JP2005021157A - ヒト成長ホルモン変異体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】複数の特定のアミノ酸置換体からなるヒト成長ホルモン変異体を含む。
【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明はヒト成長ホルモンの作用剤または拮抗剤としての使用のための特定の成長ホルモン変異体及びそれらのペグ化形態に関する。
ヒト成長ホルモン(hGH)は正常なヒトの成長及び発達の調節の多くの面に関与している。この22,000ダルトンの下垂体ホルモンは、伸長成長(体形成)、乳汁分泌、マクロファージの活性化及びインスリン様と糖尿病誘発性効果、その他を含むたくさんの生物学的効果を示す。Chawla,Annu.Rev.Med.,34:519(1983);Edwards等,Science,239:769(1988);Isaksson等,Annu.Rev.Physiol.,47:483(1985);ThornerとVance,J.Clin.Invest.,82:745(1988);HughesとFriesen,Annu.Rev.Physiol.,47:469(1985)。これらの生物学的効果はhGHと特定の細胞受容体間の相互作用に由来する。子供における成長ホルモンの欠失は小人症を導き、それはここ十年以上の間にhGHの外因性投与によりうまく治療されている。hGHの遺伝学的及び翻訳後修飾形態の識別のため(Lewis,Ann.Rev.physiol.,46:33[1984])、hGHが臨床的に投与される場合それに対する免疫学的応答を特性指摘するため、そしてホルモンの循環濃度を定量するため、hGHの抗原性にも興味が持たれている。
ある研究者は通常Cys-53とCys-165の間に存在するジスルフィド結合を破壊するために、hGHの165位のシステインをアラニンに置換することを報告している。Tokunaga等,Eur.J.Biochem.,153:445(1985)。この単一置換はhGHの三次元構造を明らかに維持しhGHに対する受容体によって認識されるミュータントを提供した。
他の者は結合性質が抗原結合ループ(Jones等,Nature,321:522-525[1986])またはDNA認識ヘリックスを含む二次構造の完全なユニットの置換によって操作し得ることを報告している。Wharton等,Nature,316:601-605(1985)。
GHと二つの受容体分子の間の1:2複合体二量体を開示するhGH変異体もまた1992年11月26日に印刷されたWO92/21029に報告されている。その変異体はその天然の構造において四つの両親媒性αヘリックスを含み連続的な順番で二つの部位を通じてその受容体と結合するモノマーポリペプチドリガンドである。リガンドがGHである場合、もし一つは野生型ホルモンのN末端約15残基内にあり、もう一つはヘリックスC内にある少なくとも2の残基でミューテーションが存在したならば、この変異体はサイト1またはサイト2内に導入されたミューテーションを持ち、サイト1はサイト1での受容体に対するリガンドのアフィニティーを増大するためにミューテートされる。
アフィニティーにおいてさらにより大きい改良を得ることが望ましい。hGHとbGHのリシン残基が成長ホルモン受容体とのhGHとbGhの相互作用において関与していることが開示されており、構造-機能関係において特に41,64,70及び115位のリシンまたはアルギニン残基が関与していることが開示されている。Martal等,FEBS Lett.,180:295-299(1985)。ラジオリセプターアッセイによって減少した活性を引き起こすために、メチル化、エチル化、グアニジン化及びアセトイミジン化によってリシン残基が化学的に修飾された。
Chawla,Annu.Rev.Med.,34:519(1983); Edwards等,Science,239:769(1988); Isaksson等,Annu.Rev.Physiol.,47:483(1985); ThornerとVance,J.Clin.Invest.,82:745(1988); HughesとFriesen,Annu.Rev.Physiol.,47:469(1985) Lewis,Ann.Rev.physiol.,46:33[1984] Nichol等,Endocrine Reviews,7:169(1986) Leung等,Nature,330:537[1987] Boutin等,Cell,53:69[1988] Chang等,Gene,55:189[1987] Goeddel等,Nature,281:544(1979); Gray等,Gene,39:247(1985) Abdel-Meguid等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:6434(1987) Cunningham等,Science,243:1330-1336(1989) CunninghamとWells,Science,244:1081-1085(1989)
本発明は以下の一連のアミノ酸置換を含むヒト成長ホルモン(hGH)変異体を提供する:
H18D,H21N,R167N,K168A,D171S,K172R,E174S,I179T。
また以下の一連のアミノ酸置換を含むヒト成長ホルモン変異体が提供される:
H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,K168A,E174A。
これらの置換はサイト1でのhGH受容体に対する結合アフィニティーを増大する。これら一連のアミノ酸置換を含むhGH変異体は、サイト2でのhGH受容体に対する結合を破壊する付加的な修飾の不存在下でhGH作用剤として機能する。
H18D,H21N,G120K,R167N,K168A,D171S,K172R,E174S,I179T(以下では「B2036変異体」という)。
もう一つの実施態様として、hGH変異体は以下の一連のアミノ酸置換を含む:
H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,G120K,K168A,E174A(以下では「B2024変異体」という)。
本発明のさらなる一面として、核酸配列、ベクター、ホスト細胞及びこれらのhGH変異体の発現のためのプロセスが含まれる。
本発明のさらなる一面として、本発明の拮抗剤hGH変異体の有効量を患者に投与することを含む、患者における成長ホルモン機能を阻害するための方法がある。
変異体
ヒト成長ホルモン(hGH)のDNA及びアミノ酸配列が報告されている。Goeddel等,上記参照;Gray等,上記参照。本発明はアラニンスキャニング方法体系またはファージミド選択法のそれぞれを用いて生産された新しいhGH変異体を記述する。本発明のhGH変異体は野生型またはmethGHを発現可能ないかなる組換え系においても発現し得る。
変異体hGH配列表記は本発明のhGH変異体における現実のアミノ酸置換を定義する。変異体に対して、置換は野生型残基を表す文字(一文字コードで)、野生型配列のアミノ酸位置を示す数及び置換されたアミノ酸を示す第二の文字によって示される。例えばR64KはArg64がLysに変換されたミューテーションを示す。複数のミューテーションはコンマによって分割された一連の単一のミューテーションによって示される。
一つの実施態様として、本発明はここでポリペプチドとその受容体の相互作用に関与するポリペプチド内の一つ以上の活性部位を検出するために、hGHの系統的な分析を利用する。該分析は組換えDNA法を用いて簡便に実施される。一般的にhGHをコードするDNAは便宜にホスト内でそれを発現するためにクローン化され操作される。hGHをコードするDNAはゲノムライブラリー、hGHを発現する細胞内のmRNAから由来するcDNA、または合成的に構築したDNA配列によって得られ得る。Maniatis等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1982)。
それから野生型hGHDNAをホスト細胞をトランスフォームするために用いられる適したプラスミドまたはベクター内に挿入する。原核生物はhGH変異体を生産するためのDNA配列のクローニング及び発現にとって好ましい。例えば大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC No.31537)、及び大腸菌c600とc600hfl、そして大腸菌W3110(F−,γ−、原栄養株性、ATCC No.27325)、枯草菌のようなバチルス、及びネズミチフス菌または霊菌及び様々なシュードモナス種のような他の腸内細菌科と同様に、大腸菌K12株294(ATCC No.31446)が用いられ得る。好ましい原核生物は大腸菌W3110(ATCC 27325)である。原核生物の細胞内で発現される場合、hGHは典型的にN末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含み、グリコシル化されていない。培地またはペリプラズム内の細胞外に発現される場合、hGHはN末端メチオニンを含んでいない。これらの例はもちろん限定することよりもむしろ実例となることを企図されている。
ターゲット受容体は天然のソースから単離され得または本分野で既知の方法によって組換え法で調製され得る。実例として、受容体はMcFarland等,Science,245:494-499(1989)によって記述されている方法によって調製され得る。
ある場合には、一つ以上の残基でのスキャニングアミノ酸の置換が受容体とのその活性の分析を実施するのに十分な量の単離を許す濃度で発現されない残基置換ポリペプチドを引き起こす。該場合には異なるスキャニングアミノ酸、好ましくは等配電子アミノ酸が用いられ得る。
一度活性アミノ酸残基が同定されると、等配電子アミノ酸が置換され得る。該等配電子置換は全ての場合で生じる必要はなく、活性アミノ酸が同定される前に実施され得る。該等配電子アミノ酸置換はいくつかの置換が引き起こし得る構造に対する潜在的な破壊効果を最小化するために実施される。等配電子アミノ酸は以下の表に示されている:
肝臓由来の体形成受容体と相互作用するhGHにとっての活性ドメイン及び残基を決定する方法が本出願の優先出願(1989年10月26日に提出されたU.S.S.N.07/428,066)の図1に概略的に示されており、選択された部分が図2に示されている。
加えて変異体はファージミドディスプレーによって分析し得る。この方法は(a)hGHをコードする第一の遺伝子、天然のまたは野生型ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第二の遺伝子を含み、第一と第二の遺伝子は異種のものであり、そして第一と第二の遺伝子と実施可能にリンクした転写調節エレメントを含み、それによって融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を形成し;(b)第一の遺伝子内の一つ以上の選択された位置でベクターをミューテートしそれによって関連するプラスミドのファミリーを形成し;(c)プラスミドを用いて適したホスト細胞をトランスフォームし;(d)ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を持つヘルパーファージを用いてトランスフォームされたホスト細胞に感染させ;(e)少なくともプラスミドの一部を含み、ホストをトランスフォームできる組換えファージミド粒子を形成するために適したコンディションの下で、トランスフォームされ感染されたホスト細胞を培養し、コンディションを少量のファージミド粒子だけが粒子の表面に融合タンパク質の一コピーより多くをディスプレーするように調節し;(f)少なくともファージミド粒子の一部が受容体分子に結合するようにファージミド粒子をhGH受容体分子(hGHbp)を用いて接触させ;(g)結合したファージミド粒子をしていないものと分離する工程より成る。好ましくはさらに本方法はhGHbpに結合する組換えファージミド粒子を用いて適したホスト細胞をトランスフォームすることと(d)から(g)の工程を一度以上繰り返すことを含む。
hGHをコードする遺伝子(遺伝子1)と同様に上述の構成要素を含む適したベクターの構築は、Sambrook等,上記参照に記述されているような標準的な組換えDNA法を用いて調製される。ベクターを形成するために結合されるための単離されたDNA断片は、望ましいベクターの生産のため特異的な順序及び配向で互いに切断され、調製され及び接合される。
互いにつながれるべきDNA断片(つながれる各断片の末端が適合するように前に適切な制限酵素で切断されている)は、大体等モルの量で溶液中に置かれる。溶液はまたATP、リガーゼバッファー及び0.5μgのDNA当たり約10ユニットのT4DNAリガーゼのようなリガーゼを含む。DNA断片がベクター内につながれるのであれば、ベクターは適当な制限酵素(類)を用いて切断することによって最初に直線化される。それから直線化ベクターをアルカリホスファターゼまたはウシ腸ホスファターゼを用いて処理される。ホスファターゼ処理はライゲーション工程の間のベクターの自己ライゲーションを避ける。
