ES2652018T3 - Modulación de la expresión del receptor de la hormona de crecimiento y de IGF-I - Google Patents

Modulación de la expresión del receptor de la hormona de crecimiento y de IGF-I Download PDF

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ES2652018T3 ES04715642.7T ES04715642T ES2652018T3 ES 2652018 T3 ES2652018 T3 ES 2652018T3 ES 04715642 T ES04715642 T ES 04715642T ES 2652018 T3 ES2652018 T3 ES 2652018T3
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Ravi Jain
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Abstract

Un oligonucleótido dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica el receptor de la hormona de crecimiento humana, en donde la secuencia de base nitrogenada de dicho oligonucleótido consiste de las IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NÚMEROS: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 91, 92, 93 o 94, en donde las vinculaciones internucleosídicas de dicho oligonucleótido se modifican, y en donde dicho oligonucleótido hibrida específicamente con dicha molécula de ácido nucleico que codifica el receptor de la hormona de crecimiento e inhibe la expresión del receptor de la hormona de crecimiento.

Description

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Modulacion de la expresion del receptor de la hormona de crecimiento y de IGF-I
Descripcion
AREA DEL INVENTO
Este invento se refiere a las composiciones y metodos para modular la expresion del receptor de la hormona de crecimiento. En particular, este invento se refiere a compuestos, particularmente compuestos de oligonucleotidos, que, en secciones importantes, se hibridan con las moleculas de acidos nucleicos que codifican al receptor de la hormona de crecimiento. Aquellos compuestos han demostrado en este estudio que modulan la expresion del receptor de la hormona de crecimiento y tambien modulan la expresion del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1 - insulin-like growth factor 1) a niveles terapeuticos equivalentes en animales y humanos que son relevantes para el tratamiento de enfermedades incluyendo la acromegalia, el gigantismo, la degeneracion macular relacionada con la edad, la retinopatfa diabetica, la nefropatfa diabetica, la diabetes, y tumores dependientes de la hormona de crecimiento y de la IGF-I. Los efectos de la modulacion del receptor de la hormona de crecimiento tambien son relevantes para el tratamiento de la artritis y otras condiciones que involucran al receptor de la hormona de crecimiento y/o el eje de la hormona de crecimiento/del factor de crecimiento similar a la insulina. Asimismo, los compuestos antisentido dirigidos a cualquier objetivo individual o a cualquier grupo de objetivos en el de hormonas de crecimiento/factor de crecimiento similar a la insulina I, incluyendo la hormona de crecimiento, el receptor de la hormona de crecimiento, el IGF-I y el receptor del IGF-I, pueden ser utilizados en el tratamiento de las mismas condiciones.
ANTECEDENTES DEL INVENTO
La hormona de crecimiento, liberada por la pituitaria, es una miembro de un grupo de hormonas que regulan el crecimiento del cuerpo y sus organos. La secrecion de la hormona de crecimiento a la sangre es seguida por enlaces al receptor de la hormona de crecimiento (GHR - growth hormone receptor) en muchos tipos de celulas y organos. La senalizacion de la hormona de crecimiento es mediada por esta interaccion. La senalizacion de la hormona de crecimiento causa la produccion de otra hormona, el factor de crecimiento similar a la insulina I (OGF-I o IGF-1 - insulin-like growth factor-I), el cual es producido en el hngado, el tejido adiposo y en el rinon y es secretado a la corriente sangumea. Alrededor de 75% del IGF-I serico es producido en el tngado en respuesta a la estimulacion de la hormona de crecimiento. Muchas enfermedades son causadas por, y/o asociadas con, niveles elevados de la hormona de crecimiento y/o niveles elevados del IGF-1 en el plasma y/o en tejidos incluyendo a la acromegalia, al gigantismo, a la retinopatfa, a la degeneracion macular, a la nefropatfa, a la diabetes y canceres. Este rol del IGF-I en la mediacion de muchos efectos de la hormona de crecimiento es bien reconocido y la interaccion es referida como un eje de la hormona de crecimiento/del factor de crecimiento similar a la insulina-I. En un circuito normal de retroalimentacion, el IGF-I tambien causa que se reduzca la produccion de la hormona de crecimiento por la pituitaria.
La hormona de crecimiento es producida y secretada por un conjunto de celulas especializadas en la pituitaria frontal. La hormona de crecimiento tiene efectos directos e indirectos en muchos tejidos, tales como la estimulacion osea y el crecimiento de tejido suave y la influencia al metabolismo de los carbohidratos, protemas y lfpidos. Actividades biologicas directas de la hormona de crecimiento incluyen al enlace de receptores, la internalizacion del complejo hormonal/receptor, y la activacion de protemas involucradas en la transduccion de senales.
Las transcripciones protemicas y de ARN para los receptores de la hormona de crecimiento (GHR - receptors of growth hormone) han sido detectadas en muchos de los tejidos influenciados por la hormona. Se determino que una sola molecula de la hormona de crecimiento enlaza secuencialmente a 2 moleculares receptoras, formando un complejo activo. Este complejo, a su vez, senaliza la estimulacion de otros genes, incluyendo al IGF-I. El IGF-I que es producido y secretado por el hngado y otros tejidos objetivos, regula algunos de los efectos indirectos de la hormona de crecimiento en el crecimiento y el desarrollo. Otros eventos intracelulares que ocurren despues de la interaccion de la hormona de crecimiento/receptor de la hormona de crecimiento incluyendo la activacion de quinasas de tirosina tales como la quinasa de Jano 2 (Jak-2 - Janus kinase 2), que conlleva a la fosforilacion y a la activacion de otras protemas incluyendo al transductor de senales y al activador de las transcripciones 5A y 5B (STAT 5A y 5B) y la quinasa protemica activada por mitogenos (MAP - mitogen activated protein) que, a su vez, activa otras protemas y genes.
La ADNc que codifica al receptor de la hormona de crecimiento ha sido clonada para muchas especies. El receptor consiste de una region extracelular enlazadora de hormonas (exon 2-7), una sola membrana que se extiende por la region (exon 8), y una region intracelular (exones 9-10). Existen tambien regiones multiples alternas no interpretadas de 5' que son los primeros exones alternos del gen, en las transcripciones humanas y de ratones. El receptor de la hormona de crecimiento no tiene un dominio intrmseco de quinasas, pero la region intracelular juega un rol importante en el proceso de transduccion de senales. Una forma truncada del receptor, conocida como la protema de enlace de la hormona de crecimiento (GHBP - growth hormone binding protein), no tiene las regiones
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de la transmembrana e intracelulares del receptor de la hormona de crecimiento y es secretada al suero. La protema truncada es producida por 1 o 2 procesos diferentes, dependiendo de la especie animal. En ratones y ratas, un empalme alternativo del ARN mensajero del precursor del receptor de la hormona de crecimiento reemplaza a las regiones de la transmembrana e intracelulares con una cola hidrofflica muy corta (codificada por el exon 8A; 15, 16). En los humanos, las vacas y los cerdos (entre otros) ningun empalme alterno de ARN es aparente, pero en vez de eso la GHBP es producida por la proteolisis del receptor de la hormona de crecimiento. La funcion de la protema de enlaces parece ser el modular del nivel de la hormona de crecimiento circulante.
El receptor de la hormona de crecimiento es expresado en muchos organos y tejidos incluyendo al tugado, al tejido adiposo, al musculo, al carfflago, a los huesos, a los dientes, al rinon, a los ojos, al sistema cardiovascular, a los intestinos, a los organos reproductivos, a la piel, al cerebro, al sistema endocrino y al sistema inmunologico.
Se ha establecido la estructura tridimensional del dominio extracelular del receptor de la hormona de crecimiento. Consiste de 2 modulos, cada uno de alrededor de 100 aminoacidos, colocados en forma de 2 emparedados cada uno con 7 hebras de laminas beta. La forma secretada del dominio extracelular del receptor de la hormona de crecimiento es la GHBP.
El receptor de la hormona de crecimiento es biologicamente responsivo a la estimulacion de la hormona de crecimiento. La JAK2 es la molecula activadora principal para la senalizacion del receptor de la hormona de crecimiento. La JAK2 es activada despues de la dimerizacion del receptor de la hormona de crecimiento. Cuando la hormona de crecimiento dimeriza a sus receptores, las JAKs son juntadas, y con una alineacion apropiada se trans- fosfosporilatan entre sf, conllevando a su activacion completa. Los objetivos intracelulares de las JAKs incluyen a residuos de tirosina en el dominio citoplasmico receptor en sf, el cual a su vez activa a los dominios SH2 (STATS, Shc y SHP2). Esto podna continuar hasta activar al sendero de quinasas MAP, que regula a la proliferacion celular. Las JAK2s tambien fosforiliozan y activan otras moleculas de senalizacion, tales como el IRS-1 y -2 y la quinasa de 3-inositol de fosfatidilo, que son partes importantes del mecanismo de senalizacion de la insulina y pueden explicar las acciones similares a la insulina de la hormona de crecimiento. Los JAK2s activados tambien fosforilizan a los STAT5, y cuando son activados, se involucran en la transcripcion de varios genes.
La activacion del receptor de la hormona de crecimiento conlleva a muchas acciones en muchos organos incluyendo a los siguientes resultados en los siguientes organos:
El tugado: se incrementa la secrecion del factor de crecimiento similar a la insulina-I, la smtesis de protemas del plasma, la regulacion de las enzimas de balance del nitrogeno, una smtesis/almacenamiento incrementado de carbohidratos, y una descomposicion incrementada de las grasas; el tejido adiposo: una descomposicion de los almacenamientos grasos; el musculo: una smtesis incrementada de protemas, una descomposicion protemica reducida; el cartflago: una altura incrementada por la proliferacion incrementada y la diferenciacion de condrocitos en el cartflago de crecimiento; los huesos y los dientes: una rotacion incrementada del tejido, una smtesis y una descomposicion incrementada; los rinones: una retencion incrementada del sodio, del bicarbonato y del agua; los ojos: una neovascularizacion retinal incrementada; el sistema cardiovascular: hipertrofia, una contractilidad, fuerza de latidos y caudales cardiacos incrementados; los intestinos: hipertrofia, absorcion incrementada de aminoacidos, sodio, calcio, fosfato y B12; sistema reproductivo: una produccion y motilidad de esperma incrementada, una secrecion incrementada de la glandula adicional en los hombres, un numero incrementado de folmulos y de la tasa de ovulacion, una tasa incrementada de la maduracion folicular, una produccion de leche incrementada; la piel: un grosor y fortaleza incrementada de la piel, un crecimiento y grosor incrementado del cabello; el cerebro: una proliferacion y conectividad neuronal prenatal incrementada, una formacion incrementada de mielinas, una memoria mejorada a largo plazo; sistema endocrino: una smtesis y secrecion incrementada de la insulina, una esteroidogenesis adrenal incrementada; el sistema inmunologico: una proliferacion incrementada de las celulas inmunologicas, una eliminacion incrementada por parte de los monocitos, los macrofagos y las celulas NK, una produccion incrementada de anticuerpos.
Corriente abajo del receptor de la hormona de crecimiento en el sendero de senalizacion de la hormona de crecimiento se encuentran el IGF-I y el receptor de IGF-I. Los factores de crecimiento similares a la insulina (IGFs) son importantes en la proliferacion. En particular, el IGF-I y el IGF-2 son polipeptidos ubicuos cada uno con efectos mitogenicos potentes en un amplio rango de celulas. Las moleculas de tipo factor de crecimiento similar a la insulina tambien son conocidas como “factores de progresion” que promueven a celulas “competentes” a traves de la smtesis del ADN. Los factores de crecimiento similares a la insulina actuan a traves de un receptor conocido como el receptor de tipo I o IGF-IR, que es vinculado por la quinasa de tirosina.
Protemas particulares, denominadas protemas enlazadoras del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBPs- insulin-like growth factor binding proteins), parecen estar involucradas en la regulacion autocntica/paracrina de la disponibilidad del factor de crecimiento similar a la insulina de los tejidos (Rechler y Brown, Growth Regulation, 1992,2, 55-68). 6 IGFBPs han sido identificados hasta el momento. Los efectos exactos de los IGFBPs todavfa no son claros y efectos observados in vitro han sido inhibitorios o estimuladores dependiendo
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del metodo experimental utilizado (Clemmons, Growth Regn. 1992, 2, 80,). Existe alguna evidencia, sin embargo, que ciertos IGFBPs estan involucrados en la direccion del factor de crecimiento similar a la insulina I hacia su receptor superficial celular. Tambien la expresion del IGFBP-3 es regulada por la hormona de crecimiento (Karen et al, mencionado anteriormente).
La IGF-IR es un receptor superficial celular vinculado a la quinasa de tirosina (Ullrich et al., EMBO J. 1986, 5, 2503-2512,) que regula la division, la transformacion y la apoptosis celular en muchos tipos celulares (LeRoith et al., Endocr. Rev., 1995, 16, 143-163; Rubin y Baserga, Laboratory Investigation (investigacion de laboratorio), 1995, 73, 311-331).
Si la regulacion de la retroalimentacion de la produccion de la hormona de crecimiento se pierde y la pituitaria continua liberando montos aberrantes de la hormona de crecimiento, el nivel del factor de crecimiento similar a la insulina I continuara elevandose, conllevando a un crecimiento oseo y crecimiento de los organos. Un exceso de la hormona de crecimiento tambien causa cambios en el metabolismo del azucar y de los lfpidos, que podna conllevar a la diabetes. Defectos en los senderos de senalizacion de la hormona de crecimiento a menudo conlleva a anormalidades de tamano de estatura, de cuerpo y/u organos. Mutaciones en el gen del receptor de la hormona de crecimiento resultan en estaturas extremadamente cortas (el smdrome de Laron). Una produccion excesiva de la hormona de crecimiento puede conllevar a una acromegalia o gigantismo.
La acromegalia y el gigantismo son enfermedades relacionadas de crecimiento donde un exceso de la hormona de crecimiento, a veces causado por un tumor pituitario, causa una desfiguracion cosmetica progresiva y manifestaciones de organos sistemicos. Afecta a 40-50 personas por cada millon a nivel mundial con alrededor de 15,000 personas que lo padecen en cada uno de los Estados Unidos y Europa y una incidencia anual de alrededor de 4-5 por cada millon. Es caracterizado inicialmente por un crecimiento anormal de las manos y de los pies y cambios oseos en las caractensticas faciales. Los pacientes tienen una calidad de vida reducida con el hiper- crecimiento de la quijada, alargamiento de los pies y de las manos, engrosamiento de la voz, engrosamiento de la piel, olor corporal ofensivo, problemas articulares de los cartflagos, hiperfosfatemia, neuropatfas perifericas, presion sangumea elevada, diabetes, enfermedades cardiacas y el cancer, y tienen expectativas de vida reducidas si no se trata. La tasa de mortalidad es de alrededor de 2 veces la de la poblacion normal debido a enfermedades cardio - respiratorias y cardiovasculares, la diabetes y la neoplasia, particularmente el cancer del colon. El objetivo de los tratamientos actuales es reversar los efectos de la hipersecrecion de la hormona de crecimiento y normalizar la produccion del IGF-I que tiene una elevacion de alrededor del 50% en estos pacientes. Cuando un tratamiento es efectivo, se moderan los smtomas de la enfermedad y la mortalidad asociada con la enfermedad.
El gigantismo, la enfermedad de un exceso de hormona de crecimiento en los ninos, es una enfermedad rara. En el gigantismo, un crecimiento lineal excesivo ocurre mientras los ligamentos de crecimiento estan abiertos durante la ninez con un exceso de hormona de crecimiento causado por medio de un tumor pituitario benigno. En el gigantismo y la acromegalia, todos los parametros de crecimiento son afectados, aunque no necesariamente simetricamente. Muchos de los resultados relacionados con el crecimiento son mediados por niveles elevados del IGF-I serico. Los niveles sangumeos sericos del IGF-I son elevados en alrededor de un 50% en los pacientes y la reduccion del IGF-I serico es utilizado para monitorear el exito del tratamiento.
Los tratamientos para la acromegalia y el gigantismo involucran la capacidad de reducir al IGF-I elevado en el plasma. Esto podna lograrse por medio de una remocion quirurgica o terapia de radiacion en el tumor pituitario benigno, pero esto solo es efectivo en el 50% de los pacientes. Agonistas de dopamina tales como mesilato de bromocriptina o cabergolina podnan administrarse oralmente lo cual es conveniente pero estas solo reducen la produccion de la hormona de crecimiento y son asociadas suficientemente por la IGF-I en un 10% de los casos. Estas producen ademas efectos colaterales gastrointestinales y centrales significativos en el 20-30% de los pacientes. Tambien se usa en el tratamiento de la acromegalia a los analogos de somatostatina tales como la Sandostatina o el octreotido, que inhiben la liberacion de la hormona que libera a la hormona de crecimiento (GHRH - growth hormone releasing hormone) desde el hipotalamo, y/o la pituitaria y por lo tanto reduce la produccion de la hormona de crecimiento en la pituitaria. Este compuesto es efectivo en el 60-65% de los pacientes con acromegalia, pero debe ser inyectada bajo la piel cada 8 horas o intramuscularmente para un tratamiento efectivo.
Recientemente un antagonista del receptor de la hormona de crecimiento, Trovert, tambien conocido como Somavert, Pegvisomant y B2036- PEG, ha demostrado ser efectiva en ensayos clmicos en un 90-95% de los pacientes. La experiencia de ensayos clmicos a la fecha demuestra una tasa de un 10% de abandonos y efectos adversos tal como la inhabilitacion del tngado. Trovert es una molecula de la hormona de crecimiento con una sustitucion de 9 aminoacidos con 4-5 pegilaciones para incrementar la vida media. Al igual que todas las protemas modificadas, esta es inmunogenica, creandose anticuerpos para Trovert en el primer mes de administracion. Esto puede afectar la utilidad a corto y largo plazo de Trovert y dificulta el pronostico de sus dosis. Trovert fue administrado inicialmente una vez al mes por medio de una administracion subcutanea (sc), pero la practica clmica actual sugiere que se necesitaran dosis una vez al dfa subcutaneamente. Trovert interfiere con los enlaces de la hormona de crecimiento a su receptor, pero no al fragmento de la protema enlazadora de la hormona de crecimiento (GHBP - Growth Hormone Binding Protein) del receptor de la hormona de crecimiento. La GHBP enlaza a la
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hormona de crecimiento y prolonga su accion, lo cual puede ser desventajoso en condiciones que involucran a excesos de la hormona de crecimiento y/o excesos del IGF-I. La pegilacion tambien podna afectar el perfil de seguridad a largo plazo de Trovert.
La diabetes y sus complicaciones que amenazan la vida tales como la retinopatfa y la nefropatia diabeticas tambien son enfermedades asociadas con los niveles de la hormona de crecimiento y/o del IGF-I. El tratamiento de primera lmea de estas condiciones involucra controlar a la hiperglicemia. Medicamentos que controlan la diabetes reducen la incidencia de la nefropatfa por un 60% y tambien reducen la incidencia de la retinopatia. Sin embargo, alrededor de la mitad de todos los diabeticos no estan conscientes de la enfermedad y por lo tanto se mantienen sin tratamiento, por lo que la nefropatfa y la retinopatfa diabeticas tienen la posibilidad de permanecer siendo una condicion importante donde se requieren otros tratamientos. En la retinopatfa, se utilizan tratamientos ablativos quirurgicos de tales como la fotocoagulacion pan-retinaria por medio de laser, pero esto permanece siendo incompletamente efectivo y destruye al tejido retinal, causando una perdida parcial del campo de la vision. En los diabeticos de tipo I, ACE y todos los inhibidores reducen la expresion de albuminuria al actuar en el rinon y en los diabeticos de tipo II los mismos inhibidores actuan localmente en el rinon y tambien reducen la presion sangumea para reducir el riesgo de muerte por falla de rinones por otro 50%. Sin embargo, el 20-30% de pacientes permanecen resistentes al tratamiento con medicamentos actuales de control glucemico y medicamentos ACE. Existe por lo tanto una necesidad de mejores tratamientos.
La causa principal de la diabetes, de la retinopatfa diabetica y de la nefropatia diabetica puede ser la hiperglicemia relacionada con la insulina, pero un exceso de la hormona de crecimiento y/o del factor de crecimiento similar a la insulina-I tambien es importante. Inhibidores octreotidos de la GHRH que reducen la produccion de la hormona de crecimiento pituitaria, reduciendo esa forma los niveles sistemicos de la hormona de crecimiento y del IGF-I, y/o los niveles moduladores de tejidos locales muestran un potencial en los aspectos clmicos. Un estudio con octreotidos por Grant et al., (Diabetes Care (Atencion Diabetica), 2000,2, 504-9) que redujo al sIGF-1 * un 51% con dosis toleradas al maximo de 5000 pg/dfa subcutaneamente de octreotidos redujo la necesidad de cirugfa por medio de laser en pacientes de retinopatfa a un paciente de 22 pacientes en vez de 9/22 pacientes a los que se administro un placebo en un estudio de 15 meses. Ademas, una enfermedad ocular fue reducida al 27% versus el 42% de los pacientes que estaban recibiendo placebos lo cual alcanza a ser significativo (P 0.06). 3 estudios humanos utilizando octreotidos a niveles que redujeron al sIGFI en alrededor de un 45%, alrededor de un 20% y alrededor de un 10% respectivamente fueron efectivos por lo menos parcialmente en ensayos clmicos de nefropatfa. Los resultados reportados por Serin et al. (JAMA, 1991, 265, 888-92) con 11 pacientes usaron dosis altas de octreotidos en un estudio de 12 semanas que redujeron al IGF-I serico por un 45%. En ese momento se declaro que se observo que tuvo un mejor efecto para reducir la tasa de filtraciones glomerulares con una reduccion del 22-33% en relacion al grupo que estaba tomando placebos. Esta dosis, sin embargo, estaban cerca del nivel maximo tolerado de octreotidos.
Estudios animales de modelos patologicos con octreotidos y con Trovert tambien apoyan la perspectiva de que agentes que modulan al eje de la hormona de crecimiento / factor de crecimiento similar a la insulina-I son beneficiosos para el tratamiento de estas condiciones diabeticas. La hormona de crecimiento y su receptor estan implicados en la induccion de la hipertrofia glomerular y la esclerosis en la nefrectoirna parcial y la nefropatfa diabetica con inhibidores de somatostatina octreotidos y de PTR-3173 (Groenbaek et al., J. Endocrinol., 2002, 172, 637-643 y Landau et al,, Kidney International (Rinon, Internacional), 2001, 60, 505-512) y el antagonista del receptor de la hormona de crecimiento, G120K-PEG, una version mas debil de Trovert, previniendo complicaciones en ratones diabeticos de tipo I y de tipo II (Chen et al,, Endocrinology (Endocrinologfa), 1996, 137, 11, 5136-5165; Flyvbjerg et al,, Diabetes, 1999, 40,377-382, y Segev et al., J. Am. Soc. Nephrol. 1999, 10,2374-81). La hormona de crecimiento y su receptor estan implicados en la induccion de una neovascularizacion a traves del IGF-I con octreotidos y antagonistas del receptor de la hormona de crecimiento MK678 que son inhibidores de la somatostatina, inhibiendo una neovascularizacion en ratones. La reduccion de MK678 de la neovascularizacion se correlaciono con un bajo IGF-I serico Smith et al, Science (Ciencia), 1997, 276, 1706-9). La retinopatfa inducida por el oxfgeno en el raton tambien fue responsiva a los octreotidos tal como se reporto por Higgins et al., Exp. Eye (Ojo) Res, 2002, 74,553-9.
La degeneracion macular tambien es asociada con los niveles elevados de la hormona de crecimiento y/o del IGF-I. Una degeneracion macular relacionada con la edad (AMD - Age-related macular degeneration) es causada por el deterioro de la parte central de la retina, la macula, lo cual resulta en la perdida de la vision detallada. La AMD humeda, una forma menos comun, es causada por una fuga proveniente de los nuevos vasos sangumeos que crecen atras de la retina. El eje de la hormona de crecimiento / IGF-I esta involucrado en la formacion de nuevos vasos sangumeos que son relevantes a esta condicion y a la retinopatfa diabetica.
Varios canceres tambien son asociados con niveles aberrantes de la hormona de crecimiento y/o del IGF-I. La reduccion del IGF-I serico por un 20-50% utilizando Trovert redujo el volumen tumoral en el cancer de la mama en modelos animales y ayudo en el cancer del colon, en la metastasis del tngado y en meningiomas (Friend et al,, Proceedings 11th NCI EoRTC. AACR Symposium (Simposio AACR) y Friend, Growth Horm. (Hormona de Crecimiento) IGF Res., 2001, Jun: 11 Suppl A: S121-3). La incidencia de canceres de la mama, del colon, de la
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prostata y de los pulmones es incrementada en individuos con un alto rango normal del IGF-I serico. No han habido estudios clmicos con Trovert en canceres. Sin embargo, se receta a octreotidos para canceres gastro-pancreaticos.
Otras condiciones que podnan ser asociadas con niveles elevados de la hormona de crecimiento y/o del IGF-I incluyen a la artritis reumatoide. Un estudio clmico piloto demostro que los octreotidos fueron utiles para el tratamiento de la artritis reumatoide refractaria en un subconjunto de pacientes (Paran et al., Ann. Rheum. Dis., 2001, 60, 888-91. Con comentarios y respuestas del autor en Ann. Rheum. Dis., 20O2, 61, 1117).
La longevidad tambien podna mejorarse al modular al receptor de hormona de crecimiento (Coschigano et al., Endocrinology (Endocrinologfa), 2000, 241, 2608-2613). Existio un incremento significativo de la duracion de vida de cerca de un ano en animales knockout con niveles bajos de IGF-I y niveles altos de la hormona de crecimiento.
Otra aplicacion de la modificacion de los niveles de la hormona de crecimiento y/o del IGF-I por medio del receptor de la hormona de crecimiento puede permitir la diferenciacion de celulas madre hacia una produccion de celulas neurales puesto que la hormona de crecimiento inhibe la diferenciacion neuronal de las celulas progenitoras neurales (Turnley et al., Nature Neuroscience (Neurociencia Natural), 7 de octubre de 2002, publicado en el Internet). Otras aplicaciones seran conocidas para aquellas personas con conocimiento normal en la tecnica.
Aunque los roles principales en varias enfermedades o condiciones podnan ser diferentes, las condiciones ya mencionadas surgen, por lo menos en parte, de factores sistemicos y/o locales provenientes de niveles incorrectos de la expresion de la hormona de crecimiento y del IGF-I de crecimiento y/o sus receptores, el receptor de la hormona de crecimiento y el IGF-IR. En estas situaciones, los agonistas de la dopamina, los agonistas de la somatostatina, y los antagonistas del receptor de la hormona de crecimiento dirigidos a las protemas han sido utilizados y/o han demostrado potencial.
Mientras que una gama de tratamientos se ha desarrollado para agentes que modifican el eje de la hormona de crecimiento/factor de crecimiento similar a la insulina, y el receptor de la hormona de crecimiento y el IGF-IR, ninguno es completamente efectivo y/o libre de efectos colaterales adversos. Ademas, existen desventajas potenciales en las rutas y/o frecuencia de administracion que pueden afectar su cumplimiento.
