transfecção, as células foram incubadas a 37 °C durante 4 dias antes da análise do título por ELISA usando um kit comercial da Invitrogen (Carlsbad, CA). Como mostrado nas Figuras 7A e 7B, a variante F42 exibe o nível de expressão mais alto entre 15 variantes durante a expressão transitória.
[0503]Teste de expansão de células T de variantes de IL-2 em células CTLL-
2. O ensaio de expansão de células CTLL-2 foi realizado usando sobrenadante variante F42 expresso transitoriamente de células CHO transfectadas. Durante o ensaio de proliferação celular, a IL-2 de tipo selvagem foi usada como um controle de 100 % de proliferação (mostrado na Figura 8). A variante F42 foi preparada em diluições em série no ensaio, 10 ng/mL, 3,33 ng/mL, 1,11 ng/mL, 0,37 ng/mL, 0,12 ng/mL e 0,04 ng/mL. A proliferação celular foi realizada usando Cell Titer Glo (Promega, WI). O sinal luminescente foi lido no TECAN genios pro. Conforme mostrado na Figura 8, F42 mostrou um EC50 em torno de 0,24 ng/mL, mantendo 95 % da função em comparação com seu controle de tipo selvagem. Um procedimento geral para estudar as variantes de IL-2 da presente invenção é mostrado a seguir: 15 sítios para Expressão de Ensaio funcional Pré-clínico triagem de proteínas de in vitro CMC muteínas pools estáveis Análise de Eficácia 2 candidatos formulação de cinética in vivo superiores PEGuilação purificação Um procedimento geral no estudo de eficácia de muteínas de IL-2 PEGuiladas com aminoácidos não naturais
[0504]Exemplo 7 - Triagem de variantes de IL-2 por expansão de células CTLL-2
[0505]Utilizando um ensaio de expansão de células CTLL-2 conforme divulgado nos Exemplos, 20 variantes diferentes de IL-2 incluindo 16 locais originalmente selecionados (tipo selvagem incluído) e 4 sítios adicionais (K32, K48, K49, K76) conhecidos na técnica foram selecionados (Charych, D., et al., PLoS One, 12 (7): p. e0179431, 2017). Conforme mostrado na Figura 9 e na Tabela 3, a maioria das variantes mantiveram suas atividades após a mutagênese. Devido à natureza das células CTLL-2 com expressão residual de IL-2Rα, as variantes com mutagênese tendo a menor ligação a células CTLL2 ainda exibiam alguma ligação inerente a IL- 2Rα, embora fosse mínima. Por exemplo, foi observado que a variante P65 IL-2, que exibiu a menor ligação a IL-2Rα, mostrou alguma ligação inerente enviesada a IL-2Rα.
As variantes identificadas foram ainda analisadas quanto às suas capacidades de ligação após PEGuilação.
[0506]Tabela 3. Atividade de variantes de IL-2 usando ensaio de proliferação de CTLL2 variantes de IL-2 EC50 (nM) WT 1,96 T3 1,86 K32 0,27 K35 2,39 T37 1,64 R38 1,67 F42 8,70 K43 0,17 F44 0,37 Y45 1,87 K48 2,87 K49 3,93 E61 1,17 E62 1,98 K64 4,09 P65 13,90 E68 1,73
L72 2,45 K76 0,29 Y107 1,60
[0507]Exemplo 8 - Análise de variantes selecionadas com ensaio de ligação in vitro
[0508]Uma análise das variantes selecionadas P65, Y45, E61, F42, K35, K49 e T37 foi conduzida usando um ensaio de ligação in vitro, ensaio de interferometria de bicamada, conforme descrito nos exemplos acima. Cada uma das variantes foi conjugada com PEG 20K em seus sítios específicos, respectivamente. As variantes PEGuiladas foram então analisadas por ensaio BLI (Bio-Layer Interferometry) descrito em outro lugar nos Exemplos. Como mostrado nas Figuras 10A a 10C, as variantes PEGuiladas foram testadas no Octet quanto à sua ligação a IL-2Rα. A IL-2 do tipo selvagem foi usada como um controle positivo nos ensaios. Após a PEGuilação, a maioria das variantes mostrou uma ligação dramaticamente reduzida a IL-2Rα entre 92,9 % e 99,9 %. Entre as variantes PEGuiladas testadas, P65 e Y45 mostraram mais de 99 % de atividade bloqueada, Tabela 4.