原核生物細胞のトランスフォーメーションはSambrook等,上記参照の1.82部分に記述されているような塩化カルシウム法を用いて容易に成し遂げられる。代わりに電気穿孔法(Neumann等,EMBO J.,1:841[1982])がこれらの細胞をトランスフォームするために用いられ得る。トランスフォームされた細胞tetまたはampを持ち、ベクター上のtet及び/またはamp耐性遺伝子の存在のためそれらが耐性を示すことによってそれらが抗生物質上の成育によって選択される。
オリゴヌクレオチド介在性ミュータジェネシスはhGHの変異体に置換、欠失または挿入を調製するための好ましい方法である。本方法はZoller等,上記参照によって記述されているように本分野でよく知られている。略記すると、テンプレートがhGHの非改変または野生型DNA配列を含むプラスミドのシングルストランド形態である場合、hGH遺伝子はDNAテンプレートに望ましいミューテーションをコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって改変される。ハイブリダイゼーション後、テンプレートの完全な第二の相補的ストランドを合成するためにDNAポリメラーゼを用い、それゆえオリゴヌクレオチドプライマーが取り込まれhGH遺伝子内で選択された改変がコードされる。
カセットミュータジェネシスもまたhGHDNAの置換、欠失及び挿入変異体を調製するために好ましい方法である。本方法はWells等,Gene,上記参照に記述されたものに基づいている。スタート時の物質はミューテートされるhGH遺伝子を含むプラスミド(または他のベクター)である。ミューテートされるhGH遺伝子のコドン(類)を同定する。場合により同定されたミューテーション部位(類)の各サイドに独特の制限酵素部位が存在する;しかしながらこれは必要条件ではない。もし該制限部位が存在しないならば、hGH遺伝子に適当な位置でそれらを導入するために、上述したオリゴヌクレオチド介在性ミュータジェネシスを用いて該制限部位を生産し得る。制限部位をプラスミド内に導入した後に、プラスミドを直線化するためにこれらの部位で切断する。制限部位間にDNAの配列をコードするが望ましいミューテーション(類)を含むダブルストランドオリゴヌクレオチドを標準的な方法を用いて合成する。2つのストランドを別々に合成し、それから標準的な方法を用いて互いにハイブリダイズさせる。このダブルストランドオリゴヌクレオチドをカセットという。このカセットをそれをプラスミドに直接的につなげるように、直線化プラスミドの末端と適合する3'と5'末端を持つようにデザインする。そこでこのプラスミドはhGHのミューテートされたDNA配列を含む。
マトリックスへの受容体の付着の後、固定化したターゲットとファージミド粒子の少なくとも一部の結合に適したコンディションの下でファージミド粒子のライブラリーと固定化したターゲットを接触させる。通常はpH、イオン強度、温度等を含む該コンディションは生理的コンディションをまねる。
適したホスト細胞をバインダー及びヘルパーファージを用いて感染し、ホスト細胞をファージミド粒子の増幅に適したコンディションの下で培養する。それからファージミド粒子を集め、ターゲット分子に対する望ましいアフィニティーを持つバインダーを選択するまで選択工程を一度以上繰り返す。
本発明のhGH変異体は標準的な組換え法によって簡便に生産し得る。最も特異的には、hGH変異体はアラニンスキャニングの議論で上述したようなベクター-ホスト細胞系を用いて発現し得る。
一つの実施態様として、本発明のファージミドをファージタンパク質の存在しないhGH変異体を生産するために用いる。例えばpSO643及び誘導体は16C9のような非サプレッサー株において簡単に成長させ得る。この場合、アンバーコドン(TAG)が翻訳の終結を導き、遊離のホルモンを生ずる。hGH変異体をホスト細胞から分泌させ、以下に記述するようにカルチャー培地から単離し得る。
加えて培養コンディションは転写、翻訳及び細胞区画の間でのタンパク質輸送を許容すべきである。これらのプロセスに影響する因子はよく知られており、例えばDNA/RNAコピー数;RANを安定化する因子;培地中に存在する栄養素、サプリメント及び転写インデューサーまたはリプレッサー;培地の温度、pH及び浸透度;及び細胞密度が含まれる。特定のベクター-ホスト細胞系において発現を促進するこれらの因子の調節は当業者の範囲内にある。
上記のように生産された組換えタンパク質の回収法はよく知られており、用いられる発現系に依存して変化する。例えば、もし典型的にはそうであるが、発現ベクターが単一の配列を含んでいれば、hGH変異体は培地またはペリプラズムから回収される。簡便には、変異体は十分にプロセシングされたタンパク質(すなわち分泌シグナル配列を欠いている)としてペリプラズム空間に分泌される。しかしながらhGH変異体は細胞内にも発現し得、細胞溶解物からも回収し得る。
第一の工程として、培地または細胞溶解物は通常細胞破片を除去するため遠心分離され、濾過される。それから典型的には上清を望ましい量に濃縮または希釈し、さらなる精製のため調製物のコンディションを整えるために適したバッファーにダイアフィルター(diafilter)する。hGH変異体のさらなる精製は典型的には、完全な形態のものからhGH変異体の脱アミド化形態及び短縮形態を分離することを含む。例えば、完全なhGH変異体は、N末端フェニルアラニンを欠失しているdes-phe-hGH変異体から分離され得る。
この実施態様の一つのバリエーションとして、hGH変異体は(1)スピニングカップシークエンサーを用いて少なくとも15残基のN末端または内部のアミノ酸を得るのに十分な程度に、(2)Coomassieブルー染色を用いて非還元または還元コンディションの下でのSDS-PAGEによって均質な程度に精製される。
本発明は一つ以上の化学的なグループと共有結合で付着した(以下では「接合した」という)hGH変異体を提供する。該接合は非修飾hGH変異体より大きい現実の分子量を持つhGH変異体接合物を生産する。ここで用いられているように、「現実の分子量」なる語はマススペクトロメトリー(例えばマトリックスアシステッドレーザー脱着イオン化マススペクトロメトリー)によって測定されるような分子量をいう。hGH変異体接合物の現実の分子量は通常少なくとも約30kDである;好ましくは約35kDから約55kDの範囲である;そしてより好ましくは約40kDから約50kDの範囲である。一般的にhGH変異体接合物の現実の分子量は100kDを越えない。
タンパク質をペグ化するための様々な方法が記述されている。例えば、生理的に活性な非免疫原性構成物を生産するためにPEG及びポリプロピレングリコールにたくさんのホルモン及び酵素を接合することを開示する米国特許第4,179,337号(Davis等により提出された)参照。一般的に少なくとも一つの末端水酸基を持つPEGは、末端反応基を持つ活性化されたPEGを形成するためにカップリング試薬を用いて反応される。それからこの反応基は共有結合を形成するためにタンパク質のα-及びε-アミンを用いて反応し得る。適宜に、PEG分子の他方の末端をタンパク質分子のPEG架橋複合体の形成を減少するために、メトキシ基のような非反応性化学グループを用いて「ブロック」し得る。
適した活性化PEGは、たくさんの適宜な反応によって生産し得る。例えばPEGのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(M-NHS-PEG)をBuckmannとMerr,Makromol.Chem.,182:1379-1384(1981)の方法にしたがって、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を用いた反応によって、PEG-モノメチルエーテル(Union Carbideから商業的に入手可能である)から調製し得る。
代わりに、本発明の使用に適した活性化PEGをたくさんの業者から購入し得る。例えば、Shearwater Polymers,Inc.(Huntsville,AL)は、メトキシ-PEGのスクシンイミジルカルボネート(「SC-PEG」)及びメトキシ-PEGスクシンイミジルプロピオネート(「SPA-PEG」;以下ではメトキシブロッキンググループの存在を示すために「M-SPA-PEG」として示す)に加えて、「SCM-PEG」としてM-NHS-PEGを販売している。B2036変異体をペグ化するためのM-SPA-PEGの使用は、実施例VII及びVIIIに示されている。Shearwater Polymersはまた、二つの10,000D鎖を持つ分枝状鎖PEG(以下では「NHS-PEG2(20,000)」という)も販売しており、その使用は実際例IXに記述されている。
タンパク質のペグ化の部位はまた、様々な第一級アミンの反応性によっていくぶん拘束される。例えばB2036変異体(K41)のサイト1ホルモン-受容体結合界面における潜在的なリシンは、M-SPA-PEG(5000)に対して比較的非反応性である。実施例X参照。それゆえ変異体分子当たりおよそ4から6のPEGを持つ、穏やかにペグ化されたB2036変異体調製物は、サイト1結合界面に潜在的なペグ化部位が存在しているのにも関わらず、サイト1でhGH受容体を結合する能力を維持している。
さらにリシンを導入または除去するアミノ酸置換は潜在的なペグ化部位の位置を改変する。例えばB2036変異体では、K168A及びK172Rの置換はホルモン受容体サイト1結合界面でペグ化に有用な部位の数を減少する。G120の異なるアミノ酸を用いた除去は、サイト2でのhGH結合を妨害し、分子をhGH拮抗剤に変換する。この位置でのグリシンからリシンへの置換は、この部位でのいかなる残余の結合をも損なうサイト2での付加的な潜在的なペグ化を提供する。B2036変異体における第一級アミンの反応性は実施例Xに示されている。
1 2,3,4,5
2 3,4,5,6
3 4,5,6,7
(活性化PEGに関して用いられているように、「遊離アミノ基当たり相当する」なる語は、分子内の遊離アミンの数を掛けられたペグ化される分子のモル量と等しい活性化PEGのモル量をいう。) 制限されたペグ化を受ける調製物(調製物1のような)では、タンパク質は最も反応性の部位でペグ化され、一方もしペグ化がより拡大されれば(調製物3のような)、比較的小さい反応性の部位もまたペグ化される。
治療上の投与のための本発明のhGH変異体の処方は、凍結乾燥塊または水溶液の形態で、適宜に製薬学的に許容可能なキャリアー、賦形剤または安定剤と望ましい純度を持ったhGH変異体を混合することによって貯蔵のため調製される(Remington's Phrmaceutical Sciences,第16編,Osol、A.編,[1980])。非経口的処方は製薬学的に許容可能なキャリアーとユニット投与量の注射形態の(溶液、懸濁液または乳濁液)hGH変異体を混合することによって調製され得る。製薬学的に許容可能なキャリアー、賦形剤または安定剤は用いられる投与量および濃度で受容者に非毒性であり、処方の他の構成要素と両立できる。例えば、処方は好ましくは酸化剤およびタンパク質に有害な他の既知の化合物を含まない。
本発明の処方は付加的に製薬学的に許容可能なバッファー、アミノ酸、膨張試薬及び/または非イオン性界面活性剤を含む。これらには例えばバッファー、キレート試薬、抗酸化剤、防腐剤、共溶媒等が含まれる;これらの特異的な例として、トリメチルアミン塩類(Trisバッファー)及びエデト酸二ナトリウムが含まれ得る。
治療上の投与に対するhGH変異体の処方は滅菌的である。滅菌は滅菌濾過メンブレン(例えば0.2ミクロンメンブレン)を通した濾過によって容易に成し遂げられる。治療上のhGH変異体構成物は一般的に、例えば皮下注射針によって穴をあけることが可能なストッパーを持った静脈溶液バッグまたはバイアル内に入れられる。
本発明のペグ化hGH変異体の処方はhGh変異体で一般的に上述されたように実施し得る。
本発明はhGHの作用剤として機能する変異体及びhGHの拮抗剤として機能する変異体を含み、後者はサイト2-破壊的ミューテーションを含む。作用剤hGH変異体は哺乳動物の同化作用または成長を増大するのに有用である。成長とは通常の成長曲線によって表せられるような幼児、子供及び思春期の間の個体によって経験される伸長成長の発達の型をいう。それゆえここでいう成長は軟骨細胞によって由来する身長を生み出す骨板の成長をいい、骨の異なる部分に由来する骨芽細胞の成長とは区別される。通常の成長パターンの回復は、患者がより満足のいく成長曲線に近づくことを許容する。GHに比較的耐性であるが同化作用の効果を含む治療を必要とする患者の例として、ターナー症候群に罹患したもの、GH欠損の子供、彼らの成長部位が閉じる約2-3年前に通常の成長曲線の遅延または阻止を経験している子供、つまりショートノーマルな子供と呼ばれている子供、及びGHに応答するインスリン様増殖因子-I(IGF-I)が化学的に(すなわちグルココルチコイド治療により)または大人の患者においてGHに応答するIGF-Iが天然において減少しているような天然のコンディションによってブロックされている患者が含まれる。