Existe, por lo tanto, un objetivo de esta presentacion para suministrar productos y composiciones nuevas donde uno o mas de los problemas y limitaciones que se acaban de mencionar puedan aliviarse.
En la ultima decada, han existido informes del uso de oligonucleotidos antisentido para explorar la funcion genetica y varios reportes en el desarrollo de medicamentos que se basan en acidos nucleicos. Los oligonucleotidos antisentido que inhiben a la interpretacion del ARNm por medio de varias formas alternas incluyendo la destruccion del ARNm objetivo a traves del reclutamiento de la ribonucleasa H, o la interferencia con el procesamiento, la exportacion nuclear, el plegamiento o la deteccion de ribosomas del ARN.
Pellegrini et al. intento bloquear la smtesis de receptor de la hormona de crecimiento en el sistema nervioso central al infundir intracerebroventricularmente un oligonucleotido antisentido 18-mer que es complementario a una porcion de la secuencia codificadora del ARNm del receptor de la hormona de crecimiento de la rata superponiendo al codon de iniciacion de la interpretacion J. Neurosci. 1996, 16, 8140-8148.
Este invento tal como se expone en este documento por primera vez, demuestra que un oligonucleotido antisentido dirigido espedficamente al receptor de la hormona de crecimiento reduce un parametro clmico de la actividad de la hormona de crecimiento, espedficamente el factor de crecimiento similar a la insulina-I serico. En una forma importante, nuestros estudios antisentido explican la capacidad para utilizar antisentidos en el receptor de la hormona de crecimiento para reducir al factor de crecimiento similar a la insulina-I serico a niveles similares a los requeridos para el tratamiento clmico de gigantismo y acromegalia. Los niveles sericos del factor de crecimiento similar a la insulina-I son elevados en los pacientes que tienen acromegalia y reducidos por medio de dosis terapeuticas humanas de Trovert por un 50% en ambos estudios de 12 semanas (Trainer et al, The New England J of Med (la Revista de Nueva Inglaterra de Medicina) 20 de abril de 2000) que muestra una reduccion de 1.3 a 2 veces, y en estudios a largo plazo superiores a un ano tal como se informo por van der Lely et al., Lancet 2001, 24 de noviembre: 358 (9295) 1754-1759.
Niveles similares de reduccion del factor de crecimiento similar a la insulina-I serico tambien fueron reportados con ensayos clmicos de retinopatfa diabetica de 15 meses con octreotidos (Grant et al, mencionado anteriormente) y ensayos clmicos de nefropatfa diabetica (Serri et al, mencionado anteriormente). Niveles similares de reduccion del 20-50% tambien son suficientes como para prevenir el crecimiento de ciertos tipos de canceres en modelos animales (Friend, mencionado anteriormente).
Este invento ensena por primera vez que el antisentido del receptor de la hormona de crecimiento puede lograr resultados terapeuticos equivalentes en humanos y animales. Ensena que el antisentido al ARNm de un componente del eje hormona de crecimiento / factor de crecimiento similar a la insulina-I, espedficamente al
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receptor de la hormona de crecimiento, puede afectar un parametro en el eje, por ejemplo, el IGF-I. En una forma importante, ensena que los anti sentidos dirigidos a cualquier otro objetivo en el eje de la hormona de crecimiento / factor de crecimiento similar a la insulina-I es potencialmente capaz de lograr niveles terapeuticos en condiciones que dependen de niveles excesivos de la hormona de crecimiento y del factor de crecimiento similar a la insulina-I.
RESUMEN DEL INVENTO
El invento proporciona un oligonucleotido dirigido a una molecula de acido nucleico que codifica el receptor de la hormana de crecimiento humana, en donde la secuencia de base nitrogenada de dicho oligonucleotido
consiste de las IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NUMEROS: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,
32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64,
65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 91, 92, 93 o 94, en donde los
vrnculos internucleosfdicos de dicho oligonucleotido se modifican, y en donde dicho oligonucleotido hibrida espedficamente con dicha molecula de acido nucleico que codifica el receptor de la hormona de crecimiento e inhibe la expresion del receptor de la hormona de crecimiento.
En este documento se presentan compuestos, especialmente acidos nucleicos u oligomeros similares a acidos nucleicos, que son dirigidos a un acido nucleico que codifican al receptor de la hormona de crecimiento, y que modulan la senalizacion de la hormona de crecimiento o el eje hormona de crecimiento / factor de crecimiento similar a la insulina-I, particularmente a la expresion del receptor de la hormona de crecimiento y/o el factor de crecimiento similar a la insulina-I. Ademas, se presentan metodos para la deteccion de moduladores del receptor de la hormona de crecimiento y/o el factor de crecimiento similar a la insulina-I y metodos para modular la expresion del receptor de la hormona de crecimiento y/o el factor de crecimiento similar a la insulina-I en celulas, tejidos o animales que comprende de contactar a dichas celulas, tejidos o animales con uno o mas de los compuestos o composiciones de la especificacion. Se presentan tambien a Metodos y botiquines de diagnostico. Los metodos para el tratamiento de un animal, particularmente un humano, que se sospecha que tiene o que es propenso a una enfermedad o condicion asociada con la senalizacion de la hormona de crecimiento o el eje hormona de crecimiento / factor de crecimiento similar a la insulina-I, particularmente la expresion del receptor de la hormona de crecimiento y/o el factor de crecimiento similar a la insulina-I, tambien se presentan en este documento.
DESCRIPCION DETALLADA DEL INVENTO
A. Vision general del Invento
Este invento utiliza oligonucleotidos para su uso en la modulacion de la funcion o del efecto de las moleculas de acidos nucleicos que codifican al receptor de la hormona de crecimiento. Esto se logra al suministrar oligonucleotidos que se hibridan espedficamente con una o mas moleculas de acidos nucleicos que codifican al receptor de la hormona de crecimiento. Tal como se utiliza en este documento, los terminos “acido nucleico objetivo” y “molecula de acidos nucleicos que codifican al receptor de la hormona de crecimiento” han sido utilizados para la conveniencia de abarcar al ADN que codifica al receptor de la hormona de crecimiento, al ARN (incluyendo al pre- ARNm y al ARNm o sus porciones (incluyendo a las regiones codificadoras y no codificadoras), la transcripcion de aquel ADN, y tambien a la ADNc entregada de aquel ARN. La hibridacion de un compuesto para su uso en este invento con su acido nucleico objetivo se denomina, generalmente, como “antisentido”. Consecuentemente, el mecanismo preferido que se cree es incluido en la practica de algunas secciones importantes del invento se denomina en este documento como la “inhibicion antisentido”. Aquella inhibicion antisentido se basa comunmente en una hibridacion que se basa en enlaces de hidrogeno de hebras de oligonucleotidos o segmentos de tal forma que por lo menos un hebra o segmento es dividida, degradada o deshabilitada de cualquier otra forma. En este aspecto, actualmente se prefiere usar como objetivo a moleculas espedficas de acidos nucleicos y sus funciones para aquella inhibicion antisentido.
Las funciones del ADN que van ser interferidas pueden incluir la replicacion y la transcripcion. La replicacion y la transcripcion, por ejemplo, pueden ser de una plantilla celular endogena, un vector, una estructura de plasmidos o de otro tipo. Las funciones del ARN que seran interferidas pueden incluir a funciones tales como la translocacion del ARN a un lugar de interpretacion protefnica, la translocacion del ARN a lugares dentro de la celula que estan distantes del lugar de la smtesis del ARN, la interpretacion de protemas del ARN, el empalme del ARN para generar una o mas especies de ARN, y la actividad catalftica o formacion de complejos que involucra al ARN que podna interactuar en, o ser facilitado por, el ARN. Un resultado preferido de aquella interferencia con la funcion del acido nucleico objetivo es modular la expresion del receptor de la hormona de crecimiento. En el contexto de esta especificacion, una “modulacion” y una “modulacion de la expresion” significa ya sea un incremento (estimulacion) o una reduccion (inhibicion) en el monto o niveles de una molecula de acido nucleico que codifica al gen, por ejemplo, el ADN o el ARN. La inhibicion es a menudo la forma preferida de modulacion de la expresion y el ARNm es a menudo un acido nucleico objetivo preferido.
En el contexto de esta especificacion, la “hibridacion” significa el emparejamiento de hebras complementarias de compuestos oligomericos. En esta especificacion, el mecanismo preferido de emparejamiento
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involucra a enlaces de hidrogeno, que podnan ser enlaces de hidrogeno tipo Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen en reversa, entre nucleosidos complementarios o bases de nucleotidos (bases nitrogenadas) de las hebras de los compuestos oligomericos. Por ejemplo, la adenina y la timina son bases nitrogenadas que se emparejan a traves de la formacion de enlaces de hidrogeno. La hibridacion puede ocurrir bajo varias circunstancias.
Un compuesto antisentido es capaz de hibridarse espedficamente cuando enlaces del compuesto a los acidos nucleicos objetivo interfiere con la funcion normal del acido nucleico objetivo para causar una perdida de la actividad, y existe un nivel suficiente de complementariedad para evitar enlaces no espedficos del compuesto antisentido a secuencias no objetivo de acidos nucleicos bajo condiciones en las cuales enlaces espedficos son deseados, es decir, bajo condiciones fisiologicas, en el caso de ensayos in vivo, o de tratamientos terapeuticos, y bajo condiciones en las cuales los ensayos son realizados, en el caso de ensayos in vitro.
En esta especificacion, la frase “condiciones estrictas de hibridacion” o “condiciones estrictas” se refiere a condiciones bajo las cuales un compuesto para su uso en el invento se hibridara con su secuencia objetivo, pero se hibridara irnnimamente con otras secuencias. Las Condiciones estrictas dependen de las secuencias y seran diferentes en circunstancias diferentes y en el contexto de esta especificacion, las “condiciones estrictas” bajo las cuales los compuestos oligomericos se hibridaran a una secuencia objetivo son determinadas por la naturaleza y la composicion de los compuestos oligomericos y los ensayos en los cuales se estan investigando.
El termino “complementario”, tal como se utiliza en este documento, se refiere a la capacidad para un emparejamiento preciso entre 2 bases nitrogenadas de un compuesto oligomerico. Por ejemplo, si una base nitrogenada en una cierta posicion de un oligonucleotido (un compuesto oligomerico), es capaz de enlaces de hidrogeno con una base nitrogenada en cierta posicion de un acido nucleico objetivo, siendo dicho acido nucleico objetivo una molecula de ADN, de ARN o de oligonucleotidos, entonces la posicion de los enlaces de hidrogeno entre el oligonucleotido y el acido nucleico objetivo es considerada como una posicion complementaria. El oligonucleotido y la molecula adicional de ADN, aRn o de oligonucleotidos son complementarias entre sf cuando un numero suficiente de posiciones complementarias en cada molecula es ocupada por bases nitrogenadas que pueden enlazarse con el hidrogeno entre sf. Por lo tanto, el termino “capaz de hibridarse espedficamente” y “complementario” son usados para indicar un nivel suficiente de emparejamiento preciso o complementariedad sobre un numero suficiente de bases nitrogenadas para que enlaces estables y espedficos ocurran entre el oligonucleotido y un acido nucleico objetivo.
Se entiende en la tecnica que la secuencia de un compuesto antisentido no necesita ser 100% complementario a aquella de su acido nucleico objetivo con el cual es capaz de hibridarse espedficamente. Ademas, un oligonucleotido podna hibridarse sobre uno o mas segmentos de tal forma que los elementos intervenidos o adyacentes no se involucran en el evento de la hibridacion (por ejemplo, una estructura tipo circuito o una estructura tipo horquilla). Se prefiere que los compuestos antisentido aqu presentados comprendan por lo menos el 70% de la complementariedad secuencial a una region objetivo dentro del acido nucleico objetivo, y mas preferiblemente que comprendan el 90% de la complementariedad secuencial y aun mas preferiblemente que comprendan el 95% de la complementariedad secuencial de la region objetivo dentro de la secuencia del acido nucleico objetivo al cual estan dirigidas. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el cual 18 de 20 bases nucleotidos del compuesto antisentido son complementarias a una region objetivo, y por lo tanto, se hibridan espedficamente, representando una complementariedad del 90%. En este ejemplo, las bases nitrogenadas restantes que no son complementarias podnan aglutinarse o entremezclarse con bases nitrogenadas complementarias y no necesitan ser contiguas entre sf o contiguas a bases nitrogenadas complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 18 bases nitrogenadas tiene 4 (cuatro) bases nitrogenadas no complementarias que estan rodeadas por 2 regiones de complementariedad completa con una complementariedad general del 77.8 por ciento con el acido nucleico objetivo y, por lo tanto, caena dentro del enfoque de esta presentacion. La complementariedad porcentual de un compuesto antisentido con una region de un acido nucleico objetivo puede determinarse rutinariamente utilizando los programas BLAST (basic local alignment search tolos - herramientas de busqueda de alineacion local basicas) y los programas PowerBLAST conocidos en la tecnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656).
B. Compuestos del invento
De acuerdo a esta especificacion, los compuestos incluyen compuestos oligomericos antisentido, oligonucleotidos antisentido, ribozimas, oligonucleotidos de secuencia de orientacion externa (EGS - external guide sequence), empalmadores alternos, cebadores, sondas y otros compuestos oligomericos que se hibridan a por lo menos una porcion del acido nucleico objetivo. Como tal, estos compuestos pueden ser introducidos en la forma de compuestos oligomericos de una sola hebra, de doble hebras, circulares o tipo horquilla y podnan contener elementos estructurales tales como protuberancias o circuitos internos o terminales. Una vez introducidos a un sistema, los compuestos para su uso en el invento podnan provocar la accion de una o mas enzimas o protemas estructurales para efectuar modificaciones del acido nucleico objetivo. Un ejemplo no limitante de una enzima como estas es la ribonucleasa H, una endonucleasa celular que divide a la hebra de ARN de un duplex de ARN:ADN. Se
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conoce en la tecnica que compuestos antisentido de una sola hebra que son “similares al ADN” provocan a la ribonucleasa H. La activacion de la ribonucleasa H, por lo tanto, resulta en una division del ARN objetivo, mejorando, por lo tanto, en una gran forma, a la eficiencia de la inhibicion mediada por oligonucleotidos de la expresion genetica. Roles similares han sido postulados para otras ribonucleasa las tales como aquellas en la familia enzimatica de la ribonucleasa III y la ribonucleasa L.
Mientras que la forma preferida de compuesto antisentido es un oligonucleotido antisentido de una sola hebra, en muchas especies la introduccion de estructuras de doble hebra, tales como moleculas de ARN de doble hebra (dsRNA - double-stranded RNA), ha demostrado inducir una reduccion potente y mediada por antisentido se espedficos de la funcion de un gen o sus productos geneticos asociados. Este fenomeno ocurre en plantas y animales y se cree que tiene una conexion evolucionaria para defensas virales y el silenciamiento de transposones.
La primera evidencia de que las dsARNs podna conllevar a un silenciamiento genetico en animales surgio en 1995 proveniente del trabajo en la nematoda, Caenorhabditis elegans (Guo y Kempheus, Cell (Celula), 1995, 81, 611-620). Montgomery et al. han demostrado que los efectos primarios de interferencia de la dsARN son post- interpretacion (Montgomery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados unidos de America, 1998, 95, 15502-15507). El mecanismo antisentido post-interpretacion definido en el Caenorhabditis elegans que resulta de la exposicion a ARN de doble hebra (dsRNA - double-stranded RNA) ha sido designado desde entonces como interferencia de ARN (ARNi - RNAi - RNA interference). Este termino ha sido generalizado para significar un silenciamiento genetico mediado por antisentidos que involucra la introduccion de dsARN que conlleva a la reduccion espedfica de secuencias de los niveles endogenos de ARNm dirigidos (Fire et al., Nature (Naturaleza), 1998, 391, 806-811). Recientemente, se ha demostrado que, en efecto, los oligomeros de ARN de una sola hebra de polaridad antisentido de los dsARNs son los inductores potentes de ARNi (Tijsterman et al., Science, 2002, 295, 694-697).
En el contexto de esta especificacion, el termino “compuesto oligomerico” se refiere a un polfmero u oligomero que comprende una pluralidad de unidades monomericas. En el contexto de esta especificacion, el termino “oligonucleotido” se refiere a una oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) o acido deoxirribonucleico (ADN) o sus mimeticos, quimeras, analogos y homologos. Este termino incluye oligonucleotidos compuestos de bases nitrogenadas que ocurren naturalmente, azucares y vinculaciones internucleosfdicas (estructurales) covalentes, asf como oligonucleotidos que tienen porciones que no ocurren naturalmente que funcionan similarmente. Aquellos oligonucleotidos modificados o sustituidos son a menudo preferidos sobre las formas naturales debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, una absorcion celular mejorada, una afinidad mejorada para un acido nucleico objetivo y una estabilidad incrementada en la presencia de nucleasas.
Aunque los oligonucleotidos son una forma preferida de los compuestos de esta especificacion, esta especificacion comprende tambien otras familias de compuestos, incluyendo, pero sin limitarse a, analogos y mimeticos de oligonucleotidos tales como aquellos aqrn descritos.
Los compuestos de acuerdo con esta especificacion comprenden preferiblemente desde alrededor de 8 a alrededor de 80 bases nitrogenadas (es decir, desde alrededor de 8 a alrededor de 80 bases nitrogenadas vinculadas). Una persona con conocimiento normal en la tecnica apreciara que esto abarca compuestos con una longitud de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ,u 80 bases nitrogenadas.
En una realizacion importante, los compuestos de la especificacion tienen longitudes de entre 12 a 50 bases nitrogenadas. Una persona con conocimiento normal en la tecnica apreciara que los compuestos cubren longitudes de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 bases nitrogenadas.
En otra realizacion importante, los compuestos de esta especificacion son de longitudes de entre 15 a 30 bases nitrogenadas. Una persona con conocimiento normal en la tecnica apreciara que estos compuestos abarcan a longitudes de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 bases nitrogenadas de largo.
Los oligonucleotidos declarados tienen longitudes que van desde las 12 a las 30 bases nitrogenadas de
largo.
Compuestos antisentido de 8-80 bases nitrogenadas de largo comprenden un tramo de por lo menos ocho (8) bases nitrogenadas consecutivas seleccionadas de las cuales los compuestos antisentido ilustrativos son considerados tambien como compuestos antisentido adecuados.
Compuestos antisentido preferidos de ejemplo incluyen a secuencias de oligonucleotidos que comprenden por lo menos las 8 bases nitrogenadas consecutivas de la terminal 5' de uno de los compuestos antisentido preferidos ilustrativos (el resto de bases nitrogenadas son un tramo consecutivo del mismo oligonucleotido que
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empieza inmediatamente corriente arriba de la terminal 5' del compuesto antisentido que es capaz de hibridarse al acido nucleico objetivo y continuar hasta que el oligonucleotido contenga alrededor de 8 a 80 bases nitrogenadas). Asimismo, compuestos antisentido preferidos son representados por secuencias de oligonucleotidos que comprenden por lo menos las 8 bases nitrogenadas consecutivas de la terminal 3' de uno de los compuestos antisentido preferidos ilustrativos (las bases nitrogenadas restantes son un tramo consecutivo del mismo oligonucleotido que empieza inmediatamente corriente abajo de la terminal 3' del compuesto antisentido que es capaz de hibridarse espedficamente al acido nucleico objetivo y continuar hasta que el oligonucleotido contenga alrededor de 8 a 80 bases nitrogenadas). Una persona que tenga conocimiento en la tecnica equipada con los compuestos antisentido aqu ilustrados sera capaz, sin experimentacion indebida, de identificar compuestos antisentido preferidos adicionales.
C. Objetivos del Invento
“Dirigir” un compuesto antisentido a una molecula particular de acido nucleico, en el contexto de este invento, puede ser un proceso de varios pasos. El proceso usualmente empieza con la identificacion de un acido nucleico objetivo cuya funcion debe modularse. Este acido nucleico objetivo podna ser, por ejemplo, un gen celular (o un ARNm transcrito del gen) cuya expresion es asociada con un trastorno espedfico o estado de enfermedad, o una molecula de acido nucleico proveniente de un agente infeccioso. En este invento, el acido nucleico objetivo codifica al receptor de la hormona de crecimiento.
El proceso de orientacion usualmente incluye ademas la determinacion de por lo menos una region, segmento o lugar objetivo dentro del acido nucleico objetivo para que ocurra una interaccion antisentido para que resulte el efecto deseado, por ejemplo, la modulacion de la expresion. Dentro del contexto de esta especificacion, el termino “region” se define como una porcion del acido nucleico objetivo que tiene por lo menos una estructura, funcion o caractenstica identificable. Dentro de las regiones de los acidos nucleicos objetivos existen segmentos. Los “segmentos” son definidos como regiones mas pequenas o sub-porciones de estas regiones dentro del acido nucleico objetivo. Los “lugares”, tal como se utiliza en esta especificacion, se definen como posiciones dentro de un acido nucleico objetivo.
Puesto, que el codon de iniciacion de interpretacion es comunmente el 5'-AUG (en moleculas de ARNm transcrito; el 5'-ATG en la molecula correspondiente de ADN), tal como es conocido en la tecnica, el codon de iniciacion de interpretacion tambien es referido como el “codon AUG”, el “codon inicial” o el “codon inicial AUG”. Una minona de genes tienen un codon de iniciacion de interpretacion que tiene la secuencia de ARN de 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG, y 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG ha demostrado funcionar in vivo. Por lo tanto, los terminos “codon de iniciacion de interpretacion” y “codon inicial” pueden abarcar muchas secuencias de codones, aunque el aminoacido iniciador en cada instancia sea comunmente la metionina (en eucariotas) y la formilmetionina (en procariotas). Tambien es conocido en la tecnica que los genes eucariotas y procariotas podnan tener 2 o mas codones alternos de inicio, cualquiera de los cuales podna ser utilizado preferencialmente para la iniciacion de interpretacion en un tipo espedfico de celula o tejido, o bajo un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la especificacion, el “codon inicial” y el “codon de iniciacion de interpretacion” se refiere al codon o codones que son utilizados in vivo para iniciar la interpretacion de un ARNm transcrito de un gen que codifica al receptor de la hormona de crecimiento, sin importar la secuencia o secuencias de aquellos codones. Tambien se conoce en la tecnica que un codon de terminacion de interpretacion (o “codon de parada”) de un gen podna tener una de 3 secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente).
Los terminos “region del codon inicial” y “region del codon de inicio de interpretacion” se refieren a una porcion de un ARNm o gen que abarca desde alrededor de 25 a alrededor de 50 nucleotidos continuos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de inicio de interpretacion. Asimismo, los terminos “region del codon de parada” y la “region del codon de finalizacion de interpretacion” se refiere a una porcion de un ARNm o gen que abarca desde alrededor de 25 a 50 nucleotidos continuos en cualquier direccion (es decir, 5' o 3') desde un codon de finalizacion de interpretacion. Consecuentemente la “region del codon inicial” (o “region del codon de inicio de interpretacion”) y la “region del codon de parada” (o “la region del codon de finalizacion de interpretacion”) son todas las regiones a las cuales se puede dirigir efectivamente con los compuestos antisentido para su uso de este invento.
El marco de lectura abierto (ORF-open reading frame) o “region de codificacion”, que es conocida en la tecnica por referirse a la region entre el codon de inicio de interpretacion y el codon de finalizacion de interpretacion, tambien es ademas una region que podna ser usada efectivamente como objetivo. Dentro del contexto de esta especificacion, una region preferida es la region intragenica que abarca al codon de inicio o finalizacion de transcripcion del marco de lectura abierta (ORF - open reading frame) de un gen.
Otras regiones objetivo incluyen a la region no interpretada de 5' (5'UTR - 5' untranslated region), conocida en la tecnica por referirse a la porcion de un ARNm en la direccion de 5' desde el codon de inicio de transcripcion, y por lo tanto, incluye a los nucleotidos desde el sitio de finalizacion de 5' y el codon de inicio de interpretacion de un ARNm (o nucleotidos correspondientes en el gen), y la region no interpretada de 3' (3'UTR - 3' untranslated region), conocida en la tecnica por referirse a la porcion de un ARNm en la direccion de 3' desde el codon de finalizacion de
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interpretacion, y por lo tanto, incluye a los nucleotidos entre el codon de finalizacion de interpretacion y el extremo de 3' en un ARNm (o los nucleotidos correspondientes en el gen). El lugar determinacion de 5' del ARNm comprende un residuo de guanosina de N7-metilada unido a la mayona de residuos de 5' del ARNm por medio de un enlace de 5'- trifosfato de 5'. La region de terminacion de 5' de un ARNm es considerada como que incluye a la estructura en sf de terminacion de 5' asf como los primeros 50 nucleotidos adyacentes al lugar de terminacion. Tambien es preferible usar como objetivo a la region de terminacion de 5'.
Aunque algunas transcripciones de ARNm eucariotas son interpretadas directamente, muchas contienen una o mas regiones, conocidas como “intrones”, que son extirpadas de una transcripcion antes de que se interprete. El resto de regiones (y por lao tanto las que son interpretadas) son conocidas como “exones” y son empalmadas entre sf para formar una secuencia continua de ARNm. El usar como objetivos a los lugares de empalme, es decir, a las uniones de intrones y exones o a las uniones exones-intrones, tambien podna ser particularmente util en situaciones en las cuales empalmes aberrantes estan implicados en la enfermedad, o donde una sobreproduccion de un producto de empalme particular esta implicada en la enfermedad. Uniones aberrantes de fusion debido a reconfiguraciones o eliminaciones tambien son lugares objetivos preferidos. Las transcripciones de ARNm producidas por medio del proceso del empalme de 2 (o mas) ARNms de diferentes fuentes geneticas se conocen como “transcripciones de fusion”. Tambien es conocido que los intrones pueden ser usados como objetivos efectivamente utilizando compuestos antisentido dirigidos a, por ejemplo, el ADN o el pre-ARNm.
Tambien se conoce en la tecnica que transcripciones alternas de ARN pueden ser producidas a partir de la misma region genomica del ADN. Estas transcripciones alternas son generalmente conocidas como “variantes”. Mas espedficamente, las “variantes de pre-ARNm” son transcripciones producidas a partir del mismo ADN genomico que difieren de otras transcripciones producidas a partir del mismo ADN genomico en la posicion de inicio o de parada y contienen secuencias de intrones y de exones).
En el momento que se extirpa una o mas regiones de exones o intrones, o sus porciones a lo largo del empalme, las variantes de pre-ARNm producen “variantes de ARNm” mas pequenas. Consecuentemente, las variantes de ARNm son procesadas antes de las variantes de pre-ARNm y cada variante pre-ARNm siempre debe producir una variante unica del ARNm como resultado de los empalmes. Estas variantes del ARNm tambien son conocidas como “variantes alternas de empalmes”. Sino ocurriese ningun empalme de la variante de pre-ARNm entonces la variante de pre-ARNm es identica a la variante del ARNm.