Tabela 4. Atividade de ligação in vitro de variantes de IL-2 variantes de IL- Estado estacionário Kd Ligação ao bloqueio de IL-2Rα 2 (nM) IL-2 WT 11 0% P65-PEG20K 32000 99,9 % Y45-PEG20K 1900 99,4 % E61-EPG20K 1400 99,0 % F42-PEG20K 1100 99,0 % K35-PEG20K 840 98,7 % K49-PEG20K 180 93,8 % T37-PEG20K 155 92,9 %
[0509]Exemplo 9 - Análise de variantes selecionadas com ensaio de Dimerização PathHunter
[0510]Para encontrar o melhor sítio para a conjugação de PEG, foi utilizado um ensaio de dimerização PathHunter desenvolvido por DiscoverX (Fremont, CA). Em geral, o sistema de ensaio usa receptores de IL-2 expressos exogenamente que foram projetados para ter domínios de ligação complementares de uma enzima para dar origem a um sinal quimioluminescente, uma vez que receptores previamente separados são ativados após dimerização por moléculas de IL-2 adicionadas, (Figura 11) Duas linhas de células foram geradas em células U2OS. Uma linha celular expressa três receptores, IL-2Rα, IL-2Rβ e IL-2Rγ. A outra linha celular expressa IL- 2Rβ e IL-2Rγ. Uma razão de valores de EC50 de ligação (EC50-βγ/EC50-αβγ) de cada variante é usada para estimar sua capacidade de ligação retida relativa. Como mostrado na Tabela 5, a melhor variante possível tem um valor de 1, o que significa que 100 % de sua capacidade de ligação βγ é retida enquanto a ligação α é 100% bloqueada. Como observado, a variante Y45-BR4, (variante Y45 com um PEG 4 ramificado 20 K conjugado) e P65-PEG20K, (variante P65 com um PEG 20 K linear conjugado), mostraram os valores mais baixos, indicando que essas duas variantes PEGuiladas iriam ser os melhores candidatos para uma avaliação posterior.
[0511]Tabela 5. Atividade de ligação de variantes de IL-2 usando ensaio de dimerização - Expt. 1 Composto βγ EC50 (nM) αβγ EC50 (nM) Razão de βγ/αβγ Melhor possível 0,41 0,41 1 Y45-BR4 5,69 1,18 5 P65-PEG20K 7,40 1,51 5 Y45-BR2 6,10 0,46 13 IL-2 WT 0,41 0,02 25 E61-PEG20K 3,78 0,02 168 Y45-PEG20K 5,50 0,03 206
[0512]Como mostrado na Tabela 6, em um experimento adicional conduzido, variante P65-BR4. (variante P65 com um conjugado de PEG ramificado 4 de 20K), e
P65-BR2. (variante P65 com um conjugado de PEG ramificado 2 de 20K) foram também selecionados como candidatos para avaliação adicional, além das variantes Y45-BR4 e P65-PEG20K.
[0513]Tabela 6. Atividade de ligação melhorada de variantes de IL-2 usando ensaio de dimerização - Expt. 2 Composto βγ EC50 (nM) αβγ EC50 (nM) Razão de βγ/αβγ Melhor possível 0,41 0,41 1 P65-BR4 8,50 4,86 1,75 P65-BR2 13,06 4,80 2,96 Y45-BR4 3,67 0,84 4,31 P65-PEG20K 5,21 1,10 5,06 Y45-BR2 3,39 0,40 8,34 IL-2 WT 0,41 0,03 16,67 Y45-PEG20K 2,34 0,04 30,87 Exemplo 10 - Ensaio de pSTAT5 ex vivo de variantes de IL-2
[0514]Para avaliar ainda mais a função in vitro de variantes PEGuiladas, um ensaio ex vivo usando PBMCs foi empregado. Conforme mostrado na Figura 12, a ligação de IL-2 aos seus receptores desencadeou aumento da fosforilação de STAT5 (pSTAT5). Portanto, a detecção dos níveis de pSTAT5 seria um índice para a ligação de variantes de IL-2 aos receptores endógenos de IL-2. PBMCs humanos inteiros foram tratados com variantes PEGuiladas selecionadas, tais como Y45-BR2. (variante Y45 com um conjugado de PEG ramificado 2 de 20K), Y45-BR4. (variante Y45 com um conjugado de PEG ramificado 4 de 20 K), e P65-PEG20K, (variante P65 com um PEG de 20K linear), seguido pela separação em duas populações, células T CD8 + e células Treg CD4 +. Como mostrado na Tabela 7, todas as três variantes exibiram atividade muito melhorada em relação à sua capacidade de ligação βγ retida e atividade de ligação α bloqueada. Estes resultados foram ainda apoiados por variantes testadas em um ensaio de pSTAT5 adicional, conforme mostrado na Tabela 8. Os resultados deste ensaio de pSTAT5, (Tabela 8), mostraram que múltiplas variantes tinham atividade dramaticamente melhorada em termos de sua capacidade reduzida de se ligar a células Treg e ligação relativamente mantida a células CD8 +. A razão calculada de CD8 +/Treg é usada na Tabela 8 para indicar a classificação de variantes de modo que os resultados do ensaio PathHunter possam ser comparados diretamente com os resultados do ensaio pSTAT5 por um sistema de classificação semelhante.