B2036及びB2024のような本発明の拮抗剤hGH変異体は、GH機能の阻害が望ましい病気を治療するのに有用である。特に拮抗剤hGHを用いた治療に影響を受けやすいものは、GHの循環レベルの減少またはIGF-IのようなGH機能のメディエーターの減少が治療上の利益を提供する病気である。該病気には例えば巨大症及び先端巨大症のようなGH過多の病気が含まれる。巨大症は長い骨の成長がいまだ可能である思春期前のGH過多から由来する。
GHレベルの減少が治療上の利益を提供すると現在では考えられている他の病気には、成長によってGHまたはGH機能のメディエーター(IGF-Iのような)に応答する悪性腫瘍が含まれる(以下では「GH応答性悪性腫瘍」という)。GH応答性悪性腫瘍の例として、ウィルムス腫、様々な肉腫(例えば骨肉腫)、及び胸部、大腸、前立腺及び甲状腺ガンが含まれる。
投与は継続的な点滴(例えば浸透性ポンプのようなミニポンプを用いて)、または例えば静脈内や皮下の手段を用いる注射によってなされる。一つの実施態様として、hGH変異体は皮下に投与される。投与はまた単一の巨丸剤としてもなされ得るし、遅放出貯蔵物処方によってもなされ得る。
以下の記述は例示として存在し、本発明の範囲を制限するために解釈されるべきではない。ここで用いられている全ての引用は、参考としてここで明らかに取り込まれる。
hGHのサイト1内の30の接触残基でのアラニン置換物に対する結合の速度論及びアフィニティーを評価した。固定化された受容体へのホルモンの結合による屈折指標の変化を測定するために、表面プラズモン共鳴に依存するBIAcoreTMバイオセンサーと呼ばれるバイオセンサー装置を用いた。本実施例では、アフィニティーが31の側鎖の4分の1より小さいものによって支配され、小パッチにおけるこれらのクラスターは接触エピトープの近くに存在することが見出された。それゆえ「構造的エピトープ」は「機能的結合エピトープ」よりかなり大きい。
hGHのサイト1に存在する残基のアラニンミューテーションはCunninghamとWells,上記参照に記述されている研究から利用され、新たに部位指定ミュータジェネシスによって作製された。Kunkel等,Methods Enzymol.,154:367-382(1987)。様々なタンパク質がCunninghamとWells,上記参照に記述されているように生産され精製された。硫安沈殿の継続時間を1時間に伸長することによって改良された。
解離割合は5μMhGHミュータントを用いてバイオセンサーを飽和し、ホルモンの存在しないバッファーに切り替えることによって測定された。バッファー流速と再生コンディションは会合プロフィールを測定するために用いられたものと同様であった。潜在的な差異結合効果を、解離定数を計算するための各解離プロフィールの最初の10分だけ用いることによって最小化した。会合定数と解離定数の両者を、割合の方程式を解くためにPharmacia Kinetics Evaluationソフトウェアーを用いて決定した。Karlsson等,上記参照。
hGHbpに対するhGHの結合を、hGHbpの変異体、(S237C)hGHbp[hGHbp中のSer237をCysに変換している]を混合されたジスルフィド結合を経由してBIAcoreTMバイオセンサー上のチオール誘導化マトリックスに固定化することによって研究した。図1A。S237C(hGHbp)ミューテーションはhGHに対する結合アフィニティーに影響せず、単一のチオール特異的蛍光プローブを付着するために用いられ、溶液中のhGHbpのhGH誘導性二量体化を引き起こした。Cunningham等,1991,上記参照。この付着は、もし第一級アミン基を通じたランダムな結合が用いられていれば得られるものと異なるマトリックス上のhGHbpの同型の配向を確実にした。結合反応の間に生じる屈折指標共鳴ユニット(RUs)の変化から、付着したhGHbpの量がPharmaciaから供給された較正曲線から計算された(BIAcoreTMバイオセンサーマニュアル参照)。
BIAcoreTMバイオセンサーのチオールマトリックス上に固定化された(S237C)hGHbpまたは(S201C)hGHbpに対する野生型または(G120R)hGHの結合に対する動力学的定数。オン-レート及びオフ-レートプロフィールを25℃で測定し、hGH及び(G120R)hGHに対して分析した;同じバイオセンサーチップでのオン-レート、オフ-レート及びアフィニティーに対する平均標準誤差は、報告された値の17%、14%及び21%であった。結合の化学量論は以下の公式にしたがって図1B及び2B中のデータから計算した。
サイト1界面で様々な程度に隠れているhGH内の残基でのアラニン置換に対する相対的なオン-レート、オフ-レート及びアフィニティー。レートの測定は表1に記述されているように25℃でhGHbp(S201C)マトリックスを用いてなされた。
2ファンデルワールス接触の全数は、hGH(hGHbp)2複合体の調査に基づいて接触側鎖β-炭素以外のいかなる原子のものであっても4.4Å以内の受容体原子の数である。接触距離の80%以上が3.8から4.2Åである。水素結合(h)または塩架橋(s)を形成する基をhGHとhGHbpの間の互いの3.3Å以内のドナー-アクセプターまたは相補的電荷ペアによって決定する。例えばH18の次のhN218はhGH上のH18とhGHbpのN218の間の水素結合を示す。mcは主鎖アミドに対する水素結合を示す。
3オフ-レートの相対的変化は以下から計算された:
アフィニティー定数の平均標準誤差はRIAでは約30%であるのに対してBIAcoreTMバイオセンサーを用いると約20%である。hGHbpの二量体化のある物はRIAで生じ得、それはアフィニティーにおける規則的な誤差を導く;これは(S201C)hGHbp-マトリックスを用いて避けられる。
それゆえH18,Q22,F25,D26,Q29,E65,K168及びE174での変化を持ったhGHミュータントはhGHbpに対する結合アフィニティーを増大している。これらの位置で全てのアラニン残基を持つ変異体は、個々のアミノ酸変化の加法に基づいて野生型hGHのものの約200倍大きい結合アフィニティーをもつと計算される。ここで実施例IIのデータを統合すると、この組み合わせのミュータントの18位でのAsp及び/または174位でのSerもまた野生型hGHよりhGHbpに対して有意に大きな結合アフィニティーをもつと期待される。
オフ-レート効果はオン-レート効果よりはるかに大きい(表2;図4)。それゆえ、アフィニティーに最も影響する同じ7残基はオフ-レートでの増大のほとんどを説明する(25倍まで)。3のArg側鎖(R64,R167及びR178)のAlaへの変換は、オン-レートでの最大の減少を生み出すが高々約2倍である。2のGlu側鎖(E65及びE174)のAlaへの変換は、オン-レートでの最大の増大を引き起こす(ほぼ2倍の改良)。これは静電気的相互作用が受容体へホルモンを導くもっとも重要な側鎖の決定因子であることを示す。
該データは界面のわずかな一連の隠れた側鎖だけが結合において機能的に重要であることを示す。いかなる理論に限定されることなく、これは分析方法のアーティファクトではないと考えられる。第一に、hGH・hGHbp複合体の構造が解決され、サイト1で隠れている残基がhGH(hGHbp)2複合体でhGHに対するサイト1でみられるものと実際に同一である。De Vos等,上記参照。それゆえ構造的エピトープが機能的エピトープよりずっと小さいという事実は、1:2複合体に対して1:1で結合するという接触差異のためではない(それは接触エピトープを定義するために用いられるコーディネートセットである)。
目的
hGHのサイト1のどの程度のアフィニティーが促進されるのかを決定することが望ましかった。また、hGHのどの側鎖が結合アフィニティー--アラニンスキャニングミュータジェネシスによって同定されるようなアフィニティーを調節するもの、接触するために結晶学によって同定されるもの、または両者--を促進するためにミューテートされるべきかを決定することも望ましかった。最後にもしミューテーションが実質的にアフィニティーを促進し得た場合、それらがミューテートされたホルモンのオン-レートまたはオフ-レートのいずれに影響することによってそれをなしたかを知ることが望ましかった。
hGHの非常に高アフィニティー変異体を、合計で約106タンパク質変異体をファージミド粒子に一価的にディスプレーしている5の別々のライブラリーから分類されたhGHのアフィニティー促進ミュータントを組み合わせることによって生産した。サイト1結合部位の全部で20の異なる残基がミューテートされた。アフィニティーにおいてほんのわずかな増大のみが各ミュータントの側鎖から寄与されたが、これらは結合の自由エネルギーの加法の増大を生み出した。このアプローチによって、野生型hGHより400倍もタイトに受容体を結合する15の置換をもつ一つのhGH変異体が生産された。
(a) 一般的方法
制限酵素、ポリヌクレオチドキナーゼ、T7DNAポリメラーゼ及びT4DNAリガーゼをGibco-BRLまたはNew England Biolabsから得て、製品の説明書にしたがって用いた。Lowman等,上記参照、およびLowmanとWells,上記参照に記述されているように、ランダムオリゴヌクレオチドカセットをリン酸化し、アニールしそして構成物につないだ。Sequenase(登録商標)酵素をUnited States Biochemicalから購入し、シングルストランドシークエンシングのため製品の説明書にしたがって用いた。Sanger等,上記参照。
可溶性ホルモンをコードするDNA分子を大腸菌において発現し(Chang等,上記参照)、浸透性ショックを受けた細胞から硫安沈殿し(Olson等,Nature,293:408[1981])、Coomassie染色されたSDS-PAGEゲルのレーザーデンシトメトリーによって定量した。Cunningham等,上記参照。さらにいくつかの変異体をMono-Qカラム(Pharmacia-LKB Biotechnology,Inc.)においてイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
hGHのMinihelix-1(41-46残基)のミュータジェネシスのため、phGHam-g3において存在するAatII部位を、オリゴヌクレオチド#718(5'-GCC ACC TGA TGT CTA AGA AAC-3')(SEQ.ID NO.1)を用いて破壊した。独特なSfiIとAatII部位をオリゴヌクレオチド#782(5'-TTT GAA GAG GCC TAT ATG GCC AAG GAA CAG AAG-3')(SEQ.ID NO.2)と#821(5'-CAG AAC CCC CAT TGA CGT CCC TCT GTT TC-3')(SEQ.ID NO.3)をそれぞれ用いてpH0779を創るためにphGHam-g3内に導入した。後者のオリゴヌクレオチドはまた+2フレームシフトと49残基の後にTGAストップコドンを導入した。ランダムなカセットを相補的オリゴヌクレオチド#822(5'-TC CCG AAG GAG CAG NNS NNS TCG TTC NNS NNS AAC CCG CAG ACG T-3')(SEQ,ID NO.4)と#823(5'-CTG CGG GTT SNN SNN GAA CGA SNN SNN CTG CTC CTT CGG GAT AT-3')(SEQ.ID NO.5)から構築した。元となるDNA(pH0779)を制限酵素SfiIとAatIIで切断し、大きい断片を精製しカセットとつないだ。ライゲーション生産物を、LowmanとWells,上記参照に記述されているように、2の等量でファージミド調製物に対してXL1-ブルー細胞内にエレクトロトランスフォームし、1×106の独立なトランスフォーマントをそれぞれ生産した。