En el raton, en la rata y en el mono, la protema enlazadora de la hormona de crecimiento, que es la forma acortada soluble del receptor de la hormona de crecimiento, es producida al empalmar alternamente a la transcripcion primaria del receptor de la hormona de crecimiento. En algunas secciones, podna ser preferible el utilizar como objetivo a regiones de la transcripcion que estan presentes en la transcripcion de receptor de la hormona de crecimiento y la transcripcion protemica mas corta enlazadora de la hormona de crecimiento. En algunas secciones, podna ser preferible usar como objetivo a regiones del ARNm que solo estan presentes en la transcripcion mas larga del receptor de la hormona de crecimiento. En los humanos, en las vacas y en los cerdos (entre otras especies), ningun empalme alterno de ARN es aparente, pero en vez de eso la protema mas corta enlazadora de la hormona de crecimiento es producida por medio de la proteolisis del receptor de la hormona de crecimiento. Se debe entender que en el contexto de esta especificacion el termino “acido nucleico que codifica al receptor de la hormona de crecimiento” incluye, por lo tanto, al acido nucleico que codifica a la protema enlazadora de la hormona de crecimiento.
Tambien es conocido en la tecnica que variantes pueden ser producidas a traves del uso de senales alternativas para iniciar o detener la transcripcion y que los pre-ARNms y los ARNms pueden tener mas de un codon de inicio y de parada. Variantes que se originan de un pre-ARNm o ARNm que usan codones alternativos de inicio o de parada son conocidos como las “variantes alternativas de inicio” de aquel pre-ARNm o ARNm. Aquellas transcripciones que utilizan un codon alternativo de parada son conocidas como las “variantes alternativas de parada” de aquel pre-ARNm o ARNm. Un tipo espedfico de variante alternativa de parada es la “variante polyA” en la cual las multiples transcripciones producidas resultan de la realizacion alternativa de una de las “senales de parada polyA” por la maquinaria de transcripcion, produciendo, por lo tanto, transcripciones que terminan en lugares polyA unicos. Dentro del contexto de la especificacion, los tipos de variantes aqrn descritas tambien son acidos nucleicos objetivo preferidos.
El ARNm del receptor de la hormona de crecimiento tiene regiones alternativas no interpretadas de 5' y una o mas de estas pueden ser preferidas para ser usadas como objetivo.
Las ubicaciones en el acido nucleico objetivo a las cuales los compuestos antisentido preferidos se hibridan se refieren desde este momento en este documento como los “segmentos objetivo preferidos”. Tal como se utiliza en este documento, el termino “segmento objetivo preferido” es definido como por lo menos una porcion de 8-bases nitrogenadas de una region objetivo a la cual un compuesto antisentido activo es usado como objetivo. Mientras que no se desea atarse a ninguna teona, se cree en la actualidad que estos segmentos objetivos representan porciones del acido nucleico objetivo en el cual son accesibles para su hibridacion.
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Mientras que las secuencias espedficas de ciertos segmentos objetivos preferidos se establecen en este documento, una persona con conocimiento en la tecnica reconocera que estos sirven para ilustrar y describir secciones espedficas dentro del enfoque de esta especificacion. Segmentos objetivo preferidos adicionales pueden identificarse por una persona que tenga un conocimiento normal en la tecnica.
Segmentos objetivo de 8-80 bases nitrogenadas de largo comprenden un tramo de por lo menos ocho (8) bases nitrogenadas consecutivas seleccionadas de entre los segmentos objetivos preferidos ilustrativos tambien son consideradas como blancos adecuados.
Segmentos objetivos podnan incluir a secuencias de ADN o de ARN que comprenden por lo menos a las 8 bases nitrogenadas consecutivas desde la terminal de 5' de uno de los segmentos objetivos preferidos ilustrativos (siendo el resto de bases nitrogenadas un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN empezando inmediatamente corriente arriba de la terminal de 5' del segmento objetivo y continuando hasta que el ADN o el ARN contenga alrededor de 8 a 80 bases nitrogenadas). Asimismo, segmentos objetivo preferidos son representados por secuencias de ADN o de ARN que comprenden por lo menos las 8 bases nitrogenadas consecutivas desde la terminal de 3' de uno de los segmentos objetivos preferidos ilustrativos (siendo el resto de las bases nitrogenadas un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente corriente abajo de la terminal de 3' del segmento objetivo y continuando hasta que el ADN o ARN y que contiene alrededor de 8 a 80 bases nitrogenadas). Una persona con conocimiento en la tecnica equipada con los segmentos objetivos preferidos aqrn ilustrados podra, sin experimentacion indebida, identificar segmentos objetivo preferidos adicionales.
Una vez que una o mas regiones, segmentos o lugares objetivos se han identificado, los compuestos antisentido son escogidos los cuales son suficientemente complementarios para orientarse, es decir, hibridarse suficientemente bien y con una especificidad suficiente, para dar el efecto deseado.
D. Examinacion y Validacion del Objetivo
En una realizacion adicional, los “segmentos objetivo preferidos” identificados en este documento podnan ser utilizados en una prueba de deteccion de compuestos adicionales que module la expresion del receptor de la hormona de crecimiento. Los “moduladores” son aquellos componentes que reducen o incrementan la expresion de una molecula de acido nucleico que codifican al receptor de la hormona de crecimiento y que comprenden de por lo menos una porcion de 8-bases nitrogenadas que es complementaria a un segmento objetivo preferido. El metodo de deteccion comprende los pasos de contactar a un segmento objetivo preferido de una molecula de acido nucleico que codifica al receptor de la hormona de crecimiento con uno o mas moduladores candidatos, y seleccionando al uno o mas moduladores candidatos que reduzcan o incrementen la expresion de una molecula de acido nucleico que codifique al receptor de la hormona de crecimiento. Una vez que se demuestra que el modulador o moduladores candidatos son capaces de regular (por ejemplo, ya sea incrementar o reducir) la expresion de una molecula de acido nucleico que codifica al receptor de la hormona de crecimiento, el modulador podna entonces ser utilizado en estudios investigativos adicionales de la funcion del receptor de la hormona de crecimiento, o para su uso como un agente de investigacion, de diagnostico o terapeutico de acuerdo con esta especificacion.
Los segmentos objetivo preferidos de esta especificacion bien podnan combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos de este invento para formar oligonucleotidos estabilizados de doble hebra (duplex).
Aquellas partfculas de oligonucleotidos de doble hebra han demostrado en la tecnica el modular la expresion objetivo y regular la interpretacion, asf como el procesamiento de ARN por medio de mecanismos antisentido. Ademas, las partfculas de doble hebra pueden ser sujetas a modificaciones qrnmicas (Fire et al., Nature (Naturaleza), 1998, 391, 806-811; Timmons y Fire, Nature (Naturaleza) 1998, 395, 854; Timmons et al., Gene (Gen), 2001, 263 , 103-112; Tabara et al., Science (Ciencia), 1998, 282, 430-431; Montgomery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de America, 1998, 95, 15502-15507; Tuschl et al., Genes (Genes) Dev., 1999, 13, 3191-3197; Elbashir et al., Nature (Naturaleza), 2001, 412, 494-498; Elbashir et al., Genes (Genes) Dev. 2001, 15, 188-200). Por ejemplo, aquellas partfculas de doble hebra han demostrado inhibir al objetivo por medio de una hibridacion clasica de las hebras antisentido del duplex hacia el objetivo, activando, por lo tanto, una degradacion enzimatica del objetivo (Tijsterman et al., Science (Ciencia), 2002, 295, 694-697).
Los compuestos de esta presentacion tambien pueden estar aplicados en las areas de descubrimiento de medicamentos y de validacion de objetivos. Esta presentacion comprende el uso de los compuestos y de los segmentos objetivo preferidos aqrn identificados en los esfuerzos de descubrimiento de medicamentos para elucidar las relaciones que existen entre el receptor de la hormona de crecimiento y un estado de enfermedad, fenotipo o condicion. Estos metodos incluyen el detectar o modular al receptor de la hormona de crecimiento que comprenden contactar a una muestra, tejido, celula u organismo con los compuestos de esta presentacion, midiendo el nivel de acido nucleico o protemico del receptor de la hormona de crecimiento y/o un punto final fenotfpico o qmmico
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relacionado un tiempo despues del tratamiento, y compartir opcionalmente el valor medido para una muestra no tratada o tratada con un compuesto adicional de la presentacion. Estos metodos tambien pueden ser realizados en paralelo o en combinacion con otros experimented para determinar la funcion de los genes desconocidos del proceso de validacion de objetivos o para determinar la validez de un producto genetico espedfico como un objetivo para el tratamiento o la prevencion de una enfermedad, condicion o fenotipo espedfico.
E. Botiquines, reactivos de investigacion, diagnosticos y terapias
Los compuestos aqu presentados pueden ser utilizados para la diagnosis, la terapia, la profilaxis y como reactivos y botiquines de investigacion. Ademas, los oligonucleotidos antisentido, que pueden inhibir la expresion genetica con una especificidad exquisita, son usados a menudo por aquellas personas con conocimiento normal para elucidar la funcion de genes espedficos o para distinguir entre funciones de varios miembros de un sendero biologico.
Para su uso en botiquines y en el diagnostico, los compuestos de esta presentacion, ya sea individualmente o en combinacion con otros compuestos o terapias, pueden ser utilizados como herramientas en analisis diferenciales y/o combinatorios para elucidar los patrones de expresion de una porcion o de un complemento total de genes expresados en las celulas y los tejidos.
Como ejemplo no limitante, los patrones de expresion dentro de celulas o tejidos tratados con uno o mas compuestos antisentido son comparados a celulas o tejidos de control que no son tratados con los compuestos antisentido y los patrones producidos son analizados para detectar niveles diferenciales de la expresion genetica puesto que pertenecen, por ejemplo, a la asociacion de enfermedades, los senderos de senalizacion, la localizacion celular, el nivel de expresion, el tamano, la estructura o la funcion de los genes examinados. Estos analisis pueden realizarse en celulas estimuladas o no estimuladas y en la presencia o ausencia de otros compuestos que afecten los patrones de expresion.
Ejemplos de metodos de analisis de expresion genetica en la tecnica incluyen ensayos o micro ensayos de ADN(Brazma y Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16), SAGE (analisis en serie de la expresion genetica - serial analysis of gene expression) (Madden, et al., Drug (Medicamento) Discov. Today (Hoy), 2000, 5, 415-425), READS (amplificacion enzimatica de restriccion de ADNcs - restriction enzyme amplification of digested cDNAs) (Prashar y Weissman, Methods Enzymol. (Metodos de Enzimologfa), 1999, 303, 258-72), TOGA (analisis total de expresion genetica-total gene expression analysis) (Sutcliffe, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de America, 2000, 97, 1976-81), ensayos protemicos y proteomica (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblut, et al., Electrophoresis, (Electroforesis) 1999, 20, 2100-10), secuenciacion de marcaciones secuenciales expresadas (EST - expressed sequence tag) (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), huellas substractivas de ARN (SuRF - subtractive RNA fingerprinting) (Fuchs, et al., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larson, et al., Cytometry (Citometna), 2000, 41, 203208), clonacion substractiva, muestras diferenciales (DD - differential display) (Jurecic y Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), hibridacion genomica comparativa (Carulli, et al., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), tecnicas FISH (hibridacion fluorescente in situ - fluorescent in situ hybridization) (Going y Gusterson, Eur. J. Cancer (Cancer), 1999, 35, 1895-904) y metodos de espectrometna de masa (para, Comb. Chem . High Throughput Screen (Deteccion de Alto Caudal), 2000, 3, 235-41).
Los compuestos de la presentacion son utiles para investigaciones y diagnosticos, puesto que estos compuestos se hibridan a acidos nucleicos que codifican al receptor de la hormona de crecimiento. Por ejemplo, los oligonucleotidos que han demostrado hibridarse con una eficiencia y bajo aquellas condiciones tal como se presento en este documento para ser inhibidores efectivos del receptor de la hormona de crecimiento tambien seran cebadores o sondas efectivas bajo condiciones que favorezcan a la amplificacion o a la deteccion genetica, respectivamente. Estos cebadores y sondas son utiles en metodos que requieren la deteccion espedfica de las moleculas de acidos nucleicos que codifican al receptor de la hormona de crecimiento y en la amplificacion de aquellas moleculas de acidos nucleicos para la deteccion o para su uso en estudios adicionales del receptor de la hormona de crecimiento. La hibridacion de oligonucleotidos antisentido, particularmente los cebadores y las sondas, de la presentacion con un acido nucleico que codifique al receptor de la hormona de crecimiento puede detectarse con sistemas conocidos en la tecnica. Aquellos sistemas podnan incluir la conjugacion de una enzima a oligonucleotidos, la radio-marcacion del oligonucleotido o cualquier otro medio de deteccion adecuado. tambien pueden prepararse botiquines que usen aquellos medios de deteccion para medir el nivel del receptor de la hormona de crecimiento en una muestra.
La especificidad y sensibilidad del antisentido tambien son recaudadas por aquellas personas con conocimiento en la tecnica para sus usos terapeuticos. Los compuestos antisentido han sido utilizados como partteulas terapeuticas en el tratamiento de estados de enfermedad en animales, incluyendo en humanos. Los medicamentos de oligonucleotidos antisentido, incluyendo a ribozimas han sido administrados en una forma segura y efectiva a humanos y numerosos ensayos clmicos estan llevandose a cabo actualmente. Por lo tanto, esta establecido que los compuestos antisentido pueden ser modalidades terapeuticas utiles que pueden configurarse
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para ser utiles en regfmenes de tratamiento de celulas, tejidos y animales.
Los compuestos para su uso en este invento han demostrado poder reducir la expresion del receptor de la hormona de crecimiento y reducir los niveles de IGF-I. Se cree, por lo tanto, que estos compuestos son utiles para la prevencion, el retraso o el tratamiento de condiciones asociadas con el receptor de la hormona de crecimiento o con el eje hormona de crecimiento/factor de crecimiento similar a la insulina-I, incluyendo la acromegalia, el gigantismo, la degeneracion macular relacionada con la edad, la retinopatfa diabetica, la nefropatfa diabetica, la diabetes, la artritis y tumores que dependen de la hormona de crecimiento y del IGF-I.
Para terapias, en animales, preferiblemente en un humano, que se sospeche que tienen una enfermedad o un trastorno que puede ser tratado al modular la expresion del receptor de la hormona de crecimiento se lo trata al administrar compuestos antisentido para su uso en este invento. Por ejemplo, en una realizacion no limitante, los compuestos son usados en metodos que comprenden el paso de administrar al animal que necesita el tratamiento, un monto terapeuticamente efectivo y un inhibidor del receptor de la hormona de crecimiento. Los inhibidores del receptor de la hormona de crecimiento para su uso en este invento inhiben efectivamente la actividad de la protema receptora de la hormona de crecimiento o inhiben la expresion de la protema receptora de la hormona de crecimiento. En una realizacion, la actividad o expresion del receptor de la hormona de crecimiento en un animal es inhibida por alrededor del 10%. Preferiblemente, la actividad o expresion del receptor de la hormona de crecimiento en un animal es inhibida por alrededor de un 30%. Mas preferiblemente, la actividad o expresion del receptor de la hormona de crecimiento en un animal es inhibida por un 45% o mas.
Por ejemplo, la reduccion de la expresion del receptor de la hormona de crecimiento podna medirse en un suero, el tejido adiposo, en el tngado o en cualquier otro fluido corporal un organo del animal. Preferiblemente, las celulas contenidas dentro de dichos fluidos, tejidos u organos que se estan analizando contienen una molecula de acidos nucleicos que codifican a la protema receptora de la hormona de crecimiento y/o la protema receptora de la hormona de crecimiento en sf.
Los compuestos para su uso en el invento pueden ser utilizados en composiciones farmaceuticas al agregar un monto efectivo de un compuesto a un diluyente o portador farmaceuticamente aceptable que sea adecuado. Los compuestos para su uso en metodos del invento tambien podnan ser utilizados profilacticamente.
F. Modificaciones
Tal como es conocido en la tecnica, un nucleosido es una combinacion que se basa en azucar. La porcion base del nucleosido es normalmente una base heterodclica. Las 2 clases mas comunes de aquellas bases heterodclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleotidos son nucleosidos que incluyen ademas un grupo fosfato vinculado covalentemente a la porcion de azucar del nucleosido. Para aquellos nucleosidos que incluyen un azucar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede ser vinculado a la partmula hidroxila de 2', 3' o 5' en el azucar. Al formar los oligonucleotidos, los grupos fosfatos se enlazan covalentemente con los nucleosidos adyacentes entre sf para formar un compuesto polimerico linear. A su vez, los extremos respectivos de este compuesto polimerico linear pueden unirse aun mas para formar un compuesto circular, sin embargo, los compuestos lineares son generalmente preferidos. Adicionalmente, los compuestos lineares pueden tener una complementariedad interna de bases nitrogenadas y, podnan, por lo tanto, plegarse en una forma que produzca un compuesto que sea completamente o parcialmente de doble hebra. Dentro de los oligonucleotidos, los grupos fosfatos son comunmente referidos como que forman a la estructura internucleosfdica del oligonucleotido. La vinculacion normal o la estructura del ARN y del ADN es una vinculacion de un fosfodiester de 3' a 5'.
Vinculaciones Intemudeos^dicas modificadas (estructuras)
Los compuestos antisentido utiles en este invento son los oligonucleotidos que contienen estructuras modificadas o vinculaciones internucleosfdicas naturales. Tal como se define en esta especificacion, los oligonucleotidos que tienen estructuras modificadas incluyen a aquellos que retienen un atomo de fosforo en la estructura y aquellos que no tienen un atomo de fosforo en la estructura. Para los propositos de esta especificacion, y tal como se denomina a veces en la tecnica, los nucleotidos modificados que no tienen un atomo de fosforo en su estructura internucleosfdica tambien pueden ser considerados como oligonucleosidos.
Estructuras preferidas de oligonucleotidos modificados que contienen un atomo de fosforo en ellas, incluyen, por ejemplo, a los fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforo-ditioatos, fosfotriesteres, aminoalquilfosfotriesteres, fosfonatos de metilo y de alquilo incluyendo a fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'- alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo a fosforamidatos de 3'-amino y aminoalquilfosforamiditos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriesteres, selenofosfatos, y boranofosfatos que tienen enlaces normales de 3'-5', analogos enlazados de 2'-5' de estos y aquellos que tienen una polaridad invertida donde una o mas vinculaciones internucleosfdicas es una vinculacion de 3' a 3', de 5' a 5', o de 2' a 2'. Los oligonucleotidos preferidos que tienen una polaridad invertida comprenden una sola vinculacion de 3' a 3' en la vinculacion mas internucleosfdica de 3', es decir, un solo residuo invertido de nucleosidos que podna ser
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abasico (la base nitrogenada no existe o tiene un grupo hidroxilo en su lugar). Tambien se incluyen varias formas de sales, sales mezcladas y de acidos libres.
Patentes representativas de los Estados Unidos que ensenan la preparacion de los enlaces que contienen
fosforo incluyen, pero no se limitan a, Estados Unidos: 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196;
5,188,897; 5,264,423 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676, 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233;
5,466,677; 5,476,925, 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253, 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599;
5,565,555; 5,527,899, 5,721,218; 5,672,697 y 5,625,050.
Estructuras preferidas de oligonucleotidos modificados que no incluyen un atomo de fosforo en ellas tienen estructuras que son formadas por vinculaciones de cadenas cortas internucleosfdicas de alquilos o cicloalquilos, vinculaciones mixtas internucleosfdicas de heteroatomos y alquilos o cicloalquilos, o una o mas vinculaciones de cadenas cortas internucleosfdicas hetero atomicas o heterodclicas. Estas incluyen a aquellas que tienen vinculaciones morfololinas (formadas en parte de porciones de azucar de un nucleosido); estructuras de siloxanos; estructuras de sulfuros, sulfoxidos y sulfonas; estructuras de formacetilos y tioformacetilos; estructuras de riboacetilos; estructuras que contienen alquenos; estructuras de sulfamatos; estructuras de metileneimino y metilenehidracino; estructuras de sulfonatos y sulfonamidas; estructuras de amidas; y otras que tienen partes componentes mezcladas de N, O, S, y CH2.
Patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de los oligonucleotidos que se acaban de mencionar incluyen, pero no se limitan a, Estados Unidos: 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677, 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289, 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070, 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 y 5,677,439.
Azucar Modificado y Vinculaciones-Mimeticas Intemudeos^dicas
En otras mimeticas de oligonucleotidos preferidas, el azucar y la vinculacion internucleosfdica (es decir, la estructura), de las unidades de nucleotidos son reemplazadas con grupos nuevos. Las unidades de bases nitrogenadas son mantenidas por medio de hibridacion con un acido nucleico objetivo apropiado. Un compuesto como ese, un mimetico de oligonucleotidos que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridacion, se lo denomina como un acido nucleico peptfdico (PNA - peptide nucleic acid). En los compuestos PNA, la estructura del azucar de un oligonucleotido es reemplazada con una estructura que contiene a amidas, en particular una estructura aminoetilglicina. Las bases nitrogenadas son retenidas y son enlazadas directamente o indirectamente a los atomos de nitrogeno aza de la porcion amida de la estructura. Patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de compuestos PNA incluyen, pero no se limitan a, Estados Unidos: 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262. Ensenanzas adicionales de los compuestos PNA pueden encontrarse en Nielsen et al., Science (Ciencia), 1991, 254, 1497-1500.
Secciones preferidas para su uso en el invento son oligonucleotidos con estructuras de fosforotioato y oligonucleosidos con estructuras de heteroatomos, y en particular a -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- [conocido como una estructura de metileno (metilimino) o MMI], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(cH3)-CH2- y -ON(CH3)-CH2-CH2 [donde la estructura del fosfodiester natural es presentada como -O-P-O-CH2-] de la patente de Estados Unidos referenciada anteriormente 5,489,677, y las estructuras de amidas de la patente de Estados Unidos referenciada anteriormente 5,602,240. Tambien son preferidos los oligonucleotidos que tienen estructuras morfolinas de la patente de Estados Unidos 5,034,506 ya referenciada.
Azucares modificados
Los oligonucleotidos modificados tambien podnan contener una o mas partfculas sustituidas de azucar. Los oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguiente en la posicion 2': OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N- alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, el alquenilo y el alquinilo podnan ser sustituidos o no sustituidos con alquilo C1 a C10, o alquenilo y alquinilo C2 a C10. Particularmente preferidos son O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de uno a alrededor de 10. Otros oligonucleotidos preferidos comprenden uno de los siguiente en la posicion 2': un alquilo C1 a C10 inferior, un alquilo inferior sustituido, un alquenilo, un alquinilo, un alcarilo, un aralquilo, un O-alcaril0 o un O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, un heterocicloalquilo, un heterocicloalcarilo, un aminoalquilamino, un polialquilamino, un sililo substituido, un grupo de division de ARN, un grupo reportado, un intercalador, un grupo mejorador de las propiedades farmacocineticas de un oligonucleotido, o un grupo para mejorar las propiedades farmaco - dinamicas de un oligonucleotido, y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. Una modificacion preferida incluye a la 2'- metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OcH3, tambien conocida como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificacion preferida adicional incluye al grupo 2'- dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, tambien conocido como 2'-DMAOE, tal como se describio en los ejemplos en secciones posteriores de este documento, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (tambien
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conocido en la tecnica como 2'-O-dimetil-amino-etoxi-etilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2, tambien descritos en los ejemplos en secciones posteriores de este documento.
Otras modificaciones preferidas incluyen a 2'-metoxi (2'-O-CH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-allyl (2'-O-CH2-CH=CH2) y 2'-fluoro (2'-F). La modificacion de 2' podna ser en la posicion arabino (arriba) o en la posicion ribo (abajo). Una modificacion preferida 2'-arabino es el 2'-F. Modificaciones similares tambien pueden realizarse en otras posiciones en el oligonucleotido, particularmente la posicion 3' del azucar en el nucleotido terminal 3' o en los oligonucleotidos vinculados en 2'-5' en la posicion 5' del nucleotido terminal 5'. Los oligonucleotidos tambien podnan tener mimeticos de azucar tales como las partfculas de ciclobutilos en el lugar del azucar pentofuranosilo. Patentes representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de aquellas estructuras modificadas de azucar incluyen, pero no se limitan a, Estados Unidos: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785, 5,519,134 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909, 5,610,300 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873, 5,670,633 5,792,747; y 5,700,920.
Una modificacion referida adicional del azucar incluye a los Acidos Nucleicos Bloqueados (LNAs - Locked Nucleic Acids) en los cuales el grupo 2'-hidroxilo esta vinculado con el atomo carbono 3' o 4' del anillo de azucar, formando, por lo tanto, una partfcula bidclica de azucar. La vinculacion es preferiblemente un grupo metileno (-CH2- )n que sirve de puente entre el atomo de oxfgeno 2' y el atomo de carbono 4' donde n es uno o 2. Las LNAs y sus preparaciones se describen en WO 98/39352 y WO 99/14226.
Bases nitrogenadas naturales y modificadas
Los oligonucleotidos tambien podnan incluir a modificaciones o sustituciones de bases nitrogenadas (a menudo denominadas en la tecnica como simplemente “bases”). Tal como se utiliza en este documento, las bases nitrogenadas “no modificadas” o “naturales” incluyen las bases purinas, la adenina (A) y la guanina (G), y las bases pirimidinas, la timidina (T), la citosina (C) y el uracilo (U). Las bases nitrogenadas modificadas incluyen otras bases nitrogenadas sinteticas y naturales tales como la 5-metilcitosina (5-me-C), la citosina de 5-hidroximetilo, la xantina, la hipoxantina, la 2-aminoadenina, el 6-metilo y otros derivados alquilos de adenina y guanina, el 2-propilo y otros derivados alquilos de adenina y guanina, el 2-tiouracilo, la 2-tiotimina y la 2-tiocitosina, el 5-halouracilo y la citosina, el 5-propinilo (-CEC-CH3) el uracilo y la citosina y otros derivados de bases de la pirimidina, el uracilo de 6-azo y citosina y otros derivados de alquinilos de bases de pirimidinas, uracilo de 6-azo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras 8-sustituidas adeninas y guaninas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citocinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Bases nitrogenadas modificadas adicionales incluyen a pirimidinas tridclicas tales como la citidina(1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxacina-2(3H)-ona) de fenoxacina, (1H-pirimido[5,4- b][1,4]benzotiacina-2(3H)-ona) de citidina de fenotiacina abrazadera G tales como una citidina de fenoxacina (por ejemplo, la 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxacina-2(3H)-ona), la (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona) de citidina de carabazol, la (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona) de citidina de piridoindol. Bases nitrogenadas modificadas podnan incluir aquellas en las cuales la base purina o pirimidina es reemplazada con otros heterociclo 2, por ejemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Bases nitrogenadas adicionales incluyen aquellas presentadas en la patente de Estados Unidos numero 3,687,808, aquellas presentadas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering (La Enciclopedia Concisa de Ciencia e Ingeniena Polimerica), paginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas presentadas por Englisch et al., Angewandte Chemie, edicion internacional, 1991, 30, 613, y aquellas presentadas por Sanghvi, Y.S., Capftulo 15, Antisense Research and Applications (Investigacion y Aplicaciones Antisentido), paginas 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Ciertas de estas bases nitrogenadas son particularmente utiles para incrementar la afinidad de enlaces de los compuestos para su uso en este invento. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6- azapirimidinas y purinas sustituidas de N-2, N-6 y O-6, incluyendo a la 2-aminopropiladenina, el 5-propiniluracilo y la 5-propinilcitosina. Las sustituciones de 5-metilcitosina han demostrado incrementar la estabilidad duplex de los acidos nucleicos por 0.6-1.2 °C y son actualmente las sustituciones preferidas de bases, aun mas espedficamente cuando se combinan con modificaciones de azucar de 2'-O-metoxietilo.