[0515]Tabela 7 - Atividade de ligação de variantes de IL-2 usando um ensaio ex vivo - Expt. 1 Composto EC50-CD8 EC50-Treg Atividade Atividade Razão de (nM) (nM) de de (βγ/αβγ) retenção retenção de βγ (%) de αβγ (%) IL-2 WT 0,1346 0,00034 100 100 1,00 Y45-BR2 1,065 0,4504 12,64 0,1 169,87 Y45-BR4 2,714 1,337 4,96 0,03 197,88 P65-PEG20K 9,204 4,179 1,46 0,01 182,38
[0516]Tabela 8 - Atividade de ligação melhorada de variantes de IL-2 usando um ensaio ex vivo - Expt. 2 Composto EC50-CD8(nM) EC50-Treg (nM) Razão de (CD8/Treg) IL-2 WT 0,03377 0,0002857 118,2 Y45-BR2 4,604 36,003 0,13 Y45-PEG20K 3,367 5,377 0,61 P65-BR2 41,467 111,644 0,37 Y45-BR4 7,462 3,398 2,20 P65-PEG20K 10,643 4,514 2,36 P65-BR4 23,961 4,351 5,51
[0517]Exemplo 11 - Crescimento clonal e propagação a longo prazo de células CTLL-2 na presença de IL-2 glicosilada produzida em células CHO de mamífero versus IL-2 não glicosilada produzida em E. coli.
[0518]Foi relatado que a IL-2 humana nativa é uma proteína glicosilada que tem glicosilação ligada à O em Thr-3 (Conradt et al., Eur J Biochem 153 (2): 255-261 (1985)). Em comparação com IL-2 não glicosilada, a função desta glicosilação está relacionada a maior solubilidade em pH fisiológico, depuração mais lenta in vivo e menos imunogenicidade na terapia do câncer (Robb et al., Proc Natl Acad Sci USA 81 (20): 6486- 6490 (1984); Goodson et al., Biotechnology (NY) 8 (4): 343-346 (1990)).
Mais importante, foi demonstrado que a IL-2 glicosilada é superior à IL-2 não glicosilada na promoção do crescimento clonal e propagação a longo prazo de células T humanas aloativadas (Pawelec et al., Immunobiology 174 (1): 67-75 (1987)), sugerindo que a IL-2 glicosilada é uma escolha melhor em aplicações terapêuticas.
[0519]Para analisar ainda mais a função biológica de IL-2 glicosilada e IL-2 não glicosilada, foi realizado um experimento analisando a taxa de crescimento clonal e a frequência de propagação de longo prazo de células CTLL-2 (Figura 13). Células CTLL-2 únicas foram depositadas em placas de 96 poços com uma camada de alimentação pré-revestida de células CF1-MEF irradiadas com y (Fibroblastos Embrionários de Rato) (Thermo Fisher, Waltham, MA, CAT # A34180). Durante 19 dias de crescimento com um único tratamento de várias concentrações (0,005 nM, 0,05 nM, 0,5 nM e 5 nM), de IL-2 de tipo selvagem produzida a partir de células CHO ou E. coli, a porcentagem dos números de colônias cultivadas e a porcentagem de colônias sobreviventes ao final da incubação de 19 dias foi contada e analisada. Como mostrado na Figura 13, (usando tratamento de 0,5 nM como um exemplo), a IL-2 glicosilada mostrou atividade superior na promoção do crescimento clonal do que a IL-2 não glicosilada. Em média, a capacidade da IL-2 glicosilada de promover o crescimento clonal é 2 vezes maior do que a da IL-2 não glicosilada na presença de concentração de IL-2 0,5 nM, que é a condição ideal de cultura de células para crescimento de células CTLL-2. Após incubação de longo prazo (~ 19 dias), a taxa de sobrevivência da colônia do tratamento com IL-2 glicosilada foi 4 vezes maior do que o tratamento com IL-2 não glicosilada. Os dados demonstram claramente que a IL-2 glicosilada tem atividade superior na promoção do crescimento clonal e propagação a longo prazo de células que respondem à IL-2 e ainda apoia suas promissoras aplicações terapêuticas.
[0520]Exemplo 12 - Melhoria de título para expressão de IL-2 em novas linhas de células CHO hospedeiras estáveis
[0521]Muitas abordagens foram tentadas no campo para aumentar a expressão de IL-2 de tipo selvagem e suas variantes em células CHO, (consultar, por exemplo, Kim et al., J Microbiol Biotechnol, 14 (4), 810-815 (2004)). No entanto, o aumento da expressão de proteínas contendo aminoácidos não naturais na indústria foi desafiado pelo relativo baixo rendimento em células de mamíferos. Para resolver este problema na presente invenção, a tecnologia proprietária em linhas de células eucarióticas para melhorar a produção de título de proteína, conforme divulgado em PCT/2018US/035764, (incorporado neste documento por referência em sua totalidade), é utilizada para gerar células de pool estáveis de IL -2 e suas variantes, e está sendo usado para gerar linhas celulares de IL-2 estáveis.