Helix-1とHelix-4bプール由来のDNA(0,2または4周から選択された;Lowman等,上記参照)を精製し、制限酵素AccIとBstXIを用いて切断した。それから各Helix-1プール(F10,M14,H18及びH21でランダムにミューテートされた)を精製し、3の組み合わせライブラリー707A(非選択Helix-1プールとHelix-4bプール)、707B(2度選択されたHelix-1プールと2度選択されたHelix4bプール)、707C(4度選択されたHelix-1プールと4度選択されたHelix4bプール)を生産するために、各Helix-4bプール(E174S,F176YバックグランドでR167,D171,T175,I179でランダムにミューテートされた)由来の小さな断片とつないだ。二重のライゲーションもまた、ベクターDNAの10分の1から2分の1を用いて作製し、707D,707E及び707Fとしてデザインし、それらはそれぞれ0-,2-及び4-周のスタートライブラリーに相当した。これらの変異体プールはまた早期のhGH-ファージミド-結合選択で得られたE174S,F176Yミューテーションを含んだ。Lowman等,上記参照。ライゲーション産物pH0707A-Fをプロセッシングし、XL1-ブルー細胞内にエレクトロトランスフォームした。コロニー形成ユニット(CFU)に基づいて、各プールから得られた独立のトランスフォーマントの数は以下のようであった:pHO707Aからは2.4×106、pHO707Bからは1.8×106、pHO707Cからは1.6×106、pHO707Dからは8×105、pHO707Eからは3×105、及びpHO707Fからは4×105。hGH-ファージミド粒子を調製し、Lowman等,上記参照に記述されているように2から7サイクル以上のhGHbp結合に対して選択した。
hGHbpに対する平衡化結合アフィニティーを125IラベルhGH、ラベル変異体BDまたはラベル変異体852dとの競合により、結合バッファー:50mMTris,pH7.5、10mMMgCl2、0.1%ウシ血清アルブミン、0.02%アジ化ナトリウムにおいてhGH変異体をアッセイすることにより測定した。Lowman等,J.Biol.Chem.,266:10982-10988(1991)。hGH-hGHbp複合体の免疫沈降を、MAb5と示されるモノクローナル抗体を用いて実施した。Barnard等,Endocrinology,115:1805-1813(1984)。解離定数をスキャッチャード分析により得た。CunninghamとWells,1989,上記参照。変異体BDと852dは、もしヨウ素で処理されるとホルモン-受容体界面を乱し得るF176Yを含む。しかしながらヨウ素化BDは結合に対して125IラベルBDと競合する非ラベルBDから区別がつかなかった(つけられなかった)。
固定化されたhGHbpへのhGH変異体結合に対する会合及び解離レート定数を、Pharmacia BIAcoreTMバイオセンサーを用いて表面プラズモン共鳴(SPR)の測定により得た。このシステムでは、hGHbpをバイオセンサーチップに付着したデキストランマトリックスに共有結合で結合する。一定の流速でこの表面を通過する液相でホルモンを一定の濃度で維持する。この装置はバイオセンサー近傍の屈折指標の変化のためSPRシグナルの変化を感受することにより、リアルタイムでマトリックス上に結合したタンパク質の量を測定する。LofasとJohnsson,J.Chem.Soc.Chem.Commun.,21:1526-1528(1990)。
hGHbp(S201C)の変異体をマトリックス上の第二の受容体をブロックするため固定化種として用いた(実施例I参照)。hGHbp(S201C)を減少し、10mM酢酸ナトリウム(pH5.0)を用いて、デキストラン層のEDC/NHS活性化を経て、及び2-(2-ピリジニルジチオ)エタンアミン塩酸(PDEA)(活性化チオール)化学を経て、バイオセンサーチップに結合した。試薬と手順はPharmacia Biosensorから得た。結合と溶出工程を0.05%Tween-20を含むPBSバッファー(pH7.4)で3-20μL/分の流速で実施した。
ε[K]=[(δK/δKオフ)2(d[Kオフ])2+(δK/δKオン)2(d[Kオン])2]1/2 (1)
ε[K]=[(Kオン)−2(δオフ)2+(Kオフ)2(Kオン)−4(δオン)2]1/2 (2)
(a) hGH-受容体結合機能的エピトープ内の残基
hGH(hGHbp)2複合体の構造的分析(de Vos等,上記参照)により、第一の受容体が結合する場合にある程度隠れている状態にあるhGHのサイト1における30以上の側鎖が同定された(図6B)。これらのほとんどは構造的解明の前にアラニンミュータントとして試験されたが(CunninghamとWells,1989,上記参照;1991,上記参照)、第一のミニヘリックス(Minihelix-1)における4残基(K41,Y42,L45及びQ46)は評価されていなかった。それゆえこれらの残基をアラニンに変換し、結合アフィニティーにおける効果を[125I]-hGHを用いた競合的置換及び免疫沈降(CunninghamとWells,1989,上記参照)によってまたはPharmaciaから得たBIAcoreTMバイオセンサーを用いてそれぞれで測定した。両方法とも実施例Iで示されているように比較可能なアフィニティー測定値を与えた。
BIAcoreTM(+)またはRIA(マークなし)によって測定し、Cunningham等,1989,上記参照によって測定されたように野生型hGHに対するRIA値と相関して標準化した、野生型バックグランドでのhGHアラニンミュータントの受容体結合アフィニティー。アラニンまたはグルタミンミューテーションを野生型hGHのMinihelix領域内の側鎖の寄与を試験するために作製した。構造的エピトープと比較した、hGH(hGHbp)2複合体の結晶構造から由来する、受容体とのファンデルワールス接触の数もまた示されている。
構造的及び/または機能的サイト1エピトープ内の4残基を無作為化した5の別々のライブラリーを分類した(図7)。4のランダムコドンに各ライブラリーを制限することは、ライブラリーサイズ(平均約1×107の独立のトランスフォーマント)内にほとんどの考え得る変異体(約1×106DNA配列から生産される約2×105タンパク質配列)のサンプリングを許容した。
以前に、K172,E174,F176及びR178残基が無作為化され一価ファージミド粒子にディスプレーされた一つのライブラリー(Helix-4aと呼ばれる)を生産した。Lowman等,Biochemistry,上記参照。結合選択の2サイクル後、最もタイトな結合ミュータント(E174S,F176Y)は、野生型hGHの約5倍高いアフィニティーを持った。これらの2のミュータントをE174S,F176YバックグランドでR167,D171,T175及びI179がランダムにミューテートされた第二のライブラリー(Helix-4bと呼ばれる)内に固定した。選択の6周後、野生型hGHより約8倍タイトに結合する5のミュータントを単離した。別々のライブラリー(Helix-1と呼ばれる)において、F10,M14,H18及びH21残基をランダムにミューテートした。選択の4周後、野生型hGHより3倍タイトに結合する4のミュータント(F10A,M14W,H18D,H21N)を単離した。
hGH-ファージミドライブラリーの分類後に同定されたコンセンサス残基。結合選択の2から7周後の全てのシークエンスされたクローンの中で分画された代表物(Pf)に基づいた、ファージミドディスプレーライブラリー由来の最も頻繁に生じている残基が示されている。予想頻度(Pe)は出発ライブラリーでの理論的に各アミノ酸に対するNNSコドンの数から計算された。標準偏差(σn)はσn=[Pe(1-Pe)/n]1/2として計算された。少なくとも2σnによって期待される画分を上回ると見出された残基のみが、(すなわち[(Pf-Pe)/σn]≧2)示されている。Miniherix-1ライブラリーに対しては、n=17配列;Loop-Aライブラリー,n=26;Combinatorialライブラリー(Herix-1),n=68;Combinatorialライブラリー(Herix-4b),n=56。
(A)Minihelix-1または(B)Loop-Aでのミューテートされた個々のhGHクローンに対する結合データ。アフィニティー定数を125IラベルhGHに対するhGHbpの競合的結合によって測定した。野生型hGHアフィニティーについてはCunninghamとWells,1989,上記参照から得ている。hGHbpを結合するためのhGHのアフィニティーの倍の増大が、Kd(hGH)/Kd(ミュータント)の割合で示されている。いくつかのクローンは検出されなかった(ND)。同一のアフィニティーを等量の変異体(+)に対して仮定した。偽のミューテーションを持つクローン(E65V‡;S57Y§;N47Y¶;P48S@)が示されている。
付加的要素にしたがって、タンパク質の非相互作用部分でのミューテーションが、結合の自由エネルギーの単純な付加的変化を生み出すために組み合わされるべきである(Wells,1990,上記参照)。それゆえファージディスプレーライブラリーから単離された置換と組み合わせることによってサイト-1を通じたhGH結合を改良するため調査された(図7)。Helix-1ライブラリー由来のhGHの3の最もタイトな結合変異体(A=F10H,M14G,H18N,H21N,B=F10A,M14W,H18D,H21N,C=M14S,H18F,H21L)をHelix-4bライブラリーで見出された3の最もタイトな結合変異体(D=R167N,D171S,E174S,F176Y,I179T,E=R167E,D171S,E174S,F176Y,F=R167N,D171N,E174S,F176Y,I179T)のそれぞれに接合した。全ての構築物を変異体Aを含むものを除いて野生型hGHの産出量に近づけた産出量で得た。変異体A及び組換え体AD,AE,AFは、非還元SDS-PAGEではダイマー(約44kDaのMW)、還元の場合にはモノマー(約22kDaのMW)で移動した。これらのタンパク質は付加的なCys残基を含んでいないが、それらが最初に非共有結合ダイマーを形成するのであれば、ジスルフィド交換が生じ得た。実際hGHはヘリックス1及び4での残基に関与する弱いダイマー複合体を形成することが知られている。Cunningham等,Science,253,1991上記参照。それにもかかわらず、これらのタンパク質はジスルフィドダイマーを形成したので、それらをさらに追求しなかった。変異体Cもまたジスルフィドダイマー形態で優勢に生産される;しかしながらCD,CE,CF組換え体は有意な量のダイマーを形成しなかった。
分析された全ての組換え体が元となる構成要素以上のアフィニティーにおける累積的な増大を示した(表6)。BD変異体は最も強いアフィニティーを持ち、それは野生型hGHの30倍タイトであった。Minihelix-1ライブラリー由来の最もタイトな結合変異体(K41I,Y42H,L45W,Q46W)と、Loop-Aライブラリー由来の最もタイトな形態の一つ(F54P,R64K)をヘキサミュータントhGH852bを生産するために組み合わせ、hGH852bのアフィニティーは野生型hGHの約40倍であった。これをhGH変異体852dを生産するためにBD組換え体に入れ込み、852dは野生型hGHより約400倍タイトに結合した。単純な加法を仮定すると、この変異体は個々の構成要素によるアフィニティーの改良の産物から由来して、hGHより約600倍タイトに結合するであろう;この計算値は本結果に合理的に近い。852d変異体は無作為化された20残基の5だけが野生型として維持されている(E56,I58,K172,T175,R178)。
組換えhGH変異体の平衡結合定数。結合定数をhGHbpとMab5を用いて125Iラベル野生型hGH、BDまたは852dのそれぞれの競合的置換によって測定した(CunninghamとWells,1989,上記参照)。結合アフィニティーにおける倍の改良はKd(hGH)/Kd(変異体)として表される。いくつかのアフィニティー(+)はLowman等,Biochemistry,上記参照から得られている。Helix-1変異体はB=(F10A,M14W,H18D,H21N)及びC=(M14S,H18F,H21L)である。Helix-4変異体はD=(R167N,D171S,E174S,F176Y,I179T)、E=(R167E,D171S,E174S,F176Y)及びF=(R167N,D171N,E174S,F176Y,I179T)である。BD,BF,CD,CE,CFはこれらのミューテーションの組み合わせを表す。852b=(K41I,Y42H,L45W,Q46W,F54P,R64K)及び852d=BD+852b。
独立に分類されたライブラリー由来の組み合わせミュータントで見出された単純な付加にもかかわらず、複雑な付加がある近傍の置換に対して観察されている(例えばF176YはE174Sと相互作用する)。Lowman等,Biochemistry,上記参照。ヘリックス1からミューテートされたいくつかの側鎖は(F10,M14,H18,H21)、ヘリックス4でミューテートされたもの(R167,D171,T175及びI179)と潜在的に接触し得る。それゆえHelix1とHelix4bライブラリー(Huse等,Science,246:1275-1281[1989];Clackson等,Nature,352:624-628[1991])から由来する分類ミュータントに対する組み合わせアプローチを調査した。独立の結合選択を0,2または4サイクルでHelix-1とHelix-4bで実施した。Helix-1プール由来のDNAを同じ周数に対するhGHbpへの結合によって分類されたHelix-4b由来のDNAと共につないだ。それから3の組み合わせライブラリーを付加的な2から7サイクルに分類し、68の代表的なクローンをシークエンスした(表7)。