Patente representativa de Estados Unidos que es en la preparacion de aquellas bases nitrogenadas modificadas mencionadas anteriormente asf como otras bases nitrogenadas incluyen, pero no se limitan a, la patente antes mencionada Estados Unidos 3,687,808, asf como Estados Unidos: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588;
6,005,096; y 5,681,941, y la patente de Estados Unidos 5,750,692.
Conjugaciones
Otra modificacion de los oligonucleotidos para su uso en el invento involucra vincularlos qmmicamente a los
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oligonucleotidos, una o mas partfculas o conjugaciones que mejoran la actividad, la distribucion celular o la absorcion celular de los oligonucleotidos. Estas partfculas o conjugaciones pueden incluir a grupos conjugados enlazados covalentemente a grupos funcionales tales como grupos de hidroxilos primarios o secundarios. Los grupos conjugados para su uso en el invento incluyen intercaladores, moleculas reportadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, polieteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinamicas de los oligomeros. Grupos de conjugacion tipicos incluyen a los colesteroles, a los lfpidos, a los fosfolfpidos, a la biotina, a la fenacina, el folato, la fenantridina, la antraquinona, la acridina, las fluorescemas, las rodaminas, las cumarinas, y colorantes. Grupos que mejoran las propiedades farmacodinamicas, en el contexto de esta especificacion, incluyen a grupos que mejoran la absorcion, mejora la resistencia a la degradacion, y/o fortalecen la hibridacion espedfica de secuencias con el acido nucleico objetivo. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocineticas, en el contexto de esta especificacion, incluyen a grupos que mejoran la absorcion, la distribucion, el metabolismo o la excrecion de los compuestos para su uso en este invento. Grupos de conjugaciones representativas se presentan en la aplicacion de patente internacional PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre de 1992, y la patente de Estados Unidos 6,287,860. Partfculas de conjugacion incluyen, pero no se limitan a, moleculas lfquidas tales como una partfcula de colesterol, acido colico, un tioeter, por ejemplo, el hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifatica, por ejemplo, el dodecandiol o residuos de undecilo, un fosfolfpido, por ejemplo, el di-hexadecil-rac-glicerol o el trietil-amonio 1, 2- di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato, una porliamina o una cadena de polietilenglicol, o acido acetico de adamantano, una partfcula de palmitilo, o una partfcula de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Tambien pueden conjugarse oligonucleotidos del invento a sustancias farmaco activas, por ejemplo, la aspirina, la warfarina, la fenilbutazona, el ibuprofeno, el suprofeno, el fenbufeno, el ketoprofeno, el (S)-(+)-pranoprofeno, el carprofeno, la dansilsarcosina, el acido 2,3,5-triiodobenzoico, el acido flufenamico, el acido folmico, una benzotiadiazida, la clorotiazida, una diazepina, una indometicina, un barbiturato, una cefalosporina, un medicamento sulfa, un antidiabetico, un antibacterial o un antibiotico. Las conjugaciones oligonucleotido-medicamento y su preparacion son descritas en la aplicacion de patente de Estados Unidos 09/334,130 (presentada el 15 de junio de 1999).
Patente representativa de Estados Unidos que ensena la preparacion de aquellas conjugaciones de oligonucleotidos incluyen, pero no se limitan a, Estados Unidos: 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465 5,541,313 5,545,730 5,552,538 5,578,717, 5,580,731 5,580,731 5,591,584 5,109,124 5,118,802. 5,138,045
5,414,077 5,486,603 5,512,439 5,578,718, 5,608,046 4,587,044 4,605,735 4,667,025 4,762,779, 4,789,737
4,824,941 4,835,263 4,876,335 4,904,582, 4,958,013, 5,082,8305, 112,963 5,214,136 5,082,830. 5,112,963
5,214,136 5,245,022 5,254,469 5,258,506, 5,262,536, 5,272,250 5,292,873,5,317,098 5,371,241, 5,391,723
5,416,203 5,451,463 5,510,475 5,512,667, 5,514,785 5,565,552 5,567,810 5,574,142,5,585,481, 5,587,371 5,595,726 5,597,696, 5,599,923 5,599,928 y 5,688,941.
Compuestos quimericos
No es necesario para todas las posiciones en un compuesto espedfico estar modificadas uniformemente, y de hecho, mas de una de las modificaciones ya mencionadas podna incorporarse en un solo compuesto o incluso en un solo nucleosido dentro de un oligonucleotido.
Este invento tambien puede incluir a compuestos antisentido para su uso los cuales son compuestos quimericos. Los compuestos “quimericos” antisentido o “quimeras”, en el contexto de esta especificacion, son compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, que contienen 2 o mas regiones qmmicamente diferentes, cada una hecha de por lo menos una unidad monomerica, es decir, un nucleotido en el caso de un compuesto oligonucleotido. Estos oligonucleotidos comunmente contienen por lo menos una region donde el oligonucleotido es modificado para otorgar al oligonucleotido una resistencia incrementada a la degradacion de las nucleasas, una absorcion celular incrementada, una estabilidad incrementada y/o una afinidad de enlaces incrementada para el acido nucleico objetivo. Una region adicional de los oligonucleotidos podna servir como un substrato para las enzimas capaz de dividir a dbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. En forma de ejemplo, la ribonucleasa H es una endonucleasa que divide a la hebra del ARN de un duplex de ARN: ADN. La activacion de la ribonucleasa H, por lo tanto, resulta en la division del objetivo ARN, mejorando, por lo tanto, extensamente la eficiencia de la inhibicion mediada por los oligonucleotidos de la expresion genetica. La division de dbridos ARN:ARN puede, en una forma similar, lograrse a traves de las acciones de las endorribonucleasas, tales como la ribonucleasa L que divide al ARN celular y viral. La division del objetivo ARN puede ser detectado rutinariamente por medio de electroforesis de gel y, si fuese necesario, tecnicas de hibridacion conocidas en la tecnica asociadas con los acidos nucleicos.
Los compuestos antisentido quimericos para su uso en el invento pueden ser formados como estructuras compuestas de 2 o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, mimeticos de oligonucleosidos y/o oligonucleotidos tal como se describio anteriormente. Aquellos compuestos han sido referidos en la tecnica como dbridos o gapmers. Patente representativas de Estados Unidos que ensena la preparacion de aquellas estructuras dbridas incluyen, pero no se limitan a, Estados Unidos: 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5,700,922.
G. Formulaciones
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Los compuestos para su uso en el invento podnan ser mezclados, encapsulados, conjugados o asociados de otras formas a otras moleculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como por ejemplo, a liposomas, moleculas dirigidas a reserva por es, formulaciones orales, rectales, topicas o de otro tipo, para asistir a la absorcion, distribucion y/o asimilacion. Patente representativas de Estados Unidos que ensenan la preparacion de formulaciones quedan asistencia a aquella absorcion, distribucion y/o asimilacion incluyen, pero no se limitan a, Estados Unidos: 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932, 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633,
5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854, 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948, 5,580,575; y 5,595,756.
Los compuestos antisentido para su uso en el invento abarca a cualquier sal, ester o sal de ester o cualquier otro compuesto farmaceuticamente aceptable, que cuando sea administrado a un animal, incluyendo un humano, sea capaz de suministrar (directamente o indirectamente) el metabolito biologicamente activo o su residuo. Asimismo, por ejemplo, la presentacion tambien es sacada de pro-medicamentos y sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos para su uso en el invento, las sales farmaceuticamente aceptables de dichos pro- medicamentos, y otros equivalentes biologicos. El sodio es una sal farmaceuticamente aceptable, particularmente para los compuestos de oligonucleotidos.
El termino “pro-medicamentos” indica el agente terapeutico que es preparado en una forma inactiva que es convertido a una forma activa (es decir, un medicamento) dentro del cuerpo o de sus celulas por la accion de enzimas endogenas u otros qmmicos y/o condiciones. En particular, las versiones de pro-medicamentos de los oligonucleotidos para su uso en el invento son preparados como derivados de [(Sacetil-2-tioetil) fosfato] de SATE de acuerdo a los metodos presentados en WO 93/24510 a Gosselin et al., publicado el 9 de diciembre de 1993 o en WO 94/26764 y U.S. 5,770,713 de Imbach et al.
El termino “sales farmaceuticamente aceptables” se refiere a sales fisiologica y farmaceuticamente aceptables de los compuestos para su uso en el invento: es decir, sales que retienen la actividad biologica deseada del compuesto padre y no imparten efectos toxicologicos. Para los oligonucleotidos, ejemplos preferidos de sales farmaceuticamente aceptables y sus usos son descritos aun mas en la patente de Estados Unidos 6,287,860.
Esta presentacion tambien incluye composiciones y formulaciones farmaceuticas que incluyen a los compuestos antisentido del invento. Las composiciones farmaceuticas de este invento podnan administrarse en varias formas dependiendo de si un tratamiento es local o sistemico es deseado y dependiendo del area que va a ser tratada. La administracion podna ser topica (incluyendo las membranas oftalmicas y mucosas incluyendo una entrega vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, por medio de la inhalacion o la insuflacion de polvos o aerosoles, incluyendo por medio de un nebulizador; intra - traquea, intranasal, epidermica y transdermica), oral o parenteral. La administracion parenteral incluye inyecciones o infusiones intravenosas, intra - arteriales, subcutaneas, intraperitoneales o intramusculares; o intracraneales, por ejemplo, una administracion intratecal o intraventricular. Se cree que los oligonucleotidos que tienen por lo menos una modificacion de 2'-O-metoxietilo son particularmente utiles para una administracion oral. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas para una administracion topica podnan incluir parches, unguentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, lfquidos y polvos transdermicos. Los portadores farmaceuticos convencionales, bases acuosas, de polvos o de aceites, enlazadores y similares podnan ser necesarios o deseables. Condones cubiertos, guantes y similares tambien podnan ser utiles.
Las formulaciones farmaceuticas para su uso en este invento, que podnan presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias, podna ser preparadas de acuerdo a tecnicas convencionales bien conocidas en la industria farmaceutica. Aquellas tecnicas incluyen el paso de asociar a los ingredientes activos con un portador o portadores o excipiente o excipientes farmaceuticos. En general, las formulaciones son preparadas al asociar uniformemente e mtimamente a los ingredientes activos con portadores lfquidos o portadores solidos divididos finamente o ambos, y luego, si fuese necesario, darle forma al producto.
Las composiciones de este invento podnan ser formuladas en cualquiera de muchas formas posibles de dosis tales como, pero sin limitarse a, tabletas, capsulas, capsulas de gel, jarabes lfquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones para su uso en este invento tambien podnan ser formuladas como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas podnan contener ademas sustancias que incrementan la viscosidad de la suspension incluyendo, por ejemplo, a la carboximetilcelulosa de sodio, al sorbitol y/o al dextrano. La suspension tamil podna contener estabilizadores.
Las composiciones farmaceuticas para su uso en este invento incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones, espumas y liposomas que contienen formulaciones. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas para su uso en este invento podnan comprender uno o mas mejoradores de penetracion, portadores, excipientes u otros ingredientes activos o inactivos.
Las emulsiones son sistemas comunmente heterogeneos de un lfquido dispersado en otro en la forma de
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gotas usualmente excediendo 0.1 pM de diametro. Las emulsiones podnan contener componentes adicionales ademas de las fases dispersas, y el medicamento activo que podna estar presente como una solucion en la fase acuosa, la fase de aceites o individualmente como una fase separada. Las micro emulsiones son incluidas como una realizacion de esta presentacion. Las emulsiones y sus usos son bien conocidas en la tecnica y son descritas aun mas en la patente de Estados Unidos 6,287,860.
Las formulaciones para su uso en este invento incluyen formulaciones de liposomas. Tal como se utiliza en esta especificacion, el termino “liposoma” se refiere a una vesfcula compuesta de ffpidos anfifflicos configurados en una bi-capa o bi-capas esfericas. Los liposomas son vesfculas unilamlares o multilamelares que tienen una membrana formada de un material lipofflico y un interior acuoso que contiene la composicion que va a ser entregada. Los liposomas cationicos son liposomas cargados positivamente que se cree que interactuan con las moleculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. Los liposomas que son sensibles al pH o que estan cargados negativamente se cree que atrapan al ADN en vez de crear complejos con el punto ambos liposomas cationicos y no cationicos han sido utilizados para entregar el ADN a las celulas.
Los liposomas tambien incluyen a liposomas “estabilizados estericamente”, un termino que, tal como se utiliza en este documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o mas ffpidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas, resultan en vidas utiles mejoradas de circulacion en relacion a los liposomas que no tienen dichos ffpidos especializados. Ejemplos de liposomas estabilizados estericamente son aquellos en los cuales una parte de la porcion de ffpidos que forma a la vesfcula de liposoma comprende uno o mas glucoffpidos o es derivado con uno o mas poffmeros hidrofflicos, tal como una parffcula de polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos son descritos aun mas en la patente de Estados Unidos 6,287,860.
Las formulaciones y composiciones farmaceuticas para su uso en este invento tambien podnan incluir surfatantes. El uso de surfactantes en productos, formulaciones y en emulsiones farmacologicas es bien conocida en la tecnica. Surfactantes y sus usos son descritos aun mas en la patente de Estados Unidos 6,287,860.
En una realizacion, esta especificacion utiliza varios mejoradores de penetracion para efectuar una entrega eficiente de los acidos nucleicos, particularmente de los oligonucleotidos. Adicionalmente a ayudar a la diffusion de los medicamentos no lipofflicos a lo largo de las membranas celulares, mejoradores de penetracion tambien incrementan la permeabilidad de los medicamentos lipofflicos. Los mejoradores de penetracion podnan clasificarse como que pertenecen a una de 5 categonas amplias, es decir, surfactantes, acidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no surfactantes no quelantes. Los mejoradores de penetracion y sus usos son descritos aun mas en la patente de Estados Unidos 6,287,860.
Una persona con conocimiento en la tecnica reconocera que las formulaciones son disenadas rutinariamente de acuerdo a la intencion de su uso, es decir, la ruta de administracion.
Otros compuestos antisentido preferidos son aquellos capaces de una administracion oral tales como los compuestos antisentido 2'MOE y los fosforodiamidatos de morfolino. Esto suministra una conveniencia adicional a los usuarios en relacion a los compuestos del receptor de la hormona de crecimiento en comparacion con los compuestos anteriores en la tecnica. Compuestos preferidos para el tratamiento de algunas condiciones seran aquellos que distribuyen ampliamente y, por lo tanto, mas habilmente efectos locales y/o sistemicos por medio del rinon. Debe entenderse, sin embargo, que en otras condiciones, la distribucion a menos organos es lo preferido.
Formulaciones preferidas para su administracion topica incluyen aquellas en las cuales los oligonucleotidos para su uso en el invento son mezclados con un agente de entrega topica tal como ffpidos, liposomas, acidos grasos, esteres de acidos grasos, esteroides, agentes quelantes y surfactantes. Los ffpidos y liposomas preferidos incluyen a neutrales (por ejemplo, etanolamina de DOPE de dioleoilfosfatidilo, DMPC de colina de dimiristoilfosfatidilo, colina de distearolifosfatidilo) negativos (por ejemplo, DMPG de glicerol de dimiristoilfosfatidilo) y cationicos (por ejemplo, DOTAP de dioleoiltetrametilaminopropilo y DOTMA etanolamina de dedioleoilfosfatidilo).
Para administracion topica o de otro tipo, pueden encapsularse oligonucleotidos de este invento dentro de liposomas o pueden formar complejos compuestos, en particular a liposomas cationicos. Alternamente, los oligonucleotidos pueden ser formados en complejos con ffpidos, en particular con ffpidos cationicos. Acidos grasos y esteres preferidos, sus sales farmaceuticamente aceptables, y sus usos son descritos aun mas en la patente de Estados Unidos 6,287,860. Formulaciones topicas son descritas en detalle en la aplicacion de patente de Estados Unidos 09/315,298 presentada el 20 de mayo de 1999.
Las composiciones y formulaciones para su administracion oral incluyen polvos o granulos, microparffculas, nanoparffculas suspensiones o soluciones en agua o en medios no acuosos, capsulas, capsulas de gel, bolsitas, tabletas o mini -tabletas. Espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionantes, asistentes de dispersion o enlazadores pueden ser deseables. Formulaciones orales preferidas son aquellas en las cuales oligonucleotidos para su uso en el invento son administrados en conjunto con uno o mas surfactantes y quelantes mejoradores de penetracion. Surfactantes preferidos incluyen acidos grasos y/o sus esteres o sus sales. Acidos/sales biliares y
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acidos grasos preferidos y sus usos son descritos aun mas en la patente de Estados Unidos 6,287,860. Tambien son preferidas combinaciones de mejoradores de penetracion, por ejemplo, acidos/sales grasas en combinacion con acidos/sales biliares. Una combinacion particularmente preferida es la sal de sodio de acido laurico, acido caprico y UDCA. Mejoradores de penetracion adicionales incluyen al eter de polioxietileno-9-laurilo, el eter de polioxietileno- 20-cetilo. Oligonucleotidos para su uso en el invento podnan ser entregados oralmente, en una forma granular incluyendo partfculas secadas y esparcidas por aerosol, o puestas en complejos para formar micro o nanopartfculas. Los agentes formadores de complejos de oligonucleotidos y sus usos son descritos aun mas en la patente de Estados Unidos 6,287,860. Mutaciones orales para oligonucleotidos y su preparacion son descritos en detalle en las aplicaciones de Estados Unidos 09/108,673 (presentada el 1 de julio 1998), 09/315,298 (presentada el 20 de mayo 1999) y 10/071,822 (presentada el 8 de febrero 2002).
Las composiciones y formulaciones para una administracion parenteral, intratecal o intraventricular podnan incluir soluciones acuosas esteriles que tambien podnan contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitarse a, mejoradores de penetracion, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmaceuticamente aceptables.
Ciertas secciones de la presentacion se refieren a composiciones farmaceuticas que contienen uno o mas compuestos oligomericos y uno o mas de otros agentes quimioterapeuticos que funcionan por medio de un mecanismo antisentido. Ejemplos de aquellos agentes quimioterapeuticos incluyen, pero no se limitan a, medicamentos quimioterapeuticos del cancer tales como la daunorubicina, la daunomicina, la dactinomicina, la doxorubicina, la epirubicina, la idarubicina, la esorubicina, la bleomicina, la mafosfamida, la ifosfamida, la citosina, la arabinosida, la bis-cloroetilnitrosurea, el busulfano, la mitomicina C, la actinomicina D, la mitramicina, la prednisona, la hidroxiprogesterona, la testosterona, el tamoxifeno, la dacarbacina, la procarbacina, la hexametilmelamina, la pentametilmelamina, la mitoxantrona, la amsacrina, el clorambucilo, la etilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrogeno, el melfalano, la ciclofosfamida, la 6-mercaptopurina, la 6-tioguanina, la citarabine, la 5-azacitidina, la hidroxiurea, la deoxico-formicina, la 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, el 5-fluorouracilo (5-FU), la 5-fluorodeoxiuridina (5-FUdR), el metotrexato (MTX), la colchicina, el taxol, la vincristina, la vinblastina, el etoposido (VP-16), el trimetrexato, el irinotecan, el topotecan, la gemcitabina, el teniposido, el cisplatino y el dietilstilbestrol (DES). Cuando se usa con los compuestos para su uso en el invento, aquellos agentes quimioterapeuticos podnan ser utilizados individualmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotidos), secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleotidos durante un periodo de tiempo seguido por MTX y oligonucleotidos), o en combinacion con uno o mas agentes quimioterapeuticos adicionales (por ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleotidos, o 5-FU, radioterapia y oligonucleotidos). Medicamentos antiinflamatorios, incluyendo, pero sin limitarse a, medicamentos no esteroideos antiinflamatorios y corticoesteroides, y medicamentos antivirales, incluyendo, pero sin limitarse a la ribivirina, la vidarabina, aciclovir y el ganciclovir, tambien podnan ser combinados en composiciones para su uso en el invento. Las combinaciones de los compuestos antisentido y otros medicamentos antisentido tambien estan dentro del enfoque de esta presentacion. 2 o mas compuestos combinados podnan ser usados juntos o secuencialmente. Combinaciones preferidas comprenden a octreotidos, a Trovert y/u otros inhibidores o antagonistas de la hormona de crecimiento, el factor de crecimiento similar a la insulina-I, el IGFBP-3, el receptor de la hormona de crecimiento o el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina.
Las composiciones del invento podnan contener uno o mas compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, dirigidos a un primer acido nucleico y uno o mas compuestos antisentido adicionales orientados hacia un 2° objetivo de acido nucleico. Alternamente, las composiciones para su uso en el invento podnan contener 2 o mas compuestos antisentido dirigidos a regiones diferentes del mismo objetivo del acido nucleico. Numerosos ejemplos de compuestos antisentido son conocidos en la tecnica. 2 o mas compuestos combinados podnan ser utilizados juntos o secuencialmente.
H. Dosis
Se cree que la formulacion de las composiciones terapeuticas y su administracion subsiguiente (dosis) esta dentro del conocimiento de aquellas personas en la tecnica. La dosis depende de la gravedad y el nivel de respuesta del estado de la enfermedad que se este tratando, con el curso de tratamiento que dura desde algunos dfas hasta algunos meses, o hasta que una cura sea efectuada o una reduccion del estado de la enfermedad sea alcanzada. Cronogramas optimos de dosis pueden calcularse a partir de mediciones de la acumulacion del medicamento en el cuerpo del paciente. Personas con un conocimiento normal pueden determinar facilmente dosis optimas, metodologfas de dosis y tasas de repeticion. Dosis optimas podnan variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleotidos individuales, y pueden, generalmente, estimarse basandose en los EC50s que han demostrado ser efectivos en modelos animales in vitro e in vivo. En general, dosis que van desde 0.01 microgramos a 100 g por kilogramo de masa corporal, y podnan ser entregados una vez o mas diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 anos. Personas con un conocimiento normal en la tecnica podran estimar facilmente las tasas de repeticion para las dosis basandose en tiempos medidos de residencia y concentraciones del medicamento en los fluidos y tejidos corporales. Despues de un tratamiento exitoso, podna ser deseable exponer a un paciente a una terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de la enfermedad, donde el oligonucleotido es administrado en dosis de mantenimiento, que vanan desde 0.01 microgramos a 100 g por
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kilogramo de masa corporal, una vez o mas veces diariamente a una vez cada 20 anos.
Oligonucleotidos antisentido preferidos son hechos con tecnicas qmmicas capaces de reducir la frecuencia de las dosis, es decir, una vez al d^a, una vez a la semana o menos frecuentemente. Qmmicas antisentido paticularmente preferidas son aquellas utilizadas en este documento que podnan ser administradas una vez cada 2 dfas y que son capaces de ser administradas por lo menos una vez a la semana subcutaneamente, e incluso menos frecuentemente como por ejemplo una vez al mes, basandose en las observaciones de antisentidos de la misma clase. Esto es menos frecuente que Trovert en el mismo modelo animal, que fue administrada todos los dfas, y menos frecuente que la experiencia clmica actual con Trovert. Esto suministra una enorme conveniencia para el tratamiento de esta condicion cronica que podna potencialmente mejorar el cumplimiento.
Aunque este invento ha sido descrito con una especificidad de acuerdo a ciertas secciones importantes, los siguientes ejemplos sirven unicamente para ilustrar el invento y no tiene la intencion de limitarlo.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Sintesis de Fosforamiditas de Nucleosidos
Los siguientes compuestos, incluyendo las amiditas y sus intermediadores fueron preparados tal como se describe en la patente de Estados Unidos 6,426,220 y publicada en la PCT WO 02/36743; el intermediador 5’-O- Dimetoxitritil-timidina para la amidita de dC de 5-metilo, el intermediador 5'-O-Dimetoxitritil-2'-deoxi-5-metilcitidina para la amidita de 5-metil-dC, el penultimo intermediador 5'-O-Dimetoxitritil-2'-deoxi-N4-benzoil-5-metilcitidina para la amidita de dC de 5-metilo, [5’-0-(4,4’-Dimetoxitrifenilmetil)-2’-deoxi-N4-benzoil-5-metilcitidina-3’-0-il]-2-cianoetil-W,A/- diisopropilfosforamidita (amidita de dC de 5-metilo), 2’-Fluorodeoxiadenosina, 2’-Fluorodeoxiguanosina, 2’- Fluorouridina, 2’-Fluorodeoxicitidina, amiditas modificadas de 2’-O-(2-Metoxietilo), el intermediador 2’-O-(2- metoxetil)-5-metiluridina, el penultimo intermediador 5’-O-DMT-2’-O-(2-metoxetil)-5-metiluridina, [5’-0-(4,4’- Dimetoxitrifenilmetil)-2’-0-(2-metoxietil)-5-metiluridina-3’-0-il]-2-cianoetil-W,A/-diisopropilfosforamidita (amidita de T de MOE), intermediador 5’-O-Dimetoxitritil-2’-O-(2-metoxietil)-5-metilcitidina, el penultimo intermediador 5’-O- dimetoxitritil-2’-0-(2-metoxetil)-N4-benzoil-5-metil-citidina, [5’-0-(4,4’-Dimetoxitrifenilmetil)-2’-0-(2-metoxietil)-N4- benzoil-5-metilcitidina-3’-0-il]-2-cianoetil-W,A/-diisopropilfosforamidita (amidita de 5-Me-C de MOE), [5’-0-(4,4’- Dimetoxitrifenilmetil)-2’-0-(2-metoxietil)-N6-benzoiladenosina-3’-0-il]-2-cianoetil-W,W-diisopropilfosforamidita (amidita de MOE), [5’-0-(4,4’-Dimetoxitrifenilmetil)-2’-0-(2-metoxietil)-N4-isobutirilguanosina-3’-0-il]-2-cianoetil-W,A/-
diisopropilfosforamidita (amidita de G de MOE), amiditas de nucleosidos de 2’-O-(Aminooxietilo) y amiditas de nucleosidos de 2’-O-(dimetilamino-oxietilo), amiditas de nucleosidos de 2’-(Dimetilaminooxietoxi), 5’-O-terc- Butildifenilsilil-O2-2’-anhidro-5-metiluridina, 5’-O-terc-Butildifenilsilil-2’-O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina, 2’-O-([2- ftalimidoxi)etil]-5’-f-butildifenilsilil-5-metiluridina, 5’-O-ferc-butildifenilsilil-2’-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina, 5’-O-ferc-Butildifenilsilil-2’-O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina, 2’-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina, 5’-O- DMT-2’-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina, 5’-O-DMT-2’-O-(2-N,N-dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3’-[(2-
cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita], amidita de nucleosidos de 2’-(Aminooxietoxi), N2-isobutiril-6-O- difenilcarbamoil-2’-O-(2-etilacetil)-5’-O-(4,4’-dimetoxitritil)guanosina-3’-[(2-caanoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita], amiditas de nucleosidos de 2’-dimetilaminoetoxietoxi (2’-DMAEOE), uridina de 2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil]- 5-metilo, uridina de 5’-O-dimetoxitritil-2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metil y uridina-3’-O-(cianoetil-N,N- diisopropil)fosforamidita de 5’-O-Dimetoxitritil-2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metilo.