[0522]Resumidamente, descobriu-se que cinco gerações diferentes de linhas de células de plataforma que expressam o nocaute de Bax/Bak melhoraram dramaticamente as expressões de proteínas de IL-2 e aumentaram a produção de proteínas de IL-2 em cerca de 40 % em relação à linha de células parentais. Além da inibição da apoptose nessas células via nocaute de Bax/Bak, descobriu-se que um nocaute de UPF1 melhora ainda mais a expressão de IL-2.
[0523]Tanto a IL-2 de tipo selvagem quanto suas variantes (F42, Y45 e P65) foram testadas gerando pools estáveis delas. Como mostrado na Figura 13, conjuntos estáveis de três variantes de IL-2 F42, Y45 e P65, incluindo IL-2 de tipo selvagem, têm níveis de expressão tremendamente aumentados, em comparação com aqueles na técnica (consultar, por exemplo, Kim et. al., J Microbiol Biotechnol., 14 (4), 810-
815, (2004)), até cerca de 740 mg/L para o tipo selvagem; e até 120 mg/L para a variante F42, (mostrado na Figura 14), após a geração de pools estáveis de cada um.
Os dados mostram que a produção ou rendimento da proteína de IL-2 pode ser melhorado ou aumentado, pela geração de uma nova linha de células CHO com um aminoácido não natural incorporado de forma eficiente. Também sugere que os níveis de expressão e a funcionalidade são especificamente relevantes para o sítio.
[0524]Exemplo 13 - IL-2 variante F42-R38A mostrou bloqueio completo da ligação de IL-2R alfa.
[0525]Conforme divulgado neste documento, as substituições de aminoácidos não codificadas naturalmente serão combinadas com outras adições, substituições ou deleções na IL-2 para afetar outras características biológicas do polipeptídeo de IL-2, incluindo, mas não se limitando a, aumentar a estabilidade (incluindo, mas não se limitando a, resistência à degradação proteolítica) da IL-2 ou aumentar a afinidade da IL-2 para o seu receptor; aumentar a estabilidade farmacêutica da IL-2; aumentar a atividade da IL-2 para a inibição do tumor e/ou redução do tumor; aumentar a solubilidade (incluindo, mas não se limitando a, quando expressa em E. coli ou outras células hospedeiras) da IL-2 ou variantes; aumentar a solubilidade de IL-2 após a expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes; aumentar a solubilidade do polipeptídeo após a expressão em E. coli ou outras células hospedeiras recombinantes; que modula a afinidade para o receptor de IL-2, proteínas de ligação ou ligante associado, modula a transdução de sinal após a ligação ao receptor de IL-2, modula a meia-vida circulante, modula a liberação ou biodisponibilidade, facilita a purificação ou melhora ou altera uma via particular de administração; aumenta a afinidade da variante de IL-2 para o seu receptor; aumenta a afinidade da variante de IL-2 para IL-2-Rbeta e/ou IL-2-Rgamma.
[0526]Portanto, para melhorar a função da variante F42, uma nova variante com uma mutação adicional, R38A, foi preparada em células CHO. Como mostrado na Figura 15A, o título aumentou para 118 mg/L com a combinação de um aminoácido não natural e uma substituição de aminoácido natural na IL-2 variante F42 em um pool estável durante a geração de uma linha celular estável. O nível de expressão da proteína da variante F42 não foi apenas mantido, mas também mostrou um aumento de 20 % na presença da mutação R38A. Para testar a função da variante F42-R38A PEGuilada, foi realizado um ensaio de ligação de células CTLL-2. Como mostrado na Tabela 9, o conjugado F42-R38A 20K PEG 2 ramificado (variante F42-R38-BR2) mostrou um EC50 de 15,9 nM em contraste com o EC50 de F42, mostrando 3,6 nM, com a eficiência de bloqueio de ligação superior a 4 aumentou em duas vezes (Figura 15B). Com base na EC50 de IL-2 de tipo selvagem de 0,025 nM, a eficiência do bloqueio de ligação é superior a 99,9 %. Esta variante mostrou grande potencial para suas aplicações terapêuticas em termos de seus altos níveis de expressão proteica e sua eficiência no bloqueio da ligação a IL-2Ralpha.