組み合わせライブラリーのホルモン-ファージミド結合選択由来のhGH変異体。非組換え体である野生型Helix4配列(-)をもつものを除いて全ての変異体が(E174S,F176Y)を含む。ライブラリー707A,707B及び707Eまたは707CをhGHbpに対する結合によって2から7サイクルに分類した(テキスト参照)。Pの下に掲げられている数は、シークエンスされたクローンの間でのわずかな発生を示す。#の下に掲げられている数は各独立の単離物を表す(例えばpHO714A.1が第一の配列である)。いくつかのアフィニティーはLowman等,Biochemistry,上記参照から得ている;等しい値は同一の値を持つものと仮定している(+)。いくつかの変異体は>10%のジスルフィドダイマーとして表した(‡)。あるクローンはアンバー(SupE株においてTAG=Gln)コドンを含み(§)、あるものは偽のミューテーション、E174Nを含み(¶)、またあるもの(@)は二つの偽のミューテーション(L15R,K168R)を含む。いくつかの変異体は発現されず(NE)または分析されなかった(ND)。
組み合わせ手段によって分類されたいくつかの配列は、2の独立のライブラリーから選択されたものと全く異なった;しかしこれは統計学的な理由が生じ得る。例えばHelix-1及びHelix-4bライブラリーは約106の異なるDNA配列を含み、もし(前選択なく)組み合わせられると、1012のあり得る組み合わせを含み得る。トランスフォーミング効率は-107の独立のクローン以下のサンプリングサイズが限界である。それゆえ同じ配列の選択はこれらのライブラリーで生じ得る配列の高多様性に顕著に与えられ、選択されたアフィニティーに穏やかな改良を与えられる。
結合アフィニティーに対するファージ改良残基のいくつかの寄与を野生型hGHにそれらを導入することによって、またはアフィニティー成熟BD変異体における野生型残基にそれらを戻すことによって評価した(表8)。K41I,Y42H,L45W,Q46W変異体は、野生型hGHの4.5倍タイトに結合した。hGHにおける単一のミュータントのそれぞれはアフィニティーにおいて1.7から2.5倍の減少を引き起こした。これらはこの部位でのミューテーションの組み合わせがアフィニティー改良に対して重大であることを示す。これらの残基はミニヘリックス-1の一表面で近接した位置で存在する。
ファージディスプレーによって同定された個々の側鎖の寄与の試験。変異体の受容体結合アフィニティーをBIAcoreTM(+)またはRIA(印なし)によって測定し、CunninghamとWells,1989,上記参照によって測定されたようにhGHに対するRIA値に標準化した。ファージ分類後に見出された個々の側鎖の寄与を試験するためにポイントミューテーションを為した。アフィニティーにおける倍の減少をKd(リバータント)/Kd(元のもの)として表し、そこでは元のものがミュータジェネシスのために用いられるバックグランドである。
実施例Iでは、受容体結合に際してサイト1で隠れるようになるhGH内の残基で生産されるアラニンミュータントに対する結合の速度論を測定するために、BIAcoreTMバイオセンサー装置を用いた。ここで選択されるアフィニティー改良に対する分子ベースのよりよい理解のため、hGHbpに対する結合の速度論を測定するためにBIAcoreTMバイオセンサーを用いた(表9)。一般的に野生型hGH由来のアフィニティーが増大するにつれて、オフ-レートはオン-レートのわずかな変化と共に減少した。実際最高アフィニティーミュータント、852dに対する野生型由来の作用では、オフ-レートにおいて>60倍の減少があるが、オン-レートでは4倍の増加があるに過ぎなかった。(オフ-レートはあまりに遅くて正確には測定できなかったが、もしRIAとオン-レートによって測定されたKdから計算すると、オフ-レートは野生型hGHより100倍遅いであろう。) hGH結合部位はhGHのホモローグ、ヒト胎盤ラクトゲン(hPL)内に以前に挿入された。これはhGHとは15%だけ配列において差異があり、〜2000倍弱く結合する。Lowman等,J.Biol.Chem.,上記参照。挿入されたhPL変異体は、hGHと同様の結合に対する速度論的パラメーターをもつ(表9)。アフィニティー成熟hGH変異体と同様に、この変異体は野生型hPLと相対的にオン-レート(約10倍)と比較してオフ-レート(〜100倍)でより大きい改良を示す。オフ-レートがファージ選択物の間で最も影響されるという事実は、分類が平衡に近づけるコンディションの元で実施されたことを示す。
hGH変異体の結合速度論。BIAcoreTMバイオセンサー測定を、PBSバッファー+0.05%Tween-20内の固定化hGHbp(S201C)を用いて実施した。BIAcoreTMバイオセンサーKdを、hPLを除いてKオフ/Kオンから計算し、hPLに対してはKオンとKオフを測定しKオフを計算した(+)。Kdの割合はBIAcoreTMバイオセンサーデータにしたがったwt-hGHに対する結合アフィニティーの倍の増大を示す。hGHにおけるミュータントの組み合わせをローマ数字で表す。hPL(0274)はV4I,D56E,M64R,E174A,M179Iを含む。
受容体と接触する位置にあるため、またはアラニンに変換された場合結合アフィニティーに影響するため、重要であると考えられるhGHの領域をランダムにミューテートした。それゆえ、これらのライブラリー由来の平均的なランダムなミュータントは野生型hGH由来の結合アフィニティーを劇的に減少すべきである。しかし選択の2,3の周のみの後では、単離物は野生型と同等及びしばしばより高いアフィニティーで結合した。単離されたクローンは通常野生型とは異なるコンセンサス配列を示した(表4)。
これらの研究は、側鎖が受容体と接触する範囲によっては相関関係は容易には評価されないことを示す。これを評価するもう一つの方法は、野生型残基が受容体によって隠されている範囲と、結合選択の後野生型残基の保存性を相関することである。図8Aに示されているように、全般的にファージミドライブラリー由来の野生型残基の保存性と本質的に相関関係はない(R2=0.022)。これはまた図6Bと図6Cを比較することによっても明らかである。しかしながら3の最も保存的な側鎖(T175,R178,L45)は全て受容体との実質的な接触をなす。
これらのデータは、アラニンスキャニングミュータジェネシスによって決定された機能性が結合選択の後配列保存性によって決定されたものと同様であることを示す。しかしながら天然の変異体成長ホルモンの間の与えられた残基の保存性の頻度と、ファージ-ディスプレーライブラリー由来の結合選択に引き続く保存性の間に何の相関関係もない(R2=0.005)(図8C)。天然では、成長ホルモンに対する機能的な選択圧がin vitro結合選択によるものと一致していない。
もう一つのクラスの残基(H21,Y42,Q46及びR167)は界面で高く隠れているが、アラニンに置換した場合結合アフィニティーにほとんど、または全く影響を持たない。これらの残基はまれに野生型残基に戻って分類される。例えばH21はAsnに分類される傾向があった;Y42はしばしばArgまたはGlnとして戻った;Q46はTrpを好み、R167はしばしばAsnに分類された(表4,5及び7;Lowman等,Biochemistry,上記参照)。これらの隠れた残基で見出されるコンセンサスにもかかわらず、それらからなされるアフィニティーの増大は大変小さかった(表8)。それゆえ機能的に不活性な接触残基からアフィニティーにおける改良を得るのはより困難と思われた。
機能的データは構造的データより最適化のための目標となる残基についてさらに重要となり得る。例えば受容体と接触しない(F10,M14及びF54)が、アラニンに置換されると結合に影響するいくつかの残基は、ランダムにミューテートされるとアフィニティーの増大を生み出した。さらに受容体と接触するが、アラニンスキャニングミュータジェネシスによってほとんど機能的な有意性を持たないいくつかの残基(Y42,Q46)は、ファージミューテーションがポイントミューテーションとして調べられた場合、アフィニティーを改良しない(表8)。
B2036変異体
さらにGH変異体ポリペプチドをポリペプチドにおける置換残基の数を限定することによって潜在的な免疫原性を減少するが、サイト1での増大した結合アフィニティーを維持する目的を持って構築した。この実験の第2の目的は、分子内に存在する、特に受容体とのGHの結合において重要な部位に存在するリシン残基の数を限定し、それによってポリエチレングリコールを用いて修飾する(「ペグ化する」)ために変異体をよりよい候補にし、一方でその受容体に対する変異体の増大したアフィニティーを保護することであった。
それゆえ「スーパーミュータント」852dの生産のために上述したデータを用いて、さらなる変異体B2036を上述した方法を用いて構築した。852dは以下の置換を持つ:F10A,M14W,H18D,H21N,K41I,Y42H,L45W,Q46W,F54P,R64K,R167N,D171S,E174S,F176Y,I179T。
対照的にここで構築された変異体(B2036)は以下の置換をもつ:H18D,H21N,G120K,R167N,K168A,D171S,K172R,E174S,I179T。
B2036は120残基でグリシンをさらにもとに戻し得、それによって852dと比較してヒトにおける抗原性を減少していると予想される作用剤としての使用に対する候補を生産することが期待される。同様に、サイト1界面内のリシン残基の数が「スーパーミュータント」と比較して減少しているので、該候補はより最適にペグ化し得るであろう。
B2024変異体
さらにGH変異体ポリペプチドをポリペプチドにおける置換残基の数を限定することによって潜在的な免疫原性を減少するが、サイト1での増大した結合アフィニティーを維持する目的を持って構築した。この実験の第2の目的は、分子内に存在する、特に受容体とのGHの結合において重要な部位に存在するリシン残基の数を限定し、それによってポリエチレングリコールを用いて修飾する(「ペグ化する」)ために変異体をよりよい候補にし、一方でその受容体に対する変異体の増大したアフィニティーを保護することであった。
それゆえ、野生型成長ホルモンより成長ホルモン受容体からの遅い「オフ-レート」を持つ成長ホルモン受容体を生産するために、アラニンミューテーションを部位特異的ミュータジェネシスと組み合わせた。変異体B2024はそれゆえ以下の配列を持つ:H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,K168A,E174A,G120K。
B2024は120残基でグリシンをさらにもとに戻し得、それによってヒトにおける抗原性を減少していると予想される作用剤としての使用に対する候補を生産することが期待される。同様に、サイト1界面内のリシン残基の数が「スーパーミュータント」と比較して減少しているので、該候補は852dと比較してより最適にペグ化し得るであろう。
B2036変異体の生産
B2036変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがって生産した。
方法
(a) 発現ベクターとホスト細胞
大腸菌においてB2036変異体の発現のため用いられるベクターはpMY233であった(図10)。プラスミドpMY223はよく特性指摘されたプラスミドpBR322が元になっており、hGH生産プラスミドpHGH4RとB2036コード配列がhGHコード配列に置き変わっていることを除いて同様である(Chang等,Gene,55:189-196[1987])。pMY223はテトラサイクリン系抗生物質耐性をコードするが、pBR322とは異なりβ-ラクタム系抗生物質(ペニシリン、アンピシリン等)に感受性である。
pMY223によってコードされるB2036変異体と野生型ヒト成長ホルモン配列の間のアミノ酸差異は、これらの部位でのコドンに沿って表10に示されている。
pMY223によってコードされるB2036変異体と野生型hGHの間の配列差異
プラスミドpB2036はphGHam-g3(その構築はLowman等,Biochemistry,30:10832-10838[1991]に記述されている)としても知られているプラスミドpSO643から由来し、それは実施例IIに記述されているファージディスプレー研究で用いられるスタートプラスミドであった。pB2036はB2036コード配列がhGHコード配列と置き換わっている点でpSO643とは異なる。
スタート株、大腸菌W3110はF−とラムダ-耐性である大腸菌K-12の誘導体である。rrnDとrrnEの間の染色体の逆位を帯びることが示されている。