Ejemplo 2
Sintesis de Oligonucleotidos y Oligonucleosidos
Los compuestos antisentido utilizados de acuerdo a este invento pueden ser hechos convenientemente y rutinariamente por medio de la tecnica bien conocida de sintesis de fase solida. Equipos para aquellas sintesis son vendidos por varios proveedores, incluyendo, por ejemplo, a Applied Biosystems (Foster City, CA). Cualquier otro metodo para aquella sintesis conocido en la tecnica podna ser utilizado adicionalmente o alternamente. Es bien conocido el usar tecnicas similares para preparar oligonucleotidos tales como derivados de fosforotioatos y alquilatados.
Oligonucleotidos: los oligonucleotidos de fosfodiesteres (P = 0) no sustituidos y sustituidos son sintetizados en un sintetizador automatizado de ADN (Applied Biosystems modelo 394) utilizando qmmica estandar defosforamiditas con oxidacion por medio de yodo.
Los fosforotioatos (P = S) son sintetizados similarmente a los oligonucleotidos de fosfodiesteres con las siguientes excepciones: la tiacion fue efectuada al utilizar el 10% masa/volumen de la solucion de 1,1 -dioxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona en acetonitrilo para la oxidacion de los enlaces de fosfito. El tiempo del paso de la reaccion de tiacion fue incrementado a 180 segundos y precedido por el paso de nivelacion normal. Despues de la division de
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la columna CPG un desbloqueo en hidroxido de amonio concentrado a 55 °C (de 12 a 16 horas), los oligonucleotidos fueron recuperados por medio de precipitaciones con >3 volumenes de etanol desde 1 M de una solucion de NH40Ac. Oligonucleotidos de fosfinatos son preparados tal como se describe en la patente de Estados Unidos 5,508,270.
Los oligonucleotidos de fosfonatos de alquilos son preparados tal como se describe en la patente de Estados Unidos 4,469,863.
Los oligonucleotidos de fosfonato de 3'-Deoxi-3'-metileno son preparados tal como se describe en las patentes de Estados Unidos 5,610,289 o 5,625,050.
Los oligonucleotidos de fosforamidita son preparados tal como se describe en la patente de Estados Unidos 5,256,775 o en la patente de Estados Unidos 5,366,878.
Los oligonucleotidos de Alquilfosfonotioato son preparados tal como se describe en las aplicaciones publicadas PCT PCT/US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicadas como WO 94/17093 y WO 94/02499, respectivamente).
Los oligonucleotidos de fosforamidatos de 3'-Deoxi-3'-amino son preparados tal como se describe en la patente de Estados Unidos 5,476,925.
Los oligonucleotidos de fosfotriesteres son preparados tal como se describe en la patente de Estados Unidos 5,023,243.
Los oligonucleotidos de fosfato de borano son preparados tal como se describe en las patentes de Estados Unidos 5,130,302 y 5,177,198.
Oligonucleosidos: oligonucleosidos enlazados a metilenemetilimino, tambien identificados como oligonucleosidos enlazados a MMI, oligonucleosidos enlazados a metilenedimetilhidrazo, tambien identificados como oligonucleosidos enlazados a MDH, y oligonucleosidos enlazados a metilenecarbonilamino, tambien identificados como oligonucleosidos enlazados a amida-3, y oligonucleosidos enlazados a metileneaminocarbonilo, tambien identificados como oligonucleosidos enlazados a amida-4, asf como compuestos de estructuras mixtas que tienen, por ejemplo, enlaces alternantes de MMI y P=O son preparados tal como se describe en las patentes de Estados Unidos 5,378,825, 5,386,023, 5,489,677, 5,602,240 y 5,610,289.
Oligonucleotidos enlazados a formacetal y tioformacetal son preparados tal como se describe en las patentes de Estados Unidos 5,264,562 y 5,264,564.
Los oligonucleotidos enlazados a oxido de etileno son preparados tal como se describe en la patente de Estados Unidos 5,223,618.
Ejemplo 3
Smtesis del ARN
En general, la qmmica de la sintesis del ARN se basa en la incorporacion selectiva de varios grupos protectores en reacciones intermediadoras estrategicas. Aunque una persona con conocimiento normal en la tecnica entendera el uso de grupos protectores en la sintesis organica, una clase util de grupos protectores incluye a eteres de sililo. En particular, eteres voluminosos de sililo son utilizados para proteger al 5'-hidroxilo en combinacion con un grupo protector de orto-esteres acidos de labil en el 2'-hidroxilo. Este conjunto de grupos protectores es utilizado entonces con tecnologfa estandar para la sintesis de fases solidas. Es importante el remover al ultimo al grupo protector del orto-ester labil acido despues de todos los otros pasos sinteticos. Ademas, el uso temprano de los grupos protectores de sililo durante la sintesis asegura una remocion facil cuando sea deseado, sin una desproteccion no deseada de hidroxilo de 2'.
Despues de este procedimiento para la proteccion secuencial del 5'-hidroxilo en combinacion con la proteccion del 2'-hidroxilo por los grupos protectores que son removidos diferencialmente y son volubles diferencialmente y qmmicamente, se procedio a sintetizar a los oligonucleotidos de ARN.
Los oligonucleotidos de ARN son sintetizados en forma de pasos. Cada nucleotido es agregado secuencialmente (en la direccion desde 3'- a 5') a un oligonucleotido enlazado a un soporte solido. El primer nucleosido en el extremo de 3' de la cadena esta adherido covalentemente a un soporte solido. Se agrego el precursor de los nucleotidos, una fosforamidita de ribonucleosidos, y un activador, acoplando la 2a base en el extremo 5' del primer nucleosido. El soporte es lavado y cualquier grupo no reaccionado de 5'-hidroxilo son tapados con anhudrido acetico para generar a las partfculas de 5'-acetilo. La vinculacion es oxidada entonces a una
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vinculacion mas estable y ultimadamente deseada P (V). Al final del ciclo de adhesion de nucleotidos, el grupo 5'- sililo es dividido con fluor. El ciclo es repetido para cada nucleotido subsiguiente.
Despues de la smtesis, los grupos protectores de metilo en los fosfatos son divididos durante 30 minutos utilizando 1 M de trihidrato de disodio-2-carbamoil-2-cianoetileno-1,1-ditiolato (S2Na2) en DMF. La solucion de desproteccion es lavada del oligonucleotido enlazado a un soporte solido utilizando agua. El soporte es tratado entonces con un 40% de metilamina en agua durante 10 minutos a 55 °C. Esta liberacion de oligonucleotidos de ARN a la solucion, desprotege a las aminas exodclicas, y modifica a los grupos 2'. Los oligonucleotidos pueden ser analizados por un HPLC de intercambio de aniones en esta etapa.
Los grupos 2'- orto-esteres son los ultimos grupos protectores que deben ser removidos. El grupo protector de ortoester de monoacetato de etilenglicol desarrollado por Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO), es un ejemplo de un grupo protector util de ortoesteres que, tienen las siguientes caractensticas importantes. Es estable en las condiciones de la smtesis de fosforamiditas de nucleosidos y en la smtesis de oligonucleotidos. Sin embargo, despues de la smtesis de oligonucleotidos el oligonucleotido es tratado con metilamina que divide al oligonucleotido del soporte solido y tambien remueve a los grupos acetilos de los ortoesteres. Los sustituyentes resultantes de 2-etil- hidroxilos en el ortoester extraen menos electrones que el precursor acetilado. Como resultado, el ortoester modificado se vuelve mas voluble para la hidrolisis catalizada por medio de acidos. Espedficamente, la tasa de division es de aproximadamente 10 veces mas rapida despues de que los grupos acetilos son removidos. Por lo tanto, este ortoester posee suficiente estabilidad para ser compatible con la smtesis de oligonucleotidos y aun asf, cuando se modifica subsiguientemente, permite que se Ileve a cabo la desproteccion bajo condiciones acuosas moderadas compatibles con el producto final de oligonucleotidos del ARN.
Adicionalmente, metodos para la smtesis de ARN son bien conocidos en la tecnica (Scaringe, S. A. tesis de Ph.D., University of Colorado, 1996; Scaringe, S. A., et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 11820-11821; Matteucci, M. D. y Caruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc., 1981, 203, 3185-3191; Beaucage, S. L. y Caruthers, M. H. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862; Dahl, B. J., et al., Acta Chem. Scand,. 1990, 44, 639-641; Reddy, M. P., et al., Tetrahedrom Lett., 1994, 25, 4311-4314; Wincott, F. et al., Nucleic Acids ([Acidos Nucleicos) Res., 1995, 23, 26772684; Griffin, B. E., et al., Tetrahedron, 1967, 23, 2301-2313; Griffin, B. E., et al., Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331).
Los compuestos antisentido de ARN (oligonucleotidos de ARN) para su utilizacion en este invento pueden sintetizarse por los metodos aqu presentados o pueden ser comprados de Dharmacon Research, Inc (Lafayette, CO). Una vez sintetizados, los compuestos antisentido de ARN complementarios pueden ser recocidos por medio de metodos conocidos en la tecnica para formar compuestos antisentido de doble hebra (duplex). Por ejemplo, los duplex pueden ser formados al combinar 30 pl de cada una de las hebras complementarias de los oligonucleotidos de ARN (50 pM de la solucion de oligonucleotidos de ARN) y 15 microlitros de 5X de amortiguador de recocido (100 mM de acetato de potasio, 30 mM de HEPES-KOH pH 7.4, 2 mM de acetato de magnesio) seguido de un calentamiento durante un minuto a 90 °C, luego una hora a 37 °C. Los compuestos antisentido duplex resultantes fueron utilizados en botiquines, ensayos, pruebas y otros metodos para investigar el rol de un acido nucleico objetivo.
Ejemplo 4
Smtesis de Oligonucleotidos Quimericos
Los oligonucleotidos, oligonucleosidos u oligonucleotidos/oligonucleosidos quimericos mezclados del invento pueden ser de diferentes tipos. Estos incluyen un primer tipo donde el segmento “vado” de nucleosidos enlazados es posicionado entre los segmentos “ala” entre 5' y 3' de los nucleosidos enlazados y un 2° tipo de “extremo abierto” donde el segmento “vado” esta ubicado en la terminal de 3' o de 5' del compuesto oligomerico. Los oligonucleotidos del primer tipo tambien son conocidos en la tecnica como “gapmers” u oligonucleotidos con vados. Los oligonucleotidos del 2° tipo tambien son conocidos en la tecnica como “hemimers” o “wingmers”.
Oligonucleotidos Quimericos de Fosforotioato [2'-O-Me]--[2'-deoxi]--[2'-O-Me]
Los oligonucleotidos quimericos que tienen segmentos oligonucleotidos de fosforotioato de 2'-O- alquilo y 2'-deoxi son sintetizados utilizando un sintetizador de ADN automatizado de Applied Biosystems modelo 394, tal como se menciono anteriormente. Los oligonucleotidos son sintetizados utilizando el sintetizador automatizado y 2'- deoxi-5'-dimetoxitritil-3'-O-fosfor-amidita para la porcion de ADN y 5'-dimetoxitritil-2'-O-metil-3'-O-fosforamidita para las alas de 5' y de 3'. El ciclo de smtesis de estandares es modificado al incorporar pasos de acoplamiento con tiempos incrementados de reaccion para la 5'-dimetoxitritil-2'-O-metil-3'-O-fosforamidita. El oligonucleotido completamente protegido es dividido del soporte y desprotegido en amonio concentrado (NH4OH) durante 12-16 horas a 55 °C. El oligo es desprotegido y entonces recuperado por medio de un metodo apropiado (preparacion, cromatograffa de columnas, volumen reducido al vado y analizado por medio de espectrofotometna para su produccion y por pureza por medio de electroforesis capilar y por medio de espectrometna de masa.
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Oligonucleotidos Quimericos de Fosforotioato de [2'-O-(2-Metoxietil)]--[2'-deoxi]--[2'-O-(Metoxietilo)]
Oligonucleotidos quimericos de Fosforotioato [2'-O-(2-Metoxietil)]--[2'-deoxi]--[2'-O-(Metoxietilo)] fueron preparados de acuerdo al procedimiento mencionado anteriormente para el nucleotido quimerico de 2'-O-metilo, con la sustitucion de las amiditas de 2'-O-(metoxietil) para las amiditas de 2'-O-metilo.
Oligonucleotidos Quimericos [2'-O-(2-Metoxietil)fosfodiester]--[Fosforotioato de 2'-deoxi]--[Fosfodiester de 2'-O-(2-Metoxietilo)]
Los oligonucleotidos quimericos [2'-O-(2-Metoxietil)fosfodiester]--[Fosforotioato de 2'-deoxi]--[Fosfodiester de 2'-O-(2-Metoxietilo)] son preparados de acuerdo al procedimiento descrito anteriormente para el oligonucleotido quimerico de 2'-O-metilo con la sustitucion de amiditas de 2'-O-(metoxietilo) para las amiditas de 2'-O-metilo, la oxidacion con yodo para generar a los enlaces internucleosfdicos de fosfodiester dentro de las porciones ala para las estructuras quimericas y la sulfurizacion utilizando 1,1 dioxido de 3,H-1,2benzoditiol-3-ona (Beaucage Reagent (Reactivo)) para generar los enlaces internucleosfdicos de fosforotioato para el vado central.
Otros oligonucleotidos quimericos, oligonucleosidos quimericos y oligonucleotidos/oligonucleotsidos quimericos mezclados son sintetizados de acuerdo a la patente de Estados Unidos 5,623,065.
Ejemplo 5
Diseno y examinacion de compuestos antisentido duplex que usan como objetivo al receptor de la hormona de crecimiento
Una serie de duplex de acidos nucleicos que comprenden a los compuestos antisentido para su uso en este invento y sus complementos pueden ser disenados para usar como objetivo al receptor de la hormona de crecimiento. En una realizacion, estos acidos nucleicos duplex son compuestos de ARN de doble hebra (ARNs pequenos que interfieren o siARNs - small interfering RNAs). En general, los lugares activos para oligonucleotidos antisentido que dependen de la ribonucleasa H predicen lugares activos del siARN (Vickers et al., 2003, J. Biol Chem. 278, 7108-7118). En una realizacion, la secuencia de bases nitrogenadas de la hebra antisentido del duplex comprende por lo menos una porcion de una secuencia de oligonucleotidos que se muestran en la tabla 1. Alternamente, una nueva “caminata genetica” en la cual varios dsARNs dirigidos al receptor de la hormona de crecimiento son sintetizados y probados para ver si pueden ser utilizados.
Los extremos de las hebras de la dsARN podnan ser modificados al agregar una o mas bases nitrogenadas naturales o modificadas para formar una saliente. La hebra sentido de la dsARN es designada entonces y sintetizada como el complemento de la hebra antisentido y tambien podna contener modificaciones o adiciones a cualquiera de las terminales. Por ejemplo, en una realizacion, ambas hebras del duplex de dsARN senan complementarias sobre las bases nitrogenadas centrales, cada una teniendo salientes en una o ambas terminales. El duplex podna ser unimolecular o di-molecular; es decir, las 2 hebras podnan estar conectadas entre sf directamente o por medio de un vinculador, o podnan ser moleculas separadas.
En forma de ejemplo, un duplex que comprende una hebra antisentido que tiene la secuencia CGAGAGGCGGACGGGACCG y que tiene una salida de 2 bases nitrogenadas de deoxitimidina (dT) tendna la siguiente estructura:
imagen1
Hebra antisentido
Complemento
En otra realizacion, un duplex que comprende una hebra antisentido que tiene la misma secuencia CGAGAGGCGGACGGGACCG podna prepararse con extremos romos (ni una sola saliente con hebras) tal como se mostro:
co ac. agg c g q acggg a c eg
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Hebra antisentido
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Las hebras de ARN del duplex pueden ser sintetizadas por medio de los metodos aqu presentados o compradas de Dharmacon Research Inc., (Lafayette, CO). Una vez sintetizadas, las hebras complementarias son recocidas. Las hebras individuales son divididas en porciones y diluidas a una concentracion de 50 |jM. Una vez diluidas, 30 pl de cada hebra es combinada con 15 pl de una solucion 5X de amortiguador de recocido. La concentracion final de dicho amortiguador es 100 mM de acetato de potasio, 30 mM de HEPES-KOH pH 7.4, y 2mM de acetato de magnesio. El volumen final es 75 pl. La solucion es incubada durante un minuto a 90 °C y luego centrifugada durante 15 segundos. Al tubo se le permite reposar durante una hora a 37 °C, tiempo durante el cual los duplex de dsARN son utilizados en experimentaciones. La concentracion final del duplex de dsARN es 20 pM. La solucion puede ser almacenada en una forma congelada (-20 °C) y congelada-descongelada hasta 5 veces.
Una vez preparados, los compuestos antisentido duplex son evaluados para detectar su capacidad para modular a la expresion del receptor de la hormona de crecimiento.
Cuando las celulas alcanzaron el 80% de confluencia, fueron tratadas con compuestos antisentido duplex. Para celulas cultivadas en placas de 96 pozos, los pozos fueron lavados una vez con 200 pl de un medio serico reducido OPTI-MEM-1 (Gibco BRL) y luego se trato con 130 pl de OPTI-MEM-1 que contema 12 pg/mililitros de LIPOFECTINA (Gibco BRL) y el compuesto antisentido duplex deseado a una concentracion final de 200 nM. Despues de 5 horas de tratamiento, el medio es reemplazado con un medio fresco. Las celulas fueron cultivadas 16 horas despues del tratamiento, en cuyo momento el ARN fue aislado y la reduccion del objetivo fue medida por RT- PCR.
Ejemplo 6
Aislamiento de los Oligonucleotidos
Despues de la division del soporte solido de vidrio de poros controlados y del desbloqueo en hidroxido de amonio concentrado a 55 °C durante 12-16 horas, los oligonucleotidos o los oligonucleosidos son recuperados por medio de precipitaciones de 1M de NH4OAc con volumenes >3 de etanol. Los oligonucleotidos sintetizados fueron analizados por medio de espectroscopfa de masa de electro aerosol (determinacion de la masa molecular) y por medio de electroforesis de gel capilar y se estimo que era por lo menos un 70% de la longitud completa del material. Los montos relativos de los enlaces de fosforotioatos y fosfodiesteres obtenidos en la smtesis se determino por la tasa de masa molecular correcta en relacion a los -16 amu del producto (+/-32 +/-48). Para algunos estudios los oligonucleotidos fueron purificados por medio de HPLC, tal como se describio por Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171. Los resultados obtenidos con el material purificado por HPLC fueron similares a aquellos obtenidos con el material no purificado por medio de HPLC.
Ejemplo 7
Smtesis de Oligonucleotidos - Formato de Placas de 96 Pozos
Los oligonucleotidos fueron sintetizados por medio de qmmica de fosforamiditas de fase solida P(III) en un sintetizador automatizado capaz de ensamblar 96 secuencias simultaneamente en un formato de 96 pozos. Los enlaces internucleosfdicos de fosfodiesteres fueron generados por medio de oxidacion en yodo acuoso. Los enlaces internucleosfdicos de fosforotioato fueron generados por medio de sulfurizacion utilizando 1,1 dioxido de 3,H-1,2 benzoditiol-3-ona (Beaucage Reagent) en acetonitrilo anhfdrido. Las fosforamidita de beta-cianoetil-diiso-propilo de base estandar protegida fue comprada de proveedores comerciales (por ejemplo, PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, o Pharmacia, Piscataway, NJ). Los nucleosidos que no eran estandar fueron sintetizados por medio de metodos estandar o patentados. Ellos son utilizados como fosforamiditas de beta-cianoetildiisopropilo de bases protegidas.
Los oligonucleotidos fueron divididos del soporte y fueron desprotegidos con NH4OH concentrado a temperaturas elevadas (55-60 °C) durante 12-16 horas y el producto liberado fue entonces secado al vado. El producto seco fue entonces re-suspendido en agua esteril para generar una placa maestra de la cual todas las muestras de las placas analfticas y de prueba fueron entonces diluidas utilizando pipetas roboticas.
Ejemplo 8
Analisis de Oligonucleotidos - Formato de Placas de 96 Pozos
La concentracion de los oligonucleotidos en cada pozo fue evaluada por medio de la dilucion de muestras y la espectroscopia de absorcion de UV. La integridad de longitud completa de los productos individuales fue evaluada por medio de electroforesis capilar (CE - capillary electrophoresis) en un formato de 96 pozos (Beckman P/ACE™ MDQ) o, para muestras preparadas individualmente, un aparato comercial de CE (por ejemplo, Beckman P/ACE™
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5000, ABI 270). La composicion base y de la estructura fue confirmada por analisis de masa de los compuestos utilizando espectros con espectroscopia de masa por electro aerosol. Todas las placas de pruebas de ensayo fueron diluidas de la placa maestra utilizando pipetas roboticas de un solo canal y de canales multiples. Se estimo que las placas eran aceptables si por lo menos el 85% de los compuestos en la placa teman un 85% de la longitud completa.
Ejemplo 9
Cultivo Celular y Tratamiento de Oligonucleotidos
El efecto de los compuestos antisentido en la expresion objetivo de acidos nucleicos puede probarse en cualquiera de una variedad de tipos celulares siempre y cuando el acido nucleico objetivo este presente a niveles medibles. Esto puede determinarse rutinariamente utilizando, por ejemplo, el analisis PCR o de Northern blot. Los siguientes tipos celulares son suministrados para propositos ilustrativos, pero otros tipos celulares pueden ser utilizado rutinariamente, siempre y cuando el objetivo este expresado en el tipo celular escogido. Esto puede determinarse facilmente por medio de metodos rutinarios en la tecnica, por ejemplo, el analisis de Northern blot, ensayos de proteccion de ribonucleasas, o RT-PCR.
Celulas T-24:
La lmea celular T-24 de carcinoma de vejiga de celulas de transicion humanas fue obtenida del American Type Culture Collection (ATCC - la Coleccion Americana de Tipos de Cultivos) (Manassas, VA). Las celulas T-24 fueron cultivadas rutinariamente en un medio completo basal 5A de McCoy (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) suplementado con un 10% de suero fetal de ternero (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), penicilina 100 unidades por mililitro, y estreptomicina de 100 |jg por mililitro (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Las celulas fueron pasadas rutinariamente por medio de tripnizacion y dilucion cuando alcanzaron una confluencia del 90%. Las celulas fueron sembradas en placas de 96 pozos (Falcon-Primaria #353872) a una densidad de 7000 celulas/pozo para su uso en un analisis de RT-PCR.
Para analisis de Northern blot o de otro tipo, las celulas podnan ser sembradas en 100 mm u otras placas de cultivos de tejidos estandar y tratadas en forma similar, utilizando volumenes apropiados de medio y de oligonucleotidos.
Celulas A549:
La lmea celular A549 de carcinoma de pulmon humano fue obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC - la Coleccion Americana de Tipos de Cultivos) (Manassas, VA). Las celulas A549 fueron cultivadas rutinariamente en un medio basal DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) suplementada con un 10% de suero fetal de ternero (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), penicilina 100 unidades por mililitro, y estreptomicina de 100 jg por mililitro (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Las celulas fueron pasadas rutinariamente por medio de tripnizacion y dilucion cuando alcanzaron el 90% de confluencia.
Celulas NHDF:
Fibroblastos dermicos neonatales humanos (NHDF - Human neonatal dermal fibroblast) fueron obtenidos de Clonetics Corporation (Walkersville, MD). Los NHDFs fueron mantenidos rutinariamente en un medio de crecimiento de fibroblastos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) suplementados tal como fue recomendado por el proveedor. Las celulas fueron mantenidas por hasta 10 pases tal como lo recomendo el proveedor.
Celulas HEK:
Los queratinocitos embrionarios humanos (HEK - Human embryonic keratinocytes) fueron obtenidos de Clonetics Corporation (Walkersville, MD). Los HEKs fueron mantenidos rutinariamente en un medio de crecimiento de queratinocitos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) formulado tal como lo recomendo el proveedor. Las celulas fueron mantenidas rutinariamente por hasta 10 pases tal como lo recomendo el proveedor.
MCF7:
La lmea celular MCF-7 de carcinoma de mama humana fue obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC - la Coleccion Americana de Tipos de Cultivos) (Manassas, VA). Las celulas mCF-7 fueron cultivadas rutinariamente DMEM de glucosa baja (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementada con un 10% de suero fetal de becerro (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las celulas fueron pasadas rutinariamente por medio de tripnizacion y dilucion cuando alcanzaron el 90% de confluencia. Las celulas fueron sembradas en placas de 96 pozos (Falcon-Primaria #3872) a una densidad de 7000 celulas/pozo para su uso en el analisis RT-PCR.
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Para Northern blotts u otros analisis, las celulas pueden sembrarse a 100 mm u otras placas estandar de cultivos de tejidos y pueden ser tratadas similarmente, utilizando volumenes apropiados de medios y oligonucleotidos.
Celulas b.END:
La lmea celular b.END endotelial de cerebro de raton fue obtenida del Dr. Werner Risau en el Max Plank Instititute (Bad Nauheim, Alemania). Las celulas b.END fueron cultivadas rutinariamente en DMEM, de alta glucosa (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementadas con un 10% de suero fetal de becerro (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las celulas fueron pasadas rutinariamente por medio de tripnizacion y dilucion cuando alcanzaron el 90% de confluencia. Las celulas fueron sembradas en placas de 96 pozos (Falcon-Primaria #3872) a una densidad de 3000 celulas/pozo para su uso en analisis de RT-PCR.
Para un analisis de Northern blots y de otro tipo, las celulas pueden ser sembradas en 100 mm u otras placas de cultivo celular estandar y tratadas similarmente, utilizando volumenes apropiados de medios y de oligonucleotidos.
Tratamiento con compuestos antisentido:
Cuando las celulas alcanzaron un 65-75% de confluencia, fueron tratadas con oligonucleotidos. Para las celulas cultivadas en placas de 96 pozos, los pozos fueron lavados una vez con 100 pl de un medio serico reducido con OPTI-MEM™-1 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) y entonces fueron tratados con 130 pl de OPTI-MEM™-1 que contema 3.75 microgramos/mililitro de LIPOFECTIN™ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) y la concentracion deseada de oligonucleotidos. Las celulas fueron tratadas y la informacion fue obtenida por triplicado. Despues de 4-7 horas de tratamiento a 37 °C, el medio fue reemplazado con un medio fresco. Las celulas fueron cultivadas 16-24 horas despues del tratamiento de los oligonucleotidos.