[0527]Tabela 9. Ensaio de ligação de CTLL-2 da variante PEGuilada F42- R38A WT-IL2 F42-PEG20K-BR2 F42-R38A-PEG20K-BR2 EC50 0,025 nM 3,6 nM 15,9 nM
[0528]A cinética de ligação da variante F42pAF, variante R38A-F42pAF (compreendendo um aminoácido não natural e uma mutação pontual) e F42-R38A- PEG20K-BR2 foram avaliadas por BLI para determinar os efeitos da mutação R38A na ligação a IL-2Ralpha. A Figura 15C mostra os sensorgramas de ligação para os três construtos e as constantes de ligação associadas (KD) são mostradas na Tabela
10. Como visto na Tabela 10, IL-2-F42pAF tem um KD de ligação a IL-2Ralpha de 20 nM. Com a mutação R38A adicionada, IL-2-F42-R38ApAF tem um KD de ligação a IL- 2Ralfa de 233 nM, que corresponde a uma redução de 12 vezes na ligação a IL- 2Ralfa. Após a conjugação de IL-2-R38A-F42pAF com uma molécula de PEG de ramificação 2 de 20K, a ligação de IL-2Ralfa foi evitada. Os resultados demonstraram claramente que a mutação adicional bloqueou efetivamente a ligação de F42-R38A ao seu receptor IL-2Rα.
[0529]Tabela 10. Ligação de variantes PEGuiladas de IL-2 com substituições de aminoácidos naturais e não naturais F42pAF F42-PEG20K-BR2 F42-R38A-PEG20K- BR2 KD 20 nM 233 nM Sem ligação
[0530]Entende-se que os exemplos e modalidades aqui descritos são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou mudanças à luz dos mesmos serão sugeridas para aquelas pessoas versadas na técnica e devem ser incluídos dentro do espírito e âmbito deste aplicação e âmbito das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes e/ou outros documentos citados neste pedido são incorporados por referência em sua totalidade para todos os fins, na mesma medida como se cada publicação individual, patente, pedido de patente e/ou outro documento fosse indicado individualmente a ser incorporado por referência para todos os fins.
[0531]A presente invenção é ainda descrita pelas seguintes modalidades numeradas.
[0532]1. Um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente, em que o dito polipeptídeo de IL-2 tem interação reduzida com sua subunidade de receptor em comparação com IL-2 de tipo selvagem.
[0533] 2. A IL-2 da modalidade 1 em que o polipeptídeo de IL-2 é 90 % homólogo a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
[0534]3. A IL-2 da modalidade 1 em que o polipeptídeo de IL-2 é pelo menos 95 % homólogo a SEQ ID NO: 2.
[0535]4. A IL-2 da modalidade 1 em que o polipeptídeo de IL-2 é pelo menos 98 % homólogo a SEQ ID NO: 2.
[0536]5. A IL-2 da modalidade 1 em que o polipeptídeo de IL-2 é pelo menos 99 % homólogo a SEQ ID NO: 2.
[0537]6. A IL-2 da modalidade 1 em que a IL-2 é conjugada a um ou mais polímeros solúveis em água.
[0538]7. A IL-2 da modalidade 6 em que pelo menos um dos polímeros solúveis em água está ligado a pelo menos um dos aminoácidos codificados não naturalmente.
[0539] 8. A IL-2 da modalidade 7 em que o polímero solúvel em água é PEG.
[0540] 9. A IL-2 da modalidade 8 em que o PEG tem um peso molecular entre 10 e 50.
[0541]10. A IL-2 da modalidade 1 em que o aminoácido codificado não naturalmente é substituído em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em resíduos antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ou adicionado ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação dos mesmos, e qualquer combinação dos mesmos.
[0542]11. A IL-2 da modalidade 10 em que a IL-2 compreende uma ou mais substituição, adição ou deleção de aminoácido que modula a afinidade do polipeptídeo de IL-2 para sua subunidade de receptor de IL2Rα em comparação com IL-2 de tipo selvagem.
[0543]12. A IL-2 da modalidade 10 em que a IL-2 compreende uma ou mais substituição, adição ou deleção de aminoácido que aumenta a estabilidade ou solubilidade da IL-2.
[0544]13. A IL-2 da modalidade 10 em que a IL-2 compreende uma ou mais substituição, adição ou deleção de aminoácido que aumenta a expressão do polipeptídeo de IL-2 em uma célula hospedeira recombinante ou sintetizada in vitro.
[0545]14. A IL-2 da modalidade 10 em que aminoácido codificado não naturalmente é substituído em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em resíduos 3. 35. 37. 38. 41. 42. 43. 44. 45. 61. 62. 64. 65. 68. 72. e 107. e qualquer combinação dos mesmos.
[0546]15. A IL-2 da modalidade 10 em que o aminoácido codificado não naturalmente é reativo em relação a um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa que é de outro modo não reativa em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns no polipeptídeo.
[0547]16. A IL-2 da modalidade 10 em que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino.
[0548]17. A IL-2 da modalidade 16 em que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo carbonila.
[0549]18. A IL-2 da modalidade 10 em que a IL-2 está ligada a uma molécula biologicamente ativa, um agente citotóxico, um polímero solúvel em água ou um agente imunoestimulador.