fhuA遺伝子(以前にtonAと示されていた)を、fhuA遺伝子内へのTn10の挿入に引き続き、Tn10の不正確な摘出によってW3110から欠失した。結果として得た株1A2はバクテリオファージT1,T5及びΦ80に耐性である。
deoC2ミュータントはデオキシリボースリン酸アルドラーゼを除去したものだが、それをP1コトランスダクションによって導入した。deoCローカスは一般的にスレオニン生合成ローカスにリンクしている。スレオニン栄養要求体をTn10挿入と不正確な摘出によって作った。それからスレオニン栄養要求体をdeoC2ミュータントで成育したP1ファージを用いてスレオニンプロトトロフィーに変換した。deoC2ミュータントの存在は結果として生じた株、16C9が炭素源として0.2%チミジン上では成育できないことによって確認した。
ilvG2096(Val')ミューテーションをホモゲノタイゼーション(homogenotization)によって導入した。このミューテーションは野生型K-12にバリンに対する感受性を引き起こすフレームシフトを繰り返す。23E3株をilvG2096(Val')マーカーとアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドを用いてトランスフォームした。同時にプラスミドを失いilvG2096(Val')ローカスを得た33B6株をバリン耐性からアンピシリン感受性クローンをスクリーニングすることによって同定した。最終株、33B6のの重要な性質は、l1ファージに耐性であり、リン酸が枯渇した場合(それは産物合成を誘導するために用いられるコンディションである)、アルカリホスファターゼを過剰生産せず、プロテアーゼを欠きそしてバリン毒性に感受性でないというものである。
B2036変異体の発現のためのpMY223ベクターを含む33B6細胞(以下では「33B6/pMY223細胞」という)の懸濁液を以下のように生産した。
1000-L発酵に必要とされるアミノ酸を以下の構成成分を無菌的に混ぜることによって調製した:
3.2kg 酵母抽出物;
24kg HY-CASE AMINO(Quest,Int'l,Hoffman Estates,IL);
50g メチオニン;
135L 脱イオン水。
以下の構成成分を3-5mMO2/L-分で流出可能な1000-L発酵槽に移した:
1.0L FERMAX ADJUVANT 27気泡防止剤(OSI Specialties Group,Witco Corp.,South Charleston,WV);
1820.0g リン酸ナトリウム二塩基酸;
910.0g リン酸ナトリウム一塩基酸二水和物;
3500.0g 硫酸アンモニウム;
700.0g クエン酸ナトリウム二水和物;
1050.0g 塩化カリウム;
700.0L 脱イオン水。
発酵槽を121℃で30分攪拌した。冷却後、以下のものを攪拌された発酵槽内に無菌的に移した:
50kg 上記したアミノ酸栄養物;
7.7L 1M硫酸マグネシウム;
350ml 2.7%塩化鉄(III);
350ml 微量元素溶液;
2L 5mg/mlテトラサイクリンアルコール;
1L 50%グルコース。
3と5mMO2/L-分の間を供給するために十分な空気混和と攪拌で、発酵槽を37℃で稼動し、pHをおよそpH7.3で維持した(すなわち7.0と7.5の間)。
接種後およそ32時間で、カルチャーを60℃で30秒の熱殺菌によって不活性化した。それから細胞懸濁液を遠心分離によって回収し、顆粒に凍結した。
発酵回収物由来の凍結顆粒(以下では「細胞ペレット」という)を使用の前-60℃以下で貯蔵した。kg細胞ペレット当たり5Lの抽出バッファー(室温で6M尿素、0.02MTris,pH7.65)を、被覆された抽出タンクに攪拌しながらゆっくりと加えた。気泡形成を最小化した。ペレットの全てが溶液中にあるまで懸濁液を4℃で混ぜた。pHを8.0に調節し、溶液を抽出物を形成するため4℃で2時間混ぜた。抽出物のリットル当たり3Lの水と10mlの5%ポリエチレンイミン(PEI)を攪拌しながら加えた。
抽出物をAlfa Laval AX213継続フロー遠心機を通過させて純化した。懸濁液を維持するために抽出物を継続的に攪拌し、遠心機内におよそ20リットル/分(LMP)の速度で与えた。上清を被覆回収タンクにおいて集め、温度を4℃に維持するようにセットした。抽出物が遠心機内で完全に与えられたら、およそ75Lの精製水(4℃)を遠心機から純化された大腸菌抽出物を回収するために遠心機内に与えた。
純化した大腸菌抽出物をDEAE TRISACRYL LS PLUS(容量=0.36L/kg細胞ペースト)のカラムを4℃で稼動して精製した。流す前に平衡化バッファー(0.05MTris-HCl,pH8.0,4℃)で洗浄して平衡化した。それからカラムを純化した大腸菌抽出物と共に注入し、溶離剤のUV吸収がベースラインになるまたはそれに近づくまで、少なくとも3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した。カラムを溶出バッファー(3M尿素、プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン、それぞれ18mM,pH5.0)で溶出した。カラムの注入、洗浄及び溶出を本実施例における全てのクロマトグラフィー工程についての標準的な流速で実施した。UV吸収溶離物の画分を集め、SDS-PAGEによって分析した。B2036変異体を含む画分をプールした。
DEAE TRISACRYL LS PLUSプールをpH調節し、DEAE SEPHAROSE FAST FLOW(容量=1.47L/kg細胞ペースト)のカラムで精製した。DEAE TRISACRYL LS PLUSプールのpHを2%水酸化ナトリウムを用いて4℃で約7.2に調節した。平衡化バッファー(0.05MTris-HCl,pH8.0,4℃)で洗浄し平衡化した。それからカラムをpH調節プールと共に注入し、溶離剤のUV吸収がベースラインになるまたはそれに近づくまで、少なくとも3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した。カラムを溶出バッファー(3M尿素、プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン、それぞれ18mM,pH5.0)で溶出し、UV吸収溶離物の画分を集め、SDS-PAGEによって分析した。B2036変異体を含む画分をプールした。
DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをpH調節し、さらにQ SEPHAROSE FAST FLOW(容量=0.43L/kg細胞ペースト)のカラムを4℃で稼動して精製した。DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールのpHを2%水酸化ナトリウムを用いて4℃で約7.2に調節した。平衡化バッファー(0.05MTris-HCl,pH8.0)で平衡化し、pH調節プールと共に注入した。カラムを1カラム容量の平衡化バッファーで洗浄し、0.05MNaCl、0.05MTris,pH8.0でスタートし0.20MNaCl、0.05MTris,pH8.0で終了する直線勾配を用い、各バッファー3カラム容量を用いて溶出した。画分を集め、SDS-PAGEによって分析し、B2036変異体を含む画分をプールした。
コンディションを整えた後、Q SEPHAROSE FAST FLOWプールをPHENYL TOYOPEARL 650Mカラム(容量=0.50L/kg細胞ペースト)を室温で稼動してさらに精製した。Q SEPHAROSE FAST FLOWプールを調節バッファー(1.2M硫酸ナトリウム、0.05MTris,pH7.2)を用いて、Q SEPHAROSEプールの容量の1.5倍に等しい調節バッファーの容量を加え、約15分結果として生じた溶液を攪拌することによって整えた。それから溶液を室温に移した。カラムを0.22μインレットフィルターを通して3カラム容量の平衡化バッファー(0.75M硫酸ナトリウム、0.05MTris,pH7.2)を用いて平衡化した。それから完全に調節されたプールを0.3μ Pall Profileインレットフィルターを通してカラムに注入した。0.75M硫酸ナトリウム、50mMTris,pH7.2でスタートし、50mMTris,pH7.5で終了する直線勾配を用いてカラムを溶出した。各バッファー3カラム容量を用いた。画分を集め、SDS-PAGEによって分析し、B2036変異体を含む画分をプールした。
0.05MTrisバッファー内にB2036変異体を交換することによって、PHENYL TOYOPEARLプールにおける塩を減少するためSEPHADEX G-25カラムを用いた。カラムは4℃で稼動した。注入の容量をカラムの全層容量の最大30%に制限した。カラムを3カラム容量の平衡化バッファー(0.05MTris,pH7.2)を用いて平衡化し、それからPHENYL TOYOPEARLプールと共に注入した。カラムを0.05MTris,pH7.2を用いて溶出した。280nmでのODが増大し始めたら、OD280がベースライン近くに落ちるまでプールを回収した。
SEPHADEX G-25プールをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0.04L/gタンパク質)を4℃で稼動させてさらに精製した。カラムを最低3カラム容量の平衡化バッファー(0.05MTris,pH8.0)を用いて平衡化した。それからカラムをSEPHADEX G-25プールと共に注入した。カラムに対する注入リミットは樹脂のリットル当たり2gタンパク質であった。カラムをおよそ10カラム容量の溶出バッファー(2M尿素プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン、各17mM,pH5.0)を用いて溶出した。溶離物の280nmでのODが0.1の値に到達したら、OD280が0.5の値以下に下がるまで画分を集めた。該画分をSDS-PAGEによって分析し、B2036変異体を含む画分をプールした。
DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをQ SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0.07L/タンパク質のg)を4℃で稼動させて濃縮した。カラムを少なくとも4カラム容量の0.1MHEPES,pH7.7を用いて平衡化した。完全なDEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをカラムに注入し、カラムを少なくとも4カラム容量のバッファーで洗浄した。カラムをおよそ2カラム容量の溶出バッファー(0.1MHEPES、0.22MNaCl,pH7.7)を用いて溶出した。溶離物の280nmのODが2.0を越えたら、OD280が2.0以下に落ちるまでプールを集めた。
B2036変異体はホスト細胞不純物及びCoomassieブルー染色を用いたSDS-PAGEによって決定されるような変異体のいかなる既知の有意な減損形態から本質的に遊離した。
B2024変異体の生産
B2024変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがって生産した。
方法
(a) 発現ベクター及びホスト細胞
pMY216はB2036コード配列の代わりにB2024コード配列を含む点を除いて、pMY223(実施例Vに記述されている)と同様にプラスミドpMY216を用いて大腸菌33B6でB2024変異体を発現した。
B2024変異体の発現のためのpMY216ベクターを含む33B6細胞(以下では「33B6/pMY216細胞」という)の懸濁液を以下のように生産した。
以下の構成成分を3-6mMO2/L-分で流出可能な60-L発酵槽に移した:
60.0ml FERMAX ADJUVANT 27気泡防止剤(OSI Specialties Group,Witco Corp.,South Charleston,WV);
156.0g リン酸ナトリウム二塩基酸;
78.0g リン酸ナトリウム一塩基酸二水和物;
300.0g 硫酸アンモニウム;
60.0g クエン酸ナトリウム二水和物;
90.0g 塩化カリウム;
36.0L 脱イオン水。
発酵槽を121℃で30分攪拌した。冷却後、以下のものを攪拌された発酵槽内に無菌的に移した:
600.0ml 1M硫酸マグネシウム;
60.0ml 2.7%塩化鉄(III);
60.0ml 微量元素溶液;
120.0ml 5mg/mlテトラサイクリンアルコール;
90ml 50%グルコース;
6.0L 10%NZ Amine A(Quest,Int'l,Hoffman Estates,IL);
48L 脱イオン水。