La concentracion de oligonucleotidos que se utilizo vario entre cada lmea celular. Para determinar la concentracion optima de oligonucleotidos para una lmea celular espedfica, las celulas son tratadas con un oligonucleotido de control positivo en un rango de varias concentraciones. Para las celulas humanas el oligonucleotido de control positivo es seleccionado de ISIS 13920 (TCCGTCATCGCTCCTCAGGG,
IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 1) la cual fue orientada hacia H-ras, o ISIS 18078, HUMANAS (GTGCGCGCGAGCCCGAAATC, IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 2) la cual fue orientada a las quinasas-2 de la terminal Jun-N humana (JNK2 - Jun-N-terminal kinase-2). Ambos controles son gapmers de 2'-O- metoxietilo (2'-O-metoxietilos mostrados en negrillas) con una estructura de fosforotioato. Para celulas de ratones o de ratas el oligonucleotido de control positivo es iSiS 15770, ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 3, un gapmer 2'-O-metoxietilo (2'-O-metoxietilos mostrados en negrillas) con una estructura de fosforotioato que es orientada hacia el raton y la rata c-raf. La concentracion de oligonucleotidos de control positivo que resultaron en un 80% de inhibicion de ARNm de c-H-ras (para ISIS 13920), JNK2 (para ISIS 18078) o c-raf (para ISIS 15770) es utilizada entonces como una concentracion de examinacion para nuevos oligonucleotidos en experimentos subsiguientes para aquella lmea celular. Si el 80% de inhibicion no fue alcanzado, la concentracion mas baja de los oligonucleotidos de control positivo que resultaron en un 60% de inhibicion del ARNm de c-H-ras, JNK2 o c-raf es utilizada entonces como la concentracion de examinacion de los oligonucleotidos en experimentos subsiguientes para aquella lmea celular. Si el 60% de inhibicion no fue alcanzado, aquella lmea celular espedfica es considerada como no apropiada para experimentos de transfeccion de oligonucleotidos. Las concentraciones de oligonucleotidos antisentido aqrn utilizadas son de 50 nM a 300 nM.
Ejemplo 10
Analisis de inhibicion de oligonucleotidos de la expresion del receptor de la hormona de crecimiento
La modulacion antisentido de la expresion del receptor de la hormona de crecimiento puede ser probada en una variedad de formas conocidas en la tecnica. Por ejemplo, los niveles del ARNm del receptor de la hormona de crecimiento pueden cuantificarse por medio de, por ejemplo, un analisis de Northern blots, reacciones en cadena de polimerasa competitivas (PCR - polymerase chain reaction), o PCR en tiempo real (RT-PCR - real-time PCR). El PCR cuantitativo en tiempo real es preferido actualmente. El analisis de ARN puede realizarse en ARN o poly(A)+ mRNA celular total. El metodo preferido de analisis de ARN es el uso de ARN celular total tal como se describio en otros ejemplos en este documento. Metodos para el aislamiento de ARN son bien conocidos en la tecnica. Los analisis de Northern blots tambien son rutinarios en la tecnica. (PCR) cuantitativo en tiempo real puede lograrse convenientemente utilizando los sistemas de deteccion secuencial ABI PRISM™ 7600, 7700, o 7900 los cuales son comercialmente disponibles, de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y utilizadas de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Los niveles protemicos del receptor de la hormona de crecimiento pueden cuantificarse en una variedad de
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formas bien conocidas en la tecnica, tales como inmunoprecipitacion, analisis de western blots (inmuno-manchado), ensayo por inmunoadsorcion vinculado a enzimas (ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay), organizacion celular activada por fluorescencia (FACS - fluorescence-activated cell sorting). Los anticuerpos dirigidos al receptor de la hormona de crecimiento pueden ser identificados y obtenidos de una variedad de fuentes, tales como el catalogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden ser preparados por medio de metodos de generacion de anticuerpos monoclonales o policlonales los cuales son bien conocidos en la tecnica.
La reduccion en la expresion del receptor de la hormona de crecimiento tambien puede medirse indirectamente al medir las reducciones del factor de crecimiento similar a la insulina-I en el suero y otros fluidos, tejidos u organos corporales.
Ejemplo 11
Diseno de ensayos fenotipicos y estudios in vivo para el uso de inhibidores del receptor de la hormona de crecimiento
Ensayos fenotipicos
Una vez que los inhibidores del receptor de la hormona de crecimiento han sido identificados por los metodos aqrn descritos, los compuestos son investigados aun mas en uno o mas ensayos fenotipicos, teniendo cada uno puntos finales medibles los cuales son pronosticables en cuanto a su eficacia en el tratamiento de un estado o condicion de enfermedad en particular. Los ensayos fenotipicos, los botiquines y los reactivos para su uso son bien conocidos para aquellas personas con conocimiento en la tecnica y son utilizados en este documento para investigar el rol y/o la asociacion con el receptor de la hormona de crecimiento en salud y enfermedad. Los ensayos fenotipicos representativos, los cuales pueden ser comprados de cualquiera de varios proveedores comerciales, incluyendo aquellos para determinar la viabilidad celular, la cito toxicidad, la proliferacion celular o la supervivencia celular (Molecular Probes, Eugene, OR; PerkinElmer, Boston, MA), los ensayos que se basan en protemas incluyendo ensayos enzimaticos (Panvera, LLC, Madison, WI; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ; Oncogene Research Products, San Diego, CA), la regulacion celular, la transduccion de senalizacion, la inflamacion, los procesos oxidantes y la apoptosis (Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI), la acumulacion de trigliceridos (SigmaAldrich, St. Louis, MO), los ensayos de angiogenesis, los ensayos de formacion de cubos, los ensayos de citoquinas y hormonas y los ensayos metabolicos (Chemicon International Inc., Temecula, CA; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
En un ejemplo no limitante, celulas que se determinaron ser apropiadas para un ensayo fenotipico en particular (es decir, celulas MCF-7 seleccionadas para estudios del cancer de la mama; adipocitos para estudios de la obesidad) son tratadas con inhibidores del receptor de la hormona de crecimiento identificadas a partir de los estudios in vitro, asf como compuestos de control a concentraciones optimas los cuales se determinaron mediante los metodos descritos anteriormente. Al final del periodo de tratamiento, las celulas tratadas y no tratadas son analizadas por uno o mas metodos espedficos para el ensayo para determinar los resultados y los puntos finales fenotipicos.
Los puntos finales fenotipicos incluyen cambios en la morfologfa celular a lo largo del tiempo o la dosis de tratamiento, asf como cambios en los niveles de los componentes celulares tales como las protemas, los tipidos, los acidos nucleicos, las hormonas, los sacaridos o los metales. Mediciones del estado celular que incluye el pH, la etapa del ciclo celular, la ingestion o la excrecion de indicadores biologicos por la celula, tambien son puntos finales de interes.
Analisis del genotipo de la celula (medicion de la expresion de uno o mas genes de la celula) despues del tratamiento tambien se utilizan como un indicador de la eficacia o la potencia de los inhibidores del receptor de la hormona de crecimiento. Genes representativos, o aquellos genes que se sospecha que estan asociados con un estado, condicion o fenotipo de enfermedad espedfica, son medidos en celulas tratadas y no tratadas.
Estudios in vivo
Los sujetos individuales de los estudios in vivo aqrn descritos son animales vertebrados de sangre caliente, que incluyen a humanos.
El ensayo clmico es sujeto a controles rigurosos para asegurar que los individuos no esten corriendo riesgos innecesariamente y que estan completamente informados acerca de su rol en el estudio. Para contabilizar los efectos psicologicos de la recepcion de tratamientos, los voluntarios son administrados aleatoriamente placebos o inhibidores del receptor de la hormona de crecimiento. Ademas, para prevenir que los doctores se parcialicen en relacion a los tratamientos, ellos no estan informados acerca de si el medicamento que estan administrando es un inhibidor del receptor de la hormona de crecimiento o un placebo. Utilizando este metodo aleatorio, cada voluntario tiene la misma oportunidad de recibir al nuevo tratamiento o al placebo.
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Los voluntarios reciben al inhibidor del receptor de la hormona de crecimiento o al placebo durante un penodo de 8 semanas con parametros biologicos asociados con el estado o condicion de la enfermedad indicada que se va midiendo al inicio (las mediciones de lmea base antes de cualquier tratamiento), al final (despues del final del tratamiento), y a intervalos regulares durante el penodo de estudio. Aquellas mediciones incluyen los niveles de las moleculas de acido nucleico que codifican al receptor de la hormona de crecimiento o a los niveles protemicos del receptor de la hormona de crecimiento en fluidos, tejidos u organos corporales en comparacion con los niveles pre-tratamiento. Otras medidas incluyen, pero no se limitan a, indices del estado o condicion de la enfermedad que se esta tratando, la masa corporal, la presion sangumea, tttulos sericos de indicadores farmacologicos de la enfermedad o de la toxicidad, asf como medidas ADME (absorcion, distribucion, metabolismo y excrecion).
La informacion registrada para cada paciente incluye la edad (anos), el genero, la altura (centfmetros), el historial familiar del estado o condicion de la enfermedad (sf/no), clasificacion de la motivacion (algo/moderada / bastante) y el numero y tipo de regfmenes previos de tratamiento para la enfermedad o condicion indicada.
Voluntarios que participaron en este estudio son adultos saludables (edades entre 18 y 65 anos de edad) y aproximadamente un numero igual de hombres y mujeres participaron en el estudio. Voluntarios con ciertas caractensticas fueron distribuidos igualmente para el tratamiento con placebo y con el inhibidor del receptor de la hormona de crecimiento. En general, los voluntarios tratados con placebo tuvieron una respuesta pequena o ninguna respuesta al tratamiento, mientras que los voluntarios tratados con el inhibidor del receptor de la hormona de crecimiento mostraron tendencias positivas en su mdice de estado o condicion de la enfermedad cuando finalizo el estudio.
Ejemplo 12
Aislamiento de ARN
Aislamiento de Poly(A) + mARN
El Poly(A)+ mRNA fue aislado de acuerdo a Miura et al., (Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764). Otros metodos para el aislamiento de poly(A)+ ARNm son rutinarios en la tecnica. Brevemente, para las celulas cultivadas en placas de 96 pozos, el medio de crecimiento fue removido de las celulas y cada pozo se lavo con 200 pl de PBS fno. Se agregaron 60 pl de amortiguador de lisis (10 mM de Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM de EDTA, 0.5 M de NaCl, 0.5% de NP-40, 20 mM de un complejo vanadilo-ribonucleosido) fue agregado a cada pozo, la placa fue agitada suavemente y luego incubada a la temperatura del cuarto durante 5 minutos. 55 pl del lisado fueron transferidos a placas de 96 pozos (AGCT Inc., Irvine CA) cubiertas con Oligo d(T). Las placas fueron incubadas durante 60 minutos a la temperatura del cuarto, lavadas 3 veces con 200 pl de amortiguador de lavado (10 mM de Tris-HCl pH 7.6, 1 mM de EDTA, 0.3 M de NaCl). Despues del lavado final, la placa fue manchada en toallas de papel para remover el exceso de amortiguador de lavado y luego secada con aire durante 5 minutos. Se agregaron 60 pl de amortiguador de elucion (5 mM de Tris-HCl pH 7.6), recalentados a 70 °C en cada pozo, la placa fue incubada en una placa caliente a 90 °C durante 5 minutos, y el elrndo fue transferido entonces a una placa fresca de 96 pozos.
Las celulas cultivadas en placas de 100 mm o de otro estandar pueden ser tratada similarmente, utilizando volumenes apropiados de todas las soluciones.
Aislamiento total de ARN
El ARN total fue aislado utilizando un botiqurn RNEASY 96™ y amortiguadores comprados de Qiagen Inc. (Valencia, CA) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. Brevemente, para las celulas cultivadas en placas de 96 pozos, el medio de crecimiento fue removido de las celulas y cada pozo fue lavado con 200 pl de PBS fno. Se agregaron 150 pl de amortiguador RTL a cada pozo y la placa fue agitada vigorosamente durante 20 segundos. 150 pl de un 70% de etanol se agrego entonces a cada pozo y los contenidos fueron mezclados por medio de pipetas 3 veces de arriba a abajo. Las muestras fueron transferidas entonces a la placa de pozos RNEASY 96™ la cual estaba adjunta a colector QIAVAC™ calzado con una bandeja de recoleccion de desperdicios y adjunto a una fuente de succion. El vacio fue aplicada durante un minuto. 500 pl del amortiguador RW1 fueron agregados a cada pozo de la placa RNEASY 96™ e incubados durante 15 minutos y el vacfo fue aplicado nuevamente durante un minuto. Se agregaron 500 pl adicionales del amortiguador RW1 a cada pozo de la placa RNEASY 96™ y la succion fue aplicada durante 2 minutos. Se agrego un micro litro de amortiguador RPE a cada pozo de la placa RNEASY 96™ y la succion fue aplicada durante un penodo de 90 segundos. El lavado del amortiguador RPE fue repetido entonces y la succion fue aplicada durante unos 3 minutos adicionales. La placa fue removida entonces del colector QIAVAC™ y secada en toallas de papel. La placa fue adherida nuevamente entonces al colector QIAVAC™ calzado con una estantena de tubos de recoleccion que contema tubos de recoleccion de una. 2 ml. El ARN fue diluido entonces con pipetas colocando 140 pl de Ribo nucleasas libres de agua en cada pozo, incubandose durante un minuto, y luego aplicando el vacfo durante 3 minutos.
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El uso repetitivo de pipetas y de los pasos de elucion pueden ser automatizados utilizando el QIAGEN BioRobot 9604 (Qiagen, Inc., Valencia CA). Esencialmente, despues de lisar a las celulas en la placa del cultivo, la placa es transferida a la cubierta del robot donde el uso de pipetas, los pasos de tratamiento y de elucion de la deoxirribonucleasa son ejecutados.
Ejemplo 13
Analisis PCR Cuantitativo en Tiempo Real del Receptor de los Niveles de ARNm de la Hormona de Crecimiento
La cuantificacion de los niveles del ARNm del receptor de la hormona de crecimiento se logro por medio de PCR cuantitativo en tiempo real utilizando el sistema de deteccion secuencial ABI PRISM™ 7600, 7700, o 7900 (PE- Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Este es un sistema de deteccion de fluorescencia de tubo cerrado, que no se basa en gel, que permite cuantificaciones de alto caudal de productos de reaccion es en cadena de polimerasa (PCR - polymerase chain reaction) en tiempo real. Al contrario que en el caso del PCR estandar en el cual los productos de amplificacion son cuantificados despues de que el PCR ha sido completado, los productos en el PCR cuantitativo en tiempo real son cuantificados mientras se van acumulando. Esto se logra al incluir en la reaccion de PCR una sonda de oligonucleotidos que recoce espedficamente entre los cebadores PCR hacia adelante y en reversa, y contiene 2 coloraciones fluorescentes. Un colorante reportador (por ejemplo, FAM o JOE, obtenidos de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA o Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA) es adherida al extremo 5' de la sonda y una coloracion neutralizadora (por ejemplo, TAMRA, obtenida de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA o Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA) es adherida al extremo 3' de la sonda. Cuando la sonda y las coloraciones estan intactas, la emision de la coloracion reportadora es neutralizada por la proximidad de la coloracion de neutralizacion en el 3'. Durante la amplificacion, el recocido de la sonda a la secuencia objetivo crea un sustrato que puede ser dividido por la actividad exonucleasa de 5' de la polimerasa Taq. Durante la fase de extension del ciclo de amplificacion del PCR, la division de la sonda por la polimerasa Taq libera a la coloracion reportadora del resto de la sonda (y por lo tanto de la partfcula neutralizadora) y una senal fluorescente de secuencia espedfica es generada. Con cada ciclo, moleculas adicionales de la coloracion reportadora son divididas de sus sondas respectivas, y la intensidad de fluorescencia es monitoreada en intervalos regulares por medio de optica laser integrada en el sistema de deteccion secuencial de ABI PRISM™. En cada ensayo, una serie de reacciones paralelas que contienen diluciones en serie del ARNm de muestras de control no tratadas genera una curva estandar que es utilizada para cuantificar la inhibicion porcentual despues del tratamiento de oligonucleotidos antisentido de las muestras de prueba.
Antes del analisis cuantitativo de PCR, conjuntos cebadores - sondas espedficos al gen objetivo que se esta midiendo son evaluados para detectar su capacidad para ser “multiplexados” con una reaccion de amplificacion GAPDH. En el multiplexamiento, el gen objetivo y el gen estandar interno de GAPDH son amplificados concurrentemente en una sola muestra. En este analisis, el ARNm aislado de las celulas no tratadas es diluido en serie. Cada dilucion es amplificada en la presencia de los conjuntos de cebadores - sondas espedficos, unicamente para GAPDH, unicamente para el gen objetivo (“un solo-plex”), o para ambos (multiplex). Despues de la amplificacion de PCR, curvas estandar de las senales ARNm GAPDH y objetivo en funcion de la dilucion son generadas de muestras de un solo plex y de varios plex. Si la inclinacion y el coeficiente de correlacion de la GAPDH y las senales objetivo generadas de las muestras multiplexadas caen dentro del 10% de sus valores correspondientes generados de las muestras de un solo plexamiento, el conjunto de cebadores - sondas espedfico para el objetivo se estima que tiene la capacidad de ser multiplexado. Otros metodos de PCR tambien son conocidos en la tecnica.
Los reactivos PCR fueron obtenidos de Invitrogen Corporation, (Carlsbad, CA). Las reacciones RT-PCR fueron ejecutadas al agregar 20 pl de un coctel PCR (2.5x de amortiguador PCR menos MgCl2, 6.6 mM de MgCl2, 375 mM de cada uno de dATP, dCTP, dCTP y dGTP, 375 nM de cada uno de cebador hacia adelante y cebador en reversa, 125 nM de la sonda, 4 unidades del inhibidor de ribonucleasa, 1.25 unidades de PLATINUM® Taq, 5 unidades de la transcriptasa en reversa de MuLV, y 2.5x de la coloracion ROX) a placas de 96 pozos que conteman 30 pl de una solucion de ARN total (20-200 ng). La reaccion RT fue ejecutada por medio de incubacion durante 30 minutos a 48 °C. Despues de una incubacion durante 10 minutos a 95 °C para activar al PLATINUM® Taq, se ejecutaron 40 ciclos de 2 pasos de protocolo de PCR: 95 °C durante 15 segundos (desnaturalizacion) seguido por 60 °C durante 1.5 minutos (recocido/extension).
Las cantidades obtenidas del objetivo genetico por el RT-PCR en tiempo real son analizadas utilizando el nivel de expresion de GAPDH, un gen cuya expresion es constante, o al cuantificar al ARN total utilizando RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). La expresion GAPDH es cuantificada por medio de RT-PCR en tiempo real, o al ejecutarse simultaneamente con el objetivo, por medio de multiplexado, o por separado. El ARN total es cuantificado utilizando el reactivo de cuantificacion de ARN RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). Los metodos de cuantificacion de ARN de RiboGreen™ son ensenados en Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry (Bioqmmica Analftica)., 1998, 265, 368-374).
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En este ensayo, 170 |jl del reactivo de trabajo RiboGreen™ (reactivo RiboGreen™ diluido a 1:350 en 10mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 7.5) colocado con pipetas en una placa de 96 pozos que contienen 30 jl de ARN celular purificado. La placa es lefda en un CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems) con una excitacion de 485 nm y una emision de 530 nm.
Las ondas y cebadores para el receptor de la hormona de crecimiento humana fueron disenadas para hibridarse a una secuencia de receptor de hormona de crecimiento humana, utilizando informacion secuencial publicada (acceso del GenBank (Banco Genetico) numero NM_000163.1, incorporado en este documento como la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 4). Para el receptor de la hormona de crecimiento humana los cebadores de PCR fueron:
cebador hacia adelante: GATGTCCCAATGTGACATGCA (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 5) cebador en reversa: AAGTAGGCATTGTCCATAAGGAAGTT (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 6) y la sonda PCR fue: FAM-CCGGAAATGGTCTCACTCTGCCAAGA-TAMRA (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 7), donde FAM es el colorador fluorescente y TAMRA es el colorador neutralizador. Para la GAPDH humana los cebadores PCR fueron:
cebador hacia adelante: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 8) cebador en reversa: GAAGATGGTGATGGGATTTC (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 9) y la sonda PCR fue: 5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC- TAMRA 3' (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 10) donde JOE es el colorante fluorescente reportador y TAMRA es el colorante neutralizador.
Las ondas y cebadores para el receptor de la hormona de crecimiento de raton fueron designadas para hibridarse a una secuencia del receptor de la hormona de crecimiento de raton, utilizando informacion secuencial publicada (acceso del GenBank (Banco Genetico) numero NM_010284.1, incorporado en este documento como la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 11). Para el receptor de la hormona de crecimiento los cebadores de PCR fueron:
cebador hacia adelante: TTGACGAAATAGTGCAACCTGATC (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 12) cebador en reversa: CGAATCCCGGTCAAACTAATG (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 13) y la sonda PCR fue: FAM-CATTGGCCTCAACTGGACTTTACTAA-TAMRA (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 14) donde FAM es el colorante reportador fluorescente y TAMRA es el colorante neutralizador. Para la GAPDH de raton los cebadores PCR fueron:
cebador hacia delante: GGCAAATTCAACGGCACAGT (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 15) cebador en reversa: GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 16) y la sonda PCR fue: 5' JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC- TAMRA 3' (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 17) donde JOE es el colorante reportador fluorescente y TAMRA es el colorante neutralizador.
Ejemplo 14
Analisis de Northern blot de los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento
18 horas despues del tratamiento antisentido, las monocapas celulares fueron lavadas 2 veces con PBS fno y se lisaron en 1 ml de RNAZOL™ (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX). El ARN total fue preparado siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. 20 jg de ARN total fueron fraccionados por medio de electroforesis a traves de 1.2 por ciento de geles de agarosa que conteman 1.1 por ciento de formaldelddo utilizando un sistema amortiguador de MOPS (AMRESCO, Inc. Solon, OH). El ARN fue transferido desde el gel a membranas nylon HYBOND™-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) por medio de una transferencia capilar durante la noche utilizando el sistema de amortiguacion de transferencia Northern/Southern (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX). La transferencia de ARN fue confirmada por medio de visualizacion ultravioleta. Las membranas fueron fijadas por medio de vinculaciones transversales ultravioleta utilizando un STRATALINKER™ UV Crosslinker 2400 (Stratagene, Inc, La Jolla, CA) y luego se sondearon utilizando la solucion de hibridacion QUICKHYB™ (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando las recomendaciones del fabricante para condiciones exigentes.
Para detectar el receptor de la hormona de crecimiento humana, una sonda espedfica para el receptor de la hormona de crecimiento humana fue preparada por medio de PCR utilizando el cebador hacia adelante GATGTCCCAATGTGACATGCA (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 5) y el cebador en reversa AAGTAGGCATTGTCCATAAGGAAGTT (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 6). Para normalizar las variaciones de eficiencia de carga y transferencia, las membranas fueron extirpadas y sondeadas para detectar ARN de deshidrogenasa de gliceraldetndo-3-fosfato (GAPDH) (Clontech, Palo Alto, CA).
Para detectar el receptor de la hormona de crecimiento de raton, se preparo una sonda espedfica del
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receptor de la hormona de crecimiento de raton por medio de PCR utilizando el cebador hacia adelante TTGACGAAATAGTGCAACCTGATC (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 12) y el cebador en reversa CGAATCCCGGTCAAACTAATG (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 13) para normalizar las variaciones de eficiencia de carga y de transferencia, las membranas fueron extirpadas y sondeadas para detectar el ARN de deshidrogenasa de gliceraldehndo-3-fosfato de raton (GAPDH) (Clontech, Palo Alto, CA).
Membranas hibridadas fueron visualizadas y cuantificadas utilizando los softwares PHOSPHORIMAGER™ y IMAGEQUANT™ V3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). La informacion fue normalizada a niveles de GAPDH en controles sin tratamiento.
Ejemplo 15
Inhibicion antisentido de la expresion del receptor de la hormona de crecimiento humana por medio de oligonucleotidos quimericos de fosforotioato que tienen alas 2'-MOE y un vacio deoxi
Una serie de compuestos antisentido fueron disenados para usar como objetivo a diferentes regiones del ARN de receptor de la hormona de crecimiento humana, utilizando secuelas publicadas (acceso del GenBank (Banco Genetico) numero NM_000163.1, incorporado en este documento como la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 4, y el complemento de las posiciones 468085 a 502183 de la secuencia con el acceso del GenBank numero NT_006702.8, incorporado en este documento como la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 18). Los compuestos son mostrados en la tabla 1. El “lugar objetivo” indica el primer numero de nucleotidos (5’-mayona) en la secuencia objetivo particular a la cual se enlaza el compuesto. Todos los compuestos en la tabla 1 son oligonucleotidos quimericos (“gapmers”), con 20 nucleotidos de largo, compuestos de una region “vada” central que consiste de 10 2’-deoxinucleotidos, que son rodeados por ambos lados (en las direcciones 5’ y 3’) por “alas” de 5- nucleotidos. Las alas son compuestas de nucleotidos 2’-metoxietilo (2’-MOE). Los enlaces internucleosfdicos (estructurales) son tipo fosforotioato (P = S) a lo largo de los oligonucleotidos. Todos los residuos de citidina son 5- metilcitidinas. Los compuestos fueron analizados por su efecto en los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento humana por medio de PCR cuantitativo en tiempo real tal como se describio en otros ejemplos en este documento. Los datos son promedios de 3 experimentos en los cuales las celulas MCF7 fueron tratadas con los oligonucleotidos antisentido. El control positivo para cada dato es identificado en la tabla por el numero de identificacion secuencial. Si estuviese presente, “N.D.” indica “sin datos” (“no data”).