[0550]19. A IL-2 da modalidade 18 em que a IL-2 conjugada está ligada a um ou mais polímeros solúveis em água.
[0551]20. A IL-2 da modalidade 18 em que a molécula biologicamente ativa, agente citotóxico ou agente imunoestimulador estão ligados à IL-2 por um ligante.
[0552]21. A IL-2 da modalidade 18 em que a molécula biologicamente ativa, agente citotóxico ou agente imunoestimulador estão ligados à IL-2 por um ligante clivável ou não clivável.
[0553]22. A IL-2 da modalidade 18 em que a molécula biologicamente ativa, agente citotóxico ou agente imunoestimulador é conjugado diretamente a um ou mais dos aminoácidos codificados não naturalmente na IL-2.
[0554]23. A IL-2 da modalidade 10 em que o aminoácido codificado não naturalmente tem a estrutura: (CH2)nR1COR2 R3HN COR4 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituída; R2 é H, uma alquila, arila, alquila substituída, e arila substituída; e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal amino, e R4 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
[0555]24. A IL-2 da modalidade 23 em que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo aminoóxi.
[0556]25. A IL-2 da modalidade 23 em que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo hidrazida.
[0557]26. A IL-2 da modalidade 23 em que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo hidrazina.
[0558]27. A IL-2 da modalidade 23 em que o resíduo de aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo semicarbazida.
[0559]28. O polipeptídeo de IL-2 da modalidade 23 em que o resíduo de aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo azida.
[0560]29. A IL-2 da modalidade 1 em que o aminoácido codificado não naturalmente tem a estrutura:
(CH2)nR1X(CH2)mN3 R2HN COR3 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída, arila substituída ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 a 10; R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
[0561]30. A IL-2 da modalidade 29 em que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo alcino.
[0562]31. A IL-2 da modalidade 1 em que o aminoácido codificado não naturalmente tem a estrutura: (CH2)nR1X(CH2)mCCH R2HN COR3 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituída; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 a 10. R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
[0563]32. A IL-2 da modalidade 7 em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0.1 kDa e cerca de 100 kDa.
[0564]33. O polipeptídeo de IL-2 da modalidade 32 em que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0.1 kDa e cerca de 50 kDa.
[0565]34. A IL-2 da modalidade 16 em que o grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida está ligado ao polímero solúvel em água através de uma ligação amida.
[0566]35. A IL-2 da modalidade 19 que é feita reagindo um polímero solúvel em água compreendendo um grupo carbonila com um polipeptídeo compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente que compreende um grupo aminoóxi, uma hidrazina, uma hidrazida ou uma semicarbazida.
[0567]36. A IL-2 da modalidade 1 em que a IL-2 é glicosilada.
[0568]37. A IL-2 da modalidade 1 em que o polipeptídeo de IL-2 compreende ainda um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa ligada ao polipeptídeo por meio do aminoácido codificado não naturalmente.
[0569]38. A IL-2 da modalidade 37 em que o polipeptídeo de IL-2 em que o ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa ligada ao polipeptídeo por meio de uma porção de sacarídeo.
[0570]39. Um método de preparar a IL-2 da modalidade 1 o método compreendendo o contato com um polipeptídeo de IL-2 isolado compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente com um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa compreendendo uma porção que reage com o aminoácido codificado não naturalmente.
[0571]40. O método da modalidade 39 em que o polímero compreende uma porção selecionada a partir de um grupo que consiste em um polímero solúvel em água e poli(etilenoglicol).
[0572]41. O método da modalidade 39 em que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino.
[0573] 42. O método da modalidade 39 em que o aminoácido codificado não naturalmente compreende uma porção de carbonila e o ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa compreende uma porção de aminoóxi, uma hidrazina, uma hidrazida ou uma semicarbazida.
[0574] 43. O método da modalidade 39 em que a porção de aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida está ligada ao ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa através de uma ligação amida.
[0575]54. Um método de modular meia-vida sérica ou tempo de circulação de um polipeptídeo de IL-2. o método compreendendo substituir um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente para qualquer um ou mais aminoácidos de ocorrência natural no dito polipeptídeo.
[0576]55. Um polipeptídeo de IL-2 compreendendo uma ou mais substituição, adição ou deleção de aminoácido que aumenta a expressão do polipeptídeo de IL-2 em uma célula hospedeira recombinante.
[0577]56. Um polipeptídeo de IL-2 compreendendo pelo menos um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa, em que o dito ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa está ligado ao polipeptídeo através de um grupo funcional de um aminoácido codificado não naturalmente incorporado de forma ribossômica no polipeptídeo.
[0578]57. Um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa que está ligado a um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente em que o dito aminoácido codificado não naturalmente é incorporado de forma ribossômica no polipeptídeo nos sítios pré-selecionados.