33B6/pMY216細胞を、光学濃度(OD)が4の600nmで1-L材料として発酵槽に無菌的に移した。できるだけ長く空気飽和の0%に溶解酸素を維持して、カルチャーの要求に合うように十分なグルコースを与え、しかし発酵槽内のグルコース蓄積を避けて、発酵槽を稼動させた。形成されたいかなる酢酸も短時間(通常30分より短いが2時間を超えることはない)で再消費されるようにグルコースを与えた。pHを47g/LのL-ロイシンを含む12N水酸化アンモニウムまたは24%硫酸を用いてコントロールし、FERMAX ADJUVANT 27を気泡のコントロールのため用いた。
接種後およそ40時間で、カルチャーを60℃で30秒の熱殺菌によって不活性化した。それから細胞ペーストを遠心分離によって回収し凍結した。
発酵回収物由来の凍結細胞ペーストを使用の前-60℃以下で貯蔵した。細胞ペーストを4℃でオーバーナイトで溶解した。kg細胞ペレット当たり5Lの抽出バッファー(4℃で6M尿素、0.02MTris,pH8.5)を細胞ペーストに加えた。細胞を攪拌し気泡形成を最小化しながら、ULTRATURREXホモゲナイザー(Tekmar,Cincinnati,OH)を用いてバッファーにおいてホモゲナイズした。温度を4℃に維持し、細胞の全てが懸濁液中にあるまで懸濁液を混ぜた。pHをおよそ8.1に調節した。溶液を抽出物を形成するため4℃で2時間混ぜた。抽出物のリットル当たり1Lの水と20mlの5%PEIを攪拌しながら加えた。
抽出物をAlfa Laval BTPX205継続フロー遠心機を通過させて純化した。懸濁液を維持するために抽出物を継続的に攪拌し、遠心機内におよそ2LPMの速度で与えた。上清を4℃で受容タンクにおいて集めた。全抽出物が遠心機内で与えられたら、およそ5-10Lの精製水(4℃)を遠心機から純化された大腸菌抽出物を置き換えるために遠心機内に与えた。純化した抽出物を、伝導度が2.0mSより小さく測定されるまで精製水(4℃)を用いて希釈した。
純化した大腸菌抽出物をDEAE TRISACRYL LS PLUS(容量=0.50L/kg細胞ペースト)のカラムと、連続的なDEAE SEPHAROSE FAST FLOW(容量=2.6L/kg細胞ペースト)のカラムで4℃で稼動して精製した。流す前に平衡化バッファー(0.02MTris-HCl,pH8.5,4℃)で洗浄して平衡化した。それからDEAE TRISACRYL LS PLUSカラムを純化した大腸菌抽出物と共に注入した。カラムを溶離剤のUV吸収がベースラインになるまたはそれに近づくまで、少なくとも3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した。それからDEAE TRISACRYL LS PLUSカラムをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラムから取り外した。B2024変異体は、pH勾配溶出バッファー(3M尿素、プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン、及びグリシルグリシン、それぞれ10mM,pH5.0)で、DEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラムから溶出した。カラムの注入、洗浄及び溶出を本実施例における全てのクロマトグラフィー工程についての標準的な流速で実施した。溶離物の光学濃度と画分のSDS-PAGE分析に基づいて、B2024変異体を含む画分を集めた。
DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをpH調節し、さらにQ SEPHAROSE FAST FLOW(容量=0.67L/kg細胞ペースト)のカラムを4℃で稼動して精製した。DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールのpHを2%水酸化ナトリウムを用いて4℃でpH8.5に調節した。平衡化バッファー(0.02MTris-HCl,pH8.5,)で平衡化し、pH調節プールと共に注入し、0.02MTris,pH8.5でスタートし0.10MNaCl、0.08MMES,pH6.5で終了する直線勾配を用い、各バッファー2.5カラム容量を用いて溶出した。画分を集め、SDS-PAGEによって分析し、B2024変異体を含む画分をプールした。
コンディションを整えた後、Q SEPHAROSE FAST FLOWプールをPHENYL TOYOPEARL 650Mカラム(容量=0.20L/kg細胞ペースト)を室温で稼動してさらに精製した。Q SEPHAROSE FAST FLOWプールを調節バッファー(2M硫酸アンモニウム、0.04MTris,pH7.2)を用いて、Q SEPHAROSEプールの容量に等しい調節バッファーの容量を加え、均一になるまで結果として生じた溶液を攪拌することによって整えた。それから溶液を室温に移した。カラムを2から3カラム容量の平衡化バッファー(1.0M硫酸アンモニウム、0.02MTris,pH7.2)を用いて平衡化した。それから完全に調節されたプールをカラムに注入し、1M硫酸アンモニウム、20mMTris,pH7.2でスタートし、精製水で終了する直線勾配を用いてカラムを溶出した。各バッファー4カラム容量を用いた。画分を集め、SDS-PAGEによって分析し、B2024変異体を含む画分をプールした。
0.02MTrisバッファー内にB2024変異体を交換することによって、PHENYL TOYOPEARLプールにおける塩を減少するためSEPHADEX G-25カラムを用いた。カラムは4℃で稼動した。注入の容量をカラムの全層容量の最大30%に制限した。カラムを3カラム容量の平衡化バッファー(0.02MTris,pH8.0)を用いて平衡化し、それからPHENYL TOYOPEARLプールと共に注入した。カラムを0.02MTris,pH8.0を用いて溶出した。280nmでのODがおよそ0.2に増大したら、OD280が0.2以下に落ちるまでプールを回収した。
SEPHADEX G-25プールをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0.04L/gタンパク質)を4℃で稼動させてさらに精製した。カラムを最低3カラム容量の平衡化バッファー(0.02MTris,pH8.0)を用いて平衡化した。G-25プールを洗浄のため等量の水を用いて希釈し、結果として生じた溶液を均一になるまで混ぜ、それからカラムに注入した。カラムをおよそ10カラム容量の溶出バッファー(2M尿素プラスMES、MOPS、Tris-HCl、TEA-HCl、グリシン及びグリシルグリシン、各10mM,pH5.0)を用いて溶出した。溶離物の280nmでのODが0.1の値に到達したら、OD280が0.5の値以下に下がるまで画分を集めた。該画分をSDS-PAGEによって分析し、B2024変異体を含む画分をプールした。
DEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをDEAE SEPHAROSE FAST FLOWカラム(容量=0.06L/タンパク質のg)を4℃で稼動させて濃縮した。カラムを少なくとも4カラム容量の0.02MTris,pH8.0を用いて平衡化した。完全なDEAE SEPHAROSE FAST FLOWプールをカラムに注入し、カラムを少なくとも2カラム容量の0.02MMESバッファー,pH6.5で洗浄した。カラムをおよそ2カラム容量の0.1MNaCl、0.02MMES,pH6.5で、引き続き2カラム容量の0.15MNaCl、0.02MMES,pH6.5を用いて溶出した。溶離物の280nmのODが2.0を越えたら、OD280が2.0以下に落ちるまでプールを集めた。
B2024変異体はホスト細胞不純物及びCoomassieブルー染色を用いたSDS-PAGEによって決定されるような変異体のいかなる既知の有意な減損形態から本質的に遊離した。
PEG(5000)を用いたB2036変異体のペグ化
M-SPA-PEG(5000)をB2036hGH変異体をペグ化するために用いた。B2036変異体のペグ化を以下のプロトコールにしたがって実施し、それはまた野生型hGH及びB2024変異体のような他の変異体のペグ化にも適している。
(a) ペグ化反応
実施例IVで示されたように生産された精製B2036変異体をM-SPA-PEG(5000)(Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,AL)と反応させたが、それはB2036変異体調製物に固体として加えられた。該反応は一定の攪拌と共に室温で実施することが可能であった。略記すると、B2036変異体調製物を0.1MHEPES,pH7.7を用いて最終タンパク質濃度が10mgB2036変異体/mlになるように希釈し、室温での実施を可能にした。室温溶液のpHは約7.5であった。固体のM-SPA-PEG(5000)を攪拌しながら20g/Lの濃度にするために調製物に加えた。pHを7.5±0.1に維持した。反応はM-SPA-PEG(5000)の添加後2時間以内に完成した。
ペグ化B2036変異体調製物を条件を整え、それからPHENYL TOYOPEARL 650Mカラム(容量=0.13L/gB2036変異体)を室温で稼動して精製した。ペグ化B2036変異体調製物の容量に等しい容量のクエン酸コンディショニング溶液(0.8Mクエン酸ナトリウム、0.05MTris,pH7.7)を加え、室温で約15分結果として生じた溶液を攪拌することによって、ペグ化B2036変異体調製物の条件を整えた。少なくとも1カラム容量の平衡化バッファー(0.40Mクエン酸ナトリウム、0.05MTris,pH7.5)を用いて室温でカラムを平衡化した。それから整えられたペグ化B2036変異体調製物をカラムに注入した。0.40Mクエン酸ナトリウム、50mMTris,pH7.5でスタートし、50mMTris,pH7.5で終了する4カラム容量直線勾配を用いてカラムを溶出した。カラム注入、洗浄及び溶出は本実施例の全てのクロマトグラフィー工程で通常の流速で実施した。画分を集め、SDS-PAGEで分析し、PEG-B2036変異体接合物を含む画分をプールした。
PHENYL TOYOPEARLプールをおよそ3倍に濃縮し、それから10kDの再生産セルロースメンブレン(Millipore,Bedford,MA)を装備した超濾過システムを用いて、6容量の0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0に対してダイアフィルターした。
濃縮の第一工程はPHENYL TOYOPEARLプールを用いた濾過オープンモードでの全リサイクルであった。リサイクルは与えられた濃度の3%より小さく濾過器中のPEG-B2036変異体の濃度を減少することを目的として約15分実施された。PHENYL TOYOPEARLプールの現実の濃縮は、UFモードで始められた(すなわちリサイクルタンクに向けられた残余物、及び排出物に向けられた濾過物で)。最初のリサイクルからUFモードへの移動は、フィードポンプ閉鎖及びフィードレートの変化または残余物圧の変化を除いて、自動的になされた。濃縮は残余物容量における3倍の減少が達成されるまで続いた。濃縮されたPHENYL TOYOPEARLプールを、DFモードで0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0の6容量に対してダイアフィルターした(すなわち、リサイクルタンクに向けられた残余物、排出物に向けられた濾過物、及びリサイクルタンクに移動したバッファーで)。UFモードからDFモードへの移動は、フィードポンプ閉鎖を除いて自動的になされた。
さらにペグ化B2036変異体を、7gタンパク質/L樹脂を超えずに注入したS SEPHAROSE FAST FLOWカラムでのカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラムを少なくとも3カラム容量の0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0を用いて室温で平衡化した。それから完全なPEG-B2036変異体UF/DFプールをカラムに注入し、カラムを0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0でスタートし、0.25MNaCl、0.025M酢酸ナトリウム,pH4.0で終了する7カラム容量の直線勾配を用いて溶出した。280nmでのODが増加し始めた後、画分を集めSDS-PAGEとマススペクトロメトリーで分析した。
S SEPHAROSE FAST FLOWプールを10kDの再生産セルロースメンブレン(Millipore,Bedford,MA)を装備した超濾過システムを用いて、およそ10g/Lに濃縮した。濃度、低圧ドロップリサイクル及び生産物移動工程は、残余物容量において7倍の減少が達成されるように上記「超濾過/ダイアフィルトレーション」部分に記述されているように実施した。