Tabla 1
Inhibicion de los niveles de ARNm de receptor de la hormona de crecimiento humana por oligonucleotidos quimericos de fosforotioato que tienen alas 2'-MOE y un vacio de deoxi
Isis #
Region Identificacion secuencial objetivo numero Lugar objetivo Secuencia % inhib Identificacio n secuencial numero Identificacion secuencial de control numero
227452
Codificacion 4 332 tcagggcattctttccattc 79 19 1
227453
Codificacion 4 337 cataatcagggcattctttc 52 20 1
227464
Codificacion 4 947 cctttaatctttggaactgg 58 21 1
227468
Codificacion 4 1079 tcatcaatatctagctcaat 62 22 1
227465
Codificacion 4 1124 cttagaagtctgtctgtgtc 63 23 1
227475
Codificacion 4 1514 cctgctggtgtaatgtcgct 68 24 1
227480
Codificacion 4 1724 atgtaaatgtcctcttggtt 66 25 1
227481
Codificacion 4 1729 tggtgatgtaaatgtcctct 45 26 1
227402
Codificacion 4 1734 ttctgtggtgatgtaaatgt 53 27 1
227483
Codificacion 4 1733 aggctttctgtggtgatgta 75 28 1
227484
Codificacion 4 1744 tggtaaggctttctgtggtg 63 29 1
227488
Codificacion 4 1922 agttggtctgtgctcacata 86 30 1
227489
Codificacion 4 1927 tgttcagttggtctgtgctc 75 31 1
227490
Codificacion 4 1936 gcatgattttgttcagttgg 67 32 1
227499
3’UTR 4 2656 tataaaagggctttgtaaaa 14 33 1
227500
3’UTR 4 4043 catagcagcaaagtagcaga 69 34 1
227501
3’UTR 4 4183 gctatttttggctatagaaa 64 35 1
227502
3’UTR 4 4197 gattgaggtatttagctatt 56 36 1
272302
Codon inicial 4 31 gatccatacctgtaggacct 60 37 1
272303
Codon inicial 4 36 ccagagatccatacctgtag 55 38 1
272304
Codificacion 4 115 tgctaaggatagctgctgtg 48 39 1
272305
Codificacion 4 160 ttgtctttaggcctggatta 68 40 1
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Inhibicion de los niveles de ARNm de receptor de la hormona de crecimiento humana por oligonucleotidos quimericos de fosforotioato que tienen alas 2'-MOE y un vacio de deoxi
Isis #
Region Identificacion secuencial objetivo numero Lugar objetivo Secuencia % inhib Identificacio n secuencial numero Identificacion secuencial de control numero
272306
Codificacion 4 170 ttagaagaatttgtctttag 13 41 1
272307
Codificacion 4 185 gtgaatttaggctccttaga 55 42 1
272308
Codificacion 4 274 gctgtatgggtcctaggttc 57 43 1
272309
Codificacion 4 362 taacagctgttttccccagc 85 44 1
272310
Codificacion 4 439 tttcatccactgtaccacca 76 45 1
272311
Codificacion 4 468 ttgcactatttcatcaacag 47 46 1
272312
Codificacion 4 480 gggtggatctggttgcacta 57 47 1
272313
Codificacion 4 564 attgcgtggtgcttcccatc 77 48 1
272314
Codificacion 4 652 tagggtccatcattttccat 56 49 1
272315
Codificacion 4 684 caatgagtacactggaactg 53 50 1
272316
Codificacion 4 752 aactcgccataatttccaga 64 51 1
272317
Codificacion 4 857 agcccaaatattccaaagat 65 52 1
272318
Codificacion 4 913 tcagcattttaatcctttgc 55 53 1
272319
Codificacion 4 979 attttccttccttgaggaga 67 54 1
272320
Codificacion 4 1000 agattgtgttcacctcctct 70 55 1
272321
Codificacion 4 1053 aacccaagagtcatcactgt 64 56 1
272322
Codificacion 4 1084 ctggctcatcaatatctagc 84 57 1
272323
Codificacion 4 1110 tgtgtctgattcctcagtct 67 58 1
272324
Codificacion 4 1236 tatgtcattggcattgaaat 53 59 1
272325
Codificacion 4 1302 aaggcataagagatctgctt 66 60 1
272326
Codificacion 4 1420 actcagctccttcagtagga 77 61 1
272327
Codificacion 4 1560 ggacatccctgccttattct 60 62 1
272328
Codificacion 4 1623 ggcattgtccataaggaagt 85 63 1
272329
Codificacion 4 1651 actttttggcatctgcctca 63 64 1
272330
Codificacion 4 1656 gatgcactttttggcatctg 47 65 1
272331
Codificacion 4 1861 cagtcgcattgagtatgagg 67 66 1
272332
Codificacion 4 1884 ctctttgtcaggcaagggca 75 67 1
272333
Codificacion 4 1913 gtgctcacatagccacatga 72 68 1
272334
Codon de parada 4 1949 aagaaaggctaaggcatgat 61 69 1
272335
3'UTR 4 1973 aaatacgtagctcttgggaa 47 70 1
272336
3'UTR 4 2196 caatcactgctactaaacag 69 71 1
272337
3'UTR 4 2249 aaacatagccattcaatgct 39 72 1
272338
3'UTR 4 2337 gtgctatggtttgcattcaa 78 73 1
272339
3'UTR 4 2454 gttttacatatccaaactat 72 74 1
272340
3'UTR 4 2853 catcaaccaagatttggtga 69 75 1
272341
3'UTR 4 2988 gaggctatagatcttatctc 65 76 1
272342
3'UTR 4 3271 tagtgagaaagaaagtttct 45 77 1
272343
3'UTR 4 3765 aatgctctcaagaatgatgt 48 78 1
272344
3'UTR 4 3980 acactcaattctagcttttc 60 79 1
272345
3'UTR 4 4011 catctattacaaataacatg 24 80 1
272346
3'UTR 4 4057 ctcttggagaaaaccatagc 67 81 1
272347
3'UTR 4 4097 tctacactgatgatacttta 62 82 1
272348
3'UTR 4 4120 cacagctttgaattgaatta 57 83 1
272349
3'UTR 4 4133 agtcttccaaacacacagct 68 84 1
272350
3'UTR 4 4156 aggctgttgtgaaatagtaa 67 85 1
272351
3'UTR 4 4170 atagaaatgttgtcaggctg 57 86 1
272352
3'UTR 4 4218 ccaaaatgacattctgagac 77 87 1
272353
3'UTR 4 4245 ataatggcttatgtggccac 72 86 1
272354
Intron 18 2571 agttatgtaaccctgattga 65 89 1
272355
Union intron: exon 18 6416 ttgagtgttgttcctaaaatgaa 24 90 1
272356
Intron 18 8405 atggaggctggaggttcaaa 63 91 1
272357
Union 18 22712 tagggtccatctttcaagac 62 92 1
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45
50
55
60
65
Inhibicion de los niveles de ARNm de receptor de la hormona de crecimiento humana por oligonucleotidos quimericos de fosforotioato que tienen alas 2'-MOE y un vado de deoxi
Isis #
Region Identificacion secuencial objetivo numero Lugar objetivo Secuencia % inhib Identificacio n secuencial numero Identificacion secuencial de control numero
272358
Intron 18 25543 tctccagatagaatctaaac 53 93 1
272359
Intron 18 29755 tccaaatattctggtacttt 72 94 1
272360
Union intron: exon 18 29935 tattagttaccttgaggaga 0 95 1
272361
Union intron: exon 18 30267 attttccttcctagaaaata 10 96 1
Tal como se muestra en la tabla 1, las IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NUMEROS 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,
56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,70, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,
89, 91, 92, 93 y 94 demostraron por lo menos un 45% de inhibicion de la expresion del receptor de la hormona de
crecimiento humana en este ensayo y son, por lo tanto, preferidas. Mas preferidas son las IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NUMEROS 30, 44 y 57.
ISIS 272322 (la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 57) es dirigida al exon 10, una region que aparece en todas las transcripciones del receptor de la hormona de crecimiento. Los compuestos dirigidos al exon 10 son, por lo tanto, secciones preferidas para su uso en el invento. Se reporto que el exon 3 era alternamente empalmado en la transcripcion o transcripciones humanas. Esta tambien podna ser una region objetiva preferida.
Las regiones objetivo a las cuales las secuencias antisentido preferidas de la tabla 2 complementan, son denominadas en este documento como “segmentos objetivo preferidos” y son, por lo tanto, objetivos preferidos de la direccion de los compuestos para su uso en este invento. Estos segmentos objetivo preferidos son mostrados en la tabla 3. Los segmentos representan el complemento en reversa de los compuestos antisentido preferidos que se muestra en la tabla 1. El “lugar objetivo” indica el primer numero de nucleotido (5’-mayona) en el acido nucleico objetivo espedfico al cual se enlaza el oligonucleotido. Tambien se muestra en la tabla 3 las especies en las cuales cada uno de los segmentos objetivo preferidos fueron encontrados.
Ejemplo 16
Inhibicion antisentido de la expresion del receptor de la hormona de crecimiento del raton por medio de oligonucleotidos quimericos de fosforotioato que tienen alas 2'-MOE y un vado de deoxi
Una 2a serie de compuestos antisentido fue disenada para usar como objetivo a regiones diferentes del ARN del receptor de la hormona de crecimiento del raton, utilizando secuencias publicadas (acceso del GenBank (Banco Genetico) numero NM_010284.1, incorporada en este documento como la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 11, una variante del acceso del GenBank (Banco Genetico) numero AF120480.2 con un lugar de empalme alterno al exon 1B: exon 2, incorporada en este documento como la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 97, una variante del acceso del GenBank (Banco Genetico) numero AF120480.2 con un lugar alterno de empalme al exon IC:exon 2, incorporada en este documento como la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 98, una variante del acceso del GenBank (Banco Genetico) numero AF120480.2 con un lugar alterno de empalme al exon 1D:exon 2, incorporado en este documento como la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 99, y una secuencia derivada de los accesos del GenBank (Banco Genetico) numeros AF120480.2 y AC073753.1, representando una secuencia genomica, incorporada en este documento como la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 100). Los compuestos se muestran en la tabla 2. El “lugar objetivo” indica el primer numero de nucleotido (5’-mayona) en el acido nucleico objetivo espedfico al cual se enlaza el compuesto. Todos los compuestos en la tabla 2 son oligonucleotidos quimericos (“gapmers”) de 20 nucleotidos de longitud, compuestos de una region “vada” central que consiste de 10 2’-deoxinucleotidos, que son rodeados en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3’) por “alas” de 5-nucleotidos. Las alas son compuestas de nucleotidos 2’-metoxietilo (2’-MOE). Los enlaces internucleosfdicos (estructurales) son fosforotioatos (P = S) a lo largo del oligonucleotido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos fueron analizados para detecta dar su efecto en los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento del raton por medio de PCR cuantitativo en tiempo real tal como se describio en otros ejemplos de este documento. Los datos son los promedios de 3 experimentos en los cuales las celulas b.END fueron tratadas con oligonucleotidos antisentido. El control positivo para cada dato es identificado en la tabla por el numero de identificacion secuencial. Si estuviese presente, “N.D.” indica “sin datos” (“no data”).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tabla 2
Inhibicion de los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento de raton por oligonucleotidos quimericos de fosforotioato que tienen alas 2'-MOE y un vacio de deoxi
Isis #
Region Identificacion secuencial objetivo numero Lugar objetivo Secuencia % inhib Identificacion secuencial numero Identificacion secuencial de control numero
227443
5 'UTR 11 5 tqcttqqcaqctcqtqqqtt 0 101 1
227444
5 'UTR 11 16 atqqctqcqcctqcttqqca 53 102 1
227445
Codon inicial 11 221 tacctqaqacctcqqaqttt 69 103 1
227446
Codon inicial 11 232 acaaaqatccatacctqaqa 87 104 1
227447
Codificacion 11 300 qctqqtqtaqcctcacttcc 77 105 1
227440
Codificacion 11 313 tttqccaaqaqtaqctqqtq 60 106 1
227449
Codificacion 11 391 acqacacttqqtqaatcqaq 69 107 1
227450
Codificacion 11 495 tqqctttcccttttaqcata 71 108 1
227451
Codificacion 11 520 atqaqcaabtcttqcaqctt 49 109 1
227454
Codificacion 11 590 aqttqaaqtaacaqctqttt 69 110 1
227455
Codificacion 11 620 aqtaqqqtatccaaatqqaq 43 111 1
227456
Codificacion 11 717 qtccaqttqaqqccaatqqq 97 112 1
227457
Codificacion 11 812 qaattatccatcccttcaqa 67 113 1
227458
Codificacion 11 832 qtactqaatttcatactcca 75 114 1
227459
Codificacion 11 975 ctqaactcqctqtacttttc 60 115 1
227460
Codificacion 11 1041 aactqqatatcttcttcaca 43 116 1
227461
Codificacion 11 1084 tqctactccaaatattcaca 75 117 1
227462
Codificacion 11 1115 qctttqaaaatataactaca 31 118 1
227463
Codificacion 11 1137 atcaqcatcttaatcctttq 39 119 1
227465
Codificacion 11 1190 tqaqaaqatctqqatcaatc 51 120 1
227466
Codificacion 11 1245 ttqtaqttatcatqaatqcc 50 121 1
227467
Codificacion 11 1265 catcattqtaqaaqtcqqqt 33 122 1
227470
Codificacion 11 1388 ctccaaqqataccaqctqat 82 123 1
227471
Codificacion 11 1530 aqqcacaaqaqatcaqcttc 52 124 1
227472
Codificacion 11 1579 aqaqccaaqqqaaqcatcat 42 125 1
227473
Codificacion 11 1710 aaqtcaatqtttqccaqtqa 71 126 1
227474
Codificacion 11 1730 tqtcqcttacttqqqcataa 68 127 1
227476
Codificacion 11 1837 qtaattttcttqqcaqqqcq 41 128 1
227477
Codificacion 11 1850 cactqttcatqctqtaattt 61 129 1
227478
Codificacion 11 1878 tttttqqcatctqactcaca 68 130 1
227479
Codificacion 11 1947 atqtcctcttqqttaaaqct 59 131 1
227485
Codificacion 11 2044 cqtqqtqtaqtctqqqacaq 45 132 1
227486
Codificacion 11 2054 cqqtqtqaaccqtqqtqtaq 39 133 1
227487
Codificacion 11 2106 tcaqqcaaaqqcaaaqcaqt 44 134 1
227491
Codon de parada 11 2182 taqqaaaqqctactqcatqa 65 135 1
227492
3'UTR 11 2239 taaaacataqttttqqttta 7 136 1
227493
3'UTR 11 2253 tcccaacacaqatttaaaac 51 137 1
227494
3'UTR 11 2517 caaaaqccacctqattqttt 56 138 1
227495
3'UTR 11 2527 tcctqaactqcaaaaqccac 47 139 1
227496
3'UTR 11 2537 qcattcaatttcctqaactq 51 140 1
227497
3'UTR 11 2637 taaatqttttqcatatccaa 77 141 1
227498
3'UTR 11 197 ttqtaaaaatctaacttqtt 49 142 1
227503
Union exon: exon 97 197 tacctqaqaccccaqttcat 24 143 1
227504
Union exon: exon 98 23 tacctqaqaccccqcqcaqc 34 144 1
227505
Union exon: exon 99 61 tacctqaqacccacaaqcqq 39 145 1
227506
Union exon: intron 100 4352 cctccaqtacctcqqaqttt 69 146 1
227507
Union intron: exon 100 4865 qtccttqctccaqqttaqca 89 147 1
227508
Union exon: intron 100 5071 ttccactcaccccaqttcat 51 148 1
227509
Union intron: exon 100 5153 qcaqttctatcaqaactttq 82 149 1
227510
Intron 100 5196 ctccaqacqtqacccqactc 64 150 1
227511
Union exon: intron 100 5264 ccacqcacccacaaqcqqat 71 151 1
227512
Intron 100 6350 taacctatqqtqactatqtc 36 152 1
227513
Union intron: exon 100 7123 tacctqaqacctqcaaqaca 40 153 1
227514
Intron 100 9753 atqctcacqtcaqctattqq 43 154 1
227515
Union exon: intron 100 13932 aaattcttacttqtccccaq 37 155 1
227516
Union intron: exon 100 17200 ttqqctttccctqqaqqttc 57 156 1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Inhibicion de los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento de raton por oligonucleotidos quimericos de fosforotioato que tienen alas 2'-MOE y un vacio de deoxi
227517
Union exon: intron 100 17224 cttcactaaccttgcagctt 63 157 1
227518
Union exon: intron 100 24259 cacggcttacctatttcgtc 6 158 1
227519
Union exon: intron 100 37843 tcacacctacctttgctgct 44 159 1
227520
Union intron: exon 100 40862 catcttaatccttggaaaca 42 160 1
Tal como se muestra en la tabla 2, las IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NUMEROS 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 117, 120, 121, 123, 124, 126, 127, 129, 130, 131, 135, 137, 138, 140, 141, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 156 y 157 demostraron por lo menos un 50% de inhibicion de la expresion del receptor de la hormona de crecimiento de raton en este experimento y son, por lo tanto, preferidas. Mas preferidas son las IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NUMEROS 104, 147 y 149.
ISIS 227446, 227507 y 227509 (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMEROS: 104, 147 y 149) fueron sujetas a estudios de respuesta de dosis. Todos los 3 compuestos demostraron buena respuesta a dosis con IC50s de aproximadamente 25 nM, 12.5 nM y 12.5 nM, respectivamente.
Las regiones objetivo a las cuales las secuencias antisentido preferidas de la tabla 2 son complementarias son referidas en este documento como los “segmentos objetivo preferidos” y son, por lo tanto, preferidas para servir de objetivo para los compuestos para su uso en este invento. Estos segmentos objetivo preferidos son mostrados en la tabla 3. Las secuencias presentan el complemento en reversa de los compuestos antisentido preferidos mostrados en la tabla 2. El “lugar objetivo” indica el primer numero de nucleotido (5’-mayona) en el acido nucleico objetivo espedfico al cual el oligonucleotido se enlaza. Tambien se muestra en la tabla 3 los espacios en los cuales cada uno de los segmentos objetivo preferidos fueron encontrados.
Tabla 3
Secuencia y posicion de los segmentos objetivo preferidos identificados en el rece
ptor de la hormona de crecimiento
Identificacion del lugar
Numero de identificacion secuencial objetivo Lugar objetivo Secuencia Rev comp de la identificacion secuencial Activo en Identificacion secuencial numero
144070
4 332 gaatggaaagaatgccctga 19 H. sapiens 161
144071
4 337 gaaagaatgccctgattatg 20 H. sapiens 162
144082
4 947 ccagttccaaagattaaagg 21 H. sapiens 163
144086
4 1079 attgagctagatattgatga 22 H. sapiens 164
144087
4 1124 gacacagacagacttctaag 23 H. sapiens 165
144093
4 1514 agcgacattacaccagcagg 24 H. sapiens 166
144098
4 1724 aaccaagaggacatttacat 25 H. sapiens 167
144099
4 1729 agaggacatttacatcacca 26 H. sapiens 168
144100
4 1734 acatttacatcaccacagaa 27 H. sapiens 169
144101
4 1739 tacatcaccacagaaagcct 28 H. sapiens 170
144102
4 1744 caccacagaaagccttacca 29 H. sapiens 171
144106
4 1922 tatgtgagcacagaccaact 30 H. sapiens 172
144107
4 1927 gagcacagaccaactgaaca 31 H. sapiens 173
144108
4 1936 ccaactgaacaaaatcatgc 32 H. sapiens 174
144118
4 4043 tctgctactttgctgctatg 34 H. sapiens 175
144119
4 4183 tttctatagccaaaaatagc 35 H. sapiens 176
144120
4 4197 aatagctaaatacctcaatc 36 H. sapiens 177
188518
4 31 aggtcctacaggtatggatc 37 H. sapiens 178
188519
4 36 ctacaggtatggatctctgg 38 H. sapiens 179
188520
4 115 cacagcagctatccttagca 39 H. sapiens 180
188521
4 160 taatccaggcctaaagacaa 40 H. sapiens 181
188523
4 185 tctaaggagcctaaattcac 42 H. sapiens 182
188524
4 274 gaacctaggacccatacagc 43 H. sapiens 183
188525
4 362 gctggggaaaacagctgtta 44 H. sapiens 184
188526
4 439 tggtggtacagtggatgaaa 45 H. sapiens 185
188527
4 468 ctgttgatgaaatagtgcaa 46 H. sapiens 186
188528
4 480 tagtgcaaccagatccaccc 47 H. sapiens 187
188529
4 564 gatgggaagcaccacgcaat 48 H. sapiens 188
188530
4 652 atggaaaatgatggacccta 49 H. sapiens 189
188531
4 684 cagttccagtgtactcattg 50 H. sapiens 190
188532
4 752 tctggaaattatggcgagtt 51 H. sapiens 191
188533
4 857 atctttggaatatttgggct 52 H. sapiens 192
188534
4 913 gcaaaggattaaaatgctga 53 H. sapiens 193
188535
4 979 tctcctcaaggaaggaaaat 54 H. sapiens 194
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Secuencia y posicion de los segmentos objetivo preferidos identificados en el receptor de la hormona de crecimiento
Identificacion del lugar
de
Numero identificacion secuencial objetivo
Lugar
objetivo
Secuencia
Rev comp de
identificacion
secuencial
la
Activo en
188536
4
1000
agaggaggtgaacacaatct
55
H. sapiens
188537
4
1053
acagtgatgactcttgggtt
56
H. sapiens
188538
1084
gctagatattgatgagccag
57
H. sapiens
188539
1110
agactgaggaatcagacaca
58
H. sapiens
188540
1236
atttcaatgccaatgacata
59
H. sapiens
188541
1302
aagcagatctcttatgcctt
60
H. sapiens
188542
1420
tcctactgaaggagctgagt
61
H. sapiens
188543
1560
agaataaggcagggatgtcc
62
H. sapiens
188544
1623
acttccttatggacaatgcc
63
H. sapiens
188545
1651
tgaggcagatgccaaaaagt
64
H. sapiens
188546
1656
cagatgccaaaaagtgcatc
65
H. sapiens
188547
1861
cctcatactcaatgcgactg
66
H. sapiens
188548
1884
tgcccttgcctgacaaagag
67
H. sapiens
188549
1913
tcatgtgactatgtgagcac
68
H. sapiens
188550
1949
atcatgccttagcctttctt
69
H. sapiens
188551
1973
ttcccaagagctacgtattt
70
H. sapiens
188552
2196
ctgtttagtagcagtgattg
71
H. sapiens
188554
2337
ttgaatgcaaaccatagcac
73
H. sapiens
188555
2454
atagtttggatatgtaaaac
74
H. sapiens
188556
2853
tcaccaaatcttggttgatg
75
H. sapiens
188557
2988
gagataagatctatagcctc
76
H. sapiens
188558
3271
agaaactttctttctcacta
77
H. sapiens
188559
3765
acatcattcttgagagcatt
78
H. sapiens
188560
3980
gaaaagctagaattgagtgt
79
H. sapiens
188562
4057
gctatggttttctccaagag
81
H. sapiens
188563
4097
taaagtatcatcagtgtaga
82
H. sapiens
188564
4120
taattcaattcaaagctgtg
83
H. sapiens
188565
4133
agctgtgtgtttggaagact
84
H. sapiens
188566
4156
ttactatttcacaacagcct
85
H. sapiens
188567
4170
cagcctgacaacatttctat
86
H. sapiens
188568
4218
gtctcagaatgtcattttgg
87
H. sapiens
188569
4245
gtggccacataagccattat
88
H. sapiens
188570
18
2571
tcaatcagggtcacataact
89
H. sapiens
188572
18
8405
tttgaacctccagcctccat
91
H. sapiens
188573
18
22712
gtcttgaaagatggacccta
92
H. sapiens
188574
18
25543
gtttagattctatctggaga
93
H. sapiens
188575
18
29755
aaagtaccagaatatttgga
94
H. sapiens
144062
11
16
tgccaagcaggcgcagccat
102
M. musculus
144063
11
221
aaactccgaggtctcaggta
103
M. musculus
144064
11
232
tctcaggtatggatctttgt
104
M. musculus
144065
11
300
ggaagtgaggctacaccagc
105
M. musculus
144066
11
313
caccagctactcttggcaaa
106
M. musculus
144067
11
391
ctcgattcaccaagtgtcgt
107
M. musculus
144068
11
495
tatgctaaaagggaaagcca
108
M. musculus
144072
11
590
aaacagctgttacttcaact
110
M. musculus
144074
11
717
cccattggcctcaactggac
112
M. musculus
144075
11
812
tctgaagggatggataattc
113
M. musculus
144076
11
832
tggagtatgaaattcagtac
114
M. musculus
144077
11
975
gaaaagtacagcgagttcag
115
M. musculus
144079
11
1084
ttggaatatttggagtagca
117
M. musculus
144083
11
1190
gattgatccagatcttctca
120
M. musculus
144084
11
1245
ggcattcatgataactacaa
121
M. musculus
144088
11
1388
atcagctggtatccttggag
123
M. musculus
144089
11
1530
gaagctgatctcttgtgcct
124
M. musculus
144091
11
1710
tcactggcaaacattgactt
126
M. musculus
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11
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ttatgcccaagtaagcgaca
127
M. musculus
144095
11
1850
aaattacagcatgaacagtg
129
M. musculus
144096
11
1878
tgtgagtcagatgccaaaaa
130
M. musculus
144097
11
1947
agctttaaccaagaggacat
131
M. musculus
144109
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tcatgcagtagcctttccta
135
M. musculus
144111
11
2253
gttttaaatctgtgttggga
137
M. musculus
144112
11
2517
aaacaatcaggtggcttttg
138
M. musculus
144114
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2537
cagttcaggaaattgaatgc
140
M. musculus
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Secuencia y posicion de los segmentos objetivo preferidos identificados en el rece
ptor de la hormona de crecimiento
Identificacion del lugar
Numero de identificacion secuencial objetivo Lugar objetivo Secuencia Rev comp de la identificacion secuencial Activo en Identificacion secuencial numero
144115
11 2637 ttggatatgcaaaacattta 141 M. musculus 258
144124
100 4352 aaactccgaggtactggagg 146 M. musculus 259
144125
100 4865 tgctaacctggagcaaggac 147 M. musculus 260
144126
100 5071 atgaactggggtgagtggaa 148 M. musculus 261
144127
100 5153 caaagttctgatagaactgc 149 M. musculus 262
144128
100 5196 gagtcgggtcacgtctggag 150 M. musculus 263
144129
100 5264 atccgcttgtgggtgcgtgg 151 M. musculus 264
144134
100 17200 gaacctccagggaaagccaa 156 M. musculus 265
144135
100 17224 aagctgcaaggttagtgaag 157 M. musculus 266
Puesto que se ha demostrado por experimentacion que estos “segmentos objetivo preferidos”, estan abiertos para, y son accesibles para, su hibridizacion con los compuestos antisentido de este invento, una persona con conocimiento en la tecnica reconocera o sera capaz de afirmar, utilizando experimentacion rutinaria a secciones adicionales que abarcan otros compuestos que se hibridan espedficamente a estos segmentos objetivos preferidos y consecuentemente inhiben la expresion del receptor de la hormona de crecimiento.
De acuerdo a esta especificacion, los compuestos antisentido incluyen compuestos oligomericos antisentido, oligonucleotidos antisentido, ribozimas, oligonucleotidos de secuencia de orientacion externa (EGS - external guide sequence), empalmadoras alternas, cebadores, sondas y otros compuestos oligomericos cortos que se hibridan a por lo menos una porcion del acido nucleico objetivo.
Ejemplo 17
Analisis de Western blot de los niveles proteinicos del receptor de la hormona de crecimiento
El analisis Western blot (analisis de inmuno manchado) es ejecutado usando metodos estandar. Las celulas son cultivadas 16-20 horas despues del tratamiento con oligonucleotidos, lavadas una vez con PBS, suspendidas en el amortiguador Laemmli (100 pl/pozo), hervidas durante 5 minutos y cargadas en un 16% de gel de SDS-PAGE. Los geles son ejecutados durante 1.5 horas a 150 V, y transferidos a la membrana para la prueba de western blots. Los anticuerpos primarios apropiados dirigidos al receptor de la hormona de crecimiento son utilizados, con un anticuerpo secundario marcado radiologicamente o fluorescentemente en contra de la especie principal de anticuerpos. Las bandas son visualizadas utilizando PHOSPHORIMAGER™ (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA).
Ejemplo 18
Reduccion de IGF-I serico en animales despues del tratamiento con antisentido al receptor de la hormona de crecimiento - estudio piloto de una semana
40 ratones Balb/C(a) machos que pesaban entre 9 a 10 g fueron colocados en jaulas, 4 animales por jaula, y se les permitio asimilarse a su entorno con nuevos companeros de camada una semana antes (dfa -7) del inicio del estudio de una semana. Los ratones de esta edad estanan a su maxima tasa de crecimiento. Sus masas corporales fueron medidas y registradas cada 2° dfa durante este periodo. Cuando los ratones teman una masa de 11 g (dfa -2), una muestra de sangre fue recaudada bajo anestesia tal como es descrito mas adelante, y un ensayo del IGF-I serico fue realizado para determinar los valores pre-tratamiento y para asistir en la asignacion de ratones a los grupos de tratamiento para reducir la variabilidad animal. Para obtener la muestra de sangre, los animales fueron anestesiados con pentobarbital (50 mg/kilogramo i.p.) y muestras de sangre sin ayunar fueron recaudadas exactamente 5 minutos despues del plexo retrobulbar a traves de tubos capilares heparinizados bajo una anestesia ligera de eter. Los 40 animales fueron colocados en 5 grupos y cada grupo tema un promedio de masa similar y una concentracion promedio similar de IGF-I para el ensayo.