[0579]58. Um método para reduzir o número de células tumorais em um humano diagnosticado com câncer, compreendendo administrar a um ser humano em necessidade de tal redução uma composição farmacêutica compreendendo um PEG- IL-2 da modalidade 56.
[0580]59. O método da modalidade 58 em que o conjugado é administrado em uma dose de cerca de 0,1 μ /kg a cerca de 50 μ/kg.

Claims (67)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo de IL-2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente, em que o dito polipeptídeo de IL- 2 tem interação reduzida com sua subunidade de receptor em comparação com IL-2 de tipo selvagem.
2. IL-2, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de IL-2 é 90 % homólogo a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
3. IL-2, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de IL-2 é pelo menos 95 % homólogo a SEQ ID NO: 2.
4. IL-2, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de IL-2 é pelo menos 98 % homólogo a SEQ ID NO: 2.
5. IL-2, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de IL-2 é pelo menos 99 % homólogo a SEQ ID NO: 2.
6. IL-2, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a IL-2 é conjugada a um ou mais polímeros solúveis em água.
7. IL-2, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos um dos polímeros solúveis em água está ligado a pelo menos um dos aminoácidos codificados não naturalmente.
8. IL-2, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o polímero solúvel em água é PEG.
9. IL-2, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o PEG tem um peso molecular entre 10 e 50.
10. IL-2, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente é substituído em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em resíduos antes da posição 1 (isto é, no N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 ou adicionado ao terminal carboxila da proteína, e qualquer combinação dos mesmos.
11. IL-2, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a IL-2 compreende uma ou mais substituição, adição ou deleção de aminoácido que modula a afinidade do polipeptídeo de IL-2 para sua subunidade de receptor de IL2Rα em comparação com IL-2 de tipo selvagem.
12. IL-2, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a IL-2 compreende uma ou mais substituição, adição ou deleção de aminoácido que aumenta a estabilidade ou solubilidade da IL-2.
13. IL-2, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a IL-2 compreende uma ou mais substituição, adição ou deleção de aminoácido que aumenta a expressão do polipeptídeo de IL-2 em uma célula hospedeira recombinante ou sintetizada in vitro.
14. IL-2, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que aminoácido codificado não naturalmente é substituído em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em resíduos 3, 35, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 61, 62, 64, 65, 68, 72, e 107, e qualquer combinação dos mesmos.
15. IL-2, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente é reativo em relação a um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa que é de outro modo não reativa em relação a qualquer um dos 20 aminoácidos comuns no polipeptídeo.
16. IL-2, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino.
17. IL-2, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo carbonila.
18. IL-2, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a IL-2 está ligada a uma molécula biologicamente ativa, um agente citotóxico, um polímero solúvel em água ou um agente imunoestimulador.
19. IL-2, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que a IL-2 conjugada está ligada a um ou mais polímeros solúveis em água.
20. IL-2, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que a molécula biologicamente ativa, agente citotóxico ou agente imunoestimulador estão ligados à IL-2 por um ligante.
21. IL-2, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que a molécula biologicamente ativa, agente citotóxico ou agente imunoestimulador estão ligados à IL-2 por um ligante clivável ou não clivável.
22. IL-2, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que a molécula biologicamente ativa, agente citotóxico ou agente imunoestimulador é conjugado diretamente a um ou mais dos aminoácidos codificados não naturalmente na IL-2.
23. IL-2, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente tem a estrutura: (CH2)nR1COR2 R3HN COR4 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituída; R2 é H, uma alquila, arila, alquila substituída, e arila substituída; e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal amino, e R4 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
24. IL-2, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo aminoóxi.
25. IL-2, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo hidrazida.
26. IL-2, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo hidrazina.
27. IL-2, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que o resíduo de aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo semicarbazida.
28. Polipeptídeo de IL-2, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o resíduo de aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo azida.
29. IL-2, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente tem a estrutura: (CH2)nR1X(CH2)mN3 R2HN COR3 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída, arila substituída ou não está presente; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 a 10; R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
30. IL-2, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo alcino.
31. IL-2, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente tem a estrutura: (CH2)nR1X(CH2)mCCH R2HN COR3 em que n é 0 a 10; R1 é uma alquila, arila, alquila substituída ou arila substituída; X é O, N, S ou não está presente; m é 0 a 10, R2 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal amino, e R3 é H, um aminoácido, um polipeptídeo ou um grupo de modificação do terminal carbóxi.
32. IL-2, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa.
33. Polipeptídeo de IL-2, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero solúvel em água tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 50 kDa.
34. IL-2, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o grupo aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida está ligado ao polímero solúvel em água através de uma ligação amida.
35. IL-2, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que é feita reagindo um polímero solúvel em água compreendendo um grupo carbonila com um polipeptídeo compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente que compreende um grupo aminoóxi, uma hidrazina, uma hidrazida ou uma semicarbazida.