4℃で稼動させるSEPHADEX G-25カラムを、処方バッファー(18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4)内にPEG-B2036変異体調製物を交換するために用いた。注入の容量はカラムの全層容量の25%に制限した。洗浄のためカラムを1カラム容量の精製水を用いて洗い、次いで少なくとも1.5カラム容量の処方バッファーを用いて平衡化した。それから完全なPEG-B2036変異体UFプールをカラムに注入し、カラムを処方バッファーを用いて溶出した。280nmでのODが0.5を超えたら、OD280がおよそ0.5以下に落ちるまで画分を集めた。それからSEPHADEX G-25プールを5.0mg/mlの濃度に処方バッファーを用いて希釈した。
hGH変異体当たりのPEGの化学量論をVESTECレーザー脱着イオン化マススペクトロメーター(PerSeptive Biosystems,Inc.,Framingham,MA)によって評価した。その結果は調製物が4及び5のPEG基を含む主要な接合物(PEG-4/5-B2036)を含むことを示した。
PEG(20,000)を用いたB2036変異体のペグ化
B2036変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがってPEG(20,000)を用いてペグ化した。
実施例Vに記述されたように精製されたB2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10カラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)を用いて、0.05Mリン酸ナトリウム,pH7.5内にバッファー交換した。それからB2036変異体溶液を10mg/mlのタンパク質濃度に希釈した。60mgのM-SPA-PEG(20,000)(Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,AL)を、チューブに計り取り、6mlのB2036変異体溶液を加えた。反応を室温で75分インキュベートした。反応混合物をG-25 SEPHADEX PD-10カラムを用いて25mM酢酸ナトリウム,pH4.0内にバッファー交換した。
結果として生じたPEG(20,000)-B2036変異体溶液を、カラムが平衡化するまで25mM酢酸ナトリウム,pH4.0を用いて洗ったSP SEPHAROSE HPカラム(Pharmacia)にアプライした。カラムを室温で4.1mg/ml樹脂の濃度でPEG(20,000)-B2036変異体溶液と共に注入した。
それから濃縮したPEG(20,000)-B2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10カラムを用いて室温で処方バッファー(18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4)内にバッファー交換した。
Y-PEGを用いたB2036変異体のペグ化
B2036変異体を以下の例示的なプロトコールにしたがって2の10,000D鎖を持つ分枝状鎖PEG(PEG2(20,000))を用いてペグ化した。
実施例Vに記述されたように精製されたB2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10カラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)を用いて、0.05Mリン酸ナトリウム,pH7.5内にバッファー交換した。それからB2036変異体溶液を10mg/mlのタンパク質濃度に希釈した。100mgのNHS-PEG2(20,000)(Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,AL)を、チューブに計り取り、4mlのB2036変異体溶液を加えた。反応を室温で90分インキュベートした。反応混合物をG-25 SEPHADEX PD-10カラムを用いて25mM酢酸ナトリウム,pH4.0内にバッファー交換した。
結果として生じたPEG2(20,000)-B2036変異体溶液を、カラムが平衡化するまで25mM酢酸ナトリウム,pH4.0を用いて洗ったSP SEPHAROSE HPカラム(Pharmacia)にアプライした。カラムを室温で2.75mg/ml樹脂の濃度でPEG2(20,000)-B2036変異体溶液と共に注入した。
濃縮したPEG2(20,000)-B2036変異体を、G-25 SEPHADEX PD-10カラムを用いて室温で処方バッファー(18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4)内にバッファー交換した。
PEG-4/5-B2036のペグ化部位
実施例V及びVIIに記述されたように生産されたPEG-4/5-B2036変異体調製物のPEG修飾の部位を、トリプシンマッピングによって分析した。精製されたPEG-4/5-B2036変異体サンプル(1MCaCl2、0.1M酢酸ナトリウム、10mMTris,pH8.8内に1mg/ml)を、Kohr,W.J.等,Anal.Biochem.,122:348-359(1982)に記述されたように1:40(トリプシン:PEG-4/5-B2036変異体)のタンパク質重量比で、ウシトリプシン(Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ)と共にインキュベートした。トリプシンを時間0で加え、切断の4時間で再び加えた。37℃で8時間のインキュベーション後、リン酸をpH2になるように加えることによって切断を止め、サンプルを4℃で貯蔵した。
F1>K145,K140,K38,K158>K120,K70
であった。相当するトリプシン処理ペプチドの修飾変異体が検出されなかったことに基づいて、K41及びK115は非反応性であると決定された。B2036変異体中の168と172残基は、この位置でのリシンが異なるアミノ酸に置換されているため、PEGと反応できなかった。最も反応性の残基はサイト1では存在しなかった。実際野生型hGHに存在する3のサイト1リシン(K41,K168及びK172)は、非反応性(K41)またはB2036には存在しない(K168及びK172)。それゆえB2036変異体のペグ化はサイト1結合を直接的にはブロックしない。
ペグ化B2036の作用剤活性の細胞ベースアッセイ
実施例V及びVIIに記述されているように生産されたPEG-4/5-B2036変異体調製物をFuh,G.等、Science,256:1677-1680(1992)とColosi,P.等,J.Biol.Chem.,268:12617-12629(1993)に記述されている細胞ベース二量体化アッセイにおいて活性をテストした。このアッセイで用いられる細胞を生産するために、フルレングスのhGH受容体を、hGHの存在下で増殖を誘導できるプレミエロイド細胞系、FDC-P1(Colosi,P.等,J.Biol.Chem.,268:12617-12629[1993])内に安定にトランスフェクトした。10%胎児ウシ血清と2-5nMhGHを含むRPMI培地において細胞を維持した。細胞を4時間hGHのない培地で取り込みを抑え、それからhGH変異体の増大していく濃度と共に37℃で10時間インキュベートした。細胞に4時間[+H]チミジンのパルスを与え、溶解し、そしてニトロセルロースフィルターに結合した放射性活性の量によってDNA合成を分析した。Fuh,G.等,Science,256:1677-1680(1992)。B2036とPEG-4/5-B2036の両者とも、0.001から1.0μg/mlのhGH変異体の範囲のいかなる濃度でも細胞増殖を刺激しなかった。
ペグ化B2036の拮抗剤活性の細胞ベースアッセイ
拮抗剤活性をテストするためにデザインされた研究において、実施例V及びVIIに記述されたように生産された非ペグ化B2036及びPEG-4/5-B2036変異体調製物を、11ng/ml組換えhGH及び増大していく濃度の変異体(104細胞/0.2ml全アッセイ容量)と共にインキュベートした。組換えhGH刺激細胞増殖の50%をブロックするのに必要とされる変異体の濃度、すなわち50%最大阻害濃度(IC50)を、両変異体について計算した。非ペグ化B2036のIC50は0.19μg/mlであり、一方PEG-4/5-B2036のIC50は13.01μg/mlであった。
別の実験では、PEG-4/5-B2036変異体調製物の拮抗剤活性をPEG(20,000)-B2036変異体及びPEG2(20,000)-B2036変異体のものと比較するアッセイを繰り返した(5×103細胞/0.15ml全アッセイ容量)。これらのペグ化変異体を実施例VII、VIII及びIXのそれぞれに記述されているように生産した。各ペグ化変異体のIC50を表11に示す。
hGH変異体のin vivo拮抗剤活性
IGF-Iレベルでの拮抗剤hGH変異体の毎日の注射の効果をアカゲザルにおいて研究した。テストされたhGH変異体は、G120K置換を含む変異体とB2036及びB2024変異体であった。加えてPEG(5000)の4から5の分子を持つこれらの変異体のペグ化形態をテストした。18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4に処方された0.25mg/kghGH変異体調製物の毎日の投与量を、治療グループ当たり2の若いオスアカゲザルに皮下に注射した。Amer.J.Primatology,11:53-62(1986)に記述されているように、IGF-Iレベルをイムノアッセイによって測定した。
PEG-4/5-B2036変異体調製物のin vivo拮抗剤活性:
単一投与量薬力学
IGH-IレベルにおけるPEG-4/5-B2036変異体調製物の単一注射の効果をアカゲザルにおいて研究した。実施例V及びVIIに記述したように生産され、18.0g/Lマンニトール、0.68g/Lグリシン、5mMリン酸ナトリウム,pH7.4に処方された1mg/kgのPEG-4/5-B2036変異体の単一投与量を、若いオスアカゲザルに静脈内または皮下のそれぞれで注射した。偽薬は皮下に投与された0.5ml処方バッファーであった。IGF-Iレベルを実施例XIIIのように測定した。
その結果が図12に示されている。投与経路に関わらず、PEG-4/5-B2036変異体調製物で治療された全てのサルのIGF-Iレベルが投与後1日で減少し、投与後4日まで減少が引き続き、7日間の研究を通じて低く維持されていた。
Claims (21)
- 以下の一連のアミノ酸置換:
H18A,Q22A,F25A,D26A,Q29A,E65A,K168A,E174A,G120
を含むヒト成長ホルモン変異体。 - G120での置換がアルギニン、リシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン及びグルタミン酸よりなるグループから選択される請求項1のヒト成長ホルモン変異体。
- ヒト成長ホルモン変異体が、該変異体の現実の分子量を約40と約100キロダルトンの間に増大させる一つ以上の化学的グループに接合されている請求項1のヒト成長ホルモン変異体。
- 上記化学的グループがポリ(エチレングリコール)である請求項3のヒト成長ホルモン変異体。
- 請求項1のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸配列。
- 請求項5の核酸配列を含むベクター。
- 請求項6のベクターを含むホスト細胞。
- 請求項7のホスト細胞を培養し、カルチャーからヒト成長ホルモン変異体を回収することを含むヒト成長ホルモン変異体の生産方法。
- 有効量の請求項1のヒト成長ホルモン変異体を含む、患者における成長ホルモン機能阻害のための組成物。
- 先端巨大症の患者のための請求項9の組成物。
- 患者がヒト成長ホルモンを結合する受容体を発現している腫瘍細胞を含む腫瘍を持つ請求項9の組成物。
- 糖尿病性網膜症の患者のための請求項9の組成物。
- 上記ヒト成長ホルモン変異体が約4と約6分子の間のポリ(エチレングリコール)と接合している請求項4のヒト成長ホルモン変異体を含む組成物。
- (a) 請求項1のヒト成長ホルモン変異体のペグ化;
(b) カチオン交換クロマトグラフィーカラムへのペグ化ヒト成長ホルモンのアプライ;及び(c) ペグ化ヒト成長ホルモンの溶出;
を含むペグ化ヒト成長ホルモンの生産法。 - G120での置換がリシンである請求項2のヒト成長ホルモン変異体。
- 上記ヒト成長ホルモン変異体がポリ(エチレングリコール)と接合している請求項15のヒト成長ホルモン変異体。
- 請求項15のヒト成長ホルモン変異体をコードする核酸配列。
- 請求項17の核酸配列を含むベクター。
- 請求項18のベクターを含むホスト細胞。
- 癌の患者のための請求項9記載の組成物。
- 糖尿病性腎症の患者のための請求項9記載の組成物。
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