A los animales (n = 8/grupo) se les designo dentro de los 5 siguientes grupos de tratamiento:
Control - solucion salina (una vez cada 2 dfas)
ASO (Antisense to growth hormone receptor - antisentido para el receptor de la hormona de crecimiento)- ISIS 227446 (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 104) (30 miligramos/kilogramo una vez cada 2 dfas).
Emparejamiento erroneo (oligonucleotidos de control negativo)- ISIS 261303 (IDENTIFICACION SeCuENCIAL NUMERO: 12:07, emparejamiento erroneo de base 8 a ISIS 261303).
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(30 mg/kilogramo una vez cada 2 dfas).
Ocreotido -(25 jg/kilogramo/2 veces al d^a).
Muestras de soluciones salinas, antisentidos, y ocreotidos fueron preparadas, y codificadas para ser administradas sin revelar el grupo. A los animales se les dio una dosis subcutanea de solucion salina cada 2 dfas, y al control de emparejamiento erroneo o de antisentido con una administracion en los dfas 0, 2, 4, 6. A los animales se les dio 2 veces al dfa dosis de 25 |jg de ocreotidos. Se albergaron 4 animales por jaula, durante una semana. Tuvieron acceso a una cantidad pre-determinada de comida y agua estandar para ratones en todo momento a lo largo del experimento. Se los albergo en un entorno callado, con la temperatura y humedad adecuada durante todo el estudio. En el dfa cero y antes del tratamiento y cada dfa o cada 2 dfas, los animales tuvieron ediciones de su masa corporal y de su consumo alimenticio, permitiendo la administracion de la dosis correcta del agente. Se monitoreo de cerca a los animales para detectar cambios en la piel, en el pelo, en los ojos, en la motricidad u otros cambios de comportamiento. No se observo ningun problema. Cada 2 dfas desde el dfa -7 hasta el dfa 7, se midio la masa corporal y el consumo de comida.
En el dfa 7, un dfa despues de la ultima dosis del antisentido, y/o despues de la ultima dosis de ocreotidos, se anestesio a los animales con pentobarbital (50 mg/kilogramo i.p.) y muestras de sangre no en ayunas fueron recaudadas exactamente 5 minutos despues del plexo retro bulbar a traves de tubos capilares heparinizados bajo anestesia ligera de eter (tal como en el dfa -7 y 0).
En el dfa -2 y en el dfa 7, se realizo una medicion del IGF-I serico por medio de un radioinmunoensayo. Los resultados fueron mostrados en la tabla 4. El nivel de IGF-I serico es la medido mas ampliamente usando de la actividad biologica de la hormona de crecimiento en terapias humanas. Es utilizado para medir la eficacia de tratamientos de antagonistas de la hormona de crecimiento similares a Trovert, que bloquean la respuesta de las celulas al exceso de la hormona de crecimiento, y los medicamentos de agonistas de dopamina y antagonistas de somatostatina de ocreotidos que bloquean la secrecion de la hormona de crecimiento de la pituitaria.
Tabla 4
Efecto del inhibidor antisentido del receptor de la hormona de crecimiento en los niveles sericos del factor de crecimiento similar a la insulina-I
IGF-I (ng/ml) dfa - 2 IGF-I (ng/ml) dfa 7 Reduccion % de IGF-I*
Control salino
217.09 + 42.61 102.64 + 31.64 0
Ocreotido
199.72 + 44.47 114.34 + 41.36 -
ASO 3mg/kg
216.23 + 78.14 129.63 + 33.76 -
ASO 30 mg/kg
181.84 + 71.32 56.95 + 10.34 44.51
Emparejamiento erroneo 30mg/kg
184.87 + 55.6 81.1 + 19.16 20.98
*Reduccion porcentual en IGF-I serico en el dfa 7 en comparacion con el control salino en el dfa 7.
Tal como se mostro en la tabla 4, el compuesto antisentido del receptor de la hormona de crecimiento, ISIS 227446 (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUmErO: 104, administrado subcutaneamente con 30 mg/kilogramos cada 2° dfa durante una semana, produjo una reduccion estadfsticamente significativa y espedfica de IGF-I serico al 55% del grupo de control (solucion salina). Los resultados de la prueba t demostraron una diferencia significativa entre los 30 mg/kilogramos del control salino (p <0.005) y el control de emparejamiento erroneo (p <0.01). El control de emparejamiento erroneo no fue diferente estadfsticamente que el control de solucion salina (p >0.05). No hubo un efecto a 3 mg/kilogramo. La reduccion del 45% en los niveles de IGF-I serico en nuestro estudio utilizando 30 mg/kilogramos de antisentido cada 2° dfa es comparable a aquel logrado utilizando unicamente 10 mg/kilogramos diariamente de Trovert (Van Neck et al., J. Endocrinol., 2000, 167, 295-303).
El control negativo de oligonucleotidos ISIS 261303 emparejados erroneamente de 8-nucleotidos (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 267), redujo el IGF-I serico por un 21% en comparacion al grupo salino de control, sin embargo, esta reduccion no fue estadfsticamente significativa (con p >0.05). Los nucleotidos a 2 dosis diarias de 25 jg cada una no tuvo efecto en los niveles de IGF-I serico en el dfa 7. La falta de efectos obtenida con ocreotidos es consistente con la informacion reportada por Groenbaek et al. (J. Endocrinol., 2002, 172, 637-643) utilizando esta dosis y 2 veces esta dosis en el dfa 7 en animales diabeticos. En animales diabeticos 2 dosis de 50 jg de ocreotidos por dfa durante 2 semanas fueron requeridos para reducir los niveles de sIGF-I.
Por lo tanto, un inhibidor antisentido del receptor de la hormona de crecimiento ha demostrado reducir espedficamente los niveles sericos del factor de crecimiento similar a la insulina-I por un 45% en comparacion al control. La reduccion del factor de crecimiento similar a la insulina-I serico con niveles similares a los vistos cuando se utilizan ocreotidos o Trovert, son clmicamente relevantes en el tratamiento de enfermedades incluyendo a la acromegalia, el gigantismo, la degeneracion macular relacionada con la edad, la retinopatfa diabetica, la nefropatfa
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diabetica, la diabetes, y tumores que dependen de la hormona de crecimiento y del IGF-I tal como se senalo anteriormente. Por lo tanto, se cree que esta terapia antisentido es terapeuticamente util para el tratamiento de condiciones asociadas con el eje hormona de crecimiento/factor de crecimiento similar a la insulina-I.
El suero restante despues del ensayo del factor de crecimiento similar a la insulina-1 fue aislado y almacenado a -80 °C. Todo el hngado fue removido rapidamente para ser pesado y congelado abruptamente en parcelas etiquetadas de aluminio por medio de sumersion en nitrogeno lfquido. Los rinones y los vasos tambien fueron congelados abruptamente en nitrogeno lfquido y almacenados a -80 °C en el congelador. La carcasa fue pesada y colocada entonces en una bolsa que podfa sellarse de plastico, congelada abruptamente en hielo seco y mantenida a -80 °C.
La reduccion en el factor de crecimiento similar a la insulina-I serico con 30 mg/kilogramos de antisentido no fue suficiente para influenciar la masa corporal o las masas de los organos durante este periodo. Esto confirma los resultados publicados de otras personas. Van Neck et al., J Endocrinol., 2000, 167, 295-303. Observando al estudio en general, un incremento de la longitud del cuerpo durante el estudio estuvo en el rango de 7.5-10%. El incremento de longitud de la cola estuvo en proporcion a los incrementos generales de longitud. El consumo de comida no vario significativamente entre los grupos de tratamiento. El crecimiento (longitud y masa del cuerpo) no fueron afectados por ningun tratamiento. La masa fue medida de 2 formas: tendencia de la masa (animal vivo), y masa final de la carcasa. Las masas absolutas del hngado no cambiaron excepto por un incremento ligero en la masa del hngado (gramos/masa corporal total) para el grupo de ocreotidos. Las masas de otros organos no fueron afectadas. Estas observaciones fueron similares a aquellas reportadas por van Neck et al. con Trovert excepto que la masa del hngado no fue afectada por Trovert, tal como fue observado con el antisentido del receptor de la hormona de crecimiento.
Los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento en muestras de tejidos de este estudio fueron expuestas a ensayos del hngado y de los rinones para detectar mecanismos de accion antisentido que se basan en la ribonucleasa H. Los niveles protemicos del receptor de la hormona de crecimiento por medio de ensayos de Western blots o de enlaces en las muestras de tejidos de este estudio fueron expuestas a ensayos del tngado y/o rinones para detectar mecanismos de accion antisentido adicionales y/o alternos. El tngado contribuyo con el 75% de los niveles sericos del factor de crecimiento similar a la insulina-I tal como se muestra en el receptor de la hormona de crecimiento de los animales knockout de Sjogren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de America, 1999, 96, 7088-7092. Analisis de muestras del factor de crecimiento similar a la insulina-I del hngado y de los rinones por analisis de ARN totales de Western y Northern blots o PCRs cuantitativos tambien fueron realizados tal como es entendido por aquellas personas con conocimiento en la tecnica.
Ejemplo 19
Reduccion de la actividad del receptor de la hormona de crecimiento en los animales despues del tratamiento con antisentido al receptor de la hormona de crecimiento
Ensayos espedficos de enlaces fueron ejecutados con los tejidos del hngado utilizando hormonas de crecimiento humanas yodadas [125I] hGH.
Preparaciones microsomales de membranas fueron obtenidas de la siguiente forma. 400 mg de polvo de tejidos fueron homogeneizados en un amortiguador fno de homogeneizacion (50mM de Tris /HCl, 250mM de sacarosa, pH 7.4). Esto fue centrifugado a 200 R P.M. durante 10 minutos a 3 °C y el sobrenadante fue guardado. Esto fue centrifugado nuevamente a 15.000 revoluciones por minuto durante 20 minutos. Los peletes fueron re - suspendidos en 0.5 mililitros de amortiguador de RRA con un inhibidor (50mM de Tris, 20mM de MgCl2, pH 7.4). Muestras de preparaciones microsomales fueron almacenadas a -80 °C hasta el ensayo de enlaces espedficos.
El ensayo de enlaces espedficos de [125I] hGH fue hecho de la siguiente forma. 4 tubos de vidrio fueron preparados para cada muestra, 2 para (-), 2 para (+). Diferentes muestras y soluciones fueron agregadas en cada tubo de la siguiente forma (i) 0.2ml de amortiguador RRA (50mM de Tris, 20mM de MgCl2, 0.1% de BSA, pH 7.4); (ii) 0.1ml de membrana (1/2 o 1/4 de dilucion); (iii) 0.1ml de bGH (10 mg /ml) para el tubo (+) o 0.1ml de amortiguador RRA para el tubo (-); y (iv) 0.1ml de rastreador [125I]-hGH.
Se incubaron muestras a 4 °C con agitacion durante la noche. La reaccion fue detenida con 2.5 mililitros de RRA fno, y la muestra fue centrifugada a 2800 revoluciones por minuto durante 25 minutos a 4 °C. El sobrenadante fue aspirado y los peletes fueron contados utilizando el contador de y. La capacidad espedfica de enlaces fue calculada: CPM(-) - CPM(+). El contenido protemico de las muestras microsomales fue determinado por el ensayo protemico BCA.
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Tabla 5
Efecto del inhibidor antisentido en la actividad de enlaces de la hormona de crecimiento con el receptor de la hormona de crecimiento
Enlaces espedficos/miligramo de dilucion protemica (cpm) A Enlaces espedficos/miligramo de dilucion protemica (cpm) %
Control salino
5647 ± 746 9071 ± 2371
ASO 30 mg/kg
4205 ± 534 (26% de reduccion en comparacion con la solucion salina) 5546 ± 789 (39% de reduccion en comparacion con la solucion salina)
Emparejamiento erroneo 30 mg/kilogramos
7090±1877 8431 ± 2663
Tal como se muestra en la tabla 5, el compuesto antisentido del receptor de la hormona de crecimiento, ISIS 227446 (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 104, administrados subcutaneamente a 30 mg/kilogramos cada 2 d^as durante una semana, produjo una reduccion estadfsticamente significativa (p <0.05) y espedfica de los niveles del receptor de la hormona de crecimiento (medidos por su actividad de enlaces de la hormona de crecimiento) al 61% del grupo de control (solucion salina). El control negativo de oligonucleotidos emparejados erroneamente de 8-nucleotidos ISIS 261303 (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 267) no tuvo ningun efecto en comparacion con el grupo de control de la solucion salina. El inhibidor antisentido del receptor de la hormona de crecimiento produjo una reduccion estadfsticamente significativa (p <0.01) y espedfica de los niveles del receptor de la hormona de crecimiento al 59% del grupo de control (emparejamiento erroneo) en el experimento de A de dilucion.
La reduccion espedfica de los niveles del receptor de la hormona de crecimiento fue significativamente diferente (por medio de la prueba t) en comparacion con el control de la solucion salina y el control de emparejamiento erroneo en ambas diluciones (P <0.05).
Estas mediciones del nivel de receptor de la hormona de crecimiento despues del tratamiento antisentido son consistentes con la reduccion del 45% en los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina-I en nuestro estudio utilizando 30 mg/kilogramos de antisentido cada 2° dfa en relacion al control (solucion salina).
Ejemplo 20
Reduccion de los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento y de IGF-I serico en los animales despues del tratamiento con antisentido al receptor de la hormona de crecimiento-estudio de una semana adicional
Ratones Balb/C(a) machos fueron preparados y agrupados para su analisis de acuerdo al ejemplo 18 mencionado anteriormente.
Se designo a los animales (n = 10/grupo) a los siguientes grupos de tratamiento:
Control-solucion salina (una vez cada 2 dfas).
ASO (Antisense to growth hormone receptor - antisentido del receptor de la hormona de crecimiento)- ISIS 227446 (IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 104) (30 y 50 mg/kilogramos una vez cada 2 dfas) Oligonucleotidos de control negativo no relacionados - ISIS 260120 (TTACCGTATGGTTCCTCACT; IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 268, (50 mg/kilogramo una vez cada 2 dias).
Los animales fueron tratados y los niveles de IGF-I serico fueron medidos tal como en el ejemplo 18 descrito anteriormente. Brevemente, durante la una semana de estudio, a los ratones se les administro una dosis subcutanea de solucion salina cada 2 dfas, y el control de emparejamiento o antisentido erroneo con su administracion en los dfas 0, 2, 4, 6. En el dfa 7, se anestesio a los animales con pentobarbital y se recolectaron muestras de sangre sin ayunar exactamente 5 minutos despues del plexo retrobulbar a traves de tubos capilares heparinizados bajo anestesia ligera de eter. La medicion de IGF-I serico se realizo por medio de un radioinmunoensayo en el dfa 7.
En el estudio de una semana, el inhibidor ISIS 227446 antisentido del receptor de la hormona de crecimiento redujo el IGF-I serico por un 33% con la dosis de 50 mg/kilogramo, en comparacion al control de solucion salina (p < 0.001), y por un 20% en comparacion con el control no relacionado (p<0.068). El control no relacionado con la dosis de 50 mg/kilogramos redujo el IGF-I serico por un 17% en comparacion de la solucion salina (p>0.05).
Los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento en las muestras de tejidos del tngado de ratones tratados y no tratados en este estudio de una semana fueron expuestos a ensayos. El inhibidor ISIS 227446
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antisentido del receptor de la hormona de crecimiento redujo los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento en el hngado despues del estudio de una semana por un 72% con una dosis de 50 mg/kilogramos, en relacion al control de solucion salina (p <0.0001). La dosis de 30 mg/kilogramo de ISIS 227446 genero una reduccion del 50% en el ARNm del receptor de la hormona de crecimiento (p<0.0001). El oligonucleotido ISIS 260120 de control no relacionado, a 50 mg/kilogramos, redujo los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento por aproximadamente un 15% (p>0.05).
Ejemplo 21
Reduccion de los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento y del IGF-I serico despues del tratamiento con antisentido al receptor de la hormona de crecimiento-estudio de 2 semanas
Un estudio de 2 semanas fue realizado en una forma similar al estudio de una semana en el ejemplo 18, esta vez utilizando ISIS 227446 con dosis de 3, 5, 10, 20 y 30 mg/kilogramo. El control de emparejamiento erroneo recibio las mismas dosis. Los ratones fueron tratados con el compuesto antisentido o la solucion salina cada 2 dfas durante 14 dfas.
La tabla 5 muestra los niveles de IGF-1 serico en ratones tratados durante 14 dfas. Los valores P fueron determinados por la prueba t.
Tabla 5
Estudio de 2 semanas de ratones - niveles de IGF/I serico despues del tratamiento con inhibidores antisentido del receptor de la hormona de crecimiento
Dosis de ISIS 227446 (miligramo/kilogramo)
IGF-I serico en el dfa 14 ng/mililitro Reduccion porcentual en relacion a los 3 mg/kilogramo de ISIS 227446 Valor p
30
126 41 0.0002
20
122 43 0.0002
10
130 39 0.0002
5
194 9 0.3261
3
214 0 -
La reduccion del IGF-I serico a los 14 dfas dependio de la dosis con una reduccion del 39-43% en los niveles alcanzados a >10 mg/kilogramo en comparacion a los 3 mg/kilogramo. La dosis de 3 mg/kilogramo de ISIS 227446 no tuvieron efectos en los niveles de IGF-I serico y fue equivalente al control de solucion salina (sin tratamiento) (mostrado en un experimento separado).
Controles de emparejamiento erroneo dieron menores reducciones en los niveles de IGF-I serico. Estos resultados son demostrados en la tabla 6. El efecto con 30 mg/kilogramos observado con el oligonucleotido de emparejamiento erroneo a las 2 semanas no fue observado con un oligonucleotido de control negativo no relacionado (ISIS 260120; IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 268).
Tabla 6
Estudio de 2 semanas de ratones-niveles de IGF-I serico despues del tratamiento con el control ISIS 261303 de emparejamiento erroneo
Dosis de ISIS 261303 (miligramos/kilogramo)
IGF-I serico en el dfa 14 ng/mililitro Reduccion porcentual en relacion a 3 mg/kilogramos de ISIS 261303 Valor p
30
130 29 0.0094
20
164 11 0.2496
10
174 5 0.6160
5
186 0 0.9359
3
184 0 -
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10
15
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50
55
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Los niveles del ARNm del receptor de la hormona de crecimiento en las muestras de tejidos del Itigado de ratones tratados y no tratados en este estudio de 2 semanas fueron expuestas a ensayos. El inhibidor ISIS 227446 antisentido del receptor de la hormona de crecimiento redujo los niveles de ARNm del receptor de la hormona de crecimiento en el Itigado despues del estudio de 2 semanas por un 50% con la dosis de 20 mg/kilogramo en comparacion al control de solution salina (p < 0.001). La dosis de 30 mg/kilogramo de ISIS 227446 genero una reduction del 53% en el ARNm del receptor de la hormona de crecimiento (p<0.0001). El oligonucleotido ISIS 261303 de control de emparejamiento erroneo (IDENTIFICACION SECUENCIaL NUMErO: 267), con una dosis de 30 mg/kilogramo, redujo los niveles de ARNm de la hormona de crecimiento por aproximadamente un 3%.
Ejemplo 22
Efecto de la inhibition antisentido del receptor de la hormona de crecimiento en la retinopatia
La retinopatia de pre-madurez es una enfermedad de neovascularization que puede conllevar a la ceguera en infantes con una masa muy baja de nacimiento. La retinopatia (una formation anormal de los vasos sangumeos) es iniciada por niveles relativamente altos de oxfgeno tales como los que se encuentran en incubadoras de infantes, por ejemplo. Un modelo de ratones de retinopatia (una formacion anormal de vasos sangumeos en la retina) es utilizado para estudiar los efectos de medicamentos en la magnitud de la neovascularizacion.
Ratones de 7 dfas de edad son colocados en una incubadora infantes con su madre mientras son amamantados en un 75% de oxfgeno desde el dfa posnatal 7 al dfa 12 para producir una retinopatia inducida por oxfgeno tal como se describio anteriormente por Smith et al., 1994, Invest Ophthalmol Vis Sci 35,101-111; Robinson et al., Proc Natl Acad Sci Estados Unidos de America, 1996, May 14;93, 4851-6. La concentration de oxfgeno es medida por lo menos diariamente mientras los animales se encuentran expuestos al oxfgeno. En el dfa 12 posnatal, los animales son regresadas al aire del cuarto. Los animales son sacrificados en el dfa posnatal 17 cuando se observa una maxima neovascularizacion.
A los ratones se les da una dosis con oligonucleotidos antisentido en los dfas posnatales 12, 13, 14, 15 y 16 o los dfas 7, 8, 9, 11, 13, 15 y 17. Los oligonucleotidos son administrados intraperitonealmente en concentraciones de 5, 10, 20 y 30 mg/kilogramo. Tambien se administraro el control ISIS 261303 de emparejamiento erroneo y/o del control ISIS 260120 de control antisentido negativo no relacionado.
Ejemplo 23
Modelos adicionales
Estudios utilizando inhibidores antisentido del receptor de la hormona de crecimiento tambien son hechos en los siguientes modelos animales de patologfa y en humanos tal como es entendido por aquellas personas con conocimiento en la tecnica: modelos de nefropatia diabetica tipo I y tipo II, modelos de cancer, modelos de artritis y modelos de diarrea inducida por quimioterapia.
LISTAS SECUENCIALES
<110> George Tachas Kenneth W. Dobie Ravi Jain
Christopher Ian Belyea Mark Andrew Heffernan
<120> MODULACION DE LA EXPRESION DEL RECEPTOR DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO Y LA EXPRESION DEL FACTOR DE CRECIMIENTO SIMILAR A LA INSULINA
<130> BIOL0002US
<150> 60/451,455
<151> 2003-02-28
<160> 268
<210> 1 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<223> Oligonucleotido Antisentido <400> 1
tccgtcatcg ctcctcaggg 20
<210>2 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligonucleotido Antisentido <400> 2
gtgcgcgcga gcccgaaatc 20
<210> 3 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Oligonucleotido Antisentido <400> 3
atgcattctg cccccaagga 20
<210> 4 <211> 4414 <212> ADN <213> H. sapiens <220>
<220>
<221> CDS <222> (44)...(1960)
<400> 4

Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Un oligonucleotido dirigido a una molecula de acido nucleico que codifica el receptor de la hormona de crecimiento humana, en donde la secuencia de base nitrogenada de dicho oligonucleotido consiste de las IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NUMEROS: 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 91, 92, 93 o 94, en donde las vinculaciones internucleosfdicas de dicho oligonucleotido se modifican, y en donde dicho oligonucleotido hibrida espedficamente con dicha molecula de acido nucleico que codifica el receptor de la hormona de crecimiento e inhibe la expresion del receptor de la hormona de crecimiento.
  2. 2. El oligonucleotido de la reivindicacion 1, en donde dicho oligonucleotido es un oligonucleotido antisentido.
  3. 3. El oligonucleotido de la reivindicacion 1, en donde dicho oligonucleotido es un oligonucleotido quimerico.
  4. 4. El oligonucleotido de la reivindicacion 1, en donde dicho oligonucleotido comprende al menos una partfcula modificada de azucar o una base nitrogenada modificada.
  5. 5. El oligonucleotido de la reivindicacion 4, en donde dicho oligonucleotido comprende al menos una vinculacion internucleosfdica de fosforotioato o partfcula de azucar de 2'-O-metoxietil o 5-metilcitosina.
  6. 6. El oligonucleotido de cualquier reivindicacion anterior, en donde dicho oligonucleotido apunta a una region en los nucleotidos 332 a 351 de la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 4.
  7. 7. El oligonucleotido de cualquier reivindicacion anterior, en donde la secuencia de base nitrogenada del oligonucleotido consiste de la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 19.
  8. 8. El oligonucleotido de cualquier reivindicacion anterior, en donde dicho oligonucleotido es un oligonucleotido
    quimerico de 20 nucleotidos de longitud, compuesto de una region "vada" central que consiste de diez 2'-
    desoxinucleotidos, que esta flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por cinco "alas" de nucleotido
    compuestas de nucleotidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE), en donde cada vinculacion internucleosfdica (esqueleto) es fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleotido, y todas las partfculas de citidina son 5-metilcitidinas.
  9. 9. Un oligonucleotido quimerico de 20 nucleotidos de longitud, compuesto de una region "vada" central que consiste
    de diez 2'-desoxinucleotidos, que esta flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por cinco "alas" de nucleotido compuestas de nucleotidos de 2'-metoxietilo (2'-MOE), en donde cada vinculacion internucleosfdica (esqueleto) es fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleotido, y todas las partfculas de citidina son 5-metilcitidinas, en donde la secuencia de base nitrogenada del oligonucleotido consiste de las IDENTIFICACIONES SECUENCIALES NUMEROS: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,
    81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 91, 92, 93 o 94.
  10. 10. El oligonucleotido de la reivindicacion 9, en donde la secuencia de base nitrogenada del oligonucleotido consiste de la IDENTIFICACION SECUENCIAL NUMERO: 19.
  11. 11. El oligonucleotido de cualquier reivindicacion anterior, en donde dicho oligonucleotido inhibe la expresion del receptor de la hormona de crecimiento y el factor-I de crecimiento tipo insulina.
  12. 12. Una composicion que comprende el oligonucleotido de cualquiera de las reivindicacion 1 a 11 y un portador farmaceuticamente aceptable.
  13. 13. El oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso como un producto farmaceutico en un metodo de tratamiento o profilaxis.
  14. 14. El oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o la composicion de la reivindicacion 12, para su uso en el tratamiento o profilaxis de acromegalia, gigantismo, cancer, diabetes, nefropatfa diabetica, retinopatfa diabetica, neovascularizacion aberrante, neovascularizacion retiniana, angiogenesis aberrante, degeneracion macular, degeneracion macular relacionada con la edad, artritis reumatoide, hipertrofia glomerular, esclerosis, metastasis hepaticas o artritis reumatoide.
  15. 15. El uso del oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o la composicion de la reivindicacion 12 en la fabricacion de un medicamente para el tratamiento o profilaxis de acromegalia, gigantismo, cancer, diabetes, nefropatfa diabetica, retinopatfa diabetica, neovascularizacion aberrante, neovascularizacion retiniana, angiogenesis aberrante, degeneracion macular, degeneracion macular relacionada con la edad, artritis reumatoide, hipertrofia glomerular, esclerosis, metastasis hepaticas o artritis reumatoide.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
  16. 16. El oligonucleotido para el uso de acuerdo con la reivindicacion 14 o el uso de la reivindicacion 15, en donde dicha cancer es cancer de mama, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de pulmon, cancer de pancreas o meningioma.
  17. 17. El uso de la reivindicacion 15 o 16, en donde el medicamento inhibe la expresion del factor-1 de crecimiento tipo insulina.
  18. 18. Un metodo para inhibir la expresion del receptor de la hormona de crecimiento en celulas o tejidos un vitro o ex vivo que comprende poner en contacto dichas celulas o tejidos con el oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o la composicion de la reivindicacion 12.
  19. 19. El metodo de la reivindicacion 18, en donde se inhibe la expresion del factor-1 de crecimiento tipo insulina.
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