36. IL-2, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a IL-2 é glicosilada.
37. IL-2, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de IL-2 compreende ainda um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa ligada ao polipeptídeo por meio do aminoácido codificado não naturalmente.
38. IL-2, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo de IL-2 em que o ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa ligada ao polipeptídeo por meio de uma porção de sacarídeo.
39. Método de preparar IL-2, de acordo com a reivindicação 1, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o contato com um polipeptídeo de IL-2 isolado compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente com um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa compreendendo uma porção que reage com o aminoácido codificado não naturalmente.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero compreende uma porção selecionada a partir de um grupo que consiste em um polímero solúvel em água e poli(etilenoglicol).
41. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente compreende um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino.
42. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente compreende uma porção de carbonila e o ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa compreende uma porção de aminoóxi, uma hidrazina, uma hidrazida ou uma semicarbazida.
43. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida está ligada ao ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa através de uma ligação amida.
44. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente compreende uma porção de alcino e o ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa compreende uma porção de azida.
45. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente compreende uma porção de azida e o ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa compreende uma porção de alcino.
46. Polipeptídeo de IL-2, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero solúvel em água é uma porção de poli(etilenoglicol).
47. Polipeptídeo de IL-2, de acordo com a reivindicação 46.
CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de poli(etilenoglicol) é um polímero ramificado ou multiarmado.
48. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende IL-2, de acordo com a reivindicação 10, e um portador farmaceuticamente aceitável.
49. Composição, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADA pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água.
50. Método de tratar um paciente tendo um transtorno modulado por IL-2.
CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição, de acordo com a reivindicação
42.
51. Composição compreendendo IL-2, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que é conjugada a uma molécula biologicamente ativa com um portador farmaceuticamente aceitável.
52. Composição compreendendo IL-2, de acordo com a reivindicação 10.
CARACTERIZADA pelo fato de que ainda compreende um ligante e um conjugado com um portador farmaceuticamente aceitável.
53. Método de preparar uma IL-2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um aminoácido codificado não naturalmente, o método compreendendo, culturar células compreendendo um polinucleotídeo ou polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de IL-2 compreendendo um códon seletor, uma sintetase de RNA ortogonal e um tRNA ortogonal sob condições para permitir a expressão do polipeptídeo de IL-2 compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente; e purificar o dito polipeptídeo.
54. Método de modular meia-vida sérica ou tempo de circulação de um polipeptídeo de IL-2, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende substituir um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente para qualquer um ou mais aminoácidos de ocorrência natural no dito polipeptídeo.
55. Polipeptídeo de IL-2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma ou mais substituição, adição ou deleção de aminoácido que aumenta a expressão do polipeptídeo de IL-2 em uma célula hospedeira recombinante.
56. Polipeptídeo de IL-2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa, em que o dito ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa está ligada ao polipeptídeo através de um grupo funcional de um aminoácido codificado não naturalmente incorporado de forma ribossômica no polipeptídeo.
57. Polipeptídeo de IL-2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa que está ligado a um ou mais aminoácidos codificados não naturalmente em que o dito aminoácido codificado não naturalmente é incorporado de forma ribossômica no polipeptídeo em sítios pré- selecionados.
58. Método para reduzir o número de células tumorais em um ser humano diagnosticado com câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um ser humano em necessidade de tal redução uma composição farmacêutica compreendendo um PEG-IL-2, de acordo com a reivindicação 56.
59. Método, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado é administrado em uma dose de cerca de 0,1 μ/kg a cerca de 50 μ/kg.
60. IL-2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, 46 a 47 e 55 a 57. CARACTERIZADA pelo fato de que a IL-2 compreende ainda pelo menos uma substituição de aminoácido natural em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em resíduos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, ou 133.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 45, 53 a 54, e 58 a 59 ou a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a
49. CARACTERIZADO pelo fato de que o método ou composição compreende ainda pelo menos uma substituição de aminoácido natural em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em resíduos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 ou 133.
62. IL-2, de acordo com a reivindicação 60, o método ou composição, de acordo com a reivindicação 61, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido natural está nas posições 38, 46 e/ou 65.
63. IL-2, de acordo com a reivindicação 60, o método ou composição, de acordo com a reivindicação 61, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido natural está nas posições 38 e 46.
64. IL-2, de acordo com a reivindicação 60, o método ou composição, de acordo com a reivindicação 61, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido natural está nas posições 38 e 65.
65. IL-2 ou o método ou a composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido natural na posição 38 é uma alanina.
66. IL-2 ou o método ou a composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido natural na posição 46 é uma leucina ou isoleucina.
67. IL-2 ou o método ou a composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 ou 64, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido natural na posição 65 é uma arginina.
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